Patents
Search within
Search within the title, abstract, claims, or full patent document: You can restrict your search to a specific field using field names.
Use TI= to search in the title, AB= for the abstract, CL= for the claims, or TAC= for all three. For example, TI=(safety belt).
Search by Cooperative Patent Classifications (CPCs): These are commonly used to represent ideas in place of keywords, and can also be entered in a search term box. If you're searching forseat belts, you could also search for B60R22/00 to retrieve documents that mention safety belts or body harnesses. CPC=B60R22 will match documents with exactly this CPC, CPC=B60R22/low matches documents with this CPC or a child classification of this CPC.
Learn More
Title
Abstract
Claims
Full Document
Find patents
Keywords and boolean syntax (USPTO or EPO format): seat belt searches these two words, or their plurals and close synonyms. "seat belt" searches this exact phrase, in order. -seat -belt searches for documents not containing either word.
For searches using boolean logic, the default operator is AND with left associativity. Note: this means safety OR seat belt is searched as (safety OR seat) AND belt. Each word automatically includes plurals and close synonyms. Adjacent words that are implicitly ANDed together, such as (safety belt), are treated as a phrase when generating synonyms.
Learn More
Search by
Chemistry searches match terms (trade names, IUPAC names, etc. extracted from the entire document, and processed from .MOL files.)
Substructure (use SSS=) and similarity (use ~) searches are limited to one per search at the top-level AND condition. Exact searches can be used multiple times throughout the search query.
Searching by SMILES or InChi key requires no special syntax. To search by SMARTS, use SMARTS=.
To search for multiple molecules, select "Batch" in the "Type" menu. Enter multiple molecules separated by whitespace or by comma.
Learn More
Patent numbers
Search specific patents by importing a CSV or list of patent publication or application numbers.
Delecní mutanty faktoru X a jejich analogy
CZ298296B6
Czechia
- Other languages
English - Inventor
Himmelspach@Michele Pfleiderer@Michael Falkner@Falko-Günter Eibl@Johann Dorner@Friedrich Schlokat@Uwe
Description
translated from
Oblast techniky $
Tento vynález sc týká analogů faktoru ΧΔ sjednou dclccí aminokyselin Argl80 až Arg234 as jednou modifikací v oblasti aminokyselinové sekvence mezi Gly] 73 až Argl79, preparátů obsahujících analogy faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu nebo analogy faktoru Xa a rovněž postupu přípravy analogů faktoru XA podle tohoto vynálezu.
io
Dosavadní stav techniky
Po inicializaci procesu srážení krve probíhá srážecí kaskáda postupnou aktivací různých proen15 zymů (zymogenů). které jsou přítomny v krvi v aktivní formě serinprotcáz. K nim patří mj. faktor Xll/XIIa. faktor Xl/XIa, faktor IX/lXa, faktor X/Xa, faktor Vll/Vlla a protronibim/trombin. Většina těchto enzymů je ve svém fyziologickém stavu aktivní pouze tehdy, jsou-li tyto enzymy asociovány v komplexu na membránovém povrchu. Řada těchto procesů se účastní i Ca-ionty. Srážení krve probíhá bud' vnitřní dráhou, při níž jsou všechny proteinové komponenty v krvi 20 obsaženy, nebo vnější dráhou, při níž má rozhodující úlohu tkáňový faktor. K uzavření rány nakonec dojde rozštěpením fibrinogenu na fibrin působením trombinu.
Aktivaci prolrombinu na trombin způsobuje protrombinázový komplex. Trornbin jc důležitý enzym, který může působit jako prokoagulant i jako antikoagulant. Protrombinázové komplex, 25 v němž se uplatňují mj. faktor V a (jako ko faktor) a faktor Xa (jako serin proteáza), spouští asociaci,kterájc závislá na přítomnosti Ca na povrchu fosfolipidů. Uvádí sc, žc faktor Xa přitom působí jako katalytická komponenta protrombinázového komplexu.
Faktor X (Stuart-Prowerúv faktor) je koagulační glykoprotein závislý na vitaminu K. který jc možno aktivoval vnitřní nebo vnější dráhou kaskády srážení krve. Primární produkt translace faktoru X (prc-pro-FX) obsahuje 488 aminokyselin a jc syntetizován v játrech nebo lidským jaterními buňkami nejprve jako 75 kD prekurzorový protein s jedním řetězcem. V plazmě sc faktor X vyskytuje převážně ve formě molekuly se dvěma řetězci (Fair a spol., 1984, Blood 64:194-204).
V průběhu biosyntézy dojde po odštěpení pre-sekvence působením signálpeptidázy (mezi Ser23/Leu24) a propeptidu (mezi Arg40/Ala41) u molekuly faktoru X s jedním řetězcem po přeměně a odstranění tripeptidu Arg 180—Lys 181—Arg 182 k přechodu na formu se dvěma řetězci, skládající sc z cca 22 kD lehkého řetězce a cca 50 kD těžkého řetězce, které jsou navzájem spo40 jeny disulfidickým můstkem a k rozštěpení této molekuly (Obr. 1). Faktor X proto cirkuluje v plazmě jako molekula se dvěma řetězci.
Při procesu srážení krve se faktor X konvertuje z inaktivního zymogenu na aktivní proteázový faktor Xa působením limitované proteolysy, přičemž aktivace faktoru X na faktor Xa může pro45 bíhat v jednom ze dvou komplexů vázaných na membránu: ve vnějším komplexu faktoru
Vlla/tkáňový faktor nebo vc vnitřním komplexu faktor Vlila-faktor IXa-fosfolipid-Ca, tzv. „tenasovém komplexu“ (Mertens a spol., 1980, Biochem. J. 185:647-658). Proteolytickc štěpení mezi aminokyselinami Arg234/Ile235 vede k uvolnění aktivačního peptidů o délce 52 aminokyselin zN-konce těžkého řetězce a tím kc tvorbě aktivního enzymu, faktoru Xa. Katalytické 50 centrum faktoru X jc umístěno v těžkém řetězci.
Aktivace prostřednictvím vnějšího komplexu faktor Vila—TF vede k tvorbě faktoru Xaa (35 kD) a faktoru Xap (31 kD), přičemž, vedle nepatrných koncentrací faktoru Vila v komplexu sc vyskytuje i polypeptid 42 (kD). Při tvorbě faktoru Xaa dochází ke štěpení u Arg234/1 Ie235 v těžkém , I .
CZ 298290 B6 řetězci, což znamená aktivaci faktoru X na faktor Xa. Výskyt faktoru Xap jc zřejmě způsoben autokatalytickým štěpením u Arg469/Gly470 u C-konce těžkého řetězce faktoru Xaa a odštěpením 4,5 kD-peptidu. Faktoru Xap vykazuje stejně jako faktor Xaa katalytickou aktivitu. Bylo však prokázáno, že štěpením faktoru Xaa na faktoru Xap vzniká plazmidem-receptorové vazné 5 místo a žc faktor Xa[3 vykazuje případně i fibr i no lytickou aktivitu, resp. že se podílí na fibrinolýze jako kofaktor. Přeměna faktoru Xaa na faktor Xap je však pomalejší než tvorba trombinu. což zabraňuje iniciaci fibrinolýzy před vytvořením krevní sraženiny (Pryzdial a spol. 1996. .1. Biol. Chem. 271:16614-16620: Pryzdial a spol., 1996. J. Biol. Chem' 271:16621-16626).
io Při přeměně na C-konci těžkého řetězce mezi Arg469/Gly470 bez předchozí úpravy mezi Arg234/IIe235 vniká 42 kD-polypeptid. Tento meziprodukt nevykazuje žádnou katalytickou aktivitu stejně jako fragment faktoru Xax, který vzniká proteolysou u Lys370 (Mertens a spol., 1980, J. Biol. Chem. 185:647-658: Pryzdial a spol., 1996. J. Biol. Chem. 271:16614 16620).
Aktivace faktoru X vnitrní dráhou je katalyzována komplexem faktor IXa-faktor Vlila. Při této aktivaci se získají stejné reakční produkty; faktor Xap se však získá ve vyšším množství než ostatní procesní produkty faktoru X (Jesty a spol.. 1074. J. Biol. Chem. 249:5614).
In vitro je možno faktor X aktivovat např. působením Russelova Viper Venomu (RVV) nebo 20 působením trypsinu (Bajaj a spol., 1073. J. Biol. Chem. 248:7729 7741) nebo pomocí čištěných fyziologických aktivátorů, jako jsou komplex FVIla/TF nebo komplex faktor IXa/faktor Vila Merkcns a spol., 1980, J. Biol. Chem. 185:647-658).
Komerčně dostupné produkty faktoru X z plazmy obsahují většinou směs faktoru Xaa a faktoru 25 XaP, přičemž po aktivaci faktoru X na faktoru Xa vzniká především faktor Xaa, který se při autokatalytickém procesu opět štěpí na faktor Xap.
Aby bylo možno získat jednotný produkt faktoru Xa s vyšší molekulární integritou, byla v patentu EP 0 651 054 navržena aktivace faktoru X působením RVV po delší dobu tak. aby 30 vzniklý konečný produkt obsahoval v podstatě pouze faktor Xap. Vedlejší produkty, a to např.
faktor Xaa nebo proteáza byly nakonec odstraněny několikanásobnou chromatografií.
Byla provedena izolace a charakterizace cDNA faktoru X (Leylus a spol.. 1984, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 82: 3699-3702; Fung a spol.. 1985, Proč. Nati. Acad.. Sci., USA. 82:3591-3595). 35 Lidský faktor X byl exprimován in vitro v různých typech buněk, jako např. v lidských embryonálních ledvinových buňkách nebo v CHO buňkách (Rudolph a spol, 1997, Prot. Expr.
Purif. 10: 373 378, Wolfa spol, 1991, J. Biol. Chem. 266:13726-13730). Bylo však zjištěno, že při rekombinační expresi lidského faktoru X byla úprava na pozici Arg40/Ala41 na rozdíl od provedení in vivo neúspěšná a že vznikaly různé N-konce na lehkém řetězci faktoru X (Wolf a 40 spol., 1991, J. Biol. Chem 266:13726-13730). Rekombinovaný faktor X (rFX) bvl pomocí RV aktivován in vitro na rfaktor Xa (rFXa) nebo byl rFXa přímo exprimován, přičemž byl aktivační peptid deletován v oblasti aminokyseliny 183 až aminokyseliny 234 a nahrazen tripeptidem, ab} bylo možno provést přeměnu bezprostředně v rFXa-formě s dvojitým řetězcem. Vyčištěný rFX byl přeměněn asi ze 70 % na lehký a těžký řetězec, zatímco zbývajících 30 % tvořil rFX s jedním 45 řetězcem se 75 kDa. Přímá exprese rFXa sice vedla ke tvorbě aktivního faktoru Xa, avšak zároveň vznikaly i inaktivní intermediály. Wolfa spol. (1991, J. Biol. Chem. 266: 13726-13730) zjistili kromě toho i sníženou aktivitu rekombinovaného faktoru X, která byla způsobena horší aktivovatelností rFX působení RVV a rovněž populací inaktivních proteinů a polypeptidáz molekul prckurzorů s jedním řetězcem. Tito autoři zjistili zejména vysokou nestabilitu rFXa při 50 expresi rekombinovami buňkami, což vysvětlují vysokou rychlostí autoproteolýzy.
Aby bylo možno sledovat funkci C-terminálních polypeptidů faktoru Xaa. zavedly Eby a spol.
(1992. Blood 80 (Suppl. 1), 1214A) stop-kodon do sekvence faktoru X na pozici Gly430. NezjisCZ 298290 B6 lili však žádný rozdíl mezi rychlostí aktivace faktoru Xa (FXact) s β-peptidem nebo dc leč ní ho mutantu bez β peptidu (FXap).
Faktor Xa je důležitou součástí protrombinázového komplexu a proto sc uvádí jako primární mediátor rychlého zastavení krvácení, který by byl vhodný pro léčbu pacientů s poruchami srážení krve, jako např. při výskytu hemofilie.
Zejména léčba hemofiliků s deficitem faktoru VIII nebo faktoru IX. prováděná koncentráty faktorů vyrobených z plazmy by mohla být při dlouhodobé terapii komplikována tvorbou inhibujících protilátek proti těmto faktorům. Proto byla pro léčbu pacientů trpících hernofilií vyvinuta řada alternativ s použitím faktorů s bypassovou aktivitou. Bylo navrženo použití koncentrátu protrombinovcho komplexu, částečně aktivovaného protrombinázového komplexu (APPC), faktoru Vila nebo FEIBA. Komerčními preparáty s faktor VH-hypassovou aktivitou (FEIBA) jsou například FEIBA nebo Autoplcx. Preparát FEIBA obsahuje přibližně stejné jednotky faktoru II, faktoru VII, faktoru IX. faktoru X a FEIBA, nepatrná množství faktoru Vlil a faktoru V. a dále stopová množství aktivovaných koagulačních faktorů jako jsou trombín a faktor Xa resp. faktor s aktivitou odpovídající faktoru X (Elsinger, 1982. Activated Protrombin Complcx Concentrates. Ed. Maruiani, Ruso. Mandelli, str. 77 87). Elsinger poukazuje zejména na význam aktivity FEIGA. která jc podobná aktivitě faktoru Xa. Bypassová aktivita faktoru Vil byla prokázána G i lesem a spol (1988. British J. Haematology 9:491 497) u kombinace čištěného faktoru Xa a fosfolipidů v modelu na zvířatech.
V řadě aplikačních oblasti je proto velká potřeba faktoru X/Xa nebo proteinů podobných faktoru X/Xa buď samotných, nebo jako součást koagulačních komplexu pro zastavení krvácení.
Doba poločasu účinnosti (1 lalbwertszeit) faktoru Xa je v porovnání se zymogenem jako v prostředí in vivo, tak i in vitro silně snížena. Tak např. jc možno faktor X v glycerolu přechovávat po dobu 18 měsíců vc stabilním stavu, zatímco faktor Xa je za stejných podmínek stálý pouze 5 měsíců (Bajaj a spol., 1973, J. Biol. Chem. 248: 7729-2241) resp. v glycerolu při 4 °C dojde po 8 měsících ke snížení aktivity o více než 60 % (Teng a spol. 1981, Trombosis Res. 22: 213-220). Doba poločasu účinnosti faktoru Xa v séru je pouze 30 sekund.
Vzhledem k nestálosti faktoru Xa bylo navrženo podávání preparátů obsahujících faktor X (US 4 501 731). Při krvácením ohrožujících život, zejména u hemofiliků. je však podávání faktoru X neúčinné, poněvadž při nedostatku účinného „tenasového komplexu” při vnitřním srážení krve nedojde k dostatečné aktivaci faktoru X na faktor Xa a aktivace pres vnější dráhu probíhá Často příliš pomalu, takže nelze dosáhnout rychlého působení. Kromě toho hemofiliei mají dostatek faktoru X. ten však vykazuje vc srovnání s faktorem Xa tisíckrát menší protrombinázovou aktivitu. V těchto případech je žádoucí podávat aktivovaný íáktor Xa přímo, případně v kombinaci s fosfolipidy, jako uvedli Giles a spol. (1988, British, J. Haematology 9:491 —497) nebo s jinými koagulačními činidly, případně s činidly s faktor VlI-bypassovou aktivitou.
Při přípravě faktoru Xa z faktoru X se aktivace doposud provádí převážně ncfýz.iologickými aktivátory živočišného původu, jak jsou RVV nebo trypsin, přičemž však musí být absolutně zajištěno, aby konečný produkt neobsahoval žádnou z těchto proteáz. Jak bylo uvedeno již dříve, vzniká při aktivaci faktoru X na faktor X řada intermediátů. z nichž některé jsou inaktivní (Bajaj a spol.. 1973, J. Biol. Chem. 248:7729-2241; Mertens a spol., 1980, J. Biol. Chem. 185: 647-658). Přítomnosti těchto intermediátů způsobuje snížení specifické aktivity tohoto produktu, některé intermediáty mohou dokonce na aktivní serinproteázy působit antagonisticky. Příprava jednotného čistého produktu s vysokou specifickou aktivitou proto při použití běžných metod vyžaduje nákladné postupy aktivace a zdlouhavé chromatografickc čištění.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je proto získání takového preparátu, který' by obsahoval polypeptid s aktivitou faktoru X/Xa. který by měl vysokou stabilitu, a při jehož získávání by se při 5 aktivaci na faktor Xa nemusely používat běžné proteázy. zejména živočišného původu, jako jsou např. RVV nebo try psin. Dalším předmětem je příprava farmaceutického preparátu s faktor VIIbypassovou aktivitu.
Tento úkol byl podle předloženého vynálezu vyřešen tak že byl získán analog faktoru X s delecí iv aminokyselin Arg 180 až Arg234 z aminokyselinové sekvence faktoru X a dále byla provedena modifikace tohoto delečního mutantu faktoru X v oblasti aminokyselinové sekvence mezi Glyl73 a Argl79. Delecí aminokyselinové sekvence Argl 82 až Arg234 by) dehtován jako tripeptid Argl 80 až Argl 82, tak i aktivační peptid Ser 183 až Arg234 a došlo tak k přímému spojení mezi lehkým a těžkým řetězcem faktoru X a aminokyselinami Argl79 a lle235. Takto získaná 15 sekvence však neobsahuje žádné místo přirozeného štěpení pro proteázy. Modifikací v oblasti aminokyselinové sekvence faktoru X mezi aminokyselinami Gly 173 a Argl79 a případně Ilc235 se získá deleční mutant faktoru X podle vynálezu, který obsahuje nové rozpoznávací resp. reakční místo (Prozessierungsstelle). které se dosud v této pozici po polypeptidu nevyskytovalo, pro působení proteázy. která v tomto místě polypeptid běžně neštěpí. Tato modifikace zahrnuje 2o přitom alespoň výměnu minimálně jedné aminokyseliny mezi pozicemi Gly 173 a Argl 79 a případně llc235 v aminokyselinové sekvenci faktoru X. Pozice jednotlivých aminokyselin je přitom vztažena na číslování podle sekvence uvedené v obr. 1. která začíná Metl a končí Lys488. U modifikovaného delečního mutantu faktoru X podle tohoto vynálezu bylo pro zjednodušení nomenklatury ponecháno číslování aminokyselin kompletní sekvence faktoru X. dále však je 25 tento modifikovaný deleční mutant fakturu X označován jako analog faktoru XA.
Tato modifikace spočívá v substituci alespoň jedné aminokyseliny nebo v jedné inzerci peptidové sekvence obsahující specifické rozpoznávací místo pro proteázy (Protcázccrkcnnungsstelle). resp. specifické místo štěpení. Tato modifikace v analogu faktoru ΧΛ je přitom přednostně taková, že 3o rozpoznávací místo pro proteázy. resp. místo štěpení představuje proteáza ze skupiny endoproteáz. jako jsou kexin/Kx2. furin/PAGE, PCI/PC3, PC2, PC4. PACE4, I.PC/PL7 (jak uvádějí Barr a spol. 1991, Cell 66:1-3 nebo v US patentu US 5 460 950), ze skupiny serinproteáz. jako jsou faktor 11a, faktor Vila, faktor IXa, faktor Xlla, faktor Xla, faktor X nebo kallikrein, nebo deriváty uvedených proteáz.
Tato modifikace se volí přednostně tak. aby působením jedné z těchto proteáz sc získal polypeptid. jehož biologická aktivita odpovídá nativnímu faktoru Xa a jehož aktivita je stejná jako aktivita faktoru Xa. Pro dosažení optimální úpravy může být v některých případech nezbytné vyměnit navíc aminokyselinu lle235. NfU-terminální aminokyselina izoleucin na těžkém řetězci 40 by měla však být pokud možno po aktivaci zachována, poněvadž izoleucin je zástupcem aminokyselin, které mají při tvorbě míst pro vázání substrátu (Substratbindungstasche) důležitou funkci (Watzke a spol.. 1995, Molecular Basis of Trombosis and Hemostasis, cd. Kathcrinc High and Harold Roberts), Analogy faktoru XA podle tohoto vynálezu v porovnání s nativní sekvencí faktoru X určitý strukturální rozdíl zejména ve složení aminokyselin, po aktivaci však mají aktivitu 4? srovnatelnou s aktivitou přírodního faktoru X resp. faktoru Xa.
V tomto vynálezu jsou uvedeny příklady řady analogů faktoru XA. u nichž by la provedena delece a kromě toho modifikace mezi Gly 173 a Argl79. případně Ile235. Tyto modifikace mohou být provedeny na jednom nebo několika místech v oblasti mezi aminokyselinami Gly 173 a Argl 79, 50 případně Ile235, vztaženo na sekvenci faktoru X s číslováním Metl až Lys488 podle obr. 1. Substituce aminokyselin mohou být provedeny v místě Be235 (Rl), Arg 179, Glu 178 (R2), Leu 177 (R3), Thr 176 (R4), Gin 175 (R5) a Lys 174 (R6), přičemž však přednostně zůstává Argl79 nezměněn.
CZ 298296 Β6
Analogy faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu obsahují přednostně sekvenci faktoru X
Gly 173-R6-R5-R4-R3-R2-Argl79-RL kde RTIle. Val. Ala. Ser nebo Thr. R2=Glu. Thr. Pro. Gly. Lys nebo Arg; R3=Leu, Phe, Lys, Met, Gin. Ser, Val, Arg nebo Pro; R4= Thr, Asn, Asp, Ile, Ser. Pro, Arg nebo Lys; R5= Asn, Lys. Ser, Glu, Gin, Ala, His nebo Arg a R6- Arg, Asp. Phe, Thr, Leu nebo Ser.
Výhodné formy provedení analogů faktoru X podle tohoto vynálezu jsou analogy faktoru X s modifikací
a) Rl-Ile. R2=Thr. R3^Leu, R4=Asn a případně R5~Asn a/anebo R6~Asp a upravené (prezessiert) faktorem Vila nebo faktorem IXa;
b) RTVal, R2=Thr, R3=Phe, R4A\p a případně R5=Asn a/nebo R6=Phe a/anebo R1 -11c nebo Val (obr. 2A) a upravené faktorem Xla;
c) RTIle nebo Val. R2~Phe, R3=Lys, R4=llc a případně R5^Lys a/anebo R6=Thr (obr. 2C) nebo RTIle. R2=Ther, R3=Ser, R4=Thr a případně R5=Lys a/nebo R6=Thr (obr,21) a upravené faktorem Xlla;
d) R1 - líc nebo Val. R2=Ther, R3~met, R4=Ser a případně R5=Ser a/anebo R6=Leu (obr. 2D) a upravené kallikrcincnu
c) R TIle, R2=Gly. R3=Gln. RT Pro a případně R5=Lys a/anebo R6-Ser (obr. 2H) nebo RTIle. R2=Gly, R3-Glu, R4=Ile (obr. 2F) nebo RTIle, R2=Thr. R3=Lys, R4=Met (Obr. 2E) a upravené faktorem Xa;
f) RTIle, R2=Lys, R3=Arg. R4-Arg a případně R5=Glu, a/anebo R6=Leu nebo RTIle, R2=Thr, R3=Val, R4=Arg a případně R5=Ala a/anebo R6-l cu nebo RTIle, R2~Arg, RTVal. R4=Arg a případně R5=Gln, a/anebo R6“Leu nebo RTIle, R2-Arg. R3=Arg, R4-Arg a případně R5-His a/anebo Rb-Lcu nebo RTIle. R2=Lys, IGTPro, Rl-Arg a případně R5=Asn a/anebo R6=Leu nebo RTIle, R2=Lys, RT Arg. R4-Ile a případně RSArg a/anebo R6_Leu nebo RTIle. R2-Lys. R3=Ser a R4_Arg nebo RTIle, R2-Thr, R3=Val a R4-Arg nebo RTIle. R2”Lys, R3=Leu a R4=Arg (viz obr. 2G), přičemž sekvence uvedené pod f)jsou upravovány bazickými endoproteázami, jako jsou kcxin/Kex2, furín/PAGE, PC1/PC3. PC’2, PC4. PACE4, LPC/PC7 nebo derivátem těchto proteáz.
Možný výběr modifikací a složek zaměňujících aminokyseliny (Aminosaure-austauscher), které vedou kc změněné proteázové specifitě je uveden v obr. 2.
Tylo modifikace mohou být prováděny například řízenou mutagenezí in vitro nebo PCR nebo jinými gcnovč-tcchnickými metodami podle současného stavu techniky, které jsou vhodné pro provádění specifických změn DNA-sekvencc pro dosažení požadované výměny aminokyselin.
Aktivace analogů faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu na analogy faktoru Xa se provádí podle tohoto vynálezu výhodně proteázou ze skupiny endoproteáz, jako jsou kcxin/Kcx2. furin/PACE. PC1/PC3. PC2. PC4. PACE4. LPC/PC7, ze skupiny serinproteáz, jako jsou faktor 11a, faktor Vila, faktor IXa, faktor Xlla, faktor Xla, faktor X nebo kalíikrein. nebo deriváty těchto proteáz.
Analogy faktoru ΧΛ podle tohoto vynálezu jsou polypeptidy s jednoduchým řetězcem v enzymaticky inaktivní formě. Aktivní analogy faktoru XA se získávají až po rozštěpení proteázou na formu se dvěma řetězci. Tato modifikace tudíž umožňuje aktivaci i n akt i vního polypeptid ické ho analogu faktoru ΧΔη na aktivní formu se dvěma řetězci.
. 5 .
Jedním z problémů při přípravě aktivního faktoru Xa je nestabilita tohoto faktoru, poněvadž při autokatalýze vznikají kromě faktoru Xaa a faktoru Xap i jiné neaktivní interrnediáty.
Pro přípravu v podstatě intaktních molekul aktivního faktoru X/Xa resp. molekul podobných 5 aktivnímu faktoru X/Xa je proto žádoucí získávat pouze takové proteiny; které by vedly ke stabilním konečným produktům.
Je známo, že preferované místo štěpení pro přeměnu faktoru Xact (FXaa) na faktoru Xa[3 (FXap) je mezi Arg469/Gly470. Jak uvádějí Lby a spol. (1992. Blood, Vol. 80, Suppl. 1, 1214) byl 10 kromě prominentního karboxyterminálního peptidu (aminokyselinové zbytky 476 487) faktoru X nalezen i další kratší peptid (aminokyselinové zbytky 464 až 477), který vzniká autokatalýzou u faktoru Xaa. Aby bylo možno provést požadovanou úpravu in taktní ho faktoru X na v podstatě aktivní faktor Xa bez vzniku inaktivních intermediátů při léto úpravě, vykazují analogy faktoru ΧΛ podle tohoto vynálezu případné další modifikace.
Analogy faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu se vyznačují tím. že vykazují ve zvláštní formě svého provedení i další modifikaci v C-koncovc části aminokyselinové sekvence faktoru X.
Jedna z forem provedení se vyznačuje tím, že analog faktoru XA výše popsaného druhu je intak2(1 tni β-peptid (FXA a). Analogy faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu mají přitom provedenou modifikaci zejména v oblasti C-koncového β-peptidickcho místa štěpení (Belapeptidspcltstelle), která zabraňuje, aby po aktivaci faktoru XA na analog faktoru Xa došlo k odštěpení β—peptidu z faktoru x. l ak byl získán faktor Xa, který je možno izolovat až ze 100% ve formě intaktní molekuly faktoru Xaa.
Iíito modifikaci je možno provést mutací, delecí nebo inzercí v oblasti aminokyselinové sekvence faktoru X mezi aminokyselinami v místě Arg469 a Ser476 a případně Lys370. Preferována je však taková substituce aminokyselin, která zabrání tornu, aby při výměně aminokyselin nedošlo ke změně prostorového uspořádání polypeptidu, což by mohlo dále vést kc změně struktury a jo případně i funkce aktivity daného proteinu.
Jeden způsob provedení se vyznačuje tím, že u analogu faktoru XA podle tohoto vynálezu jc provedena záměna jedné aminokyseliny na místě Arg469 a/anebo Gly470. přičemž Arg469 je přednostně zaměňován Lys, 1 lis nebo Ile a Gly470 je přednostně zaměňován Ser. Ala, Val nebo Thr.
Analogy faktoru XA podle tohoto vynálezu mohou obsahovat kromě mutace na pozici Arg469 a/anebo Gly 470 další mutaci na pozici Lys370 a/anebo Lys475 a/anebo Ser476. Substitucí aminokyselin na této (těchto) pozici(ích) se zabrání přeměně analogů faktoru Xaa na analogy faktoru Xap resp. na C koncové analogy faktoru Xa. poněvadž přirozeně se vyskytující sekvence pře40 měny (přeměn) je (jsou) modifikována (-v) tak, žc nemůže dojít k případnému autokatalytickému odštěpení karboxyterminálního peptidu.
Jiný způsob provedení sc vyznačuje tím. že je u analogů faktoru XA podle tohoto vy nálezu provedena delece karboxyterminálního β—peptidu (FXAp). Takovýto analog faktoru X je možno při45 pravit tak, že cDNA pro kódování analogu faktoru XA sc exprimuje v rekombinantním expresním systému přičemž se klonují pouze ty sekvence, které jsou kódovány pro aminokyseliny Metl až ASrgl79/lle235 až Arg469.
Další způsob provedení se vyznačuje tím. že analogy faktoru XA podle tohoto vynálezu obsahují 50 translační stop—signál v C—terminální části sekvence faktoru X. Tento translační stop- signál je přitom přednostně na pozici, která následuje za C-tcrmináhií aminokyselinou vznikající při přirozeném reakčním průběhu. Tento translační stop—signál je proto přednostně na pozici aminokyseliny 470 v sekvenci faktoru X. přičemž koncový Arg469 ve faktoru ΧΛ β zůstává zachován. Přitom kódující kodon GGC pro aminokyselinu Gly470 nahrazuje Taa, J AG nebo 1GA.
-6CZ 298296 B6
Další aspekt tohoto vynálezu sc týká analogů faktoru ΧΔ. které se aktivují působením příslušné proteázy in vitro na analogy faktoru Xa, tzn. na aktivované analogy faktoru ΧΔ. V závislosti na použitém a aktivovaném analogu faktoru XA se získá analog faktoru XA. který má na C- koně i 5 lehkého řetězce provedenou odpovídající modifikaci aminokyselin která se liší od přirozeného faktoru Xa. Iyto modifikace jsou však podle tohoto vynálezu voleny tak. aby neovlivňovaly biologickou aktivitu.
Jestliže takovýto analog faktoru X zahrnuje případně ještě translační stop—signál v C-koncové io části β—peptidu. získají se modifikované molekuly faktoru Xap. Jestliže se však použije analog faktoru X, tato modifikace (tyto modifikace) β—peptidické sekvence vede (vedou) k tomu, žc se β—peptid neoštěpí, takže analog faktoru Xact s provedenou záměnou aminokyselin na C-konci molekuly zůstane zachován.
Analogy faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu se vyznačují výhradně takovými modifikacemi, které mění specifícitu při aktivaci, avšak aktivitu významně neovlivňují. To znamená, že se získávají vždy biologicky i funkčně aktivní molekuly faktoru Xa resp. analogů faktoru Xa.
Pro aktivaci in vitro in vitro je možno volit proteázu ze skupiny endoproteáz, jako jsou 2o kcxin/Kcx2. Íurin/PACE, PC1/PC3. PC2, PC4. PACE4, LPC/PC7, ze skupiny serinproteáz, jako jsou faktor lla. faktor Vila, faktor IXa, faktor Xlla, faktor Xla, faktor X nebo kallikrein, nebo derivát těchto proteáz. V rámci tohoto vynálezu jc možno použít jakoukoli proteázu s výjimkou RVV nebo trypsinu, která je vhodná pro přeměnu analogů faktoru XA na analogy faktoru Xa.
Wolf a spol. (1991, J. Biol. Chem. 266:13726-137309) sice uvádějí, že endopeptidáza jako je Kcx2, furin nebo PÁCE se může podílet na tvorbě delečních m titan tu faktoru Xa. v žádném případě však tito autoři neuvádějí údaje o vlivu těchto proteáz při přípravě faktoru X. V patentu US 5 669 950 je popsána rekombinantní příprava PÁCE a použití proteázy pro zlepšenou tvorbu proteinů závislých na vitaminu K. V řadě výčtů jiných krevních faktorů je uveden i faktor X, w u tohoto údaje však chybí ověřující data.
V rámci tohoto vynálezu bylo poprvé jednoznačně prokázáno, že jednou z proteáz nezbytných pro proces zrání faktoru X je bibazická endoproteáza, zejména endogenně se vyskytující furin.
V prostředí in vivo zajišťuje tato endoproteáza především štěpení molekuly faktoru X s jedním 35 řetězcem na zralou formu skládající se z těžkého a lehkého řetězce. V prostředí in vitro zajišťuje tato endoproteáza kromě toho i odštěpení pro-peptidové sekvence faktoru X (příklad 2).
Podle jednoho zvláštního způsobu provedení se připraví analog faktoru ΧΔ, který existuje přednostně v čištěném stavu ve formě molekuly s jedním řetězcem. Analogy faktoru ΧΔ. které 40 v modifikované oblasti obsahují štěpné místo pro proteázy které se v rckombinantních buňkách nevyskytuje, se po expresi získají ve formě molekul s jedním řetězcem. Molekuly faktoru ΧΔ s jedním řetězcem se vyznačují zejména vysokou stabilitou a integritou molekul. Dokud nebylo možno izolovat inaktivní molekuly faktoru XA s jedním řetězcem v čisté formě, poněvadž, v rckombinantních buňkách se ve faktoru Xa vytvářela řada dalších i inaktivních intermediátú 4? (Wolfa spol. 1991, J. Biol. Chem. 266:13726 13730). Izolovaný analog faktoru ΧΛ sjedním řetězcem je možno specifickým postupem aktivovat přímo na formu analogu faktoru Xa se dvěma řetězci. Tato aktivace probíhá tak, že dojde ke styku jednořctězcovc molekuly faktoru ΧΔ se štěpnou proteázou, která se nachází v aktivovaném místě analogu faktoru ΧΛ. Jestliže dojde k expresi jednoho analogu faktoru ΧΔ s jedním furinovým aktivačním místem v jedné 5d furin—deficitní buňce, je možno izoloval analog faktoru ΧΔ v jednořetězcové formě a stykem s bibazickou proteázou. jako je furin/PACE nebo Kex2, jc možno tento analog převést na aktivní analog faktoru ΧΔ a se dvěma řetězci. Analogy faktoru ΧΔ s jedním reakční m místem pro jednu serinproteázu nebo kallikrein je možno izolovat i ve furin-exprimu jících buňkách ve formě
-7CZ 29X290 Β6 jednořetězcových molekul, které je možno pomocí serinproteázy převést na aktivní analog faktoru Xa.
Takto získaný analog faktoru Xa vykazuje díky selektivní a řízené přípravě vysokou stabilitu a strukturní integritu. Zvláště důležité je, že neobsahuje inaktivní intermedíáty analogů faktoru X/Xa a produkty autoprolcolytického odbourávání.
Analogy faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu je možno podle předloženého vynálezu získat jak ve formě faktoru ΧΔ a s intaktním β-peptidem, tak i ve formě analogů faktoru ΧΛ s dclccí tohoto β-peptidu.
Další aspekt tohoto vynálezu se týká rekombinantní DNA kódované pro analogy faktoru XA podle tohoto vynálezu. Rekombinantní DNA se získá po expresi v analogu faktoru XA s aminokyselinovou sekvencí odpovídající lidskému faktoru X. až na jednu deleci aminokyselin od Argl780 až Arg234 a jednu modifikaci, která umožňuje přeměnu a aktivaci na aktivní formu analogu faktoru Xa jak s intaktním, tak i s deletovaným β-peptidcm.
Další aspekt tohoto vynálezu se týká preparátu zahrnujícího čištěný analog faktoru XA s jednotí dclccí aminokyselin od ArglSO do Arg234 a sjednou modifikací aminokyselin v oblasti mezi Gly 173 a Artgl 79 a případně Ile235. Touto modifikací se získá nové rozpoznávací resp. štěpné místo, které se na této pozici polypeptidů v přírodě nevyskytuje, pro proteázu, která polypeptidů v případě nevyskytuje, pro proteázu, která polypeptid v tomto místě běžně nepřeměňuje. Tento preparát může přitom být čištěný preparát obsahující jednořetězcový analog faktoru ΧΔ, přičemž polypeptidy se získají buď zkultivovaného buněčného systému po izolaci ze supernatantu buněčně kultury', nebo z extraktu buněčné kultury. Předčištčný rckombinovaný analog faktoru ΧΛ získaný zkultivovaného buněčného systému je možno dále čistit známými postupy odpovídajícími současnému stavu techniky. K tomu jsou vhodné zejména chromatografické metody jako jc gelová filtrace, chromatografie na iontoměničích nebo afínitní chromatografie.
Podle jednoho provedení obsahuje získat preparát analog faktoru ΧΔ podle tohoto vy nálezu ve formě molekuly s jedním řetězcem v enzymaticky inaktivní formě, přičemž tento analog faktoru XA má čistotu minimálně 80 %, výhodně minimálně 90 %, obzvláště preferována je čistota 95 % a tento vyčištěný preparát neobsahuje žádné inaktivní proteolytické intermedíáty vznikle z analogu faktoru X/Xa.
Podle zvláštního aspektu obsahuje tento preparát jednořetězcový analog faktoru XA s modifikací, která umožňuje aktivaci na analogy faktoru Xa působením proteázy ze skupiny bazických endoproteáz, jako jsou kexín/Kex2, furin/PACE, PC 1/PC3, PC2, PC4. PACE4. LPC/PC7, ze skupiny serinproteáz, jako jsou faktor 11a. faktor Vila, faktor IXa. faktor XHa, faktor Xla, faktor X nebo kallikrein. nebo derivát těchto proteáz. Aktivace probíhá přitom při kontaktu analogu faktoru XA s odpovídající proteázou. která štěpí modifikovanou sekvenci, přičemž sc získá analog faktoru Xa.
V preparátu podle tohoto vynálezu se může analog faktoru XA vyskytovat jako faktor ΧΔα (FXAa) s intaktním β-peptidem nebo s deleci β-peptidu jako faktor ΧΔβ nebo s jinou C-terminální deleci.
Podle dalšího způsobu provedení obsahují preparáty analogů faktoru XA podle tohoto vynálezu přednostně jednořetězcové molekuly v izolované formě. Přitom se získávají na příklad rekombinantní molekuly analogů faktoru XA s jedním řetězcem s modifikací, která umožňuje provést aktivaci na analogy faktoru Xa. Tuto aktivaci analogů faktoru XA na analogy faktoru Xa je možno provést stykem analogu faktoru X s proteázou vybranou ze skupiny bibazických endoproteáz. jako jsou kexin/Kex2. furin/PACE. PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, LPT/PC7, ze skupiny
-8CZ 298296 B6 serinproteáz. jak jsou faktor Ha, faktor Vila, faktor IXa, faktor XHa. faktor Xla, faktor Xa nebo kallikrein, nebo derivát těchto proteáz. Tyto proteázy mohou být přitom imobilizovány na nosiči.
Preparáty podle tohoto vynálezu se mohou použít jako výchozí materiál pro přípravu a získávání analogů faktoru Xa. Ve velkém technologickém měřítku se přitom uvede do styku preparát obsahující jednoretězcový analog faktoru XA s případně imobilizovanou proteázou za podmínek umožfiujících optimální aktivaci analogů faktoru ΧΔ na analogy faktoru Xa, takže se získají analogy faktoru Xa. Takto získané analogy faktoru Xa je možno nakonec vyčistit pomocí všeobecně známých metod a získat tak farmaceutický preparát s definovanou aktivitou faktoru Xa.
Podle dalšího aspektu tohoto vynálezu se připraví preparát obsahující analog faktoru Xa s vysokou stabilitou a strukturální integritou, který neobsahuje inaktivní intermcdíáty analogů faktoru X/Xa, ani autoprotolytické produkty odbourávání a kléry se získá v takové formě, že umožňuje provést aktivaci na dříve popsaný analog faktoru ΧΔ a připravit lak odpovídající preparát.
Podle zvláštního provedení zahrnuje tento preparát obsahující analogy faktoru XA s jedním nebo dvěma řetězci a fyziologicky přijatelný nosič a je možno zněj případné připravit farmaceuticky preparát. Tuto přípravu jc možno provést běžným způsobem smísením s přídavkem pufru obsahujícího soli jako jsou NaCl, CaCl· a aminokyseliny jako je glycin a/anebo lysin při pH v rozmezí 6 až 8, a získat tak farmaceutický preparát. Vyčištěné preparáty obsahující analog faktoru X jc možno připravovat jako hotové roztoky. lyoHlizáty nebo hlubokozmrazené produkty skladovatelné až do doby jejich konečného použití. Skladování těchto preparátů sc přednostně provádí ve formě lyofilizátu a jejich převedení na opticky čirý roztok se provádí pomocí odpovídajícího rckonstitučního roztoku.
Preparáty podle tohoto vynálezu je možno připravit i v kapalné formě nebo ve formě hlubokozmrazené kapaliny.
Preparáty podle tohoto vynálezu jsou obzvláště stabilní, to znamená, že je možno je nechat stát v rozpuštěné formě i po delší dobu před jejich použitím. Bylo prokázáno, že u preparátů podle tohoto vynálezu nedošlo k úbytku aktivity ani po několika hodinách až dnech.
Preparáty podle tohoto vynálezu jc možno získat vc vhodném zařízení, přednostně v aplikátoru s použitím proteázy vybrané ze skupiny en do proteáz, jako jsou kexin/Kex2. furin/PACTL PC1/PC3. PC2, PC4, PÁCE 4, LPT/PC'7. ze skupiny serinproteáz, jako jsou faktor Ha, faktor Vila, faktor IXa, faktor XIla, faktor Xla. faktor Xa nebo kallikrein, nebo deriváty těchto proteáz.
Preparát podle tohoto vynálezu, obsahující analog faktoru XA v kombinaci s proteázou schopnou aktivovat analog faktoru ΧΔ na analog faktoru Xa je možno připravit jako kombinovaný produkt skládající se z nádobky obsahující proteázu imobilizovanou na nosiči, případně ve formě minikolonky nebo injekční stříkačky s imobilizovanou proteázou a z nádobky obsahující farmaceutický preparát s analogem faktoru XA. Aktivace analogu faktoru XA se provede tak, že se např. roztok s analogem faktoru ΧΔ protlačí přes imobilizovanou proteázou. Roztok obsahující analog faktoru ΧΔ se přednostně po dobu skladování preparátu ukládá odděleně od imobilizované proteázy. Preparát podle tohoto vynálezu může být uložen i vc stejné nádobce jako proteáza, ovšem je třeba, aby obě složky byly odděleny nepropustnou membránou, kterou jc možno při případném použití snadno odstranit. Tyto roztoky jc možno uchovávat i v oddělených nádobách a smísit je až krátce před jejich použitím.
Ve zvláštním provedení se jako proteáza používá pro aktivaci přírodní serinproteáza, která se podílí na přirozeném srážení krve, jako je např. faktor XIla. který nemusí byl před aplikací oddělen od aktivovaného analogu faktoru Xa a může s ním být aplikován společně.
-9CZ 298296 B6
Aktivace analogu faktoru ΧΔ na analog faktoru Xa se může provést krátce před přímým použitím tj. krátce před podáním pacientům. Tuto aktivaci je možno provést stykem s imobilizovanou proteázou nebo smísením roztoků, obsahujících jednak proteázu a jednak analog faktoru ΧΔ. Je proto možné obě složky uchovávat v oddělených roztocích a smísit je při průtoku vhodným zaří5 zením, přičemž dojde k aktivaci analogu faktoru ΧΔ na analog faktoru Xa. Pacientu jc tak podávána směs faktoru Xa a další serinprotcázy, která vyvolala aktivaci. Přitom je zvláště třeba dbát na dávkování, poněvadž nadbytečná dávka serinproteázy aktivuje i endogenní faktor X. což může způsobit zkrácení doby koagulace.
io Podle výhodné formy způsobu provedení se farmaceutický preparát dodává vc vhodném zařízení, přednostně v aplikátoru, buď v kapalnc-zmrazené formě, nebo v lyofilizované formě. Jako vhodný aplikátor je možno použít dvoukomorovou injekční stříkačku, popsanou v patentech AT 366 916 nebo AT 382 783.
Podle dalšího aspektu tohoto vynálezu obsahuje preparát podle tohoto vynálezu případně jako další složku krevní faktor (Blutfaktor) ve formě zymogenu nebo aktivní serinprotcázy. Jako další složky jsou přitom preferovány složky s FEIB-aktivitou. K těmto látkám patří zejména faktor II, faktor Vil, faktor IX, faktor Vlil, faktor V a/anebo příslušné serinprotcázy. Jako další složky mohou být použity i fosfolipidy, Ca-ionty a pod. Podle zvláštního způsobu provedení podle tolio20 to vynálezu obsahuje preparát podle tohoto vynálezu minimálně jednu další složku s FEIB—aktivitou.
Preparát podle tohoto vynálezu se může dodávat jako farmaceutický preparát s aktivitou faktoru Xa jako jednosložkový preparát nebo v kombinaci s jinými faktory'jako vícesložkový preparát.
Před zpracováním na farmaceutický preparát sc vyčištěný protein podrobuje běžné kontrole kvality a převede se na terapeuticky použitelnou formu. Při rekombinační přípravě je nutno zejména vyčištěný preparát kontrolovat, zda neobsahuje buněčné nukleové kyseliny a nukleovc kyseliny pocházející z expresního vektoru, přičemž preferovaným postupem jc postup popsaný v EP 0 714 30 987.
Vzhledem k tomu, že každý biologický materiál může být kontaminován infekčními zárodky, je nutno pro přípravu bezpečného preparátu případně provést inaktivaci virů.
Další aspekt tohoto vynálezu se týká použití preparátu výše uvedeného druhu pro výrobu léčiva. Léčivo obsahující analog faktoru XA a odpovídající aktivovaný analog faktoru X je vhodné zejména pro léčbu pacientů s poruchami srážení krve, jako jsou hcmofílici nebo pacienti, ti nichž se vyvinuly inhibující protilátky proti podávaným terapeutickým prostředkům, jako např. faktoru VIII nebo faktoru IX.
Další aspekt tohoto vynálezu se týká postupu přípravy analoga faktoru ΧΔ a preparátu obsahujícího analog faktoru XA podle tohoto vynálezu. Přitom se kódovací sekvence pro analog faktoru ΧΛ vloží do vhodného expresního systému a příslušné buňky se transfikují rekombinantní DNA. Výhodně se používají buněčné linie, které exprimují analog faktoru ΧΔ. Tyto buňky sc kultivují 45 za optimálních podmínek pro expresi genu a analog faktoru X sc izoluje buď z extraktu buněčné kultury, nebo zc supematantu buněčné kultury. Rckombinované molekuly je možno dále čistit pomocí všech známých chromatografícký postupů, jako jsou anexová, katexová, afinitní nebo imunoafinitní chromatografie nebo kombinací těchto metod.
Pro přípravu analogu faktoru XA podle tohoto vynálezu sc klonuje úplná cDNA pro kódování faktoru X v expresním vektoru. To se provádí podle všeobecně známých způsobů klonování. Nukleotidová sekvence kódující faktor X sc nakonec modifikuje tak, že se kódující sekvence pro aminokyseliny Argl80 až Arg234 vyštěpí a aminokyseliny v oblasti mezi Gly 173 a Arg 179, případně IIe235 se změní tak, aby se získaly molekuly faktoru X výše popsaného druhu. To se pro- 10C7. 298296 B6 vádí známými genově-technickými metodami odpovídajícími aktuálnímu stavu techniky, jako jsou řízená mutagenczc in vitro. delece sekvencí, např. restrikčním odstraňováním pomocí endonukleáz, vkládáním jiných pozměněných sekvencí nebo pomocí PCR. Takto připravené mutanty faktoru XA se potom vkládají a exprimují do expresního systému vhodného pro rekombinantní expresi.
Analogy faktoru ΧΔ podle tohoto vynálezu je možno připravovat i chemickou syntézou.
Analogy faktoru XA sc výhodně připravují rekomb i nauční expresí. Genové-technickou přípravu je možno provádět pomocí veškerých dostupných expresních systémů, jako jsou např. permanentní buněčné linie nebo virální expresní systémy. Permanentní buněčné linie sc připraví stabilní integrací cizí DNA (Fremd-DNA) do chromozomu hostitelské buňky např. z Věro, MRC5, CHO. BHK. 293. Sk-Help, zejména z jater nich buněk a buněk ledvin, nebo pomocí cpisomálního vektoru odvozeného např. z viru Papilloma. Rovněž je možno použít virální expresní systémy, jako jsou např. Vaccinia Virus, Baculovirus nebo retrovirální systémy. Jako buněčné linie je možno obecně použít Věro, MRC5, CHO, BHK, 293, Sk-Hcpl, žlázové (Drůsen ), jaterní a ledvinové buňky. Jako cukaryotické expresní systémy Je možno použít i kvasinky; endogenní žlázy (např. žlázy transgenních zvířat) a jiné buněčné typy. Transgcnní zvířata je možno samozřejmě použít i k expresi polypeptidu podle tohoto vynálezu nebo jeho derivátů. Pro expresi rckombinantních proteinů se osvědčily speciální buňky CHO DHFR (Urlaub a spol.. Proč. Nati. Acad. Sci.. USA. 77:4216-4220. 1980).
Pro rekombinantní přípravu analogu faktoru XA podle tohoto vynálezu jc možno použít i prokaryotické expresní systémy. K tornu jsou vhodné zejména systémy, které umožňují expresi v E. coli nebo B. subtilis.
Analogy faktoru XA se exprimují v odpovídajících expresních systémech řízených vhodnými promotory. Při expresi v eukaryontech jsou vhodné všechny známé promotory, jako jsou SV40-, CMV-, RSV , HSV-. EBV-. β-aktin, hGH nebo indukovatclnc promotory jako jsou např. hsp . nebo metallothioncinový promotor. Preferovaná je exprimace analogů faktoru X řízená β-aktinovým promotorem v CHO-DHFR buňkách.
Podle jednoho způsobu provedení tohoto vynálezu zahrnuje postup přípravy preparátu podle tohoto vynálezu následující kroky: přípravy DNA pro kódování analogu faktoru XA, transformace buňky s rekombinantní DNA. exprese analogu faktoru X, případně za přítomnosti proteázy. izolace analogu faktoru X a případné čištění pomocí chromatografie.
Podle jednoho způsobu provedení tohoto vynálezu se analog faktoru Xa izoluje přímo jako molekula skládající sc zc dvou řetězců. Přitom se analog faktoru XA s modifikací, která umožňuje provedení úpravy pomoci bibazieke proteázy jako je furin. v buňce exprimuje a analog faktoru XA se převede na analog faktoru Xa se dvěma řetězci. Jako buňka se používá přednostně buňka, která exprimuje proteázu vhodnou pro provedení této přeměny, jako je bibazická proteáza jako je furin nebo jeho derivát. Pro zvýšení resp. pro zlepšení účinnosti této přeměny je případně možno buňky modifikovat tak. aby exprimovala proteázu vc zvýšené míře. To je možno provést např. ko-expresí příslušné bibazieke endoproteázy, jak oje furin/PACE, Kex2 nebo odpovídajícím derivátem. Analog faktoru XA podle tohoto vynálezu je možno rovněž exprimovat v buňce, která vykazuje normální nebo suboptimální endogenní koncentraci proteázy pro přeměnu a proto probíhá neúplná přeměna na dvou řetězcovou aktivní formu. Následující přeměna na analogy faktoru Xa probíhá, proud se secernujc v supernatantu buněčné kultury jednořetězcový analog faktoru X jak bylo popsáno dříve ko—kultivací s buňkami exprimujícími proteázu nebo při styku s proteázou případně v i mobilizovaném stavu. Buněčný supernatant je možno přečerpat přes nosnou matrici, na níž je navázána proteáza, přičemž se v eluátu získá dvouřetězcový analog faktoru Xa.
Takto získaný analog faktoru Xa je možno nakonec izolovat, vyčistit a až do příštího použití, jako bylo popsáno dříve, případně upravený na farmaceutický preparát a ve stabilizovaném stavu uskladnil. Odborník muže být problémů v závislosti na pokusném uspořádání a reakčních podmínkách provést optimalizaci reakčních podmínek pro přeměnu a aktivaci. Obzvláštní význam přitom má doba styku a rychlost průtoku reakčních složek. Hodnoty průtoku by se mely pohybovat v rozmezí 0,01 ml/min a 1 ml/min. Dalšími důležitými parametry jsou teplota, hodnota pH a eluční podmínky. Po průtoku mohou být analogy faktoru Xa případně dále čištěny selektivními chromatografickými metodami. Provedení tohoto postupu s proteázou navázanou na nosiči jc výhodné proto, že uspořádání reakce s použitím nosiče, přednostně v chromatografickc koloně, umožňuje provedení dalších čisticích operací.
Podle jednoho způsobu provedení se aktivace provádí jedním chromatografiekým postupem, přičemž proteáza je zmobilizována na nosiči. Čištěny analog faktoru XA s jedním řetězcem se přitom vede přes matrici, na nížjc navázána proteáza a zcluátu se potom izoluje vyčištěný analog faktoru Xa.
Podle jednoho aspektu tohoto vynálezu sc preparát, obsahující aktivní analog faktoru Xa, získá tak. že se analog faktoru ΧΔ připravený výše uvedeným způsobem podrobí přcmčne/aktivaci a aktivovaný polypeptid se dále zpracuje na vyčištěný preparát, případně upravený jako farmaceutický preparát.
Podle dalšího aspektu přípravy preparátu obsahujícího analog faktoru XA s jedním řetězcem se analog faktoru XA s řídicí sekvencí pro b i bazickou proteázu exprimuje v buňce s endoproteázovou deficiencí. Tato buňka přitom přednostně vykazuje deficicnci b i bazické endoproteázy, jako je kexin, furin, PÁCE nebo jejich homology. V jedné takové endoproteáza-deficientní inutantní buňky je možno izolovat analog faktoru ΧΔ ve formě jednořetězcové molekuly . Analogy faktoru ΧΛ obsahující procesní místo pro serinprotcázu se mohou expriniovat v jakékoliv běžné buňce, i v purin-pozitivní buňce a izolovat ve formě jednořetězcových molekul.
Takto izolovaný a případně přečištěný analog faktoru X se nakonec uvede do styku s proteázou vybranou ze skupiny endoproteáz, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PCI/PC3, PC2, PC4, PACE4. EPC/PC7. ze skupiny serinproteáz. jako jsou faktor 11a, faktor Vila, faktor IXa, faktor Xlla. faktor Xla, faktor X nebo kallikrein. nebo s derivátem těchto proteáz za podmínek, při nichž se analog faktoru X s jedním řetězcem rozštěpí na analog faktoru Xa a aktivuje sc.
Pii použití analogů faktoru XA aktivovaných výše uvedeným postupem na analogy faktoru Xa se získají analogy faktoru Xa s vysokou stabilitou a strukturní integritou, které přitom neobsahují inaktivní intennediáty faktoru X/Xa.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. I: Nukleotidové a aminokyselinová sekvence faktoru X
Obr. 2: Schematické znázornění analogu faktoru XA s modifikovaným štěpným místem pro proteázy (Proteázen Sehnittstelle)
Obr. 3: Schematické znázornění expresního vektoru ppAct-rRE
Obr. 4. Westernblooting-analýza rFaktoru X c.xprimovaného v CHO-bunkách před a po ampli fikaci
Obr. 5: Westernblotting-analýza rFaktoru X po in vitro—štěpení furinovými deriváty
- 12 C7. 298296 B6
Obr. 6: Westemblotting-analýza molekul rFaktoru X exprimovaných v buňkách obsahujících a neobsahujících furin
Obr. 7: Schematické znázornění analogu rFaktoru ΧΔ s pozměněným C koncem těžkého řetězce
Obr. 8: Schematické znázornění N-konce produktu přeměny rFaktoru X z CHO-. C11O/rFurin- a z furindeflcitních buněk.
Obr. 9: Westcrnbnlotting-analýza rFaktoru X RVIR', exprimovancho v CHO- buňkách
Obr. 10: Westerbnlotting-analýza rFaktoru XRVIR1 p0 jn vitro aktivaci furinovým derivátem.
Tento vynález je blíže popsán v dále uvedených příkladech a obrázcích, přičemž tento vynález se však neomezuje pouze na tyto zvláštní příklady provedení.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1 popisuje konstrukci a expresi rFaktoru X; příklad 2 popisuje úpravu těžkého a lehkého řetězce rFaktoru X f urinem; příklad 3 popisuje postup pro získání pro-faktoru X pomocí i mobilizované proteázy; příklad 4 popisuje aktivitu rFaktoru X připraveného in vitro; příklad 5 popisuje expresi rFaktoru X ve furin—deficítních buňkách; příklad 6 popisuje konstrukci a expresi analogu rFaktoru ΧΔ; příklad 7 popisuje stanovení produktů přeměny faktoru X na N-konci; příklad 8 popisuje expresi a charakterizaci FX-analogu s místem (Stelle) Arg-Val-Thr-Arg/llc (rFXkVIIÍ'); příklad 9 popisuje in vítro-aktívaci tohoto rFXKVIk'-proteinu pomocí derivátu rFurinu.
Expresní vektory byly připraveny běžnými způsoby klonovány (Maniatis a spol.: „Molecular Cloning“ - A Laboratory Maiiuak Cold Spring Harbor. New York. USA, 1983). Příprava DNA-fragmentů pomocí polymerasové reakce (Polymcrasc-Ketten-Rcaktion - PCR) byla provedena obecnými metodami (Clackson a spol., 1991, PCR A practical approach. ED. McPherson, Quirkc, Taylor, S. 187-214).
Příklad 1
Exprese a převedení jednořetězcového rFX na rFX s lehkým/tězkým řetězcem
a. Příprava rFX-expresního vektoru
Pro přípravu rekombinantního FX (rFX) byla izolována cDNA z FX z lidské jaterní lambda cDNA-banky (Leber Lambda-cDNA-Ban), jak uvedli Mcsseir a spol. (1991, Gene 99:291-294). Z pozitivního klonu byl pomocí PCR s oligonukleotidem #2911 (5-ATT ACT CGA GAA GCT TAC CAT GGG GCG CCC ACTG-3') (SEQ.ID.Nrl) jako 5'-primerem a oligonukleotidem #2912 (5-ATTACAATTGCAGGGATCCAC-3') (SEQ ID. Nr. 2) jako 3-prinicrcm ampliíikován DNA-fragment, který' obsahoval 1,467 kB FX—kódující sekvenci a dále 39 bp 3'-nctranslatovanou oblast, a který byl atakován v místě štěpení Xhol na 5' konci a v místě štěpení Mfel na 3-konci. Kromě toho byla působením primerů #2911 vložena sekvence ACC před A FX v FX, takže vznikla optimální Kozak-translačně-inicializační sekvence. Nakonec byl tento PCR-produkt klonován jako Xhol/Mfel-fragment v expresním vektoru se Sall a EcoRl. Vzniklý expresní plazmid byl označen jako phAet-rFX (Obr. 3). Expresní vektoru phAct zahrnuje lidský beta-actin-proniotor. 78Bp 5'UTR a rovněž intron. násobné klonovací místo štěpení a SV40polyadenylační místo.
- 13 CZ 298296 Β6
b. Exprese rFX v CHO-buňkách
Pro získání stabilní buněčné linie pro expresi rFX byly ko-transfekovány dhfr—deílcitni 5 CHO-buňky s expresním plazmidem phAct-rFX a selektivním markerplazmidem pSV-dhfr. Při všech dalších expresních a funkčních analýzách byly buněčné kultury s bezsérovým selektivním médiem inkubovány za přítomnosti 10 μ^/ml vitaminu K po dobu 24 hodin. Exprese rFX ve vzniklých buněčných klonech byla prokazována pomocí protilátky (EE1SA, Asserachrom, Boehringer Mannheim) a rekombinantní protein byl potom charakterizován pomocí SDS-PAGE 10 (obr. 4A a Β). V počátečních klonech i v subklonechje rekombinantní FX-protein ve formě lehkého řetězce (LC) 22 kD a těžkého řetězce (HC) o cca 50 kD, které jsou identické s plasmatickým proteinem faktoru X. jak vyplývá z Westernblotting-analýzy (Obr. 4Λ). Kromě toho z pásu proteinu při 75 kD vyplývá, žc tento pás odpovídá (SC)-molekule s jedním řetězcem, jejíž přítomnost byla popsána v FX -transfekačních CHO-buňkách (Wolf a spol. J. Biol. Chem. 15 266:13726-13730. 1991) a rovněž v lidské plazmě (Fair a spol, Blood 64:194-204, 1984). Pro přípravu vysoce exprimujících klonů byly počáteční klony amplifikovány se stoupajícím množstvím mcthotrexátu a nakonec subklonovány až do stabilizace. Expresi bylo možno zvýšit z cca 200 až 500 ng/10E6 buněk resp. 1 pg/ml na 78 ^ig/10E6 buněk resp. 120 pg/nil za 24 hodin.
Westernblotting-analýza těchto vysoce exprimovaných buněčných klonů (obr. 4B a obr. 5A, 20 záznam 2) vykazuje obohacení jednořetězcových rFX-molekul a rovněž přítomnost dalších forem v lehkém řetězci. Vedle 22 kD-formy v lehkém řetězci, která odpovídá formě v plazmě (úplně karboxylovaná a bez propeptidu), jsou přítomny ještě při další varianty lehkého řetězce s 21 kD, 22,5 kD a 20 kD. Heterogenita lehkého řetězec v těchto klonech může být způsobena vytváření N-terminálních sekvencí v rekombinantním materiálu na neúplně odštěpený propeptid 25 (v tomto případě: ca 50% materiálu rFX) a rovněž nedostatečným stupněm karboxylacc (Untercarboxylierung) (v tomto případě: 50 % rFX). 21 kD-protcin je nedostatečně karboxylovaná forma lehkého řetězce obsahující propeptid a 20 kD-protein je nedostatečně karboxylovaná forma lehkého řetězce neobsahující propeptid, zatímco 22.5 kD pás představuje úplně karboxylovanoU LC-formu obsahující propeptid.
Příklad 2
Přeměna rFX na rFX lehký/těžký řetězec působením rFurinového derivátu.
Vzhledem k podobnosti štěpných míst mezi faktor X-propcptidcm/N koncem lehkého řetězce (RVTR A) a mezi lehkým/těžkým řetězcem (RRKR S) s rozpoznávací sekvencí furinu (Furin-Konsensus -Erkennungssequenz), (RXK/RR X) Se naskytla možnost pro zlepšení přeměny jak jednořctčzcovc. tak i propeptid—obsahu j ící rFX-molekuly působením rFurinového to derivátu in vitro. V literatuře byly pro oba způsoby přeměny navrženy proteázy, které však neměly k furinu žádný vztah (Rehemtulla a spol.. 1992, Brood 79:2349-2355: Wallin a spol.. 1994. Tromb. Res. 1994: 395-403).
Supematanty buněčných kultur CHO-rFX a CHO rFurin THóxlIis (přihláška vynálezu 45 EP 0 775 750) a rovněž CHO-rFX a netransfekované CHO (jako negativní kontrola) byly smíšeny v poměru 1:1a inkubovány při teplotě 37 °C. V alikvotních podílech reakční směsi byl pomocí Westernblotting-analýzy sledován obsah přeměněného rFX před inkubaci (t=0) a po různých dobách inkubace (t= 2, 4, 6 hodin) (obr. 5). Důkaz rFX v supematantu buněčných kultur byl prováděn pomocí a nt i humánního FX-antiséra (obr. 5Λ) resp. monoklonální protilátka spec i5o Fické pro lehlý řetězec FX (obr. 5B).
Na rozdíl od směsi CHO-rFX/CHO vykazovala směs CHO-rFX/CHO-rFurin již po dvou hodinách inkubace při teplotě 37 °C (obr. 5A. záznam 7; Obr. 5B záznam 8) téměř úplnou přeměnu. Jednořctczcový rFX je v převážné míře převeden na formu lehkého a těžkého řetězce. V oblasti 55 lehkého řetězce byly však ještě nalezeny přeměněné bezpropeptidové formy 22 kD (karboxylo- 14CZ 298296 B6 váná forma) a 20 kD (nedostatečně karboxylovaná forma) v poměru 50 : 50. Optimalizací podmínek buněčné kultury je možno tento poměr posunout v prospěch karboxylové formy. Správné odštěpování pro-sckvence mezi Arg-1 a Ala+1 a homogenita N-konce lehkého řetězce byly stanovovány pomocí N-terminálního vytváření sekvencí. Při srovnávacím pokusu, při němž byly smíscny CHO-rFX sc supernatanty CHO nebyly ani po 6-hodinové inkubaci prokázána žádná změna rFX-pásů (obr. 5A. záznam 5; obr. 5B, záznam 6). Bylo tak prokázáno, že rFurin v supcrnatantu CHO-buněk je biologicky aktivní a že je možno uskutečnit jak přeměnu propeptidu. tak i lěžkého/lehkého řetězce rFX.
Příklad 3
Přeměna faktoru X pomocí rFurinu imobilizováného na chelát-tentakelgelu
Pro zjištění, zda je možno substrát štěpit rFurinovým derivátem vázaným v chromatografické koloně bylo při jednom experimentálním uspořádání zjišťováno, zda je možno tak matrici v koloně namísto Ni2 -NTA-agarosy použít Fructogel EMDR Tentakelgel (Fa.Měrek). Kovové ionty jsou v tomto případě v porovnání s Ni“-NTA-agarosou prostorově více vzdáleny od vlastní matrice v koloně, což by mohlo zlepšit stařičkou přístupnost vázaného rFur i nového derivátu. Při tomto pokusném uspořádání byl profaktor X získán pomocí rFurinového derivátu vázaného na Tentakelgel následujícím způsobem:
Do Fractogel EMD- Tentalekgelu byly podle předpisu připraveny zakotveny Ni2 ionty a získaný mateirál byl ekvilibrován s bezsérovou buněčnou kulturou. Nakonec byl na kolonu zakotven CHO-rFurinový derivát. Promývání bylo prováděno bezsérovou buněčnou kulturou obsahující stoupající koncentraci imidazolu až na 40 mM. Nakonec byl pres tuto kolonu veden profaktoru X jako bezsérový CHO-supematant. Pomocí Westernblotting-analýzy sc specifickým faktorem X-antiscrcm byla po průtoku kolonou prokázána přeměna profaktoru X na faktor X sc dvěma řetězci.
Příklad 4
Aktivita rekombinantního faktoru X připraveného in vitro
Rekombinantní prckurzor faktoru X byl inkubován při teplotě 4 °C s rFurinem a bez rFurinu. Po určitých intervalech byly odebírány vzorky a zmrazovány na teplotu -20 °C. Po ukončení inkubace (po 4 dnech) byla u všech vzorků sledována FX—aktivita pomocí sady FX-Coatest Kit (Fa.Chromogcnix). Přitom bylo vždy 50 μΙ supernatantu smísenos 50 μΙ FX-deficitního lidského plazmatu a podle předpisu výrobce byl rFX přídavkem hadího jedu (RVV) za přítomnosti CaCE převeden na rFXa; rFXa hydro lyžoval nakonec chromogenní substrát (S—2337), přičemž došlo k uvolnění žlutého paranitroanilinu. Množství rFXa a intenzita barvy jsou vzájemně úměrné, což umožňuje stanovit množství rFXa aktivovatelncho v rFX/ml buněčném supernatantu pomocí kalibrační přímky interpolované podle hodnot zřed ovací řady v plazmatu. Z těchto výsledků a ze známého množství rFX-antigenu (E EISA-data) je možno vypočíst procentuální podíl r Faktoru X aktivovatelného na faktor Xa. Získané výsledky jsou uvedeny v Tabulce 1.
Aby bylo možno vyloučit nespecifickou proleolytickou aktivitu CHO—, CIIO-rFurinovvch supernatanlů. byla vyhodnocována i směs těchto obou supernatantů buněčných kultur.
CHO-rFX inkubovaný s CHO-supernalanty (bez rFurinu) jako kontrolní vzorek nevykázal po dnech žádnou podstatnou změnu aktivity fFXa, která v rozmezí experimentálních chyb byla cca
800 niU/ml, což odpovídalo 50 až 60 % funkčního rFX. Pro porovnání byl CHO-rFX inkubován s CHO-rFurinem. přičemž byl po dobu inkubace zjištěn konstantní nárůst rFX—aktivity z cca
60% (čas T=0) na 86% (Tabulka 1). Tím bylo prokázáno, že in vitro úpravou CHO rFX
- 15 CZ 298296 B6
7. vysoce exprimo váných klonů pomocí derivátu rFurinu se podstatně zvyšuje podíl rFX akt i v ovatě 1 něho na funkční rFXa.
Tabulka 1
| Inkubace, dny | Aktivj ta. mU | Množství ani igenu, gg/ml | Funkční podíl rFX, % | |
| CHO-rFXř | 0 | 814 | 14 | 58 |
| CHO | 1 | 847 | 14 | 61 |
| 2 | 835 | 14 | 60 | |
| 3 | 790 | 14 | 56 | |
| 4 | 763 | 14 | 55 | |
| CH0-rFX+ | 0 | 853 | 14 | 61 |
| CHO-rFurin | 1 | 1018 | 14 | 73 |
| 2 | 1099 | 14 | 49 | |
| 3 | 1135 | 14 | 81 | |
| 4 | 1198 | 14 | 86 | |
| CHO + CHO-rFurin | 0 | |||
| Plasma FX 500 mU | 585 |
Příklad 5 io
Exprese rekombinantního faktoru X vc furin-deficitních buňkách
Jak bylo uvedeno v předcházejících příkladech, dochází u prekurzorového proteinu faktoru X působením furinu in vitro jak k odštěpení propeptidu, tak i ke štěpení jednoduchého řetězce na 15 lehký/těžký řetězec. Z toho vyplývá, že tyto kroky mohou být s různou účinností uskutečněny i endogenně v buňkách působením všudepřítomného furinu v závislosti na množství příslušného exprimovaného fFakturu X. Tímto postupem s dále získá směs heterogenních forem rFaktoru X.
Jednou z možností, jak získat maximálně homogenní a přitom stabilní formu molekul rFaktoru X. 20 je zabránit štěpení rFaktoru X endogenními proteázami, zejména íurinem, a tak získat funkčně inaktivní prekurzor rFaktoru X (který je možno pozdější úpravou průtokem kolonou převést na funkčně aktivní formu, pokud možno přímo před použitím).
Tento postup je obzvláště výhodný pří přípravě FX-delečních mutantú, které obsahují namísto 25 původního aktivačního místa místo štěpíteIné furinem (Furin-Spallstelle). U těchto látek (konstruktů) je možno provést aktivaci těchto rekombinantních rFX-mutantů in vivo působením endogenního furinu a sekrecí aktivovaných nestabilních rFX forem. Degradací těchto forem CHO-proteázami. např. v buněčných kulturách s vy sokou buněčnou lýzoii při skladování supernatantu buněčné kultury nebo pomocí čisticích postupů je možno získal inaktivní produkty 30 odbourání (Wolf a spol.. 1991).
-16CZ Z9829Ó B6
Tohoto cíle Je možno dosáhnout např. přídavkem činidel, která snižují nebo blokují intraceliilární furinovou aktivitu, do buněčné kultury.
Jinou možností je apriorní použití furin-deficitních buněk (Móhringa spol., 1983, Infect. Immun. 41:998-1009; Ohniski a spol.. 1994, J. Virol. 68:4075-40791 Gordon a spol.. 1995, Infect. Immun, 63:82 87).
Při tomto postupu byl furin—deficitní CHO-buněčný klon FD11 (Gordon a spol., 1995. Infect. 10 Immun. 63:82-87) ko-transfekován s 20 pg phAct-FX a 1 gg pUCSV-neo (s obsahem neomycin-rezistcntního genu v pUC vektoru za kontroly SV40-promotoru). Pro získání stabilního klonu bylo toto médium suplcmcntováno 0,8 μ« G418/ml. Při porovnání molekul rFaktoru scccr· novaného v bezsérovém supernatantu CHO klonů s obsahem a bez obsahu furinu bylo pomocí Wcstcrnblottinganalýzy prokázáno, že ve furindeficitních buňkách nedocházelo k přeměně pre15 kurzoru rFaktoru a byl přítomen pouze jednořctčzcový prekurzor faktoru X (obr. 6): naproti tomu sc rFaktor X z „normálních“ buněk při mírnější (modeste) expresi přeměňoval ještě úplně, při vyšší expresi sc přes přítomnost endogenního furinu přeměňoval pouze v omezené míře. Vzhledem k velmi nízkému stupni exprese rFX u použitého buněčného klonu není lehký řetězce rFaktoru X při Blolting analýze vidět.
Příklad 6
Příprava analogů faktoru X (podle vyjádření přihlašovatele jde v současné době o nejlepší způsob provedení podle tohoto vynálezu)
6.1 Konstrukce expresních plazmidů pro přípravu FX-deleČních mutantů
Deleční mutanty faktoru X se od „divokého typu“ sekvence faktoru X liší delecí aktivačního peptidů o velikosti cca 4,5 kDa mezi aminokyselinami 180 až 234. Kromě toho jc možno mutagenezí v C koncové části lehkého řetězce a/anebo v N-koncové části těžkého řetězce vkládat různá štěpná místa sloužící pro aktivaci takto vzniklých jednořetězcových molekul faktoru X na 35 aktivovaný polypeptid. Expresní plazmidy pro tyto deleční mutanty faktoru X jsou vždy odvozovány od phAct-FX (popsaného v příkladu 1).
Pro zjednodušení klonování delečních mutantů faktoru X byl DNA-fragment HindlII—Neal z plazmidu phAct-FX, obsahující kódování faktoru X od pozice f 1 až do +1116, vložen do 4o Hindllll/Smal-restrikčních štěpných míst plazmidu plICI9. Takto získaný plazmid byl označen jako plJC/FX. Pro deleci aktivačního peptidů a vložení nových štěpných míst, např. fur i nových, nebo FXIa- FXIla-, Fxa . Fila-štěpných míst byl DNA-fragmcnt Bspl201/BstXi FX z pUC/FX-vektoru nahrazen syntetickým oligonukleotidem. Pro vložení trombin- nebo FXlaŠtčpného místa byla přečnívající sekvence BstXI-3' vyhlazena pomocí MungBeanovy nukleázy, 45 takže bylo možno provést i výměnu aminokyseliny Ile na pozici 235. Potom byly deletované
DNA-fragmenty faktoru X v plazmidu pAct-FX klonovány pomocí Hindi II-A gel.
Pro přípravu Asp Phe Thr-Arg/Via FXla-štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0009 (5-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG GAC ITC ACC AGG GTG-3' (SEQ ID Nr. 3) 50 a oligonukleotid antisens ti 0010 (5'-CAC CCT GG I GAA GTC CTG TTT CCC ACA GGG
GTA G-3') (SEQ. ID. Nr. 4) a vložen do Bsp místa a do BstXl-místa upraveného Mung Beánovou nuklcázou. Tímto způsobem byl provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 na Asp-Phe- I hr a Val (Obr. 2A).
- 17L/_ zvazvo B6
Pro přípravu Arg/Thr Flla-štčpncho místa byl použit oligonukleotid sens #0011 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ACC CTG GAA CGG ACC-3' (SEQ ID Nr. 5) a oligonukleotid antisens #0012 (5' GGT CCG TTC CAG GGT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ ID Nr 6) a vložen do Bspl201-místa a do BstXI-místa upraveného Mung Beánovou nukleázou. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyseliny Ile na pozici 235 na Thr (Obr 2B).
Pro přípravu He-Lys-Pro-Arg/IIe EXHa-štěpeného místa byl použit oligonukleotid sens #0013 (5'-GG CCC TAG CCC TGT GGG AAA CAG ATC AAG CCC AGG ATC-3' (SEQ ID. Nr. 7) a oligonukleotid antisens # 0014 (5'-CT GGG CTT GAT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ ID: Nr. 8) a vložen do Bspl 201 - a do BstXI-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178na Ile-Lys -Pro (Obr. 2C).
Pro přípravu Ser-Met-Thr-arg/IIc kallikrein -štěpného místa byl použit oligonukleotid send # 0015 (5' GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG ATG ACC AGG ATC 3' (SEQ. IDNr. 9) a oligonukleotid #0016 (5'-CT GGT CAT GCT CTG I IT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID Nr. 10) a vložen do Bsp a BstXI-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminoky selin na pozici 176 až 178 na Ser Met-Thr (Obr. 2D).
Pro přípravu Met-Lys-Thr-Arg/lle FXa štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0033 (5'-GG CCC 1AC CCC TGT GGG AAA CAG ATG AAA ACG AGG ATC-3' (SEQ. ID. Nr. 11) a oligonukleotid antisend # 0034 (5'-CT CGT 11 I CAT CTG TTT CCC’ ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. Nr 12) a vložen do Bsp 1201 a do BstXI-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 zThr-Leu Glu na Met-Lys-Thr (obr. 2E).
Pro přípravu Ile-Glu-Gly-Arg/Ile FXa-štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0035 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ATC GACi GGA AGG ATC-3' (SEQ. ID. Nr. 13) a oligonukleotid antisens # 0036 (5'-CT TCC CTC GAT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. Nr. 14) a vložen do Bsp 1201 a do BstXI-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 z Thr-Lcu-Glu na Ile-Glu-Cíly (Obr. 2F).
Pro přípravu Arg-Arg-Lys-Arg/Ile furin štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0017 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG AGG AAG AGG ATC-3' (SEQ. ID. Nr. 15) a oligonukleotid antisens #0018 (5'-C’T CTT CCT CCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. Nr. 16) a vložen do Bspl201— a clo BstXI-místa. 'Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 na Arg-Arg-Lys (Obr. 2G).
Pro přípravu Arg-Val-Arg-Arg/lle furin-štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0019 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG GTG AGG AGG ATC-3' (SEQ. ID. Nr. 17) a oligonukleotid antisens # 0020 (5' CT CCT CAC CCT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. Nr. 18) a vložen do Bspl20l a do BstXI-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 na Arg-Val-Arg (Obr. 2G).
Pro přípravu Arg Arg Arg-Arg/Ile furin-štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0021 (5' GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG AGG AGG AGG ATC-3' (SEQ. ID. Nr. 19) a oligonukleotid antisen # 0022 (5'-CT CCT CCT CCT CTG I IT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID Nr. 20) a vložen do Bspl201- a do BstXI-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 na Arg-Arg-Arg (Obr. 2G).
Pro přípravu Arg-Pro-Lys-Arg/llc furin štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0023 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG CCC AAG AGG ATC-3'
CL ZWSZW) BÓ (SEQ. ID. Nr. 21) a oligonukleotid antiscns # 0024 (5'-CT CTT GGG CCT CTG TTT CCC
ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. Nr. 22) a vložen do Bsp 1201- a do BstXl-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 na Arg-Pro-Lys (Obr. 2G).
Pro přípravu Ile-Arg-1.ys- Arg/lle furin-stěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0025 (5MJG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ATC AGG AAG AGG ATC-3' (SEQ, ID.Nr. 23) a oligonukleotid antisens # 0026 (5'· CT CTT CCT GAT CTG TTT CCA ACA GGG GTA G—3') (SEQ. ID. Nr. 24) a vložen do Bsp 1201— a do BstXl-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 na Ile-Arg-Lys (Obr. 2G).
Pro přípravu Arg-Scr-Lys-Arg/He furin štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0027 (5' GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG AGC AAG AGG ATC-3' (SEQ. ID. Nr. 25) a oligonukleotid antiscns ti 0028 (5'-CT CTT GCT CCT CTG T Γ T CCC ACA GGG GTA G 3') (SEQ. ID. Nr. 26) a vložen do Bsp 1201- a do BstXl-místa, Tímto způsobem i? byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 na Arg-Ser- Lys (Org. 2G).
Pro přípravu Arg-Val-Thr-Arg/lle furin—štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0029 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG GTC ACT AGG ATC-3' (SEQ. ID. Nr. 27) a oligonukleotid antisens # 0030 (5-CT CGT GAC CCT CTG TTT CCC 20 ACA GGG G1A G-3') (SEQ. ID. Nr. 28) a vložen do Bsp 1201- a do BstXl-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 na Arg -Val-Thr (Obr. 2G).
Pro přípravu Arg-Leu-Lys- Arg/lle furin-štěpného místa byl použit oligonukleotid sense # 0031 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG AGG CTG AAA AGG ATC-3' 25 (SEQ ID.Nr. 29) a oligonukleotid antisense # 0032 (5'-CT TTT CAG CCT CTG TTT’ CCC
ACA GGG GTA G-3' (SEQ. ID. Nr. 30) a vložen do Bsp 1201- a do BstXl-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 na Arg a Lys (Obr. 2G).
Pro přípravu Pro-GIn-Glv-Arg/lle EXa štěpného místa byl použit oligonukleotid sens 0037 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG CCC CAA GGA AGG ATC-3' (SEQ. ID. Nr, 31) a oligonukleotid antisens // 0038 (5'-CT TCC TTG GGG CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') (SEQ. ID. Nr. 32) a vložen do Bsp 1201 - a do BstXl-místa. Tímto způsobem byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 z Thr-Lcu-Glu na Pro-GIn-Gly (Obr. 211).
Pro přípravu Thr-Scr-Thr Arg/lle ΓΧHa--štěpného místa byl použit oligonukleotid sens ti 0039 (5'-GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ACG AGC1 ACG AGG ATC-3' (SEQ. ID.Nr. 33) a oligonukleotid antisens # 0040 (5'- CT CGT GCT CGT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G 3') (SEQ. ID. Nr, 34) a vložen do Bsp 1201- a do BstXl-místa. Tímto způso40 bcm byla provedena mutace aminokyselin na pozici 176 až 178 na Ser-Thr (Obr. 21).
Pro přípravu Arg/lle trypsin-štěpného místa byl použit oligonukleotid sens # 0041 (5' GG CCC TAC CCC TGT GGG AAA CAG ACC CTG GAA CGG ATC-3' (SEQ. ID. Nr. 35) a oligonukleotid antisens # 0042 (5'-CG TTC CAG GGT CTG TTT CCC ACA GGG GTA G-3') 45 (SEQ. ID. Nr. 36) a vložen do Bsp 1201-a do BstXl -místa (Obrj. 2J).
Získané expresní plaztnidy (viz obr. 3) zahrnují lidsky buta-aktinovy promotor, 78 bp 5'UTR, beta—aktin—intron. modifikovanou sekvenci faktoru X a dále 39 bp 3'UTR a polyadenvláční místo SV40.
5(1
- 19</. Λ/σζ,νυ do
6.2 Konstrukce expresních plazmidu pro přípravu ΕΧβ-analogů
Tyto konstrukty jsou odvozeny od konstruktů dříve uvedených analogů faktoru X V do nichž byl vložen jeden TGA-stop-kodon na pozici 470. Přitom byly aminokyseliny od pozice 457 až ke 5 stop-kodonu odstraněny natrávcní (Verdau) působení Spěl a částečně BstEII a nahrazeny oligonukleotidovým párem #0003 (5 -GTC ACC GCC TTC CTC AAG TGG ATC GAC AGG TCC ATG AAA ACC AGG TGA A-3') (SEQ ID. Nr, 37) a #004 (5'- CTA GI T CAC CTG GTT TTC ATG GAC CTG TCG ATC CAC TTG AGG AAG GCG-3') (SEQ, ID. Nr. 38). Schematické znázornění tohoto konstruktu analogu faktoru ΧΔ β jc uvedeno v obr. 7. Pro zjednodušení 10 vyobrazení jsou všechny konstrukty analogu faktoru ΧΔ β znázorněny jako obecný konstrukt, v němž jsou proměnlivé aminokyseliny v oblasti místo štěpení znázorněny jako stínové “X.
6.3 Konstrukce expresních plazmidu pro přípravu FXAa analogů
Aktivací faktoru X odštěpením 4,5 kDa-aktivačního peptidu na C-konci těžkého řetězce vznikne Xaa-forma faktoru. Tato forma se potom přemění působením autoproteolytieke aktivity a odštěpením C-konce těžkého řetězce mezi Arg469 a Gly470 na formu Ρ’Χοβ. Pro přípravu expresních plazmidů faktoru X vedoucích k tvorbě analogů faktoru ΧΔ. které se po aktivaci vyskytují výhradně ve formě FXaa s intaktním β-peptidem, byla provedena záměna ani i noky seči) liny Arg469 na Lys, takže nemohlo docházet k žádné přeměně na C konci těžkého řetězce.
Proto byla DNA-sekvence faktoru X kódující C-koncovou sekvenci aminokyselin odstraněna od pozice 1363 až ke stop-signálu částečným naštěpením pomocí BstEII-Spěl a nahrazena dvěma vaznými oligonukleotidovými páry. Oligonukleotid # 005 (5 -GTC ACC GCC F I C CTC AAG 25 TGG A TC GAC AGG TCC A TG ΑΛΑ ACC AAG GGC TTG CCC AAG-3') (SEQ. ID. Nr. 39) a oligonukleotid #0006 (5'-TTG GCC TTG GGC AAG CCC TTG GTT TTC ATG GAC CTG TCG ATC CAC TTG AGG AAG GCG-3' (SEQ. ID. Nr. 40) by ly ligovány s oligonukleotidcni #0007 (5M3CC AAG AGC CAT GCC CCG GAG GTC A FA ACC TCC TCT CCA TTA AAG
TGA GAT CCC A-3' (SEQ ID Nr. 41) a oligonukleotidem # 008 (5 -CTA GIG GGA TCI 30 CAC TTT AAT GGA GAG GAC GTT ATG ACC TCC GGG GCA TGG CTC 3') (SEQ II) Nr. 42). Mutace aminokyseliny Arg469 byla provedena oligonukleotidovým párem #0005 #0006. Schematické znázornění FXA-analogu jc uvedeno v obr. 7.
Příklad 7
Stanovení N -konce faktoru X a produktů jeho přeměny s rFurincm a bez rFurinu
Rekombinantní faktor X byl exprimován v CHO-buňkách s endogenním fúrinem, jak bylo 40 popsáno v příkladu 1, resp. ve furin deficitních buňkách, jak bylo popsáno v příkladu 5. Izolace rFaktoru X byla provedena jednak za) předběžně neupravené b) inkubované 12 hodin při 37 °C ac) 12 hodin při 37 °C s CHO-rFurincin upravené buněčné kultury vysoce cxprimujícího CHO-rFX-klonu a jednak zd) předběžně neupravené a e) 12 hodin při 37 °C s CHO-rFurincm upravené buněčné kultury7 klonu CHO-FD11-fRX. Vzniklá N-koncová aminokyselina faktoru X 45 a produktů přeměny při reakčních podmínkách a) až e) byla stanovena Edmanovou analýzou.
V obr. 8 je uvedeno schematické znázornění výsledků.
rFaktor X z vysoce exprimujících CHO-buněk se vyskytuje ve formě zralého těžkého a lehkého řetězce a rovněž v jednoretězcové formě, která částečně obsahuje propeptid. Po kultivaci této 50 buněčné kultury po dobu 12 hodin při 37 °C (b) vznikají navíc, jak popsali již Wolfa spol. (1991.
J. Bio.. Chem. 266:13726-13730). chybné N-koncovky lehkého řetězce rFX s třemi aminokyselinami Val38-Thr39 -Arg40. Tyto kryptické konce byly nalezeny i při sekvenování rFX-materiálu z neupravených CHO-FDl 1 -buněk (d). Z těchto porovnání vyplývá, žc výskytu těchto chybných N-koncových je možno zabránit minimalizací rFX proteolýzy působením CHO
-20CL Z9W290 B6 proteáz. Jestliže se použijí vhodné reakční nebo buněčné podmínky, odpovídající způsoby skladování a odpovídající čisticí postupy.
Na rozdíl od čištěného materiálu z CHO-buněk (a a b) je rFX z neamplifikovaných furindefícit5 nich buněk (d) přitom pouze vc formě neupraveného jednořctčzcovcho prekurzoru. Neby ly nalezeny ani žádné N-koncové sekvence, které by odpovídaly podílu propeptidu. Tím bylo prokázáno, že úprava jednořetězcového prekurzoru fFX v lehkém/těžkém řetězci ve furin—deficitních CHO-buňkách (d) již neprobíhá, což ukazuje na hlavní roli endoproteázy furinu v tomto operačním kroku probíhajícím in vivo. Dodatečně bylo prokázáno, že přeměna fFX-molekul 10 obsahujících propeptid probíhá i ve furirwlcficilních CHO-buňkách. takže furin nemá při úprav v podmínkách in vivo žádnou podstatnou úlohu. Po inkubaci rFX z CHO-buněk (c) a z CHOFC11-buněk (e) za přítomnosti furinu byly nalezeny lehké a těžké řetězce se správnými N-konci. Tím bylo prokázáno, že jak jednořetězcové prekurzory FX, tak i rFX molekuly obsahující propeptid se při zpracování in vitro přeměňují na homogenní zralý faktor X. Faktor X připravený i? za přítomnosti furinu vykazoval kromě toho mimořádnou integritu struktury.
Příklad 8
Exprese a charakterizace rekombinantního delečního mutantu FX s místem štěpení Arg-ValThr Arg/TIe (FXARV,R')
Expresní plazmid, kódující deleční mutanty FX s místem štěpení Arg-Val-Thr-Arg/Hc (FXARVIRI) byl, jak bylo uvedeno v Příkladu 1, ko-transferován se selekčním markérem 25 pSV/dhfr do dhfr—deficitních CHO-buněk. Rekombinantní protein FXARVIRI z permanentních CHO-buněk. Rekombinantní protein FXARVIRI z permanentních HO-klonů byl charakterizován pomocí Westernblotting-analýzy. Jak vyplývá z obr. 9, záznam 4, vystupuje tento rekombinantní protein ve formě dvojitého pásu s cca 56 a 50 kD. V buněčných kulturách netransferovaných CHO-bunčk nebyl žádný FX-rcaktivní materiál detegován (záznam 2). Tylo výsledky vylučují. 30 že by tyto proteinové pásy odpovídaly znečištění analyzovaného supernatantu divokým typem FX ze zbytků hovězího séra v buněčném médiu. Je proto pravděpodobné, že dvojité pásy mohou souviset s různými posttranslačními modifikacemi, např. přítomností propeptidu nebo rozdílnou glykosylací molekuly rFXARVIR I
Štěpné místo Arg-Val-Thr-Arg/llc zavedené do tohoto konstruktu jc identické s propeptidovým štěpným místem divokého typu molekul FX. které bylo účinně rozpoznáno a rozštěpeno in vivo působením CHO-cndoprotcázy (viz příklad 7). Westernblotting analýza neprokázala žádné další 35 kD-resp. 31 kD těžké FX-molckuly, které by odpovídaly aktivovaným a- a β-formám těžkých řetězců rFXARVIRI Tyto výsledky nasvědčují tomu, žc buď nebylo množství endoproteázy 40 pro aktivaci proteinu dostatečné, a/anebo tomu, že štěpné místo Arg-Val-Thr-Arg/lIe v uvedených sekvencích není in vivo rozlišeno vůbec nebo je rozlišeno nedostatečně rFXARVil<l se proto vyskytuje prakticky výhradně v jednořetězcové formě.
Příklad 9
Aktivace rekombinantního proteinu rFXARV,RI pomocí rekombinantních tur i nových derivátů ín vivo
Místo štěpení Arg-Val-Thr-Arg v rFX-propeptidu in vivo sice bylo prokázáno pomocí jiné proteázy než je furin, v příkladu 2 však bylo uvedeno, že tato sekvence se in vitro velmi účinně a správným způsobem štěpí rFurinovým derivátem.
Vyhodnocování aktivovatelnosti rFXARViR '-proteinu působením rFurinu in vitro bylo provedeno pomocí směšných experimentů. Při nich byl k supernatantu kultury buněk Cl 10- FXAkVlkl přidán rFurinový derivát rFurinu Cys-Spacer-lOxHis (viz přihláška vynálezu EP 0 775 750 Λ2) za přítomnosti 20 mM Hepes. pH 7,0, 150 mM NaCl, 4 mM CaCl· a 0,1 % BSA v poměru 1 : 1. Při kontrolním pokusu byl supematant CHO- rFXAKVIk'! smísen ve stejném poměru pouze s pufrem obsahujícím BSA. Přídavek BSA má sloužit pro stabilizaci enzymatické aktivity rFurinového derivátu a vznikajících aktivovaných produktů rFXARV,Rl. Průběh přeměny rFXARV,KI byl sledován pomocí Wcstemblotting-analýzy v alikvotních podílech reakční směsi a před a po inku· bační době 6, 24, 48 a 72 hodin (t“(), t-6. t“24. t“72) při teplotě 37 °C (obr. 10). V pokusu bez přídavku rFurinu (obr. I0B) není ve spektru pásů v průběhu inkubačni doby patrná žádná změna (záznam 4 až 9). Vzhledem k přítomnosti BSA v reakční směsi jsou dobře viditelné pouze lehčí molekuly rFXAkVlk 1 (50 kD), molekuly 56 kD jsou překryty pásy BSA.
Za přítomnosti rFurinového derivátu (obr. 10A) sc objevil již po inkubačni době 6 hodin (záznam 5) proteinový pás odpovídající 35 kD, který odpovídá α-forntě FX-těžkého řetězce (viz záznam 9). Tento protein se v průběhu inkubace akumuluje a nakonec se - jako jc známo u plazmy FX přeměňuje na proteolytickou β formu (záznam 7 a 8). Současně s detekcí aktivovaných forem těžkého řetězce byly delegovány lehké řetězce 22 kD a 20 kD. které byly v Příkladu l.b identifikovány jako karboxylovaná LC2 forma neobsahující propeptid (což vlastně odpovídá funkční formě) resp. jako nedostatečně karboxylovaná LC4-forma neobsahující propeptid. Přítomnost nedostatečně karboxylovaná LC4-formy potvrzuje, že v analyzovaných CHO klonech jsou posttranslační mechanismy modifikace omezeny. 50 kD-pás sc sice jeví jako neměnný, zatímco zdánlivě se 56 kD-forma přímo odbourává na lehké/těžké řetězce, ve skutečnosti však dochází ktomu, že 56 kD-molekula se nejprve přeměňuje na 50 kD-fonnu a teprve potom se štěpí na lehký a těžký řetězec. 1 o je způsobeno přítomností propropeptidu v 56 kDmolekule, který se odstraňuje za vzniku 50 kD-formy.
Tímto bylo prokázáno že rFXARVIR-konstrukt je aktivovalelný prostřednictvím zabudovaného štěpného místa Arg-Val-Thr-Arg/Ile působením rFurinového derivátu in vitro a že velikost vzniklých produktů přeměny konstruktu rFXAKViR 1 odpovídá plazmový produktům FXa. Přítomnost FXAB. vznikajícího autoproteolytiekvm průběhem reakce z FXAa, ukazuje na funkcionalitu molekuly rFXAiíV|k l.
Sekvenční protokol (1) Všeobecné údaje (i) Přihlašovatel:
(A) Jméno: IMMUNO AG (B) Ulice: Industriestrasse 67 (C) Místo: Wicn (D) Spolková země: Rakousko (E) Země: Rakousko (F) PSČ: 1220 (A) Jméno: Friedrich Dorner (B) Ulice: Peterlinigasse 17 (C) Místo: Wtcn (D) Spolková země: Rakousko (E) Zcmč: Rakousko (F) PSČ: 1238 (Λ) Jméno: Falko Guenthcr Falkner
- 22 CZ 298296 Β6 (Β) Ulice: Mannsdorf 116 (C) Místo: Manndorf (D) Spolková země: Rakousko (E) Země: Rakousko (F) PSČ: 2304 (A) Jméno: Michele Himmelspach (B) Ulice Breitsietien 19 (C) Místo: Eeopoldsdorf (D) Spolková země: Rakousko (E) Země: Rakousko (F) PSČ: 2285 (A) Jméno: Michael Pfleider (B) Ulice: Johanu Ncstroygasse 12/16 (C) Místo: Gross-Enzersdorf (D) Spolková země: Rakousko (E) Země: Rakousko (F) PSČ: 2301 (A) Jméno: Uwe Schlokat (B) Ulice: Haupstrassc 51 (C) Místo: Orth/Donau (D) Země: Rakousko (F) PSČ: 2304 (A) Jméno: Johanu Eibl (B) Ulice: Gustav Tschcrniakgassc 2 (C) Místo: Wein (D) Spolková země: Rakousko (E) Země: Rakousko (F) PSČ: 1180 (ii) Název vynálezu: DelcČni mutanty faktoru X a jejich analogy (iii) Počet sekvencí: 44 (iv) Počítačem čitatel né znění:
(A) Nosič dat: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC compatible (C) Pracovní systém: PCDOS/MS - DOS (D) Software: Patent In Release # 1.0, Vcrsion # 1.30 (EPA) (2) Údaje k sekvenci ID NO: I:
(i) Data sekvence (A) Délka: 34 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: I:
ATTACTCGAG AAGCTTACCA TGGGGCGCCC ACTG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 2:
(i) Data sekvence (A) Délka: 24 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 2:
ATTACAATTG CTGCAGGGAT CCAC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 3:
(i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 3:
GGCCCACCC CTGTGGGAAA CAGGACTTCA CCAGGGTG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 4:
(i) Data sekvence (A) Délka: 34 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 4:
CACCCTGGTG AAGTCCTGTT TCCCACAGGG GTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 5:
(i) Data sekvence
4? (A) Dclka: 38 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec
- 24 CZ 298296 B6 (D) Topologie: lineami (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 5:
GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGACCCTGG AACCCACC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 6:
(i) Data sekvence (A) Délka: 34 párii bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 6:
GGTCCGTTCC AGGGTCTGTT TCCCACAGGG GTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 7:
(i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 7:
GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGATCAAGC CCAGGATC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 8:
(i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 8:
CTGGGCTTGA TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG
C7. 298296 B6 (2) Údaje k sekvenci ID NO: 9:
(i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězec: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 9:
GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGCATGA CCAGGATC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 10:
(i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 10:
.. CTGGTCATGC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 11:
(i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 11:
GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGATGAAAA CGAGATC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 12:
(i) Data sekvence (A) Délka: 30 páru bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA
- 26 CZ 298296 B6 (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 12:
CTCGTTTTCA TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 13:
(i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) T opologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA i? (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 13:
GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGATCGAGG GAAGGATC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 14:
2o (i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 14:
CTTCCCTCGA TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 15:
(i) Data sekvence (A) Délka: 38 párii bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) T opologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 15:
GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGAGGA AGAGGATC
-27CZ 298296 B6 (2) Údaje k sekvenci ID NO: 16:
(i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 16:
CTCTTCCTCC TCTGTTTCCC acaggggtag (2) Údaje k sekvenci ID NO: 17:
(i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 17:
GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGGTGA GGAGGATC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 18:
(i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 18:
CTCCTCACCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 19:
(i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA
-28CZ 298296 B6 (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 19:
GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGAGGA GGAGGATC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 20:
(i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů hází (B) Druh: nukleotid io (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 20:
CTCCTCCTCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 21:
(i) Data sekvence (A) Délka: 38 párii bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 21:
GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGCCCA AGAGCATC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 22:
(i) Data sekvence (A) Délka: 30 páru bázi (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězce (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 22:
CTCTTGGGCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 23:
(i) Data sekvence
- 29 CZ 298290 B6 (A) Délka: 38 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 23:
GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGATCAGGA AGAGGATC io (2) Údaje k sekvenci ID NO: 24:
(i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 24:
CTCTTCCTGA TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 25:
(i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie; lineami (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 25:
GGCCCGACCC CTGTGGGAAA CAGAGGAGCA AGAGGATC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 26:
(i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) lopologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 26:
- 30 CZ 298296 B6
CTCTTGCTCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 27:
(i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Gcnom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 27:
GGCCCTACCC CTGTGGGAA/X CAGAGGGTCA CGAGGATC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 28:
(i) Data sekvence (Λ) Délka: 30 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly : Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 28:
CTCGTGACCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 29:
(i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 29:
GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGAGGCTGA AAAGGATC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 30:
(i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 30:
CTTTTCAGCC TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 31:
(i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 31:
GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGCCCCAAG GAAGGATC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 32;
(i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 32:
CTTCCTTGGG GCTCTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 33:
(i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom· DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 33:
GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGACGAGCA CGAGGATC
CZ 298290 B6 (2) Údaje k sekvenci ID NO: 34:
(i) Data sekvence (Λ) Délka: 30 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 34:
CTCGTGCTCG TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 35:
(i) Data sekvence (A) Délka: 38 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 35:
25 GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGACCCTGG AACGGATC (2) IJdaje k sekvenci ID NO: 36:
(i) Data sekvence (A) Délka: 30 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 36:
CGTTCCAGGG TCTGTTTCCC ACAGGGGTAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 37:
(í) Data sekvence (A) Délka: 49 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA
- jj CZ 298296 B6 (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 37:
GTCACCGCCT TCCTCAAGTG GATCGACAGG TCCATGAAAA CCAGGTGAA (2) Údaje k sekvenci ID NO: 38:
(i) Data sekvence (A) Délka: 48 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 38:
h CTAGTTCACC TGGTTlTCAT GGACCTGTCC ATCCACTTGA GGAAGGCG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 39:
(i) Dala sekvence (A) Délka: 57 páru bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 39:
GTCACCGCCT TCCTCAAGTG GATCGACAG TCCATGAAAA CCAAGGGCTT
GCCCAAG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 40:
(i) Data sekvence (A) Délka: 57 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA
4o (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 40:
TTGGCCTTGG GCAAGCCCTT GGTTTTCATG GACCTGTCGA TCCACTTGAG
GAAGGCG (2) Údaje k sekvenci ID NO: 41:
-34CZ 29829b B6 (i) Data sekvence (Λ) Délka: 55 párii bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 41;
GCCAGAGCC ATGCCCCGGA GGTCATAACG TCCTCTCCAT TAAAGTGAGA TCCCA (2) Údaje k sekvenci ID NO: 42:
(i) Data sekvence (A) Délka: 54 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (xi) Popis sekvence: sekvence ID NO: 42:
ctagtgggat ctcactttaa tggagaggac GTTATGACCT CCGGGGCATG GCTC (2) Údaje k sekvenci ID NO: 43:
(i) Data sekvence (A) Délka: 1467 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Forma řetězce: jednotlivý řetězec (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: Genom-DNA (ix) Znak:
(A) Jméno/khc: CDS (B) Poloha: 1..1467
Claims (43)
Hide Dependent
translated from
Claims (43)
Hide Dependent
translated from
1’ ATÉN Γ O V É NÁROKY
1. Analog faktoru ΧΔ, zahrnující jednu deleci aminokyselin Argl80 až Arg 234 v aminokyselinové sekvenci faktoru X a jednu modifikaci v oblasti aminokyselinové sekvence mezi Gly 173 a ίο Argl 79.
2. Analog faktoru ΧΔ podle nároku 1, kde modifikace představuje místo přeměny pro proteázu. která za přírodních podmínek sekvenci faktoru X na tomto místě neštěpí.
15 3. Analog faktoru XA podle nároku I nebo 2. kde tato modifikace spočívá ve výměně minimálně jedné aminokyseliny v oblasti aminokyselinové sekvence mezi Gly 173 a Argl 79, vztaženo na číslování aminokyselin podle obr. 1.
4. Analog faktoru XA, podle některého z nároku 1 až 3, který obsahuje sekvenci faktoru X
20 zahrnující Gly 173-R6-R5-R4-R3-R2-Argl79/R 1(235), kde
a) R1 je aminokyselina vybraná ze skupiny Val, Ser, Thr, líc nebo Ala
b) R2 jc aminokyselina vybraná ze skupiny Glu. Thr, Pro, Gly, Lys nebo Arg
c) R3 je aminokyselina vybraná ze skupiny Leu, Phe. Lys, Met, Gin, Glu. Ser, Val, Arg nebo Pro
d) R4 je aminokyselina vybraná ze skupiny Thr. Asp, Asn, líc. Ser. Met. Pro Arg nebo Lys
c) R5 je aminokyselina vybraná ze skupiny Asn, Lys, Ser, Glu, Gin, Ala. His nebo Arg a
f) R6 je aminokyselina vybraná ze skupiny Asp. Phe, Thr, Arg, Leu nebo Ser.
3? 5. Analog faktoru ΧΔ podle některého nároku 1 až 4. ve kterém lato modifikace představuje místo přeměny pro proteázu vybranou ze skupiny endoproteáz, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE, PC1/PC3, PC2, PC4. PACE4, LPC/PC7, ze skupiny, serinproteáz, jako jsou faktor Ha, faktor Vila, faktor IXa. faktor XHa, faktor Xlajakoje faktor X nebo kallikrcin, nebo derivát těchto proteáz.
-40CL ZV3ZV0 HO
6. Analog faktoru XA podle některého z nároků 1 až 5. který' se vyskytuje jako jednoretězcová molekula v enzymaticky inaktivní formě.
7. Analog faktoru XA podle některého z nároků 1 až 6. ve kterém tato modifikace umožňuje 5 aktivaci inaktivního polypeptidů jednořetězcového analogu faktoru X na dvouřetězcovou aktivní formu analogu faktoru Xa.
8. Analog faktoru XA podle některého z nároků 1 až 7. který zahrnuje další modifikaci v oblasti C-koncové aminokyselinové sekvence faktoru X.
9. Analog faktoru ΧΔ podle nároku 8, vc kterém je tato modifikace provedena v C-koncovc části β-peptidickcho štěpného místa.
10. Analog faktoru ΧΔ podle nároku 9, vc kterém tato modifikace představuje mutaci, deleci 15 nebo vložení v oblasti aminokyselinové sekvence faktoru X mezi pozicí aminokyseliny Arg469 a Ser476.
11. Analog faktoru ΧΔ, podle některého z nároků 8 až 10, ve kterém tato modifikace zabraňuje odštěpení β-pcptidu.
12. Analog faktoru XA podle nároku 8, který' zahrnuje deleci β peptidů faktoru X.
13. Analog faktoru ΧΔ podle nároku 12, který zahrnuje translační stop-signál v oblasti C-konce sekvence faktoru X.
14. Analog faktoru ΧΔ podle nároku 13. který zahrnuje translační stop-signál na pozici aminokyseliny Lys470 sekvence faktoru X.
15. Analog faktoru ΧΔ podle některého z nároků 1 až 14, ve kterém tato modifikace umožňuje 30 v oblasti aminokyselinové sekvence mezi Cíly 173 a Arg 179 in vitro aktivaci inaktivního analogu faktoru X na aktivní analog faktoru X.
16. Analog faktoru XA podle nároku 15, ve kterém tato modifikace umožňuje aktivaci působením proteázy vybrané ze skupiny endoproteáz, jako jsou kexin/Kcx2, furin/PACE, PCI/PC3,
35 PC2. PC4. PACE4. LPC/PC7. ze skupiny scrinprotcáz, jako je faktor 11a, faktor Vila, faktor IXa.
faktor Xlla, faktor Xla, faktor X nebo kalIikrein, nebo derivátu těchto proteáz.
17. Analog faktoru ΧΔ podle některého z nároků I až 16. který· obsahuje intaktní β-peptid a vyskytuje se jako faktor Xa.
18. Analog faktoru XA podle některého z nároků 1 až 16. který zahrnuje deleci β-pcptidu.
19. Rekombinantní DNA. kódující analog faktoru XA podle některého z nároků I až 18, obsaženo na vektoru pro rekombinantní expresi kódovaného proteinu.
20. T ransformovanc buňky, obsahující rekombinantní DNA podle nároku 19.
21. Preparát pro přípravu a získávání analogů faktoru Xa, obsahující čištěný analog faktoru ΧΛ, zahrnující jednu deleci aminokyselin Argl80 až Arg234 v oblasti aminokyselinové sekvence
50 faktoru X a jednu modifikaci v oblasti aminokyselinové sekvence mezi Gly i 73 a Arg 179.
22. Preparát podle nárok 21, v y z n a č u j í c í se t í m . že obsahuje jcdnořetězcový analog faktoru ΧΔ v enzymaticky inaktivní formě o čistotě minimálně 80 %, výhodně 90 %, obzvláště výhodně 95 % a že neobsahuje Žádné inaktivní proteolytické intermediáty analogu faktoru X/Xa.
-41 Lá zvbzvd tsn
23. Preparát podle některého z nároku 21 nebo 22, v y z n a č u j í c í se tím, že obsahuje analog faktoru ΧΔ jako faktor X a.
24. Preparát podle některého z. nároku 21 nebo 22, v y z n a č uj í c í se t í m , že obsahuje analog faktoru ΧΛ jako faktor X β.
25. Preparát podle některého z nároků 21 až 24. v y z n a č u j í c í se t í m , že obsahuje analog faktoru ΧΔ vc formě jednořetězcové molekuly v izolované formě.
26. Preparát podle některého z nároku 21 až 25, vy z n a č u j í c í se log faktoru ΧΔ s vysokou stabilitou a strukturní integritou molekuly.
tím. že obsahuje ana
27. Preparát podle některého z nároku 21 až 26, v y z n a č u j í c í se t í m , že obsahuje analog faktoru ΧΔ, vykazující modifikaci umožňující in vitro aktivaci analogu faktoru X na analog faktoru Xa.
28. Preparát podle některého z nároků 21 až 27, v y z n a č u j í c í se t í m , že je formulován jako farmaceuticky preparát.
29. Preparát podle nároku 28. v y z n a č u j í c í se t í m , že je uložen ve vhodném zařízení, přednostně v aplikátoru, v kombinaci s proteázou vybranou ze skupiny endoproteáz, jako jsou kexin/Kex2, furin/PACE. PC1/PC3, PC2. PC4, PACE4. LPC/PC7. zc skupiny serinproteáz, jako jsou faktor 11a, faktor Vila, faktor IXa, faktor XIla, íáklor XIa, faktor X nebo kallikrein, nebo derivátem těchto proteáz.
30. Preparát podle nároku 29. vyznačující se t í m . žc jednotlivé složky jsou vzájemně prostorové odděleny.
31. Preparát obsahující čištěný analog faktoru Xa s vysokou stabilitou a strukturní integritou, který neobsahuje zejména inaktivní intermediáty analogů faktoru ΧΔ/Xa a produkty autoprotcolytického odbourávání, a který jc získáte lny aktivací analogu faktoru XA podle některého z nároků 1 až 20.
32. Preparát podle nároku 31. vyznačující s c t í m , že obsahuje aktivní analog faktoru Xa v izolovaném stavu ve formě dvou řetězcových molekul.
33. Preparát podle některého z nároku 31 nebo 32,vyznačující se t í m . že obsahuje aktivní analog faktoru Xa o čistotě minimálně 80 %, výhodné 90 %. obzvláště výhodně 95 % a že neobsahuje žádné inaktivní prolcolytické intermediáty analogu faktoru X/Xa.
34. Preparát podle některého z nároků 31 až 33, v y z n a č u j í c í sc tím, že obsahuje nosič ve fyziologicky akceptovatelné formě a je v dlouhodobě pro skladování stabilní formě.
35. Preparát podle některého / nároků 21 až 34,vyznačující se t í m , že obsahuje případně jako další složku krevní faktor nebo aktivovanou formu krevního faktoru.
36. Preparát podle nároku 35, vyznačující se tím, že obsahuje jako další složku minimálně jednu složku s faktor Vili bypassovou aktivitou.
37. Preparát podle některého z nároku 21 nebo 36, v y z n a č u j í c í se tím, žc je formulován jako farmaceutický preparát.
38. Použití preparátu podle některého z nároků 21 až 37 pro výrobu léčiva.
-42CJ. ZV8Z9Í) B6
39. Použití preparátu podle některého z nároku 21 až 37 pro výrobu léčiva pro léčbu pacientů s poruchami srážení krve, jako jsou pacienti trpící hemofilií, u nichž se vyvinuly inhibiční protilátkv.
40. Způsob přípravy preparátu, obsahujícího čištěný rekombinantní analog faktoru ΧΔ, vyznačující se tím, žc analog faktoru ΧΔ, získaný rekombinantní přípravou se izoluje jako jednořetězcová molekula a čistí se chromatografickyrn postupem.
io
41. Způsob podle nároku 40, v y z n a č u j í c í se t í m , že zahrnuje následující kroky: příprava nuklcovc kyseliny pro kódování analogu faktoru ΧΔ podle některého z nároků I až 18 transfekace vhodné buňky exprese analogu faktoru ΧΔ
15 - izolace jednoretězcového analogu faktoru ΧΔ a čištění polypeptidu.
42. Způsob přípravy preparátu, obsahujícího aktivní analog faktoru X a, vyznačující sc tím, že se preparát, připraveny podle některého z nároku 40 nebo 41, podrobí aktivačnímu
20 kroku.
43. Působ podle nároku 42, v y z n a č u j í c í se tím. že se preparát, obsahující jednořetězcový analog faktoru ΧΔ, uvede do styku $ proteázou vybranou ze skupiny endoproteáz, jako jsou kcxin/Kcx2, furin/PACE, PCI/PC3, PC2, PC4, ΡΑ0Έ4, LPC/PC'7. ze skupiny serin proteáz. jako
25 jsou faktor 11a. faktor Vila, faktor IXa. faktor Vila, faktor Xla, faktor X nebo kallikrein, nebo derivátem těchto proteáz, za podmínek umožňujících štěpení na dvou řetězcovou formu analogu faktoru Xa.
44. Způsob podle nároku 43,vyznačující s c t í m , že tato proteáza je imobilizovaná.
45. Způsob podle některého z nároků 41 až 44, vy zn a č u j í c í sc t í ni, že se získá vyčištěný analog faktoru Xa s vysokou stabilitou a strukturní integritou, který zejména neobsahuje inaktivní intermediáty analogu faktoru ΧΔ/Xa.