JPH11512621A

JPH11512621A - トロンビン抑制剤の解毒薬としてのトロンビンムテイン

Info

Publication number: JPH11512621A
Application number: JP9528173A
Authority: JP
Inventors: ラディッチュマーティン; フリートリヒトーマス; ボルシュヴァイラークラウス; シュミットマーティン; ヴォルフガングヘフケンハンス; シュヴェーデンユルゲン; リュープザーメンクラウス
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1996-02-12
Filing date: 1997-02-11
Publication date: 1999-11-02
Also published as: BR9707280A; NO983677L; ZA971107B; CN1211280A; NO983677D0; IL125077A0; DE19605126A1; KR19990082479A; WO1997029198A1; US6060300A; CO4600682A1; CA2245546A1; CZ247798A3; EP0880591A1; HUP9900574A2; HRP970077A2; AR005797A1; AU1768497A

Abstract

(57)【要約】天然トロンビンと比べて配列中で次の違い：（ａ）ＧｌｙのＡｌａでの置換、このＧｌｙは配列環境Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ中に存在し、天然のヒトプロトロンビン（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）中の位置５５８を占めている；（ｂ）次の残基の少なくとも１個の置換又は欠失：（ｂ１）配列環境Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ中に存在し、天然のヒトプロトロンビン（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）中の位置３６３を占めているＨｉｓ；（ｂ２）配列環境Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ中に存在し、天然ヒトプロトロンビン（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）中の位置４１９を占めているＡｓｐ；（ｂ３）配列環境Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ中に存在し、天然ヒトプロトロンビン（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）中の位置５２５を占めているＳｅｒを有するトロンビンムテイン。

Description

【発明の詳細な説明】トロンビン抑制剤の解毒薬としてのトロンビンムテイン本発明は、新規トロンビンムテイン、その製造及びトロンビン抑制剤の解毒薬としてのその使用に関する。直接的トロンビン抑制の原理に従って作用する抗凝血薬は、抗血栓治療のために重要性が増大している。抗凝血薬の広い用途にとって必須の条件は、緊急の出血性副作用、例えば腹膜、心膜、胸膜の領域での出血を抑制するために、過剰適用の場合の分解障害又は排泄遅延の作用を中和する可能性である。ヘパリンの場合には硫酸プロタミン、ポリリジン及び血小板第４因子が高い有効性の解毒薬として提供されるが、今日、ヒトにおける使用のために好適であるトロンビン抑制剤の中和のための解毒薬はない。文献中に種々の解毒原理が記載されている。ファリード（Fareed）は、活性血漿フラクシヨン、例えばオートプレックス製剤又はヒルジンの中和のための原理としてのＦＥＩＢＡを記載しているが、これらはトロンボプラスチン類似の活性の故に、中和のためには不適当である（Fareed,Fed Proc 1989;3:A 328;Walenga Sem.Thromb.Hemost.1989;15:316-333）。マークワルト(Markwardt；Thrombosis Reseach,Vol.74,No.1,pp 1-23)は、トロンビン及びトロンビン誘導体の使用を記載している。この例は、−トロンビン、トロンビン−２−マクログロブリン−コンプレックス及びメイゾトロンビン（ Meizothrombin）である。ヒルジンを中和するための化学的に失活されたトロンビン、例えばＤＦＰ−トロンビン又はベンゾイル−トロンビンの使用も記載されている(Markwardt,Pharmazie 1989;44;648 649)。しかしながら、これらの製剤は、凝固活性の故に及びヒルジンに対する１０００分の１の低い親和性の故に、ヒトでの使用のための解毒薬としては不適当である(F.Doyl in Methods Enzymol; Vol．222,pp 299ff,Moriata in Methods Enzym ol; Vol．80，pp 303 ff,Stone et al．Biochemistry; 1987,26,4617-4624，Mar kwadt,Pharmazie; Vol．44，1989,pp648-649). ヒトプロトロンビンは公知であり、フリーツナー(Friezner)等により記載されている(Biochemistry，Vol．22，1983，pp 2089 2097)。ヒトプロトロンビンのアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４にも挙げられている。文献中には、ヒトトロンビン配列に関する種々の番号の付け方があるので、特に断りのない限り、以後、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４に関する番号の付け方を使用する。遺伝子操作法で製造された酵素的に不活性のトロンビンは、レンツ(Lentz)等により記載されている(Lentz et al，JBC;Vol 266，No 15,pp 9598-9604)。ここでは、触媒分解に必要な２０５の位置（ＳＱＥＩＤＮＯ：１４中の位置５２５）のセリン残基をアラニンで置換して、合成基質及び天然基質フィブリノーゲンに対して分解活性を有しないが、トロンビン抑制剤ダンシルアルギニン−Ｎ−（３−エチル−１，５−ペンタンジイル）アミドに対して低い結合親和性を有する酵素的に不活性なトロンビン変性体にしている。ストーン（Stone）等の研究(Biochemistry;Vol 30，6392-6397)から、天然のトロンビン変性体ＱｕｉｃｋＩＩが公知である。ＱｕｉｃｋＩＩ−トロンビンは、天然のトロンビンとは２３８の位置（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４中では５５８の位置）で異なっているだけである。ここでは、天然のトロンビン中に存在するグリセリン基２３８が疎水性基バリンに変異されている。この酵素のＰ１ −ポケット内での僅かな交換が、フィブリノーゲンの明らかに減少された分解率（当初の活性の２％）及び同時に低分子量基質及びヒルジンの結合性の著しい低下をもたらす。ストーンは、このムテインのヒルジンに対する結合定数が１０００分の１以下にも低下することを示しており、このことは結合ポケットの立体的ブロッキングによっても、活性中心の周りの立体的改造によっても説明できる。従来公知のトロンビンムテインは、トロンビン抑制剤への低すぎる親和性を有するか又はフィブリノーゲン上に高すぎる結合性及び酵素的活性を有するので、トロンビン抑制剤の解毒薬としては好適ではない。従って、酵素的に充分に不活性で、トロンビン抑制剤への良好な結合性を有し、同時に天然の基質フィブリノーゲンと非変性トロンビンよりは低い活性で結合する新規トロンビンムテインを提供する課題が存在した。本発明の課題は、天然のトロンビンに比べて次の配列中の違いを有するトロンビンムテインにより達成されることが判明した：（ａ）ＧｌｙをＡｌａで置換、その際、このＧｌｙは配列環境Ｔｙｒ−Ｇｌｙ− Ｐｈｅ中に存在し、天然のヒトプロトロンビン（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）中で位置５５８を占めている；（ｂ）次の残基の少なくとも１個の置換又は欠失：（ｂ１）配列環境Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ中に存在し、天然のヒトプロトロンビン（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）中の位置３６３を占めているＨｉｓ；（ｂ２）配列環境Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ中に存在し、天然のヒトプロトロンビン（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）中の位置４１９を占めているＡｓｐ；（ｂ３）配列環境Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ中に存在し、天然のヒトプロトロンビン（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）中の位置５２５を占めているＳｅｒ。この新規トロンビンムテインは、公知の天然トロンビン、例えばヒト及び他の哺乳動物、霊長類、家畜、豚、犬、猫、ネズミ、ウサギのトロンビンから出発して製造することができる。天然のトロンビンとは、トロンビン活性を有し、自然に組織中に存在するポリペプチド配列を意味する。トロンビンムテインとは、ジスルファイド架橋された２連鎖分子（Ａ−及びＢ −連鎖）のみならず、単鎖形−分子、例えばプレトロンビン又はＢ−鎖又はＢ− 鎖の部分のみ、有利にＮ−及び／又はＣ−末端で短縮されたＢ−鎖から成る蛋白質を意味する。本発明のトロンビンムテインにとって決定的なことは、トロンビン抑制剤−結合に関する活性が存在することである。本発明よるトロンビンムテインは、トロンビンの公知蛋白質分解生成物、例えばβ−トロンビン、γ−トロンビン、ω−トロンビン又はトロンビンの前駆物質、例えばプロトロンビン、プロトロンビン−中間体又はメイゾトロンビンから出発して製造することができ、これらを、次に場合によっては、例えばＸａ因子、エキス・カリナツス（Echis carinatus）又はオキシラヌス・スクテラツス（Oxy ranus scutellatus）からの蛇毒のフラクシヨンを用いる適当な分解法により、活性のトロンビン分子に変更することができるる。本発明によるトロンビンムテインは、ヒルジン、ヒルジン誘導体又は他のトロンビン抑制剤の中和のために好適である。トロンビンムテインの相応する遺伝子を製造し、この遺伝子を適当な宿主組織中で発現させる遺伝子技術的製造が好適である。この新規トロンビンムテインは、天然のトロンビンに比べて少なくとも２つの配列の違いを有し、この際、第１の違いは、１個のグリシン基のアラニン基への置換である。この置換の位置は、天然の出発トロンビンの起源に依存する。しかしながら、これは、配列環境Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ中に存在し、天然のヒトプロトロンビン（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）中で位置５５８を占めるグリシン位置である。第２の配列の違いは、プロテアーゼの触媒性三つ組みがトロンビンを形成する３つの位置（Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ）の１箇所でのアミノ酸残基の置換又は欠失である。天然のヒトプロトロンビン（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）では、これらの位置は、Ｈｉｓの３６３、Ａｓｐの４１９及びＳｅｒの５２５である。他の非ヒトトロンビンの場合には、これらの位置は、分子の全長に依存していくらか移動してうる。しかしながら、配列環境、即ち相応するアミノ酸の前及び後のアミノ酸残基は、トロンビンの場合には保持され、従って、相応するアミノ酸残基の正確な位置を配列環境に基づき決定することは容易に可能である。本発明によるトロンビンムテインは、触媒性三つ組みのところで複数の変化（欠失又は置換）を有することもあり得る。触媒性三つ組みの所の唯一の変更を有するトロンビンムテインが有利である。有利な変更は、触媒性三つ組み中のアミノ酸の置換を行ったものである。ヒスチジン残基の有利な置換は、極性又は疎水性のアミノ酸による、殊にＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ａｌａ又はＶａｌによる置換である。アスパラギン酸塩残基は、他の極性アミノ酸、例えばＧｌｎ又はＡｓｎによる置換が有利である。セリン残基が、殊にセリンのヒドロキシ官能性を有しないアミノ酸、殊にセリンと同様な空間充填度を有するもので置換されているトロンビンムテインが特に有利である。ＳｅｒのＡｌａへの置換が全く有利である。このトロンビンムテインの活性は、分子への他の変更の導入により更に改善することができる。例えば、生体内での長い作用を可能とするために蛋白質分解の安定性を更に改善することが考えられる。このためには、例えば、塩基性基Ａｒｇ３９３、Ｌｙｓ４６５、Ａｒｇ３９０又はＡｒｇ３８２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）を、他の非塩基性アミノ酸で置換することができる。本発明のもう一つの課題は、核酸配列、殊に記載のトロンビンムテインをコードするＤＮＡ配列である。これは、遺伝的コードに従ってポリペプチド配列を相応するＤＮＡ配列中に逆翻訳することにより容易に確認することができる。所望の宿主組織中で良好に発現するようなコドンを使用するのが有利である。核酸配列は、天然のトロンビン遺伝子配列から出発して位置特異的な突然変異誘発により又は完全合成的にＤＮＡ−合成により製造することができる。本発明によるトロンビンムテインは、トロンビン抑制剤、例えばヒルジン、ヒルジン誘導体及び低分子トロンビン抑制剤の解毒薬として特に好適である。ヒルジンは、起源的に蛭から単離され、トロンビンに対して極めて高い親和性（Ｋｉ＝１０^-12モル／ｌ）及びトロンビンに関して傑出した選択性により優れている６５のアミノ酸より成る蛋白質である。ヒルジンの作用は、動物実験でもヒトでも有効であることが明らかである。起源的に単離されたヒルジンと並んで、多くのヒルジンムテイン及び天然のヒルジンに比べて配列変更を有するイソヒルジンも存在する。従って、ヒルジンとは、天然のヒルジンのみならず薬用蛭からのヒルジンに対して１以上の配列変更を有し、少なくとも同等なトロンビンに対する親和性を有するようなヒルジンをも意味する。ヒルジンは、遺伝子技術を用いて容易に入手できる。その半価時間は、ヒトでは約４５分である。化学的変性によりヒルジンの薬物学的速度が変更されたヒルジンの誘導体も公知である。マークワルト（M arkwardt）は、長い作用時間を有するデキストランとヒルジンとの結合体を記載している。ＥＰ３４５６１６、ＥＰ５０２９６２及びＥＰ５５７１９９からは、長時間作用性のポリマー結合体が公知である。ＷＯ９５１５１８３には、長時間作用性の疎水性ヒルジン誘導体が記載されている。デポ−形及び長時間作用性のヒルジン−二量体（ＷＯ９５０４８２３）も同様に公知である。更なるトロンビン抑制剤は、低分子量のトロンビン抑制剤であり、これは、例えば、ＥＰ２３６１６４、ＤＥ２８０１４７８、ＥＰ２９３８８１又はＥＰ１８５３９０から公知である。更なるトロンビン抑制剤は、組み換えにより製造されたデスルフェート−ヒルジン、ヒルジン−ムテイン、ポリマー変性ヒルジン、例えばデキストラン−ヒルジン、ＰＥＧ−ヒルジン、疎水性ヒルジン誘導体及び延長された作用時間を有するヒルジン−ムテインである。更に、ヒルジジン類、短縮されたヒルジン及びヒルジン及びその部分配列から誘導されたヒルジン−同族体、例えばヒルローゲ又はＣ−末端ヒルジンペプチドの拮抗のために使用することができる。他のトロンビン抑制ペプチド、例えば吸血動物組織から記載され、遺伝子技術的製造の後に治療のために使用されている、例えばロードニイン（Rhodniin）、インフェスチン（Infestin）を中和することもできる。中和可能なトロンビン抑制剤の例は、有利に低分子量の合成トロンビン抑制剤でもあり、例えばトリペプチドＤ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇの誘導体、ＮＡＰＡＰ、ホウ酸誘導体、藻類又はベンズアミジン誘導体である。解毒薬としての本発明による使用は、前記の全てのトロンビン抑制剤に適用可能である。本発明によるトロンビンムテインは、トロンビン抑制剤を従来記載のトロンビン抑制剤の中和のための原理におけるよりも良好に中和する。本発明によるトロンビンムテインは、過剰用量の場合でも安全に使用でき、従って緊急時にトロンビン抑制剤を迅速及び有効に中和することを可能とする。本発明によるトロンビンムテインは、非経腸適用、即ち皮下、筋肉内又は静脈適用のために適当な形で存在する。静脈適用が有利である。場合によっては本発明のトロンビンムテインは長時間注入で適用することもできる。適用すべき不活性トロンビンの量は、例えば過剰用量の程度、体重及び選択された適用形により決まる。過剰用量の程度は当業者によりトロンビン使用の前又は使用の間にも適当なテストにより測定できる。本発明によるトロンビンムテインは、遺伝子技術を用いて製造可能である。それからトロンビンムテインが蛋白質分解的活性化により遊離される、トロンビンムテインの前駆形（プロトロンビンと類似）の遺伝子技術的製造が有利である。特にＢ−鎖のみより成っているトロンビンムテインのもう一つの有利な製造形は、微生物、有利にＥ．コリのような細菌中での本発明により変更されたＢ−鎖の遺伝子の発現である。得られる発現生成物は、場合によっては、有効なトロンビンムテイン分子を得るために当業者に慣用の方法で再生すべきである。細菌中でのＢ−鎖の発現時には、天然のヒトトロンビン中でＳ−Ｓ−架橋に寄与するＣｙｓ−基を他のアミノ酸基、例えばＳｅｒ又はＡｌａで交換することが有利であることも判明した。次の実施例につき本発明を詳説するが、本発明はこれらに限定されるものではない。プロトロンビンは、デゲン（Degen）等による文献（Biochemie １９８３，２２，２０８７−９７頁）に従い、ヒト肝臓ｃＤＮＡバンクからクローン化した。本発明のムテインを、トロンビン部分中での目標突然変異誘発により製造した。例１Ａｌａ５５８プロトロンビンの製造目標突然変異誘発により、ヒトプロトロンビンの位置５５８（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）中のアミノ酸グリシンに関するコドンＧＧＣを、アミノ酸Ａｌａに関するコドンＧＣＣに変異させた。このために、この遺伝子の方向でオリゴヌクレオチドＳＥＱＩＤＮＯ：５を、かつこれの相補的オリゴヌクレオチドＳＥＱＩＤＮＯ：６を逆方向で相応するヌクレオチド交換により合成した。プロトロンビン遺伝子の末端に相応して本来の方向で、オリゴヌクレオチドＳＥＱＩＤＮＯ：１を合成した。付加的にＥｃｏＲ１制限切断位置の配列をこの５’末端に付けた。プロトロンビン遺伝子の３’末端に対して逆方向で、オリゴヌクレオチドＳＥＱＩＤＮＯ：２を合成し、これの５’末端に同様にＥｃｏＲ１制限切断位置の配列を付けた。テンプレートとしてのヒトプロトロンビンｃＤＮＡ５０ｎｇ及びオリゴＳＥＱＩＤＮＯ：５及びＳＥＱＩＤＮＯ：２のそれぞれ５０ピコモルを用いて、ｄＮＴＰｓ２ｎＭ、ポリメラーゼ緩衝液及びＰｆｕ−ポリメラーゼ（戦略遺伝子）の添加の後に、９４℃で各１分間、５５℃で２分間及び７２℃で３分間を３５サイクルでＰＣＲ反応を、実施した。相応して、第２のＰＣＲを同じテンプレート及びオリゴＳＥＱＩＤＮＯ：６及びＳＥＱＩＤＮＯ：１を用いて実施した。こうして得られた２つのＤＮＡ−フラグメントを、標準プロトコル（ＰＣＲ精製キット、Quiagen,Hirden）に従って、精製した。２つのフラグメントの各０.１ピコモルを一緒にし、変性のために９５℃に５分間加熱し、再生のために室温で１時間保持した。完全なＤＮＡ−２本鎖を得るために、２ｎＭｄＮＴＰｓ、ポリメラーゼ緩衝液及びＰｆｕポリメラーゼの添加の後に、各々９４℃ で１分及び７２℃で５分の１０サイクルを実施した。完全長のフラグメントの増幅のために、混合物にもう一つのＰＣＲの増幅のために、外部のオリゴＳＥＱＩＤＮＯ：１及びＳＥＱＩＤＮＯ：２各々５０ピコモルを加え、ｐｆｕ−ポリメラーゼの再度添加の後に、各々９４℃で１分、５５℃で２分及び７２ ℃で３分の３５サイクルを実施した。こうして製造された５５８の位置でのＧｌｙのＡｌａでの置換を有する突然変異されたプロトロンビンｃＤＮＡを標準プロトコルで精製し、次いで、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ１を用いて後切断し、Ｔ４−リガーゼを用いて標準プロトコルにより、同様にＥｃｏＲ１切断されたベクターｐＵＣ１８(Pharmacia Biotech Europe GmbH,Freiburg)中に入れてクローン化した。対照のために、このＤＮＡを配列決定した。例２Ａｌａ５２５、Ａｌａ５５８プロトロンビンの製造目標突然変異誘発により、ヒトプロトロンビンの５２５の位置（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）のアミノ酸ＳｅｒのコドンＡＧＴをアミノ酸ＡｌａのコドンＧＣＴに、かつ５５８の位置（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）のアミノ酸ＧｌｙのコドンＧＧＣをＡｌａのコドンＧＧＣに変異させた。このために、例１からのプロトロンビンムテインＤＮＡ及びオリゴＳＥＱＩＤＮＯ：３をベースとして、５２５の位置で本来の方向でのＡｌａへの適当なヌクレオチド交換及びオリゴＳＥＱＩＤＮＯ：２（３’末端プロトロンビン）を用いてＰＣＲを実施した。実験条件は、例１におけるそれに相当した。第２のＰＣＲは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３に対して相補的なオリゴＳＥＱＩＤＮＯ：４及びオリゴＳＥＱＩＤＮＯ：１（５’末端プロトロンビン）を用いて実施した。こうして得られたＤＮＡフラグメントを変性し、ハイブリッド化し、充填して２本鎖にし、次いで、例１と同様に、外部のオリゴＳＥＱＩＤＮＯ：１及びＳＥＱＩＤＮＯ：２を用いてもう一つのＰＣＲを実施した。こうして製造されたプロトロンビン−ムテインｃＤＮＡを精製し、ＥｃｏＲ１を用いて後切断し、ベクターｐＵＣ１８中に入れてクローン化し、対照のために配列決定した。例３Ａｌａ３６３、Ａｌａ５５８プロトロンビンの製造目標突然変異誘発により、ヒトプロトロンビンの位置３６３（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）のＨｉｓのコドンＡＧＴをＡｌａのコドンＧＣＡに、かつ位置５５８（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）のＧｌｙのコドンＧＧＣをＡｌａのコドンＧＣＣに変異させた。このために、例１からのプロトロンビンムテインＤＮＡ及びオリゴＳＥＱＩＤＮＯ：１０をベースとして、位置３６３でのＡｌａへの本来の方向での相応するヌクレオチド交換及びオリゴＳＥＱＩＤＮＯ：２（３’末端プロトロンビン）を用いてＰＣＲを実施した。実験条件は例１に記載のものと同様である。第２のＰＣＲを、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０に対して相補的なオリゴＳＥＱＩＤＮＯ：１１及びオリゴＳＥＱＩＤＮＯ：１（５’末端プロトロンビン）を用いて実施した。こうして得られたＤＮＡフラグメントを変性し、ハイブリッド化し、充填して２本鎖にし、次いで、例１と同様に、外部のオリゴＳＥＱＩＤＮＯ：１及びＳＥＱＩＤＮＯ：２を用いてもう一つのＰＣＲを実施した。こうして製造されたプロトロンビン−ムテインｃＤＮＡを精製し、ＥｃｏＲ１で後切断し、ベクターｐＵＣ１８中に入れてクローン化し、対照のために配列決定した。例４Ａｓｎ４１９、Ａｌａ５５８プロトロンビンの製造目標突然変異誘発により、ヒトプロトロンビンの位置４１９（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）のＡｓｐのコドンＧＡＣをＡｓｎのコドンＧＣＡに、かつ位置５５８（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）のＧｌｙのコドンＧＧＣをＡｌａのコドンＧＣＣに変異させた。このために、例１からのプロトロンビンムテインＤＮＡ及びオリゴＳＥＱＩＤＮＯ：１２をベースとし、位置４１９での本来の方向のＡｓｎへの相応するヌクレオチド交換及びオリゴＳＥＱＩＤＮＯ：２（３’末端プロトロンビン）を用いてＰＣＲを実施した。実験条件は例１のそれに相応する。第２のＰＣＲは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２に対して相補的なオリゴＳＥＱＩＤＮＯ：１３及びＳＥＱＩＤＮＯ：１（５’末端プロトロンビン）を用いて実施した。こうして得られたＤＮＡフラグメントを変性し、ハイブリッド化し、充填して２本鎖にし、次いで、例１に相応して、外部のオリゴＳＥＱＩＤＮＯ：１及びＳＥＱＩＤＮＯ：２を用いる第２のＰＣＲを実施した。こうして得られたプロトロンビン−ムテインｃＤＮＡを精製し、ＥｃｏＲ１を用いて後切断し、ベクターｐＵＣ１８中に入れてクローン化した。対照のために配列決定した。例５Ａｌａ５２５プロトロンビンの製造目標突然変異誘発により、ヒトプロトロンビンの位置５２５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）のＳｅｒのコドンＡＧＴをＡｌａのコドンＧＣＴに変異させた。このために、プロトロンビンムテインＤＮＡ及びオリゴＳＥＱＩＤＮＯ：３をベースとし、位置５２５でのＡｌａの本来の方向の相応するヌクレオチド交換及びオリゴＳＥＱＩＤＮＯ：２（３’末端プロトロンビン）を用いてＰＣＲを実施した。第２のＰＣＲは、ＳＥＱＩＤＮＯ：３に対して相補的なオリゴＳＥＱＩＤＮＯ：４及びＳＥＱＩＤＮＯ：１（５’末端プロトロンビン）を用いて実施した。こうして得られたＤＮＡフラグメントを変性し、ハイブリッド化し、充填して２本鎖にし、次いで、外部のＳＥＱＩＤＮＯ：１及びＳＥＱＩＤＮＯ：２を用いる第２のＰＣＲを実施した。こうして製造されたプロトロンビン−ムテインｃＤＮＡを精製し、ＥｃｏＲ１で後切断し、ベクターｐＵＣ１８中に入れてクローン化した。対照のために配列決定した。例６ヒトプロトロンビン−ムテインの発現ベクターの構築ＣＨＯ哺乳動物細胞中での分泌組み換え発現のために、変異されたプロトロンビンｃＤＮＡ（例１〜５参照）の５’末端に、ヒトｔＰＡ遺伝子の分泌リーダー配列を付けた(Pennica 等のNature 301，214-221,1983)。ｔＰＡｃＤＮＡから出発して、合成オリゴヌクレオチドＳＥＱＩＤＮＯ：９（ｔＰＡリーダーの５’末端及びＥｃｏＲＩ位置）及びＳＥＱＩＤＮＯ：８（ｔＰＡリーダーの３’末端、プロトロンビンの５’末端）を用いてｔＰＡ−分泌リーダ−ｃＤＮＡのＰＣＲに基づく増幅を実施した。ＳＥＱＩＤＮＯ：８に対して相補的なオリゴＳＥＱＩＤＮＯ：７及びＳＥＱＩＤＮＯ：２を用いて、それぞれ変異されたプロトロンビンムテインフラグメントを増幅させた。ｔＰＡ−リーダーフラグメントをその都度のプロトロンビンムテインフラグメントに添加した。この混合物を変性させ、ハイブリッド化し、充填して２本鎖にし、オリゴヌクレオチドＳＥＱＩＤＮＯ：９０及びＳＥＱＩＤＮＯ：２を用いる更なるＰＣＲによりそれぞれのｔＰＡ−リーダープロトロンビンムテイン−ＤＮＡを製造した。これらをＥｃｏＲ１で切断し、ｐＵＣ１８中に入れてクローン化した。対照のために配列決定した。ＣＨＯ細胞中での発現のために、これらのＤＮＡをＥｃｏＲ１を用いてｐＵＣ１８ベクターから切り出し、単離し、ベクターｐｃＤＮＡ３ｎｅｏ（invitr ogen,San Diego,USA）のＥｃｏＲ１切断位置中に挿入した。プロトロンビンｃＤＮＡの転写は、このベクター中での強いサイトメガロウイルス−プロモーターの制御下にある。形質転換された細胞の選択を、プラスミド中に存在する、Ｇ４１８−抵抗コロニーのみを成長させるネオマイシン−抵抗遺伝子を用いて実施する。形質転換の前に、ＣＨＯ−細胞中での発現のための相応するＤＮＡを、制限酵素ＰｖｕＩを用いて線状化し、沈殿させ、１０ｍＭトリス緩衝液（pH８.５）中に無菌条件下に入れた。例７哺乳動物細胞中でのプロトロンビン−ムテインの発現発現ベクターのＤＮＡをリポフェクタミン（Fa.Gibco;Life Technologies Gmb H;Dieselstrasse 5，76334 Eggenstein，Deutscheland;Nr．530-8324SA）を用いて哺乳動物細胞中に形質転換させた。使用細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）；２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）であった。細胞２×１０５／ｍｌを６−ウエル−培養プレートの１ウエル当たり成長培地３ｍｌ中に接種した。次の日に形質転換を実施した。このために、細胞を血清不含の媒体で１回洗浄した。リポフェクトアミンでの形質転換を製造会社Ｆａ．Ｇｉｂｃｏの指示に従って実施した(Focus(1993),15 Nr.3,73 78)。各ウエルは、ＤＮＡ１μｇ及びリポフェクタミン６μｌを含有し、これらを一緒に血清不含の細胞培地１０００μｌ中に入れた。３７℃で６時間恒温保持の後にこの形質転換培地を吸引濾去し、細胞を正常の成長培地（牛胎児血清，ＦＣＳを含有）と一緒に１晩恒温保持した。例８２９３−細胞中でのプロトロンビンムテインの一時的発現２９３−細胞をＤＭＥＭ−培地（Gibco Nr.41965）＋ＦＣＳ１０％(Biowhitta ker Nr.14601 B)中に保持する。形質転換を、前記と同様に実施した。この場合に、発現率を高めるために共形質転換をプラスミドｐＡｄＶａｎｔａｇｅ（Promega Nr.E1711）を用いて実施した。ｐＡｄＶａｎｔａｇｅ−ＤＮＡ０.２μｇ及び発現ベクターｐｃＤＮＡ３中のその特定のプロトロンビンムテインのＤＮＡ０.８μｇを前記と同様に形質転換させた。形質転換後の第１日に、血清含有培地を吸引濾去し、血清不含の培地（フェノールレッド不含）で交換した。形質転換後の第３日に、この細胞培養上澄みを取り出し、検定まで−２０℃で貯蔵した。例９ＣＨＯ−Ｋ１細胞中でのプロトロンビンムテインの安定な発現前記と同様に形質転換を実施した。ＣＨＯ−細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２＝１：１ (Gibco Nr.21331-020)＋ＦＣＳ１０％中で保持し、培養した。形質転換後の第１日に細胞を散布して、６−ウエルプレートの１ウエルから２０〜１００個の１０ｃｍペトリシャーレ上に接種した。同時にＧ４１８（Fa.Gibco,培地中１２００ μｇ／ｍｌ）での処理により組み換え細胞を選択することを開始した。得られた抵抗コロニーを、”クローニングシリンダー”法により単離し、更なる培養及び充分な細胞数の達成の後に、相応するトロンビンムテインの発現に関して検査した。このために、集めた細胞から媒体を吸引除去し、新たな血清不含の媒体と交換した。決められた時間、例えば２４時間、４８時間の後に、この恒温保持された細胞培養上澄みを取り出し、プロトロンビンの存在をＥＬＩＳＡを用いて検定した。部分的に、得られた組み換え細胞を発現の増加のためにマイクロ滴定プレート中で単離してクローン化させた。血清不含の細胞培養上澄みの充分な量を得るために、良好な発現性のＣＨＯ− 細胞を種々の培養容器中のＦＣＳ１０％を含有する媒体中に集めるまで培養した。引き続き、細胞をＰＢＳで洗浄し、血清不含のＤＭＥＭ／Ｆ１２−培地（ＤＭＥＭ：Giobco Nr.11880-028;F12:Gibco Nr.21765-029：混合物は、同じ容量部より成る）と共に恒温保持した。この目的のために使用されたＤＭＥＭは、フェノールレッド不含であった。２日又は３日後に、プロトロンビンムテイン含有細胞培養上澄みを収穫するために、それぞれ培地交換（”収穫”）を行った。この方法で、１つの培養容器から１０−回まで収穫できた。この場合に、異なる培養容器からの異なる収穫物を、精製に認容可能な量に達するために集めた。例１０組み換えプロトロンビンムテインの発現の検出プロトロンビンを発現し細胞培地中に分泌する細胞を、組み換えプロトロンビンの存在に関して検定し、ここでは、集められた細胞の細胞培養上澄みを、ＥＬＩＳＡを用いるプロトロンビンの存在に関して、又はプロトロンビンの分解の後にトロンビン活性又はトロンビン抗体に関して検査した。このために、血清不含の細胞培養上澄みを種々の長さの培養時間の後に取り出した。細胞上澄み中に存在するプロトロンビンの分解は、蛇毒を用いて達成した（Fa．Sigma;Kat.Nr.V3129）。各々のバッチは、次のように実施した：試料（血清不含の細胞培養上澄み又はプロトロンビンビン３８８μｌ蛇毒（Ｈ₂Ｏ中０．２ｍｇ／ｍｌ）６３μｌ緩衝液（１ＭＮａＣｌ；１００ｍＭＣａＣｌ₂；２００ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．４）５０μｌＨ₂Ｏ１００μｌこの分解混合物を室温で４５分間恒温保持した。引き続き、生じたトロンビンを種々の検定で特徴付けた。例１１ＥＬＩＳＡによるプロトロンビンムテイン及びトロンビンムテインの検出プロトロンビン及びトロンビンの測定用のＥＬＩＳＡを次の概要に従って実施した： − マイクロ滴定プレートを抗−トロンビン−抗体０．１ｍｌ／ウエルで塗布；０.０５ＭＮａＨＣＯ３，ｐＨ９.２５μｇ／ｍｌ；１６時間／４℃、 − １％ＢＳＡ／ＰＢＳで飽和；０.３ｍｌ／ウエル；０.５〜１時間／ＲＴ − ０.５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄 − ヒト−トロンビン（Calbochem 605195；３．１５９ＮＩＨＵ／ｍｇ）の１１標準二倍希釈、２工程で０.１％ＢＳＡ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ１０ｎｇ／ｍｌを用いて開始；これに平行して測定すべき試料の希釈；０.１ｍｌ／ウエル；２〜４時間／ＲＴ − 前記と同様に洗浄 − ビオチニル化された抗−トロンビン−抗体１：２０００.１ｍｌ／ウエル；０.１％ＢＳＡ／０.０５Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ中で希釈；２〜４時間／ＲＴ − 前記と同様に洗浄 − ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ−コンプレックス（Ｂ．Ｍ．１０８９１５３）０.１ｍｌ／ウエル；０.１％ＢＳＡ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ中で１：１００００希釈；３０分／ＲＴ − 前記と同様に洗浄 − ペルオキシダーゼ基質０.１ｍｌ／ウエル − 反応を２ＭＨ₂ＳＯ₄０.１ｍｌ／ウエルを用いて停止 − ４５０ｎｍでの吸収の測定ペルオキシダーゼ基質：ＴＭＢ−溶液（ＤＳＭＯ中の４２ｍＭＴＭＢ）０.１ｍｌ及び基質緩衝液（０.１Ｍ酢酸ＮａｐＨ４.９）１０ｍｌを混合；次いで３％Ｈ₂Ｏ₂ １４.７μｌを添加。例１２ヒトトロンビンに対する抗体の製造ポリクローナル抗体の誘導のために、ウサギを次のようにして免疫化させた。１日ＰＢＳ／完全フロインドのアジュバント(Si gma F5881)０.５ｍｌ中のヒトトロンビン２００μｇ１４日ＰＢＳ／不完全フロインドのアジュバント（S igma F5506)０.５ｍｌ中のヒトトロンビン２００μｇ２８日ＰＢＳ／不完全フロインドのアジュバント０.５ｍｌ中のヒトトロンビン２００μｇ４２日ＰＢＳ０.５ｍｌ中のヒトトロンビン２００ μｇ最後の免疫化の後７日目に、ウサギの耳血管から血液を採取した。得られた血清からのポリクローナルウサギ−抗体の精製は、プロテインＡセファロース(製造者Pharmacia)を介して、ＩｇＧ６５ｍｇ／血清１０ｍｌの収率で行われた。ビオチニル化の前に、この抗体を０.０５ＭＮａＨＣＯ₃ｐＨ９. ０（２×２リットル）に対して透析させ、次いで、抗体６００μｌ当たりビオチン−ｘ−ＮＨＳ−エステル(Calbiochem 203189;Img/ml H2O)２００μｌ（２.４ｍｇ／ｍｌ）を添加し、かつ２時間／ＲＴ振動させた。引き続きＰＢＳに対して３回透析させた。得られた抗体を用いて、サンドイッチ−ＥＬＩＳＡを構築させた： − マイクロ滴定プレートを０.０５ＭＮａＣＯ₃（ｐＨ９.２）中の抗トロンビン−ＡＫ５μｇ／ｍｌ０．１ｍｌ／ウエルで塗布した；１６時間／４℃ − １％ＢＳＡで飽和；０.３ｍｌ／ウエル；０.５時間／ＲＴ − ０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄 − ２工程で０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０１０ｎｇ／ｍｌで開始してヒトトロンビン（Calbiochem 605195）の１１標準希釈；これに平行して測定すべき試料の希釈；０.１ｍｌ／ウエル；２時間／ＲＴ − 前記のように洗浄 − ビオチニル化された抗−トロンビン−ＡＫ１：２００．１ｍｌ／ウエル、０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で希釈；２時間／ＲＴ − 前記のように洗浄 − ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ−コンプレックス（Ｂ．Ｍ．１０８９１５３）０.１ｍｌ／ウエル、０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で１：１００００希釈；３０分／ＲＴ − ペルオキシダーゼ基質０.１ｍｌ／ウエル − 反応を２ＭＨ₂ＳＯ₄０.１ｍｌ／ウエルを用いて停止 − ４５０ｎｍでの吸収（ＯＤ）の測定。第１図中には、トロンビン濃度に対する吸収（ＯＤ）がプロットされている。ペルオキシダーゼ−基質：ＴＭＢ−溶液（ＤＭＳＯ中４２ｍＭ）０.１ｍｌ及び基質緩衝液（０.１Ｍ酢酸−ＮａｐＨ４.９）１０ｍｌを混合；次いで３％Ｈ₂Ｏ₂ １４.７μｌを添加。ＥＬＩＳＡによるプロトロンビン及びトロンビンムテインの検出：次の概要に示すようにしてプロトロンビン及びトロンビンを測定するためのＥＬＩＳＡを実施した： − マイクロ滴定プレートに抗−トロンビン−抗体０.１ｍｌ／ウエルで塗布；０.０５ＭＮａＨＣＯ₃ｐＨ９.２５μｇ／ｍｌ、；１６時間／４℃、 − １％ＢＳＡ／ＰＢＳで飽和；０.３ｍｌ／ウエル；０.５〜１時間／ＲＴ − ０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄 − ２工程で０.１％ＢＳＡ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ１０ｎｇ／ｍｌを用いて開始したヒト−トロンビン（Calbiochem 605195;3.159 NIH U/mg）の１１標準希釈；これに平行して測定すべき試料の希釈；０.１ｍｌ／ウエル；２〜４時間／ＲＴ − 前記のように洗浄 − ビオチニル化された抗−トロンビン−抗体１：２０００．１ｍｌ／ウエル；０.１％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ中で希釈；２〜４時間／ＲＴ − 前記のように洗浄 − ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ−コンプレックス（Ｂ．Ｍ．１０８９１５３）０．１ｍｌ／ウエル；０.１％ＢＳＡ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ中で１：１００００希釈；３０分／ＲＴ − 前記のように洗浄 − ペルオキシダーゼ基質０．１ｍｌ／ウエル − ２ＭＨ₂ＳＯ₄ ０．１ｍｌ／ウエルを用いて反応を停止 − ４５０ｎｍでの吸収の測定。ペルオキシダーゼ基質：ＴＭＢ溶液（ＤＭＳ中ＴＭＢ４２ｍＭ）０.１ｍｌ及び基質緩衝液（０.１Ｍ酢酸−Ｎａ、pH４.９）１０ｍｌを混合し、次いで３％Ｈ₂Ｏ₂１４.７μｌを添加した。例１３ａ血漿からのヒトトロンビンの精製ヒトクエン酸塩血漿からのヒトトロンビンの精製は、ヘンリクソン(Henrikson ;Methodes in Enzymology，Vol．222,pp312 3279)が記載しているように行う。プロトロンビン分解及びこのトロンビンのヘパリンクロマトグラフィによる精製は、例１４及び１５に記載のように行う。トロンビン含有フラクシヨンを色原性トロンビン検定により、Ｓ２２３８を用いて測定し、限外濾過により１ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、ＰＢＳに対して透析濾過した。色原性基質Ｓ２２３８を用いるトロンビン活性の測定トロンビンムテインの活性をトリペプチドの分解により測定する。このために次の滴定法に従って実施する：試料（トロンビン０.５Ｕ；／ｍｌ；又は種々の希釈度の分解されたプロトロンビン）５０μｌ水１００μｌＳ−２２３８（Ｈ₂Ｏ中１ｍｇ／ｍｌ；Fa.Chromog enix,Moelndal;Sweden）５０μｌ。この混合物を３７℃で１０〜１５分間恒温保持する。引き続き、４０５ｎｍの波長での吸収を測定し、検量曲線を用いてトロンビン量０.０１〜１Ｕ／ｍｌが測定された。例１３ｂアニオン交換体クロマトグラフィによるプロトロンビンムテインの精製ＣＨＯ−細胞培養からのプロトロンビン−含有細胞培養上澄み３５リットルを、まず、４Ｃでの限外濾過（ＳＰＳ４００Membran、Fresenius,St.Wendel）により４００ｍｌまで濃縮させ、次いで１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７.５に対して、導電率１.１ｍＳ／ｃｍになるまで透析濾過する。脱塩された濾液を次いで、Ｑ −セファロースＦＦカラム（直径５ｃｍ、容積５３０ｍｌ）上に６ｍｌ／ｍｉｎの流速で装入し、このカラムを出発緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌｐＨ７．５）で洗浄し、引き続き４００ｍＭＮａＣｌへの勾配で、１５カラム量にわたり展開させる。プロトロンビン−含有フラクシヨンを、ＥＬＩＳＡを用いて同定する。プロトロンビンムテインは、２８０ｍＭＮａＣｌから溶離開始する。このカラムから蛋白質約１５０〜２００ｍｇが単離される。例１４プロトロンビンからのトロンビンムテインの遊離Ｑ−セファロースクロマトグラフィのアミコン（Amicon）ＹＭ３０上で濃縮されたフラクシヨン（最終量２０ｍｌ、総蛋白質１７５ｍｇ）を、２０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７.５）２リットル、１００ｍＭＮａＣｌに対して透析させ、分解のために１ＭＣａＣｌ₂、２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７.５）の添加により１０ｍＭの最終濃度に調節する。オキシラヌス・スクテラツス(Oxyranus scut ellatus)からの蛇毒３０ｍｇの添加により、４℃で撹拌下に分解させ、１２時間後に２０ｍＭＥＧＴＡ−溶液（ｐＨ７.５）２ｍｌの添加により反応を停止させる。例１５ヘパリンクロマトグラフィによるトロンビンムテインの精製例１４からのトロンビン−含有分解混合物を、引き続きヘパリンセファロース −カラム(１４ｃｍ×１ｃｍ、Pharmacia)上に３８ｃｍ／ｈの流速で装入する。カラムを２０ｍＭ燐酸−Ｎａ２０ｍｌ、０.１ＭＮａＣｌ（ｐＨ７.５、０.０１％プルリオール(Pluriol)Ｆ６８）で洗浄の後に、このカラムを６００ｍＭＮａＣｌへの直線的勾配で、２０ｍＭ燐酸−Ｎａ、ｐＨ７.５、０.０１％プルリオールＦ６８１５０ｍｌにわたり展開させる。次いで、このトロンビンムテインをＥＬＩＳＡで検定する。このムテインを約４００ｍＭＮａＣｌで溶離させる。ムテイン３０〜３５ｍｇが得られ、ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）の添加の後に、ＰＢＳ、０.０１％プルリオールＦ６８に対して透析させ、−２０℃で貯蔵した。例１６インビトロ系でのヒルジンの中和ヒルジン上の不活性組み換えトロンビンの解毒作用を、トロンビン−活性試験で検査した。このために、ヒルジン；試験すべきトロンビンムテイン；活性トロンビン及びＳ−２２３８を一緒に恒温保持した。この検定の基礎になっている原理は、試験すべき不活性トロンビンによるヒルジンの中和（又は競合）及びこれから生じる活性トロンビンの高い活性である。このために次のピペット法に従って実施する：ヒルジンＨＬ２０（１．５Ｕ／ｍｌ）１００μｌ又はＴＢＳ（ｐＨ７.５）中の０.１％ＢＳＡ及びトロンビンムテイン（例２で製造）１００μｌを室温で５分間前恒温保持した。活性トロンビン（０．５Ｕ／ｍｌ）５０μｌの添加の後に、この反応をＳ−２２３８（Ｈ₂Ｏ中１ｍｇ／ｍｌ；Fa,Chromegenix,Moeldal; Scweden）５０μｌの添加により開始させた。この混合物を３７℃で１５分間恒温保持した。引き続き４１０ｎｍの波長での吸収を測定した。不活性トロンビンムテインでのヒルジンの中和は、吸収の上昇をもたらした（第２図参照）。例１７犬におけるＰＥＧ−ヒルジンの中和ビーグル犬（９.８〜１３.５ｋｇ）にＰＥＧ−ヒルジンを１０ｍｇ／ｋｇの量で皮下適用した。ＰＥＧ− ヒルジン注射の後１８０分に例２で製造したトロンビンムテイン（Thrombinmut ＃３）を２０ｇ／ｋｇの用量で５０分にわたり静脈注射適用した。この実験の開始時に、血液試料を犬の気管支静脈(Ｖ．bachialis)の穿孔により取り出し、更なる試料は１５０の後に６時間までの時間にわたり取り出した。クエン酸塩−血液から２０００ｇでの２０分間の遠心分離により血漿を取得し、分析するまで− ２０℃で貯蔵した。この血漿試料中の抗トロンビン−活性を、スパンナーゲル（Spannagel）等によるBlood Coagulation Fibrinolysis,1991,2:121-127 に記載のようにして測定した。抗凝集活性（ａＰＴＴ）は、パトロムチン−系（Behring）を用いて測定した。結果を第３図にまとめる。対照動物では抗トロンビン活性がＰＥＧ−ヒルジンの適用の後に急速に上昇しているが、解毒薬で処理された動物中では抗トロンビン活性の上昇を阻止することができた（第３Ｂ図）。解毒薬注射の終了後に、ＰＥＧ−ヒルジン血漿中濃度は、対照のそれに匹敵する割合でさらに上昇する。定性的に同じ様な経過がａＰＴＴでも観察される（第３Ａ図参照）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ // Ａ６１Ｋ 38/46 Ａ６１Ｋ 37/54 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/74 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＵ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＬＶ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＵＡ，ＵＳ (72)発明者クラウスボルシュヴァイラードイツ連邦共和国Ｄ―69118 ハイデルベルクカール―クリスト―シュトラーセ 13 (72)発明者マーティンシュミットドイツ連邦共和国Ｄ―64625 ベンスハイムミッテルシュトラーセ 49ベー (72)発明者ハンスヴォルフガングヘフケンドイツ連邦共和国Ｄ―67069 ルートヴィッヒスハーフェンダムシュテュッカーヴェーク 37 (72)発明者ユルゲンシュヴェーデンドイツ連邦共和国Ｄ―67433 ノイシュタットハインリヒ―シュトリーフラー― シュトラーセ 19 (72)発明者クラウスリュープザーメンドイツ連邦共和国Ｄ―67434 ノイシュタットカイザーシュトゥール６

Claims

【特許請求の範囲】１．天然トロンビンと比べて配列中で次の違い：（ａ）ＧｌｙのＡｌａでの置換、このＧｌｙは配列環境Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ中に存在し、天然のヒトプロトロンビン（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）中の位置５５８を占めている；（ｂ）次の残基の少なくとも１個の置換又は欠失；（ｂ１）配列環境Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ中に位置し、天然のヒトプロトロンビン（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）中の位置３６３を占めているＨｉｓ；（ｂ２）配列環境Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ中に位置し、天然ヒトプロトロンビン（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）中の位置４１９を占めているＡｓｐ；（ｂ３）配列環境Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ中に位置し、天然ヒトプロトロンビン（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）中の位置５２５を占めているＳｅｒを有するトロンビンムテイン。２．天然ヒトトロンビン（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）と比べて配列中で次の違い：（ａ）位置５５８でのＧｌｙのＡｌａでの置換；（ｂ）次の残基の少なくとも１個の置換又は欠失：（ｂ１）位置３６３でのＨｉｓ；（ｂ２）位置４１９でのＡｓｐ；（ｂ３）位置５２５でのＳｅｒを有する、請求項１に記載のトロンビンムテイン。３．配列中の違い（ｂ）は、位置５２５での置換である、請求項２に記載のトロンビンムテイン。４．配列中の違い（ｂ）は、ＳｅｒのＡｌａへの置換である、請求項３に記載のトロンビンムテイン。５．請求項１から４のいずれか１項に記載のトロンビンムテインをコード化している核酸配列。６．請求項１から４のいずれか１項に記載のトロンビンムテインの凝血障害の治療の際の使用。７．トロンビン抑制剤の解毒薬としての請求項６に記載の使用。８．ヒルジン、ヒルジンムテイン又はヒルジン誘導体の解毒薬としての請求項７に記載の使用。９．ポリエチレングリコールで変性されたヒルジン誘導体の解毒薬としての請求項８に記載の使用。１０．請求項１から４のいずれか１項に記載のトロンビンムテインを薬剤学的に慣用の助剤と一緒に含有する、トロンビン抑制剤の解毒薬。