KR20140106448A - 인자 vii을 포함하는 융합 단백질의 분리 및 정제 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인자 VII을 포함하는 융합 단백질의 분리 및 정제 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인자 VII 및 트렌스페린을 포함하는 융합 단백질을 고순도로 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 인자 VII을 포함하는 재조합 융합 단백질을 고순도로 분리 및 정제할 수 있는 방법을 제공하므로, 수술과 같이 대량 출혈이 발생하는 경우에 사용될 수 있는 인자 VII을 포함하는 약제학적 제제를 제조하는데 있어서 유용하다.

Description

인자 VII을 포함하는 융합 단백질의 분리 및 정제 방법{Method for isolating and purifying a fusion protein comprising Factor VII}
본 발명은 인자 VII(FVII)을 포함하는 융합 단백질의 분리 및 정제 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 FVII 및 트렌스페린을 포함하는 융합 단백질을 고순도로 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다.
혈액응고인자 VII(Blood coagulation factor VII; 이하, '인자 VII' 또는 'FVII'라 함)는 비타민 K에 의존하는 혈장 단백질로서, 혈액응고 개시에 있어서 결정적인 역할을 한다. 혈액과 조직 내에는 50종 이상의 물질들이 혈액응고에 관여하는데 혈액을 응고시키는데 관여하는 것을 전응고물질(procoagulants)이라 하고, 혈액응고를 방지하는 것을 항응고물질(anticoagulants)이라고 한다. 혈액과 조직 내에는 이 상반된 두 물질 군이 항상 평형을 이루지만 보통은 항응고물질이 우세하여 응고가 일어나지 않도록 한다. 그러나 혈관이 손상되면 이 부위에서 항응고물질보다 전응고물질(procoagulants)이 우세하게 되고, 간에서 비타민 K의 작용으로 혈액 속에 있는 혈장 단백질의 하나인 프로트롬빈(prothrombin)이 칼슘 이온이나 혈소판 등의 작용으로 트롬빈(thrombin)으로 전환되고, 이 트롬빈이 다시 피브리노겐에 작용하여 피브린(fibrin)을 생성함으로써 혈액이 응고된다.
혈액응고는 작용기전에 따라 혈관 벽이나 주위 조직의 손상으로부터 시작되는 외인성 경로(extrinsic pathway)와 혈액 자체에서 시작되는 내인성 경로(intrinsic pathway)로 나눠진다. 이 중 외인성 경로는 혈관 벽의 조직이 손상되면 세포막에 존재하는 조직 인자(Tissue factor, TF)가 순환 중인 혈액에 노출되어 혈액 내에 존재하는 FVII 또는 활성 인자 VII(FVIIa: 총 FVII 단백질 질량 중 약 1%에 해당하는 양으로 혈액 중에 존재)와 복합체를 형성함으로써 개시된다. 이 복합체는 촉매 능력이 있어서 세포 표면상의 인자 X(FX)에 작용하여 이를 활성화된 인자 X(FXa)로 변환시키고, 상기 FXa는 인자 IX(FIX)을 활성 인자 IX(FIXa)으로 전환시키는 연속적인 혈액 응고 반응(blood coagulation cascade)을 진행시킨다.
FVII은 406개 아미노산으로 구성된 단일쇄 당단백질이고 분자량이 약 50kDa이며 불활성 자이모겐(zymogen)으로서 간세포에 의해 혈류로 분비된다. FVII은 아미노말단-카복시글루탐산(Gla) 도메인, 두 개의 상피성장인자 유사(EGF-like) 도메인 및 세린 프로테아제 도메인의 네 개의 도메인으로 이루어져 있다(Hagen FS et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., USA, 83(8):2412-2416, 1986). FVII은 Arg152-Ile153에서의 단일 펩타이드 결합이 단백질 분해되어, 이황화결합에 의해 연결되어 있는 2개의 폴리펩타이드 쇄, 즉 N-말단 경쇄(24kDa) 및 C-말단 중쇄(28kDa)를 형성함으로써 활성 형태의 FVIIa로 전환된다. FVII은 혈장에 500 ng/ml의 농도로 존재하는데, 이의 1%, 즉 5 ng/ml의 FVII은 FVIIa로서 존재한다.
FVII은 혈장 내 단백질 중 반감기가 가장 짧아서 효과적인 지혈을 위해서는 반복 투여해야 하는 단점이 있다. 최근에는 이러한 문제를 해결하기 위해, 반감기를 증가시켜 환자의 편의성을 개선하고 효능을 증가시킬 수 있는 기술, 예를 들어 페길화(PEGylation), CTP(carboxyl terminal peptide), 알부민 융합 등의 기술이 연구되고 있다.
특히, 본 발명자들은 FVII의 생체내 반감기를 증가시키는 방안으로서 FVII을 트랜스페린에 융합시킨 융합 단백질의 형태를 제시한 바 있다(국내출원공개 제10-2011-0133454호 참조). 상기 FVII-트랜스페린 융합 단백질은 천연형 FVII에 비해 높은 생체내 반감기를 가질 뿐만 아니라 높은 FVII의 생물학적 활성을 보유하므로, FVII을 이용한 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 융합 단백질은 상기 융합 단백질을 코딩하는 DNA가 삽입된 재조합 벡터를 이용하여 숙주 세포(예컨대, CHO 세포 등)에서 발현될 수 있다. 하지만, 상기 발현된 단백질을 분리 및 정제하는 방법은 아직 확립되어 있지 않다. 종래에 혈액 응고 인자 자체를 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분리 및 정제하는 방법이 연구된 바 있으나, 융합 단백질에 적용하기에는 분리 및 정제된 단백질의 순도가 너무 낮은 문제가 있었다.
따라서, 본 발명의 목적은 상기의 문제를 해결하고자 안출된 것으로서, 유전공학적 방법으로 발현된 인자 VII을 포함하는 융합 단백질을 고순도로 분리 및 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 1) 동물 세포에서 발현된 인자 VII을 포함하는 융합 단백질을 화학식 1의 구조를 갖는 레진을 고정상으로 하는 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography), 또는 세라믹 플루오르아파타이트 젤(fluoroapatite gel; Ca10(PO4)6F2)을 고정상으로 하는 혼합-방식(mixed mode) 크로마토그래피에 의해 분리 및 정제하는 단계; 및 2) 상기 융합 단백질을 Q-세파로스 FF 젤을 고정상으로 하는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 인자 VII을 포함하는 융합 단백질의 분리 및 정제 방법을 제공한다:
<화학식 1>
Figure pat00001
상기 식에서, 매트릭스는 교차결합된 아가로스이며, R은 리간드로서 인자 VII 결합 단백질이다.
본 발명은 인자 VII을 포함하는 재조합 융합 단백질을 고순도로 분리 및 정제할 수 있는 방법을 제공하므로, 수술과 같이 대량 출혈이 발생하는 경우에 사용될 수 있는 인자 VII을 포함하는 약제학적 제제를 제조하는데 있어서 유용하다.
도 1은 FVII 서열을 코딩하는 cDNA를 포함하는 벡터 및 트랜스페린(Tf) 서열을 코딩하는 cDNA를 포함하는 벡터로부터 FVII-Tf 발현 벡터를 제조하기 위한 클로닝 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 중첩 PCR(overlapping PCR)을 이용하여 FVII-GS1(링커)-Tf 발현 벡터를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 3은 링커로서 GS3, GS5, GS7, GS9, GS11, GS13, GS15 또는 GS-1-T를 포함하는 FVII-GS 링커-Tf 발현 벡터를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 융합 단백질인 FVII-Tf, FVII-GS1-Tf, FVII-GS3-Tf, FVII-GS5-Tf, FVII-GS7-Tf, FVII-GS9-Tf, FVII-GS11-Tf, FVII-GS13-Tf, FVII-GS15-Tf, FVII-GS1-T-Tf 및 FVII-Helix-Tf, 및 FVII(NovoSevenTM)을 웨스턴 블랏(Western blot)으로서 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 융합 단백질인 FVII-Tf, FVII-GS1-Tf, FVII-GS3-Tf, FVII-GS5-Tf, FVII-GS7-Tf, FVII-GS9-Tf, FVII-GS11-Tf, FVII-GS13-Tf, FVII-GS15-Tf, FVII-GS1-T-Tf 및 FVII-Helix-Tf의 비활성을 비교한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 융합 단백질인 FVII-GS1-T-Tf의 링커 및 양 말단의 제한효소 인식서열의 구조를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 정제된 융합 단백질인 FVII-Tf, FVII-GS1-Tf, FVII-GS1-T-Tf, FVII-GS3-Tf, 및 FVII-GS15-Tf와 NovoSeven 및 FVII의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 재조합 FVII 융합 단백질(FVII-GS1-T-Tf)을 실시예 <9-2>에 기재된 용출 조건 하에서 XK16/20 VII 셀렉트(select)를 고정상으로 하는 친화성 크로마토그래피로 분리 및 정제한 후, UV 280 nm의 파장에서 측정한 흡광도를 나타내는 크로마토그램이다.
도 9는 본 발명의 재조합 FVII 융합 단백질(FVII-GS1-T-Tf)을 실시예 <9-2>에 기재된 용출 조건 하에서 XK16/20 VII 셀렉트(select)를 고정상으로 하는 친화성 크로마토그래피로 분리 및 정제한 후, SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 10은 본 발명의 재조합 FVII 융합 단백질(FVII-GS1-T-Tf)을 실시예 <9-2>에 기재된 용출 조건 하에서 XK16/20 VII 셀렉트(select)를 고정상으로 하는 친화성 크로마토그래피로 분리 및 정제하고, Q-세파로스 FF를 고정상으로 하는 음이온 교환 크로마토그래피로 추가로 분리 및 정제한 후, UV 280 nm의 파장에서 측정한 흡광도를 나타내는 크로마토그램이다.
도 11은 본 발명의 재조합 FVII 융합 단백질(FVII-GS1-T-Tf)을 실시예 <9-2>에 기재된 용출 조건 하에서 XK16/20 VII 셀렉트(select)를 고정상으로 하는 친화성 크로마토그래피로 분리 및 정제하고, Q-세파로스 FF를 고정상으로 하는 음이온 교환 크로마토그래피로 추가로 분리 및 정제한 후, SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 12는 본 발명의 재조합 FVII 융합 단백질(FVII-GS1-T-Tf)을 비교예 1에 기재된 용출 조건 하에서 XK16/20 VII 셀렉트(select)를 고정상으로 하는 친화성 크로마토그래피로 분리 및 정제한 후, UV 280 nm의 파장에서 측정한 흡광도를 나타내는 크로마토그램이다.
도 13은 본 발명의 재조합 FVII 융합 단백질(FVII-GS1-T-Tf)을 XK16/20 세라믹 플루오르아파타이트를 고정상으로 하는 혼합 방식(mixed-mode) 크로마토그래피로 분리 및 정제한 후, UV 280 nm의 파장에서 측정한 흡광도를 나타내는 크로마토그램이다.
도 14는 본 발명의 재조합 FVII 융합 단백질(FVII-GS1-T-Tf)을 XK16/20 세라믹 플루오르아파타이트를 고정상으로 하는 혼합 방식(mixed-mode) 크로마토그래피로 분리 및 정제한 후, SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 15는 본 발명의 재조합 FVII 융합 단백질(FVII-GS1-T-Tf)을 XK16/20 세라믹 하이드록시아파타이트를 고정상으로 하는 혼합 방식(mixed-mode) 크로마토그래피로 분리 및 정제한 후, UV 280 nm의 파장에서 측정한 흡광도를 나타내는 크로마토그램이다.
도 16은 본 발명의 재조합 FVII 융합 단백질(FVII-GS1-T-Tf)을 XK16/20 세라믹 하이드록시아파타이트를 고정상으로 하는 혼합 방식(mixed-mode) 크로마토그래피로 분리 및 정제한 후, SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
본 발명은 1) 동물 세포에서 발현된 인자 VII을 포함하는 융합 단백질을 화학식 1의 구조를 갖는 레진을 고정상으로 하는 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography), 또는 세라믹 플루오르아파타이트 젤(fluoroapatite gel; Ca10(PO4)6F2)을 고정상으로 하는 혼합-방식(mixed mode) 크로마토그래피에 의해 분리 및 정제하는 단계; 및 2) 상기 융합 단백질을 Q-세파로스 FF 젤을 고정상으로 하는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 인자 VII을 포함하는 융합 단백질의 분리 및 정제 방법을 제공한다:
<화학식 1>
Figure pat00002
상기 식에서, 매트릭스는 교차결합된 아가로스이며, R은 리간드로서 인자 VII 결합 단백질이다.
본원에서 '인자 VII을 포함하는 융합 단백질'은 혈액 응고 인자 VII(FVII)이 임의의 융합 파트너에 연결된 융합 단백질을 지칭하는 것으로서, 상기 융합 파트너에 의해 인자 VII의 활성, 즉 혈액 응고 기능이 소멸되거나 감소되지 않은 융합 단백질을 의미한다.
상기 융합 단백질의 예로는 인자 VII과 트랜스페린을 포함하는 융합 단백질, 인자 VII과 알부민을 포함하는 융합 단백질, 인자 VII과 피브리노겐을 포함하는 융합 단백질, 인자 VII과 IgA를 포함하는 융합 단백질, 인자 VII과 IgM을 포함하는 융합 단백질, 또는 인자 VII와 항체의 Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 융합 단백질은 인자 VII(FVII) 및 트랜스페린(Tf)을 포함하는 융합 단백질이다. 상기 FVII-Tf 융합 단백질의 FVII 잔기 및 트랜스페린 잔기는 임의의 포유동물, 바람직하게는 인간 FVII 및 인간 트랜스페린으로부터 유래할 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 FVII 잔기 및 트랜스페린은 인간의 혈액에서 발견되는 각각의 천연형 단백질과 95% 이상의 서열 상동성을 갖는다. 가장 바람직하게는, FVII은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지며, 트랜스페린은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는다.
또한, 상기 FVII-Tf 융합 단백질에는 실질적으로 동등한 기능적인 활성을 갖는 기능적 동등물 또는 기능적 유도체가 포함된다. 이러한 기능적 동등물의 예로서, 서열번호 1 및 2로 표시되는 각 아미노산 서열에서의 임의의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환되거나 또는 이들의 조합에 의해 변이된 변이체를 예시할 수 있으며, 이 때 당해 변화는 FVII의 생물학적 활성을 부여하는 활성 부위 또는 활성 도메인을 실질적으로 변화시키지 않는다. 경우에 따라, 상기 FVII-Tf 융합 단백질은 이들의 물리, 화학적 성질을 증가 또는 감소시키는 변형을 가질 수 있어 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation), 아미드화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수 있으며, 이러한 수식에 의해 FVII의 활성이 실질적으로 유지되는 한, 이러한 기능적 유도체도 본 발명의 범위에 포함된다.
상기 FVII-Tf 융합 단백질은 트랜스페린이 FVII의 C-말단에 연결되는 것이 바람직하다. 상기 FVII-트랜스페린의 순서로 연결된 융합 단백질의 경우 FVII의 N 말단이 드러나 트랜스페린-FVII의 순서로 연결된 융합 단백질에 비해 치료제로서의 효과가 뛰어나다(표 3 참조).
또한, 상기 FVII-Tf 융합 단백질은 하기 설명될 링커의 삽입을 용이하게 하기 위하여, FVII와 트랜스페린 사이에 제한효소 인식 서열을 포함할 수 있다. 상기 제한효소로는 당해 기술분야에 알려진 다양한 제한효소 인식 서열이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 Age I 인식 서열(A/CCGGT)을 포함할 수 있다. 즉, FVII의 C-말단에 제한효소 인식 서열이 연결되고, 이에 트랜스페린이 연결된 융합 단백질이 본 발명의 범위에 포함된다.
나아가, 상기 FVII-Tf 융합 단백질은 FVII 잔기와 트랜스페린 잔기의 사이에 링커(linker)를 포함할 수 있다. 링커는 1 내지 100개의 아미노산, 바람직하게는 1 내지 75개의 아미노산, 보다 바람직하게는 5 내지 25개의 아미노산을 가질 수 있는데, FVII 잔기와 트랜스페린 잔기를 분리시킬 수 있는 어떠한 펩타이드라도 가능하다. 링커는 나선형과 같은 안정한 2차 구조를 갖거나 IgG 힌지(hinge) 부분으로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 링커는 수용액 상에서 자유롭게 회전 가능하고 고정된 구조를 갖지 않아, 비면역원성이며, 두 융합 파트너의 잠재적 간섭을 최소화하여 융합 단백질의 FVII 활성을 증가시킨다. 이러한 링커로서, 상기 링커는 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 나선형 링커일 수 있다. 또한, 이러한 유연한 링커는 글라이신(G) 및 세린(S)을 반복적으로 또는 무작위적 패턴으로 포함할 수 있다. 링커의 예는, (GGGGS)N을 포함하고(N은 1 내지 20의 정수임), 바람직하게는, 상기 링커는 서열번호 3 내지 10의 아미노산 서열을 갖는다(표 1 참조). 또한, 상기 링커의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 바람직하게는 85% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열 역시 FVII-Tf 융합 단백질에 사용될 수 있다.
또한, 상기 링커는 손상된 조직에 풍부하게 존재하는 프로테아제에 의해 인식될 수 있는, 프로테아제 절단 부위를 포함할 수 있다. 상기 절단 부위는 트롬빈, 인자 Xa, 인자 IXa 및 인자 VIIa로 이루어진 군에서 선택되는 프로테아제에 의해 절단되는 부위일 수 있다. 이러한 프로테아제 절단 부위를 포함하는 융합 단백질은 작용 부위(working site)에서 FVII 및 트랜스페린의 각각의 단백질로 분리되어 개별 단백질로서 기능하게 된다. 바람직하게는, 상기 링커는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는다(표 1 참조).
상기 링커는 FVII과 트랜스페린 사이에 삽입되어 있는 제한효소 인식 서열을 통해 보다 용이하게 삽입될 수 있다. 따라서, 상기 링커의 앞이나 뒷부분, 또는 이들 모두에 제한효소 인식 서열이 존재할 수 있으며, 이들은 상기 서열에 해당하는 아미노산으로 번역될 수 있다. 일례로, Age I 제한효소 인식 서열이 사용되는 경우, 상기 링커의 앞에 Thr이 존재하고, 상기 링커의 뒤에 Thr-Gly이 존재할 수 있다. 즉, (GGGGS)3과 같은 링커가 사용되는 경우, --T(GGGGS)3TG--의 형태로 존재한다. 상기 링커 앞뒤에 번역되는 아미노산은 사용되는 제한효소 인식 서열에 따라 달라질 수 있으나, 이의 존재로 인하여 융합 단백질이 활성에 변화가 생기지는 않는다(표 5 참조).
상기 FVII-Tf 융합 단백질은 비융합된 천연형 FVII과 비교하여 0.7 이상의 FVII 비활성(specific activity)을 나타낸다. 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 FVII 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 트랜스페린을 포함하는 융합 단백질은, 비융합된 천연형 FVII과 비교하여 약 0.82 내지 0.92의 FVII 비활성을 갖는다(표 2 및 3 참조). 또한, 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 FVII, 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 링커 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 트랜스페린을 포함하는 융합 단백질은, 비융합된 천연형 FVII과 비교하여 약 0.97의 FVII 비활성을 갖는다(표 2 참조). 나아가, 이외 다른 링커를 FVII과 트랜스페린 사이에 삽입시킨 융합 단백질도 비융합된 천연형 FVII과 비교하여 약 0.74 내지 1의 FVII 비활성을 갖는다(표 2 참조). 또한, 상기 FVII-Tf 융합 단백질은 트랜스페린이 결합되지 않은 FVII에 비해 3~4배 정도 긴 반감기를 갖는다(표 6 참조).
본 발명에서 인자 VII을 포함하는 융합 단백질은, 상기 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 숙주 세포에 도입함으로써 발현될 수 있다.
상기 융합 단백질을 코딩하는 DNA는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 융합 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있다. 예를 들어, FVII-Tf 융합 단백질의 경우, 이를 코딩하는 DNA는 바람직하게는 서열번호 13 내지 24의 염기서열로 표시되는 DNA이다.
상기 융합 단백질을 코딩하는 DNA는 재조합 발현 벡터를 이용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 본 발명에서 "벡터"는 숙주 세포에 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 도입하여 융합 단백질을 발현시키기 위한 수단을 말하며, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 포함하고, 바람직하게는 플라스미드 벡터이다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 또한, 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제가능한 발현 벡터인 경우 복제 원점을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 세포 DNA에 통합될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 pcDNA3.1-hygro 벡터에 상기 융합 단백질 서열을 코딩하는 DNA를 삽입하여 제조될 수 있다.
본 발명에서 상기 융합 단백질을 발현하기 위해 사용되는 숙주 세포는 본 기술분야에 알려진 통상적인 동물 세포를 사용할 수 있으며, 그 예로는 차이니스 햄스터 난소 세포(CHO), 인간 배아 신장 세포(HEK293), 햄스터 신장 세포(BHK 21), 인간 간암 세포(Hep G2) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키기 위하여 당 분야에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 이러한 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합법, 인산 칼슘(CaPO4) 침전법 및 염화 칼슘(CaCl2) 침전법 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 1) 동물 세포에서 발현된 인자 VII을 포함하는 융합 단백질을 전술한 구조를 갖는 레진을 고정상으로 하는 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography), 또는 세라믹 플루오르아파타이트 젤(fluoroapatite gel; Ca10(PO4)6F2)을 고정상으로 하는 혼합-방식(mixed mode) 크로마토그래피에 의해 분리 및 정제하는 단계; 및 2) 상기 융합 단백질을 Q-세파로스 FF 젤을 고정상으로 하는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 분리 및 정제하는 단계에 의해 분리 및 정제하는 것을 특징으로 한다.
상기 크로마토그래피를 수행기에 앞서, 본 발명의 융합 단백질은 선택적으로 하기와 같은 단계를 거칠 수 있다:
a) 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양한 다음, 세포와 배양액을 분리하는 단계; 및
b) 상기 세포 배양액을 한외여과(ultrafiltration)하여 농축하는 단계.
상기 단계 a)에서, 당업계에 통상적으로 알려진 배양 방법에 따라 숙주 세포를 배양한다. 이후 배양물을 원심분리에 의해 세포와 배양액으로 분리한 다음, 상기 분리된 배양액을 단계 b)에 적용한다. 상기 단계 a)의 원심분리를 통해 단계 b)의 한외여과 또는 투석 효율을 높일 수 있다.
상기 단계 b)에서, 분리된 세포 배양액을, 바람직하게는 30 KDa 크기의 미 투과 제한(retention time)을 가진 막을 이용하여 한외여과(UF)함으로써 농축시킬 수 있다. 상기 한외여과용 막은 관심대상 단백질의 특성에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 세포 배양액을 관심대상 단백질의 분자량보다 작은 크기를 갖는 막을 통과시킴으로써, 공극 한계를 통해 큰 손실없이 관심대상 단백질을 농축할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양액을 30 KDa의 공극 크기를 갖는 막을 통과시킴으로써 130 KDa의 분자량을 가지는 FVII 융합단백질을 농축할 수 있다. 또한, 상기 한외여과 후, 상기 단계에서 사용된 완충액을 이후 과정에 사용되는 평형 완충액으로 교환할 수 있다. 예시적인 평형 완충액은 25 mM 이미다졸 및 0.02% 트윈 80을 포함하는 완충액(pH 6.5)일 수 있다.
하나의 구체예에서, 상기 선택적인 과정을 거친 농축물은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 레진을 고정상으로 하는 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)에 의해 인자 VII을 포함하는 융합 단백질로 분리 및 정제된다.
<화학식 1>
Figure pat00003
상기 친화성 크로마토그래피에 사용되는 레진은 매트릭스(matrix), 친수성 가교제(cross-linker) 및 리간드(R)로 구성된다. 상기 구조에서, 매트릭스는 교차결합된 아가로스, 바람직하게는 고도 가교성 고유동 아가로스(highly cross-linked high-flow agarose)이며, 리간드(R)은 인자 VII에 결합하는 단백질인 카멜리데(camelidae) 유래의 단일-도메인 항체 단편이다. 상기 레진은 FVII에 특이적으로 결합하는 분자가 아가로즈 단편에 공유결합으로 연결되어 있어 FVII 유래 단백질에 선택적으로 결합할 수 있다. 또한, 상기 레진에서 리간드는 친수성을 가진 긴 가교제를 가지고 있으므로, 분리하고자 하는 목적 단백질을 쉽게 결합할 수 있는 구조로 되어 있다. 상기 레진의 예로는 GE Helathcare(UK)에서 주문자 설계 매질(custom-designed media)로 시판되는 'VII 셀렉트(VII Select)'를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 VII 셀렉트는 하기와 같은 특성을 갖는다.
- 입자 크기: 75 μm(d50v)
- 리간드: 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에서 생산된 재조합 단백질
- 리간드 밀도: 5.7 mg/매질 1 mL
- 결합능: 8 mg/매질 1mL
- 작동 온도: 4℃ 내지 30℃
상기 VII 셀렉트를 이용한 친화성 크로마토그래피는 통상적으로 50 mM 트리스, 1.5 M 염화나트륨 및 50% 프로필렌 글리콜로 구성된 용출 완충액(pH 7.5)을 사용하여 인자 VII를 용출시키는 것으로 알려져 있으나, 본 발명에 따른 인자 VII을 포함하는 융합 단백질의 경우 상기 용출액을 이용시 수율이 크게 저하되는 문제가 있다. 이에 본 발명은 종래 공지된 용출액 대신에 pH 5.0 내지 pH 8.0, 바람직하게는 pH 7.0의 티오시안화 나트륨(2.5 M)의 수성 완충액을 사용하여 인자 VII을 포함하는 융합 단백질의 분리 및 정제 수율을 개선하는 것을 기술적 특징으로 한다.
친화성 크로마토 그래피를 이용하는 본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 레진 고정상을 50 mM 트리스(Tris) 및 150 mM 염화나트륨으로 구성된 완충액(pH 7.5)으로 평형화시킨 후, 잔류되지 않은 단편을 평형에 도달할 때까지(기준선에 일정하게 유지될 때까지) 세척 완충액으로 제거하고 나서, pH 7.0의 티오시안화 나트륨(2.5 M)의 수성 완충액을 사용하여 FVII 융합 단백질을 분리 및 정제할 수 있다.
FVII 융합 단백질의 회수량은 280 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 결정될 수 있다. 회수된 단백질의 활성도는 혈액응고 분석기를 이용하여 샘플 플라즈마와 시약의 혼합액에 적색광(660nm)을 투과시켜 산란되는 빛의 양 즉, 응고된 정도를 측정하여 결정될 수 있다. 본 발명은 전술한 친화성 크로마토그래피에 의해 90% 이상의 수율로 95% 이상의 순도를 가지는 FVII 융합 단백질을 회수할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명에 따른 FVII 융합 단백질은 세라믹 플루오르아파타이트 젤(fluoroapatite gel; Ca10(PO4)6F2)을 고정상으로 하는 혼합-방식(mixed mode) 크로마토그래피에 의해 분리 및 정제된다.
상기 세라믹 플루오르아파타이트 젤을 고정상으로 사용하는 컬럼은 전하 상호작용(charge interaction)을 기초로 낮은 pI 범위를 갖는 단백질을 분리하는 컬럼으로서, 노보(Novo)사의 제품 중 FVII 재조합 단백질의 정제 공정에 사용되는 세라믹 하이드록시아파타이트 컬럼과 유사한 구조로 되어있다. 세라믹 플루오르아파타이트는 세라믹 하이드록시아파타이트의 하이드록시(OH-) 그룹이 플루오르(F-)로 변경된 구조로서, 하이드록시 그룹에 비해 플루오르 이온이 산성 조건에서 레진의 안정성이 높다고 알려져 있다.
상기 세라믹 플루오르아파타이트 고정상은 25 mM 이미다졸 및 0.02% 트윈 80으로 구성된 완충액(pH 6.5)으로 평형화된다. 잔류되지 않은 단편을 평형에 도달할 때까지(기준선에 일정하게 유지될 때까지) 세척 완충액으로 제거한다. 인자 FVII을 용출시키기 위한 용출 완충액으로서, 인산나트륨 및 염화나트륨을 포함하는 pH 5.0 내지 8.0의 수성 완충액, 바람직하게는 pH 6.3인 25 mM 이미다졸, 0.02% 트윈 80, 180-340 mM Na-Pi 용출 완충액이 사용될 수 있다. FVII 융합 단백질의 회수량은 280 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 결정될 수 있다. 회수된 단백질의 활성도는 COASET FVII(Chromogenix, #821900-63) 분석 키트를 이용하여 색소형성능(chromogenic activity)을 분석할 수 있다. 본 발명은 음이온 교환 크로마토그래피를 수행함으로써 90% 이상의 수율로 95% 이상의 순도를 가지는 FVII 융합 단백질을 회수할 수 있다.
본 발명에서, 상기 친화성 크로마토그래피 또는 혼합-방식 크로마토그래피를 거친 융합 단백질은 Q-세파로스 FF 젤을 고정상으로 하는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 분리 및 정제된다.
Q-세파로즈 FF 젤은 강력한 음이온 교환체로서 특정 pH에서 순전하가 음의 값을 가지면 전하 교환을 통하여 단백질의 아민 그룹을 아민 교환체에 결합시켜 숙주 세포 내의 낮은 수준의 비특이적 결합 불순물들을 제거할 수 있다.
상기 Q-세파로스 FF 젤 고정상은 20 mM 트리스, 20 mM 염화나트륨 및 5 mM 염화칼슘으로 구성된 완충액(pH 8.0)으로 평형화된다. 잔류되지 않은 단편을 평형에 도달할 때까지(기준선에 일정하게 유지될 때까지) 세척 완충액으로 제거한다. 활성화된 인자 FVII 융합단백질을 용출시키기 위한 용출 완충액으로서, 10 mM 내지 50 mM의 트리스, 1 mM 내지 10 mM의 염화칼슘 및 50 mM 내지 150 mM의 염화나트륨을 포함하는 pH 5.0 내지 8.0의 수성 완충액, 바람직하게는 20 내지 40 mM의 트리스, 2 내지 5 mM의 염화칼슘 및 60 내지 100 mM의 염화나트륨을 포함하는 pH 5.0 내지 8.0의 수성 완충액, 더욱 바람직하게는 20 mM 트리스, 5 mM 염화칼슘 및 86.64 mM 염화나트륨으로 구성된 pH 8.0의 완충액이 사용될 수 있다.
FVII 융합 단백질의 회수량은 280 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 결정될 수 있다. 회수된 단백질의 활성도는 COASET FVII(Chromogenix, #821900-63) 분석 키트를 이용하여 색소형성능(chromogenic activity)을 분석할 수 있다. 상기 음이온 교환 크로마토그래피를 수행함으로써 50% 이상의 수율로 95% 이상의 순도를 가지는 FVII 융합 단백질을 회수할 수 있다.
본 발명은 VII 셀렉트를 이용한 친화성 크로마토그래피 또는 세라믹 플루오르아파타이트를 이용한 혼합-방식 크로마토그래피 및 Q-세파로스 FF 젤을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피를 사용함으로써, 세포 배양액으로부터 50% 이상의 수율로 95% 이상의 순도를 가지는 FVII 융합 단백질을 회수할 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 인자 VII ( FVII ) 플라스미드 벡터( pcDNA3 .1- hygro - FVII )의 제조
Hep G2 세포(KCLB No. 88065)로부터 정제한 RNA를 역전사를 위한 주형으로 사용하였다. cDNA 전사체를 PCR을 통해 FVII 유전자 특이적인 프라이머 FVII-F 및 FVII-R(서열번호 25 및 26)를 이용하여 인간 FVII 유전자의 ORF(open reading frame)를 증폭하였다. 상기 PCR은 50 μL의 반응액(0.5 μL의 cDNA, 각 0.4 μM의 서열번호 25 및 서열번호 26의 프라이머(10 pmol/μL), 0.2 mM dNTP, 5 unit Taq DNA 폴리머라아제 및 물)을 94℃에서 5분 반응시키고, 94℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 2.5분 반응시키는 것을 1 사이클로 하여 35 사이클 반응시킨 후, 72℃에서 5분 반응시킴으로써 종결시켰다. 정제한 PCR 생성물을 pGEM-T easy 벡터(Promega, Cat #: A1360)에 클로닝하였다. 제한효소 EcoRI 및 NcoI을 처리하여 양성 클론을 선별하였다. 선별한 클론을 DNA 시퀀싱(sequencing)으로 확인하였다. 상기 FVII의 ORF(FVII-ORF)를 발현 벡터로 전달하기 위해, pGEM-T easy 벡터의 FVII-ORF를 제한효소 NotI으로 절단하였다. NotI으로 절단한 FVII-ORF를 T4 DNA 폴리머라아제로 블런트 엔드(blunt end)로 만들어 제한효소 HindIII/XbaI으로 처리한 pcDNA3.1-hygro 벡터(Invitrogen)와 라이게이션(ligation)시켰다. 라이게이션한 벡터를 제한효소 ApaI, XbaI, EcoRI, NcoI 및 PstI을 처리하여 확인하고 DNA 시퀀싱으로도 확인하였다. 이 벡터를 "pcDNA3.1-hygro-FVII"로 명명하였다.
실시예 2: FVII - Tf 발현 벡터( pcDNA3 .1- hygro - FVII - Tf )의 제조
실시예 1에서 제조한 FVII cDNA를 인간 트랜스페린(Tf) cDNA와 연결시켜 동물 세포에서 단일 자이모겐으로서 발현시키고자 하였다. 인간 트랜스페린 cDNA는 오리젠사(Origene, Cat #: SC322130)로부터 구입하여, GenBank accession #: NM_001063.2와 동일한 서열의 cDNA를 확보하였다. 연결에 사용한 프라이머는 FVII의 종결 코돈 및 Tf의 신호 펩타이드를 제거하도록 디자인하였다. 이후, 다양한 크기의 링커를 FVII 와 Tf 사이에 삽입시키기 위해, 트레오닌(Thr) 및 글라이신(Gly)으로 번역되는 AgeI 부위(ACCGGT)를 링킹(linking) 프라이머에 추가하였다. 융합 단백질은 (리더 펩타이드)-(mature FVII)-(Thr-Gly)-(mature Tf)의 구조를 가지게 된다(상기 리더 펩타이드(leader peptide)는 mature FVII에는 존재하지 않는 신호 펩타이드(prepeptide)와 가공 효소(processing enzyme)에 의해 잘리는 펩타이드(propeptide)가 합해진 것으로 38개 아미노산으로 구성되고, 서열번호 1의 아미노산 서열 중 1위치 내지 38위치의 아미노산에 해당함). FVII 및 Tf의 cDNA를 프라이머 FVII-S1, FVII-AS1, Tf-S1 및 Tf-AS1(서열번호 27 내지 30)를 이용하여 증폭하였으며, 벡터는 실시예 1에 기재된 벡터를 사용하였다. 서열번호 27 및 30의 프라이머는 NheI 및 XhoI 부위를 각각 포함한다.
FVII cDNA와 Tf cDNA를 연결하는 클로닝 도식은 도 1에 묘사되어 있다. 먼저, FVII cDNA를 실시예 1에서 제조한 pcDNA3.1-hygro-FVII 벡터에서 PCR 반응으로 증폭하였다. 상기 PCR은 50 μL의 반응액(1 μL 혼합한 벡터 주형, 1 μL 프라이머 FVII-S1 및 FVII-AS1(각 10 μM), 10 μL 5x Phusion HF 완충액, 200 μM dNTP, 0.5 μL Phusion DNA 폴리머라아제(FINNZYMES, #F-530S, 2 units/μL) 및 35.5 μL 물)을 98℃에서 30초 반응시키고, 98℃에서 10초, 60℃에서 45초, 72℃에서 30초 반응시키는 것을 1 사이클로 하여 30 사이클 반응시킨 후, 72℃에서 7분 반응시킴으로써 종결시켰다.
다음으로, Tf를 인간 트랜스페린 cDNA를 주형으로 하여 증폭시켰다. 프라이머 Tf-S1(10 μM) 및 프라이머 Tf-AS1(10 μM)을 사용한 것을 제외하고는 상기 FVII PCR 반응 조건과 동일하게 수행하였다.
증폭한 FVII 및 Tf cDNA를 일련의 제한효소 절단 및 라이게이션에 의해 연결하였다. 각각의 PCR로 증폭된 DNA를 제한효소 AgeI 및 XhoI 또는 NheI으로 처리하였다. 제한효소로 처리한 DNA를 정제하여 1:1 몰비로 라이게이션하였다. 라이게이션한 DNA를 제한효소 NheI/ShoI으로 처리한 pcDNA3.1-hygro 벡터(Invitrogen)에 서브클로닝하였다. 삽입 부위의 크기 및 서열은 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다.
실시예 3: FVII - GS 링커- Tf 발현 벡터의 제조
글라이신 및 세린을 포함하는 5개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 기본 링커 유닛으로 사용하였다. 기본 링커 유닛은 4개의 글라이신 및 하나의 세린을 'GGGGS'로서 포함한다. 상기 기본 GS 링커 유닛(이하, "GS-X 링커"라 함, X는 기본 GS 링커 유닛의 반복 숫자임)은 더 긴 길이의 GS 링커를 만드는 데 사용되었다. 본 발명에서는 GS-1부터 GS-15에 이르는 링커를 제조하였다.
1) FVII-GS-1 링커-Tf 발현 벡터의 제조
기본 GS 링커 유닛 서열을 포함하는 프라이머 GS-FV-AS1 및 GS-Tf-S1(서열번호 31 및 32)을 합성하고, 중첩(overlapping) PCR에 의해 FVII과 Tf 사이에 GS-1 링커를 삽입하였다(도 2 참조).
프라이머 FVII-S1 및 GS-FV-AS1(서열번호 27 및 31)을 사용하여 Phusion DNA 폴리머라아제(FINNZYMES, #F-530S)에 의해 PCR을 수행하여 FVII에 GS-1 링커를 연결하였다. 상기 PCR은 50 μL의 반응액(1 μL pcDNA3.1-hygro-FVII-Tf 벡터, 1 μL FVII-S1(10 pmole/μL), 1 μL GS-FV-AS1(10 pmole/μL), 1 μL의 10 mM dNTP, 10 μL 5x Phusion HF 완충액, 35.5 μL의 물, 0.5 μL의 Phusion DNA 폴리머라아제(2 unit/μL)를 98℃에서 30초 반응시키고, 98℃에서 10초, 64℃에서 30초, 72℃에서 45초 반응시키는 것을 1 사이클로 하여 30 사이클 반응시킨 후, 72℃에서 7분 반응시킴으로써 종결시켰다. 한편, GS-1 링커에 Tf를 연결시킴에 있어서는 상기 반응액의 프라이머 대신 GS-Tf-S1 및 Tf-AS1의 프라이머(서열번호 32 및 30)를 사용한 것을 제외하고는 동일하게 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 생성물들을 주형으로 하여 중첩 PCR을 수행하였다. 상기 중첩 PCR은 1 μL 씩의 증폭된 PCR 생성물, 1 μL FVII-S1(10 pmole/μL, 서열번호 27), 1 μL 안티센스 프라이머(Tf-AS1 10 pmole/μL, 서열번호 30), 10 μL 5x Phusion HF 완충액, 1 μL 10 mM dNTP, 34.5 μL의 물, 0.5 μL의 Phusion DNA 폴리머라아제(2 units/μL)로 구성된 반응액을 98℃에서 1분 반응시키고, 98℃에서 10초, 66/68℃에서 30초, 72℃에서 45초 반응시키는 것을 1 사이클로 하여 45 사이클 반응시킨 후, 72℃에서 7분 반응시킴으로써 종결시켰다. 증폭된 중첩 PCR 생성물은 제한효소 NheI 및 XhoI을 이용하여 pcDNA3.1-hygro-lacZ 벡터에 클로닝하였다.
2) FVII-GS-3 링커-Tf 발현 벡터의 제조
GS-3 및 AgeI 부위를 포함하는 프라이머 GS3-S 및 GS3-AS(서열번호 33 및 34)를 합성하였다. GS-3 이중 나선 링커를 만들기 위해 5 μL GS3-S(100 pmole/μL), 5 μL GS3-AS(100 pmole/μL), 2 μL 10X 어닐링 완충액(100 mM Tris-Cl[pH 8.0], 1 M NaCl, 10 mM EDTA) 및 8 μL의 물을 섞은 후 98℃에서 10분 가열시키고 25℃에서 1시간 동안 냉각시켜 어닐링하였다. 어닐링한 링커를 제한효소 AgeI으로 절단하고 실시예 2에서 제조한 pcDNA3.1-hygro-FVII-Tf 벡터 역시 AgeI으로 절단하였다. 절단한 벡터에 1 μL의 CIP(Calf intestinal phosphatase; NEB, #M0290S)를 37℃ 1시간 처리하고 젤 추출 과정(QIAGEN, #28704)을 거친 뒤 1:3(vector:insert)의 몰비로 T4 DNA 라이게이즈(TAKARA, #2011A)를 이용하여 라이게이션하였다
3) FVII-GS-5 링커-Tf 발현 벡터 내지 FVII-GS-15 링커-Tf 발현 벡터의 제조
GS-5 링커를 포함하는 융합 단백질 발현 벡터의 제조를 위해 새로운 방법을 도입하였다. 다음의 두 단계에 의해 연장된 링커를 갖는 FVII-Tf 융합 벡터를 제조하였다.
첫 번째 단계는 상기에서 수득한 GS-3 링커에 합성한 이중 사슬(ds) GS-2 링커를 추가하는 단계이다. 링커가 연장된 것을 확인한 후, 링커를 절단하여 pcDNA3.1-hygro-FVII-Tf 벡터의 FVII 와 Tf 유전자 사이에 삽입하였다. 예컨대, GS-3 링커를 GS-5링커로 연장하기 위하여, 서열번호 35의 합성된 dsGS-2 유닛을 BglII로 처리한 후, 제한효소 BamHI 및 StuI으로 처리한 pcDNA3.1-hygro-FVII-GS-3-Tf 벡터에 라이게이션하였다. 다음으로, BamHI 및 AgeI의 처리에 의해 링커의 연장을 확인한 후, 연장된 링커를 AgeI으로 절단하여 AgeI 및 CIP로 처리한 pcDNA3.1-hygro-FVII-Tf 벡터에 서브클로닝하였다. GS-7, GS-9, GS-11, GS-13 및 GS-15 링커를 포함하는 FVII-Tf 융합 발현 벡터 또한 같은 방법으로 제조하였다(도 3 참조).
실시예 4: 트롬빈 절단 부위를 포함하는 링커를 포함하는 FVII - Tf 발현 벡터( pcDNA3 .1- hygro - FVII - GS1 -T- Tf )의 제조
GS-1 유닛의 양쪽에 트롬빈 절단 부위를 연결하였다(이하, "GS1-T 링커"라 함). 서열번호 36(센스)의 dsGS1-T 링커를 양 말단에 AgeI 부위를 포함하도록 합성하였다. dsGS1-T 링커를 AgeI으로 처리하고 PCR 정제 키트(Qiagen, cat #: 28104)를 이용하여 정제하였다. 정제된 링커를 CIP/AgeI 처리한 pcDNA3.1-hygro-FVII-Tf 벡터에 라이게이션하였다.
실시예 5: 나선형 링커를 포함하는 FVII - Tf 발현 벡터( pcDNA3 .1- hygro - FVII -Helix-Tf)의 제조
나선형 링커 DNA를 미국특허공개 제2009/0170163호에 개시된 방법으로 제조하였다. 프라이머 Helix linker S 및 Helix linker AS(서열번호 37 및 38)를 이용하여, 상기 제조한 나선형 링커(Helix linker) DNA의 양쪽에 AgeI 부위를 추가하였다. 프라이머 Helix linker S 및 Helix linker AS(서열번호 37 및 38)를 어닐링한 헬릭스 링커를 AgeI으로 처리한 후, AgeI 및 CIP로 처리한 pcDNA3.1-hygro-FVII-Tf 벡터에 삽입하였다. 제조한 pcDNA-hygro-FVII-Helix-Tf 벡터를 DNA 시퀀싱으로서 확인하였다.
실시예 2 내지 5에서 제조한 발현 벡터의 특징을 하기 표 1에 나타내었다.
FVII 융합 단백질 FVII의
C-말단		 링커 서열 (서열번호) 융합 파트너의
N-말단		 링커의
아미노산
개수
FVII-Tf APFP - VPDKTV 0
FVII-GS1-Tf APFP GGGGS (서열번호 3) VPDKTV 5
FVII-GS3-Tf APFP (GGGGS)3 (서열번호 4) VPDKTV 15
FVII-GS5-Tf APFP (GGGGS)5 (서열번호 5) VPDKTV 25
FVII-GS7-Tf APFP (GGGGS)7 (서열번호 6) VPDKTV 35
FVII-GS9-Tf APFP (GGGGS)9 (서열번호 7) VPDKTV 45
FVII-GS11-Tf APFP (GGGGS)11 (서열번호 8) VPDKTV 55
FVII-GS13-Tf APFP (GGGGS)13 (서열번호 9) VPDKTV 65
FVII-GS15-Tf APFP (GGGGS)15 (서열번호 10) VPDKTV 75
FVII-GS1-T-Tf APFP GGGGSLVPRGSGGGS (서열번호 12) VPDKTV 15
FVII-Helix-Tf APFP GA(EAAAK)4A (서열번호 11) VPDKTV 23
* 상기 FVII-Tf의 경우 Age I으로부터 유래된 Thr-Gly이 존재함
* 상기 서열번호 4 내지 12의 링커 서열 앞에는 Age I으로부터 유래된 Thr이 존재하며, 상기 링커 서열 뒤에는 Age I으로부터 유래된 Thr-Gly이 존재함
실험예 1: FVII -융합 단백질의 비활성 측정
실시예 2 내지 5에서 제조한 FVII-융합 단백질을 VKORC1(비타민 K 에폭사이드 환원복합체 서브유닛 1)을 안정적으로 발현하는 CHO 세포주인 CHO(VK2)에서 발현시켰다.
실시예 2 내지 5에서 제조한 발현 벡터를 엔도-프리 플라스미드 맥시 키트(Endo-free plasmid maxi kit; Qiagen, #27104)를 이용하여 정제하였다. β-갈락토시다아제를 형질감염의 대조군으로 사용하였다. CHO(VK2) 세포를 6-웰 플레이트에 농도 1.5 X 106/웰로 시딩(seeding)하였다. 상기 세포를 10% FBS(Lonza, #14-501F), 1X HT(Invitrogen,#11067-030), 4 mM L-글루타민(Lonza, #17-605E) 및 200 μg/mL 하이그로마이신(Invitrogen, #10687-010)을 추가한 α-MEM(Lonza, #12-169F)에서 24시간 배양한 후, 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하여 공급자의 매뉴얼에 따라 형질감염시켰다. 형질감염 4시간 후, 상기 배양액을 무혈청 배양액(OptiMEM)으로 대체하고, 5 μg/mL 비타민 K를 추가하였다. 배양 48시간 후, 배양액을 샘플링하여 -70℃에 저장하였다.
발현된 FVII-융합 단백질의 색소형성능(chromogenic activity) 및 항원의 양을 각각 COATEST Factor VII 분석 키트(Chrmogenix, #821900-63) 및 FVII ELISA 키트(Cedarlene Lab, #CL20030K)를 이용하여 분석하였다. 분석은 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. WHO 표준에 대해 표준화된 표준 인간 혈장을 양 분석에서 대조군 FVII으로 사용하였다. 단백질의 발현은 FVII 및 Tf 항체를 사용하여 웨스턴 블랏 기법을 통해 확인하였다. ELISA 결과에 기초하여 FVII 융합 단백질의 동일한 양을 로딩하였고, 상기 발현된 FVII-융합 단백질은 단편화되지 않고 예상한 크기를 가짐을 알 수 있었다(도 4 참조).
한편, FVII-트랜스페린 융합 단백질의 비활성은 0.74 내지 1을 나타내었다(표 2 참조). 링커를 포함한 FVII-트랜스페린 융합 단백질 또한 70% 이상의 FVII 활성을 보유하였다. 링커의 길이와 FVII 융합 단백질의 비활성은 일정한 관계를 보이지 않았으나, 링커의 길이가 짧은 FVII 융합 단백질이 링커의 길이가 긴 FVII 융합 단백질과 비교하여 다소 높은 비활성을 보였다. 특히, FVII-GS1-Tf 및 FVII-GS1-T-Tf 융합 단백질의 경우 상당히 높은 비활성을 나타내었다(도 5 참조).
FVII 융합 단백질 항원 (%) 활성 (%) 비활성 (활성/항원)
FVII-Tf 53.2 ± 5.0 43.9 ± 0.3 0.82
FVII-GS1-Tf 53.4 ± 3.1 52.0 ± 0.5 0.97
FVII-GS3-Tf 61.9 ± 8.0 57.7 ± 0.2 0.93
FVII-GS5-Tf 69.3 ± 5.6 55.9 ± 1.4 0.81
FVII-GS7-Tf 70.9 ± 8.2 59.3 ± 1.1 0.84
FVII-GS9-Tf 64.2 ± 8.6 47.5 ± 0.7 0.74
FVII-GS11-Tf 59.1 ± 3.9 45.3 ± 0.9 0.77
FVII-GS13-Tf 59.7 ± 5.1 49.1 ± 0.8 0.82
FVII-GS15-Tf 59.2 ± 6.0 50.2 ± 0.5 0.85
FVII-GS1-T-Tf 70.8 ± 8.7 71.0 ± 2.6 1.00
FVII-Helix-Tf 89.0 ± 5.7 78.9 ± 2.2 0.89
실시예 6: Tf 융합 방향에 따른 FVII 융합 단백질 특성 분석
융합 단백질의 융합 방향에 따른 특성 변화를 살펴보기 위하여, 인간 트랜스페린(Tf)을 FVII의 N-말단(terminus)에 연결한 융합 단백질을 제조하고, 이를 FVII의 C-말단(terminus)에 연결한 융합 단백질과 비교하고자 하였다. 구체적인 과정은 하기와 같다.
<6-1> Tf - FVII 및 Tf - GS1T - FVII 발현 벡터 제조
Tf이 FVII의 N-말단에 연결된, 하기 구조를 갖는 2종의 융합 단백질을 제조하였다: 1) (Tf의 리더 펩타이드)-(mature Tf)-(Thr-Gly)-(mature FVII); 및 2) (Tf의 리더 펩타이드)-(mature Tf)-(Thr)-(GS1-T; 서열번호 12)-(Thr-Gly)-(mature FVII).
먼저, 리더 펩타이드를 포함하는 Tf의 유전자 서열을 얻기 위해 증폭에 사용된 정방향 프라이머(Nhe-Tf: 서열번호 46)는 클로닝 목적으로 Nhe I 부위를 포함하도록 고안하였고, 역방향 프라이머(Tf-Age: 서열번호 47)는 트랜스페린의 종결 코돈을 제거하는 동시에 클로닝 목적으로 Age I 부위를 포함하도록 고안하였다. 리더 펩타이드가 제거된 mature FVII을 클로닝하기 위한 정방향 프라이머(Age-FVII: 서열번호 48)는 제한효소 Age I을 포함하도록 고안하였고, 역방향 프라이머(VII-Xho: 서열번호 49)는 제한효소 Xho I을 포함하도록 고안하였다.
Tf 유전자의 경우 실시예 2에서와 같이 오리젠사(Origene, Cat #: SC322130)로부터 구입한 cDNA를 PCR 주형으로 사용하였다. 상기 PCR은 50 ㎕의 반응액(1 ㎕ 벡터 주형, 2 ㎕ 프라이머 Nhe-Tf 및 Tf-Age I(각 10 μM), 10 ㎕ 5x Phusion HF 완충액, 1 ㎕ 10 mM dNTP, 0.5 ㎕ Phusion DNA 폴리머라아제(FINNZYMES, #F-530S, 2units/㎕) 및 33.5 ㎕ 물)을 98℃에서 30초간 반응시키고, 98℃에서 10초, 70℃에서 30초, 72℃에서 36초간 반응시키는 것을 1 사이클로 하여 25 사이클을 반응시킨 후, 72℃에서 10분간 반응시킴으로써 종결시켰다. FVII의 경우 실시예 4에서 pcDNA3.1-hygro-FVII-GS1-T-Tf 벡터를 주형으로 PCR 반응으로 증폭하였다. 프라이머 Age-FVII(10 μM) 및 프라이머 VII-Xho(10 μM)을 사용한 것을 제외하고는 상기 Tf PCR 반응 조건과 동일하게 수행하였다.
상기 PCR로 증폭된 Tf 유전자를 Nhe I/Age I 제한효소를 이용하여 pcDNA3.1-hygro-FVII-GS1T-Tf 벡터에 삽입하여 pcDNA3.1-hygro-Tf-Tf 벡터를 얻었다. 얻어진 pcDNA3.1-hygro-Tf-Tf 벡터 및 상기 FVII PCR 산물을 Age I/Xho I 제한효소로 처리한 후 라이게이션(ligation)을 수행하여 pcDNA3.1-hygro-Tf-FVII 융합 단백질을 포함하는 발현벡터를 구축하였다. pcDNA3.1-hygro-Tf-GS1-T-FVII 발현 벡터는 얻어진 pcDNA3.1-hygro-Tf-FVII에 실시예 4에서와 같이 합성한 dsGS1-T 서열을 Age I 제한효소로 처리하여 삽입함으로써 구축하였다. 제작된 발현 벡터들은 제한효소 지도작성 및 염기서열 분석을 통해 목적한 대로 제작되었음을 확인하였다.
<6-2> 융합 단백질의 발현 및 특성 분석
Tf이 FVII의 C-말단에 융합된 단백질과 Tf이 FVII의 N-말단에 융합된 단백질들의 특성을 파악하기 위해 각각의 발현벡터(pcDNA3.1-hygro-FVII-Tf, pcDNA3.1-hygro-FVII-GS1T-FVII, pcDNA3.1-hygro-Tf-FVII, pcDNA3.1-hygro-Tf-GS1-T-FVII)를 CHO 세포에서 일시적으로 발현시켰다.
구축된 4종의 플라스미드 DNA를 엔도프리-맥시 프렙 키트(Endofree-maxi prep kit; Qiagen)로 분리하였다. 형질감염 실행 하루 전에 T75 플라스크에서 배양한 CHO(DG44) 세포를 트립신으로 처리하여 떼어낸 후, 1.5 X 106 세포/웰 농도로 6-웰 플레이트에 시딩(seeding)하였다. 24시간 후, 제조사 매뉴얼에 따라 형질감염시켰다. 형질감염 4 시간 후에 각 웰의 배지를 제거하고 비타민 K 5 ㎍/mL이 포함된 성장배지 2 mL로 교환하여 주었다. 형질감염 후, 6-웰 플레이트를 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였고, 48시간 후 배지를 원심분리하여 상층액을 1.5 mL 튜브에 분주하여 -70℃에 보관해 두었다가 FVII 색소형성 분석(Chromogenic assay) 및 FVII ELISA시 이용하였으며, 배지를 제거한 플레이트는 웰 당 2 mL의 HBSS로 세척한 다음 용해액(lysis solution; Tropix, #ABX210LM, 1 mM DTT 첨가) 250㎕를 넣고 골고루 퍼지게 한 다음 β-갈락토시다아제 분석을 위해 -70℃에 보관해 두었다.
FVII 색소형성 분석(chromogenic assay) 및 FVII ELISA는 실험예 1과 동일하게 수행하였다. 분석할 시료는 형질감염 이후 냉동 저장한 배지를 실험 직전에 녹여 원심분리로 상층액을 얻어 사용하였다. 분석법의 표준품은 표준 인간 혈장(standard human plasma; Dade Behring, # ORKL13, Lot#503216F)을 사용하였다.
측정 결과를 하기 표 3에 나타내었다. FVII의 N-말단에 Tf를 결합시킨 Tf-FVII 및 Tf-GS1T-Tf의 경우 FVII의 C-말단에 결합시킨 FVII-Tf 및 FVII-GS1T-Tf와 달리 전혀 활성이 측정되지 않았다. 또한, FVII ELISA로 융합 단백질의 양을 측정한 결과 FVII의 N-말단에 Tf를 결합시킨 융합 단백질들의 경우 낮은 양이 검출 되었다. 하지만, Tf의 다클론 항체(polyclonal antibody)를 이용하여 웨스턴 블랏으로 확인한 결과, 융합 방향에 관계없이 비슷한 검출 감도를 나타내었다. 상기 결과들은 Tf을 FVII의 N-말단에 융합시키는 경우, 번역(translation)은 정상적으로 이루어지지만, FVII의 활성이 없는 융합 단백질이 생성됨을 보여준다.
융합 단백질 FVII 활성 (%) FVII 항원 (%) 비활성 (활성/항원)
FVII-Tf 33.8 ± 0.73 37.0 ± 2.17 0.92
Tf-FVII 활성측정 불가 8.0 ± 1.51 -
FVII-GS-1-T-Tf 46.6 ± 0.29 43.0 ± 4.75 1.08
Tf-GS-1-T-Tf 활성측정 불가 13.5 ± 1.01 -
실시예 7: 융합시 사용된 제한효소 인식 서열의 제거에 따른 특성 분석
실시예 2에서는 FVII과 Tf을 융합시 그 사이에 다양한 링커의 삽입을 용이하게 하기 위해 제한효소(Age I) 인식 서열을 사용하였다. 이로 인해 몇몇 융합 단백질은 링커의 양 옆에 상기 제한효소에 의해 암호화되는 Thr과 Gly을 가지게 되었다. 이에 본 실시예에서는 제한효소(Age I) 인식 서열의 유무에 따라 융합 단백질의 성질이 변화하는지를 살펴보고자 하였다.
본 실시예에서는 GS1-T 링커를 포함하는 FVII-GS1-T-Tf 융합 단백질을 대상으로, 돌연변이 유발(mutagenic) 프라이머를 이용하는 PCR 기반의 부위-특이적 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis)을 수행하여 제한효소 인식 서열을 제거하였다. 도 6에서 보는 바와 같이, 링커 앞쪽의 Thr과 뒤쪽의 Thr-Gly을 제거하고자 하였으며, 사용된 프라이머는 하기 표 4와 같다.
프라이머 종류 서열 (5'-> 3') 서열번호
TG del-S CAG CGG AGG CGG TTC AGT CCC TGA TAA AAC TG 50
TG del-AS CAG TTT TAT CAG GGA CTG AAC CGC CTC CGC TG 51
T del-S CGA GCC CCA TTT CCC GGT GGA GGC GGA TC 52
T del-AS GAT CCG CCT CCA CCG GGA AAT GGG GCT CG 53
<7-1> Thr - Gly 제거
PCR 방법으로 돌연변이 유발을 수행하였다. PCR 조건은 pcDNA3.1-hygro-FVII-GS1T-Tf 벡터 1 μL, 센스 프라이머(TG del-S 10 μM) 0.2 μL, 안티센스 프라이머(TG del-AS 10 μM) 0.2 μL, 1 μL의 10 mM dNTP, 4 μL의 5X PCR 완충액, 14 μL의 증류수, 0.2 μL의 Phusion DNA 중합효소(FINNZYMES, #F-530S)를 첨가하여 98℃에서 30초간의 반응을 1 사이클 실시한 후, 98℃에서 10초, 58℃에서 30초, 72℃에서 3분간의 반응을 18 사이클 실시하고 72℃에서 7분간의 반응을 1 사이클 실시하였다. 원래의 주형 DNA를 제거하기 위해 앞서 증폭된 PCR 산물에 DpnI(NEB, #R0176S) 1 μL를 첨가한 뒤 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 DpnI으로 처리된 DNA 10 μL를 HIT 컴피턴트 세포(DH5α, RH617) 50 μL에 형질전환시킨 뒤, LB+amp(10 mg/ml) 고체 배지에 하룻밤동안 배양하였다. 형질전환 결과 얻은 4개의 클론에 대해 염기서열 분석을 의뢰하여 그 중 2 개의 클론에서 돌연변이가 확인되었다.
<7-2> Thr 제거
실시예 <7-1>과 유사한 방법으로 프라이머의 종류를 달리하여 수행하였다. 즉, 실시예 <7-1>에서 돌연변이가 확인된 클론의 플라스미드 DNA 1 μL를 주형으로 사용하고, 1 μL의 센스 프라이머(T del-S 10 pmole) 및 1 μL의 안티센스 프라이머(T del-AS 10pmole)를 사용하여 동일한 조건으로 PCR 방식의 돌연변이 유발을 수행하였다. 선택된 4개의 클론에 대해서 염기서열 분석을 수행하여 그 중 3개의 클론에서 돌연변이가 확인되었다. 확보된 발현 벡터를 pcDNA3.1-hygro-FVII-GS1-T-Tf(M3)으로 명명하였다.
<7-3> 제한효소 인식 서열이 제거된 융합 단백질의 특성 확인
FVII-GS1-T-Tf와 FVII-GS1-T-Tf(M3) 발현 벡터를 CHO 세포에 형질감염시켜 배지 상층액을 확보하였다. 확보한 상층액을 FVII 색소형성 분석(Chromogenix) 및 FVII ELISA 분석(cedarlane)을 수행하여 활성/항원 비율 변화를 확인하였다. 그 결과, 표 5에서 보는 바와 같이, FVII-GS1T-Tf 및 FVII-GS1T-Tf(M3) 융합 단백질의 항원량 및 활성은 거의 동일하였으며 그 비율(비활성) 역시 변화가 없는 것으로 나타났다.
FVII 항원(%) FVII 활성(%) 비활성(활성/항원)
FVII-GS1-T-Tf 34.1 ± 2.1 39.6 ± 2.2 1.16
FVII-GS1-T-Tf(M3) 33.5 ± 4.7 38.0 ± 0.7 1.14
실시예 8: 융합 단백질의 반감기 측정
본 발명에 따른 융합 단백질의 반감기 증가효과를 확인하고자 하였다. 본 실시예에서 사용한 융합 단백질은 FVII-Tf, FVII-GS1-Tf, FVII-GS3-Tf, FVII-GS15-Tf, FVII-GS1-T-Tf을 사용하였으며 대조 물질로 융합 단백질이 없는 원형 FVII과 상용화된 FVIIa인 노보세븐(NovoSeven® Novo Nordisk)을 사용하였다.
<8-1> 시료 준비
1) 발현 배지 확보
융합 단백질이 없는 FVII 및 Tf이 융합된 5종의 FVII 융합 단백질의 발현 벡터를 프리스타일 CHO-S 세포주(FreeStyle CHO-S Cell line; invitrogen, Cat.no. R800-07)에서 발현시켰다. 상기 CHO-S 세포는 8 mM L-glu(GIBCO, L-글루타민 200 mM(100X), Cat. no. 25030-081)이 첨가된 프리스타일 CHO 발현 배지가 담긴 스피너 플라스크(spinner flask)에서 현탁배양시켰다. 상기 배양된 세포를 형질전환 24시간 전에 4×105 세포/ml로 시딩(seeding)하고 1×106 세포/ml이 되었을 때 형질 감염을 수행하였다. 형질 감염에 사용된 DNA는 엔도-프리 맥시 프렙 키트(QIAGEN, Cat no.12362) 또는 엔도-프리 플라스미드 프렙 키트(QIAGEN, 12381)를 이용하여 준비하였고, 프리스타일 맥스 시약(FreeStyle MAX Reagent; Invitrogen, Cat no.16447-100) 형질감염 프로토콜을 참고하여 수행하였다. OptiPRO SFM(Invitrogen, Cat no.12309-019) 8 ml에 500 μg DNA를 넣어준 후 혼합하였다. 또 다른 튜브에 OptiPRO SFM(Invitrogen, Cat no.12309-019) 8 ml에 프리스타일 맥스 시약 500 μL를 넣어준 후 상기 두 혼합물을 조심스럽게 섞어 상온에서 10분간 보관하였다. 10분 후, 상기 혼합물로 프리스타일 CHO-S 세포를 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 37℃, 5% CO2 배양기에서 3일~5일간 배양한 다음 상층액을 분획하였다.
2) 발현 배지의 정제
스피너 플라스크 배양을 통해 얻은 배양액 내에 잔존하는 세포 및 세포의 파편을 제거하기 위해 0.22 μm 필터(corning)로 여과시켰다. 여과된 배양액을 접선 유동 막(tangential-flow membrane; satorious, 30KDa)을 이용하여 한외여과시켜 10배로 농축하였다. 농축된 배지를 세라믹 하이드록시아파타이트(Ceramic Hydroxyapatite; BIO-RAD, 157-0040) 레진이 충진된 XK16/20(GE healthcare) 컬럼에 적용하였다. 하이드록시아파타이트 컬럼은 배지의 적용 전에 10배 컬럼 부피 이상의 평형 완충액(equilibration buffer: 25 mM imidazole, 0.02% Tween 80, 150 mM NaCl, pH 6.5)으로 평형화시켰다. 상기 농축 배지를 흘려준 후 평형 완충액과 세척 완충액-1 (25 mM imidazole, 0.02% Tween 80, 100 mM sodium phosphate, pH 6.3) 및 세척 완충액-2(25 mM imidazole, 0.02% Tween 80, 100 mM sodium phosphate, 1 M NaCl, pH 6.3)를 흘려주어 불순물을 세척하였다. 세척이 완료되면, 컬럼에 결합된 융합 단백질을 용출 완충액(25 mM imidazole, 0.02% Tween 80, 500 mM sodium phosphate, pH 6.3)으로 용출시켰다. 용출액을 정용여과(diafiltration) 방법으로 Q-평형 완충액(25 mM Histidine, 0.02% Tween 80, 25 mM NaCl, pH 6.0)으로 교환한 후 미리 충진된 Hitrap Q HP(1.6×2.5cm, 5 mL) 컬럼에 적용하였다. 이후, Q-평형 완충액으로 세척시킨 다음, 컬럼에 결합된 FVII/융합 단백질을 Q-용출 완충액(25 mM histidine, 0.02% Tween 80, 0.025 mM CaCl2, 1 M NaCl pH 6.0)으로 용출시켰다. 용출된 단백질을 FVII-색소형성 분석, FVII ELISA 분석 및 SDS-PAGE/웨스턴 블랏 방법을 통해 분석하였다.
<8-2> 웨스턴 블랏 분석
2단계 컬럼을 통해 부분 정제된 FVII 및 FVII/Tf 융합 단백질들을 SDS-PAGE/쿠마시 염색을 통해 45% 이상의 순도를 가짐을 확인하였다. 동물 실험을 통해 잔존하는 인간 FVII을 ELISA 방법으로 분석해야 하므로 정제된 단백질 내에 FVII 유래 단편(fragment)의 존재 여부를 웨스턴 블랏으로 확인하고자 하였다. 노보세븐(NovoSeven®; Novo Nordisk, 1.2 mg/vial, 60 KIU) 및 정제된 시료를 0.1 IU(FVII 활성도)/10 μL로 준비한 후 NuPage 4-12% bis-Tri 겔(invitrogen)을 이용하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 전기영동이 끝난 후, PVDF 막으로 이전시킨 후, 상기 막을 블로킹 완충액(25 mM Tris, 150 mM NaCl(pH 7.2), 5% skin milk 및 0.1% Tween 80) 10 mL를 첨가하여 1 시간 동안 상온에서 블로킹하였다. 상기 블로킹 용액을 버리고, 막에 항-FVII 항체(Cat. No F8146, Sigma) 또는 마우스 항-트랜스페린 항체(sc52256, santa cruz)를 각각 1:5000과 1:500 비율로 10 ml(PBS-T 중에 5% skim milk)를 첨가하여 1 시간 동안 교반하였다. 상기 막을 세척액(25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.2)으로 4회 세척한 후 이차 항체인 염소 항-마우스 IgG-HRP 항체(Cat. No G21040, Invitrogen)가 1:50,000 비율로 첨가된 용액 10 mL(PBS-T 중에 5% skim milk)에서 1시간 동안 흔들어 주었다. 세척액(25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.2)으로 막을 4회 세척한 후 수퍼-시그날 웨스트 펨토 믹스(Super-signal west Femto mix; Thermo) 2 mL를 첨가하여 5분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 필름을 현상하였다.
상기 웨스턴 블랏 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서 보는 바와 같이, 정제된 단백질 내에 FVII 유래 절편은 확인되지 않았다. 트랜스페린 블랏도 역시 절편이 확인되지 않았다.
<8-3> 반감기 측정
링커가 없는 융합 단백질 및 4가지 링커(GS1, GS1-T, GS3, GS15)를 갖는 융합 단백질 5종과 동일 조건으로 발현 및 정제된 원형 FVII 및 상용화된 노보세븐 2종의 대조물질의 반감기를 랫트에서 비교하였다. 투여할 시료 및 채취된 시료의 분석은 제조사의 지침에 따라 인간 FVII ELISA(Cedarlane, Paired Antibodies for ELISA Factor VII, #CL20030K)에 의해 수행하였다. 투여할 시료의 농도는 투여희석용액(NaCl 3 mg/mL, CaCl2 이수화물 1.5 mg/mL, 글리실글리신 1.3 mg/mL, 폴리소르베이트 80 0.1 mg/mL, 만니톨 30 mg/mL, pH 5.5)에 희석하여 3회 측정한 값의 평균값으로 정하였다. FVII ELISA 정량 후 각 단백질을 투여희석용액에 희석하여 실험 당일 측정한 랫트(체중 250~300g의 스프라구에 다울레이)의 체중을 기준으로 150 IU/kg으로 꼬리 정맥에 투여하였다(FVII 종류별로 3마리). 약물 투여 전, 약물 투여 후 5분, 15분, 30분, 60분, 1.5시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 24시간, 총 11회로 채혈하였으며, 채혈된 혈액 225 μL와 3.2% 시트르산나트륨 25 μL를 섞어 4℃, 13,000 rpm에서 1분간 원심분리한 후 상층액을 -70℃에 보관하였다. 랫트 혈장 분석은 FVII ELISA 키트(cedarlane)에 사용되는 세척 완충액에 1/50 또는 1/100으로 희석하여 수행하였다. 측정된 시간대별로 잔존하는 인간 FVII 항원량을 이용하여 추세선 수식을 얻었다. 최종적으로 '반감기 = LN(2) / 추세선 기울기'로 계산하여 각 실험 개체들을 비교하였다. 하기 표 6에서 보는 바와 같이, 본 발명의 융합 단백질들은 융합되지 않은 FVII에 비해서 3~4배의 증가된 반감기를 나타내었다.
종류 반감기 (분)
FVII-GS1-Tf 254.2 ±19.1
FVII-GS3-Tf 227.4 ±23.5
FVII-GS1-T-Tf 235.4 ±27.4
FVII-GS15-Tf 257.0 ±23.9
FVII-Tf 277.0 ±24.5
노보세븐 80.3 ±27.4
원형 FVII 59.6 ± 2.9
실시예 2 내지 5에서 제조한 FVII-융합 단백질을 VKORC1(비타민 K 에폭사이드 환원복합체 서브유닛 1)을 안정적으로 발현하는 CHO 세포주인 CHO(VK2)에서 발현시켰다.
실시예 2 내지 5에서 제조한 발현 벡터를 엔도-프리 플라스미드 맥시 키트(Endo-free plasmid maxi kit; Qiagen, #27104)를 이용하여 정제하였다. β-갈락토시다아제를 형질감염의 대조군으로 사용하였다. CHO(VK2) 세포를 6-웰 플레이트에 농도 1.5 X 106/웰로 시딩(seeding)하였다. 상기 세포를 10% FBS(Lonza, #14-501F), 1X HT(Invitrogen,#11067-030), 4 mM L-글루타민(Lonza, #17-605E) 및 200 μg/ml 하이그로마이신(Invitrogen, #10687-010)을 추가한 α-MEM(Lonza, #12-169F)에서 24시간 배양한 후, 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하여 공급자의 매뉴얼에 따라 형질감염시켰다. 형질감염 4시간 후, 상기 배양액을 무혈청 배양액(OptiMEM)으로 대체하고, 5 μg/ml 비타민 K를 추가하였다. 배양 48시간 후, 배양액을 샘플링하여 -70℃에 저장하였다.
실시예 9: FVII 융합 단백질의 분리 및 정제 (1)
<9-1> FVII 융합 단백질의 발현 및 배양액의 분리/농축
FVII-GS1-T-Tf 융합 단백질을 포함하는 발현 벡터를 실시예 <8-1>에 기재된 바와 같이 CHO 세포주에서 발현시켰다. 형질감염된 세포를 37℃, 5% CO2 배양기에서 3일 내지 5일간 배양한 다음 배양액 내에 잔존하는 세포 및 세포의 파편을 제거하기 위해 0.22 μm 필터(corning)로 여과시켰다. 여과된 배양액을 접선 유동 막(tangential-flow membrane; satorious, 30KDa)을 이용하여 한외여과시켜 10배로 농축하였다. 상기 여과막은 FVII 융합 단백질과 같은 130 KDa의 큰 분자량의 물질은 잔류시키고 낮은 분자량 및 무기 염류 그리고 완충액 성분은 공극 막을 통하여 통과시킨다. 상기 농축된 배양액은 초기 배양액의 활성도(%) 대비 수율이 대략 90%로 확인되었다.
<9-2> 친화성 크로마토그래피를 통한 분리 및 정제
상기 <9-1>에서 농축된 배양액을 VII 셀렉트(select) 레진이 충진된 XK16/20 VII 셀렉트(select) 컬럼(GE Helathcare)을 이용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 분리 및 정제하였다.
구체적으로, 크로마토그래피를 수행하기에 앞서, VII 셀렉트 컬럼을 50 mM Tris 및 150 mM 염화나트륨으로 구성된 완충액(pH 7.5)으로 평형화시켰다. 이후, 배양액을 상기 컬럼에 충진하고, 컬럼에 충진된 불순물을 제거하기 위해 50 mM 트리스(Tris) 및 150 mM 염화나트륨으로 구성된 완충액(pH 7.5)으로 컬럼을 세척하였다. 세척 후, 용출 완충액으로서 2.5 M 티오시안화 나트륨의 수성 완충액(pH 7.0)을 사용하여 FVII 융합 단백질을 용출시켰다.
상기 용출물로부터 크로마토그램(GE healthcare, 기기명: AKTA explorer) 및 SDS-PAGE를 사용하여 FVII 융합 단백질을 확인하였다. 상기 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다. 도 8은 VII 셀렉트를 사용한 정제 과정을 크로마토그램을 이용하여 분석한 결과로서, A, B 및 C는 각각 주입한 배양액, 레진에 결합하지 않은 불순물 및 융합 단백질 용출액을 나타낸다.
또한, 도 9는 비환원(non-reducing) 조건 하에서 4-12% 비스 트리스 젤 SDS-PAGE를 수행하고, 실버 염색한 후, Bio-rad ChemiDoc XRS 프로그램 이미지 분석기로 분석한 결과로서, A 및 C는 각각 주입한 배양액 및 융합 단백질 용출액을 나타낸다.
상기 결과에서 보는 바와 같이, VII 셀렉트 컬럼을 이용함으로써 최소 90%의 수율로 최소 95% 이상의 순도를 갖는 FVII 융합 단백질을 얻을 수 있었다.
<9-3> 음이온 교환 크로마토그래피를 통한 분리 및 정제
활성화된 FVII 융합 단백질 단편을 분리하기 위해, <9-2>에서 VII 셀렉트 컬럼을 통과한 용출물을 Q-세파로스 FF 젤이 충진된 컬럼(1.6 X 2.5 cm, 충진량: 5 ml; GE healthcare)을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피에 통과시켜 순전하 반응을 통하여 단백질이 아민 그룹에 결합하는 방법으로 활성화된 FVII 융합 단백질 단편을 추가로 분리 및 정제하였다.
구체적으로, 크로마토그래피를 수행하기에 앞서, <9-2>에서 얻은 용출물을 20 mM 트리스, 20 mM 염화나트륨 및 5 mM 염화칼슘으로 구성된 완충액(pH 8.0)으로 농축 및 완충액 교환을 수행하였다.
이후, 상기 용출물을 Q-세파로스 FF 컬럼에 결합시키기 전에 20 mM 트리스, 20 mM 염화나트륨 및 5 mM 염화칼슘으로 구성된 완충액(pH 8.0)을 이용하여 분당 5 mL의 유속으로 평형화시켰다. 상기 용출물을 컬럼에 충진한 후, 활성화된 형태의 FVII 융합 단백질을 분리하기 위해 20 mM 트리스, 5 mM 염화칼슘 및 20 mM 내지 1 M의 염화나트륨으로 구성된 완충액(pH 8.0)을 이용하여 기울기 용출(Gradient elution) 방법으로 단편을 분리하였다.
상기 용출물로부터 크로마토그램 및 SDS-PAGE를 사용하여 FVII 융합 단백질을 확인하였다. 상기 결과를 도 10 및 11에 나타내었다.
도 10은 Q-세파로스 FF 젤을 이용한 정제 과정을 크로마토그램을 이용하여 분석한 결과로서, A 및 B는 각각 활성화된 융합 단백질 용출액 및 불활성화된 융합 단백질 용출액을 나타낸다. 상기 크로마토그램 결과, 86.64 mM의 염화나트륨 농도에서 활성화된 형태의 단편 A가 용출됨을 확인할 수 있었다.
또한, 도 11은 환원(reducing) 조건 하에서 4-12% 비스 트리스 젤 SDS-PAGE를 수행하고, 쿠마시 염색한 후, Bio-rad ChemiDoc XRS 프로그램 이미지 분석기로 분석한 결과이다. 상기 도 11에서 A 및 B는 각각 활성화된 융합 단백질 용출액 및 불활성화된 형태의 단편을 3 ug 농도로 정량하여 분석한 결과이다. 상기 SDS-PAGE 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 정제 방법을 통해 활성화된 단편(A)과 불활성화된 단편(B)을 분리할 수 있음을 확인할 수 있다.
상기 결과에서 보는 바와 같이, Q-세파로스 FF 컬럼을 이용함으로써 최소 50%의 수율로 최소 98% 이상의 순도를 갖는 FVII 융합 단백질을 얻을 수 있었다.
비교예 1: 다른 용출 조건 하에 친화성 크로마토그래피를 통한 FVII 융합 단백질의 분리 및 정제
실시예 <9-2>의 친화성 크로마토그래피를 이용한 분리 및 정제에서 2.5 M 티오시안화 나트륨으로 구성된 용출 완충액(pH 7.0) 대신에 50 mM 트리스, 1.5 M 염화나트륨 및 50% 프로필렌 글리콜로 구성된 용출 완충액(pH 7.5)을 사용하는 것을 제외하고 실시예 <9-2>의 과정을 반복하여 FVII 융합 단백질을 분리 및 정제하였다.
상기 방법에 의해 용출된 용출물을 실시예 <9-2>에서와 동일한 방식으로 크로마토그램에 의해 분석하였다. 상기 결과를 도 12에 나타내었다. 상기 도면에서 A, B 및 C는 각각 주입한 배양액, 레진에 결합하지 않은 불순물 및 융합 단백질 용출액을 나타낸다.
상기 도 12에서 보는 바와 같이, 50 mM 트리스, 1.5 M 염화나트륨 및 50% 프로필렌 글리콜로 구성된 용출 완충액(pH 7.5)을 사용하는 경우 FVII 융합 단백질이 상당히 낮은 수율(5% 이하)로 얻어짐을 확인할 수 있었다. 실시예 <9-2>와 비교예 1의 결과를 비교해볼 때, FVII 융합 단백질의 경우 친화성 크로마토그래피에서 50 mM 트리스, 1.5 M 염화나트륨 및 50% 프로필렌 글리콜로 구성된 용출 완충액 대신에 2.5 M 티오시안화 나트륨의 수성 완충액(pH 7.0)을 사용하는 것이 FVII 융합 단백질을 분리 및 정제하는데 더 효과적임을 알 수 있다.
실시예 10: FVII 융합 단백질의 분리 및 정제 (2)
상기 실시예 9에서 <9-2>의 친화성 크로마토그래피 대신에 하기의 하기의 혼합-방식(mixed mode) 크로마토그래피를 사용하는 것을 제외하고, 실시예 9의 과정을 반복하였다.
<10-1> 혼합-방식( mixed mode ) 크로마토그래피를 통한 분리 및 정제
실시예 <9-1>에서 농축된 배양액을 세라믹 플루오르아파타이트 젤(fluoroapatite gel; Ca10(PO4)6F2)이 충진된 컬럼(Bio rad)을 이용하여 혼합-방식(mixed mode) 크로마토그래피에 의해 분리 및 정제하였다.
구체적으로, 크로마토그래피를 수행하기에 앞서, XK16/20 세라믹 플루오르아파타이트 컬럼을 25 mM 이미다졸 및 0.02% 트윈 80으로 구성된 완충액(pH 6.5)으로 평형화시켰다. 이후, 실시예 <9-1>에서 얻은 농축된 배양액을 상기 컬럼에 충진하고, 컬럼에 충진된 불순물 및 원하지 않는 이형체를 제거하기 위해 25 mM 이미다졸, 0.02% 트윈 80 및 100 mM Na-Pi로 구성된 완충액(pH 6.3)으로 1차 세척한 후, 25 mM 이미다졸, 0.02% 트윈 80, 100 mM Na-Pi 및 0.2 M 염화나트륨(pH 6.3)으로 구성된 완충액으로 2차 세척하였다. 세척 후, 25 mM 이미다졸, 0.02% 트윈 80 및 180-340 mM Na-Pi로 구성된 용출 완충액(pH 6.3)을 사용하여 인산 단계 구배(phosphate step gradient) 방법에 의해 FVII 융합 단백질을 용출시켰다. 상기 용출물로부터 크로마토그램 및 SDS-PAGE를 사용하여 FVII 융합 단백질을 확인하였다. 상기 결과를 도 13 및 도 14에 나타내었다. 도 13은 세라믹 플루오르아파타이트 젤을 사용한 정제 과정을 크로마토그램을 이용하여 분석한 결과로서, A, B, C 및 D는 각각 주입한 배양액, 세척 1단계, 세척 2단계 및 융합 단백질 용출액을 나타낸다. 또한, 도 14는 비환원(non-reducing) 조건 하에서 4-12% 비스 트리스 젤 SDS-PAGE를 수행하고, 실버 염색한 후, Bio-rad ChemiDoc XRS 프로그램 이미지 분석기로 분석한 결과로서, A, B, C 및 D는 각각 주입한 배양액, 세척 1단계, 세척 2단계 및 융합 단백질 용출액을 나타낸다.
상기 결과에서 보는 바와 같이, 혼합-방식 세라믹 플루오르아파타이트 컬럼을 이용함으로써 최소 60%의 수율로 최소 90% 이상의 순도를 갖는 FVII 융합 단백질을 얻을 수 있었다.
<10-2> 음이온 교환 크로마토그래피를 통한 분리 및 정제
이어서, 상기 세라믹 플루오르아파타이트 젤을 통과한 용출물을 실시예 <9-3>에서와 같이 음이온 교환 크로마토그래피를 통하여 분리 및 정제하였다. 상기 분리 및 정제를 통해 최소 50%의 수율로 최소 98% 이상의 순도를 갖는 FVII 융합 단백질을 얻을 수 있었다.
비교예 2: 세라믹 하이드록시아파타이트 컬럼을 사용한 FVII 융합 단백질의 분리 및 정제
실시예 <10-1>의 혼합-방식 크로마토그래피를 이용한 분리 및 정제에서, 세라믹 플루오르아파타이트 컬럼 대신에 하기와 같이 세라믹 하이드록시아파타이트 컬럼을 사용하는 것을 제외하고, 실시예 <10-1>의 과정을 반복하였다.
구체적으로, 크로마토그래피를 수행하기에 앞서, XK16/20 세라믹 하이드록시아파타이트 컬럼(Bio-rad)을 25 mM 이미다졸, 100 mM 염화나트륨 및 0.02% 트윈 80으로 구성된 완충액(pH 6.5)으로 평형화시켰다. 이후, 실시예 <9-1>에서 얻은 농축된 배양액을 상기 컬럼에 충진하고, 컬럼에 충진된 불순물 및 원하지 않는 이형체를 제거하기 위해 25 mM 이미다졸, 0.02% 트윈 80 및 100 mM Na-Pi로 구성된 완충액(pH 6.3)으로 1차 세척한 후, 25 mM 이미다졸, 0.02% 트윈 80, 100 mM Na-Pi 및 0.6 M 염화나트륨으로 구성된 완충액(pH 6.3)으로 2차 세척하였다. 세척 후, 25 mM 이미다졸, 0.02% 트윈 80, 180-340 mM Na-Pi로 구성된 용출 완충액(pH 6.3)을 사용하여 인산 단계 구배(phosphate step gradient) 방법에 의해 FVII 융합 단백질을 용출시켰다. 상기 용출물로부터 크로마토그램 및 SDS-PAGE를 사용하여 FVII 융합 단백질을 확인하였다. 상기 결과를 도 15 및 도 16에 나타내었다. 도 15는 세라믹 하이드록시아파타이트 젤을 이용한 정제 과정을 크로마토그램을 이용하여 분석한 결과로서, A, B, C 및 D는 각각 주입한 배양액, 세척 1단계, 세척 2단계 및 융합 단백질 용출액을 나타낸다. 또한, 도 16은 비환원(non-reducing) 조건 하에서 4-12% 비스 트리스 젤 SDS-PAGE를 수행하고, 실버 염색한 후, Bio-rad ChemiDoc XRS 프로그램 이미지 분석기로 분석한 결과로서, A, B, C 및 D는 각각 주입한 배양액, 세척 1단계, 세척 2단계 및 융합 단백질 용출액을 나타낸다.
상기 결과에서 보는 바와 같이, 세라믹 하이드록시아파타이트 컬럼을 이용한 결과, 최소 수율 52%로 최소 90% 이상의 순도를 갖는 FVII 융합 단백질을 얻을 수 있었다. 상기 결과를 실시예 <10-1>에서 수행한 세라믹 플루오르아파타이트 컬럼과 비교하여 볼 때 수율이 저하됨을 알 수 있었다.
<110> SK CHEMICALS CO., LTD. <120> METHOD FOR ISOLATING AND PURIFYING A FUSION PROTEIN COMPRISING FACTOR VII <130> FPD/201402-0042 <150> 10-2013-0019913 <151> 2013-02-25 <160> 53 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 444 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(444) <223> Factor VII protein <400> 1 Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln 1 5 10 15 Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val 20 25 30 Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro 35 40 45 Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu 50 55 60 Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile 65 70 75 80 Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly 85 90 95 Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro 100 105 110 Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile 115 120 125 Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr 130 135 140 Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala 145 150 155 160 Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile 165 170 175 Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val 180 185 190 Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu 195 200 205 Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile 210 215 220 Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg 225 230 235 240 Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly 245 250 255 Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr 260 265 270 Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln 275 280 285 Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg 290 295 300 Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser 305 310 315 320 Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met 325 330 335 Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser 340 345 350 Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala 355 360 365 Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly 370 375 380 Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val 385 390 395 400 Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr 405 410 415 Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu 420 425 430 Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 435 440 <210> 2 <211> 679 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(679) <223> Transferrin protein <400> 2 Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu His Glu Ala 1 5 10 15 Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val Ile Pro Ser 20 25 30 Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr Leu Asp Cys 35 40 45 Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Ala 50 55 60 Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu Lys Pro Val 65 70 75 80 Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr Phe Tyr Tyr 85 90 95 Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met Asn Gln Leu 100 105 110 Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp 115 120 125 Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu Pro Arg Lys 130 135 140 Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser Cys Ala Pro 145 150 155 160 Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu Cys Pro Gly 165 170 175 Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe 180 185 190 Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Ser 195 200 205 Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu 210 215 220 Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu Tyr Lys Asp 225 230 235 240 Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Arg Ser Met 245 250 255 Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln Ala Gln Glu 260 265 270 His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe Ser Ser Pro 275 280 285 His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly Phe Leu Lys 290 295 300 Val Pro Pro Arg 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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 5 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker GS-5 <400> 5 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 6 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker GS-7 <400> 6 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 7 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker GS-9 <400> 7 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 <210> 8 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker GS-11 <400> 8 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 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Sequence <220> <223> Linker Helix <400> 11 Gly Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala 1 5 10 15 Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala 20 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker GS1-T <400> 12 Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 13 <211> 3378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene sequence encoding FVII-Tf protein <400> 13 atggtctccc aggccctcag gctcctctgc cttctgcttg ggcttcaggg ctgcctggct 60 gcagtcttcg taacccagga ggaagcccac ggcgtcctgc accggcgccg gcgcgccaac 120 gcgttcctgg aggagctgcg gccgggctcc ctggagaggg agtgcaagga ggagcagtgc 180 tccttcgagg aggcccggga gatcttcaag gacgcggaga ggacgaagct gttctggatt 240 tcttacagtg atggggacca gtgtgcctca agtccatgcc agaatggggg ctcctgcaag 300 gaccagctcc agtcctatat ctgcttctgc ctccctgcct tcgagggccg gaactgtgag 360 acgcacaagg atgaccagct gatctgtgtg aacgagaacg gcggctgtga gcagtactgc 420 agtgaccaca cgggcaccaa gcgctcctgt cggtgccacg aggggtactc tctgctggca 480 gacggggtgt cctgcacacc cacagttgaa tatccatgtg gaaaaatacc tattctagaa 540 aaaagaaatg ccagcaaacc ccaaggccga attgtggggg gcaaggtgtg ccccaaaggg 600 gagtgtccat ggcaggtcct gttgttggtg aatggagctc agttgtgtgg ggggaccctg 660 atcaacacca tctgggtggt ctccgcggcc cactgtttcg acaaaatcaa gaactggagg 720 aacctgatcg cggtgctggg cgagcacgac ctcagcgagc acgacgggga tgagcagagc 780 cggcgggtgg cgcaggtcat catccccagc acgtacgtcc cgggcaccac caaccacgac 840 atcgcgctgc tccgcctgca ccagcccgtg gtcctcactg accatgtggt gcccctctgc 900 ctgcccgaac ggacgttctc tgagaggacg ctggccttcg tgcgcttctc attggtcagc 960 ggctggggcc agctgctgga ccgtggcgcc acggccctgg agctcatggt cctcaacgtg 1020 ccccggctga tgacccagga ctgcctgcag cagtcacgga aggtgggaga ctccccaaat 1080 atcacggagt acatgttctg tgccggctac tcggatggca gcaaggactc ctgcaagggg 1140 gacagtggag gcccacatgc cacccactac cggggcacgt ggtacctgac gggcatcgtc 1200 agctggggcc agggctgcgc aaccgtgggc cactttgggg tgtacaccag ggtctcccag 1260 tacatcgagt ggctgcaaaa gctcatgcgc tcagagccac gcccaggagt cctcctgcga 1320 gccccatttc ccaccggtgt ccctgataaa actgtgagat ggtgtgcagt gtcggagcat 1380 gaggccacta agtgccagag tttccgcgac catatgaaaa gcgtcattcc atccgatggt 1440 cccagtgttg cttgtgtgaa gaaagcctcc taccttgatt gcatcagggc cattgcggca 1500 aacgaagcgg atgctgtgac actggatgca ggtttggtgt atgatgctta cctggctccc 1560 aataacctga agcctgtggt ggcagagttc tatgggtcaa aagaggatcc acagactttc 1620 tattatgctg ttgctgtggt gaagaaggat agtggcttcc agatgaacca gcttcgaggc 1680 aagaagtcct gccacacggg tctaggcagg tccgctgggt ggaacatccc cataggctta 1740 ctttactgtg acttacctga gccacgtaaa cctcttgaga aagcagtggc caatttcttc 1800 tcgggcagct gtgccccttg tgcggatggg acggacttcc cccagctgtg tcaactgtgt 1860 ccagggtgtg gctgctccac ccttaaccaa tacttcggct actcaggagc cttcaagtgt 1920 ctgaaggatg gtgctgggga tgtggccttt gtcaagcact cgactatatt tgagaacttg 1980 gcaaacaagg ctgacaggga ccagtatgag ctgctttgcc tggacaacac ccggaagccg 2040 gtagatgaat acaaggactg ccacttggcc caggtccctt ctcataccgt cgtggcccga 2100 agtatgggcg gcaaggagga cttgatctgg gagcttctca accaggccca ggaacatttt 2160 ggcaaagaca aatcaaaaga attccaacta ttcagctctc ctcatgggaa ggacctgctg 2220 tttaaggact ctgcccacgg gtttttaaaa gtccccccca ggatggatgc caagatgtac 2280 ctgggctatg agtatgtcac tgccatccgg aatctacggg aaggcacatg cccagaagcc 2340 ccaacagatg aatgcaagcc tgtgaagtgg tgtgcgctga gccaccacga gaggctcaag 2400 tgtgatgagt ggagtgttaa cagtgtaggg aaaatagagt gtgtatcagc agagaccacc 2460 gaagactgca tcgccaagat catgaatgga gaagctgatg ccatgagctt ggatggaggg 2520 tttgtctaca tagcgggcaa gtgtggtctg gtgcctgtct tggcagaaaa ctacaataag 2580 agcgataatt gtgaggatac accagaggca gggtattttg ctgtagcagt ggtgaagaaa 2640 tcagcttctg acctcacctg ggacaatctg aaaggcaaga agtcctgcca tacggcagtt 2700 ggcagaaccg ctggctggaa catccccatg ggcctgctct acaataagat caaccactgc 2760 agatttgatg aatttttcag tgaaggttgt gcccctgggt ctaagaaaga ctccagtctc 2820 tgtaagctgt gtatgggctc aggcctaaac ctgtgtgaac ccaacaacaa agagggatac 2880 tacggctaca caggcgcttt caggtgtctg gttgagaagg gagatgtggc ctttgtgaaa 2940 caccagactg tcccacagaa cactggggga aaaaaccctg atccatgggc taagaatctg 3000 aatgaaaaag actatgagtt gctgtgcctt gatggtacca ggaaacctgt ggaggagtat 3060 gcgaactgcc acctggccag agccccgaat cacgctgtgg tcacacggaa agataaggaa 3120 gcttgcgtcc acaagatatt acgtcaacag cagcacctat ttggaagcaa cgtaactgac 3180 tgctcgggca acttttgttt gttccggtcg gaaaccaagg accttctgtt cagagatgac 3240 acagtatgtt tggccaaact tcatgacaga aacacatatg aaaaatactt aggagaagaa 3300 tatgtcaagg ctgttggtaa cctgagaaaa tgctccacct catcactcct ggaagcctgc 3360 actttccgta gaccttaa 3378 <210> 14 <211> 3387 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene sequence encoding FVII-GS1-Tf protein <400> 14 atggtctccc aggccctcag gctcctctgc cttctgcttg ggcttcaggg ctgcctggct 60 gcagtcttcg taacccagga ggaagcccac ggcgtcctgc accggcgccg gcgcgccaac 120 gcgttcctgg aggagctgcg gccgggctcc ctggagaggg agtgcaagga ggagcagtgc 180 tccttcgagg aggcccggga gatcttcaag gacgcggaga ggacgaagct gttctggatt 240 tcttacagtg atggggacca gtgtgcctca agtccatgcc agaatggggg ctcctgcaag 300 gaccagctcc agtcctatat ctgcttctgc ctccctgcct tcgagggccg gaactgtgag 360 acgcacaagg atgaccagct gatctgtgtg aacgagaacg gcggctgtga gcagtactgc 420 agtgaccaca cgggcaccaa gcgctcctgt cggtgccacg aggggtactc tctgctggca 480 gacggggtgt cctgcacacc cacagttgaa tatccatgtg gaaaaatacc tattctagaa 540 aaaagaaatg ccagcaaacc ccaaggccga attgtggggg gcaaggtgtg ccccaaaggg 600 gagtgtccat ggcaggtcct gttgttggtg aatggagctc agttgtgtgg ggggaccctg 660 atcaacacca tctgggtggt ctccgcggcc cactgtttcg acaaaatcaa gaactggagg 720 aacctgatcg cggtgctggg cgagcacgac ctcagcgagc acgacgggga tgagcagagc 780 cggcgggtgg cgcaggtcat catccccagc acgtacgtcc cgggcaccac caaccacgac 840 atcgcgctgc tccgcctgca ccagcccgtg gtcctcactg accatgtggt gcccctctgc 900 ctgcccgaac ggacgttctc tgagaggacg ctggccttcg tgcgcttctc attggtcagc 960 ggctggggcc agctgctgga ccgtggcgcc acggccctgg agctcatggt cctcaacgtg 1020 ccccggctga tgacccagga ctgcctgcag cagtcacgga aggtgggaga ctccccaaat 1080 atcacggagt acatgttctg tgccggctac tcggatggca gcaaggactc ctgcaagggg 1140 gacagtggag gcccacatgc cacccactac cggggcacgt ggtacctgac gggcatcgtc 1200 agctggggcc agggctgcgc aaccgtgggc cactttgggg tgtacaccag ggtctcccag 1260 tacatcgagt ggctgcaaaa gctcatgcgc tcagagccac gcccaggagt cctcctgcga 1320 gccccatttc ccggtggagg cggatccgtc cctgataaaa ctgtgagatg gtgtgcagtg 1380 tcggagcatg aggccactaa gtgccagagt ttccgcgacc atatgaaaag cgtcattcca 1440 tccgatggtc ccagtgttgc ttgtgtgaag aaagcctcct accttgattg catcagggcc 1500 attgcggcaa acgaagcgga tgctgtgaca ctggatgcag gtttggtgta tgatgcttac 1560 ctggctccca ataacctgaa gcctgtggtg gcagagttct atgggtcaaa agaggatcca 1620 cagactttct attatgctgt tgctgtggtg aagaaggata gtggcttcca gatgaaccag 1680 cttcgaggca agaagtcctg ccacacgggt ctaggcaggt ccgctgggtg gaacatcccc 1740 ataggcttac tttactgtga cttacctgag ccacgtaaac ctcttgagaa agcagtggcc 1800 aatttcttct cgggcagctg tgccccttgt gcggatggga cggacttccc ccagctgtgt 1860 caactgtgtc cagggtgtgg ctgctccacc cttaaccaat acttcggcta ctcaggagcc 1920 ttcaagtgtc tgaaggatgg tgctggggat gtggcctttg tcaagcactc gactatattt 1980 gagaacttgg caaacaaggc tgacagggac cagtatgagc tgctttgcct ggacaacacc 2040 cggaagccgg tagatgaata caaggactgc cacttggccc aggtcccttc tcataccgtc 2100 gtggcccgaa gtatgggcgg caaggaggac ttgatctggg agcttctcaa ccaggcccag 2160 gaacattttg gcaaagacaa atcaaaagaa ttccaactat tcagctctcc tcatgggaag 2220 gacctgctgt ttaaggactc tgcccacggg tttttaaaag tcccccccag gatggatgcc 2280 aagatgtacc tgggctatga gtatgtcact gccatccgga atctacggga aggcacatgc 2340 ccagaagccc caacagatga atgcaagcct gtgaagtggt gtgcgctgag ccaccacgag 2400 aggctcaagt gtgatgagtg gagtgttaac agtgtaggga aaatagagtg tgtatcagca 2460 gagaccaccg aagactgcat cgccaagatc atgaatggag aagctgatgc catgagcttg 2520 gatggagggt ttgtctacat agcgggcaag tgtggtctgg tgcctgtctt ggcagaaaac 2580 tacaataaga gcgataattg tgaggataca ccagaggcag ggtattttgc tgtagcagtg 2640 gtgaagaaat cagcttctga cctcacctgg gacaatctga aaggcaagaa gtcctgccat 2700 acggcagttg gcagaaccgc tggctggaac atccccatgg gcctgctcta caataagatc 2760 aaccactgca gatttgatga atttttcagt gaaggttgtg cccctgggtc taagaaagac 2820 tccagtctct gtaagctgtg tatgggctca ggcctaaacc tgtgtgaacc caacaacaaa 2880 gagggatact acggctacac aggcgctttc aggtgtctgg ttgagaaggg agatgtggcc 2940 tttgtgaaac accagactgt cccacagaac actgggggaa aaaaccctga tccatgggct 3000 aagaatctga atgaaaaaga ctatgagttg ctgtgccttg atggtaccag gaaacctgtg 3060 gaggagtatg cgaactgcca cctggccaga gccccgaatc acgctgtggt cacacggaaa 3120 gataaggaag cttgcgtcca caagatatta cgtcaacagc agcacctatt tggaagcaac 3180 gtaactgact gctcgggcaa cttttgtttg ttccggtcgg aaaccaagga ccttctgttc 3240 agagatgaca cagtatgttt ggccaaactt catgacagaa acacatatga aaaatactta 3300 ggagaagaat atgtcaaggc tgttggtaac ctgagaaaat gctccacctc atcactcctg 3360 gaagcctgca ctttccgtag accttaa 3387 <210> 15 <211> 3426 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gene sequence encoding FVII-GS3-Tf protein <400> 15 atggtctccc aggccctcag gctcctctgc cttctgcttg ggcttcaggg ctgcctggct 60 gcagtcttcg taacccagga ggaagcccac ggcgtcctgc accggcgccg gcgcgccaac 120 gcgttcctgg aggagctgcg gccgggctcc ctggagaggg agtgcaagga ggagcagtgc 180 tccttcgagg aggcccggga gatcttcaag gacgcggaga ggacgaagct gttctggatt 240 tcttacagtg atggggacca gtgtgcctca agtccatgcc agaatggggg ctcctgcaag 300 gaccagctcc agtcctatat ctgcttctgc ctccctgcct tcgagggccg gaactgtgag 360 acgcacaagg atgaccagct gatctgtgtg aacgagaacg gcggctgtga gcagtactgc 420 agtgaccaca cgggcaccaa gcgctcctgt cggtgccacg aggggtactc tctgctggca 480 gacggggtgt cctgcacacc cacagttgaa tatccatgtg gaaaaatacc tattctagaa 540 aaaagaaatg ccagcaaacc ccaaggccga attgtggggg gcaaggtgtg ccccaaaggg 600 gagtgtccat ggcaggtcct gttgttggtg aatggagctc agttgtgtgg ggggaccctg 660 atcaacacca tctgggtggt ctccgcggcc cactgtttcg acaaaatcaa gaactggagg 720 aacctgatcg cggtgctggg cgagcacgac ctcagcgagc acgacgggga tgagcagagc 780 cggcgggtgg cgcaggtcat catccccagc acgtacgtcc cgggcaccac caaccacgac 840 atcgcgctgc tccgcctgca ccagcccgtg gtcctcactg accatgtggt gcccctctgc 900 ctgcccgaac ggacgttctc tgagaggacg ctggccttcg tgcgcttctc attggtcagc 960 ggctggggcc agctgctgga ccgtggcgcc acggccctgg agctcatggt cctcaacgtg 1020 ccccggctga tgacccagga ctgcctgcag cagtcacgga aggtgggaga ctccccaaat 1080 atcacggagt acatgttctg tgccggctac tcggatggca 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tgccggctac tcggatggca gcaaggactc ctgcaagggg 1140 gacagtggag gcccacatgc cacccactac cggggcacgt ggtacctgac gggcatcgtc 1200 agctggggcc agggctgcgc aaccgtgggc cactttgggg tgtacaccag ggtctcccag 1260 tacatcgagt ggctgcaaaa gctcatgcgc tcagagccac gcccaggagt cctcctgcga 1320 gccccatttc ccaccggtgc tgaagctgca gccaaagaag ctgcagccaa agaggccgca 1380 gctaaggaag ccgcagcaaa agctaccggt gtccctgata aaactgtgag atggtgtgca 1440 gtgtcggagc atgaggccac taagtgccag agtttccgcg accatatgaa aagcgtcatt 1500 ccatccgatg gtcccagtgt tgcttgtgtg aagaaagcct cctaccttga ttgcatcagg 1560 gccattgcgg caaacgaagc ggatgctgtg acactggatg caggtttggt gtatgatgct 1620 tacctggctc ccaataacct gaagcctgtg gtggcagagt tctatgggtc aaaagaggat 1680 ccacagactt tctattatgc tgttgctgtg gtgaagaagg atagtggctt ccagatgaac 1740 cagcttcgag gcaagaagtc ctgccacacg ggtctaggca ggtccgctgg gtggaacatc 1800 cccataggct tactttactg tgacttacct gagccacgta aacctcttga gaaagcagtg 1860 gccaatttct tctcgggcag ctgtgcccct tgtgcggatg ggacggactt cccccagctg 1920 tgtcaactgt gtccagggtg 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cgctgggtgg aacatcccca taggcttact ttactgtgac 1800 ttacctgagc cacgtaaacc tcttgagaaa gcagtggcca atttcttctc gggcagctgt 1860 gccccttgtg cggatgggac ggacttcccc cagctgtgtc aactgtgtcc agggtgtggc 1920 tgctccaccc ttaaccaata cttcggctac tcaggagcct tcaagtgtct gaaggatggt 1980 gctggggatg tggcctttgt caagcactcg actatatttg agaacttggc aaacaaggct 2040 gacagggacc agtatgagct gctttgcctg gacaacaccc ggaagccggt agatgaatac 2100 aaggactgcc acttggccca ggtcccttct cataccgtcg tggcccgaag tatgggcggc 2160 aaggaggact tgatctggga gcttctcaac caggcccagg aacattttgg caaagacaaa 2220 tcaaaagaat tccaactatt cagctctcct catgggaagg acctgctgtt taaggactct 2280 gcccacgggt ttttaaaagt cccccccagg atggatgcca agatgtacct gggctatgag 2340 tatgtcactg ccatccggaa tctacgggaa ggcacatgcc cagaagcccc aacagatgaa 2400 tgcaagcctg tgaagtggtg tgcgctgagc caccacgaga ggctcaagtg tgatgagtgg 2460 agtgttaaca gtgtagggaa aatagagtgt gtatcagcag agaccaccga agactgcatc 2520 gccaagatca tgaatggaga agctgatgcc atgagcttgg atggagggtt tgtctacata 2580 gcgggcaagt gtggtctggt gcctgtcttg gcagaaaact acaataagag cgataattgt 2640 gaggatacac cagaggcagg gtattttgct gtagcagtgg tgaagaaatc agcttctgac 2700 ctcacctggg acaatctgaa aggcaagaag tcctgccata cggcagttgg cagaaccgct 2760 ggctggaaca tccccatggg cctgctctac aataagatca accactgcag atttgatgaa 2820 tttttcagtg aaggttgtgc ccctgggtct aagaaagact ccagtctctg taagctgtgt 2880 atgggctcag gcctaaacct gtgtgaaccc aacaacaaag agggatacta cggctacaca 2940 ggcgctttca ggtgtctggt tgagaaggga gatgtggcct ttgtgaaaca ccagactgtc 3000 ccacagaaca ctgggggaaa aaaccctgat ccatgggcta agaatctgaa tgaaaaagac 3060 tatgagttgc tgtgccttga tggtaccagg aaacctgtgg aggagtatgc gaactgccac 3120 ctggccagag ccccgaatca cgctgtggtc acacggaaag ataaggaagc ttgcgtccac 3180 aagatattac gtcaacagca gcacctattt ggaagcaacg taactgactg ctcgggcaac 3240 ttttgtttgt tccggtcgga aaccaaggac cttctgttca gagatgacac agtatgtttg 3300 gccaaacttc atgacagaaa cacatatgaa aaatacttag gagaagaata tgtcaaggct 3360 gttggtaacc tgagaaaatg ctccacctca tcactcctgg aagcctgcac tttccgtaga 3420 ccttaa 3426 <210> 24 <211> 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gcctgtggtg 1620 gcagagttct atgggtcaaa agaggatcca cagactttct attatgctgt tgctgtggtg 1680 aagaaggata gtggcttcca gatgaaccag cttcgaggca agaagtcctg ccacacgggt 1740 ctaggcaggt ccgctgggtg gaacatcccc ataggcttac tttactgtga cttacctgag 1800 ccacgtaaac ctcttgagaa agcagtggcc aatttcttct cgggcagctg tgccccttgt 1860 gcggatggga cggacttccc ccagctgtgt caactgtgtc cagggtgtgg ctgctccacc 1920 cttaaccaat acttcggcta ctcaggagcc ttcaagtgtc tgaaggatgg tgctggggat 1980 gtggcctttg tcaagcactc gactatattt gagaacttgg caaacaaggc tgacagggac 2040 cagtatgagc tgctttgcct ggacaacacc cggaagccgg tagatgaata caaggactgc 2100 cacttggccc aggtcccttc tcataccgtc gtggcccgaa gtatgggcgg caaggaggac 2160 ttgatctggg agcttctcaa ccaggcccag gaacattttg gcaaagacaa atcaaaagaa 2220 ttccaactat tcagctctcc tcatgggaag gacctgctgt ttaaggactc tgcccacggg 2280 tttttaaaag tcccccccag gatggatgcc aagatgtacc tgggctatga gtatgtcact 2340 gccatccgga atctacggga aggcacatgc ccagaagccc caacagatga atgcaagcct 2400 gtgaagtggt gtgcgctgag ccaccacgag aggctcaagt gtgatgagtg gagtgttaac 2460 agtgtaggga aaatagagtg tgtatcagca gagaccaccg aagactgcat cgccaagatc 2520 atgaatggag aagctgatgc catgagcttg gatggagggt ttgtctacat agcgggcaag 2580 tgtggtctgg tgcctgtctt ggcagaaaac tacaataaga gcgataattg tgaggataca 2640 ccagaggcag ggtattttgc tgtagcagtg gtgaagaaat cagcttctga cctcacctgg 2700 gacaatctga aaggcaagaa gtcctgccat acggcagttg gcagaaccgc tggctggaac 2760 atccccatgg gcctgctcta caataagatc aaccactgca gatttgatga atttttcagt 2820 gaaggttgtg cccctgggtc taagaaagac tccagtctct gtaagctgtg tatgggctca 2880 ggcctaaacc tgtgtgaacc caacaacaaa gagggatact acggctacac aggcgctttc 2940 aggtgtctgg ttgagaaggg agatgtggcc tttgtgaaac accagactgt cccacagaac 3000 actgggggaa aaaaccctga tccatgggct aagaatctga atgaaaaaga ctatgagttg 3060 ctgtgccttg atggtaccag gaaacctgtg gaggagtatg cgaactgcca cctggccaga 3120 gccccgaatc acgctgtggt cacacggaaa gataaggaag cttgcgtcca caagatatta 3180 cgtcaacagc agcacctatt tggaagcaac gtaactgact gctcgggcaa cttttgtttg 3240 ttccggtcgg aaaccaagga ccttctgttc agagatgaca cagtatgttt 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer T del-S <400> 52 cgagccccat ttcccggtgg aggcggatc 29 <210> 53 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer T del-AS <400> 53 gatccgcctc caccgggaaa tggggctcg 29

Claims (8)

1) 동물 세포에서 발현된 인자 VII을 포함하는 융합 단백질을 화학식 1의 구조를 갖는 레진을 고정상으로 하는 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography), 또는 세라믹 플루오르아파타이트 젤(fluoroapatite gel; Ca10(PO4)6F2)을 고정상으로 하는 혼합-방식(mixed mode) 크로마토그래피에 의해 분리 및 정제하는 단계; 및
2) 상기 융합 단백질을 Q-세파로스 FF 젤을 고정상으로 하는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 분리 및 정제하는 단계
를 포함하는, 인자 VII을 포함하는 융합 단백질의 분리 및 정제 방법:
<화학식 1>
Figure pat00004

상기 식에서, 매트릭스는 교차결합된 아가로스이며, R은 리간드로서 인자 VII 결합 단백질이다.
제1항에 있어서, 상기 동물 세포가 CHO 세포, BHK21 세포, HEK293 세포 및 Hep G2 세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 인자 VII을 포함하는 융합 단백질의 분리 및 정제 방법.
제1항에 있어서, 상기 인자 VII을 포함하는 융합 단백질이 인자 VII이 트랜스페린에 융합된 것임을 특징으로 하는, 인자 VII을 포함하는 융합 단백질의 분리 및 정제 방법.
제3항에 있어서, 상기 융합 단백질이 인자 VII과 트랜스페린의 사이에 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인자 VII 활성을 갖는 융합 단백질의 분리 및 정제 방법.
제4항에 있어서, 상기 링커가 서열번호 3 내지 12 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드인 것을 특징으로 하는, 인자 VII 활성을 갖는 융합 단백질의 분리 및 정제 방법.
제1항에 있어서, 단계 1의 친화성 크로마토그래피가 용출 완충액으로서 pH 5.0 내지 pH 8.0의 티오시안화 나트륨의 수성 완충액을 사용하는 것을 특징으로 하는, 인자 VII을 포함하는 융합 단백질의 분리 및 정제 방법.
제1항에 있어서, 단계 1의 혼합-방식(mixed mode) 크로마토그래피가 인산나트륨 및 염화나트륨을 포함하는 pH 5.0 내지 8.0의 수성 완충액을 사용하는 것을 특징으로 하는, 인자 VII을 포함하는 융합 단백질의 분리 및 정제 방법.
제1항에 있어서, 단계 2의 음이온 교환 크로마토그래피가 용출 완충액으로서 10 mM 내지 50 mM의 트리스, 1 mM 내지 10 mM의 염화칼슘 및 50 mM 내지 150 mM의 염화나트륨을 포함하는 pH 5.0 내지 8.0의 수성 완충액을 사용하는 것을 특징으로 하는, 인자 VII을 포함하는 융합 단백질의 분리 및 정제 방법.
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