JP2022531664A - 一本鎖第ｖｉｉｉ因子分子 - Google Patents
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Abstract
本発明は、一本鎖において、第ＶＩＩＩ因子のＡ１およびＡ２ドメインを含む重鎖部分ならびにＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインを含む軽鎖部分を含む組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質に関し、ここでＢドメインは２つの欠失において部分的に欠失しており、第１の欠失はトロンビンによって切断可能な規定されたプロセシング配列の存在をもたらし、第２の欠失は位置Ｒ１６６４－Ｒ１６６７におけるフーリン切断認識部位の欠如をもたらす。Ｂドメインの内部フラグメントは維持されている。前記タンパク質をコードする核酸、宿主細胞、およびタンパク質を調製する方法ならびに前記タンパク質、核酸または宿主細胞を含む医薬組成物が提供され、これらは血友病Ａの処置のために使用され得る。
Description
本発明は、一本鎖において、第ＶＩＩＩ因子のＡ１およびＡ２ドメインを含む重鎖部分ならびにＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインを含む軽鎖部分を含む組換え第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）タンパク質に関し、ここでＢドメインは２つの欠失において部分的に欠失しており、第１の欠失はトロンビンによって切断可能な規定されたプロセシング配列の存在をもたらし、第２の欠失はフーリン切断認識部位の欠如をもたらす。Ｂドメインの内部フラグメントは維持されている。前記タンパク質をコードする核酸、宿主細胞、およびタンパク質を調製する方法ならびに前記タンパク質、核酸または宿主細胞を含む医薬組成物が提供され、これらは血友病Ａの処置のために使用され得る。
ＦＶＩＩＩは、凝固カスケードにおける重要な補因子である。天然のＦＶＩＩＩは一本鎖タンパク質として合成され、その後細胞内プロテアーゼによって切断される。分泌されたＦＶＩＩＩは、切断されたＢドメインを有するヘテロ二量体である。凝固カスケードが活性化されると、ＦＶＩＩＩはトロンビンによって３つの位置で切断され、ヘテロ三量体、およびＢドメインの欠損をもたらす（ヘテロ三量体ＦＶＩＩＩａ）。このヘテロ三量体は活性化された凝固第ＩＸａ因子および凝固第Ｘ因子と複合体を構築し、それにより後者の活性化を促進する。
ヒト天然ＦＶＩＩＩ一本鎖タンパク質は２３５１アミノ酸からなる。最初の１９アミノ酸はシグナル配列を含み、これは分泌前に切断されて２３３２アミノ酸を含むＦＶＩＩＩ分子をもたらす。さらに、ＢドメインのＣ末端部分において切断が生じ、成熟ヘテロ二量体ＦＶＩＩＩをもたらす。ヘテロ二量体の重鎖はドメインＡ１（残基２０－３５５）、Ａ２（３９２－７２９）およびＢ（７６０－１６６７）を含み、軽鎖はドメインＡ３（１７０９－２０３８）、Ｃ１（２０３９－２１９１）およびＣ２（２１９２－２３５１）を含む。さらに、ａ１（３５６－３９１）、ａ２（７３０－７５９）およびａ３（１６６８－１７０８）の３つのスペーサー領域が存在する。
ＦＶＩＩＩ分子におけるアミノ酸のアノテーションは著者間で異なっている。これは、アミノ酸の数に含まれ得るか、または省略され得る１９アミノ酸のシグナル配列に起因する（上記のアノテーションはシグナル配列を含めたものに基づく）。このプラスまたはマイナス１９アミノ酸の変動が、先行文献における全長ＦＶＩＩＩ配列の数え方の頻繁な差異である。Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩコンストラクトの場合、欠失は数え方に変化をもたらし得る。重鎖について、数え方は全長ＦＶＩＩＩの数え方と相関する。Ｂドメイン欠失から、軽鎖の数え方は全長ＦＶＩＩＩ分子の数え方と同じに保たれるか（例えば、欠失の前にあるＱ７６３の後に欠失後のＤ１５８２が続く）、または欠失が生じていないかのように継続され得る（例えば、アミノ酸が欠失しているにもかかわらずＱ７６３の後にＤ７６４が続く）。何個のアミノ酸が欠失したか不明である場合、継続の数え方はアミノ酸配列の比較を複雑にする。本明細書において、全長ＦＶＩＩＩ分子の数え方は、（部分的な）Ｂドメインの欠失にかかわらず維持される。
血友病ＡはＸ染色体に結合した凝固第ＶＩＩＩ因子の欠乏を伴う遺伝性の出血性疾患であり、男性新生児５０００人に１人が発症する。しかし、血友病ＡはＦＶＩＩＩに対する自己免疫応答により自然発症し得る。血友病Ａの患者は、より長い出血の持続時間、自然出血および内出血に苦しみ、これらは日常生活に影響を及ぼす。
血友病Ａの患者は、一般にＦＶＩＩＩの投与によって処置される。疾患の重症度（軽度、中等度または重度）に応じて、処置はオンデマンドまたは予防的である。治療用ＦＶＩＩＩ製品はヒト血漿から精製されている（ｐＦＶＩＩＩ）か、または細胞培養で組換えにより産生されている（ｒＦＶＩＩＩ）かのいずれかである。
治療のための組換えＦＶＩＩＩ分子の開発において、Ｂドメインは凝固におけるＦＶＩＩＩの機能性に重要でないため、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ分子が設計されている。これは主にサイズの減少をもたらし、製造および貯蔵を容易にする。最も一般的なＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ製品は、ファイザーによって製造されているＲｅＦａｃｔｏ（登録商標）またはＲｅＦａｃｔｏ ＡＦ（登録商標）である。このＦＶＩＩＩバリアントは、Ｂドメインの８９４アミノ酸を持たない。しかし、Ｂドメインの末端におけるフーリン切断認識部位は未だ存在しているため、ＲｅＦａｃｔｏ ＡＦ（登録商標）は二重鎖タンパク質である。Kenneth Lieuwの総説（J Blood Med. 2017; 8: 67-73）は、現在利用可能な第ＶＩＩＩ因子製品間のいくつかの差異を強調している。
現在、ほとんどのｒＦＶＩＩＩ治療法は、重鎖（ドメインＡ１－ａ１－Ａ２－ａ２－［Ｂ］）および軽鎖（ドメインａ３－Ａ３－Ｃ１－Ｃ２）を含む古典的な二重鎖ＦＶＩＩＩ構造に基づいている。発現時において、重鎖および軽鎖はともに１つのｍＲＮＡ分子から最初に翻訳されるが、アミノ酸配列はＢドメインの末端にフーリン切断認識部位（Ｒ１６６４－Ｒ１６６７）を含んでおり、これはＲ１６６７後の切断による細胞内タンパク質プロセシングおよび両ドメインの分離を可能にする。しかし、重鎖および軽鎖は通常、二価の陽イオンを介して非共有結合している。
最近では、組換え一本鎖ＦＶＩＩＩタンパク質が開発されている。このようなＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩタンパク質はＢドメイン切断型組換えＦＶＩＩＩ分子として設計され、安定な一本鎖ＦＶＩＩＩ分子を形成するために軽鎖および重鎖は共有結合している（Schmidbauer S. et al., Thromb Res 2015; 136: 388-395）。この手法により、重鎖および軽鎖セグメントは強力な共有結合を介して結合するため、該セグメントは解離しにくくなる（Pabinger-Fasching, I., Thromb Res 2016; 141S3: 2-4）。一本鎖分子は、純粋で均一な化合物として単離され得る。一本鎖ＦＶＩＩＩ分子の半減期は、全長組換えＦＶＩＩＩ分子の約２倍であったことが観察されている（Zollner S. et al., Thromb Res 2014; 134: 125-131）。しかし、組換え一本鎖第ＶＩＩＩ因子分子（ＡＦＳＴＹＬＡ（登録商標））を用いたいくつかの臨床結果は、二重鎖分子と比較した一本鎖分子のわずかに増強された半減期を示した。Nguyen et al.（J Thromb Haemost. 2017 Jan; 15(1): 110-121）は、改変されたフーリン切断認識部位（１６６４－１６６７位のフーリン切断認識部位）を有する新規の第ＶＩＩＩ因子バリアントを記載している。フーリン切断認識部位に変異を有するバリアントは、主に単一ポリペプチド鎖の形態で分泌され、二重鎖Ｂドメイン欠失バリアントと比較して改善された発現を示す。
ＷＯ２０１７／１２３９６１Ａ１は、Ｂドメインの欠失を有する第ＶＩＩＩ因子バリアントを開示しており、ここで１６７６位または１６７７位の１つまたは２つのアミノ酸が野生型ＦＶＩＩＩと比較して置換、改変または欠失されている。任意で、該バリアントは変異したＰＡＣＥ－フーリン切断認識部位（１６６４－１６６７位のＨＨＱＲまたはＲＨＱＲ）をさらに含み得る。
ＵＳ６，３１６，２２６Ｂ１は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドを開示しており、該ポリペプチドはヒトＦＶＩＩＩと比較して７６０から１６８７までのアミノ酸の内部欠失を有する。
ＷＯ２０１４／００８４８０Ａ２は、Ｂドメインの完全または部分的な欠失を有する一本鎖ＦＶＩＩＩ分子を開示している。好ましい分子は、７８４－１６７７位の欠失ならびに置換Ｒ１６８３ＡおよびＲ１６８６Ａを有する（ＷＯ２０１４／００８４８０Ａ２の配列番号８）。
ＷＯ２０１３／０５７２１９Ａ１は、７６０から１６６６位のアミノ酸から選択される第１のアミノ酸が、１６６８から１７０９位のアミノ酸から選択される第２のアミノ酸と融合しているＦＶＩＩＩ分子を記載している。Ａｒｇ１６６７とＧｌｕ１６６８との間のタンパク質切断部位、および存在する場合にはＡｒｇ１３３２とＡｌａ１３３３との間のタンパク質切断部位が不活性化されている。
ＷＯ２００４／０６７５６６Ａ１は、約７６０から８０１までのＢドメインにおける任意のアミノ酸配列と融合した、１６６８～１７０７の１つ以上のアミノ酸の内部欠失を含むＦＶＩＩＩポリペプチドを開示している。
ＵＳ６，３１６，２２６Ｂ１は、第ＶＩＩＩ因子類似体をコードするＤＮＡを開示しており、ここで該類似体はヒト第ＶＩＩＩ因子と比較して７６０から１６８７までのアミノ酸の内部欠失を有する。
さらなる一本鎖ＦＶＩＩＩ分子が、例えばＷＯ８８／０９８１３Ａ１およびＷＯ２０１１／０４１７７０Ａ１に記載されている。
ＷＯ２０１４／２１０５４７Ａ１、ＷＯ２０１４／０２６９５４Ａ１、ＷＯ２０１３／１２２６１７Ａ１、ＷＯ２０１３／１０６７８７Ａ１、ＷＯ２０１５／１０６０５２Ａ１は、フーリン切断認識部位の改変または欠失を有するさらなる一本鎖ＦＶＩＩＩバリアントを開示している。要約すると、ＦＶＩＩＩの一本鎖バリアントは、特に医薬品用途を目的とする場合、その精製および製造に関して特定の利点を有する。野生型ＦＶＩＩＩの精製は、ＦＶＩＩＩ重鎖と軽鎖との間の非共有結合のために困難である。さらに、対応する非共有結合はＦＶＩＩＩフラグメントにより形成され得る。その結果、精製はフラグメントの共精製ならびに重鎖および軽鎖の不定比の精製をもたらし得、これらはすべて、純粋で、明確に定義され、頑強なプロセスで製造されるべきである医薬製品のために望ましくない。
しかし、現在の一本鎖ＦＶＩＩＩバリアントは、特定の不利益（低い発現レベルおよび生物活性の障害など）に悩まされている。したがって、高い発現レベルおよび改善された生物活性を有するさらなる改善されたＦＶＩＩＩ一本鎖バリアントが必要とされている。
先行技術を考慮して、本発明者らは、改善されてバランスのとれた性質のプロファイルを有する改善された一本鎖第ＶＩＩＩ因子分子を開発するという問題に取り組んだ。例えば、該分子はサイズ排除クロマトグラフィーなどによる簡便な精製を可能にし、高レベルの発現を示し、安定であり、良好に維持された生物学的機能（改善された高い比活性を含む）を示す。
第１の実施態様において、本発明は、一本鎖において、第ＶＩＩＩ因子のＡ１およびＡ２ドメインを含む重鎖部分ならびにＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインを含む軽鎖部分を含む組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質であって、
ａ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、配列番号１に規定される野生型第ＶＩＩＩ因子のＦ７６１とＰ１６５９との間の連続したアミノ酸に対応する８９４アミノ酸が欠失しており、第１の欠失をもたらす；
ｂ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、第１の欠失の部位に広がる配列番号２または配列番号２において最大で１つのアミノ酸置換を有する配列を含むプロセシング配列を含み、前記プロセシング配列が第１のトロンビン切断部位を含む；
ｃ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、少なくとも野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸Ｒ１６６４からＲ１６６７に対応するアミノ酸が欠失しており、第２の欠失をもたらす；および
ｄ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、第２の欠失のＣ末端およびＡ３ドメインのＮ末端に第２のトロンビン切断部位を含む、組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質を提供する。
ａ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、配列番号１に規定される野生型第ＶＩＩＩ因子のＦ７６１とＰ１６５９との間の連続したアミノ酸に対応する８９４アミノ酸が欠失しており、第１の欠失をもたらす；
ｂ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、第１の欠失の部位に広がる配列番号２または配列番号２において最大で１つのアミノ酸置換を有する配列を含むプロセシング配列を含み、前記プロセシング配列が第１のトロンビン切断部位を含む；
ｃ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、少なくとも野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸Ｒ１６６４からＲ１６６７に対応するアミノ酸が欠失しており、第２の欠失をもたらす；および
ｄ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、第２の欠失のＣ末端およびＡ３ドメインのＮ末端に第２のトロンビン切断部位を含む、組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質を提供する。
第２の実施態様において、本発明は、一本鎖において、第ＶＩＩＩ因子のＡ１およびＡ２ドメインを含む重鎖部分ならびにＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインを含む軽鎖部分を含む組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質であって、
ａ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、配列番号２または配列番号２において最大で１つのアミノ酸置換を有する配列を含むプロセシング配列を含み、前記プロセシング配列が第１のトロンビン切断部位を含む；
ｂ）任意で、前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質が異種配列を前記プロセシング配列のＣ末端に直接含む；
ｃ）前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する統合配列を前記プロセシング配列のＣ末端に直接、または存在する場合には前記異種配列のＣ末端に直接含む；および
ｄ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、第２のトロンビン切断部位を配列番号９～１１のＣ末端に含む、組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質を提供する。
ａ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、配列番号２または配列番号２において最大で１つのアミノ酸置換を有する配列を含むプロセシング配列を含み、前記プロセシング配列が第１のトロンビン切断部位を含む；
ｂ）任意で、前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質が異種配列を前記プロセシング配列のＣ末端に直接含む；
ｃ）前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する統合配列を前記プロセシング配列のＣ末端に直接、または存在する場合には前記異種配列のＣ末端に直接含む；および
ｄ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、第２のトロンビン切断部位を配列番号９～１１のＣ末端に含む、組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質を提供する。
第３の実施態様において、第２の実施態様（実施態様２）の第ＶＩＩＩ因子タンパク質はまた、第１の実施態様（実施態様１）のタンパク質である。
第４の実施態様において、実施態様１～３のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、配列番号９の配列を含む。
第５の実施態様において、実施態様１～４のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、配列番号１に規定される野生型第ＶＩＩＩ因子の
ｉ）Ｆ７６１およびＳ１６５６；
ｉｉ）Ｓ７６２およびＱ１６５７；
ｉｉｉ）Ｑ７６３およびＮ１６５８；または
ｉｖ）Ｎ７６４およびＰ１６５９に対応するアミノ酸が互いに隣接しており、ここで前記アミノ酸は配列番号２に規定される配列の一部である。これは、第１の実施態様に規定される第１の欠失に起因する。
ｉ）Ｆ７６１およびＳ１６５６；
ｉｉ）Ｓ７６２およびＱ１６５７；
ｉｉｉ）Ｑ７６３およびＮ１６５８；または
ｉｖ）Ｎ７６４およびＰ１６５９に対応するアミノ酸が互いに隣接しており、ここで前記アミノ酸は配列番号２に規定される配列の一部である。これは、第１の実施態様に規定される第１の欠失に起因する。
第６の実施態様において、実施態様１～５のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、プロセシング配列は配列番号２または前記配列において最大で１つのアミノ酸置換を有する配列であり、任意で、Ｆ、ＦのＣ末端のＳ、ＱまたはＮが置換されている。
第７の実施態様において、実施態様１～５のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、プロセシング配列は配列番号３または前記配列において最大で１つのアミノ酸置換を有する配列であり、任意で、Ｆ、ＦのＣ末端のＳ、ＱまたはＮが置換されている。
第８の実施態様において、実施態様１～５のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、プロセシング配列は配列番号４または前記配列において最大で１つのアミノ酸置換を有する配列であり、任意で、Ｆ、ＦのＣ末端のＳ、ＱまたはＮが置換されている。
第９の実施態様において、実施態様１～５または８のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、プロセシング配列は配列番号４、５、６、７または８からなる群から選択される。
第１０の実施態様において、実施態様９の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、プロセシング配列は配列番号５である。第１１の実施態様において、実施態様９の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、プロセシング配列は配列番号６である。第１２の実施態様において、実施態様９の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、プロセシング配列は配列番号７である。第１３の実施態様において、実施態様９の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、プロセシング配列は配列番号８である。第１４の実施態様において、実施態様９の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、プロセシング配列は配列番号４である。
第１５の実施態様において、先行実施態様のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、前記プロセシング配列は、野生型第ＶＩＩＩ因子のＱ１６７５、Ｉ１６８１またはＥ１６９０に対応するアミノ酸の直接のＮ末端にある。
第１６の実施態様において、先行実施態様のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸Ｋ１６６３からＬ１６７４に対応するアミノ酸が欠失しており、これは第２の欠失をもたらす。
第１７の実施態様において、実施態様１～１６のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、第２の欠失により、配列番号１に規定される野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸Ｖ１６６１およびＬ１６７４に対応するアミノ酸が互いに隣接しているか、または野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸Ｌ１６６２およびＱ１６７５に対応するアミノ酸が互いに隣接している。両方の選択肢は同一の配列をもたらし得る。
第１８の実施態様において、実施態様１～１６のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、第２の欠失により、配列番号１に規定される野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸Ｖ１６６１およびＩ１６８１に対応するアミノ酸が互いに隣接している。
第１９の実施態様において、実施態様１～１６のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、第２の欠失により、配列番号１に規定される野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸Ｐ１６６０およびＩ１６８１に対応するアミノ酸が互いに隣接している。
第２０の実施態様において、実施態様１～１６のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、第２の欠失により、配列番号１に規定される野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸Ｖ１６６１およびＥ１６９０に対応するアミノ酸が互いに隣接している。
第２１の実施態様において、先行実施態様のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、フーリン切断認識部位を含まない。
第２２の実施態様において、先行実施態様のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、プロセシング配列と統合配列との間にフーリン切断認識部位ＲＨＱＲに対して７５％よりも高い（好ましくは５０％よりも高い）配列同一性を有する配列を含まない。前記フーリン切断認識部位を含む配列番号１５に対応する配列は、欠失されてい得る。任意で、先行実施態様のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、配列番号１５に対して３０％よりも高い配列同一性を有する配列を含まない。あるいは、先行実施態様のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、配列番号１５に対して４０％よりも高い配列同一性を有する配列を含まない。
第２３の実施態様において、先行実施態様のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、プロセシング配列および前記プロセシング配列のＣ末端に統合配列を含み、ここで前記プロセシング配列は配列番号２、３、４、５、６、７または８を含む群から選択され、前記統合配列は配列番号１２、１３または１４を含む群から選択される。
第２４の実施態様において、第２３の実施態様の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、プロセシング配列は配列番号４であり、統合配列は配列番号１２である。第２５の実施態様において、第２３の実施態様の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、プロセシング配列は配列番号５であり、統合配列は配列番号１２である。第２６の実施態様において、第２３の実施態様の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、プロセシング配列は配列番号６であり、配列番号１２の統合配列である。第２７の実施態様において、第２３の実施態様の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、プロセシング配列は配列番号７であり、配列番号１２の統合配列である。第２８の実施態様において、第２３の実施態様の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、プロセシング配列は配列番号８であり、統合配列は配列番号１２である。第２９の実施態様において、第２３の実施態様の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、プロセシング配列は配列番号３であり、配列番号１３の統合配列である。第３０の実施態様において、第２３の実施態様の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、プロセシング配列は配列番号２であり、統合配列は配列番号１３である。第３１の実施態様において、第２３の実施態様の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、プロセシング配列は配列番号３であり、統合配列は配列番号１４である。第３２の実施態様において、実施態様２３～３１のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、統合配列は前記プロセシング配列の直接のＣ末端にある。
第３３の実施態様において、先行実施態様のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、Ｆｃ領域、アルブミン結合配列、アルブミン、ＰＡＳポリペプチド、ＨＡＰポリペプチド、絨毛性ゴナドトロピンのベータサブユニットのＣ末端ペプチド、アルブミン結合小分子、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプンからなる群から選択される少なくとも１つの異種融合パートナーとの融合タンパク質である。
第３４の実施態様において、実施態様３３の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、前記異種融合パートナーは、前記プロセシング配列のＣ末端に直接挿入されている。第３５の実施態様において、実施態様３３または３４のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、前記異種融合パートナーは、Ｃ２ドメインのＣ末端に挿入されている。
第３６の実施態様において、先行実施態様のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、Ａ１ドメインとＡ２ドメインとの間に第３のトロンビン切断部位をさらに含む。
本発明はさらに、第３７の実施態様として、先行実施態様のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードする核酸を提供し、ここで前記ポリヌクレオチドは任意で、哺乳類細胞（例えばヒト細胞）における前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現に適した発現ベクターである。
本発明はさらに、第３８の実施態様として、実施態様３７の核酸を含む宿主細胞を提供し、ここで好ましくは宿主細胞は、前記細胞における前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現に適した発現ベクターを含む哺乳類細胞である。前記細胞は、Ｈｅｋ２９３細胞株またはＣＡＰ細胞株を含む群から選択されるヒト細胞であり得る。好ましくは、前記細胞はＣＡＰ細胞株である。
本発明はさらに、第３９の実施態様として、第ＶＩＩＩ因子タンパク質を調製する方法であって、実施態様３８の宿主細胞を第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現に適した条件下で培養すること、および第ＶＩＩＩ因子タンパク質を単離することを含む方法を提供し、ここで前記方法は任意で、第ＶＩＩＩ因子タンパク質を医薬組成物として製剤化することを含む。
第４０の実施態様において、本発明は、実施態様１～３６のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質を含む組成物を提供し、ここで全ての第ＶＩＩＩ因子タンパク質のうち一本鎖タンパク質である第ＶＩＩＩ因子タンパク質の含有量は少なくとも９０％である。
本発明はさらに、第４１の実施態様として、実施態様１～３６または４０のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質、実施態様３７の核酸または実施態様３８の宿主細胞を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、薬学的に許容され得る溶媒（例えば水または緩衝液）および／または薬学的に許容され得る賦形剤を含み得る。第４２の実施態様において、実施態様４１の医薬組成物、または実施態様４１の医薬組成物を含むキットは、免疫抑制物質（例えば、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、シクロホスファミド、リツキシマブおよび／またはシクロスポリンを含む群から選択される免疫抑制物質）をさらに含む。
本発明はさらに、第４３の実施態様として、血友病Ａの処置における使用のための実施態様４１または４２のいずれかに記載の医薬組成物を提供し、ここで任意で、処置は免疫寛容導入（ＩＴＩ）である。第４４の実施態様において、実施態様４１～４３のいずれかに記載の医薬組成物は、任意の第ＶＩＩＩ因子タンパク質で以前に処置されていない患者、第ＶＩＩＩ因子タンパク質で以前に処置された患者、第ＶＩＩＩ因子タンパク質に対する阻害性抗体応答を含む抗体応答を有する患者、およびＩＴＩで処置されているか、またはＩＴＩで処置されていない第ＶＩＩＩ因子タンパク質に対する阻害性抗体応答を含む抗体応答を有する患者を含む群から選択される血友病Ａの患者の処置における使用のためのものである。
第４５の実施態様において、本発明は、実施態様４１～４４のいずれかに記載の医薬組成物を含むバイアル（例えば、プレフィルドシリンジまたは使用準備済のシリンジ）を提供する。
第４６の実施態様において、本発明は処置方法であって、実施態様４１～４４のいずれかに記載の有効量の医薬組成物を、それを必要とする患者（例えば、本明細書に規定される患者群から選択され得る血友病Ａの患者）に投与することを含む方法を提供する。
配列
配列番号１ 野生型第ＶＩＩＩ因子
配列番号２ ＰＲＳＦＳＱＮＰＰ 最小のプロセシング配列
配列番号３ ＰＲＳＦＳＱＮＰＰＶ プロセシング配列
配列番号４ ＰＲＳＦＳＱＮＰＰＶＬ プロセシング配列
配列番号５ ＰＲＳＸＳＱＮＰＰＶＬ プロセシング配列
配列番号６ ＰＲＳＦＸＱＮＰＰＶＬ プロセシング配列
配列番号７ ＰＲＳＦＳＸＮＰＰＶＬ プロセシング配列
配列番号８ ＰＲＳＦＳＱＸＰＰＶＬ プロセシング配列
配列番号９ ＱＳＤＱＥＥＩＤＹＤ、（例えばＶ０における）統合配列
配列番号１０ ＩＤＹＤＤＴＩ （例えばＶ５＋Ｖ６における）統合配列
配列番号１１ ＥＭＫＫＥＤＦＤ （例えばＶ７における）統合配列
配列番号１２ Ｑ１６７５からＲ１７０８ ｖｏｎ Ｖ０、（例えばＶ０における）統合配列
配列番号１３ Ｉ１６８１からＲ１７０８ ｖｏｎ Ｖ６、（例えばＶ６における）統合配列
配列番号１４ Ｅ１６９０からＲ１７０８ ｖｏｎ Ｖ７、（例えばＶ７における）統合配列
配列番号１５ ＫＲＨＱＲＥＩＴＲＴＴ 本発明のタンパク質において欠失されたフーリン切断認識部位を含む配列
配列番号１６ Ｖ０ ａａ配列
配列番号１７ Ｖ１ ａａ配列
配列番号１８ Ｖ２ ａａ配列
配列番号１９ Ｖ３ ａａ配列
配列番号２０ Ｖ４ ａａ配列
配列番号２１ Ｖ５ ａａ配列
配列番号２２ Ｖ６ ａａ配列
配列番号２３ Ｖ７ ａａ配列
配列番号２４ Ｖ０ ｎａ配列
配列番号２５ Ｖ５ ｎａ配列
配列番号２６ Ｖ６ ｎａ配列
配列番号２７ Ｖ７ ｎａ配列
配列番号２８ ＡＣ－６ｒｓ－ＲＥＦ ａａ配列
配列番号２９ ＡＣ－６ｒｓ ａａ配列
配列番号３０ ＡＣ－６ｒｓ－ＲＥＦ ｎａ配列
配列番号３１ ＳＶＥＭＫＫＥＤＦ Ｖ１における統合配列
配列番号３２ ＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲ プロセシング配列の２ａａを含む、プロセシング配列のＮ末端の配列（すなわち、トロンビン切断部位のＮ末端の配列）
配列番号３３－３８ 部分的なＦＶＩＩＩ配列
配列番号１ 野生型第ＶＩＩＩ因子
配列番号２ ＰＲＳＦＳＱＮＰＰ 最小のプロセシング配列
配列番号３ ＰＲＳＦＳＱＮＰＰＶ プロセシング配列
配列番号４ ＰＲＳＦＳＱＮＰＰＶＬ プロセシング配列
配列番号５ ＰＲＳＸＳＱＮＰＰＶＬ プロセシング配列
配列番号６ ＰＲＳＦＸＱＮＰＰＶＬ プロセシング配列
配列番号７ ＰＲＳＦＳＸＮＰＰＶＬ プロセシング配列
配列番号８ ＰＲＳＦＳＱＸＰＰＶＬ プロセシング配列
配列番号９ ＱＳＤＱＥＥＩＤＹＤ、（例えばＶ０における）統合配列
配列番号１０ ＩＤＹＤＤＴＩ （例えばＶ５＋Ｖ６における）統合配列
配列番号１１ ＥＭＫＫＥＤＦＤ （例えばＶ７における）統合配列
配列番号１２ Ｑ１６７５からＲ１７０８ ｖｏｎ Ｖ０、（例えばＶ０における）統合配列
配列番号１３ Ｉ１６８１からＲ１７０８ ｖｏｎ Ｖ６、（例えばＶ６における）統合配列
配列番号１４ Ｅ１６９０からＲ１７０８ ｖｏｎ Ｖ７、（例えばＶ７における）統合配列
配列番号１５ ＫＲＨＱＲＥＩＴＲＴＴ 本発明のタンパク質において欠失されたフーリン切断認識部位を含む配列
配列番号１６ Ｖ０ ａａ配列
配列番号１７ Ｖ１ ａａ配列
配列番号１８ Ｖ２ ａａ配列
配列番号１９ Ｖ３ ａａ配列
配列番号２０ Ｖ４ ａａ配列
配列番号２１ Ｖ５ ａａ配列
配列番号２２ Ｖ６ ａａ配列
配列番号２３ Ｖ７ ａａ配列
配列番号２４ Ｖ０ ｎａ配列
配列番号２５ Ｖ５ ｎａ配列
配列番号２６ Ｖ６ ｎａ配列
配列番号２７ Ｖ７ ｎａ配列
配列番号２８ ＡＣ－６ｒｓ－ＲＥＦ ａａ配列
配列番号２９ ＡＣ－６ｒｓ ａａ配列
配列番号３０ ＡＣ－６ｒｓ－ＲＥＦ ｎａ配列
配列番号３１ ＳＶＥＭＫＫＥＤＦ Ｖ１における統合配列
配列番号３２ ＤＳＹＥＤＩＳＡＹＬＬＳＫＮＮＡＩＥＰＲ プロセシング配列の２ａａを含む、プロセシング配列のＮ末端の配列（すなわち、トロンビン切断部位のＮ末端の配列）
配列番号３３－３８ 部分的なＦＶＩＩＩ配列
第１の実施態様において、本発明は、一本鎖において、第ＶＩＩＩ因子のＡ１およびＡ２ドメインを含む重鎖部分ならびにＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインを含む軽鎖部分を含む組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質であって、
ａ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、配列番号１に規定される野生型第ＶＩＩＩ因子のＦ７６１とＰ１６５９との間の連続したアミノ酸に対応する８９４アミノ酸が欠失しており、第１の欠失をもたらす；
ｂ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、第１の欠失の部位に広がる配列番号２または配列番号２において最大で１つのアミノ酸置換を有する配列を含むプロセシング配列を含み、前記プロセシング配列が第１のトロンビン切断部位を含む；
ｃ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、少なくとも野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸Ｒ１６６４からＲ１６６７に対応するアミノ酸が欠失しており、第２の欠失をもたらす；および
ｄ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、第２の欠失のＣ末端およびＡ３ドメインのＮ末端に第２のトロンビン切断部位を含む、組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質を提供する。
ａ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、配列番号１に規定される野生型第ＶＩＩＩ因子のＦ７６１とＰ１６５９との間の連続したアミノ酸に対応する８９４アミノ酸が欠失しており、第１の欠失をもたらす；
ｂ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、第１の欠失の部位に広がる配列番号２または配列番号２において最大で１つのアミノ酸置換を有する配列を含むプロセシング配列を含み、前記プロセシング配列が第１のトロンビン切断部位を含む；
ｃ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、少なくとも野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸Ｒ１６６４からＲ１６６７に対応するアミノ酸が欠失しており、第２の欠失をもたらす；および
ｄ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、第２の欠失のＣ末端およびＡ３ドメインのＮ末端に第２のトロンビン切断部位を含む、組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質を提供する。
本発明者らは、Ｂドメインの欠失を含む領域が他の一本鎖ＦＶＩＩＩバリアントよりも短い新たなＦＶＩＩＩ一本鎖バリアントを分析した。特に、Ｂドメインの内部フラグメントを保持することによって、本発明者らは、野生型のプロセシング配列により近いプロセシング配列（配列番号２参照）を形成することができた。好ましくは、プロセシング配列の一部は切断されたＢドメインに対応しており、従ってプロセシング配列は野生型ＦＶＩＩＩに由来する配列に組み込まれている。これらの知見の結果として、得られたＦＶＩＩＩタンパク質は高レベルの発現、フラグメントおよび副生成物の低いプロファイル、ならびに特に、種々の生物活性アッセイによって証明される高い比活性を示す。さらに、本発明者らは、特定の羊膜細胞株が機能性分子の高レベルの発現に特に良く適していることを見出した。
さらなる利点および好ましい実施態様が、本明細書の他の部分で説明されている。
二重鎖ＦＶＩＩＩ（Ｍｏｒｏｃｔｏｃｏｇ Ａｌｆａ配列を用いている、実施例参照）または最新の一本鎖バリアント（バリアントＶ１およびＶ２、実施例参照）のいずれかとの対照比較は、改善された比活性と組み合わされた高い発現レベルを示す。本発明におけるＦＶＩＩＩタンパク質はまた、設計および試験された他の一本鎖バリアント（Ｖ３、Ｖ４）よりもはるかに優れた結果をもたらす。
当業者はＦＶＩＩＩ（または第ＶＩＩＩ因子）という用語を理解しており、野生型ＦＶＩＩＩおよびその典型的なバリアントの構造および生物学的機能を認識している。上記で特定された配列とは別に、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、当業者によって適切かつ有利であると考えられるように設計され得る。特に、本発明の第ＶＩＩＩ因子タンパク質は通常、生物学的機能に重要であることが知られているすべての必要な部分およびドメインを含むべきである。例えば、好ましくは、ＦＶＩＩＩタンパク質は、野生型ＦＶＩＩＩのＡおよびＣドメインに対応する、実質的に対応する、および／または機能的に対応するドメインをさらに含む。ＦＶＩＩＩタンパク質は、追加の部分およびドメインをさらに含み得る。例えば、好ましくは、ＦＶＩＩＩタンパク質は、Ａ１ドメインとＡ２ドメインとの間にａ１ドメイン、およびＡ２ドメインのＣ末端にａ２ドメインをさらに含み、ここでプロセシング配列はａ２ドメインのＣ末端に位置する。プロセシング配列の一部は、切断されたＢドメインに対応する。前記プロセシング配列のＣ末端に、ＦＶＩＩＩタンパク質は少なくとも切断されたａ３ドメインを含み、これは本明細書で規定される統合配列を含み得る。プロセシングの前に、本発明の第ＶＩＩＩ因子タンパク質はまた、シグナル配列を含み得る。前記ドメインのいずれかまたはすべては野生型（ｗｔ）ＦＶＩＩＩドメインであり得、または（例えば、最新の技術において知られているように、または当業者によって適切であると考えられているように）野生型ドメインと異なり得る。前記ドメインは、好ましくはこの順序（すなわち、タンパク質のＮ末端からＣ末端まで）でタンパク質中に含まれる。
本発明におけるＦＶＩＩＩタンパク質は、（特に凝固における機能に関して）ｗｔ ＦＶＩＩＩタンパク質の少なくとも１つの生物活性または機能を有する。ＦＶＩＩＩタンパク質はトロンビンによって切断可能であるべきであり、これは活性化をもたらす。好ましくは、前記トロンビン認識部位および／またはトロンビン切断部位は、野生型ＦＶＩＩＩのものに対応するか、または実質的に対応する。ＦＶＩＩＩタンパク質は活性化された凝固第ＩＸａ因子および凝固第Ｘ因子との複合体を形成でき、軽鎖はリン脂質二重層（例えば（活性化された）血小板の細胞膜）に結合できる。
ＦＶＩＩＩの生物活性は、本明細書に記載されているように、タンパク質の発色活性または凝固活性を分析することによって決定され得る。通常、発色活性は生物活性の尺度として用いられる。
本発明のＦＶＩＩＩタンパク質の他の部分は当業者によって所望されるように設計され得るが、好ましくは高いＦＶＩＩＩ生物活性を維持している。実施例に示されるように、本発明は、（例えば発色活性によって測定される）高い生物活性を有するＦＶＩＩＩタンパク質を作製できる。したがって、好ましくは、本発明におけるＦＶＩＩＩタンパク質は、ｗｔタンパク質の活性に少なくとも相当する発色活性を有する（すなわち、本発明におけるＦＶＩＩＩタンパク質は、ｗｔタンパク質（配列番号１）の少なくとも５０％の発色活性を有する）。好ましくは、本発明におけるＦＶＩＩＩタンパク質は、ｗｔタンパク質の少なくとも８０％の発色活性、少なくとも１００％の発色活性、または１００％よりも高い発色活性を有する。好ましくは、発色活性はまた、市販のＢドメイン欠失型ＦＶＩＩＩ（Pfizer）であるＲｅＦａｃｔｏ ＡＦ（登録商標）（国際一般名称：Ｍｏｒｏｃｔｏｃｏｇ Ａｌｆａ）の少なくとも８０％の発色活性、少なくとも９０％の発色活性、少なくとも１００％の発色活性、または１００％よりも高い発色活性である。
ａ）において規定されるように、本発明のＦＶＩＩＩにおいて、配列番号１に規定される野生型第ＶＩＩＩ因子のＦ７６１とＰ１６５９との間の連続したアミノ酸に対応する８９４アミノ酸が、本発明の第ＶＩＩＩ因子タンパク質において欠失しており、これは第１の欠失をもたらす。ある実施態様において、特に、欠失または挿入を有しないＦＶＩＩＩのアミノ酸の番号付けから開始する場合、用語「対応する」は「同一である」を意味することが理解されるはずである。
ｗｔと比較して変異され得る特定のアミノ酸について、野生型ａａに対応するアミノ酸は、例えばＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（ニードルマン－ブンシュアルゴリズムに基づく；設定：ＭＡＴＲＩＸ：「ＢＬＯＳＵＭ６２」、ＧＡＰ ＯＰＥＮ：「２０」、ＧＡＰ ＥＸＴＥＮＤ：「０．５」、ＥＮＤ ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ：「ｆａｌｓｅ」、ＥＮＤ ＧＡＰ ＯＰＥＮ：「１０」、ＥＮＤ ＧＡＰ ＥＸＴＥＮＤ：「０．５」）を用いたアライメントによって決定される。
２つのポリペプチドの配列同一性を評価するために、このようなアライメントは２段階の手法で実行され得る：Ｉ．ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（設定：ＭＡＴＲＩＸ：「ＢＬＯＳＵＭ６２」、ＧＡＰ ＯＰＥＮ：「２０」、ＧＡＰ ＥＸＴＥＮＤ：「０．５」、ＥＮＤ ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ：「ｆａｌｓｅ」、ＥＮＤ ＧＡＰ ＯＰＥＮ：「１０」、ＥＮＤ ＧＡＰ ＥＸＴＥＮＤ：「０．５」）を用いてグローバルタンパク質アラインメントを行い、最も高い類似性を有する特定の領域を同定する。ＩＩ．対になっていないアミノ酸を除外しながら（Ｉ）で同定した完全に重なっているポリペプチド配列を比較するＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（設定：ＭＡＴＲＩＸ：「ＢＬＯＳＵＭ６２」、ＧＡＰ ＯＰＥＮ：「２０」、ＧＡＰ ＥＸＴＥＮＤ：「０．５」、ＥＮＤ ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ：「ｆａｌｓｅ」、ＥＮＤ ＧＡＰ ＯＰＥＮ：「１０」、ＥＮＤ ＧＡＰ ＥＸＴＥＮＤ：「０．５」）を用いて第２のアライメントによって正確な配列同一性を規定する。
「間(between)」は記載されたアミノ酸を除外する（例えば、記載されたアミノ酸は維持されていることを意味する）。「欠失」または「欠失した」は、先行の分子に以前に存在していたアミノ酸を欠失させることによってタンパク質が実際に調製されたことを必要とせず、分子の調製とは独立してアミノ酸が存在しないことを単に規定する。例えば、タンパク質は、デノボ合成または遺伝子工学技術によって調製された核酸に基づいて作製され得る。
ｂ）において規定されるように、組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、第１の欠失の部位に広がる配列番号２（ＰＲＳＦＳＱＮＰＰ）または配列番号２において最大で１つのアミノ酸置換を有する配列を含むプロセシング配列を含み、前記プロセシング配列は第１のトロンビン切断部位を含む。したがって、プロセシング配列の少なくとも１つのアミノ酸は欠失のＣ末端のアミノ酸に対応し、プロセシング配列の少なくとも１つのアミノ酸は欠失のＮ末端のアミノ酸に対応する。プロセシング配列は、配列番号２または配列番号２において最大で１つのアミノ酸置換を有する配列を含む（すなわち、プロセシング配列はより長くなり得る）。特に、プロセシング配列は、配列番号２、３、４、５、６、７または８を含む群から選択される。本発明者らは、本発明のプロセシング配列がトロンビンによる特に良好な切断を可能にすることを見出した。
通常、プロセシング配列は配列番号４よりも長くない。プロセシング配列は、ａ２ドメインからの配列（例えばｗｔ ａ２ドメイン配列）の直接のＣ末端にあり得る。プロセシング配列の最初のＮ末端の２つのアミノ酸は、ａ２ドメインに既に属してい得る。好ましくは、プロセシング配列の直接のＮ末端のアミノ酸はＥである。
配列番号２の１つのアミノ酸は、例えば免疫原性を低下させるために置換され得る。任意で、Ｆ、ＦのＣ末端のＳ、ＱまたはＮが置換されている。
プロセシング配列は、配列番号２または前記配列において最大で１つのアミノ酸置換を有する配列であり得、ここで任意で、Ｆ、ＦのＣ末端のＳ、ＱまたはＮが置換されている。例えば、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質Ｖ０、Ｖ５、Ｖ６およびＶ７は配列番号２を含む。Ｖ６のプロセシング配列は配列番号２からなる。
あるいは、プロセシング配列は、配列番号３（ＰＲＳＦＳＱＮＰＰＶ）または前記配列において最大で１つのアミノ酸置換を有する配列であり得、ここで任意で、Ｆ、ＦのＣ末端のＳ、ＱまたはＮが置換されている。例えば、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質Ｖ０、Ｖ５およびＶ７は配列番号３を含む。Ｖ５およびＶ７のプロセシング配列は配列番号３からなる。
あるいは、プロセシング配列は、配列番号４（ＰＲＳＦＳＱＮＰＰＶＬ）または前記配列において最大で１つのアミノ酸置換を有する配列であり得、ここで任意で、Ｆ、ＦのＣ末端のＳ、ＱまたはＮが置換されている。例えば、本発明者らは、配列番号４、５、６、７または８のように、プロセシング配列のＣ末端におけるＬがＦＶＩＩＩに特に優れた活性を与えることを示している。特に有利であることが見出されている本発明のＦＶＩＩＩタンパク質Ｖ０のプロセシング配列は配列番号４からなり、これは配列番号５～８の特定の実施態様である。
代替のプロセシング配列である配列番号５（ＰＲＳＸＳＱＮＰＰＶＬ）、配列番号６（ＰＲＳＦＸＱＮＰＰＶＬ）、配列番号７（ＰＲＳＦＳＸＮＰＰＶＬ）および配列番号８（ＰＲＳＦＳＱＸＰＰＶＬ）は、Ｘが天然に存在する任意のアミノ酸であり得るバリアントである。任意で、Ｘは配列番号４における対応するアミノ酸と比較して保存的な置換である（すなわち、疎水性アミノ酸は疎水性アミノ酸に置換され、親水性アミノ酸は親水性アミノ酸に置換され、芳香族アミノ酸は芳香族アミノ酸に置換され、酸性アミノ酸は酸性アミノ酸に置換され、塩基性アミノ酸は塩基性アミノ酸に置換される）。
ｃ）において規定されるように、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質において、野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸Ｒ１６６４からＲ１６６７に対応するアミノ酸は欠失しており、第２の欠失をもたらす。これらのアミノ酸は、ｗｔ ＦＶＩＩＩのフーリン切断認識部位に対応している。したがって、タンパク質は本質的にフーリンによって切断されない。本組成物において、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質の少なくとも８０％（任意で少なくとも９０％または少なくとも９５％）が、一本鎖の形態で存在する。
ｄ）において規定されるように、本発明の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、第２の欠失のＣ末端およびＡ３ドメインのＮ末端に第２のトロンビン切断部位を含む。したがって、活性化により、プロセシング配列におけるトロンビン切断部位と第２のトロンビン切断部位との間のＦＶＩＩＩタンパク質の部分が、活性化されたＦＶＩＩＩタンパク質から切除される。
第２の実施態様として、本発明はまた、一本鎖において、第ＶＩＩＩ因子のＡ１およびＡ２ドメインを含む重鎖部分ならびにＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインを含む軽鎖部分を含む組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質であって、
ａ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、配列番号２または配列番号２において最大で１つのアミノ酸置換を有する配列を含むプロセシング配列を含み、前記プロセシング配列が第１のトロンビン切断部位を含む；
ｂ）任意で、前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質が異種配列を前記プロセシング配列のＣ末端に直接含む；
ｃ）前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、配列番号９（ＱＳＤＱＥＥＩＤＹＤ）、配列番号１０（ＩＤＹＤＤＴＩ）および配列番号１１（ＥＭＫＫＥＤＦＤ）からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する統合配列を前記プロセシング配列のＣ末端に直接、または存在する場合には前記異種配列のＣ末端に直接含む；および
ｄ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、第２のトロンビン切断部位を配列番号９～１１のＣ末端に含む、組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質を提供する。
ａ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、配列番号２または配列番号２において最大で１つのアミノ酸置換を有する配列を含むプロセシング配列を含み、前記プロセシング配列が第１のトロンビン切断部位を含む；
ｂ）任意で、前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質が異種配列を前記プロセシング配列のＣ末端に直接含む；
ｃ）前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、配列番号９（ＱＳＤＱＥＥＩＤＹＤ）、配列番号１０（ＩＤＹＤＤＴＩ）および配列番号１１（ＥＭＫＫＥＤＦＤ）からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する統合配列を前記プロセシング配列のＣ末端に直接、または存在する場合には前記異種配列のＣ末端に直接含む；および
ｄ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、第２のトロンビン切断部位を配列番号９～１１のＣ末端に含む、組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質を提供する。
前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質は任意で、第１の実施態様として上述された第ＶＩＩＩ因子タンパク質である。いずれの場合においても、本明細書で与えられている定義は両方の実施態様に適用される。
ｂ）に記載されているように、任意で、前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質は異種配列をプロセシング配列のＣ末端に直接含む。異種配列は、野生型タンパク質において同一の相対的な位置に生じておらず、任意で本発明のタンパク質から欠失した配列と同じ数のアミノ酸からならない。好ましくは、異種配列は、野生型ＦＶＩＩＩに生じていない少なくとも１０個（任意で少なくとも２０個、少なくとも３０個または少なくとも４０個）のアミノ酸の非ＦＶＩＩＩ配列を含み、好ましくは、任意の野生型ＦＶＩＩＩフラグメントに対して３０％未満の配列同一性（任意で、任意の野生型ＦＶＩＩＩフラグメントに対して２５％未満の配列同一性）を有する。特に、異種配列は、Ｂドメインまたはａ３ドメインからの任意のｗｔ ＦＶＩＩＩ配列に対して２０％未満の配列同一性を有し得る。しかし、異種配列は、ＦＶＩＩＩに見出される部分配列を含み得る。任意で、異種配列の少なくとも６０％は非ＦＶＩＩＩ配列である。
ｃ）に記載されているように、前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、配列番号９（ＱＳＤＱＥＥＩＤＹＤ）、配列番号１０（ＩＤＹＤＤＴＩ）および配列番号１１（ＥＭＫＫＥＤＦＤ）からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する統合配列をプロセシング配列のＣ末端に直接、または存在する場合には前記異種配列のＣ末端に直接含む。用語「統合配列」は、配列がプロセシング配列とともに最終的な配列に統合されており、任意で前記配列のＣ末端に直接統合されていることを示しており、これはｗｔ ＦＶＩＩＩにおける欠失によってもたらされ得る。統合配列は「ａ３由来」の配列に指定され得、これは配列の起源を示す。この配列は、本発明の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質に含まれるすべてのａ３配列に対応することを必ずしも意味しない。好ましくは、規定された統合配列のＮ末端にａ３由来のアミノ酸は存在しないが、特に配列番号９～１１において、（例えば配列番号１２、１３または１４で規定されるように）規定された前記配列のＣ末端にａ３由来のアミノ酸が存在し得る。
好ましくは、第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、配列番号９、１０または１１からなる群から選択される統合配列を含み得る。本発明者らは、ＦＶＩＩＩタンパク質が配列番号９のＣ末端にあるａ３ドメインの部分に対応する（好ましくは配列番号１２の配列をもたらす）より長い配列を含む場合に有利であることを示し得る。配列番号１０（好ましくは配列番号１３の配列をもたらす）および配列番号１１（好ましくは配列番号１４の配列をもたらす）についても同様である。したがって、好ましくは、組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は配列番号９を含む。例えば、Ｖ０タンパク質は配列番号９を含む。これはまた、配列番号９の（少なくとも部分的に）Ｃ末端にあるａ３領域に由来する配列番号１０および配列番号１１を含む。Ｖ５およびＶ６は配列番号１０を含み、Ｖ７は配列番号１１を含む。
本発明の第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、配列番号１に規定される野生型第ＶＩＩＩ因子の
ｉ）Ｆ７６１およびＳ１６５６；
ｉｉ）Ｓ７６２およびＱ１６５７；
ｉｉｉ）Ｑ７６３およびＮ１６５８；または
ｉｖ）Ｎ７６４およびＰ１６５９に対応するアミノ酸が互いに隣接している限りにおいて規定され得、ここで前記アミノ酸は配列番号２に規定される配列の一部である。これは、第１の実施態様に規定される第１の欠失に起因する。当業者は、この特定の構造物が欠失を有しない場合と欠失を有する場合とで同一のアミノ酸の維持をもたらすことを認識する。したがって、タンパク質の構造は、最新技術において公知のＢドメインの他の欠失よりも欠失によって影響されない場合がある。本発明の文脈における「隣接する」は「直接隣接する」と同じ意味であり、タンパク質の二次構造に関する。
ｉ）Ｆ７６１およびＳ１６５６；
ｉｉ）Ｓ７６２およびＱ１６５７；
ｉｉｉ）Ｑ７６３およびＮ１６５８；または
ｉｖ）Ｎ７６４およびＰ１６５９に対応するアミノ酸が互いに隣接している限りにおいて規定され得、ここで前記アミノ酸は配列番号２に規定される配列の一部である。これは、第１の実施態様に規定される第１の欠失に起因する。当業者は、この特定の構造物が欠失を有しない場合と欠失を有する場合とで同一のアミノ酸の維持をもたらすことを認識する。したがって、タンパク質の構造は、最新技術において公知のＢドメインの他の欠失よりも欠失によって影響されない場合がある。本発明の文脈における「隣接する」は「直接隣接する」と同じ意味であり、タンパク質の二次構造に関する。
異種配列がプロセシング配列のＣ末端に直接挿入されていない本発明のある実施態様において、プロセシング配列は野生型第ＶＩＩＩ因子のＱ１６７５、Ｉ１６８１またはＥ１６９０に対応するアミノ酸の直接のＮ末端にあることがさらに好ましい。例えば、これはＶ０ではＱ１６７５、Ｖ５およびＶ６ではＩ１６８１、ならびにＶ７ではＥ１６９０について生じる。
本発明の第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、ａ３ドメインの７個のＮ末端アミノ酸は好ましくは存在せず（すなわち欠失しており）、すなわちａ３ドメインは部分的に欠失または切断されている。
本発明の第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸Ｋ１６６３からＬ１６７４に対応するアミノ酸は欠失してい得、これは第２の欠失をもたらし得る。これは、例えばＶ０およびＶ５～Ｖ７における場合である。
本発明のＦＶＩＩＩタンパク質において、第２の欠失により、配列番号１に規定される野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸Ｖ１６６１およびＬ１６７４に対応するアミノ酸が互いに隣接してい得、または野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸Ｌ１６６２およびＱ１６７５に対応するアミノ酸が互いに隣接してい得る。Ｖ０は、これが適用されるタンパク質の一例である。異種配列がプロセシング配列のＣ末端に直接挿入されている場合、野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸Ｌ１６６２およびＱ１６７５に対応するアミノ酸は互いに隣接していない。
本発明の他のＦＶＩＩＩタンパク質（例えばＶ５）において、第２の欠失により、配列番号１に規定される野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸Ｖ１６６１およびＩ１６８１に対応するアミノ酸が互いに隣接している。
本発明の他のＦＶＩＩＩタンパク質（例えばＶ６）において、第２の欠失により、配列番号１に規定される野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸Ｐ１６６０およびＩ１６８１に対応するアミノ酸が互いに隣接している。
本発明の他のＦＶＩＩＩタンパク質（例えばＶ７）において、第２の欠失により、配列番号１に規定される野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸Ｖ１６６１およびＥ１６９０に対応するアミノ酸が互いに隣接している。
本発明の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、フーリン切断認識部位を含まない。好ましくは、本発明の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、プロセシング配列と統合配列との間にフーリン切断認識部位ＲＨＱＲに対して７５％よりも高い配列同一性を有する配列を含まない。フーリン切断認識部位の欠失は、他の変異（例えば置換）よりも優れていることが見出されている。任意で、本発明の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、プロセシング配列と統合配列との間にフーリン切断認識部位ＲＨＱＲに対して５０％よりも高い配列同一性を有する配列を含まない。
好ましくは、フーリン切断認識部位の近傍にある他のアミノ酸も欠失している。したがって、好ましくは、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、フーリン切断認識部位を含む配列番号１５（ＫＲＨＱＲＥＩＴＲＴＴ、すなわち配列番号１のａａＫ１６６３－Ｔ１６７３）に対して３０％よりも高い配列同一性を有する配列を含まない。任意で、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、配列番号１５に対して４０％よりも高い配列同一性を有する配列を含まない。
フーリン切断認識部位が存在しないため、本タンパク質は本質的にフーリンによって切断されず、全ての第ＶＩＩＩ因子タンパク質のうち一本鎖タンパク質である第ＶＩＩＩ因子タンパク質の含有量は少なくとも９０％である。
プロセシング配列および前記プロセシング配列のＣ末端に統合配列を含み、プロセシング配列が配列番号２、３、４、５、６、７または８を含む群から選択され、統合配列が配列番号１２、１３または１４を含む群から選択される本発明の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質について、発現および活性に関する特に良好な結果が見出されている。
したがって、本発明はまた、プロセシング配列および前記プロセシング配列のＣ末端に統合配列を含み、プロセシング配列が配列番号２、３、４、５、６、７または８を含む群から選択され、統合配列が配列番号１２、１３または１４を含む群から選択される組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質を提供する。
例えば、（例えばコンストラクトＶ０のように）プロセシング配列は配列番号４であり得、統合配列は配列番号１２であり得る。プロセシング配列はまた、配列番号５であり得、統合配列は配列番号１２であり得る。プロセシング配列は配列番号６であり得、統合配列は配列番号１２であり得る。プロセシング配列は配列番号７であり得、統合配列は配列番号１２であり得る。プロセシング配列は配列番号８であり得、統合配列は配列番号１２であり得る。（例えばＶ５のように）プロセシング配列は配列番号３であり得、統合配列は配列番号１３であり得る。（例えばＶ６のように）プロセシング配列は配列番号２であり得、統合配列は配列番号１３であり得る。（例えばＶ７のように）プロセシング配列は配列番号３であり得、統合配列は配列番号１４であり得る。任意で、前記統合配列は、前記プロセシング配列の直接のＣ末端にある。あるいは、例えば以下の融合パートナーについて規定されるように、異種配列はプロセシング配列と統合配列との間に挿入され得る。
本発明の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は通常、Ａ１ドメインとＡ２ドメインとの間に第３のトロンビン切断部位をさらに含む。本発明の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質はまた、生物学的機能が維持される限りさらなるトロンビン切断部位を含み得るが、これは必須ではない。
本発明の好ましいＦＶＩＩＩタンパク質は、配列番号１６（Ｖ０）、２１（Ｖ５）、２２（Ｖ６）または２３（Ｖ７）のいずれか（好ましくは配列番号１６）の成熟タンパク質（すなわちシグナル配列を含まない）またはこれらのタンパク質のいずれかの融合タンパク質のアミノ酸配列を含む。
したがって、本発明は、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３（それぞれはシグナル配列を含まない）におけるアミノ酸配列を含むか、またはこれらの配列の少なくとも１つを含む融合タンパク質である組換え第ＶＩＩＩ因子分子を提供する。配列番号１６（シグナル配列を含まない）におけるアミノ酸配列を含むタンパク質は、特に良好な特性を有することが示されている。シグナル配列は、各タンパク質のアミノ酸１－１９に対応する。（特に医薬の目的で通常使用される）成熟タンパク質において、シグナル配列は通常、欠落している。しかし、シグナル配列が本発明のタンパク質に含まれることもあり得る。
融合パートナーは、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質のインビボでの血漿中半減期を延長するために利用され得る。ある実施態様において、本発明の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質は、少なくとも１つの異種融合パートナー（好ましくはＦＶＩＩＩタンパク質のインビボでの血漿中半減期を延長する融合パートナー）との融合タンパク質である。融合パートナーは、例えばＦｃ領域、アルブミン、アルブミン結合配列、ＰＡＳポリペプチド、ＨＡＰポリペプチド、絨毛性ゴナドトロピンのベータサブユニットのＣ末端ペプチド、アルブミン結合小分子、およびこれらの組合せを含む群から選択され得る。ＦＶＩＩＩタンパク質は、代替的または追加的に非タンパク質融合パートナー（ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）および／またはＨＥＳ（ヒドロキシエチルデンプン）など）と共有結合してい得る。ＰＡＳポリペプチドまたはＰＡＳ配列は、主にアラニンおよびセリン残基を含むか、または主にアラニン、プロリンおよびセリン残基を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、ＰＡＳ配列はＷＯ２０１５／０２３８９４に規定されているように生理条件下でランダムコイル構造を形成する。ＨＡＰポリペプチドまたは配列は、ＷＯ２０１５／０２３８９４に規定されているように、例えばグリシンまたはグリシンおよびセリンの反復配列を含むホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）である。潜在的な融合物、融合パートナーおよびそれらの組合せは、例えばＷＯ２０１５／０２３８９４により詳細に記載されている。
任意で、特定の治療応用のために、組換えＦＶＩＩＩタンパク質はＦｃ領域と融合され得る。Ｆｃ領域との融合は、半減期を延長し、免疫原性を低下させるために使用され得る。
本発明者らは、前記異種融合パートナーが前記プロセシング配列の直接のＣ末端および／またはＣ２ドメインのＣ末端に有利に挿入され得ることを見出した。これらの位置は、ＦＶＩＩＩタンパク質の良好な生物活性を維持しつつ、融合に有利であることが本発明者らによって見出されている。任意で、融合タンパク質は少なくとも１つのリンカーをさらに含む。
本タンパク質は、さらにグリコシル化および／または硫酸化されてい得る。好ましくは、翻訳後修飾（タンパク質のグリコシル化および／または硫酸化など）はヒト細胞中で生じる。翻訳後修飾の特に適したプロファイルは、ＣＡＰ細胞（特にＣＡＰ－Ｔ細胞またはＣＡＰ－Ｇｏ細胞）を用いて達成され得る（ＷＯ２００１／３６６１５；ＷＯ２００７／０５６９９４；ＷＯ２０１０／０９４２８０；ＷＯ２０１６／１１０３０２）。Cevec Pharmaceuticals GmbH (Cologne, Germany)から入手可能なＣＡＰ細胞は、日常的な羊水穿刺中に経腹腔的に単離されたものであるため、ヒト羊膜細胞に由来する。得られた羊膜細胞をアデノウイルス機能（Ｅ１Ａ、Ｅ１ＢおよびｐＩＸ機能）により形質転換し、次いで無血清培地中の懸濁での増殖に適応させた。
ｗｔ ＦＶＩＩＩは通常、ｖＷＦによって結合される。ｖＷＦは分解を遮蔽し得、免疫寛容に良い影響を与え得る。したがって、本発明の特定の実施態様において、本タンパク質はｖＷＦとの結合が可能であるべきである。例えば、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質のｖＷＦへの結合力は、ＲｅＦａｃｔｏ ＡＦ（登録商標）のｖＷＦへの結合力の１０％－１００％、１０％－９０％、２０－８０％、３０－７０％、４０－６０％または５０－６０％であり、これはＥＬＩＳＡに基づく方法で決定され得る。ｖＷＦ結合は、特にアミノ酸位置Ｙ１６８３およびＹ１６９９によって媒介される。ｖＷＦ結合が望まれる場合、これらは変異させるべきではない。
特定の例において、ＦＶＩＩＩタンパク質がｖＷＦと結合できない場合があり得、または望まれ得る。例えば、これは安定化がｖＷＦ結合とは異なる手段によって媒介される場合であり得る。ｖＷＦ結合を回避するために、例えばアミノ酸Ｙ１６８３および／またはＹ１６９９が変異され得、またはｖＷＦ結合は異なる結合パートナーによって立体的に障害され得る。
有利なことに、本発明におけるＦＶＩＩＩタンパク質は、医薬用途のために十分安定であることが可能である。本発明者らは、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質のインビトロおよびインビボでの安定性がＲｅＦａｃｔｏ ＡＦ（登録商標）の安定性に相当することを示し得る（実施例参照）。したがって、本発明のタンパク質は、好ましくはインビトロおよび／またはインビボ（特にインビボ）のヒト血漿中で十分に安定である。好ましくは、インビボにおいて、（阻害剤を有しない患者の）ヒト血漿中における本発明のＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、少なくとも約６時間（好ましくは少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間または少なくとも３０時間）である。本明細書に規定されているように、ＦＶＩＩＩタンパク質は融合パートナーを含まないＦＶＩＩＩタンパク質であってもよく、本明細書に規定されている融合タンパク質であってもよい。しかし、実施例に示されているように、特定の半減期は融合パートナーを含まずに既に得られ得る。１以上の融合パートナーが存在する場合、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は同じであってもよく、さらに長くてもよい。
本発明はまた、本発明の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードする核酸を提供する。前記ポリヌクレオチドは、（例えば、ヒト細胞などの哺乳類細胞における前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現に適した）発現ベクターであり得る。
核酸は、好ましくはＮ末端シグナル配列（例えば配列番号１の１９ａａのシグナル配列）を有するＦＶＩＩＩをコードする。本発明の好ましい核酸は、配列番号１６および２１－２３（Ｖ０、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７）、または任意でその融合タンパク質をコードする。本発明の好ましい核酸は配列番号２４－２７であり得る。本発明の核酸はＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり得る。核酸は、宿主細胞（例えばヒト細胞）における発現のために最適化されてい得る。
発現ベクターは、構成的または誘導性プロモーターであり得る適切なプロモーターの機能的制御下においてＦＶＩＩＩタンパク質をコードする配列を（好ましくはコドン最適化された形態で）含む。プロモーターは、天然におけるＦＶＩＩＩの発現に関連しないプロモーター（例えばＥＦ－１アルファ）または異種プロモーター（例えばＣＭＶまたはＳＶ４０）であり得る。発現ベクターは、原核生物および／または真核生物選択マーカー（アンピシリン耐性およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）など）ならびに複製起点（例えばＳＶ４０複製起点および／またはｐＢＲ３２２複製起点）をさらに含み得る。「コドン最適化」は、宿主細胞における発現（好ましくはヒト宿主細胞における発現）のための最適化を意味する。
あるいは、核酸は遺伝子治療（例えばヒト患者の遺伝子治療）に適したベクターであり得る。遺伝子治療に適したベクターは当分野で公知であり、例えば（例えばアデノウイルスもしくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）またはレトロウイルスに基づく）ウイルスベースのベクター（レンチウイルスベクターなど）または非ウイルスベースのベクター（限定されないが、小型プラスミドおよびミニサークルまたはトランスポゾンベースのベクターなど）である。本発明のＡＡＶベースのベクターは、例えば血友病Ａ患者の遺伝子治療のためにＡＡＶ粒子にパッケージ化されてい得る。
本発明はまた、本発明の核酸を含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、細菌細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞または動物細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞は動物細胞（特に哺乳類細胞における前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現に適した発現ベクターを含む前記細胞）である。宿主細胞は好ましくは、ヒト細胞における前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現に適した発現ベクターを含むヒト細胞である。細胞は、本発明の核酸を一過性または安定に遺伝子導入されてい得る。細胞は、細胞株、初代細胞または幹細胞であり得る。タンパク質の産生のために、細胞は通常、細胞株（ＨＥＫ－２９３細胞などのＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｃｒｕｃｅｌｌ’ｓ Ｐｅｒ．Ｃ６などのヒト胚性網膜細胞、またはＣＡＰなどのヒト羊膜細胞など）である。本タンパク質を用いたヒト患者の処置のために、宿主細胞は好ましくはヒト細胞（例えばＨＥＫ２９３細胞株またはＣＡＰ細胞株（例えばＣＡＰ－Ｔ細胞またはＣＡＰ－Ｇｏ細胞））である。本発明者らは、ＣＡＰ細胞株において特に高い一本鎖含有量の本発明のＦＶＩＩＩタンパク質が産生されることを見出した。ＣＡＰ細胞のうち、ＣＡＰ－Ｔ細胞は一過性の発現のために好ましく、ＣＡＰ－Ｇｏ細胞はＦＶＩＩＩ分子に有利なグリコシル化プロファイルを与える安定な細胞株の作成のために使用され得る。
細胞は、遺伝子導入および患者の体内への再導入後に患者においてＦＶＩＩＩを産生するのに適した血友病Ａ患者の自己細胞であり得る。細胞は幹細胞（例えば造血幹細胞）であり得るが、好ましくは（特に患者がヒトである場合）胚性幹細胞ではない。細胞はまた、肝細胞、肝類洞壁内皮細胞または血小板であり得る。
本発明のタンパク質を発現する細胞株は、ＦＶＩＩＩタンパク質の発現に適した条件下で前記細胞を培養すること、および（例えば本明細書に記載されている）例えば当業者に公知の複数の方法を用いて前記タンパク質を精製することを含む、本発明のタンパク質を調製する方法において使用され得る。そのような精製方法は、細胞除去のための標準的な回収手順（例えば遠心分離およびその後のクロマトグラフィー工程（例えばアフィニティークロマトグラフィー））およびＦＶＩＩＩタンパク質を適切な緩衝液中に交換する方法を含み得る。したがって、本発明は、第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養すること、および第ＶＩＩＩ因子タンパク質を単離することを含む第ＶＩＩＩ因子タンパク質を調製する方法を提供し、ここで前記方法は任意で、第ＶＩＩＩ因子タンパク質を医薬組成物として製剤化することを含む。
したがって、本発明は、本発明の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質、本発明の核酸または本発明の宿主細胞を含む医薬組成物を提供する。そのような医薬組成物は、適切な賦形剤（例えば、緩衝液、安定化剤、充填剤、保存剤、別の（例えば組換え）タンパク質またはそれらの組合せ）を含み得る。本発明の文脈において他に明示されていない場合、「ａ」は１以上を意味することが理解される。製剤に適した緩衝液は、例えば２０５ｍＭ ＮａＣｌ、５．３ｍＭ ＣａＣｌ２、６．７ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、１．３％スクロースおよび０．０１３％ Ｔｗｅｅｎ２０を蒸留水中に含み得、ｐＨは７．０であり得る（ＦＶＩＩＩ製剤緩衝液）。前記緩衝液は、他に記載されていない場合、本明細書に記載の実験において使用される。ＦＶＩＩＩの製剤は、特にインビボでの使用のために無菌であり得、例えば無菌濾過されてい得る。
医薬組成物は、当業者が望むように適切に（例えば静脈内（ｉ．ｖ．）または皮下への適用、腹腔内または筋肉内への適用のために）製剤化され得る。一般に、医薬組成物は緩徐なｉ．ｖ．プッシュボーラス注入としての投与のためのものである。持続注入は、例えば重度の出血または外科手術のために入院を必要とする患者に指示される。（例えば植物における発現の後に）耐性誘導に寄与し得る経口適用も可能である。医薬組成物は徐放用であり得る。
ＦＶＩＩＩを含む医薬組成物は、凍結乾燥され得る。投与量および処置スキームは、（例えば、出血の予防のために、または出血性イベントのための間欠的なオンデマンドの治療とともに）適切に選択され得る。投与量の決定は医師によってなされ得る。投与量は患者（例えば、体重、ＦＶＩＩＩ状態など）に依存する。例えば、本発明のＦＶＩＩＩは、疾患の重症度に応じて０．５～６日ごとに０．５～２５０ＩＵ／ｋｇ体重（通常、０．５～２００ＩＵ／ｋｇ体重）の用量で静脈内投与され得る。本発明はまた、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質を免疫抑制物質（例えば、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、シクロホスファミド、リツキシマブおよび／またはシクロスポリン）と組み合わせて含む医薬組成物を提供し、かつ／またはそのような物質と実質的に同時（例えば数分～１２時間以内）に投与するためのものであり得る。
（例えば本発明のタンパク質を含む）医薬組成物は、それを必要とする患者（特に血友病Ａ患者、例えばＦＶＩＩＩに対する自己免疫応答を伴う後天性血友病を有する患者または先天性血友病Ａ患者）の処置における使用のためのものであり得る。哺乳類（マウスまたはイヌなど）は本発明の医薬組成物で処置され得るが、患者は通常、ヒト患者である。
本発明の医薬組成物はまた、組換えおよび／または血漿第ＶＩＩＩ因子タンパク質で以前に処置された患者の処置のために使用され得る。組換えおよび／または血漿第ＶＩＩＩ因子タンパク質に対する阻害性抗体応答を含む抗体を有する患者において、医薬組成物は例えば免疫寛容導入（ＩＴＩ）処置のために使用され得る。したがって、本発明の組成物はまた、レスキューＩＴＩのために使用され得る。医薬組成物はまた、組換えおよび／または血漿第ＶＩＩＩ因子タンパク質に対する阻害性抗体応答を含む抗体応答を有する患者（例えばＩＴＩによって処置されている患者）において有利に使用され得る。医薬組成物はまた、ＩＴＩによって処置されていない組換えおよび／または血漿第ＶＩＩＩ因子タンパク質に対する阻害性抗体応答を含む抗体応答を有する患者において有利に使用され得る。
本発明はまた、本発明の医薬組成物を含むバイアル（例えばシリンジ）を提供する。シリンジはプレフィルドシリンジ（例えば使用準備済のシリンジ）であり得る。
本明細書において引用されているすべての刊行物は、本明細書に完全に組み込まれる。本発明は以下の実施例によってさらに説明されるが、これらは本発明の範囲を限定するものとして理解されるべきではない。
１．一本鎖バリアントの生成および生物活性の決定
新たな組換え血友病Ａ治療物質の開発において、フーリン切断認識部位を持たず、それにより酵素切断を阻害する一本鎖ＦＶＩＩＩ分子を使用する可能性を試験した。前記一本鎖ＦＶＩＩＩ分子は精製および保存中の安定性に関して有利であり得るが、（例えば皮下投与のための）安定性および血漿中半減期に関してインビボにおいても利点を有し得る。したがって、フーリン切断認識部位を含む個別の欠失をそれぞれ有する種々のＢドメイン切断型ＦＶＩＩＩ一本鎖バリアントをコードするＤＮＡプラスミドを設計し、それらの機能性をインビトロでのアッセイを用いて評価した。
新たな組換え血友病Ａ治療物質の開発において、フーリン切断認識部位を持たず、それにより酵素切断を阻害する一本鎖ＦＶＩＩＩ分子を使用する可能性を試験した。前記一本鎖ＦＶＩＩＩ分子は精製および保存中の安定性に関して有利であり得るが、（例えば皮下投与のための）安定性および血漿中半減期に関してインビボにおいても利点を有し得る。したがって、フーリン切断認識部位を含む個別の欠失をそれぞれ有する種々のＢドメイン切断型ＦＶＩＩＩ一本鎖バリアントをコードするＤＮＡプラスミドを設計し、それらの機能性をインビトロでのアッセイを用いて評価した。
材料および方法
コンストラクトの調製
クローニングのための基本的なＦＶＩＩＩ配列としてＲｅｆａｃｔｏ ＡＦ（登録商標）のコドン最適化された配列を用い、ここでクローニングを単純化するためにサイレント変異により６つの制限部位を追加した。これらの制限部位のいくつかは、コドン最適化のために再度除外された。基本配列はＡＣ－６ｒｓ－ＲＥＦ（配列番号２８）である。
コンストラクトの調製
クローニングのための基本的なＦＶＩＩＩ配列としてＲｅｆａｃｔｏ ＡＦ（登録商標）のコドン最適化された配列を用い、ここでクローニングを単純化するためにサイレント変異により６つの制限部位を追加した。これらの制限部位のいくつかは、コドン最適化のために再度除外された。基本配列はＡＣ－６ｒｓ－ＲＥＦ（配列番号２８）である。
本発明のＦＶＩＩＩをコードするコンストラクトおよびこの文脈で分析された比較コンストラクトについて、完全なＦＶＩＩＩ配列またはＦＶＩＩＩのａ２ドメインからＡ３ドメインまでの５５０～６００ｂｐをコードするＤＮＡ領域のいずれかを合成した。完全に合成されたＤＮＡをコドン最適化した。ＤＮＡフラグメントは、５’末端においてＥｃｏＲＶ制限部位と隣接しており、３’末端においてＥｃｏＲＩ制限部位と隣接しており、これらの制限部位は使用した基本のＦＶＩＩＩ配列にも存在していた。ＤＮＡ挿入物およびＦＶＩＩＩ骨格プラスミドの制限は、標的ライゲーションおよびＦＶＩＩＩ一本鎖プラスミドの生成を可能にした。完全に合成されたＦＶＩＩＩ ＤＮＡは５’末端においてＨｉｎｄＩＩＩ制限部位と隣接しており、３’末端においてＮｏｔＩ制限部位と隣接していた。
大腸菌Ｋ１２を前記プラスミドで形質転換し、形質転換した細菌をアンピシリン選択下で増殖させ、プラスミドを調製することにより、大量のプラスミドを調製できた。遺伝子工学の作業は、ＶｅｃｔｏｒＮＴＩソフトウェア（Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA）を用いた設計の後に、Thermo Fisher Scientificによって行われた。
ＣＡＰ－Ｔ細胞の培養
ＣＡＰ－Ｔ細胞（Cevec Pharmaceuticals, Koln, Germany）を、４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Thermo Fisher Scientific, 35050038）および５μｇ／ｍｌブラストサイジン（Thermo Fisher Scientific, R21001; 完全PEM培地）を添加したＰＥＭ培地中で培養した。細胞を解凍するために、必要な量の冷凍されたバイアルを３７℃の水浴に移した。解凍後、各バイアルを１０ｍｌの冷却された完全ＰＥＭ培地に移した。細胞懸濁液を１５０ｘｇで５分間遠心分離した。この洗浄工程において、凍結保存のために使用したジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を除去した。ペレットを１５ｍｌの温かい完全ＰＥＭ培地に再懸濁し、１２５ｍｌの振盪フラスコに移した。細胞を、５％ＣＯ２を含む雰囲気の加湿インキュベーター内において３７℃でインキュベートした。フラスコを５０ｍｍの軌道および１８５ｒｐｍで回転する振盪プラットフォームに配置した。
ＣＡＰ－Ｔ細胞（Cevec Pharmaceuticals, Koln, Germany）を、４ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Thermo Fisher Scientific, 35050038）および５μｇ／ｍｌブラストサイジン（Thermo Fisher Scientific, R21001; 完全PEM培地）を添加したＰＥＭ培地中で培養した。細胞を解凍するために、必要な量の冷凍されたバイアルを３７℃の水浴に移した。解凍後、各バイアルを１０ｍｌの冷却された完全ＰＥＭ培地に移した。細胞懸濁液を１５０ｘｇで５分間遠心分離した。この洗浄工程において、凍結保存のために使用したジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を除去した。ペレットを１５ｍｌの温かい完全ＰＥＭ培地に再懸濁し、１２５ｍｌの振盪フラスコに移した。細胞を、５％ＣＯ２を含む雰囲気の加湿インキュベーター内において３７℃でインキュベートした。フラスコを５０ｍｍの軌道および１８５ｒｐｍで回転する振盪プラットフォームに配置した。
細胞の継代培養を３～４日ごとに行った。必要な量の培養細胞懸濁液を新たなフラスコに移し、完全ＰＥＭ培地を加えることによって新鮮な培養物を０．５ｘ１０６細胞／ｍｌに設定した。移した細胞懸濁液が全体積の２０％を超える場合、懸濁液を１５０ｘｇで５分間遠心分離し、ペレットを新鮮な完全ＰＥＭ培地に再懸濁した。振盪フラスコあたりの細胞懸濁液の体積は、フラスコの全体積の２０％であった。
解凍後、遺伝子導入実験を行う前に、最低３回の継代培養を行った。
一過性の遺伝子導入によるＣＡＰ－Ｔ細胞におけるタンパク質発現
ＣＡＰ－Ｔ細胞を、４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）（Lonza, Basel, Switzerland）を用いて遺伝子導入した。各遺伝子導入について、１０ｘ１０６個のＣＡＰ－Ｔ細胞を１５ｍｌのコニカルチューブ中において１５０ｘｇで５分間遠心分離した。ペレットの体積およびプラスミド溶液の体積を考慮して、細胞を９５μｌの追加のＳＥ緩衝液に再懸濁した。その後、５μｇの各プラスミドを細胞懸濁液に添加し、次いで穏やかに混合した。この溶液を１００μｌのＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅに移した。使用した遺伝子導入プログラムはＥＤ－１００であった。遺伝子導入後、１つのＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅからの細胞を１２．５ｍｌの完全ＰＥＭ培地を含む１２５ｍｌの振盪フラスコに移した。細胞を上述のように４日間培養した。４日目に細胞を１５０ｘｇでの５分間の遠心分離によって回収した。上述のように１２．５ｍｌの手法を組み合わせることによって、より大きなタンパク質量を産生できた。
ＣＡＰ－Ｔ細胞を、４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）（Lonza, Basel, Switzerland）を用いて遺伝子導入した。各遺伝子導入について、１０ｘ１０６個のＣＡＰ－Ｔ細胞を１５ｍｌのコニカルチューブ中において１５０ｘｇで５分間遠心分離した。ペレットの体積およびプラスミド溶液の体積を考慮して、細胞を９５μｌの追加のＳＥ緩衝液に再懸濁した。その後、５μｇの各プラスミドを細胞懸濁液に添加し、次いで穏やかに混合した。この溶液を１００μｌのＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅに移した。使用した遺伝子導入プログラムはＥＤ－１００であった。遺伝子導入後、１つのＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅからの細胞を１２．５ｍｌの完全ＰＥＭ培地を含む１２５ｍｌの振盪フラスコに移した。細胞を上述のように４日間培養した。４日目に細胞を１５０ｘｇでの５分間の遠心分離によって回収した。上述のように１２．５ｍｌの手法を組み合わせることによって、より大きなタンパク質量を産生できた。
ＦＶＩＩＩ発色活性
ＦＶＩＩＩの活性を発色アッセイによって決定した。この２段階のアッセイでは、第１の段階においてＦＩＸａおよびＦＶＩＩＩａがＦＸを活性化する。第２の段階において、活性化されたＦＸが発色基質を加水分解して色の変化をもたらし、これは４０５ｎｍで測定され得る。カルシウムおよびリン脂質が最適な量で存在し、過剰なＦＩＸａおよびＦＸが利用可能であるという事実のため、ＦＸの活性化率は試料中の活性なＦＶＩＩＩの量のみに依存する。
ＦＶＩＩＩの活性を発色アッセイによって決定した。この２段階のアッセイでは、第１の段階においてＦＩＸａおよびＦＶＩＩＩａがＦＸを活性化する。第２の段階において、活性化されたＦＸが発色基質を加水分解して色の変化をもたらし、これは４０５ｎｍで測定され得る。カルシウムおよびリン脂質が最適な量で存在し、過剰なＦＩＸａおよびＦＸが利用可能であるという事実のため、ＦＸの活性化率は試料中の活性なＦＶＩＩＩの量のみに依存する。
このＦＶＩＩＩ発色活性アッセイのための試薬を、Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）ＳＰ ＦＶＩＩＩキットから得た。このキットは、リン脂質、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、微量のトロンビン、基質であるＳ－２７６５、ＦＩＸａおよびＦＸの混合物、ならびにトロンビン阻害剤であるＩ－２５８１を含んでいた。反応中に構築されたトロンビンによる基質の加水分解を防ぐため、阻害剤を添加した。すべての希釈を、蒸留水またはＴｒｉｓ－ＢＳＡ（ＴＢＳＡ）緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）および１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含み、ｐＨ７．４に設定した）で行った。各試料を、ＦＶＩＩＩ枯渇血漿で少なくとも１：２に希釈した。ＴＢＳＡ緩衝液を用いてさらなる希釈を行った。
このアッセイを、全自動止血分析装置であるＢＣＳ ＸＰ（Siemens Healthcare, Erlangen, Germany）を用いて行った。水、ＴＢＳＡ緩衝液および試料を含むすべての試薬を分析装置に挿入した。各試料について、分析装置により３４μｌの塩化カルシウム、２０μｌのＴＢＳＡ緩衝液、１０μｌの試料、４０μｌの水、１１μｌのリン脂質、および５６μｌのＦＩＸａ－ＦＸ混合物を混合した。この混合物を３００秒間インキュベートした。その後、５０μｌのＳ－２７６５＋Ｉ－２５８１を反応物に加えた。基質を添加して、４０５ｎｍの吸収を２００秒間測定した。
活性なＦＶＩＩＩの量を算出するために、反応を開始した後３０秒～１９０秒の間に測定された動態の勾配を分析装置のソフトウェアによって評価した。この結果は、ＦＶＩＩＩの生物学的基準製剤（ＢＲＰ）を用いて作成された検量線と相関していた。ＢＲＰの活性をＩＵ／ｍｌで示す。しかし、ＩＵ／ｍｌはＵ／ｍｌと同等であると想定され得る。結果を「正常の％」として示した。正常なＦＶＩＩＩ活性の１００％は１ｍｌあたりの１ＵのＦＶＩＩＩ活性と同等であるため、これらの結果をＵ／ｍｌに変換した。
凝固活性ＦＳＬ
２段階の発色アッセイ（上記参照）に加えて、活性なＦＶＩＩＩの量を決定するために１段階の凝固アッセイを行った。このアッセイでは、ＦＶＩＩＩ枯渇血漿、ＣａＣｌ２、活性化剤アクチンＦＳＬ、およびＦＶＩＩＩを含む試料を１段階で混合する。活性化剤は、ＦＩＸを活性化するＦＸＩａの生成をもたらす。ＦＶＩＩＩａ、ＦＩＸａおよびＦＸはテナーゼ複合体を構築し、ＦＸが活性化される。プロトロンビンおよびフィブリノーゲンのさらなる活性化は、フィブリン塊の形成を最終的にもたらす。この塊を形成するのに必要とされる時間である活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定する。ａＰＴＴは、ＦＶＩＩＩの量に応じて変動する。
２段階の発色アッセイ（上記参照）に加えて、活性なＦＶＩＩＩの量を決定するために１段階の凝固アッセイを行った。このアッセイでは、ＦＶＩＩＩ枯渇血漿、ＣａＣｌ２、活性化剤アクチンＦＳＬ、およびＦＶＩＩＩを含む試料を１段階で混合する。活性化剤は、ＦＩＸを活性化するＦＸＩａの生成をもたらす。ＦＶＩＩＩａ、ＦＩＸａおよびＦＸはテナーゼ複合体を構築し、ＦＸが活性化される。プロトロンビンおよびフィブリノーゲンのさらなる活性化は、フィブリン塊の形成を最終的にもたらす。この塊を形成するのに必要とされる時間である活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を測定する。ａＰＴＴは、ＦＶＩＩＩの量に応じて変動する。
凝固アッセイを、ＢＣＳ ＸＰを用いて行った。ＴＢＳＡ緩衝液、ＦＶＩＩＩ枯渇血漿、アクチンＦＳＬ、ＣａＣｌ２、および試料を分析装置に挿入した。試料をＦＶＩＩＩ枯渇血漿で少なくとも１：２に希釈した。ＴＢＳＡ緩衝液を用いてさらなる希釈を行った。各試料について、分析装置により４５μｌのＴＢＳＡ緩衝液、５μｌの試料、５０μｌのＦＶＩＩＩ枯渇血漿、および５０μｌのアクチンＦＳＬを混合した。５０μｌのＣａＣｌ２を添加することによって反応を開始した。分析装置により、塊の形成に必要とされる時間を測定した。
活性なＦＶＩＩＩの量を算出するために、反応開始時の４０５ｎｍにおけるベースライン吸光を分析装置のソフトウェアによって評価した。２００秒以内のその後のすべての吸光値を、ベースライン吸光との差に関して分析した。規定された閾値を超えた最初の時点を凝固時間として決定した。この結果は、ＦＶＩＩＩのＢＲＰを用いて作成された検量線と相関していた。
ＦＶＩＩＩ抗原ＥＬＩＳＡ
ＦＶＩＩＩ抗原の量を、Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ（登録商標）ＶＩＩＩ：Ａｇ ＥＬＩＳＡ（Diagnostica Stago, Asnieres sur Seine Cedex, France）を用いて決定した。このサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、適用したＦＶＩＩＩは、製造者によってプレートにコーティングされたマウスモノクローナル抗ヒトＦＶＩＩＩ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと結合する。結合したＦＶＩＩＩの検出は、ペルオキシダーゼと結合したマウスモノクローナル抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体により行われる。ＦＶＩＩＩが存在する場合、ペルオキシダーゼと結合した抗体はＦＶＩＩＩに結合し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液の添加によって検出され得る。ＴＭＢはペルオキシダーゼとの反応により透明な溶液から青緑色の溶液に変化する。短時間経過した後に、この反応を硫酸（Ｈ２ＳＯ４）の添加によって停止させ、これは溶液を黄色に変化させる。結合したＦＶＩＩＩの量は、４５０ｎｍで測定され得る黄色の強度に相関する。ＦＶＩＩＩの最終的な量を、既知の抗原濃度を有する標準物質の少なくとも５つの段階希釈物の測定によって作成された検量線を用いて算出する。
ＦＶＩＩＩ抗原の量を、Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍ（登録商標）ＶＩＩＩ：Ａｇ ＥＬＩＳＡ（Diagnostica Stago, Asnieres sur Seine Cedex, France）を用いて決定した。このサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、適用したＦＶＩＩＩは、製造者によってプレートにコーティングされたマウスモノクローナル抗ヒトＦＶＩＩＩ Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと結合する。結合したＦＶＩＩＩの検出は、ペルオキシダーゼと結合したマウスモノクローナル抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体により行われる。ＦＶＩＩＩが存在する場合、ペルオキシダーゼと結合した抗体はＦＶＩＩＩに結合し、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液の添加によって検出され得る。ＴＭＢはペルオキシダーゼとの反応により透明な溶液から青緑色の溶液に変化する。短時間経過した後に、この反応を硫酸（Ｈ２ＳＯ４）の添加によって停止させ、これは溶液を黄色に変化させる。結合したＦＶＩＩＩの量は、４５０ｎｍで測定され得る黄色の強度に相関する。ＦＶＩＩＩの最終的な量を、既知の抗原濃度を有する標準物質の少なくとも５つの段階希釈物の測定によって作成された検量線を用いて算出する。
提供された標準物質および対照を、ＥＬＩＳＡを開始する３０分前に５００μｌの蒸留水を用いて再構成した。このインキュベーション時間の後、標準物質を提供されたリン酸緩衝液で１：１０に希釈した。これは開始濃度であった。さらに、標準物質を１：６４の希釈物まで１：２で段階希釈した。標準物質の濃度はバッチに応じて約１Ｕ／ｍｌのＦＶＩＩＩを含んでいたため、開始濃度は０．１Ｕ／ｍｌのＦＶＩＩＩに相当し、最後の希釈物は約０．００１６Ｕ／ｍｌのＦＶＩＩＩを含んでいた。対照をリン酸緩衝液で１：１０および１：２０に希釈した。すべての試料を、検量線の中央にあることを目的として以前に決定された活性（上記参照）に応じてリン酸緩衝液で希釈した。ＦＶＩＩＩ試料、対照および標準物質を希釈した後、２００μｌの各溶液をウェルごとに二通りで適用した。さらに、ブランク対照として２つのウェルを２００μｌのリン酸緩衝液で満たした。プレートをフィルムで覆い、室温で２時間インキュベートした。この時間に、ペルオキシダーゼと結合した抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体を８ｍｌのリン酸緩衝液を用いて再構成し、室温で３０分インキュベートした。抗原を固定化した後、以前に蒸留水で１：２０に希釈した提供された洗浄溶液でウェルを５回洗浄した。洗浄後すぐに、２００μｌのペルオキシダーゼと結合した抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体を各ウェルに添加し、フィルムで覆い、室温で２時間インキュベートした。その後、以前と同様にプレートを５回洗浄した。結合したＦＶＩＩＩの量を明らかにするために、２００μｌのＴＭＢ溶液を各ウェルに添加し、室温で正確に５分間インキュベートした。この反応を、５０μｌの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を各ウェルに添加することによって停止させた。室温で１５分間インキュベートした後、各ウェルの吸光度をＰＯＬＡＲｓｔａｒ Ｏｍｅｇａプレートリーダー（BMG LABTECH, Ortenberg, Germany）を用いて４５０ｎｍで測定した。
ＥＬＩＳＡの結果を、ＭＡＲＳソフトウェア（BMG Labtech）を用いて算出した。最初の段階において、すべてのウェルをブランク補正し、二通りの平均値を算出した。その後、検量線から濃度を算出するために、４パラメータフィットを適用した。この検量線に従って、各ウェルにおけるＦＶＩＩＩ抗原の量を決定した。最後の段階において、これらの値を希釈率で補正し、これは各試料のＦＶＩＩＩ抗原量をもたらした。
結果および考察
一本鎖ＦＶＩＩＩ分子の種々のバリアント（図１、２）を作成および分析した。すべてのバリアントにおいて、フーリン切断認識部位を欠失させた。バリアントＡＣ＿ＳＣ－Ｖ１（Ｖ１）および－Ｖ３（Ｖ３）は、天然のトロンビン切断部位（それぞれＰＲ／ＳＶまたはＳＣ／ＳＶ）を有し、ａａ７６０－１６８７（Ｖ１）およびａａ７３１－１６８７（Ｖ３）の単一の欠失のみが存在する。Ｖ１およびＶ３と比較して、バリアントＡＣ＿ＳＣ－Ｖ２（Ｖ２）および－Ｖ４（Ｖ４）は異なるトロンビン切断部位（それぞれＰＲ／ＶＡまたはＩＲ／ＳＶ）を含み、Ｖ１に基づくＶ２はＢドメインに由来すると考えられ得るＶＡ配列をさらに含む。Ｖ３に基づくＶ４は、欠失の部位に挿入ＤＰＲ－ＩＲＳＶ－ＶＡＱを含む（図１）。コンストラクトＶ１－Ｖ４はいずれも本発明に必要とされる（例えば、目的のトロンビン切断部位の文脈において配列ＮＰＰを含む）プロセシング配列を含まない。
一本鎖ＦＶＩＩＩ分子の種々のバリアント（図１、２）を作成および分析した。すべてのバリアントにおいて、フーリン切断認識部位を欠失させた。バリアントＡＣ＿ＳＣ－Ｖ１（Ｖ１）および－Ｖ３（Ｖ３）は、天然のトロンビン切断部位（それぞれＰＲ／ＳＶまたはＳＣ／ＳＶ）を有し、ａａ７６０－１６８７（Ｖ１）およびａａ７３１－１６８７（Ｖ３）の単一の欠失のみが存在する。Ｖ１およびＶ３と比較して、バリアントＡＣ＿ＳＣ－Ｖ２（Ｖ２）および－Ｖ４（Ｖ４）は異なるトロンビン切断部位（それぞれＰＲ／ＶＡまたはＩＲ／ＳＶ）を含み、Ｖ１に基づくＶ２はＢドメインに由来すると考えられ得るＶＡ配列をさらに含む。Ｖ３に基づくＶ４は、欠失の部位に挿入ＤＰＲ－ＩＲＳＶ－ＶＡＱを含む（図１）。コンストラクトＶ１－Ｖ４はいずれも本発明に必要とされる（例えば、目的のトロンビン切断部位の文脈において配列ＮＰＰを含む）プロセシング配列を含まない。
本発明者らは、図２に示されるＡＣ＿ＳＣ－Ｖ０、－Ｖ５、－Ｖ６、および－Ｖ７（または、省略してＶ０、Ｖ５、Ｖ６、およびＶ７）と名付けられた追加のコンストラクトを作成することによってさらなる実験を行った。あまり単純ではない方法において、それらのＢドメインの単一の欠失から２つの欠失を作成し、これらはＢドメインの短いフラグメントを保持することによって架橋されている。このように、野生型の配列により近いと考えられるプロセシング配列を生成した。これらのコンストラクトは、２つの欠失の導入によってＲｅｆａｃｔｏ ＡＦ（登録商標）のアミノ酸配列ＡＣ－６ｒｓ－Ｒｅｆに基づいており、すなわち本明細書に規定されるプロセシング配列を含む本発明のタンパク質である。したがって、Ｖ０、Ｖ５、Ｖ６およびＶ７は、本発明におけるＦＶＩＩＩタンパク質を表す。
Ｖ０－Ｖ７のウエスタンブロットは主に一本鎖分子としてのすべての分析されたコンストラクトの発現を示し（図示せず）、これは約１８０ｋＤの二重のバンド、および約８０ｋＤの重鎖のバンドの欠如または低い存在によって示される。
種々の一本鎖ＦＶＩＩＩバリアントの発現レベルおよびインビトロでの機能性を、ＲｅＦａｃｔｏ ＡＦ（登録商標）と同一のアミノ酸配列を有し、血友病Ａ治療物質の開発におけるベースライン分子として使用される二重鎖ＦＶＩＩＩバリアントＡＣ－６ｒｓ－ＲＥＦと比較して評価した。当然に、この二重鎖ＦＶＩＩＩが最も優れた機能的結果をもたらすことが予想されるはずである。
上述のように、ＣＡＰ－Ｔ細胞に、ＡＣ－６ｒｓ－ＲＥＦまたは種々の一本鎖分子のいずれかをコードする各プラスミドＤＮＡを二通りで一過性に遺伝子導入した。４日間の培養の後に、細胞を遠心分離し、細胞培養上清を（Ｉ）ＦＶＩＩＩ発色活性、（ＩＩ）ＦＶＩＩＩタンパク質の総量に対応するＦＶＩＩＩ抗原、および（ＩＩＩ）アクチンＦＳＬを介して誘導されるＦＶＩＩＩ凝固活性を決定するために直接使用した。
コンストラクトＶ１－Ｖ４とＦＶＩＩＩ二重鎖分子ＡＣ－６ｒｓ（配列番号２９）との比較において、発現した一本鎖コンストラクトの発色活性および発色比活性（発色活性とＦＶＩＩＩ抗原の比率を示す）は、二本鎖分子よりも低かった。より詳細には、Ｖ３およびＶ４の発色活性および発色比活性は、Ｖ１およびＶ２よりも低かった。また、発現したコンストラクトＶ１およびＶ２の発色活性および発色比活性は、二本鎖分子よりも低かった（データ示さず）。
Ｖ１、Ｖ２、Ｖ０、Ｖ５、Ｖ６、Ｖ７および二重鎖ＦＶＩＩＩ（ＡＣ－６ｒｓ－ＲＥＦ）の比較において、図３Ａに示されるように、二重鎖ＦＶＩＩＩ対照は最も高いＦＶＩＩＩ発色活性レベルである約１Ｕ／ｍｌに達した（すべて遺伝子導入細胞からの上清において決定されている）。一本鎖バリアントＡＣ＿ＳＣ－Ｖ０、－Ｖ５、および－Ｖ６は約０．７Ｕ／ｍｌの発色活性を示し、ＡＣ＿ＳＣ－Ｖ１、－Ｖ２、および－Ｖ７は約０．４～０．５Ｕ／ｍｌを示した。
ＦＶＩＩＩタンパク質量は、約２．４Ｕ／ｍｌを有する二重鎖ＡＣ－６ｒｓ－ＲＥＦ対照において最も高いことが見出された（図３Ｃ）。一本鎖バリアントは、ＡＣ＿ＳＣ－Ｖ２の１．４Ｕ／ｍｌからＡＣ＿ＳＣ－Ｖ５の２．０Ｕ／ｍｌまでの範囲で発現していた。２段階のＦＶＩＩＩ発色アッセイと比較して、１段階の凝固アッセイは一般により低い活性値をもたらした（図３Ｂ）。ＡＣ＿ＳＣ－Ｖ０、ＡＣ－６ｒｓ－ＲＥＦ、ＡＣ＿ＳＣ－Ｖ５、およびＡＣ＿ＳＣ－Ｖ６は約０．３Ｕ／ｍｌを示したが、ＡＣ＿ＳＣ－Ｖ７は約０．２Ｕ／ｍｌの凝固活性を示し、ＡＣ＿ＳＣ－Ｖ１および－Ｖ２は非常に低い凝固活性を示した。
発色比活性はＦＶＩＩＩ発色活性とＦＶＩＩＩ抗原レベルの比率を表し、すなわち活性の決定的な尺度を表す。患者の観点から、高い比活性はより少ない物質でより良い処置を達成し得ることを意味するため望ましい。この文脈において、比活性を、％で表示されるＦＶＩＩＩ抗原に対するＦＶＩＩＩ発色活性の比率として算出した。図３Ｄに示されるように、ＡＣ＿ＳＣ－Ｖ０について最も高い比活性が観察された（４４％）。二重鎖ＡＣ－６ｒｓ－ＲＥＦ対照は４０％の比活性に達し、次いでＡＣ＿ＳＣ－Ｖ５、－Ｖ６、および－Ｖ７の活性であった。凝固比活性を、％で表示されるＦＶＩＩＩ抗原に対するＦＶＩＩＩ凝固活性の比率として算出した。図３Ｅに示されるように、ＡＣ＿ＳＣ－Ｖ０（２２．８％）について最も高い比活性が観察され、次いで－Ｖ６（１６．９％）、－Ｖ５（１５．５％）、－Ｖ７（１４．８％）であった。二重鎖ＡＣ－６ｒｓ－ＲＥＦ対照は１３．９％というより低い凝固比活性に達し、一本鎖コンストラクトＡＣ＿ＳＣ－Ｖ１および－Ｖ２（先行技術）はそれぞれ６．７％および９．６％にしか達しなかった。
結論として、種々の一本鎖ＦＶＩＩＩ分子ＡＣ＿ＳＣ－Ｖ０、－Ｖ１、－Ｖ２、－Ｖ５、－Ｖ６、および－Ｖ７を、二重鎖ＦＶＩＩＩであるＡＣ－６ｒｓ－ＲＥＦと比較してインビトロでの機能性について評価した。したがって、２段階の発色活性アッセイ、１段階の凝固アッセイ、およびＦＶＩＩＩタンパク質の総量を検出するＦＶＩＩＩ抗原ＥＬＩＳＡを用いて、すべてのＦＶＩＩＩ分子を分析した。ＦＶＩＩＩ抗原レベルが測定できたため、すべてのＦＶＩＩＩバリアントが発現したことが観察された。さらに、発色および凝固の両方のアッセイにおいて活性値が測定できたため、すべての分子は一般に機能的であった。しかし、一本鎖バリアントＡＣ＿ＳＣ－Ｖ１およびＡＣ＿ＳＣ－Ｖ２について最も低い活性が測定された。ＡＣ＿ＳＣ－Ｖ７はこれらの活性アッセイにおいて中程度であったが、ＡＣ＿ＳＣ－Ｖ０、－Ｖ５、－Ｖ６、および－Ｖ７は一本鎖バリアントとして最良であった。二重鎖ＡＣ－６ｒｓ－ＲＥＦ対照は、全体的に最も高いタンパク質量およびＦＶＩＩＩ発色活性を示した。ＦＶＩＩＩ抗原に対する発色活性の比率またはＦＶＩＩＩ抗原に対する凝固活性の比率のいずれかを表す比活性（これらはともにタンパク質の機能性の指標となる）は、ＡＣ＿ＳＣ－Ｖ０、ＡＣ＿ＳＣ－Ｖ５、ＡＣ＿ＳＣ－Ｖ６、およびＡＣ＿ＳＣ－Ｖ７について最良であった。
２．安定性および薬物動態データ
インビトロでの安定性実験およびインビボでの実験の前に、細胞除去および上清の濃縮、その後のアフィニティークロマトグラフィーによるＦＶＩＩＩタンパク質の精製、ならびにＦＶＩＩＩ製剤緩衝液への再緩衝を含む標準的な精製手順によって、ＦＶＩＩＩ一本鎖タンパク質を精製した。
インビトロでの安定性実験およびインビボでの実験の前に、細胞除去および上清の濃縮、その後のアフィニティークロマトグラフィーによるＦＶＩＩＩタンパク質の精製、ならびにＦＶＩＩＩ製剤緩衝液への再緩衝を含む標準的な精製手順によって、ＦＶＩＩＩ一本鎖タンパク質を精製した。
Ｖ０およびＲｅＦａｃｔｏ ＡＦ（登録商標）の発色活性および凝固活性を、緩衝液中およびＦＶＩＩＩを有しない血漿中の両方において２４時間および１４日間にわたって分析した。Ｖ０およびＲｅＦａｃｔｏ ＡＦ（登録商標）は安定性に関して同等であった（図４）。
Ｖ０および市販の二重鎖ＦＶＩＩＩであるＲｅＦａｃｔｏ ＡＦ（登録商標）の薬物動態データをマウスにおいて分析した。雌性血友病Ａマウス（ＦＶＩＩＩ欠損マウス、Jax No B6;129S-F8tm1Kaz/J, Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germany）に、凝固因子（２００ＩＵ（発色活性）／ｋｇ体重）を６ｍＬ／ｋｇ体重で単回尾静脈内注射によって投与した。処置の０．５、４、８、１２および２０時間後に採血を行い、次いでクエン酸血漿を遠心分離によって抽出した。血漿試料を、ＦＶＩＩＩ発色活性およびＦＶＩＩＩタンパク質量（ＦＶＩＩＩ抗原）について分析した。生の値を分析し、Phoenix WinNonlin 8.1（Certara, USA）を用いてノンコンパートメント分析（ＮＣＡ）を行うことによって、薬物動態評価を行った。
この試験において、ＲｅＦａｃｔｏ ＡＦ（登録商標）は抗原について約７．４時間およびＦＶＩＩＩ発色活性について６．９時間という平均を上回る半減期を達成した。これと比較して、Ｖ０は抗原および発色活性についてそれぞれ６．１および６．８時間の半減期を示した。静脈内投与後の最大濃度をＶ０およびＲｅＦａｃｔｏ ＡＦ（登録商標）の両方について注射の０．５時間後に採取した試料において観察し、これらはそれぞれ２．１６ＩＵ／ｍｌおよび２．０２ＩＵ／ｍｌの値であった。したがって、両バリアントは抗原および発色活性の両方に関して同等の半減期を示し（図５）、注射後において同等の最大濃度を示す。
したがって、インビトロでの知見を動物モデルに適用し、本発明者らは本発明におけるＦＶＩＩＩバリアントの有利な特性をインビボでの状況においても確認できた。
Claims (15)
- 一本鎖において、第ＶＩＩＩ因子のＡ１およびＡ２ドメインを含む重鎖部分ならびにＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインを含む軽鎖部分を含む組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質であって、
ａ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、配列番号１に規定される野生型第ＶＩＩＩ因子のＦ７６１とＰ１６５９との間の連続したアミノ酸に対応する８９４アミノ酸が欠失しており、第１の欠失をもたらす；
ｂ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、第１の欠失の部位に広がる配列番号２または配列番号２において最大で１つのアミノ酸置換を有する配列を含むプロセシング配列を含み、前記プロセシング配列が第１のトロンビン切断部位を含む；
ｃ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質において、少なくとも野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸Ｒ１６６４からＲ１６６７に対応するアミノ酸が欠失しており、第２の欠失をもたらす；および
ｄ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、第２の欠失のＣ末端およびＡ３ドメインのＮ末端に第２のトロンビン切断部位を含む、組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質。 - 一本鎖において、第ＶＩＩＩ因子のＡ１およびＡ２ドメインを含む重鎖部分ならびにＡ３、Ｃ１およびＣ２ドメインを含む軽鎖部分を含む組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質であって、
ａ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、配列番号２または配列番号２において最大で１つのアミノ酸置換を有する配列を含むプロセシング配列を含み、前記プロセシング配列が第１のトロンビン切断部位を含む；
ｂ）任意で、前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質が異種配列を前記プロセシング配列のＣ末端に直接含む；
ｃ）前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１からなる群から選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する統合配列を前記プロセシング配列のＣ末端に直接、または存在する場合には前記異種配列のＣ末端に直接含む；および
ｄ）前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質が、第２のトロンビン切断部位を配列番号９～１１のＣ末端に含む、
ここで、前記第ＶＩＩＩ因子タンパク質が任意で請求項１記載の第ＶＩＩＩ因子タンパク質である、組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質。 - プロセシング配列が配列番号４または前記配列において最大で１つのアミノ酸置換を有する配列であり、任意で、Ｆ、ＦのＣ末端のＳ、ＱまたはＮが置換されている、請求項１または２に記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質。
- プロセシング配列が配列番号４、６、７または８からなる群から選択される、請求項１～３のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質。
- プロセシング配列が配列番号４である、請求項１～４のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質。
- 野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸Ｋ１６６３からＬ１６７４に対応するアミノ酸が欠失しており、第２の欠失をもたらす、請求項１～５のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質。
- フーリン切断認識部位を含まず、プロセシング配列と統合配列との間にフーリン切断認識部位ＲＨＱＲに対して７５％よりも高い配列同一性を有する配列を含まず、好ましくは配列番号１５に対して４０％よりも高い配列同一性を有する配列を含まない、請求項１～６のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質。
- プロセシング配列および前記プロセシング配列のＣ末端に統合配列を含み、前記配列が以下からなる群から選択される、請求項１～７のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質：
ａ．配列番号４のプロセシング配列および配列番号１２の統合配列、
ｂ．配列番号５のプロセシング配列および配列番号１２の統合配列、
ｃ．配列番号６のプロセシング配列および配列番号１２の統合配列、
ｄ．配列番号７のプロセシング配列および配列番号１２の統合配列、
ｅ．配列番号８のプロセシング配列および配列番号１２の統合配列、
ｆ．配列番号３のプロセシング配列および配列番号１３の統合配列、
ｇ．配列番号２のプロセシング配列および配列番号１３の統合配列、
ｈ．配列番号３のプロセシング配列および配列番号１４の統合配列、
ここで任意で、前記統合配列は前記プロセシング配列の直接のＣ末端にある。 - Ａ１ドメインとＡ２ドメインとの間に第３のトロンビン切断部位をさらに含む、請求項１～８のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質。
- Ｆｃ領域、アルブミン結合配列、アルブミン、ＰＡＳポリペプチド、ＨＡＰポリペプチド、絨毛性ゴナドトロピンのベータサブユニットのＣ末端ペプチド、アルブミン結合小分子、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプンからなる群から選択される少なくとも１つの異種融合パートナーとの融合タンパク質であり、任意で前記異種融合パートナーが前記プロセシング配列のＣ末端に直接挿入されている、請求項１～９のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質。
- 請求項１～１０のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質をコードする核酸であって、任意で前記ポリヌクレオチドがヒト細胞を含む群から選択される哺乳類細胞における前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現に適した発現ベクターである、核酸。
- 請求項１１に記載の核酸を含む宿主細胞であって、好ましくは宿主細胞が前記細胞における前記組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現に適した発現ベクターを含む哺乳類細胞である、宿主細胞。
- 第ＶＩＩＩ因子タンパク質を調製する方法であって、請求項１２に記載の宿主細胞を第ＶＩＩＩ因子タンパク質の発現に適した条件下で培養すること、および第ＶＩＩＩ因子タンパク質を単離することを含み、任意で第ＶＩＩＩ因子タンパク質を医薬組成物として製剤化することを含む、方法。
- 請求項１～１０のいずれかに記載の組換え第ＶＩＩＩ因子タンパク質、請求項１１に記載の核酸、または請求項１２に記載の宿主細胞を含む、医薬組成物。
- 血友病Ａの処置における使用のための請求項１４に記載の医薬組成物であって、任意で処置が免疫寛容導入である、医薬組成物。
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