KR20090102795A - 연장된 생체내 반감기를 갖는 변형된 응고 인자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 응고 인자, 바람직하게는 응고 인자 VIII 및 이의 유도체를 암호화하는 변형된 핵산 서열, 이 핵산 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터, 이 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 상기 핵산 서열에 의해 암호화되고 비변형 야생형 단백질에 비해 생체내 반감기가 연장되고 생물학적 활성을 보유하는 재조합 폴리펩타이드 및 유도체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 시험관내 안정성을 향상시키는 해당 서열에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 재조합 단백질의 제조 방법에 관한 것이며, 이들의 유도체도 포함된다. 본 발명은 또한 상기 변형된 핵산 서열을 포함하는, 사람 유전자 요법용 전달 벡터에 관한 것이다.

Description

연장된 생체내 반감기를 갖는 변형된 응고 인자{Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life}

본 발명은 응고 인자, 바람직하게는 응고 인자 VIII 및 이의 유도체를 암호화하는 변형된 핵산 서열, 이러한 핵산 서열을 함유하는 재조합 발현 벡터, 이러한 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 상기 핵산 서열에 의해 암호화되고 비변형 야생형 단백질에 비해 연장된 생체내 반감기 및/또는 증가된 생체내 회수율과 함께 생물학적 활성을 나타내는 재조합 폴리펩타이드 및 유도체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 시험관내 안정성을 향상시키는 대응 서열에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 재조합 단백질 및 이의 유도체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 사람 유전자 요법에 사용하기 위한, 상기 변형된 핵산 서열을 포함하는 전달 벡터에 관한 것이다.

혈액 응고 인자의 결핍을 원인으로 하는 출혈 장애에는 다양한 종류가 있다. 가장 일반적인 장애는 혈액 응고 인자 VIII 및 IX의 결핍으로부터 각각 초래되는 혈우병 A 및 B이다. 다른 공지된 출혈 장애는 폰 빌레브란트씨병이다.

전형적 혈우병 또는 A형 혈우병은 유전성 출혈 질환이다. 이는 혈액 응고 인자 VIII의 염색체 X-연관된 결함으로 인한 것이며, 10,000 명당 한 명 내지 두 명의 발생률로 거의 전적으로 남성에게 일어난다. X-염색체 결함은 그 자신은 혈우병 환자가 아닌 여성 보인자에 의해 유전된다. A형 혈우병의 임상소견은 출혈 경향의 증가이다. 인자 VIII 농축물을 사용한 치료가 도입되기 전에, 중증 혈우병에 걸린 사람의 평균 수명은 20년 미만이었다. 혈장 유래의 인자 VIII의 농축물의 사용은 혈우병 환자의 평균 수명을 길게 연장시키고 이들 대부분에게 다소간의 정상 생활을 영위할 가능성을 주어, 혈우병 환자의 상황을 크게 개선시켰다. 그러나, 혈장 유래 농축물 및 이의 사용에는 특정 문제가 있는데, 가장 심각한 것은 바이러스가 전달된다는 것이다. 지금까지, B형 간염, 비-A형 비-B형 간염 및 AIDS를 일으키는 바이러스가 사람들에게 심각한 피해를 주었다. 이후, 상이한 바이러스 불활성화 방법 및 새로운 고도로 정제된 인자 VIII 농축물이 최근에 개발되어, 혈장 유래된 인자 VIII에 대해 매우 높은 안전성 표준이 확립되었다.

인자 VIII에 대한 cDNA의 클로닝 [참조: Wood, W.I., et al. (1984) Nature 312, 330-336; Vehar, G.A., et al. (1984) Nature 312, 337-342]를 이용하여 인자 VIII을 재조합적으로 발현할 수 있었으며, 이로써 여러 재조합 인자 VIII 생성물의 개발이 유도되었고, 1992년 내지 2003년 사이에 규제 당국에 의해 승인되었다. 아미노산 Arg-740과 Glu-1649 사이에 존재하는 인자 VIII 폴리펩티드 쇄의 중앙 B 도메인이 완전한 생물학적 활성에 필요한 것으로 보이지 않는다는 사실은 B 도메인 결실된 인자 VIII의 개발을 이끌었다.

성숙한 인자 VIII 분자는 2332개의 아미노산으로 이루어지며, 이는 3개의 상동성 A 도메인, 2개의 상동성 C 도메인 및 하나의 B 도메인으로 구분될 수 있고 A1-A2-B-A3-C1-C2의 순서로 배열된다. 성숙한 사람 인자 VIII의 완전한 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시된다. 혈장으로의 이의 분비 동안에, 단일쇄 인자 VIII이 B-A3 경계에서 및 B 도메인 내의 상이한 부위에서 절단되면서, 인자 VIII이 일련의 금속 이온 결합된 이종이량체로 세포 내에서 프로세싱된다. 이러한 프로세싱은 A1, A2 및 B-도메인의 다양한 부분으로 이루어지고 분자량이 90 kDa 내지 200 kDa 범위인 중쇄를 생성시킨다. 중쇄는 금속 이온을 통해, A3, C1 및 C2 도메인으로 이루어진 경쇄에 결합된다 (Saenko et al. 2002. Vox Sang. 83:89-96). 혈장에서, 이러한 이종이량체 인자 VIII은 높은 친화성으로 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand Factor)에 결합하여, 이를 조숙 이화작용으로부터 보호한다. vWF에 결합된 비-활성화된 인자 VIII의 반감기는 혈장에서 약 12시간이다.

인자 VIII은 중쇄 내의 아미노산 Arg372 및 Arg740에서 및 경쇄 내의 아미노산 Arg1689에서 FXa 및 트롬빈에 의한 단백질분해 절단을 통해 활성화되어, 폰 빌레브란트 인자가 방출되고 활성화된 인자 VIII 이종삼량체가 생성되고, 이는 Ca^{2 +} 가 존재하는 경우에 FIXa 및 FX와 함께 인지질 표면 상에서 테나즈(tenase) 복합체를 형성할 것이다. 당해 이종삼량체는 A1 도메인, 50 kDa 단편, A2 도메인, 43 kDa 단편 및 경쇄 (A3-C1-C2), 73 kDa 단편으로 이루어진다. 따라서, 인자 VIII의 활성형 (인자 VIIIa)은 트롬빈-절단된 A3-C1-C2 경쇄에 2가 금속 이온을 통해 연결된 A1-서브유닛, 및 A1 및 A3 도메인과 비교적 느슨하게 연결된 유리 A2 서브유닛으로 이루어진다.

과도한 파종 응고를 피하기 위하여, 인자 VIIIa는 활성화 후 곧바로 불활성화되어야 한다. Arg336 및 Arg562에서의 절단에 의한 활성화된 단백질 C(APC)를 통한 인자 VIIIa의 불활성화는 율속 단계인 것으로 여겨지지 않는다. 오히려, 이종삼량체로부터 비-공유결합된 A2 서브유닛의 해리가 트롬빈 활성화 후 인자 VIIIa 불활성화에서의 율속 단계인 것으로 생각된다 [참조: Fay et al. 1991. J. Biol. Chem. 266 8957, Fay & Smudzin 1992. J. Biol. Chem. 267: 13246-50]. 이는 신속한 과정으로서, 단지 2.1분에 불과한 혈장 내에서의 인자 VIIIa의 짧은 반감기를 설명해준다 [참조: Saenko et al., 2002. Vox Sang. 83: 89-96].

예방적 치료를 받고 있는 중증 A형 혈우병 환자의 경우에, 인자 VIII은 혈장에서의 약 12시간의 인자 VIII의 짧은 반감기로 인해 주당 약 3회 정맥내로 투여되어야 한다. 매번 정맥내 투여하는 것은 번거로우며, 통증을 수반하고, 환자 자신 또는 A형 혈우병으로 진단된 아이들의 부모에 의해 가정 요법으로 대부분 행해지기 때문에 특히 감염 위험이 있다.

따라서, 덜 자주 투여되는, 인자 VIII을 함유하는 약제학적 조성물의 제조를 가능케 하는 작용성 반감기가 증가된 인자 VIII을 제조하는 것이 매우 바람직할 것이다.

세포 수용체와의 상호작용을 감소시키거나 (WO 03/093313A2, WO 02/060951 A2), 중합체를 인자 VIII에 공유결합시키거나 (WO 94/15625, WO 97/11957 및 US 4970300), 또는 인자 VIII의 캡슐화 (WO 99/55306)에 의해 비-활성화된 인자 VIII의 반감기를 연장시키려는 여러 시도가 있었다.

WO 97/03193에서, 신규 금속 결합 부위의 도입이 인자 VIII, 특히 His 또는 Met가 Phe652, Tyr1786, Lys1818, Asp1840 및/또는 Asn1864 중의 어느 하나에 의해 치환된 돌연변이체를 안정화시킬 수 있다는 것이 추측되었다. 그러나, 이러한 변형으로 얻어진 안정화를 의미하는 성공을 어떻게 결정하는 지에 대한 근거가 제공되지 않았으며 또한 제안된 아미노산이 왜 선택되었는지에 대한 근거도 제공되지 않았다.

먼저 A2 도메인을 A3 도메인에 공유결합시키고, 그 다음 APC 절단 부위를 돌연변이시킴으로써 불활성화 내성인 인자 VIIIa를 제조하고자 하는 또 다른 시도가 있었다 [참조: Pipe and Kaufman. 1997. PNAS 94:11851-11856, WO 97/40145 및 WO 03/087355]. 또한, 이러한 기본 유전자 작제물을 사용하여 문헌[WO 02/072023A2]에 기재된 바와 같이 유전자전이(transgenic) 동물을 생산하였다. 이러한 변이체는 트롬빈 활성화 후 4시간이 지나도 이의 피크 활성의 38%를 여전히 나타내었다. 그러나, 이러한 변이체는 vWF 결합 도메인이 없는데, 그 이유는 A2를 A3 도메인에 융합시킴으로써 이 도메인이 결실되었기 때문이다. vWF 결합이 생체내에서 FVIII의 반감기를 현저히 연장시키기 때문에, 당해 FVIII 변이체의 비-활성화된 형태의 반감기가 줄어들 것으로 예상된다. 상기 발명자들은 스스로 이를 인식하고, vWF에 대한 약간의 친화성을 보유하는 입체형태로 경쇄를 안정화시키는 항체를 부가하여 이러한 문제를 극복하였다.

게일 등(Gale et al.) [참조 문헌: Protein Science (2002), 11 :2091-2101]은, A3 도메인을 A2 도메인에 공유 결합시킴으로써 FVa가 안정화된다는 것을 공개하였다. 이들은 구조 예측에 따라 두 개의 인접 아미노산, 즉 A2 도메인 상의 하나와 A3 도메인에 위치한 다른 하나를 동정하였고, 이들 두 개의 아미노산을 시스테인 잔기로 대체하였고, 이들은 소포체로 배출되는 동안 디설파이드 가교를 형성하였다. 동일한 방법을 사용하여, 디설파이드 가교를 통해 인자 VIII의 A2를 A3 도메인에 공유결합시켰다 (WO 02/103024A2). 이와 같이 공유결합된 A3 및 A2 도메인을 보유하여 FVIIIa를 안정화시키는 인자 VIII 돌연변이체는, 활성화 후 40분 동안 초기 최고 활성의 약 90%를 보유한 반면에, 야생형 인자 VIII의 활성은 초기 최고 활성의 10%로 빠르게 감소하였다. 인자 VIII 돌연변이체는, 더 이상의 활성의 손실 없이, 추가로 3시간 동안 이의 90% 활성을 보유하였다 (Gale et al., J. Thromb. Haemost. (2003), 1:1966-1971).

WO2006/108590은 Arg372에서 트롬빈 활성화 부위를 대신하여 FVIII의 활성화 형태를 안정화시키는 여러 펩타이드 링커의 삽입을 특징으로 하는 안정화된 FVIII 돌연변이체를 개시한다. FVIII 활성의 수준은 링커가 길어짐과 동시에 증가하여, 99개 아미노산(L99)이 삽입되었을 때 최대가 되었다.

발색 분석법을 사용하는 경우, FVIII L99에 의해 검출된 FVIII 활성은 FVIII WT와 유사했다. 활성화된 FVIII L99는 1시간 이상 동안 거의 안정했다.

하지만, 전술한 시도들 중 어떠한 시도도 환자에게 적용할 수 있는 개량된 FVIII 분자를 생산하지는 못했는바, 연장된 반감기를 나타내는 변형된 응고 인자 VIII 분자의 개발은 여전히 필요로 되고 있다.

잠재적인 혈전형성의 위험성 측면에서, FVIIIa보다 FVIII의 비활성화 형태의 반감기를 연장시키는 것이 더욱 바람직하다.

rec FVIII 생산 시 일반적으로 부딪히는 또 다른 문제점은 불량한 수율이다. 당업자에게 공지된 다양한 방법들이 시도되었지만, 이러한 불량한 수율 문제점을 해결하지는 못했다.

발명의 개요

본 발명의 목적은 생체내 반감기가 증가된 혈액 응고 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 생체내 회수율이 증가된 혈액 응고 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기와 같은 변형된 혈액 응고 분자가 포유동물 세포에 의해 발현될 수 있고 발현된 변형 단백질이 생물학적 활성을 보유하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 포유동물 세포 배양물에서 응고 분자의 발현 및/또는 안정성의 증가에 의해 수율을 증가시키는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 혈청- 및/또는 동물 단백질-미함유 배양 배지에서, 특히 vWF의 부재 하에, 포유동물 세포 배양물의 안정성이 증가된 FVIII 분자를 제공하는 것이다.

현재 발견된 놀라운 점은, 알부민과 같은 이종 폴리펩타이드를 FVIII 분자에 삽입하면, 바람직하게는 FVIII B 도메인을 거의 전부 또는 부분적으로 대체하도록 삽입하면, 포유동물 세포로부터 FVIII 키메라 단백질의 발현 및 분비가 허용될 뿐만 아니라 상당한 FVIII 활성을 보유하는 변형 FVIII 분자가 생성된다는 것이다. 또한, 이와 같은 변형 FVIII 분자는 연장된 생체내 반감기 및/또는 증가된 생체내 회수율을 나타낸다.

FVIII이 응고 인자이고 A2 도메인이 활성화 후 A3 도메인에 공유 부착되지 않은 상태를 유지하는 본 발명의 상기 양태들의 또 다른 잠재적 이익은 FVIII의 비활성화 형태의 반감기만이 증가하고, 이에 반해 FVIII의 활성화된 형태의 반감기는 본질적으로 동일하게 유지되어 혈전형성의 위험을 감소시킬 수 있다는 점이다.

더욱이, 본 발명의 FVIII 분자는 포유동물의 세포 배양물에서, 특히 혈청- 및/또는 동물 단백질-미함유 배양 배지에서 안정화 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 부재 하에 야생형 FVIII보다 더욱 안정한 것으로 발견되었다.

이러한 분자는 혈액 응고 인자의 아미노산 서열 내로, 예컨대 FVIII 분자 내로 반감기 향상 단백질(HLEP) 부분(moiety)을 삽입하여 생성시킬 수 있다. 혈액 응고 인자가 FVIII인 경우, HLEP는 FVIII의 B 도메인 또는 이의 일부 내로 삽입되거나 대체되는 것이 바람직하다.

본 발명의 의미에서 HLEP는 알부민, 아파민, 알파-태아단백질 및 비타민 D 결합 단백질을 포함하는 알부민 계열의 구성원, 뿐만 아니라 면역글로불린 불변 영역의 일부 및 생리학적 조건 하에서 상기 알부민 계열의 구성원 및 면역글로불린 불변 영역의 일부에 결합할 수 있는 폴리펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 가장 바람직한 HLEP는 사람 알부민이다.

또한, 본 발명에는 HLEP가 다른 응고 인자, 예컨대 폰 빌레브란트 인자, 인자 V, 및 프로트롬빈 인자, 예컨대 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z 및 프로트롬빈 등에 삽입된 다른 단백질도 포함된다. 전술한 FVIII에서와 마찬가지로, 특정 HLEP, 바람직하게는 알부민은 바람직한 양태에 따르면 상기 응고 인자의 도메인 또는 서브유닛에, 또는 그 도메인이나 서브유닛의 경계 부위 부근에 삽입된다.

종래 기술에는 반감기 향상 폴리펩타이드로서 알부민(WO 01/79171), 알파-태아단백질(WO 2005/024044) 및 면역글로불린(WO 2004/101740)에 대한 응고 인자의 융합이 기술되어 있다. 이들은 각 치료 단백질 부분의 카르복시 말단이나 아미노 말단 또는 양 말단에 부착되고, 때로는 펩타이드 링커, 바람직하게는 글리신과 세린으로 이루어진 링커를 통해 결합되는 것으로 교시되었다.

밸런스 등(Ballance et al.)(WO 01/79271)은 사람 혈청 알부민에 융합된 다수의 상이한 치료 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단 융합 폴리펩타이드에 대해 설명한 바 있다. 잠재적인 융합 파트너의 긴 목록이 실제 각각의 알부민 융합 단백질이 생물학적 활성을 보유하고 향상된 성질을 나타내는지의 여부에 관계없이 이들 폴리펩타이드의 거의 모두에 대한 실험 데이터를 개시하지 않고 설명되어 있다. 이러한 치료 폴리펩타이드의 목록 중에는 인자 VIII도 언급되어 있다.

종래 기술의 융합 단백질에 반해, 본 발명의 변형된 응고 인자 중의 이종 아미노산 서열은 응고 인자의 바로 N-말단 또는 C-말단에 융합되는 것이 아니라, 응고 인자의 아미노산 서열 중 내부 영역에 삽입된다. 놀랍게도, 훨씬 큰 폴리펩타이드의 삽입도 응고 인자의 생물학적 활성을 완전히 상실시키지 않았다. 오히려, 이와 같은 변형된 응고 인자는 생물학적 활성을 보유했고, 생체내 기능 반감기, 생체내 회수율 및 안정성이 증가되어 있었다.

따라서, 본 발명은 응고 인자의 내부 영역에 반감기 향상 폴리펩타이드(HLEP)가 삽입된 변형된 응고 인자에 관한 것으로서, 상기 변형된 응고 인자는 상기 삽입이 결여된 응고 인자의 기능 반감기 및/또는 야생형 응고 인자의 기능 반감기에 비해 기능 반감기가 연장된 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 여러번 삽입되는 HLEP가 동일한 HLEP이거나 또는 상이한 HLEP의 조합일 수 있는, 하나보다 많은 HLEP의 삽입에 관한 것이다. 또한, 응고 인자의 내부 영역에 하나 이상의 HLEP의 삽입과 함께 동일한 HLEP 또는 상이한 HLEP의 조합일 수 있는 하나 이상의 HLEP의 추가 N-말단 및/또는 C-말단 융합의 조합도 본 발명에 포함된다.

또한, 본 발명은 응고 인자의 내부 영역에 반감기 향상 폴리펩타이드(HLEP)가 삽입된 변형된 응고 인자로서, 상기 삽입이 결여된 응고 인자의 생체내 회수율 및/또는 야생형 응고 인자의 생체내 회수율에 비해 생체내 회수율이 증가된 변형된 응고 인자에 관한 것이다.

본 발명의 다른 관점에서, 변형된 응고 인자는 무혈청 배양 배지에서의 안정성이 상기 삽입이 결여된 응고 인자의 안정성 및/또는 야생형 응고 인자의 안정성에 비해 증가된 것이다. 또 다른 본 발명의 관점에서, 변형된 응고 인자는 동물 단백질-미함유 배양 배지에서의 안정성이 상기 삽입이 결여된 응고 인자의 안정성 및/또는 야생형 응고 인자의 안정성에 비해 증가된 것이다. 무혈청 배양 배지 및/또는 동물 단백질-미함유 배양 배지에서의 안정성 증가는 vWF의 안정화량이 없는 경우에 특히 현저하다.

본 발명의 의미에서 동물 단백질-미함유 배지는 동물에서 유래된 단백질 또는 단백질 단편이 없는 배지이다.

본 발명의 다른 관점은 본 발명의 변형된 응고 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 세트이다.

또한, 본 발명은 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 플라스미드 또는 벡터, 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오타이드 또는 플라스미드 또는 벡터를 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다.

본 발명의 다른 관점은

(a) 변형된 응고 인자가 발현되도록 하는 조건 하에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하고;

(b) 임의로, 상기 변형된 응고 인자를 상기 숙주 세포로부터 또는 배양 배지로부터 회수함을 포함하는, 변형된 응고 인자의 생산 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 명세서에 기술된 변형된 응고 인자, 폴리뉴클레오타이드, 또는 플라스미드 또는 벡터를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 관점은 혈액 응고 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조를 위한, 본 발명에 따른 변형된 응고 인자, 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드 또는 벡터, 또는 숙주 세포의 용도에 관한 것이다.

도 1은 알부민에 의한 FVIII B 도메인의 대체를 도시한 것이다. FVIII 야생형(FVIII wt) 및 B 도메인이 알부민으로 대체된 FVIII(FVIII-HA)의 cDNA 구성이 개략되었다. FVIII-HA 작제물 중에 전이 서열과 남은 B 도메인의 아미노산이 도시되어 있다. 아미노산 번호는 서열번호 2에 개략된 FVIII 야생형 서열을 참조한다. DNA pF8-1211에 C1636S 아미노산 교환과 pF8-1413에 R740 결실이 표시되어 있다.

도 2는 본 발명의 변형 인자 VIII 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA의 다양한 양태를 모식적으로 도시한 것이다. HLEP는 앞에서 기술한 바와 같이 FVIII 서열 내의 다양한 위치에 삽입될 수 있다.

도 3은 알부민이 통합되고 B 도메인의 일부가 결실된 2가지 변형 FVIII 분자(DNA pF8-1211 및 pF8-1413, 도 1 참조)의 약동학적 프로파일을 야생형 FVIII와 비교하여 도시한 것이다(실시예 5 참조).

본 발명은 응고 인자의 1차 해독 폴리펩타이드의 N-말단 아미노산과 C-말단 아미노산 사이의 내부 영역에 반감기 향상 폴리펩타이드(HLEP)의 삽입을 포함하는 변형된 응고 인자에 관한 것으로서, 이 변형된 응고 인자는 상기 삽입이 결여된 응고 인자의 기능 반감기 및/또는 야생형 응고 인자의 기능 반감기에 비해 연장된 기능 반감기를 보유하는 것을 특징으로 하는 변형된 응고 인자에 관한 것이다.

본 발명에 따른 "기능 반감기"는 일단 포유동물에 투여되면, 응고 인자가 투여된 다음 여러 시간 간격에서 상기 포유동물로부터 채취한 혈액 샘플에서 시험관내 측정될 수 있는 응고 인자의 생물학적 기능의 반감기이다.

"삽입", "삽입하는" 및 "삽입된"이란 어구는 응고 인자 아미노산 서열의 내부 위치에 아미노산이 부가되는 것을 의미한다. N-말단 또는 C-말단 융합 단백질의 경우 이외에, 본 발명에 따른 아미노산은 응고 인자 아미노산 서열의 바로 그 N-말단 또는 C-말단에 부가되지 않고 응고 인자의 아미노산 서열 내의 내부 위치에 삽입된다. "삽입"은 아미노산의 부가(응고 인자 아미노산 서열로부터 아미노산이 결실됨이 없이)뿐만 아니라, 응고 인자 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산의 "삽입되는" 아미노산으로의 대체를 포함하기도 한다. 예를 들어, 완전한 내부 도메인 또는 이의 실질적인 부분은 HLEP로 대체될 수 있다.

한가지 양태에서, 변형된 응고 인자는 다음과 같은 구조를 보유한다:

N-L1-H-L2-C

상기 화학식 1에서,

N은 응고 인자의 N-말단 부분이고,

L1 및 L2는 독립적으로 화학 결합 또는 링커 서열로서, 여기서 링커 서열은 상이한 링커 서열 또는 동일한 링커 서열일 수 있으며,

H는 HLEP이고,

C는 응고 인자의 C-말단 부분이다.

바람직하게는, N은 야생형 응고 인자의 N-말단에 존재하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 단백질 도메인을 포함한다. C는 야생형 응고 인자의 C-말단에 존재하는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 단백질 도메인을 포함하는 것이 바람직하다. 한가지 양태에서, 야생형 응고 인자는 실질적으로 구조 N-C를 보유한다. 다른 양태에서, 야생형 응고 인자는 실질적으로 구조 N-D-C를 보유하고, 여기서 D는 변형된 응고 인자에서 HLEP로 대체된 도메인 또는 이의 부분을 나타내고, 환언하면 D는 변형된 응고 인자에서 HLEP로 대체된 야생형 응고 인자의 부분(즉, 완전한 도메인 또는 이의 부분)의 결실을 나타낸다. 바람직한 응고 인자 서열은 이하에 설명된다. 일반적으로, N+C의 길이는 야생형 응고 인자의 길이를 초과하지 않는다.

L1 및 L2는 독립적으로 화학 결합이거나, 또는 하나 이상의 아미노산, 예컨대 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개 또는 1 내지 3개(예컨대, 1, 2 또는 3개)의 아미노산으로 이루어지고 서로 동일하거나 상이할 수 있는 링커 서열일 수 있다. 일반적으로, 링커 서열은 야생형 응고 인자의 대응 위치에 존재하는 것은 아니다. L1 및 L2에 존재하는 적당한 아미노산의 예는 Gly 및 Ser을 포함한다.

바람직한 HLEP 서열은 이하에 설명된다. 본 발명의 변형된 응고 인자는 하나보다 많은 HLEP 서열, 예컨대 2개 또는 3개의 HLEP 서열을 포함할 수 있다. 이러한 다수의 HLEP 서열은 연속 반복체와 같이 일렬로 삽입되거나, 또는 응고 인자 서열의 바로 N-말단 또는 바로 C-말단 또는 양말단에서의 HLEP 서열의 융합체를 비롯하여 응고 인자 서열의 여러 위치에 존재할 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 HLEP 서열은 응고 인자 서열 내의 내부 위치에 삽입되어야 한다. 이러한 양태들에서, 변형된 응고 인자는 다음과 같은 구조 중 하나인 것일 수 있다:

N-L1-H-L2-I-L3-H-L4-C

N-L1-H-L2-C-L3-H

H-L1-N-L2-H-L3-C

H-L1-N-L2-H-L3-C-L4-H

상기 화학식 2, 3, 4 및 5에서,

N은 응고 인자의 N-말단 부분이고,

L2, L2, L3 및 L4는 독립적으로 화학결합이거나 또는 상이하거나 동일할 수 있는 링커 서열이며,

H는 HLEP이고,

I는 응고 인자의 내부 서열이며,

C는 응고 인자의 C-말단 부분이다.

응고 인자는 다양한 단계에서 단백질분해적으로 프로세싱될 수 있다. 예를 들어, 앞에서 언급한 바와 같이, 혈장내로 분비되는 동안, 단일쇄 인자 VIII은 B-A3 경계 및 B-도메인 내의 여러 부위에서 세포내 절단된다. 중쇄는 금속 이온을 통해 도메인 구조 A3-C1-C2를 보유하는 경쇄에 결합된다. 인자 VIII은 중쇄 내의 아미노산 Arg372 및 Arg740에서, 그리고 경쇄 내의 Arg1689에서 단백질분해적 절단을 통해 활성화되어 A1 도메인, A2 도메인 및 경쇄(A3-C1-C2), 73kDa 단편으로 이루어진 활성화된 인자 VIII 이종삼량체를 생성한다. 즉, 인자 VIII의 활성 형태(인자 VIIIa)는 트롬빈 절단된 A3-C1-C2 경쇄에 2가 금속 이온 결합을 통해 연결된 A1 서브유닛과 A1 및 A3 도메인과 비교적 느슨하게 연결된 유리 A2 서브유닛으로 이루어진다.

따라서, 본 발명은 단일쇄 폴리펩타이드로 존재하지 않고 비공유 결합을 통해 서로 연결된 여러 폴리펩타이드(예: 1, 2 또는 3개)로 이루어진 변형된 응고 인자를 포함한다. 예를 들면, 변형된 응고 인자의 구조는 다음과 같을 수 있다:

N-L1-H-L2…C

N-L1-H…L2-C

N-L1…H-L2-C

N…L1-H-L2-C

상기 화학식 6, 7, 8 및 9에서,

"…"은 비공유 결합을 의미하고, N, L1, L2, H 및 C의 의미는 위에서 정의한 바와 같다. 화학식 2 내지 5에 따른 폴리펩타이드의 화학식 6 내지 화학식 9의 폴리펩타이드와 유사한 절단된 형태도 본 발명에 포함된다.

일반적으로, 삽입 부위는 응고 인자의 생물학적 활성이 완전히 또는 적어도 부분적으로 유지되도록 선택되어진다. 본 발명의 변형된 응고 인자의 생물학적 활성은 삽입이 결여된 응고 인자 또는 야생형 형태의 응고 인자의 생물학적 활성의 적어도 25%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 75%인 것이 바람직하다.

일반적으로, 응고 인자의 두 도메인 사이에서의 삽입 또는 두 도메인 사이의 경계 부근에서의 삽입이 바람직하다. 두 도메인은 야생형 응고 인자에서 인접한 도메인이거나 그렇지 않을 수 있다.

여기서 두 도메인 사이의 삽입을 언급할 때(예컨대, "도메인 X와 도메인 Y 사이의 삽입"), 이는 정확히 도메인 X의 C-말단 아미노산과 도메인 Y의 N-말단 아미노산 사이에서의 삽입을 의미한다. 하지만, 본 발명의 의미에서, "도메인 X와 도메인 Y 사이의 삽입"은 도메인 X의 C-말단 아미노산의 최대 n개 아미노산 상류쪽 아미노산 위치 또는 도메인 Y의 N-말단 아미노산의 최대 n개 아미노산 하류쪽 아미노산 위치에서의 삽입을 포함할 수도 있다. 숫자 n은 언급된 도메인의 아미노산 총 수의 10% 이하, 바람직하게는 5% 이하인 정수여야 한다. 보통, n은 20, 바람직하게는 15, 더욱 바람직하게는 10, 더욱 더 바람직하게는 5 또는 그 이하(예: 1, 2, 3, 4 또는 5)이다.

또한, 무혈청 배지에서 변형된 응고 인자의 안정성은 삽입이 결여된 응고 인자의 안정성 및/또는 야생형 응고 인자의 안정성보다 큰 것이 바람직하다. 또한, 동물 단백질-미함유 배지에서 변형된 응고 인자의 안정성은 삽입이 결여된 응고 인자의 안정성 및/또는 야생형 응고 인자의 안정성보다 큰 것이 바람직하다. 삽입이 결여된 응고 인자 및/또는 야생형 응고 인자와 비교된 안정성의 증가는 바람직하게는 적어도 10%, 더욱 바람직하게는 적어도 25%, 가장 바람직하게는 적어도 50%인 것이 바람직하다. 상기 배지들에서 응고 인자의 안정성은 실시예 7에 기술된 바와 같이 측정할 수 있다.

본 발명에 따른 기능 반감기는 포유동물에게 일단 투여된 응고 인자의 생물학적 기능의 반감기이며 시험관 내에서 측정된다. 본 발명에 따른 변형된 응고 인자의 기능 반감기는 동일한 종에서 검사했을 때 변형이 결여된 응고 인자의 기능 반감기보다 길어야 한다. 기능 반감기는 변형이 결여된 응고 인자 및/또는 야생형 응고 인자에 비해 25% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 더욱 더 바람직하게는 100% 이상 증가된 것이 바람직하다.

HLEP 변형을 포함하는 변형된 응고 인자의 기능 반감기는 각각의 변형된 응고 인자(및 비교용으로 비변형된 응고 인자)를 래트, 토끼 또는 다른 실험 동물종에 정맥내 또는 피하로 투여한 후, 투여 후 적당한 간격을 두고 채취한 혈액 샘플에서 상기 변형 또는 각각의 비변형된 응고 인자의 생물학적 활성의 소실을 추적하여 측정할 수 있다. 적당한 시험 방법은 본 명세서에 기술된 활성 시험이다.

생물학적 활성의 반감기에 대한 대용 마커로서, 변형 또는 각각의 비변형된 응고 인자의 항원 수준도 측정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 응고 인자의 1차 해독 폴리펩타이드의 N-말단 아미노산과 C-말단 아미노산 사이의 내부 영역에 반감기 향상 폴리펩타이드(HLEP)가 삽입된 변형된 응고 인자로서, 이 응고 인자 항원의 반감기가 상기 삽입이 결여된 응고 인자 항원의 반감기에 비해 연장된 것을 특징으로 하는 변형된 응고 인자도 포함한다. 본 발명에 따른 "응고 인자 항원의 반감기"는 포유동물에 일단 투여된 응고 인자 항원의 반감기이며, 시험관내에서 측정된다. 항원 시험 방법은 당업자에게 공지되고 시중에서 입수용이한(예: Dade Behring, Instrumentation Laboratory, Abbott Laboratories, Diagnostica Stago) 효소 면역검정 방식에서의 특정 항체를 기준으로 한다. 기능 및 항원 반감기는 베타상의 소실 시점을 이용하여 식 t_½ = ln2/k에 따라 계산할 수 있고, 여기서 k는 회귀선의 기울기이다.

일단 응고 인자가 응고 동안 생체내에서 활성화되면, 지금 활성화된 응고 인자의 증가된 반감기를 더이상 유지하는 것이 바람직하지 않을 수 있으며, 이는 야생형 활성화된 응고 인자 FVIIa(Aledort 2004. J Thromb Haemost 2: 1700-1708)에 대한 경우 및 활성화된 인자가 증가된 반감기를 가진 경우 훨씬 더 위협적일 수 있는 혈전성 합병증으로 이어질 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 생체내 내인적 활성화 후 또는 생체내 보조인자의 이용가능 후 비변형된 응고 인자의 기능 반감기와 비슷한 기능 반감기를 보유하는 수명이 긴 응고 인자 분자를 제공하는 것이다. 이것은 특정 절단 부위를 변형된 응고 인자(이하 참조)에 유지시켜 활성화 중에 단백질분해 절단으로 이어져 HLEP로부터 응고 인자를 분리함으로써 달성할 수 있다. 따라서, 한가지 양태에 따르면, 내인적으로 활성화된 변형된 응고 인자의 기능 반감기는 변형이 결여된 활성화된 비변형된 응고 인자의 기능 반감기와 실질적으로 동일하고/하거나 활성화된 야생형 응고 인자의 기능 반감기와 실질적으로 동일하다(예컨대, ±15%, 바람직하게는 ±10%).

다른 양태에 따르면, 내인적으로 활성화된 변형된 응고 인자의 기능 반감기는 삽입이 결여된 활성화된 비변형된 응고 인자 또는 활성화된 야생형 응고 인자의 기능 반감기에 비해 연장된 것이다. 이러한 증가는 15% 이상, 예컨대 20% 이상 또는 50% 이상일 수 있다. 또한, 이러한 기능 반감기 값은 상기 기능 반감기에 대해 기술된 바와 같이 측정 및 계산될 수 있다. 내인적으로 활성화된 변형된 응고 인자의 증가된 반감기는 단지 극소량의 응고 인자만이 이용가능하여 혈전형성성이 아닌 상황에서 유익할 수 있다. 이러한 상황은, 예컨대 종종 낮은 발현률만이 달성될 수 있는 유전자 요법 치료 시에 나타날 수 있다. 따라서, 이러한 안정화된 응고 인자는, 예컨대 고용량 또는 생리학적 용량의 단백질로서 투여되는 경우, 이러한 응고 인자와 관련된 혈전형성 위험에도 불구하고 유전자 요법 등에 유익할 수 있다.

반감기 향상 폴리펩타이드(HLEP)

본 명세서에 사용된 "반감기 향상 폴리펩타이드"는 알부민, 알부민 계열의 구성원, 면역글로불린 G의 불변 영역 및 이의 단편, 및 생리학적 조건 하에서 알부민과 알부민 계열의 구성원 뿐만 아니라 면역글로불린 불변 영역의 부위들에 결합할 수 있는 폴리펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 예컨대, 응고 인자의 치료 활성 또는 생물학적 활성을 안정화 또는 연장시킬 수 있는, 본 명세서에 기술된 전장의 반감기 향상 단백질(예: 알부민, 알부민 계열의 구성원 또는 면역글로불린 G의 불변 영역) 또는 이의 하나 이상의 단편일 수 있다. 이러한 단편은 아미노산 길이가 10개 이상일 수 있고, 또는 HLEP 서열로부터 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개, 적어도 약 30개, 적어도 약 50개, 적어도 약 100개 또는 그 이상의 인접 아미노산을 포함할 수 있고, 또는 HLEP 단편이 야생형 응고 인자에 비해 25% 이상의 기능 반감기 연장을 제공하는 한, 각 HLEP의 특정 도메인 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.

본 발명의 제안된 응고 인자 삽입 작제물의 HLEP 부위는 정상 HLEP의 변이체일 수 있다. "변이체"란 용어는 보존적 또는 비보존적인 치환, 삽입 및 결실을 포함하고, 이러한 변화는 변형된 응고 인자의 생물학적 활성을 부여하는 활성 도메인 또는 활성 부위를 실질적으로 변경시키지 않는 것이다.

특히, 본 발명의 제안된 FVIII HLEP 삽입 또는 B 도메인 대체 작제물은 자연 발생의 다형태 변이체인 HLEP 및 HLEP의 단편을 포함할 수 있다. HLEP는 임의의 척추동물 유래인 것일 수 있고, 특히 임의의 포유동물, 예컨대 사람, 원숭이, 소, 양 또는 돼지 유래일 수 있다. 비-포유동물 HLEP는 암탉 및 연어를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.

HLEP 로서의 알부민

"사람 혈청 알부민"(HSA) 및 "사람 알부민"(HA) 및 "알부민"(ALB)이란 용어는 본 명세서에서 호환 사용되고 있다. "알부민" 및 "혈청 알부민"이란 용어가 더 광범위하고 사람 혈청 알부민(및 이의 단편과 변이체) 뿐만 아니라 다른 종 유래의 알부민(및 이의 단편과 변이체)도 포함한다.

본 명세서에 사용된 "알부민"은 알부민의 하나 이상의 기능성 활성(예컨대, 생물학적 활성)을 보유하는 알부민 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열, 또는 알부민 단편 또는 변이체를 총칭한 말이다. 특히, "알부민"은 사람 알부민 또는 이의 단편, 특히 서열번호 3에 제시된 바와 같은 사람 알부민의 성숙 형태 또는 다른 척추동물 유래의 알부민 또는 이의 단편, 또는 이러한 분자들 또는 이의 단편들의 유사체 또는 변이체를 의미한다.

특히, 본 발명의 제안된 응고 인자 삽입 작제물은 사람 알부민의 자연 발생의 다형태 변이체 및 사람 알부민의 단편을 포함할 수 있다. 일반적으로, 알부민 단편 또는 변이체는 아미노산 길이가 10개 이상, 바람직하게는 40개 이상, 가장 바람직하게는 70개 이상일 것이다. 알부민 변이체는 주로 알부민의 하나 이상의 전체 도메인 또는 이 도메인들의 단편, 예컨대 도메인 1(서열번호 3의 아미노산 1-194), 도메인 2(서열번호 3의 아미노산 195-387), 도메인 3(서열번호 3의 아미노산 388-585), 도메인 1+2(서열번호 3의 아미노산 1-387), 도메인 2+3(서열번호 3의 아미노산 195-585), 도메인 1+3(서열번호 3의 아미노산 1-194 + 서열번호 3의 아미노산 388-585)으로 구성되거나, 또는 이들을 대안적으로 포함할 수 있다. 각 도메인은 그 자체가 2개의 상동성 서브도메인, 즉 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 및 512-585로 구성되어 있으며, 서브도메인간의 가요성 링커 영역은 잔기 Lys106 내지 Glu119, Glu292 내지 Val315 및 Glu492 내지 Ala511을 포함한다.

본 발명의 제안된 응고 인자 삽입 작제물의 알부민 부위는 HA의 적어도 하나의 서브도메인 또는 도메인이나 이의 보존적 변형을 포함할 수 있다.

HLEP 로서의 아파민 , 알파- 태아단백질 및 비타민 D 결합 단백질

알부민 외에도, 알부민 계열의 다른 구성원인 알파-태아단백질은 생체내에서 부착된 치료 폴리펩타이드의 반감기를 증가시키는 것으로 주장된 바 있다(WO 2005/024044). 알부민 계열의 단백질인, 진화적으로 관련된 혈청 수송 단백질은 알부민, 알파-태아단백질(AFP; Beattie & Dugaiczyk 1982. Gene 20: 415-422), 아파민(AFM; Lichenstein et al. 1994. J. Biol. Chem. 269: 18149-18154) 및 비타민 D 결합 단백질(DBP; Cooke & David 1985. J. Clin. Invest. 76: 2420-2424). 이들의 유전자는 사람, 마우스 및 래트에서 동일한 염색체 영역에 맵핑되는, 구조적 및 기능적 유사성이 있는 다유전자 클러스터(multigene cluster)를 나타낸다. 알부민 계열 구성원의 구조적 유사성은 HLEP로서의 유용성을 시사한다. 따라서, 본 발명의 다른 목적은 상기 알부민 계열 구성원, 이의 단편 및 변이체를 HLEP로서 사용하는 것에 관한 것이다. "변이체"란 용어는 원하는 기능이 존재하는 한, 보존적이건 비보존적이건 상관없는 치환, 결실 및 삽입을 포함한다.

알부민 계열 구성원은 전장의 각 단백질 AFP, AFM 및 DBP를 포함할 수 있고, 또는 치료 활성을 안정화 또는 연장시킬 수 있는 하나 이상의 단편을 포함할 수 있다. 이러한 단편은 아미노산 길이가 10개 이상이거나, 또는 각 단백질 서열의 약 15개, 20개, 25개, 30개, 50개 또는 그 이상의 인접 아미노산을 포함하거나, 또는 각 단백질의 특정 도메인 전체 또는 부분을 포함할 수 있으며, 단 이러한 HLEP 단편들은 반감기 연장율이 25% 이상이어야 한다. 본 발명의 삽입 단백질의 알부민 계열 구성원은 AFP, AFM 및 DBP의 자연발생의 다형태 변이체를 포함할 수 있다.

HLEP 로서의 면역글로불린

면역글로불린 G(IgG) 불변 영역(Fc)은 치료 단백질의 반감기를 증가시키는 것으로 당업계에 공지되어 있다(Dumont JA et al. 2006. BioDrugs 20:151-160). 중쇄 IgG 불변 영역은 3개의 도메인(CH1-CH3)과 힌지(hinge) 영역으로 이루어진다. 면역글로불린 서열은 모든 포유동물 유래인 것이거나, 또는 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 각각 유래될 수 있다. 항원결합 도메인이 없는 IgG 및 IgG 단편도 HLEP로서 사용될 수 있다. 치료 폴리펩타이드 부위는 IgG 또는 IgG 단편에 연결되는데, 바람직하게는 절단될 수도 있는, 펩타이드 링커 또는 항체의 힌지 영역을 통해 연결되는 것이 좋다. 치료 단백질의 생체내 반감기를 증가시키기 위한 면역글로불린 불변 영역에 치료 단백질의 융합에 대해서는 몇몇 특허와 특허출원에 기술되어 있다. US 2004/0087778 및 WO 2005/001025는 생체내에서 빠르게 소실될 펩타이드의 반감기를 증가시키는, 생물학적 활성 펩타이드와 면역글로불린 불변 영역의 Fc 도메인 또는 적어도 일부와의 융합 단백질에 대해 기술하고 있다. Fc-IFN-β 융합 단백질은 생물학적 활성을 증가시키고, 혈행 반감기를 연장시키고 더 큰 용해성을 나타내는 것으로 설명되었다(WO 2006/000448). 혈청 반감기가 연장되고 생체내 효능이 증가된 Fc-EPO 단백질(WO 2005/063808) 뿐만 아니라 G-CSF와의 Fc 융합체(WO 2003/076567), 글루카곤 유사 펩타이드-1과의 Fc 융합체(WO 2005/000892), 응고 인자와의 Fc 융합체(WO 2004/101740) 및 인터루킨-10과의 Fc 융합체(US 6,403,077)가 모두 반감기 향상 성질이 있는 것으로 개시되었다.

응고 인자

본 명세서에 사용된 "응고 인자"란 용어는 혈액 응고 인자 또는 응혈인자를 의미한다. 응고 인자에는 인자 VIII, 폰 빌레브란트 인자, 프로트롬빈 인자(인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z 및 프로트롬빈 포함) 및 인자 V가 포함된다.

본 발명의 응고 인자는 또한 야생형 응고 인자의 변이체일 수 있다. "변이체"란 용어는 보존적 및 비보존적 중 어느 한 경우인 치환, 삽입 및 결실을 포함하며, 이러한 변화는 각각의 응고 인자의 생물학적 활성을 부여하는 활성 부위 또는 활성 도메인을 실질적으로 변경시키지 않는 것이다.

FVIII

"혈액 응고 인자 VIII", "인자 VIII" 및 "FVIII"이란 용어는 본 명세서에서 호환 사용된다. "혈액 응고 인자 VIII"은 야생형 혈액 응고 인자 VIII뿐만 아니라 야생형 혈액 응고 인자 VIII의 응고촉진 활성을 보유하는 야생형 혈액 응고 인자 VIII의 유도체를 포함한다. 유도체는 야생형 인자 VIII의 아미노산 서열과 비교했을 때 결실, 삽입 및/또는 부가를 보유할 수 있다. FVIII이란 용어는 중쇄 및 경쇄를 포함하는, 활성화 전의 형태와 같은 인자 VIII의 단백질분해 처리된 형태를 포함한다.

"인자 VIII"이란 용어는 야생형 인자 VIII의 생물학적 활성의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 25%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 75%의 생물학적 활성을 보유하는 임의의 인자 VIII 변이체 또는 돌연변이체를 포함한다.

비제한적 예로서, 인자 VIII 분자는 APC 절단을 방지하거나 감소시키는 인자 VIII 돌연변이체(Amano 1998. Thromb. Haemost. 79: 557-563), A2 도메인을 추가로 안정화하는 인자 VIII 돌연변이체(WO 97/40145), 발현을 증가시키는 FVIII 돌연변이체(Swaroop et al. 1997. JBC 272: 24121-24124), 면역원성을 감소시키는 인자 VIII 돌연변이체(Lollar 1999. Thromb. Haemost. 82: 505-508), 상이하게 발현된 중쇄 및 경쇄로부터 재구성된 FVIII(Oh et al. 1999. Exp. Mol. Med. 31: 95-100), HSPG(헤파란 설페이트 프로테오글리칸) 및/또는 LRP(저밀도 지단백 수용체 관련 단백질)과 같은 FVIII의 이화작용으로 이어지는 수용체에 대한 결합을 감소시키는 FVIII 돌연변이체(Ananyeva et al. 2001. TCM, 11: 251-257), 이황화 결합-안정화된 FVIII 변이체(Gale et al., 2006. J.Thromb. Hemost. 4: 1315-1322), 분비 성질이 향상된 FVIII 돌연변이체(Miao et al., 2004, Blood 103: 3412-3419), 보조인자 특이적 활성이 증가된 FVIII 돌연변이체(Wakabayashi et al., 2005. Biochemistry 44: 10298-304), 생합성 및 분비가 향상되고 ER 샤페론 상호작용이 감소되며 ER-골지 수송이 향상되고 활성화 또는 불활성화에 대한 저항성이 증가되며 반감기가 증가된 FVIII 돌연변이체(Pipe 2004. Sem. Thromb. Hemost. 30: 227-237에 요약정리됨)를 포함한다. 이러한 인자 VIII 돌연변이체 및 변이체 모두는 전부 참조로서 본원에 포함된다.

인자 VIII의 생물학적 활성을 측정하기에 적당한 시험은 1단계 또는 2단계 응고 분석법(Rizza et al. 1982. Coagulation assay of FVIII:C and FIXa in Bloom ed. The Hemophilias. NY Churchchill Livingston 1992) 또는 발색성 기질 FVIII:C 분석법(S. Rosen, 1984. Scand J Haematol 33: 139-145, suppl.)이다. 상기 문헌들의 내용은 본원에 참고인용되었다.

성숙한 야생형 사람 혈액 응고 인자 VIII의 cDNA 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 및 서열번호 2에 제시했다. 특정 서열의 아미노산 위치에 대한 언급은 FVIII 야생형 단백질의 상기 아미노산 위치를 의미하는 것으로, 언급된 서열의 다른 위치에 결실, 삽입 및/또는 치환과 같은 돌연변이의 존재를 배제하지는 않는다. 예를 들어, 서열번호 2를 참조하는 "Glu2004"의 돌연변이는 변형 동족체 서열번호 2의 위치 1 내지 2332에서 하나 이상의 아미노산이 결손된 것을 배제하지 않는다.

HLEP 삽입을 보유한 FVIII 단백질

본 발명의 변형 FVIII 단백질은 가장 일반적인 취지에서 HLEP가 야생형 FVIII의 몰 특이적 FVIII 활성의 약 10% 이하로 키메라 단백질의 몰 특이적 FVIII 활성을 감소시키지 않도록 FVIII 분자에 통합된 HLEP를 보유한 FVIII 분자를 포함한다는 것을 특징으로 한다. HLEP의 삽입은 FVIII 서열의 N-말단과 C-말단 아미노산 사이의 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 주로, HLEP는 야생형 FVIII 단백질의 도메인 사이에 통합된다.

FVIII의 도메인은 다음과 같은 아미노산 위치를 포함한다(아미노산 번호는 서열번호 2를 참조한다):

A1: ...1-336

a1: ...337-372

A2: ...373-710

a2: ...711-740

B: ...741-1648

a3: ...1649-1689

A3: ...1690-2019

C1: ...2020-2172

C2: ...2173-2332

FVIII 분자 내에 HLEP의 바람직한 통합 부위는 HLEP 부분의 삽입이 FVIII 기능적 활성에 최소한 부정적 효과를 미치는 부위로서 정의된다. 잠재적인 통합 부위에는, 산성 영역 1(a1)의 C-말단과 A2 도메인의 N-말단 사이의 영역, A3 도메인의 C-말단과 C1 도메인의 N-말단 사이의 영역, C1 도메인의 C-말단과 C2 도메인의 N-말단 사이의 영역 및 바람직하게는 B 도메인의 영역이 포함되지만, 이에 국한되지는 않고, 상기 B 도메인은 부분적으로 또는 전체가 대체될 수 있다(도 2).

본 발명의 바람직한 양태에서, 본 발명의 키메라 FVIII 단백질은 B 도메인이 부분 또는 완전 결실된 FVIII 분자 및 HLEP가 기능성 A1/A2 도메인의 아미노 말단과 기능성 A3/C1/C2 도메인의 카르복시 말단 사이에 삽입되도록 상기 FVIII 분자에 통합된 HLEP를 포함하는 것을 특징으로 한다.

HLEP 또는 HLEP 유도체는 FVIII의 생물학적 기능에 없어도 될 것 같은 B 도메인(A2 도메인과 A3 도메인 사이의 FVIII 서열[아미노산 741 내지 1648])(Pittman et al. 1992. Blood 81: 2925-2935) 내에 삽입하는 것이 가능하여 FVIII의 생물학적 활성을 유지하면서 새롭고 개선된 성질을 보유한 FVIII 분자를 제공할 수 있는 것으로 밝혀졌다. B 도메인은 아미노산 길이가 약 900개이며 B 도메인의 어떠한 결실 없이 B 도메인 내의 임의의 위치에 HLEP가 삽입될 수 있고, 또는 B 도메인은 부분적으로 또는 그 전체가 HLEP로 대체될 수 있다. 부분 결실은 B 도메인의 적어도 하나의 아미노산의 결실, 바람직하게는 B 도메인의 아미노산 100 내지 600개의 결실 및 가장 바람직하게는 B 도메인의 아미노산 600개 초과의 결실을 의미한다(도 2e-h).

본 발명의 바람직한 양태에서, B 도메인의 대부분은 HLEP로 대체되지만, 본 발명의 FVIII 분자의 절단 및 활성화에 중요한 프로세싱 부위를 함유하는 B 도메인의 아미노 및 카르복시 말단 서열의 몇몇 아미노산은 보존된다(도 1a, b, d 및 2h-i). FVIII 서열(서열번호 2)의 아미노산 위치 740에서 트롬빈을 위한 프로세싱 부위 및 분비 과정 중에 B 도메인과 A3 도메인 사이의 프로테아제 절단을 위한 프로세싱 부위를 보존하는데 필요한 B 도메인의 C말단 및 N말단에 있는 약 1 내지 20개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 3 내지 10개의 아미노산은 본 발명의 FVIII 분자 내에 유지되는 것이 바람직하다(도 1 및 도 2h). 대안적으로, B 도메인으로부터 유지된 아미노산은 합성 절단 부위로 대체될 수도 있다. PACE/Furin 절단 부위(Nakayama 1997. Biochem. J. 327: 625-635)는 분비 중에 프로세싱의 유도를 위해 사용될 수 있고, WO 2004/005347에 기술된 합성 트롬빈 절단 부위(도 1c) 또는 다른 프로테아제 절단 부위도 활성화 프로세싱 동안 도입될 수 있다(도 1e).

본 발명의 다른 관점은 여러번 삽입되는 HLEP가 동일한 HLEP이거나 또는 다른 HLEP의 조합일 수 있는 하나보다 많은 HLEP의 삽입이다. 또한, 동일한 HLEP이거나 상이한 HLEP의 조합일 수 있는 하나 이상의 HLEP의 FVIII 내의 삽입과 추가로 하나 이상의 HLEP의 N- 및/또는 C-말단 융합과의 복합물도 본 발명에 포함된다.

일단 응고 인자가 응고동안 생체내에서 활성화되면, 지금 활성화된 응고 인자의 증가된 반감기를 유지하는 것이 더 이상 바람직하지 않을 수 있으며, 이는 이미 야생형 활성화된 응고 인자 FVIIa(Aledort 2004. J Thromb Haemost 2: 1700-1708)에 대한 경우에 나타났고 활성화된 인자가 증가된 기능 반감기를 가진 경우 훨씬 더 관련이 있을 수 있는 혈전성 합병증으로 이어질 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 생체내 내인적 활성화 후 또는 보조인자의 이용가능 후 비변형 FVIII의 기능 반감기와 비슷한 기능 반감기를 보유하는 수명이 긴 응고 인자 VIII 분자를 제공하는 것이다. 이것은 FVIII 서열(서열번호 2)의 아미노산 위치 740에 트롬빈을 위한 절단 부위 및 분비 과정 중에 B 도메인과 A3 도메인 사이에 프로테아제 절단을 위한 절단 부위를 유지시킴으로써 달성할 수 있고, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 FVIII-HLEP 연결 서열을 보유하면, 본 발명의 FVIII 키메라 단백질의 활성화는 이에 동반되는 HLEP 부분으로부터 FVIIIa의 완전한 분리로 이어질 것이다.

하지만, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 하나 이상의 단백질분해 절단 부위, 바람직하게는 Arg740의 트롬빈 절단 부위(예: 도 2i) 및/또는 Arg372의 트롬빈 절단 부위는 절단을 방지하기 위해 변이되거나 결실될 수 있고, 그 결과 활성화된 분자여도 증가된 기능 반감기와 같은 개선된 성질을 나타내는 삽입 단백질이 수득된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, B 도메인의 결실은 인접 산성 영역 a2 및 a3(도 2k 및 2l)까지 확장될 수 있다. a2와 관련하여, 이 영역은 부분적으로(도 2k) 또는 전체적으로 결실될 수 있다. 따라서, HLEP 부분은 FVIII 활성화 시에 해리되지 않고 A2 도메인에 그대로 부착되어 있을 수 있다. 이와 같이 활성화된 삽입 단백질은 증가된 기능 반감기를 보유할 것이다. 산성 영역 a3은 a3의 vWF 결합 성질이 영향을 받지 않는 한, 부분적으로 결실될 수 있다(도 2l).

본 발명의 한가지 양태에 따르면, FVIII 분자 내의 다른 잠재적 통합 부위에는 산성 영역 1(a1)의 C-말단과 A2 도메인의 N-말단 사이의 영역이 있다(도 2a-d). 도 2a는 추가 트롬빈 절단 부위가 알부민 C-말단에 도입된 통합 계획을 설명한다. 이러한 삽입 단백질에서, HLEP 부분은 생체내 내인성 FVIII 활성화 중에 절단될 것이며, 활성화된 FVIII 분자는 야생형 FVIII와 비슷한 기능 반감기를 보유할 것이다. 도 2b에 도시된 바와 같은 삽입 단백질의 경우에, HLEP C-말단에 추가 트롬빈 절단 부위는 결여되어 있다. 따라서, HLEP는 FVIII 활성화 시에 해리되지 않고 A2 도메인에 그대로 부착되어 있을 것이다. 이와 같이 활성화된 삽입 단백질은 증가된 기능 반감기를 보유할 것이다. 도 2c에 도시된 바와 같은 삽입 단백질의 경우에는 Arg372의 트롬빈 절단 부위가 결여되어 있다. 따라서, HLEP는 FVIII 활성화 시에 해리되지 않고 A1 도메인에 부착된 상태로 있을 것이다. 이와 같이 활성화된 삽입 단백질은 증가된 반감기를 보유할 것이다. 도 2d에 도시된 바와 같은 삽입 단백질은 공유 결합된 A1 및 A2 도메인을 보유하여, 활성화된 형태도 기능 반감기가 연장된 삽입 단백질을 생성할 것이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, FVIII 분자 내의 다른 잠재적인 통합 부위에는 A3 도메인의 C-말단과 C1 도메인의 N-말단 사이의 영역이 있다(도 2m). 이러한 삽입 단백질에서 HLEP 부분은 FVIII 경쇄의 통합 구성요소가 되어, 비활성화 및 활성화된 삽입 단백질 모두 증가된 기능 반감기를 보유할 것이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, FVIII 분자 내의 다른 잠재적 통합 부위로서, C1 도메인의 C-말단과 C2 도메인의 N-말단 사이의 영역이 있다(도 2n). 이러한 삽입 단백질에서 HLEP 부분은 FVIII 경쇄의 통합 구성요소가 되어, 비활성화 및 활성화된 삽입 단백질 모두 증가된 기능 반감기를 보유할 것이다.

본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 FVIII 단백질은 2개의 분리된 쇄로서 표현되기도 한다(이하 참조).

본 발명에 따른 변형된 응고 인자 VIII은 단일쇄 폴리펩타이드이거나 또는 단백질분해 프로세싱으로 인해, 비공유 결합을 통해 결합된 2개 또는 3개의 폴리펩타이드 쇄로 구성될 수도 있다.

본 발명의 다른 양태에서, PACE/Furin 절단 부위(Arg1648, 예컨대 도 1a) 또는 그 부근의 아미노산은 PACE/Furin에 의한 절단을 방지하기 위해 변이 또는 결실될 수 있다. 이것은 반감기가 개선된 단일쇄 인자 VIII/HLEP 융합 분자를 생성할 것으로 생각된다.

본 발명의 한가지 양태에서, 본 발명의 변형 FVIII은 통합된 HLEP가 없는 대응하는 FVIII 형태 및/또는 야생형 FVIII 형태에 비해 증가된 기능 반감기를 나타낸다. 이러한 기능 반감기는 예컨대 A형 혈우병의 동물 모델, 예컨대 FVIII 녹아웃 마우스에서 생체내 측정될 수 있으며, 이때 야생형 FVIII에 비해 장기 지속적인 지혈 효과가 예상될 것이다. 지혈 효과는 예컨대 꼬리를 자른 후 출혈 정지에 걸리는 시간을 측정하여 시험할 수 있다.

기능 반감기는 HLEP를 포함하지 않은 형태 및/또는 FVIII의 야생형에 비해 적어도 25%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 100% 증가된 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 변형 FVIII은 통합된 HLEP를 함유하지 않은 대응 FVIII 및/또는 야생형 FVIII에 비해 증가된 생체내 회수율을 나타낸다. 생체내 회수율은 정상 동물의 생체내에서 측정하거나 또는 A형 혈우병 동물 모델, 예컨대 FVIII 녹아웃 마우스에서 측정할 수 있고, 이때 본 발명의 변형 FVIII은 통합된 HLEP가 없는 대응 FVIII 형태 및/또는 야생형 FVIII에 비교했을 때 정맥내 투여 후 즉시(5 내지 10 분) 혈행 중의 항원 또는 활성 분석을 통해 증가된 백분율로 발견될 수 있을 것으로 예상된다.

생체내 회수율은 HLEP를 함유하지 않은 형태 및/또는 FVIII의 야생형과 비교했을 때 적어도 10%, 더욱 바람직하게는 적어도 20%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 40% 증가된 것이 바람직하다.

또 다른 본 발명의 양태에 따르면, 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부는 HLEP로서 사용된다. 바람직하게는, CH2 및 CH3 도메인과 IgG의 힌지 영역으로 구성된 Fc 영역, 더욱 바람직하게는 IgG1로 구성된 Fc 영역 또는 이의 단편이나 변이체가 사용되고, 변이체는 신생 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합을 증가시키는 돌연변이를 포함한다. 이러한 Fc 영역은 당해 기술분야에 기술된 단량체 또는 이량체 Fc 삽입체를 생성하는데 사용되는 것이 아니라, 그 N-말단에 FVIII 분자의 부분이 융합되고 C-말단에 다른 부분이 융합되도록 FVIII 분자에 삽입된다(도 2a 내지 2n). 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 미융합 Fc 영역은 다른 발현 벡터로부터 또는 심지어 동일한 발현 벡터로부터 공동발현되어 이황화 가교 결합을 통해 키메라 FVIII 분자 내의 Fc 영역과 Fc 이종이량체를 형성한다.

FVIII의 기능 반감기의 연장 외에도, 본 발명에 기술된 HLEP 부분은 반감기 연장과 동일한 목적으로 다른 멀티-도메인 단백질에 삽입하는데 사용될 수도 있다.

따라서 본 발명은 아미노산 서열 내에 HLEP 부분이 삽입된, 다른 변형 단백질, 바람직하게는 변형 응고 인자도 포함한다.

폰 빌레브란트 인자

폰 빌레브란트 인자(vWF)는 주요 역할이 일차 지혈인 다량체 혈장 당단백질이다. 성숙 단백질은 2050개의 아미노산으로 이루어지며, D'-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-CK의 순서로 배열된 상동성 도메인으로 구성되어 있다. 야생형 vWF의 아미노산 서열 및 cDNA 서열은 문헌[Collins et al. 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4398-4397]에 개시되어 있다. "폰 빌레브란트 인자"란 용어는 야생형 vWF의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 25%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 75%의 생물학적 활성을 보유하는 야생형 vWF의 임의의 돌연변이체 및 변이체를 포함한다. 야생형 vWF의 생물학적 활성은 리스토세틴 보조인자 활성(Federici AB et al. 2004. Haematologica 89: 77-85), 혈소판 당단백질 복합체 Ib-V-IX의 GP Ibα에 대한 vWF의 결합(Sucker et al. 2006. Clin Appl Thromb Hemost. 12: 305-310), 또는 콜라겐 결합 검정(Kallas & Talpsep. 2001. Annals of Hematology 80: 466-471)에 대한 방법을 사용하여 당업자에 의해 측정될 수 있다.

하나 이상의 HLEP가 vWF 분자에 삽입될 수 있다. HLEP 삽입은 vWF의 FVIII, 혈소판, 헤파린 또는 콜라겐 등에 대한 결합능을 방해하지 않는 것으로 선택한다. 적당한 삽입 부위에는 D3-A1 경계, D4-B1 경계, C2-CK 경계 뿐만 아니라 A2 도메인의 부분 또는 전체 제거 시에 HLEP 부분이 삽입될 수 있는 A2가 포함되며, 이에 국한되는 것은 아니다. vWF 기능적 활성은 위에서 설명한 바와 같이 평가할 수 있다.

프로트롬빈 인자

프로트롬빈 인자, 예컨대 인자 VII(FVII), 인자 IX(FIX), 인자 X(FX), 단백질 C(PC), 단백질 S, 단백질 Z 및 프로트롬빈(PT)은 단백질의 활성화 시에 절단되는 짧은 개재 서열에 의하여 트립신 프로테아제 도메인(단백질 S의 경우에는 2개의 라미닌-G 도메인)을 함유하는 중쇄에 의해 분리된, 경쇄 상의 EGF- 또는 크링글(Kringle) 도메인과 γ-카르복시화된 글루탐산 잔기를 함유하는 gla 도메인을 특징으로 하는 단백질 계열이다.

이 응고 인자의 아미노산 서열과 cDNA 서열은 문헌에 공지되어 있고, PubMed 단백질 서열 라이브러리(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db= Protein)에서 등록번호 NP_000122 (FVII), NP_000124 (FIX), NP_000495 (FX), NP_000303 (PC), NP_000304 (단백질 S), NP_003882 (단백질 Z) 및 NP_000497 (프로트롬빈)로 개시되어 있다.

또한, 프로트롬빈 인자는 본 발명에 기술된 바와 같이 HLEP 부분을 삽입함으로써 안정화될 수 있다. 프로트롬빈 인자는 인자 VII(FVII), 인자 IX(FIX), 인자 X(FX), 단백질 C(PC), 단백질 S, 단백질 Z 및 프로트롬빈(PT)을 포함한다. 위에서 설명한 바와 같이, 프로트롬빈 인자는 단백질의 활성화 시에 절단되는 짧은 개재 서열에 의하여 트립신 프로테아제 도메인(단백질 S의 경우에는 2개의 라미닌-G 도메인)을 함유하는 중쇄에 의해 분리된, 경쇄 상의 EGF- 또는 크링글(Kringle) 도메인과 γ-카르복시화된 글루탐산 잔기를 함유하는 gla 도메인을 특징으로 한다. 이 펩타이드 서열은 HLEP 부분의 바람직한 통합 부위이다. 바람직하게는, HLEP는 자연 활성화 서열을 유지시키거나, PACE/Furin 절단 부위(Nakayama 1997. Biochem. J. 327: 625-635), 합성 트롬빈 절단 부위(WO2004/005347에 기술된 것) 또는 다른 적당한 프로테아제 절단 부위와 같은 합성 절단 부위를 삽입하여 활성화 절단이 방해되지 않도록 삽입한다. HLEP 삽입 후에 각 프로트롬빈 인자의 활성 보존은 당업자에게 공지된 분석법을 사용하여 평가할 수 있다. FVII 활성은 셀리그손 등(Seligsohn et al. 1978. Blood 52:978-988)에 의해 기술된 방법을 기초로 한 시판되는 발색 시험 키트(Chromogenix Coaset FVII)를 사용하여 측정할 수 있고, FVIIa 활성은 모리세이 등(Morissey et al. 1993. Blood 81: 734-744)에 기술된 방법을 기초로 한 STACLOT® FVIIa-rTF 키트(Diagnostica Stago)를 사용하여 측정할 수 있다. FIX 활성은 차빈 앤드 와이드너(Chavin & Weidner, 1984. J. Biol. Chem. 259: 3387-3390)에 의해 기술된 바와 같은 응고 분석법으로 평가할 수 있다. FX 활성은 밴 위크(Van Wijk et al. 1981. Thromb. Res. 22: 681-686)에 의해 기술된 바와 같은 발색 분석법을 사용하여 측정할 수 있다. 단백질 C 활성은 콤브(Comb et al., 1984. Blood 63: 15-21)에 의해 기술된 방법에 기초하여 Instrumentation Laboratory(HaemosIL Protein C)에서 공급하는 발색 분석으로 평가할 수 있으며, 단백질 S 활성은 히에브(Heeb et al., 2006. J.Thromb.Haemost. 4:385-391)에 의해 기술된 방법으로 평가할 수 있다. 프로트롬빈에 대한 활성 분석은 문헌[Petrovan et al. 1999. Am. J. Clin. Pathol. 112: 705-711]에 기술되어 있고, 단백질 Z 활성 분석은 문헌[Tabatabai et al. 2001. Thromb. Haemost. 85: 655-660]에 공개되어 있다.

응고 인자 V

응고 인자 V(FV)는 인자 Xa에 의한 프로트롬빈의 활성화에 보조인자로서 관여하는 고분자량의 혈장 당단백질이다. 이는 인자 VIII 세룰로플라스민(Ceruloplasmin)과 상동성이고, 유사한 도메인 구조 A1-A2-B-A3-C1-C2를 보유한다. 야생형 FV의 아미노산 서열과 cDNA 서열은 예컨대 PubMed에 등록번호 NP_000121 및 NM_000130으로 각각 개시되어 있다.

위에서 인자 VIII에 대해 설명한 바와 같이, HLEP 부분은 반감기 연장을 위해 비슷한 도메인간 부위에서 FV 분자 내로 삽입될 수 있고, 바람직하게는 B 도메인 내로 또는 B 도메인의 일부 또는 전부를 대체하면서 삽입될 수 있다. FV 활성은 비크(Bick et al. 1973. Beitr. Pathol. 150: 311-315)에 의해 기술된 바와 같이 평가될 수 있다.

폴리뉴클레오타이드

본 발명은 추가로 본 명세서에 기술된 바와 같은 변형된 응고 인자, 바람직하게는 변형 FVIII 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. "폴리뉴클레오타이드(들)"란 용어는 비변형 RNA 또는 DNA 또는 변형 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 의미한다. 폴리뉴클레오타이드는 일본쇄 또는 이본쇄 DNA, 일본쇄 또는 이본쇄 RNA일 수 있다. 본 명세서에 사용된, "폴리뉴클레오타이드(들)"란 용어는 변형 염기 및/또는 독특한 염기, 예컨대 이노신을 포함하는 DNA 또는 RNA를 포함한다. DNA 또는 RNA에는 당업자에게 공지된 많은 유용한 목적을 제공하는 다양한 변형이 이루어질 수 있음은 이미 인식하고 있을 것이다. 본 명세서에 사용된 "폴리뉴클레오타이드(들)"란 용어는 이러한 화학적, 효소적 또는 대사적으로 변형된 폴리뉴클레오타이드 형태 뿐만 아니라 바이러스 및 세포, 예컨대 단순 세포 및 복합 세포 등의 특징적인 DNA 및 RNA의 화학적 형태를 포함한다.

당업자는 유전자 암호의 축퇴성으로 인해 주어진 폴리펩타이드가 여러 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화될 수 있음을 알고 있을 것이다. 이러한 "변이체"는 본 발명에 포함된다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 분리된 폴리뉴클레오타이드인 것이 바람직하다. "분리된" 폴리뉴클레오타이드란 용어는 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA와 같은, 이에 국한되지 않는 다른 핵산 서열이 거의 없는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 분리된 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 분리된 폴리뉴클레오타이드를 수득하기 위해, 당업자에게 공지된 통상의 핵산 정제방법을 사용할 수 있다. 또한, 이 용어는 재조합 폴리뉴클레오타이드 및 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오타이드도 포함한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 변형된 응고 인자를 함께 암호화하는 폴리뉴클레오타이드들의 그룹에 관한 것이다. 이 그룹에 속하는 제1 폴리뉴클레오타이드는 변형된 응고 인자의 N-말단 부분을 암호화할 수 있고, 제2 폴리뉴클레오타이드는 변형된 응고 인자의 C-말단 부분을 암호화할 수 있다.

또 다른 본 발명의 관점은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 플라스미드 또는 벡터이다. 이 플라스미드 또는 벡터는 발현 벡터인 것이 바람직하다. 특정 양태에서, 벡터는 사람 유전자 요법에 사용되는 전달 벡터이다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드들의 그룹을 포함하는 플라스미드들 또는 벡터들의 그룹에 관한 것이다. 제1 플라스미드 또는 벡터는 상기 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 제2 플라스미드 또는 벡터는 상기 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 그 예로서, 그리고 응고 인자 VIII과 관련하여, 시그날 펩타이드, A1 및 A2 도메인, B 도메인 서열 나머지 및 HLEP의 암호화 서열은 제1 발현 벡터에 클로닝될 수 있고, A3, C1 및 C2의 암호화 서열은 적당한 시그날 펩타이드 서열과 함께 제2 발현 벡터(도 2o)에 클로닝될 수 있다. 두 발현 벡터는 모두 적당한 숙주 세포에 공동형질감염될 수 있고, 그 결과 본 발명의 FVIII 분자의 경쇄 및 중쇄의 발현과 기능성 단백질의 형성으로 이어질 수 있다.

또는, FVIII 시그날 서열, A1 및 A2 도메인의 암호화 서열은 제1 발현 벡터에 클로닝되고 HLEP, FVIII A3, C1 및 C2의 암호화 서열은 적당한 시그날 서열과 함께 제2 발현 벡터에 클로닝된다(도 2p). 이 두 발현 벡터는 모두 적당한 숙주 세포에 공동형질감염되어, 본 발명의 FVIII 분자의 경쇄 및 중쇄의 발현과 기능성 단백질의 형성을 유도한다.

또는, 두 암호화 서열은 두 FVIII 쇄의 발현을 유도하기 위해 하나의 프로모터와 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 사용하거나 2개의 분리된 프로모터 서열을 사용하여 하나의 발현 벡터에 클로닝된다.

본 발명의 또 다른 관점은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드 또는 벡터를 포함하거나, 또는 전술한 바와 같은 폴리뉴클레오타이드들의 그룹 또는 플라스미드들 또는 벡터들의 그룹을 포함하는 숙주 세포이다.

본 발명의 숙주 세포는 본 발명의 일부인 변형된 응고 인자, 바람직하게는 변형 FVIII 분자를 생산하는 방법에 사용될 수 있다. 본 방법은

(a) 원하는 삽입 단백질이 발현되도록 하는 조건 하에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및

(b) 임의로, 상기 숙주 세포로부터 또는 배양 배지로부터 원하는 삽입 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명의 변형된 응고 인자는 순도 80% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상으로 정제하는 것이 바람직하고, 특히 오염성 거대분자, 특히 다른 단백질 및 핵산에 대해 순도가 99.9%를 초과하고 감염원 및 발열원이 없는 약제학적으로 순수한 상태인 것이 바람직하다. 본 발명의 분리 또는 정제된 변형된 응고 인자는 다른 비-관련 폴리펩타이드가 실질적으로 없는 것이 바람직하다.

본 발명의 다양한 산물은 약제로서 유용하다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 변형된 응고 인자, 바람직하게는 변형 FVIII 분자, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명의 플라스미드 또는 벡터를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 A형 혈우병 또는 B형 혈우병과 같은 혈액 응고 장애를 앓고 있는 개체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 상기 개체에게 본 명세서에 기술된 변형된 응고 인자, 바람직하게는 변형 FVIII 또는 FIX의 유효량을 투여함을 포함한다. 다른 양태에 따르면, 본 방법은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명의 플라스미드 또는 벡터를 유효량으로 개체에게 투여함을 포함한다. 또는, 본 방법은 본 명세서에 기술된 본 발명의 숙주 세포의 유효량을 상기 개체에게 투여함을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 전술한 바와 같은 변형 vWF 및 프로트롬빈 인자 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

제안된 돌연변이체의 발현

적당한 숙주 세포에서 재조합 돌연변이 단백질을 높은 수준으로 생산하기 위해서는 효과적인 전사 단위에 전술한 변형 cDNA의 어셈블리와 함께, 당업자에게 공지된 방법에 따라 다양한 발현계에서 증식될 수 있는 재조합 발현 벡터 중의 적당한 조절 요소를 필요로 한다. 효과적인 전사 조절 요소는 자연 숙주가 동물 세포인 바이러스에서 유래되거나, 또는 동물 세포의 염색체 DNA로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 시미안 바이러스 40, 아데노바이러스, BK 폴리오마 바이러스, 사람 사이토메갈로바이러스 또는 라우스 육종 바이러스의 장말단 반복체 유래의 프로모터-인핸서 조합, 또는 베타-액틴 또는 GRP78과 같은 동물 세포 중의 강한 구성적 전사 유전자를 포함하는 프로모터-인핸서 조합이 사용될 수 있다. cDNA로부터 전사된 mRNA를 안정된 높은 수준으로 달성하기 위해, 전사 단위는 이의 3'-인접 부분에 전사 종결-폴리아데닐화 서열을 암호화하는 DNA 영역을 함유해야 한다. 이 서열은 시미안 바이러스 40 조기 전사 영역, 토끼 베타-글로빈 유전자 또는 사람 조직 플라스미노겐 활성인자 유전자에서 유래되는 것이 바람직하다.

그 다음, cDNA는 인자 VIII 단백질의 발현을 위해, 적당한 숙주 세포의 게놈에 통합된다. 이러한 세포주는 바람직하게는 정확한 폴딩, 이황화 결합 형성, 아스파라긴 결합된 글리코실화 및 다른 해독후 변형을 보장하고, 뿐만 아니라 배양 배지로의 분비를 확실히 하기 위해 척추동물 기원의 동물 세포주이어야 한다. 다른 해독후 변형의 예에는 티로신 O-황산화 및 신생 폴리펩타이드 쇄의 단백질분해 프로세싱이 있다. 사용될 수 있는 세포주의 예는 원숭이 COS-세포, 마우스 L-세포, 마우스 C127-세포, 햄스터 BHK-21 세포, 사람 배아 신장 293 세포, 햄스터 CHO-세포이다.

대응하는 cDNA를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 여러 다른 방식으로 동물 세포주에 도입될 수 있다. 예를 들어, 재조합 발현 벡터는 다른 동물 바이러스를 기초로 한 벡터에서 생성될 수 있다. 그 예는 배큘로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 및 바람직하게는 소 유두종 바이러스를 기초로 한 벡터이다.

또한, 대응하는 DNA를 암호화하는 전사 단위는 게놈에 재조합 DNA가 통합된 특정 세포 클론의 분리를 용이하기 위해 상기 세포에 우성 선별 마커로서 작용할 수 있는 다른 재조합 유전자와 함께 동물 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 종류의 우성 선별 마커 유전자의 예는 제네티신(G418)에 대한 내성을 부여하는 Tn5 아미노 글리코사이드 포스포트랜스퍼라제, 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 및 퓨로마이신에 대한 내성을 부여하는 퓨로마이신 아세틸 트랜스퍼라제이다. 이러한 선별 마커를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 원하는 단백질의 cDNA를 암호화하는 벡터와 동일한 벡터에 존재할 수 있거나, 또는 숙주 세포의 게놈에 동시에 도입되어 통합되는 분리된 벡터에서 암호화되어, 종종 다른 전사 단위 사이에 강한 물리적 결합이 이루어지기도 한다.

원하는 단백질의 cDNA와 함께 사용될 수 있는 선별 마커 유전자의 다른 종류는 디하이드로폴레이트 리덕타제(dhfr)를 암호화하는 다양한 전사 단위를 기초로 한다. 이러한 종류의 유전자를 내인성 dhfr 활성이 결여된 세포, 주로 CHO 세포(DUKX-B11, DG-44)에 도입시킨 후, 이 세포들을 뉴클레오사이드가 결여된 배지에서 증식시킬 수 있을 것이다. 이러한 배지의 예에는 하이포잔틴, 티미딘 및 글리신이 없는 햄스(Ham's) F12가 있다. 이러한 dhfr-유전자는 인자 VIII cDNA 전사 단위와 함께, 동일한 벡터에 결합되거나 또는 다른 벡터에 결합되어 전술한 종류의 CHO 세포에 도입될 수 있고, 그 결과 재조합 단백질을 생산하는 dhfr 양성 세포주가 생성된다.

상기 세포주가 세포독성 dhfr-억제제 메토트렉세이트의 존재 하에 증식된다면, 메토트렉세이트 내성인 신규 세포주가 출현할 것이다. 이러한 세포주는 결합된 dhfr과 원하는 단백질의 전사 단위의 증폭된 수로 인해 증가된 속도로 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 메토트렉세이트의 농도(1-10000nM)를 증가시키면서 상기 세포주를 증식시키면, 원하는 단백질을 생산하는 신규 세포주가 매우 높은 비율로 수득될 수 있다.

원하는 단백질을 생산하는 상기 세포주는 현탁 배양 또는 다양한 고체 지지체 상에서 대량으로 증식될 수 있다. 상기 지지체의 예는 덱스트란 또는 콜라겐 매트릭스를 기초로 한 마이크로 캐리어, 또는 중공 파이버 형태 또는 다양한 세라믹 재료 형태의 고체 지지체이다. 세포 현탁 배양에서 증식되거나 마이크로 캐리어에서 증식될 때, 상기 세포주의 배양은 배쓰(bath) 배양 또는 장시간에 걸쳐 조건 배지가 연속 생산되는 관류 배양으로서 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면 상기 세포주는 원하는 재조합 돌연변이 단백질을 생산하기 위한 산업용 공정의 개발에 매우 적합하다.

정제 및 제형

전술한 종류의 분비 세포의 배지에서 축적되는 재조합 돌연변이 단백질은 다양한 생화학 및 크로마토그래피 방법, 예컨대 원하는 단백질과 세포 배양 배지 중의 다른 물질 간에 크기, 전하, 소수성, 용해성, 특이적인 친화성 등의 차이를 이용하는 방법 등으로 농축 및 정제할 수 있다.

이러한 정제의 한 예는 고체 지지체에 고정시킨, 예컨대 HLEP, 바람직하게는 사람 알부민 지향성 또는 각 응고 인자 지향성인 모노클로날 항체에 대한 재조합 돌연변이 단백질의 흡착이다. 지지체에 FVIII 돌연변이체를 흡착시키고, 세척 및 탈착 처리한 후, 상기 단백질은 전술한 성질을 기초로 한 다양한 크로마토그래피 기술을 통해 추가로 정제할 수 있다. 정제 단계의 순서는 예컨대 단계들의 능력 또는 선택성, 지지체의 안정성 또는 다른 관점에 따라 선택한다. 바람직한 정제 단계는 에컨대 이온 교환 크로마토그래피 단계, 면역친화성 크로마토그래피 단계, 친화성 크로마토그래피 단계, 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계, 염료 크로마토그래피 단계 및 크기 배제 크로마토그래피 단계이지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

바이러스 오염의 이론적 위험을 최소화하기 위해, 바이러스를 효과적으로 불활성화 또는 제거하는 추가 단계를 본 방법에 포함시킬 수 있다. 이러한 단계는 예컨대 액체 또는 고체 상태에서의 열 처리, 용매 및/또는 계면활성제 처리, 가시광선 또는 UV 스펙트럼에서의 광조사, 감마 조사 또는 나노여과이다.

본 발명의 변형 폴리뉴클레오타이드(예: DNA)는 또한 사람 유전자 요법에 사용되는 전달 벡터에 통합시킬 수도 있다.

본 명세서에 기술된 다양한 양태들은 서로 조합될 수 있다. 이하 본 발명은 실시예를 통해 더 상세하게 설명될 것이다. 이러한 본 발명의 특정 양태들에 대한 설명은 첨부되는 도면과 연관지어 기술될 것이다.

본 발명에 기술된 삽입 단백질은 치료용 약제학적 제제로 제형화될 수 있다. 정제된 단백질은 통상의 생리학적으로 적합한 수성 완충 용액에 용해되고, 여기에 선택적으로 약제학적 부형제가 첨가되어 약제학적 제제가 제공될 수 있다.

이러한 약제학적 담체 및 부형제 뿐만 아니라 적당한 약제학적 제형은 당업계에 공지되어 있다(예컨대, "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer et al., Taylor & Francis(2000) 또는 "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3rd edition, Kibbe et al., Pharmaceutical Press(2000)). 특히, 본 발명의 폴리펩타이드 변이체를 함유하는 약제학적 조성물은 동결건조 형태 또는 안정한 액체 형태로 제형화될 수 있다. 폴리펩타이드 변이체는 당업계에 공지된 다양한 절차를 통해 동결건조될 수 있다. 동결건조된 제형은 주사용 멸균수 또는 멸균 생리식염수와 같은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제를 첨가하여 사용하기 전에 재구성시킨다.

조성물의 제형은 임의의 약제학적으로 적당한 투여 수단에 의해 개체에게 전달된다. 다양한 전달 시스템이 공지되어 있고 조성물을 임의의 편리한 경로로 투여하는데 사용될 수 있다. 주로, 본 발명의 조성물은 전신 투여된다. 전신 투여용인 경우, 본 발명의 삽입 단백질은 통상의 방법에 따라 비경구(예: 정맥내, 피하, 근육내, 복강내, 뇌내, 폐내, 비강내 또는 경피) 전달 또는 장(예: 경구, 질 또는 직장) 전달용으로 제형화된다. 가장 우선적인 투여 경로는 정맥내 및 피하 투여이다. 이 제형들은 주입 또는 일시 주사에 의해 연속해서 투여될 수 있다. 일부 제형은 서방형 시스템을 포함한다.

본 발명의 삽입 단백질은 허용할 수 없는 부작용을 일으키는 용량에 이르지 않고 치료할 병태 또는 징후의 병도 또는 확산을 예방하거나 축소시키면서 원하는 효과를 생산하기에 충분한 용량을 의미하는 치료학적 유효량으로 환자에게 투여한다. 정확한 용량은 징후, 제형, 투여 방식 등과 같은 다양한 요인에 따라 달라지는 바, 각각의 징후마다 임상전 및 임상 시험을 통해 결정되어야 한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독 투여할 수도 있고 또는 다른 치료제와 병용 투여할 수도 있다. 이러한 제제는 동일한 약제의 일부로서 포함될 수 있다. 이러한 제제의 일 예는 폰 빌레브란트 인자이다.

실시예 1: FVIII B 도메인이 알부민으로 대체된 FVIII 분자를 위한 발현 벡터의 생성

먼저, 다중 클로닝 부위에 전장의 FVIII cDNA 서열을 함유하는 pIRESpuro3(BD Biosciences)을 기초로 한 발현 플라스미드(pF8-FL)를 사용하여 B 도메인 서열의 대부분을 결실시켜 이종 서열을 삽입하기 위한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 만들었다. 이를 위해, 올리고뉴클레오타이드 We1356과 We1357(서열번호 5 및 6)은 주형으로서 pF8-FL을 이용하는 PCR 반응에 사용하여 A2 도메인의 일부 및 B 도메인의 N-말단을 증폭시켰고(단편 1), 올리고뉴클레오타이드 We1358 및 We1359(서열번호 7 및 8)는 주형으로서 pF8-FL을 이용한 다른 PCR 반응에 사용하여 B 도메인의 C-말단, A3 도메인 및 C1 도메인의 일부를 증폭시켰다(단편 2). 두 단편을 겔 정제했다. 단편 1은 연속해서 제한 엔도뉴클레아제 PinAI 및 BamH1으로 분해하고, 단편 2는 제한 엔도뉴클레아제 PinAI 및 BspEI으로 분해했고, 두 단편을 정제하여 pF8-FL에 연결시켰으며, 여기서 A2 도메인의 부분, B 및 A3 도메인 및 C1 도메인의 일부를 포함하는 BamH1/BspEI 단편은 제거되었다. 그 결과 수득되는 플라스미드 pF8-DB는 이제 주요 B 도메인 결실을 포함했고, 남은 N- 및 C-말단 B 도메인 서열은 PinAI 부위에 의해 결합되었다. 이 부위에, 프라이머 We2502 및 We2503(서열번호 9 및 10)을 사용해 알부민 cDNA 상에서 PCR 증폭으로 생산하여 PinAI 분해 후 정제한 사람 알부민 단편을 삽입했다. PinAI 부위를 제거하기 위해, 수득한 플라스미드를 표준 프로토콜에 따른 부위-지시된 돌연변이유발법(QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit, Stratagene)으로 2회 처리했다. 이를 위해, 1차 시기에는 돌연변이유발 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 We2504 및 We2505(서열번호 11 및 12)를 사용했고, 2차 돌연변이유발에는 올리고뉴클레오타이드 We2506 및 We2507(서열번호 13 및 14)을 사용했다. 최종 발현 플라스미드는 pF8-1210으로 명명했다. 유리 시스테인 잔기(아미노산 1636, 서열번호 2 및 도 1)를 제거하기 위해서는 올리고뉴클레오타이드 We2508 및 We2509(서열번호 15 및 16)를 이용한 부위-지시된 돌연변이유발법을 적용하여 플라스미드 pF8-1211을 수득했다.

플라스미드 pF8-1211 내의 위치 740에 존재하는 아르기닌을 결실시키기 위해서도 부위-지시된 돌연변이유발법을 표준 프로토콜(QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit, Stratagene)에 따라 적용했다. 이를 위해, 올리고뉴클레오타이드 We2768 및 We2769(서열번호 17 및 18)를 사용했다. 수득되는 발현 플라스미드는 pF8-1413으로 명명했다. 야생형 FVIII 대조군으로서, B 도메인이 아미노산 서열 RRGR로 대체된 FVIII 분자를 사용했고, 암호화 플라스미드는 pF8-457로 명명했다.

전술한 프로토콜과 플라스미드를 사용하고 당업자에게 공지된(또한 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM et al.(eds.) including supplement 80, October 2007, John Wiley & Sons, Inc.; http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/에 기술된) 분자생물학 기술을 적용하여, 도 1b-e에 예시적으로 나타낸 바와 같은 링커 서열을 보유하고 도 2에 도시된 위치에 HLEP 분자가 삽입된 다른 작제물이 당업자에 의해 제조될 수 있을 것이다.

실시예 2: FVIII B 도메인이 면역글로불린 불변 영역으로 대체된 FVIII 분자를 위한 발현 벡터의 생성

FVIII 분자에서 B 도메인의 대부분을 대체하는 IgG Fc 도메인 삽입은 전술한 문헌 및 프로토콜과 유사하게 수행했다. 그 결과 수득되는 플라스미드는 pF8-1518이라 명명하고 이 플라스미드로부터 해독된 성숙 단백질은 서열번호 19에 제시했다.

신생 Fc 수용체에 의한 IgG의 재순환 작업으로서 이량체 pF8-1518인 Fc를 사람 면역글로불린 G 중쇄 영역(p1335, 서열번호 20)을 암호화하는 플라스미드와 함께 사용하여 HEK-293 세포를 공동형질감염시켰다. 플라스미드 pF8-1518 및 p1335의 공동발현은 기능성 FVIII 분자의 발현으로 이어졌다(표 1).

다른 작제물 세트로서, FVIII 중쇄와 경쇄를 각각 발현시켰다. pF8-1518이 돌연변이되도록 하기 위해 종결 코돈을 IgG 중쇄 서열의 3' 말단 끝에 도입시켰다. 이러한 작제물(pF8-1515)의 발현으로, B 도메인의 몇몇 아미노산과 그 다음 IgG 중쇄를 보유하는 FVIII 중쇄(A1 및 A2 도메인)가 수득되었다 (서열번호 21). FVIII 경쇄 작제물 역시, A1 및 A2 도메인 암호화 서열을 시그날 펩타이드로 대체한 플라스미드 pF8-1518을 기초로 했다. 이러한 작제물(pF8-1517)의 발현은 N-말단에 IgG 중쇄가 부착된 FVIII 경쇄로 이어졌다 (서열번호 22). 플라스미드 pF8-1515 및 pF8-1517의 공동발현은 기능성 FVIII 분자의 발현으로 이어졌다(표 1).

실시예 3: FVIII 돌연변이체의 형질감염 및 발현

발현 플라스미드는 이.콜라이 TOP10(Invitrogen)에서 증폭시켜 표준 프로토콜(Qiagen)에 따라 정제했다. HEK-293 세포는 Lipofectamine 2000 시약(Invitrogen)을 사용하여 형질감염시키고, 퓨로마이신 4 ㎍/ml와 임의로 0.5 IU/ml vWF의 존재 하에 무혈청 배지(Invitrogen 293 Express)에서 배양했다. 형질감염된 세포 집단은 T 플라스크를 거쳐 회전병 또는 소규모 발효조로 확장시키고, 이로부터 상청액을 모아 정제했다.

표 1은 도 1과 2에 개략되고 실시예 1과 2에 설명된 다수의 작제물의 발현 데이터를 열거한 것이다. 다른 표시가 없는 한, 사용된 HLEP는 알부민이다.

실시예 4: 인자 VIII 돌연변이체의 정제

FVIII 활성을 거의 전부 결합시키기 위해 키메라 인자 VIII 분자를 함유하는 발현 상청액에 충분한 양의 면역친화성 수지를 첨가했다. 면역친화성 수지는 지지체로서 사용된 세파크릴(Sephacryl) S1000 수지에 적당한 항-FVIII MAb를 공유 결합시켜 제조했다. 수지를 세척한 후, 크로마토그래피 컬럼에 충전한 뒤, 다시 세척했다. 용출은 250mM CaCl₂ 및 50% 에틸렌 글리콜을 함유하는 완충액을 사용하여 수행했다.

FVIII:C 활성을 함유하는 면역친화성 크로마토그래피(IAC) 분획을 모아서, 제형 완충액(부형제: 염화나트륨, 슈크로스, 히스티딘, 염화칼슘 및 Tween 80)에 대해 투석하고 농축했다. 샘플은 동결시켜 보관하거나 또는 적당한 동결건조 사이클로 동결건조했다. 표 2는 주 정제 단계로서 IAC와 FVIII 돌연변이체(HEK-293 유래의 pF8-1211)를 이용한 정제 실험의 결과이다.

또는, FVIII 함유 세포 배양물 상청액은 1차 이온교환 크로마토그래피로 농축/정제한 다음, 면역친화성 크로마토그래피(IAC)를 이용하여 추가 정제했다. 이러한 경우에, 이온교환크로마토그래피의 용출액은 위에서 언급한 수지를 이용한 IAC 컬럼에 로딩된다.

실시예 5: 키메릭 인자 FVIII 활성 및 항원의 분석

시험관내에서 FVIII:C의 활성을 측정하기 위해, 응고 분석(예: Pathromtin SL 시약 및 FVIII 결핍 혈장, Dade Behring(독일) 공급) 또는 발색 분석(예: 헤모크롬(Haemochrom)에서 공급된 Coamatic FVIII:C 분석)을 사용했다. 이 분석들은 제조업체의 지시에 따라 수행했다.

FVIII 항원(FVIII:Ag)은 당업자에게 성능이 알려져 있는 ELISA로 측정했다. 간략히 설명하면, 마이크로플레이트에 포획 항체(양 항-사람 FVIII IgG, Cedarlane CL20035K-C, 완충액 A[Sigma C3041]에 1:200 희석한 것)를 웰당 100㎕ 주입하여 주위 온도에서 2시간 동안 항온처리했다. 플레이트를 완충액 B(Sigma P3563)으로 3회 세척한 후, 샘플 희석 완충액(Cedarlane) 중의 시험 샘플의 연속 희석물뿐만 아니라 샘플 희석 완충액(웰당 용적: 100㎕) 중의 FVIII 제조물(ZLB Behring: 200-2mU/ml)의 연속 희석물을 주위 온도에서 2시간 동안 항온처리했다. 완충액 B로 3회 세척 단계를 수행한 후, 검출 항체(양의 항-사람 FVIII IgG, Cedarland CL20035K-D, 퍼옥시다제 표지됨)를 완충액 B에 1:2 비율로 희석한 것 100㎕를 각 웰에 첨가하고 주위 온도에서 추가 시간 동안 항온처리했다. 완충액 B로 3회 세척 단계를 수행한 후, 기질 용액(1:10(v/v) TMB OUVF : TMB 완충액 OUVG, Dade Behring) 100㎕를 웰당 첨가하여 암실에서 주위 온도 하에 30분 동안 항온처리했다. 종결 용액(Dade Behring, OSFA) 100㎕를 첨가하여, 450nm 파장에서 적당한 마이크로플레이트 판독기로 판독할 샘플을 준비했다. 그 다음, 시험 샘플의 농도는 참조물질로서 FVIII 제조물로 작성한 표준 곡선을 사용하여 계산했다.

실시예 6: 래트에서 인자 VIII 돌연변이체의 약동학

FVIII 돌연변이체는 마취된 CD/루이스 래트(물질 당 래트 6마리)에게 100 IU/kg체중의 용량으로 정맥내 투여했다. 시험 물질을 투여한지 5분 후부터 시작해서 적당한 간격을 두고 혈액 샘플을 채취했다. 이어서, FVIII 항원 함량은 사람 인자 VIII에 특이적인 ELISA 분석 또는 알부민과 FVIII에 각각 특이적인 혼합 ELISA로 정량분석했다 (상기 참조). 처리 그룹의 평균값을 사용하여 5분 후 생체내 회수율을 계산했다. 각 단백질의 반감기는 베타상의 제거 시점을 사용하여 식 t_½=ln2/k에 따라 계산했고, 여기서 k는 회귀선의 기울기이다. 결과는 도 3에 도시했다.

키메라 FVIII-HA 작제물에서 2 내지 24시간 사이에 계산된 최종 반감기는 1413의 경우에는 4.97시간이고 1211의 경우에는 6.86시간이었으며, 야생형 FVIII에서 2시간과 8시간 사이에 계산된 최종 반감기는 2.17시간이었다. 따라서, 최종 반감기의 분명한 증가는 키메라 FVIII-HA 분자에서 FVIII 반감기를 2 내지 3배 연장시키는 것으로 확인된다.

키메라 FVIII-HA 작제물과 야생형 FVIII의 생체이용률은 본 발명의 FVIII-HA 단백질의 우수한 생체이용률을 보여주는 표 3에 제시했다.

실시예 7: 래트에서 인자 VIII 돌연변이체의 기능 반감기

FVIII 돌연변이체 pF8-1211(HEK-293 세포에서 발현되고 IAC로 정제함) 뿐만 아니라 대조 제제(야생형 FVIII 헬릭세이트 NexGen)를 마취된 CD/루이스 래트(물질 당 래트 6마리)에게 100 IU/kg체중의 용량으로 정맥내 투여했다. 시험 물질을 투여한지 5분 후부터 시작해서 적당한 간격을 두고 혈액 샘플을 채취했다. 이어서, FVIII 항원 함량은 사람 인자 VIII에 특이적인 ELISA 분석을 이용하여 대조군에서 정량분석했다(실시예 4 참조). 래트 혈장에 존재하는 FVIII 돌연변이체의 FVIII:C 활성을 측정하기 위해 FVIII 돌연변이체 활성을 특이적으로 측정하는 분석법을 수립했다. 원칙적으로, FVIII 돌연변이체는 사람 알부민에 대해 지향성인 항체를 통해 래트 혈장 샘플로부터 미세역가 플레이트에 결합하게 되고, 그 다음 발색 FVIII:C 분석(Coatest VIII:C/4)으로 FVIII 활성을 측정했다. 간략히 설명하면, 96웰 미세역가 플레이트는 주위 온도에서 밤새 포획 항체(탄산염/중탄산염 완충액에 5㎍/ml로 희석된 마우스의 항-사람 알부민 Mab 3E8)로 코팅했다. 플레이트를 세척 완충액(PBST = 0.05% Tween 20을 함유하는 인산염 완충 식염수, Sigma P3563)으로 세척한 후, 플레이트를 PBS(인산염 완충 식염수) 중의 탈지유로 차단시키고, 다시 세척 완충액과 그 다음 희석 완충액(50mM Tris x HCl, 100mM NaCl, 0.05% Tween 20 pH 7.2)으로 세척했다. 샘플은 웰당 40㎕ 용적으로 적용하고 37℃에서 1시간 동안 항온처리했다. 세척은 300mM CaCl₂를 함유하는 희석 완충액과 그 다음 희석 완충액을 사용하여 수행했다. FVIII:C 활성 측정은 Coatest VIII:C/4 시약을 사용하여 수행했다. 희석 완충액 10㎕와 Coatest FIXa 및 FX 시약 50㎕를 웰에 적용하고 37℃에서 5분 동안 항온처리했다. 그 다음, CaCl₂ 용액 25㎕를 첨가하고, 다시 37℃에서 10분 동안 항온처리했다. 기질 용액 50㎕를 첨가하고, 다시 37℃에서 10분 동안 항온처리했다. 이 단계 이후 종결 용액(20% 아세트산) 25㎕를 첨가했다. 미세역가 플레이트 판독기로 405nm에서 흡광도를 판독했다. 샘플의 FVIII:C 농도는 참조물질로서 FVIII 돌연변이체 pF8-1211을 사용하여 작성한 표준 곡선을 이용하여 계산했다.

처리 그룹의 FVIII:C 및 FVIII 항원 각각의 결과는 해당 단백질의 최종 반감기를 계산하는데 사용했다. 키메라 FVIII-HSA 작제물 pF8-1211에서 2 내지 24시간 사이에 계산된 최종 기능 반감기는 4.44시간이었고, 야생형 FVIII에서 2 내지 8시간 사이에 계산된 FVIII 항원의 최종 반감기는 2.75시간이었다. 따라서, FVIII:C 활성의 기능 반감기의 분명한 증가가 키메라 FVIII-HSA 분자에서 관찰되었다(야생형 FVIII의 최종 FVIII:Ag 반감기에 비해 61% 증가됨).

실시예 8: FVIII 알부민 삽입 단백질의 시험관내 안정성

표 4는 무혈청 세포 배양물에서 FVIII 알부민 삽입 단백질의 발현 연구를 수행한 결과를 정리한 것이다. HEK-293 세포는 pF8-1439(FVIII 알부민 삽입) 및 pF8-457(FVIII 야생형)로 각각 3반복으로 형질감염시키고, 동일한 세포수로 T80 플라스크에 파종하고 안정화 vWF의 부재 하에 배양했다. 그 다음, 배양 상청액을 96, 120 및 144 시간 후 수거하고, FVIII 활성과 항원 함량에 대해 시험했다.

상기 결과는 세포 배양물에서 FVIII 분자의 통합 부분으로서 존재할 때의 알부민의 안정화 효과를 입증한다. 생산성은 삽입 단백질의 경우에 반드시 더 높은 것은 아니지만 FVIII 단백질의 비활성(활성/항원 비로 나타냄)은 알부민이 FVIII 분자의 통합 부분일 때 야생형 FVIII에 비해 유의적으로 더 높았다(도 3).

<110> CSL Behring GmbH <120> Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life <130> 2006_M007_A122 <150> EP 06026747.3 <151> 2006-12-22 <150> US 60/879,334 <151> 2007-01-09 <160> 49 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 7056 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 1 atgcaaatag agctctccac ctgcttcttt ctgtgccttt tgcgattctg ctttagtgcc 60 accagaagat actacctggg tgcagtggaa ctgtcatggg actatatgca aagtgatctc 120 ggtgagctgc ctgtggacgc aagatttcct cctagagtgc caaaatcttt tccattcaac 180 acctcagtcg tgtacaaaaa gactctgttt gtagaattca cggatcacct tttcaacatc 240 gctaagccaa ggccaccctg gatgggtctg ctaggtccta ccatccaggc tgaggtttat 300 gatacagtgg tcattacact taagaacatg gcttcccatc ctgtcagtct tcatgctgtt 360 ggtgtatcct actggaaagc ttctgaggga gctgaatatg atgatcagac cagtcaaagg 420 gagaaagaag atgataaagt cttccctggt ggaagccata catatgtctg gcaggtcctg 480 aaagagaatg gtccaatggc ctctgaccca ctgtgcctta cctactcata tctttctcat 540 gtggacctgg taaaagactt gaattcaggc ctcattggag ccctactagt atgtagagaa 600 gggagtctgg ccaaggaaaa 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ccatataaca tctaccctca cggaatcact 1500 gatgtccgtc ctttgtattc aaggagatta ccaaaaggtg taaaacattt gaaggatttt 1560 ccaattctgc caggagaaat attcaaatat aaatggacag tgactgtaga agatgggcca 1620 actaaatcag atcctcggtg cctgacccgc tattactcta gtttcgttaa tatggagaga 1680 gatctagctt caggactcat tggccctctc ctcatctgct acaaagaatc tgtagatcaa 1740 agaggaaacc agataatgtc agacaagagg aatgtcatcc tgttttctgt atttgatgag 1800 aaccgaagct ggtacctcac agagaatata caacgctttc tccccaatcc agctggagtg 1860 cagcttgagg atccagagtt ccaagcctcc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtt 1920 tttgatagtt tgcagttgtc agtttgtttg catgaggtgg catactggta cattctaagc 1980 attggagcac agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatatacctt caaacacaaa 2040 atggtctatg aagacacact caccctattc ccattctcag gagaaactgt cttcatgtcg 2100 atggaaaacc caggtctatg gattctgggg tgccacaact cagactttcg gaacagaggc 2160 atgaccgcct tactgaaggt ttctagttgt gacaagaaca ctggtgatta ttacgaggac 2220 agttatgaag atatttcagc atacttgctg agtaaaaaca atgccattga accaagaagc 2280 ttctcccaga attcaagaca ccctagcact 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tttaagaaaa aggataccat tttgtccctg 4860 aacgcttgtg aaagcaatca tgcaatagca gcaataaatg agggacaaaa taagcccgaa 4920 atagaagtca cctgggcaaa gcaaggtagg actgaaaggc tgtgctctca aaacccacca 4980 gtcttgaaac gccatcaacg ggaaataact cgtactactc ttcagtcaga tcaagaggaa 5040 attgactatg atgataccat atcagttgaa atgaagaagg aagattttga catttatgat 5100 gaggatgaaa atcagagccc ccgcagcttt caaaagaaaa cacgacacta ttttattgct 5160 gcagtggaga ggctctggga ttatgggatg agtagctccc cacatgttct aagaaacagg 5220 gctcagagtg gcagtgtccc tcagttcaag aaagttgttt tccaggaatt tactgatggc 5280 tcctttactc agcccttata ccgtggagaa ctaaatgaac atttgggact cctggggcca 5340 tatataagag cagaagttga agataatatc atggtaactt tcagaaatca ggcctctcgt 5400 ccctattcct tctattctag ccttatttct tatgaggaag atcagaggca aggagcagaa 5460 cctagaaaaa actttgtcaa gcctaatgaa accaaaactt acttttggaa agtgcaacat 5520 catatggcac ccactaaaga tgagtttgac tgcaaagcct gggcttattt ctctgatgtt 5580 gacctggaaa aagatgtgca ctcaggcctg attggacccc ttctggtctg ccacactaac 5640 acactgaacc ctgctcatgg gagacaagtg 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<210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 13 ctgccttagg cttaggtagg actgaaagg 29 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 14 cctttcagtc ctacctaagc ctaaggcag 29 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 15 ggactgaaag gctgtcctct caaaacccac cag 33 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 16 ctggtgggtt ttgagaggac agcctttcag tcc 33 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 17 caatgccatt gaaccaagct tctcccagaa ttcaag 36 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 18 cttgaattct gggagaagct tggttcaatg gcattg 36 <210> 19 <211> 1671 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> FVIII with human albumin replacing part of the B-domain <400> 19 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15 Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro 20 25 30 Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr 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acid sequence of a human immunoglobulin G heavy chain region (240 amino acids: 1-19 human IgG signal peptide, 20-35 human IgG hinge region and 36-240 human IgG heavy chain) <400> 20 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 20 25 30 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 35 40 45 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 50 55 60 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 65 70 75 80 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 85 90 95 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 100 105 110 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 115 120 125 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 130 135 140 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Val Thr Lys Asn Gln 145 150 155 160 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 165 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Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser 565 570 575 Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His 580 585 590 Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr 595 600 605 Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala 610 615 620 Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr 625 630 635 640 Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile 645 650 655 Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln 660 665 670 Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile 675 680 685 Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser 690 695 700 Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile 705 710 715 720 Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu 725 730 735 His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met 740 745 750 Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys 755 760 765 Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met 770 775 780 Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg 785 790 795 800 Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln 805 810 815 Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly 820 825 830 Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser 835 840 845 Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys 850 855 860 Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn 865 870 875 880 Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln 885 890 895 Ser Trp Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu 900 905 910 Ala Gln Asp Leu Tyr 915 <210> 23 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 23 Asn Asn Ala Ile Glu Pro Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser 1 5 10 15 Thr Arg Gln Lys Gln Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg 20 25 30 <210> 24 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 24 Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro 1 5 10 15 Ser Thr Arg Gln Lys Gln Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg 20 25 30 <210> 25 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 25 Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro 1 5 10 15 Ser Thr Arg Gln Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg 20 25 30 <210> 26 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 26 Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro 1 5 10 15 Ser Thr Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg 20 25 <210> 27 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 27 Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Asp 1 5 10 15 Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg 20 25 <210> 28 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 28 Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Asp Ala His 1 5 10 15 Lys Ser Glu Val Ala His Arg 20 <210> 29 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 29 Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Asp Ala His Lys Ser Glu 1 5 10 15 Val Ala His Arg 20 <210> 30 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 30 Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg 20 25 30 <210> 31 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 31 Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr 1 5 10 15 Trp Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg 20 25 <210> 32 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 32 Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr 1 5 10 15 Phe Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg 20 25 <210> 33 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 33 Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ala Val Gly Gly Asp Ala His Lys Ser 1 5 10 15 Glu Val Ala His Arg 20 <210> 34 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 34 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly Arg Thr Glu Arg Leu 1 5 10 15 Cys Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr 20 25 30 Arg Thr Thr Leu 35 <210> 35 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 35 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly Arg Thr Glu Arg Leu 1 5 10 15 Ser Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr 20 25 30 Arg Thr Thr Leu 35 <210> 36 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 36 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Thr Glu Arg Leu Cys Ser 1 5 10 15 Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr 20 25 30 Thr Leu <210> 37 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 37 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Thr Glu Arg Leu Ser Ser 1 5 10 15 Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr 20 25 30 Thr Leu <210> 38 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 38 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Leu Cys Ser Gln Asn Pro 1 5 10 15 Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu 20 25 30 <210> 39 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 39 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Leu Ser Ser Gln Asn Pro 1 5 10 15 Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu 20 25 30 <210> 40 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 40 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Ser Gln Asn Pro Pro Val 1 5 10 15 Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu 20 25 <210> 41 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 41 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Val Leu Lys Arg His Gln 1 5 10 15 Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu 20 <210> 42 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 42 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Arg His Gln Arg Glu Ile 1 5 10 15 Thr Arg Thr Thr Leu 20 <210> 43 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 43 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly Arg Thr Glu Arg Leu 1 5 10 15 Cys Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Arg Arg Glu Ile Thr 20 25 30 Arg Thr Thr Leu 35 <210> 44 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 44 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Ser Gln Asn Pro Pro Val 1 5 10 15 Leu Lys Arg His Arg Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu 20 25 <210> 45 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 45 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Arg His Arg Arg Glu Ile 1 5 10 15 Thr Arg Thr Thr Leu 20 <210> 46 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 46 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Arg His Arg Arg Glu Ile Thr 20 25 30 Arg Thr Thr Leu 35 <210> 47 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 47 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Arg His Arg Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr 20 25 30 Leu <210> 48 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 48 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 15 Arg His Arg Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu 20 25 <210> 49 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Linker <400> 49 Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 15 Arg His Arg Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu 20 25

Claims (32)

1. 응고 인자의 1차 해독 폴리펩타이드의 N-말단 아미노산과 C-말단 아미노산 사이의 내부 영역에 반감기 향상 폴리펩타이드(HLEP)가 삽입된, 변형된 응고 인자.
2. 응고 인자의 1차 해독 폴리펩타이드의 N-말단 아미노산과 C-말단 아미노산 사이의 내부 영역에 반감기 향상 폴리펩타이드(HLEP)가 삽입된 변형된 응고 인자로서, 상기 변형된 응고 인자는 상기 삽입이 결여된 응고 인자의 기능 반감기에 비해 연장된 기능 반감기를 보유하는 것을 특징으로 하는, 변형된 응고 인자.
3. 응고 인자의 1차 해독 폴리펩타이드의 N-말단 아미노산과 C-말단 아미노산 사이의 내부 영역에 반감기 향상 폴리펩타이드(HLEP)가 삽입된 변형된 응고 인자로서, 상기 변형된 응고 인자는 상기 삽입이 결여된 응고 인자 항원의 반감기에 비해 연장된 응고 인자 항원의 반감기를 보유하는 것을 특징으로 하는, 변형된 응고 인자.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 기능 반감기가 HLEP의 삽입이 결여된 응고 인자의 기능 반감기에 비해 25% 이상 증가된, 변형된 응고 인자.
5. 제3항에 있어서, 응고 인자 항원의 반감기가 HLEP의 삽입이 결여된 응고 인자의 기능 반감기에 비해 25% 이상 증가된, 변형된 응고 인자.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 인자가 단백질분해 절단에 의한 생체내 내인성 활성화 동안에 HLEP로부터 분리되는, 변형된 응고 인자.
7. 응고 인자의 1차 해독 폴리펩타이드의 N-말단 아미노산과 C-말단 아미노산 사이의 내부 영역에 반감기 향상 폴리펩타이드(HLEP)가 삽입된 변형된 응고 인자로서, 상기 변형된 응고 인자의 생체내 회수율이 상기 삽입이 결여된 응고 인자의 생체내 회수율에 비해 향상된 것을 특징으로 하는, 변형된 응고 인자.
8. 제7항에 있어서, 응고 인자의 생체내 회수율이 HLEP의 삽입이 결여된 응고 인자의 생체내 회수율에 비해 10% 이상 증가된, 변형된 응고 인자.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 무혈청 배양 배지 및/또는 동물 단백질 미함유 배양 배지에서의 안정성이, 상기 삽입이 결여된 응고 인자에 비해 증가된, 변형된 응고 인자.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 인자가 FVIII, 폰 빌레브란트 인자, FV 및 프로트롬빈 인자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 변형된 응고 인자.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 프로트롬빈 인자가 인자 VII, 인자 IX, 인자 X, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z 및 프로트롬빈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 변형된 응고 인자.
12. 제10항에 있어서, 응고 인자가 FVIII인 변형된 응고 인자.
13. 제12항에 있어서, HLEP의 삽입이 FVIII의 B-도메인 내에서 이루어진, 변형된 응고 인자.
14. 제13항에 있어서, HLEP의 삽입이 FVIII의 B-도메인 내에서 이루어지고 상기 B-도메인의 75% 이상이 결실되거나 링커 펩타이드로 대체된, 변형된 응고 인자.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입이 결여된 응고 인자의 생물학적 활성의 10% 이상을 보유하는, 변형된 응고 인자.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 반감기 향상 폴리펩타이드가, 알부민 계열 단백질 및 면역글로불린의 불변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 변형된 응고 인자.
17. 제16항에 있어서, 반감기 향상 폴리펩타이드가 알부민 또는 이의 단편인 변형된 응고 인자.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 인자가 FVIII이고, B-도메인의 일부 또는 전체가 사람 알부민으로 대체된, 변형된 응고 인자.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 변형된 응고 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들의 그룹.
20. 제19항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드 또는 벡터, 또는 제19항에 따른 폴리뉴클레오타이드들의 그룹을 포함하는 플라스미드들 또는 벡터들의 그룹.
21. 제20항에 있어서, 플라스미드(들) 또는 벡터(들)가 발현 벡터(들)인, 플라스미드 또는 벡터, 또는 플라스미드들 또는 벡터들의 그룹.
22. 제21항에 있어서, 사람 유전자 요법에 사용하기 위한 전달 벡터(들)인, 벡터 또는 벡터들의 그룹.
23. 제19항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들의 그룹, 또는 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 플라스미드 또는 벡터, 또는 플라스미드들 또는 벡터들의 그룹을 포함하는 숙주 세포.
24. 변형된 응고 인자의 생산 방법으로서,

    (a) 제23항에 따른 숙주 세포를 상기 변형된 응고 인자가 발현되도록 하는 조건 하에서 배양하고;

    (b) 임의로 상기 변형된 응고 인자를 상기 숙주 세포 또는 배양 배지로부터 회수함

    을 포함하는, 변형된 응고 인자의 생산 방법.
25. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 변형된 응고 인자, 제19항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들의 그룹, 또는 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 플라스미드 또는 벡터, 또는 플라스미드들 또는 벡터들의 그룹을 포함하는 약제학적 조성물.
26. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 변형된 응고 인자, 제19항에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들의 그룹, 또는 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 플라스미드 또는 벡터, 또는 플라스미드들 또는 벡터들의 그룹, 또는 제23항에 따른 숙주 세포의, 혈액 응고 장애의 치료 또는 예방용 약제의 제조를 위한 용도.
27. 제26항에 있어서, 혈액 응고 장애가 A형 혈우병인 용도.
28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 치료가 사람 유전자 요법을 포함하는 용도.
29. 증가된 기능 반감기를 보유하는 변형된 응고 인자의 제조 방법으로서, 상기 응고 인자의 아미노산 서열의 내부 영역에 반감기-향상 폴리펩타이드를 삽입함을 포함하는 방법.
30. 응고 인자의 기능 반감기를 증가시키는 방법으로서, 상기 응고 인자의 아미노산 서열의 내부 영역에 반감기-향상 폴리펩타이드를 삽입함을 포함하는 방법.
31. 혈청- 및 동물 단백질-미함유 배양 배지에서의 응고 인자의 안정성을 증가시키는 방법으로서, 상기 응고 인자의 아미노산 서열의 내부 영역에 반감기-향상 폴리펩타이드를 삽입함을 포함하는 방법.
32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, FVIII의 B-도메인 또는 이의 일부를 반감기-향상 폴리펩타이드로 대체함을 포함하는 방법.