JP2010512768A - インビボで長い半減期を有する修飾された凝固因子 - Google Patents

Abstract

本発明は、凝固因子、好ましくは第ＶＩＩＩ凝固因子およびそれらの誘導体をコードする修飾された核酸配列、このような核酸配列を含む組換え発現ベクター、このような組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞、上記核酸配列によってコードされた組換えポリペプチドおよび誘導体に関し、これら組換えポリペプチドおよび誘導体は、生物活性、および未修飾の野生型タンパク質と比較してインビボで長い半減期をまさに有する。本発明はまた、改善されたインビトロでの安定性をもたらす対応する配列にも関する。本発明はさらに、このような組換えタンパク質およびそれらの誘導体の製造方法に関し、これらも包含される。本発明はまた、このような修飾された核酸配列を含む、ヒトの遺伝子治療に使用するためのトランスファーベクターにも関する。

Description

本発明は、凝固因子、好ましくは第ＶＩＩＩ凝固因子およびそれらの誘導体をコードする修飾された核酸配列、このような核酸配列を含む組換え発現ベクター、このような組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞、上記核酸配列によってコードされた組換えポリペプチドおよび誘導体に関し、これら組換えポリペプチドおよび誘導体は、未修飾の野生型タンパク質と比較して、インビボでの長い半減期、および／または改善されたインビボでの回収と一緒に生物活性をまさに有する。本発明はまた、改善されたインビトロでの安定性をもたらすそれに対応する配列にも関する。本発明はさらに、このような組換えタンパク質およびそれらの誘導体の製造方法に関する。本発明はまた、このような修飾された核酸配列を含む、ヒトの遺伝子治療に使用するためのトランスファーベクターにも関する。

血液凝固因子の欠陥によって引き起こされる様々な出血障害がある。最も一般的な障害は血友病ＡおよびＢであり、これは、それぞれ血液凝固第ＶＩＩＩ因子およびＩＸの欠損によって生じる。その他の既知の出血障害は、フォン−ビルブランド病である。

典型的な血友病または血友病Ａは、遺伝性出血性疾患である。これは、血液凝固第ＶＩＩＩ因子のＸ染色体連鎖の欠損が原因で起こり、１０，０００人中１〜２人の発生率でほとんど例外なく雄が影響を受ける。Ｘ染色体異常は、自身は血友病者ではない雌のキャリアーによって運搬される。血友病Ａの臨床症状は、高い出血傾向である。第ＶＩＩＩ因子濃縮製剤での治療が導入される前は、重い血友病に罹った人の平均寿命は２０歳未満であった。血漿由来の第ＶＩＩＩ因子濃縮製剤を使用することによって、血友病Ａ患者を取り巻く状況が顕著に改善され、平均寿命がかなり長くなり、彼等の多くに程度の差はあるが普通の生活を送る可能性を与えてきた。しかしながら、血漿由来の濃縮物およびそれらの使用に関してある種の問題が依然として存在し、そのうち最も重篤な問題は、ウイルスを伝播することである。これまで、Ｂ型肝炎、非Ａ非Ｂ型肝炎およびＡＩＤＳを引き起こすウイルスは、人々に深刻な打撃を与えてきた。近年、様々なウイルスの不活性化方法、および新しい高度に精製された第ＶＩＩＩ因子濃縮製剤が開発されたために、血漿由来の第ＶＩＩＩ因子に関する極めて高い安全基準も確立されている。

第ＶＩＩＩ因子に関するｃＤＮＡのクローニング（非特許文献１、２）によって、第ＶＩＩＩ因子を組換え発現することによって第ＶＩＩＩ因子の組換え発現が可能になったことから、数種の組換え第ＶＩＩＩ因子製品が開発され、これは、１９９２〜２００３年の間に規制当局の承認を受けている。アミノ酸Ａｒｇ−７４０〜Ｇｌｕ−１６４９に存在する第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド鎖中央のＢドメインは、十分な生物活性に必要ではないようであるということから、Ｂドメインが欠失した第ＶＩＩＩ因子の開発が行われてきた。

成熟した第ＶＩＩＩ因子分子は、２３３２個のアミノ酸からなり、これらアミノ酸は、３つの相同Ａドメイン、２つの相同ＣドメインおよびＢドメインに分類することができ、これは以下の順番：Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２で並んでいる。成熟したヒト第ＶＩＩＩ因子の完全なアミノ酸配列を、配列番号２に示す。第ＶＩＩＩ因子は、血漿に分泌されている間に、単鎖の第ＶＩＩＩ因子は、細胞内でプロセシングを受けて、Ｂ−Ａ３の境界と、Ｂドメイン内の異なる部位とで切断されることによって一連の金属−イオン結合ヘテロ二量体になる。このプロセシングにより、９０ｋＤａ〜２００ｋＤａの範囲の分子サイズを有する、Ａ１、Ａ２およびＢドメインの様々な部分からなる異種重鎖分子が生じる。重鎖は、金属イオンを介して、Ａ３、Ｃ１およびＣ２ドメインからなる軽鎖に結合している（非特許文献３）。血漿中では、このヘテロ二量体の第ＶＩＩＩ因子は高親和性でフォン−ビルブランド因子（ｖＷＦ）と結合し、それにより、フォン−ビルブランド因子を早すぎる異化から保護する。ｖＷＦに結合した非活性型の第ＶＩＩＩ因子の半減期は、血漿中で約１２時間である。

第ＶＩＩＩ凝固因子は、重鎖内のアミノ酸Ａｒｇ３７２およびＡｒｇ７４０、ならびに、軽鎖内のＡｒｇ１６８９におけるＦＸａおよびトロンビンによるタンパク質分解的切断によって活性化され、それによりフォン−ビルブランド因子の放出が起こり、活性型第ＶＩＩＩ因子ヘテロ三量体が生成し、この三量体は、Ｃａ²⁺が存在するという条件下で、リン脂質表面でＦＩＸａおよびＦＸとテナーゼ複合体を形成すると予想される。このヘテロ三量体は、Ａ１ドメイン、５０ｋＤａのフラグメント、Ａ２ドメイン、４３ｋＤａのフラグメント、および軽鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）、７３ｋＤａのフラグメントからなる。従って、第ＶＩＩＩ因子の活性型（第ＶＩＩＩａ因子）は、２価の金属イオンでトロンビンで切断されたＡ３−Ｃ１−Ｃ２軽鎖と結合したＡ１サブユニットと、比較的緩くＡ１およびＡ３ドメインと結合した遊離のＡ２サブユニットとからなる。

過度の凝固を回避するために、第ＶＩＩＩａ因子は、活性化の直後に不活性化されなければならない。Ａｒｇ３３６およびＡｒｇ５６２での切断による活性型プロテインＣ（ＡＰＣ）を介した第ＶＩＩＩａ因子の不活化は、主要な律速段階とはみなされない。むしろ、ヘテロ三量体からの非共有結合で結合したＡ２サブユニットの解離が、トロンビン活性化後の第ＶＩＩＩａ因子の不活性化における律速段階と考えられる（非特許文献４、５）。これは、わずか２．１分間という第ＶＩＩＩａ因子の短い血漿中半減期を説明する急速なプロセスである（非特許文献３）。

予防的治療を受けた重度の血友病Ａ患者において、第ＶＩＩＩ因子は、約１２時間という第ＶＩＩＩ因子の短い血漿中半減期のために、１週間約３回、静脈内投与（ｉ．ｖ．）しなければならない。いずれの静脈内投与も、面倒であり、痛みを伴い、特に静脈内投与は、主に患者自身によって、または血友病Ａに関して診断を受けた子供の親によって自宅で行われるために、必然的に感染の危険を伴う。

従って、長い機能的な半減期を有する第ＶＩＩＩ因子を作製すること極めて望ましいと予想され、それにより、より少ない頻度での投与で済む第ＶＩＩＩ因子を含む薬剤組成物の製造が可能になる。

第ＶＩＩＩ因子と細胞受容体との相互作用を減少させること（特許文献１、２）、第ＶＩＩＩ因子にポリマーを共有結合させること（特許文献３、４および５）、または、第ＶＩＩＩ因子をカプセル化すること（特許文献６）のいずれかにより、非活性型の第ＶＩＩＩ因子の半減期を延長させるためのいくつかの試みがなされてきた。

特許文献７において、新規の金属結合部位の導入が、第ＶＩＩＩ因子、および具体的には、ＨｉｓまたはＭｅｔがＰｈｅ６５２、Ｔｙｒ１７８６、Ｌｙｓ１８１８、Ａｓｐ１８４０および／またはＡｓｎ１８６４のいずれかで置換された突然変異体を安定化させることができるという仮説が立てられている。しかしながら、どのように成功（このような修飾から安定化が生じることを意味する）を決定しているのかについての論理的説明が示されておらず、なぜ提唱されているアミノ酸が選択されたかの論理的説明もない。このアプローチは、それ以来さらなる証拠が公開されていないために推論のままである。

第ＶＩＩＩａ因子の形成においてなさるその他のアプローチは、第一に、Ａ２ドメインをＡ３ドメインに共有結合させ、第二にＡＰＣ切断部位を突然変異させることによる不活化に対する耐性である（非特許文献６、特許文献８および９）。さらに、特許文献１０に記載されているように、基礎となる遺伝学的コンストラクトを用いてトランスジェニック動物も生産した。その発明の変異株は、トロンビン活性化の４時間後にそれでもなおそのピーク活性の３８％を示したが、Ａ２をＡ３ドメインに融合させたためにこの具体的なドメインが欠失しているために、ｖＷＦ結合ドメインが欠けている。ｖＷＦ結合がインビボでのＦＶＩＩＩの半減期を有意に延長させる理由のために、この発明のＦＶＩＩＩ変異株の非活性型の半減期が短くなることが予想される。発明者等自身もこれを認識しており、ｖＷＦへの親和性をある程度保持するコンフォメーションで軽鎖を安定化する抗体を添加することによってその問題を克服することを試みている。

非特許文献７は、Ａ３ドメインをＡ２ドメインに共有結合させることによるＦＶａの安定化を公開している。彼等は、構造的な予測に従って２つの隣接するアミノ酸を同定したが、そのうち一方はＡ２ドメイン上に、他方はＡ３ドメインに位置しており、これら２種のアミノ酸はシステイン残基で置換されていることから、小胞体への輸送中にジスルフィド架橋が形成される。同じアプローチを用いて、ジスルフィド架橋を介して第ＶＩＩＩ因子のＡ２ドメインをＡ３ドメインに共有結合させている（特許文献１１）。このような、Ａ３ドメインとＡ２ドメインとが共有結合することによって、ＦＶＩＩＩａを安定化した第ＶＩＩＩ因子の突然変異体は、活性化後に、４０分におけるそれらの初期の最高活性の約９０％を保持していたが、それに対して野生型第ＶＩＩＩ因子の活性は、その初期の最高活性の１０％に迅速に減少した。第ＶＩＩＩ因子の突然変異体は、さらに３時間、それらの９０％の活性をさらなる活性の損失をまったく起こすことなく保持していた（非特許文献８）。

特許文献１２には、Ａｒｇ３７２におけるトロンビン活性化部位を置換し、さらにＦＶＩＩＩの活性型も安定化する異なるペプチド性リンカーの挿入を特徴とする、数種の安定化されたＦＶＩＩＩ突然変異体が記載されている。リンカーの長さに応じてＦＶＩＩＩ活性のレベルが増加し、ここで、９９個のアミノ酸（Ｌ９９）が挿入されたケースにおいて最大値に達している。発色分析方法を用いたところ、ＦＶＩＩＩ Ｌ９９を用いて検出されたＦＶＩＩＩ活性は、ＦＶＩＩＩ ＷＴに類似していた。活性型ＦＶＩＩＩ Ｌ９９は、１時間より長い時間、ほぼ安定していた。

上記の説明されているアプローチのうちどれによっても、未だに患者に適用できる改善されたＦＶＩＩＩ分子が得られてないため、長い半減期を示す修飾された第ＶＩＩＩ凝固因子分子を開発する必要が未だにある。

血栓形成の危険があるかもしれないということを考慮すれば、ＦＶＩＩＩの非活性型の半減期をＦＶＩＩＩａよりも延長させることがより望ましい。

ｒｅｃＦＶＩＩＩ生産の際に一般的に発生するその他の問題は、収率が低いことである。当業者既知の様々な方法が試されてきたが、このような低い収率の問題を解決するには至っていない。

ＷＯ０３／０９３３１３Ａ２ ＷＯ０２／０６０９５１Ａ２ ＷＯ９４／１５６２５ ＷＯ９７／１１９５７ ＵＳ４９７０３００ ＷＯ９９／５５３０６ ＷＯ９７／０３１９３ ＷＯ９７／４０１４５ ＷＯ０３／０８７３５５ ＷＯ０２／０７２０２３Ａ２ ＷＯ０２／１０３０２４Ａ２ ＷＯ２００６／１０８５９０

Wood et al. 1984. Nature 312:330-336 Vehar et al. 1984. Nature 312:337-342 Saenko et al. 2002. Vox Sang. 83:89-96 Fay et al. 1991. J. Biol. Chem. 266 8957 Fay & Smudzin 1992. J. Biol. Chem. 267:13246-50 Pipe & Kaufman. 1997. PNAS 94:11851-11856 Gale et al. 2002 (Protein Science 11:2091-2101) Gale et al. 2003. J. Thromb. Haemost. 1:1966-1971

本発明の目的は、生体内での半減期が増強された血液凝固分子を提供することである。

本発明のその他の目的は、インビボで改善された回収を示す血液凝固分子を提供することである。

本発明のその他の目的は、これらの修飾された血液凝固分子を哺乳動物細胞で発現させ、発現された修飾タンパク質のそれらの生物活性を保持することを可能にすることである。

本発明のその他の目的は、発現を増加させる、および／または哺乳動物細胞培養における凝固分子の安定性を増加させることによって、改善された収率を提供することである。

本発明のさらにその他の目的は、血清および／または動物タンパク質を含まない培地、特にｖＷＦの非存在下の培地の哺乳動物細胞培養において、向上した安定性を有するＦＶＩＩＩ分子を提供することである。

ここで驚くべきことに、アルブミンのような異種ポリペプチドを、好ましくはそれによってＦＶＩＩＩのＢドメインがほぼ完全にまたは部分的に置換されるようにＦＶＩＩＩ分子に挿入すると、哺乳動物細胞からＦＶＩＩＩキメラタンパク質の発現および分泌が可能になるだけでなく、有意なＦＶＩＩＩ活性を保持する修飾されたＦＶＩＩＩ分子も生じることが発見された。加えて、このような修飾されたＦＶＩＩＩ分子は、インビボでの長い半減期および／または改善されたインビボでの回収を示す。

本発明の実施態様（ここでＦＶＩＩＩは凝固因子であり、活性化後Ａ２ドメインがＡ３ドメインに非共有結合で結合したままである）のさらなる可能性のある利点は、ＦＶＩＩＩの非活性型の半減期だけが長くなり、ＦＶＩＩＩの活性型の半減期は実質的に同じままである点であり、それにより、血栓形成性の危険が減少する可能性がある。

さらに、哺乳動物細胞培養において、特に血清および／または動物タンパク質を含まない培地中でフォン−ビルブランド因子（ｖＷＦ；ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ Ｆａｃｔｏｒ）を安定化しなくても、本発明のＦＶＩＩＩ分子は、野生型ＦＶＩＩＩよりも安定であることが見出された。

このような分子は、半減期を増強するタンパク質（ＨＬＥＰ）部分を、血液凝固因子のアミノ酸配列に、例えばＦＶＩＩＩ分子に挿入することによって生成させることができる。ＦＶＩＩＩが血液凝固因子である場合、ＨＬＥＰは、好ましくは、ＦＶＩＩＩのＢドメインまたはその一部に挿入されるか、またはそれらを置換する。

ＨＬＥＰは、本発明の意味において、アルブミンファミリーからなる群より選択され、このアルブミンファミリーは、アルブミン、アファミン（ａｆａｍｉｎ）、アルファ−フェトプロテインおよびビタミンＤ結合タンパク質、ならびに免疫グロブリン定常領域の部分、およびアルブミンファミリーのメンバーおよび免疫グロブリン定常領域の部分に生理学的条件下で結合することができるポリペプチドも含む。最も好ましいＨＬＥＰは、ヒトアルブミンである。

また本発明は、ＨＬＥＰが、フォン−ビルブランド因子、第Ｖ因子、およびプロトロンビン因子、例えば第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺおよびプロトロンビンのような他の凝固因子に挿入されているその他のタンパク質も包含する。上述のＦＶＩＩＩと同様に、特にＨＬＥＰ、好ましくはアルブミンは、好ましい実施態様において、上記の凝固因子のドメインまたはサブユニットのジャンクション部位で、またはその付近に挿入される。

従来技術において、凝固因子を、半減期を増強するポリペプチドとしてアルブミン（ＷＯ０１／７９２７１）、アルファ−フェトプロテイン（ＷＯ２００５／０２４０４４）および免疫グロブリン（ＷＯ２００４／１０１７４０）に融合させることが記載されている。これらは、それぞれの治療用タンパク質部分のカルボキシもしくはアミノ末端、または両方の末端に結合しており、場合によってはペプチド性のリンカー、好ましくはグリシンおよびセリンからなるリンカーで連結されることが教示されている。

Ballance et al.（ＷＯ０１／７９２７１）には、ヒト血清アルブミンに融合した多数の様々な治療用ポリペプチドのＮまたはＣ末端融合ポリペプチドが記載されている。可能性がある融合パートナーの長いリストが記載されているが、それぞれのアルブミン融合タンパク質が実際に生物活性を保持し、改善された特性を有するかどうかこれらのポリペプチドのほとんど全てについて実験データの開示はない。前記治療用ポリペプチドのリストのなかに、第ＶＩＩＩ因子も言及されている。

従来技術の融合タンパク質とは異なり、本発明の修飾された凝固因子における異種アミノ酸の配列は、凝固因子のＮ末端またはＣ末端先端に融合されておらず、凝固因子のアミノ酸配列の内部領域内に挿入されている。驚くべきことに、さらに大きいポリペプチドを挿入しても、凝固因子の生物活性の完全な消失は起こらなかった。むしろ、このようにして修飾された凝固因子は、生物活性、インビボでの機能的な半減期、インビボでの回収の増加、および高い安定性を示した。

従って本発明は、凝固因子の内部領域に、半減期を増強するポリペプチド（ＨＬＥＰ）が挿入された修飾された凝固因子であって、本修飾された凝固因子は、前記挿入がない凝固因子の機能的な半減期と比較して、および／または野生型凝固因子の機能的な半減期と比較して長い機能的な半減期を有することを特徴とする凝固因子に関する。

本発明はまた、１個より多くのＨＬＥＰの挿入に関し、ここで数回挿入されるＨＬＥＰは、同じＨＬＥＰであってもよいし、または異なるＨＬＥＰの組み合わせであってもよい。また本発明は、凝固因子の内部領域への１つまたはそれ以上のＨＬＥＰの挿入と、追加の１つまたはそれ以上のＨＬＥＰ（これらは、同じＨＬＥＰでもよいし、または異なるＨＬＥＰの組み合わせでもよい）のＮおよび／またはＣ末端の融合との組み合わせも包含する。

本発明はまた、凝固因子の内部領域に、半減期を増強するポリペプチド（ＨＬＥＰ）が挿入された修飾された凝固因子であって、本修飾された凝固因子は、前記挿入がない凝固因子のインビボでの回収と比較して、および／または野生型凝固因子のインビボでの回収と比較して改善されたインビボでの回収を示すことを特徴とする凝固因子に関する。

本発明のその他の形態において、本修飾された凝固因子は、無血清培地中で、前記挿入がない凝固因子の安定性と比較して、および／または野生型凝固因子の安定性と比較して高い安定性を示す。本発明のその他の側面において、本修飾された凝固因子は、動物タンパク質を含まない培地中で、前記挿入がない凝固因子の安定性と比較して、および／または野生型凝固因子の安定性と比較して高い安定性を示す。このような無血清および／または動物タンパク質を含まない培地中における高い安定性は、安定化する量のｖＷＦが存在しない場合、特に顕著である。

動物タンパク質を含まない培地は、本発明の意味において、動物由来のタンパク質またはタンパク質フラグメントを含まない培地である。

本発明のその他の側面は、本発明の修飾された凝固因子をコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド群である。

本発明はさらに、本明細書において説明されるポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはベクター、本明細書において説明されるポリヌクレオチドまたはプラスミドもしくはベクターを含む宿主細胞に関する。

本発明のその他の側面は、修飾された凝固因子の製造方法であって、本方法は：
（ａ）本発明の宿主細胞を、修飾された凝固因子が発現されるような条件下で培養すること；および
（ｂ）場合により、宿主細胞または培地から修飾された凝固因子を回収すること、を含む。

本発明はさらに、本明細書において説明される修飾された凝固因子、ポリヌクレオチド、またはプラスミドもしくはベクターを含む薬剤組成物に関する。

本発明のさらにその他の側面は、血液凝固障害を治療または予防する薬剤を製造するための、修飾された凝固因子、ポリヌクレオチド、またはプラスミドもしくはベクター、または本発明に係る宿主細胞の使用である。

実施例で用いられるＦＶＩＩＩアルブミン挿入タンパク質におけるＢドメイン配列の置換である。それぞれ、ｐＦ８−１２１０について示された転位配列は、配列番号２４（Ａ２／Ｂ／アルブミン）および３４（アルブミン／Ｂ／Ａ３）に相当し、ｐＦ８−１２１１については、配列番号２４および３５に相当し、ｐＦ８−１４１３については配列番号２３および３５に相当し、およびｐＦ８−１４３９については、配列番号２８および４０に相当する。 ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインと、ＨＬＥＰを置換するＢドメインとの間のリンカーとして用いられるＢドメイン配列の例（ＨＬＥＰ部分の例としてアルブミンを使用）である。 ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインとＨＬＥＰ（例としてアルブミンを使用）で置換されるＢドメインとの間のその他の切断可能なリンカー配列の例である。 ＨＬＥＰ（例としてアルブミンを使用）で置換されるＢドメインとＦＶＩＩＩのＡ３ドメインとの間のリンカーとして用いられるＢドメイン配列の例である。 ＨＬＥＰ（例としてアルブミンを使用）で置換されるＢドメインとＦＶＩＩＩのＡ３ドメインとの間のその他のリンカー配列の例である。 ＦＶＩＩＩ分子内のＨＬＥＰ挿入の例である。矢印は、切断部位を意味する。 野生型ＦＶＩＩＩ（ヘリキセート^（R））と比較した、ヒトアルブミンで置換されたＢドメインを有するＦＶＩＩＩ突然変異体を有するラットにおける薬物動態学的な分析である。 細胞を播種した後の３つのタイムポイント（９６、１２０、および、１４４時間）における細胞培養上清の分析である。ＨＥＫ−２９３トランスフェクタントのプールを、ＦＶＩＩＩ凝固活性およびＦＶＩＩＩ抗原の生産性、ならびにそれらの野生型ＦＶＩＩＩ（４５７）と、Ｂドメインがヒトアルブミンで置換されたＦＶＩＩＩ突然変異体との比率について評価した。

本発明は、凝固因子の一次翻訳ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸とＣ末端のアミノ酸との間の内部領域に、半減期を増強するポリペプチド（ＨＬＥＰ）の挿入を含む修飾された凝固因子であって、本修飾された凝固因子は、前記挿入がない凝固因子の機能的な半減期と比較して、および／または野生型凝固因子の機能的な半減期と比較して長い機能的な半減期を有することを特徴とする凝固因子に関する。

本発明に係る「機能的な半減期」は、凝固因子が哺乳動物に投与されてからの凝固因子の生物学的機能の半減期であり、これは、凝固因子が投与された後に前記哺乳動物から異なる時間間隔で採取された血液サンプル中で、インビトロで測定することができる。

語句「挿入」、「〜を挿入すること」および「挿入された」は、凝固因子のアミノ酸配列の内部の位置にアミノ酸が付加されることを意味する。Ｎ末端またはＣ末端の融合タンパク質のケース以外で、このようなアミノ酸は、本発明に従って凝固因子のアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端の先端には付加されないが、凝固因子のアミノ酸配列内の内部の位置に挿入される。「挿入」は、アミノ酸の付加（凝固因子のアミノ酸配列からアミノ酸を欠失させることなく）だけでなく、凝固因子のアミノ酸配列の１個またはそれ以上のアミノ酸の「挿入」しようとするアミノ酸での置換も包含する。例えば、完全な内部ドメイン、または実質的なそれらの部分が、ＨＬＥＰで置換されてもよい。

一実施態様において、本修飾された凝固因子は、以下の構造を有する：
Ｎ−Ｌ１−Ｈ−Ｌ２−Ｃ ［式１］
式中、
Ｎは、凝固因子のＮ末端部分であり、
Ｌ１およびＬ２は、独立して、化学結合またはリンカー配列であり、ここでリンカー配列は、異なるリンカー配列であってもよいし、または同じリンカー配列であってもよく、
Ｈは、ＨＬＥＰであり、および
Ｃは、凝固因子のＣ末端部分である。

好ましくは、Ｎは、野生型凝固因子のＮ末端に存在する１個、または２個、または３個、または４個、または５個のタンパク質ドメインを含む。好ましくは、Ｃは、野生型凝固因子のＣ末端に存在する１個、または２個、または３個、または４個、または５個のタンパク質ドメインを含む。一実施態様において、野生型凝固因子は、実質的に構造Ｎ−Ｃを有する。その他の実施態様において、野生型凝固因子は、実質的に構造Ｎ−Ｄ−Ｃを有し、ここでＤは、修飾された凝固因子中のＨＬＥＰで置換されたドメインまたはそれらの部分を示し、または言い換えれば、Ｄは、修飾された凝固因子中の、ＨＬＥＰで置換された野生型凝固因子（すなわち完全なドメインまたはそれらの部分）の一部の欠失を示す。好ましい凝固因子の配列は、以下で説明する。通常、Ｎ＋Ｃの長さは、野生型凝固因子の長さを超えない。

Ｌ１およびＬ２は、独立して、１個またはそれ以上のアミノ酸、例えば１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、または、１〜３（例えば、１、２または３）個のアミノ酸からなる化学結合であってもよいし、またはリンカー配列であってもよく、これらは互いに同一でもよいし、または異なっていてもよい。通常、リンカー配列は、野生型凝固因子におけるそれに対応する位置には存在しない。Ｌ１およびＬ２に存在する適切なアミノ酸の例としては、ＧｌｙおよびＳｅｒが挙げられる。

以下で好ましいＨＬＥＰ配列を説明する。本発明の修飾された凝固因子は、１個より多くのＨＬＥＰ配列を含んでもよく、例えば２または３個のＨＬＥＰ配列を含んでもよい。これらの複数のＨＬＥＰ配列は、タンデム状に挿入されてもよいし、例えば連続した反復として挿入されてもよく、またはこれらは凝固因子配列の異なる位置に存在していてもよく、さらにＮ末端先端またはＣ末端先端での、または凝固因子配列の両方の末端でのＨＬＥＰ配列融合を含んでいてもよく、ここで少なくとも１つのＨＬＥＰ配列は、凝固因子の配列内の内部の位置に挿入されていなければならない。これらの実施態様において、本修飾された凝固因子は、以下の構造のいずれか１つを有していてもよい：
Ｎ−Ｌ１−Ｈ−Ｌ２−Ｉ−Ｌ３−Ｈ−Ｌ４−Ｃ ［式２］
Ｎ−Ｌ１−Ｈ−Ｌ２−Ｃ−Ｌ３−Ｈ ［式３］
Ｈ−Ｌ１−Ｎ−Ｌ２−Ｈ−Ｌ３−Ｃ ［式４］
Ｈ−Ｌ１−Ｎ−Ｌ２−Ｈ−Ｌ３−Ｃ−Ｌ４−Ｈ ［式５］
式中、
Ｎは、凝固因子のＮ末端部分であり、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、独立して、化学結合またはリンカー配列であり、ここでリンカー配列は、異なるリンカー配列であってもよいし、または同じリンカー配列であってもよく、
Ｈは、ＨＬＥＰであり、
Ｉは、凝固因子の内部配列であり、および
Ｃは、凝固因子のＣ末端部分である。

凝固因子は、様々な段階でタンパク質分解によってプロセシングされていてもよい。例えば、上述したように、それらが血漿に分泌される間に、単鎖の第ＶＩＩＩ因子は、細胞内において、Ｂ−Ａ３の境界で、およびＢドメイン内の異なる部位で切断される。重鎖は、金属イオンを介してドメイン構造Ａ３−Ｃ１−Ｃ２を有する軽鎖に結合される。第ＶＩＩＩ因子は、重鎖内のアミノ酸Ａｒｇ３７２およびＡｒｇ７４０の位置で、および軽鎖内のＡｒｇ１６８９の位置でタンパク質分解的切断によって活性化され、それによりＡ１ドメイン、Ａ２ドメイン、および軽鎖（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２）からなる活性型第ＶＩＩＩ因子のヘテロ三量体が生成する（７３ｋＤａのフラグメント）。従って、第ＶＩＩＩ因子の活性型（第ＶＩＩＩａ因子）は、２価の金属イオンとの結合を介してトロンビンで切断されたＡ３−Ｃ１−Ｃ２軽鎖と結合したＡ１−サブユニットと、比較的緩くＡ１およびＡ３ドメインと結合した遊離のＡ２サブユニットとからなる。

従って、本発明はまた、単鎖ポリペプチドとしては存在しないが、非共有結合を介して互いに結合した数個のポリペプチド（例えば、１、または２、または３個）からなる修飾された凝固因子も包含する。一例として、本修飾された凝固因子の構造は、以下に示す構造であってもよい：
Ｎ−Ｌ１−Ｈ−Ｌ２・・・Ｃ ［式６］
Ｎ−Ｌ１−Ｈ・・・Ｌ２−Ｃ ［式７］
Ｎ−Ｌ１・・・Ｈ−Ｌ２−Ｃ ［式８］
Ｎ・・・Ｌ１−Ｈ−Ｌ２−Ｃ ［式９］
式中、「・・・」は、非共有結合を意味し、Ｎ、Ｌ１、Ｌ２、ＨおよびＣの意味は上記で定義された通りである。式２〜式５で示されるポリペプチドの式６〜式９で示される形態に類似した切断された形態も本発明に包含される。

通常、挿入部位は、凝固因子の生物活性が、十分に、または少なくとも部分的に保持されるように選択される。本発明の修飾された凝固因子の生物活性は、挿入がない凝固因子の、または凝固因子の野生型の形態の生物活性の、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％である。

一般的に、凝固因子の２つのドメイン間の挿入、または２つのドメイン間の境界近傍内への挿入が好ましい。このような２つのドメインは、野生型凝固因子において隣接するドメインであってもよいし、またはそうでなくてもよい。

本明細書において２つのドメイン間の挿入と言及される場合（例えば、「ドメインＸとドメインＹとの間への挿入」）、これは、好ましくは、正確にドメインＸのＣ末端のアミノ酸と、ドメインＹのＮ末端のアミノ酸との間への挿入を意味する。しかしながら、本発明の意味において「ドメインＸとドメインＹとの間への挿入」はまた、ドメインＸのＣ末端のアミノ酸上流のアミノ酸ｎ個以内のアミノ酸位置における挿入、またはドメインＹのＮ末端のアミノ酸下流のアミノ酸ｎ個以内のアミノ酸位置における挿入も含む可能性がある。ここで記号ｎは、言及されたドメインのアミノ酸総数の１０％以下、好ましくは５％以下に相当する整数である。通常、ｎは、２０であり、好ましくは１５、より好ましくは１０、さらにより好ましくは５またはそれ未満（例えば、１、２、３、４、または５）である。

また、無血清培地中の修飾された凝固因子の安定性は、挿入がない凝固因子の安定性、および／または凝固因子の野生型の形態の安定性よりも大きいことが好ましい。また、動物タンパク質を含まない培地中の修飾された凝固因子の安定性は、挿入がない凝固因子の安定性、および／または凝固因子の野生型の形態の安定性よりも大きいことが好ましい。安定性の増加は、挿入がない凝固因子、および／または凝固因子の野生型の形態と比較して、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％、最も好ましくは少なくとも５０％である。上記培地中における凝固因子の安定性は、実施例７で記載したようにして決定することができる。

本発明に係る機能的な半減期は、凝固因子が哺乳動物に投与されてからの凝固因子の生物学的機能の半減期であり、これは、インビトロで測定される。同じ種で試験したところ、本発明に係る修飾された凝固因子の機能的な半減期は、修飾がない凝固因子の機能的な半減期よりも大きい。機能的な半減期は、修飾がない凝固因子、および／または凝固因子の野生型の形態と比較して、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、および、さらにより好ましくは少なくとも１００％高い。

ＨＬＥＰでの修飾を含む修飾された凝固因子の機能的な半減期は、ラット、ウサギまたはその他の実験動物種に、それぞれの修飾された凝固因子（および比較のために、未修飾凝固因子）を静脈内または皮下投与し、および続いて、適用後の適切なインターバルで採取された血液サンプル中の前記修飾された、またはそれぞれの未修飾凝固因子の生物活性を除去することによって決定することができる。適切な試験方法は、本明細書において説明される活性試験である。

生物活性の半減期を示す代用マーカーとして、修飾された凝固因子、またはそれぞれの未修飾凝固因子の抗原レベルを測定してもよい。従って、凝固因子の一次翻訳ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸とＣ末端のアミノ酸との間の内部領域に、半減期を増強するポリペプチド（ＨＬＥＰ）が挿入された修飾された凝固因子であって、本修飾された凝固因子は、前記挿入がない凝固因子の抗原の半減期と比較して、本凝固因子の抗原の長い半減期を有することを特徴とする凝固因子も本発明に包含される。本発明に係る「凝固因子の抗原の半減期」は、哺乳動物に投与されてからの凝固因子の抗原の半減期であり、これは、インビトロで測定される。抗原の試験方法は、酵素免疫検査法様式における特異的な抗体に基づいており、このような抗体は当業者既知であり、市販されている（例えば、デイド・ベーリング（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）、インスツルメンテーション・ラボラトリー（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、アボット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ダイアグノスティカ・スターゴ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ））。機能的な半減期および抗原の半減期は、式：ｔ_1/2＝ｌｎ２／ｋ（式中ｋは、回帰線の傾きである）に従って除去のベータ相のタイムポイントを用いて計算することができる。

生体内で凝固中に凝固因子が活性化されると、それにより血栓性合併症が生じる可能性があるので、目下の活性化された凝固因子の高い半減期を維持することはもはや望ましくなくなる場合があり、このような血栓性合併症は、すでに野生型の活性型凝固因子ＦＶＩＩａに関して症例があり（Aledort 2004. J Thromb Haemost 2:1700-1708）、さらに、活性型の因子が高い半減期を有する可能性がある場合にはよりいっそう脅威となると予想される。従って、本発明のその他の目的は、生体内での内因性の活性化の後に、または生体内で補因子が利用可能になった後に、未修飾凝固因子の半減期と同等の機能的な半減期を有する長寿命の凝固因子の分子を提供することである。これは、修飾された凝固因子中に、活性化の間にＨＬＥＰから凝固因子を分離するタンパク質分解的切断を引き起こすことができる所定の切断部位を維持すること（下記を参照）によって達成できる。従って、一実施態様において、内因的に修飾された活性型凝固因子の機能的な半減期は、修飾がない活性化型の未修飾凝固因子の機能的な半減期と実質的に同じであるか、および／または野生型の活性型凝固因子の機能的な半減期と実質的に同じである（例えば、±１５％、好ましくは±１０％）。

その他の実施態様において、内因的に修飾された活性型凝固因子の機能的な半減期は、挿入がない活性化型の未修飾凝固因子の機能的な半減期と比較して、または野生型の活性型凝固因子の機能的な半減期と比較して長い。その長さは、１５％より長くてもよく、例えば少なくとも２０％、または少なくとも５０％である。この場合も、このような機能的な半減期の値は、上記の機能的な半減期に関して説明されているようにして測定し計算することができる。増加した半減期の内因的に修飾された活性型凝固因子は、極めて低いレベルの凝固因子しか利用できないために血栓形成されないような状況において有益な場合がある。このような状況は、例えばしばしば低い発現率しか達成できない遺伝子治療の際に起こる可能性がある。それゆえに、このような安定化された凝固因子は、例えば遺伝子治療においてタンパク質として高用量でまたは生理学的な用量で投与される場合このような凝固因子に関連する血栓形成の危険性にもかかわらず有益となるはずである。

半減期を増強するポリペプチド（ＨＬＥＰ）
本明細書で用いられる「半減期を増強するポリペプチド」は、アルブミン、アルブミンファミリーの一種、免疫グロブリンＧの定常領域およびそれらのフラグメント、および生理学的条件下でアルブミン、アルブミンファミリーの一種および免疫グロブリン定常領域の部分と結合できるポリペプチドからなる群より選択される。これは、凝固因子の治療活性または生物活性を安定化したり、または延長することができる、本明細書において説明される全長の半減期を増強するタンパク質（例えば、アルブミン、アルブミンファミリーの１種、または、免疫グロブリンＧの定常領域）、または１種またはそれ以上のそれらのフラグメントであってもよい。このようなフラグメントは、長さが１０個またはそれ以上のアミノ酸であるものでもよいし、またはＨＬＥＰ配列からの少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個またはそれ以上の連続したアミノ酸を含んでいてもよいし、またはそれぞれのＨＬＥＰの特定のドメインの一部または全部を含んでいてもよく、ここでこれらは、ＨＬＥＰフラグメントの機能的な半減期が野生型凝固因子と比較して少なくとも２５％延長する程度の長さである。

ここで提案の本発明の凝固因子の挿入コンストラクトのＨＬＥＰ部分は、正常なＨＬＥＰの変異体であってもよい。用語「変異体」は、挿入、欠失および置換を含み、これらは保存的または非保存的のいずれでもよく、ここでこのような変化によっては、実質的に修飾された凝固因子の生物活性を付与する活性部位または活性ドメインは変更されない。

具体的には、提案の本発明のＦＶＩＩＩへのＨＬＥＰ挿入、またはＢドメイン置換コンストラクトは、ＨＬＥＰおよびＨＬＥＰのフラグメントの天然に存在する多型変異体を含んでいてもよい。ＨＬＥＰは、あらゆる脊椎動物、特にあらゆる哺乳動物、例えばヒト、サル、ウシ、ヒツジまたはブタから誘導することができる。非哺乳動物のＨＬＥＰとしては、これらに限定されないが、ニワトリおよびサケのものが挙げられる。

ＨＬＥＰとしてのアルブミン
用語「ヒト血清アルブミン」（ＨＳＡ）および「ヒトアルブミン」（ＨＡ）および「アルブミン」（ＡＬＢ）は、本願中では交換可能に用いられる。用語「アルブミン」および「血清アルブミン」はそれよりも上位の概念であり、ヒト血清アルブミン（および、それらのフラグメントおよび変異体）、加えて他の種由来のアルブミン（および、それらのフラグメントおよび変異体）を包含する。

本明細書で用いられるように、「アルブミン」は、集合的に、アルブミンのポリペプチドもしくはアミノ酸配列、または、アルブミンの１種またはそれ以上の機能的な活性（例えば生物活性）を有するアルブミンのフラグメントもしくは変異体を意味する。具体的には、「アルブミン」は、ヒトアルブミンまたはそれらのフラグメントを意味し、特に、本明細書において配列番号３で示されるようなヒトアルブミンの成熟型、または他の脊椎動物由来のアルブミンもしくはそれらのフラグメント、またはこのような分子の類似体もしくは変異体もしくはそれらのフラグメントを意味する。

具体的には、提案の本発明の凝固因子に挿入されるコンストラクトは、ヒトアルブミンおよびヒトアルブミンフラグメントの天然に存在する多型変異体を含んでいてもよい。一般的に言えば、アルブミンフラグメントまたは変異体のアミノ酸の長さは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも４０、最も好ましくは７０個より多くなる。アルブミン変異体は、好ましくは、少なくとも１つのアルブミンのドメイン全体、または前記ドメインのフラグメント、例えばドメイン１（配列番号３のアミノ酸１〜１９４）、２（配列番号３のアミノ酸１９５〜３８７）、３（配列番号３のアミノ酸３８８〜５８５）、１＋２（配列番号３のアミノ酸１〜３８７）、２＋３（配列番号３のアミノ酸１９５〜５８５）、または１＋３（配列番号３のアミノ酸１〜１９４＋配列番号３のアミノ酸３８８〜５８５）からなるものでもよいし、またはその代替としてそれらを含むものであってもよい。各ドメインは、それ自体２個の相同サブドメインで構成されており、すなわち１〜１０５、１２０〜１９４、１９５〜２９１、３１６〜３８７、３８８〜４９１および５１２〜５８５と、残基Ｌｙｓ１０６〜Ｇｌｕ１１９、Ｇｌｕ２９２〜Ｖａｌ３１５、および、Ｇｌｕ４９２〜Ａｌａ５１１を含むフレキシブルなサブドメイン間リンカー領域とで構成されている。

提案の本発明の凝固因子に挿入されるコンストラクトのアルブミン部分は、少なくとも１つのサブドメインまたはＨＡのドメイン、またはそれらの保存的修飾を含んでもよい。

ＨＬＥＰとしてのアファミン、アルファ−フェトプロテインおよびビタミンＤ結合タンパク質
アルブミンの他にも、アルファ−フェトプロテイン、アルブミンファミリーのその他のメンバーが、インビボで、結合した治療用ポリペプチドの半減期を増強すると特許請求されている（ＷＯ２００５／０２４０４４）。タンパク質のアルブミンファミリーは、進化的に関連する血清輸送タンパク質であり、これらは、アルブミン、アルファ−フェトプロテイン（AFP; Beattie & Dugaiczyk 1982. Gene 20:415-422）、アファミン（AFM; Lichenstein et al. 1994. J. Biol. Chem. 269:18149-18154）、およびビタミンＤ結合タンパク質（DBP; Cooke & David 1985. J. Clin. Invest. 76:2420-2424）からなる。それらの遺伝子は、ヒト、マウスおよびラットにおいて同じ染色体の領域にマッピングされた構造的および機能的な類似性を有する多重遺伝子クラスターに含まれる。アルブミンファミリーの構造的な類似性は、それらのＨＬＥＰとしての有用性を示す。従って、本発明のその他の目的は、このようなアルブミンファミリー、それらのフラグメントおよび変異体をＨＬＥＰとして使用することである。用語「変異体」は、挿入、欠失および置換を含み、これらは、所望の機能が存在する限り保存的または非保存的のいずれでもよい。

アルブミンファミリーは、それぞれのタンパク質ＡＦＰ、ＡＦＭおよびＤＢＰの全長を含んでもよいし、または治療活性を安定化または延長することができる１つまたはそれ以上のそれらのフラグメントを含んでいてもよい。このようなフラグメントの長さは、ＨＬＥＰフラグメントが少なくとも２５％の半減期の延長を与える限りにおいて、１０個またはそれより多くのアミノ酸であってもよいし、またはそれぞれのタンパク質配列の約１５個、２０個、２５個、３０個、５０個またはそれより多くの連続したアミノ酸を含んでいてもよいし、または、それぞれのタンパク質の特定のドメインの部分または全部を含んでいてもよい。本発明の挿入タンパク質のアルブミンファミリーは、ＡＦＰ、ＡＦＭおよびＤＢＰの天然に存在する多型変異体を含んでいてもよい。

ＨＬＥＰとしての免疫グロブリン
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）定常領域（Ｆｃ）が、治療用タンパク質の半減期を長くすることは、当該技術において既知である（Dumont JA et al. 2006. BioDrugs 20:151-160）。重鎖のＩｇＧ定常領域は３つのドメイン（ＣＨ１〜ＣＨ３）およびヒンジ領域からなる。この免疫グロブリン配列は、あらゆる哺乳動物から誘導することもできるし、またはそれぞれサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４から誘導することもできる。また、抗原結合ドメインを含まないＩｇＧおよびＩｇＧフラグメントも、ＨＬＥＰとして用いてもよい。治療用ポリペプチドの部分は、好ましくは抗体のヒンジ領域またはペプチド性のリンカーを介してＩｇＧまたはＩｇＧフラグメントに連結され、これらのヒンジ領域またはペプチド性のリンカーは切断可能である。数々の特許および特許出願で、治療用タンパク質のインビボでの半減期を増強するための、治療用タンパク質の免疫グロブリン定常領域への融合が記載されている。ＵＳ２００４／００８７７７８およびＷＯ２００５／００１０２５には、Ｆｃドメインまたは免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部と、生物学的に活性なペプチドとの融合タンパク質が記載されており、それはペプチドの半減期を延長し、そのペプチドはその他の点ではインビボで迅速に除去されるとする。Ｆｃ−ＩＦＮ−β融合タンパク質が増強された生物活性、長い血中半減期、およびより大きい溶解性を達成したことが記載されている（ＷＯ２００６／０００４４８）。血清中半減期が延長し、インビボでの効力が増加したＦｃ−ＥＰＯタンパク質が記載されており（ＷＯ２００５／０６３８０８）、さらにＦｃと、Ｇ−ＣＳＦ（ＷＯ２００３／０７６５６７）、グルカゴン様ペプチド−１（ＷＯ２００５／０００８９２）、凝固因子（ＷＯ２００４／１０１７４０）、およびインターロイキン−１０（ＵＳ６，４０３，０７７）との融合も記載されており、いずれも半減期が増強された特性を示している。

凝固因子
本明細書で用いられる用語「凝固因子」は、血液凝固因子を意味する。凝固因子としては、第ＶＩＩＩ因子、フォン−ビルブランド因子、プロトロンビン因子（第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、および、プロトロンビンを含む）、および凝固因子Ｖが挙げられる。

また、本発明の凝固因子は、野生型凝固因子の変異体であってもよい。用語「変異体」は、挿入、欠失および置換を含み、これらは保存的または非保存的のいずれでもよく、ここでこのような変化によっては、それぞれの凝固因子の生物活性を付与する活性部位または活性ドメインは実質的に変更されない。

ＦＶＩＩＩ
用語「血液凝固第ＶＩＩＩ因子」、「第ＶＩＩＩ因子」および「ＦＶＩＩＩ」は、本明細書において交換可能に用いられる。「血液凝固第ＶＩＩＩ因子」は、野生型の血液凝固第ＶＩＩＩ因子、および野生型の血液凝固第ＶＩＩＩ因子の凝血促進活性を有する野生型の血液凝固第ＶＩＩＩ因子の誘導体を含む。誘導体は、野生型第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列と比較して欠失、挿入および／または付加を含んでいてもよい。用語ＦＶＩＩＩは、第ＶＩＩＩ因子のタンパク質分解によってプロセシングされた形態を含み、例えば重鎖と軽鎖とを含む活性化前の形態を含む。

用語「第ＶＩＩＩ因子」は、野生型の第ＶＩＩＩ因子の生物活性の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％を有する第ＶＩＩＩ因子のあらゆる変異体または突然変異体を含む。

非限定的な例として、第ＶＩＩＩ因子の分子としては、ＡＰＣ切断を防ぐか、または減少させる第ＶＩＩＩ因子の突然変異体（Amano 1998. Thromb. Haemost. 79:557-563）、Ａ２ドメインをさらに安定化する第ＶＩＩＩ因子の突然変異体（ＷＯ９７／４０１４５）、発現の増加をもたらすＦＶＩＩＩ突然変異体（Swaroop et al. 1997. JBC 272:24121-24124）、その免疫原性を減少させる第ＶＩＩＩ因子の突然変異体（Lollar 1999. Thromb. Haemost. 82:505-508）、別々に発現された重鎖および軽鎖から再構築されたＦＶＩＩＩ（Oh et al. 1999. Exp. Mol. Med. 31:95-100）、受容体への結合を減少させてＨＳＰＧ（ヘパラン硫酸プロテオグリカン）および／またはＬＲＰ（低密度リポタンパク質受容体関連のタンパク質）のようなＦＶＩＩＩの異化をもたらす、ＦＶＩＩＩ突然変異体（Ananyeva et al. 2001. TCM, 11:251-257）、ジスルフィド結合で安定化したＦＶＩＩＩ変異体（Gale et al., 2006. J. Thromb. Hemost. 4:1315-1322）、改善された分泌特性を有するＦＶＩＩＩ突然変異体（Miao et al., 2004. Blood 103:3412-3419）、高い補因子特異的な活性を有するＦＶＩＩＩ突然変異体（Wakabayashi et al., 2005. Biochemistry 44:10298-304）、改善された生合成および分泌、減少したＥＲシャペロンとの相互作用、改善されたＥＲ−ゴルジ輸送、高い活性化または不活性化への耐性、および改善された半減期を示すＦＶＩＩＩ突然変異体（Pipe 2004. Sem. Thromb. Hemost. 30:227-237でまとめられている）が挙げられる。これらの第ＶＩＩＩ因子の突然変異体および変異体は全て、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

第ＶＩＩＩ因子の生物活性を決定する適切な試験は、一段階または二段階の凝固分析（Rizza et al. 1982. Coagulation assay of FVIII:C and FIXa in Bloom ed. The Hemophilias. NY Churchchill Livingston 1992)、または発色性基質ＦＶＩＩＩ：Ｃ分析（S. Rosen, 1984. Scand J Haematol 33: 139-145, 上記）である。これらの参考文献の内容は、この参照により開示に含まれる。

ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子の成熟した野生型の形態のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および配列番号２に示す。特定の配列のアミノ酸位置が記載されている場合、これは、ＦＶＩＩＩ野生型タンパク質における前記アミノ酸の位置を意味しており、記載された配列の他の位置における突然変異（例えば欠失、挿入および／または置換）の存在を排除しない。例えば、配列番号２に記載されている「Ｇｌｕ２００４」における突然変異は、修飾された相同体において、配列番号２の１〜２３３２の位置で１個またはそれ以上のアミノ酸が失われていることを排除しない。

ＨＬＥＰが挿入されたＦＶＩＩＩタンパク質
最も一般的な意味での本発明の修飾されたＦＶＩＩＩタンパク質は、これらが、ＨＬＥＰがキメラタンパク質のＦＶＩＩＩ活性のモル比が野生型ＦＶＩＩＩのＦＶＩＩＩ活性のモル比の約１０％未満に減少しないように、ＨＬＥＰがＦＶＩＩＩ分子に統合された、ＦＶＩＩＩ分子を含むことを特徴とする。ＨＬＥＰの挿入は、ＦＶＩＩＩ配列のＮ末端アミノ酸とＣ末端アミノ酸との間のあらゆる場所で起こすことができる。好ましくは、ＨＬＥＰは、野生型ＦＶＩＩＩタンパク質のドメイン間に組み込まれる。

ＦＶＩＩＩのドメインは、以下のアミノ酸位置を含む（アミノ酸の番号は、配列番号２に従う）：
Ａ１：…１〜３３６
ａ１：…３３７〜３７２
Ａ２：…３７３〜７１０
ａ２：…７１１〜７４０
Ｂ：…７４１〜１６４８
ａ３：…１６４９〜１６８９
Ａ３：…１６９０〜２０１９
Ｃ１：…２０２０〜２１７２
Ｃ２：…２１７３〜２３３２。

ＨＬＥＰにとって好ましいＦＶＩＩＩ分子内の組込部位は、ＨＬＥＰ部分の挿入が、ＦＶＩＩＩの機能的な活性に最小の負の作用しか与えないような部位と定義される。可能性のある組込部位としては、これらに限定されないが、酸性領域１のＣ末端（ａ１）とＡ２ドメインのＮ末端との間の領域、Ａ３ドメインのＣ末端とＣ１ドメインのＮ末端との間の領域、Ｃ１ドメインのＣ末端とＣ２ドメインのＮ末端との間の領域、および好ましくはＢドメインの領域（ここでＢドメインは部分的に、またはその全体が置換されていてもよい）が挙げられる（図２）。

本発明のその他の好ましい実施態様において、本発明のキメラＦＶＩＩＩタンパク質は、Ｂドメインが部分的または完全に欠失し、さらに、ＨＬＥＰがそのアミノ末端において機能的なＡ１／Ａ２ドメインに挿入され、そのカルボキシ末端において機能的なＡ３／Ｃ１／Ｃ２ドメインに挿入されるようにＨＬＥＰがＦＶＩＩＩ分子に組込まれたＦＶＩＩＩ分子を含むことを特徴とする。

Ｂドメイン内にＨＬＥＰまたはＨＬＥＰ誘導体（ＦＶＩＩＩの生物学的機能には必須ではないように思われるＡ２ドメインととＡ３ドメインの間のＦＶＩＩＩ配列［アミノ酸７４１〜１６４８］（Pittman et al. 1992. Blood 81:2925-2935）を挿入することができ、ＦＶＩＩＩの生物活性を保持しつつ新規の改善された特性を有するＦＶＩＩＩ分子を提供できることがわかった。Ｂドメインは、約９００個のアミノ酸の長さを有し、ＨＬＥＰは、Ｂドメイン内の任意の場所に挿入されていてもよいし（Ｂドメインの欠失はない）またはＢドメインが部分的にまたはその全体がＨＬＥＰで置換されていてもよい。この部分的な欠失は、Ｂドメインの少なくとも１個のアミノ酸の欠失を意味し、好ましくは１００〜６００個のアミノ酸の欠失、最も好ましくは６００個より多いアミノ酸の欠失を意味する（図２ｅ〜ｈ）。

本発明のその他の好ましい実施態様において、Ｂドメインの多くがＨＬＥＰで置換されており、一方で、本発明のＦＶＩＩＩ分子の切断および活性化に重要なプロセシング部位を含むＢドメインのアミノおよびカルボキシ末端配列の数個のアミノ酸が保存されている（図１ａ、ｂ、ｄおよび２ｈ〜ｉ）。ＦＶＩＩＩ配列（配列番号２）のアミノ酸位置７４０におけるトロンビンのためのプロセシング部位、および分泌プロセス中にＢドメインとＡ３ドメインとの間で切断するプロテアーゼのためのプロセシング部位を保存するのに必要な、ＢドメインのＣおよびＮ末端における好ましくは約１〜２０個のアミノ酸、より好ましくは３〜１０個のアミノ酸が、本発明のＦＶＩＩＩ分子内に維持される（図１、および、図２ｈ）。あるいは、Ｂドメインから保存されるアミノ酸は、人工的な切断部位で置換されていてもよい。ＰＡＣＥ／フューリン切断部位（Nakayama 1997. Biochem. J. 327:625-635）を用いて、分泌中にプロセシングを導入してもよく、さらに、ＷＯ２００４／００５３４７（図１ｃ）で記載されているような人工的なトロンビン切断部位またはその他のプロテアーゼによる切断部位を活性化プロセシングのために導入してもよい（図１ｅ）。

本発明のその他の形態は、１個より多くのＨＬＥＰの挿入であり、ここで数回挿入されるＨＬＥＰは、同じＨＬＥＰであってもよいし、または異なるＨＬＥＰの組み合わせであってもよい。また、ＦＶＩＩＩへの１つまたはそれ以上のＨＬＥＰの挿入と、追加の１つまたはそれ以上のＨＬＥＰ（これらは、同じＨＬＥＰでもよいし、または異なるＨＬＥＰの組み合わせでもよい）のＮおよび／またはＣ末端の融合との組み合わせも、本発明に包含される。

生体内で凝固の間に凝固因子が内因的に活性化されると、それにより血栓性合併症が生じる可能性があるので、目下の活性型凝固因子の高い機能的な半減期を維持することはもはや望ましくなくなる場合があり、このような血栓性合併症は、すでにＦＶＩＩａとしての野生型の活性型凝固因子に関して症例があり（Aledort 2004. J Thromb Haemost 2:1700-1708）、さらに、活性型の因子が長い機能的な半減期を有する可能性がある場合にはよりいっそう問題となる。従って、本発明のその他の目的は、生体内での内因性の活性化の後に、または補因子が利用可能になった後に、未修飾のＦＶＩＩＩの機能的な半減期と同等の機能的な半減期を有する、長寿命の第ＶＩＩＩ凝固因子分子を提供することである。これは、非限定的な例を挙げれば、ＦＶＩＩＩ配列（配列番号２）のアミノ酸位置７４０でトロンビンのための切断部位、および分泌プロセス中にＢドメインとＡ３ドメインとの間を切断するプロテアーゼのための切断部位を維持することによって達成することができる。このようなＦＶＩＩＩ−ＨＬＥＰが連結した配列を用いれば、本発明のＦＶＩＩＩキメラタンパク質を活性化することによって、それに伴いＦＶＩＩＩａがＨＬＥＰ部分から完全に分離されることになる。

しかしながら、本発明のなおその他の実施態様において、切断を防ぐために１個またはそれ以上のＡｒｇ７４０（例えば、図２ｉ）および／またはＡｒｇ３７２でタンパク質分解による切断部位、好ましくはトロンビンによる切断部位が、突然変異または欠失しており、それにより、活性化された分子であるとともに増強された機能的な半減期等の改善された特性を示す挿入タンパク質が生じる。

本発明のその他の実施態様において、Ｂドメインの欠失は、端にある酸性領域ａ２およびａ３（図２ｋおよびｌ）に及んでもよい。ａ２に関して、この領域は、部分的に欠失していてもよいし（図２ｋ）、または、完全に欠失していてもよい。従って、ＨＬＥＰ部分は、ＦＶＩＩＩが活性化されても放出されないが、その代わりにＡ２ドメインに結合したままになる。このような活性型の挿入タンパク質は、増強された機能的な半減期を有すると予想される。酸性領域ａ３は、ａ３のｖＷＦ結合特性が影響を受けない限り、部分的に欠失していてもよい（図２ｌ）。

本発明の一実施態様において、ＦＶＩＩＩ分子内のその他の可能性のある組込部位の一つは、酸性領域１（ａ１）のＣ末端とＡ２ドメインのＮ末端との間の領域である（図２ａ〜ｄ）。図２ａには、アルブミンのＣ末端に追加のトロンビン切断部位が導入される組込スキームが説明されている。このような挿入タンパク質において、ＨＬＥＰ部分は、インビボでの内因性のＦＶＩＩＩ活性化の間に切断されて除去され、活性型ＦＶＩＩＩ分子は、野生型ＦＶＩＩＩと同等の機能的な半減期を有する。図２ｂで示すような挿入タンパク質の場合では、ＨＬＥＰのＣ末端における追加のトロンビン切断部位は、欠失している。従って、ＨＬＥＰは、ＦＶＩＩＩが活性化されても放出されないが、その代わりにＡ２ドメインに結合したままになる。このような活性型の挿入タンパク質は、増強された機能的な半減期を有する。図２ｃで示すような挿入タンパク質の場合では、Ａｒｇ３７２におけるトロンビン切断部位が欠失している。従って、ＨＬＥＰは、ＦＶＩＩＩが活性化されても放出されないが、その代わりにＡ１ドメインに結合したままになる。このような活性型の挿入タンパク質は、増強された半減期を有する。図２ｄで示すような挿入タンパク質は、共有結合で連結されたＡ１およびＡ２ドメインを維持し、同様に活性型の機能的な半減期の延長を示す挿入タンパク質を生成する。

本発明のその他の実施態様において、ＦＶＩＩＩ分子内のその他の可能性のある組込部位の一つは、Ａ３ドメインのＣ末端とＣ１ドメインのＮ末端との間の領域である（図２ｍ）。このような挿入タンパク質では、ＨＬＥＰ部分は、ＦＶＩＩＩ軽鎖の組込まれた構成要素であり、さらに、活性化されていない、および活性型の挿入タンパク質の両方が増強された機能的な半減期を有する。

本発明のその他の実施態様において、ＦＶＩＩＩ分子内のその他の可能性のある組込部位の一つは、Ｃ１ドメインのＣ末端とＣ２ドメインのＮ末端との間の領域である（図２ｎ）。このような挿入タンパク質において、ＨＬＥＰ部分は、ＦＶＩＩＩ軽鎖の組込まれた構成要素であり、さらに、活性化されていない、および活性型の挿入タンパク質の両方が増強された機能的な半減期を有する。

本発明のその他の実施態様において、本発明のＦＶＩＩＩタンパク質は、２つの別々の鎖として発現される可能性もある（下記を参照）。

本発明に係る修飾された第ＶＩＩＩ凝固因子は、単鎖ポリペプチドであってもよいし、またはタンパク質分解でのプロセシングによって、非共有結合を介して結合した２または３種のポリペプチド鎖で構成されていてもよい。

本発明のその他の実施態様において、ＰＡＣＥ／フューリン切断部位（Ａｒｇ１６４８、例えば図１ａ）におけるアミノ酸またはその付近のアミノ酸は、ＰＡＣＥ／フューリンによる切断を防ぐために突然変異しているか、または欠失している。それにより、改善された半減期を有する単鎖の第ＶＩＩＩ因子／ＨＬＥＰ融合分子が生じると考えられる。

本発明の一実施態様において、本発明の修飾されたＦＶＩＩＩは、それに対応する組込まれたＨＬＥＰを含まないＦＶＩＩＩの形態、および／または野生型ＦＶＩＩＩと比較して増加した機能的な半減期を示す。例えば、機能的な半減期は、インビボで、ＦＶＩＩＩノックアウトマウスのような血友病Ａの動物モデルを用いて決定することができ、この場合、野生型ＦＶＩＩＩと比較して長く持続する止血効果が予想される。このような止血効果は、例えば、尾を切ってから出血が止まるまでの時間を測定することによって試験できる。

機能的な半減期は、ＦＶＩＩＩのＨＬＥＰを含まない形態、および／または野生型の形態と比較して、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも１００％増加する。

本発明のその他の実施態様において、本発明の修飾されたＦＶＩＩＩは、それに対応する組込まれたＨＬＥＰを含まないＦＶＩＩＩの形態、および／または野生型の形態のＦＶＩＩＩと比較して改善されたインビボでの回収を示す。インビボでの回収は、インビボで、正常な動物、または、ＦＶＩＩＩノックアウトマウスのような血友病Ａの動物モデルにおいて決定することができ、この場合、血中で、静脈内投与後に短時間で（５〜１０分間．）抗原または活性分析によって、本発明の修飾されたＦＶＩＩＩのパーセンテージが、それに対応する組込まれたＨＬＥＰを含まないＦＶＩＩＩの形態および／または野生型の形態のＦＶＩＩＩと比較して増加したことが確認されると予想される。

インビボでの回収は、ＦＶＩＩＩのＨＬＥＰを含まない形態、および／または野生型の形態と比較して、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、および、さらにより好ましくは少なくとも４０％増加する。

さらにその他の本発明の実施態様において、免疫グロブリン定常領域またはそれらの部分が、ＨＬＥＰとして用いられる。好ましくは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインで構成されるＦｃ領域、ならびに、ＩｇＧの、より好ましくはＩｇＧ１のヒンジ領域、またはそれらのフラグメントもしくは変異体が用いられ、ここで変異体としては、新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合を増強する突然変異が挙げられる。Ｆｃ領域は、当業界で説明されているような単量体または二量体Ｆｃの挿入を形成するのには用いられないが、むしろＦＶＩＩＩ分子の一部がそのＮ末端に融合し、その他の部分がそのＣ末端に融合するようにＦＶＩＩＩ分子に挿入される（図２ａ〜ｎ）。本発明のその他の好ましい実施態様において、融合していないＦｃ領域は、他の発現ベクターからまたは同じ発現ベクターからでも共発現され（coexpresed）、それにより、ジスルフィド架橋結合を介して、キメラＦＶＩＩＩ分子内にＦｃ領域を有するＦｃヘテロ二量体が形成される。

ＦＶＩＩＩの機能的な半減期の延長に加えて、本発明で説明されているようなＨＬＥＰ成分はまた、半減期の延長という同じ目的のために、他のマルチドメインタンパク質内に挿入するために用いてもよい。

従って、本発明はまた、他の修飾タンパク質も包含し、好ましくはそれらのアミノ酸配列内にＨＬＥＰ成分が挿入された修飾された凝固因子も包含する。

フォン−ビルブランド因子
フォン−ビルブランド因子（ｖＷＦ）は、一次的な血流遮断において傑出した役割を有する多量体の血漿糖タンパク質である。その成熟タンパク質は２０５０個のアミノ酸からなり、Ｄ’−Ｄ３−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ｄ４−Ｂ１−Ｂ２−Ｂ３−Ｃ１−Ｃ２−ＣＫの順に配置された相同ドメインで構成される。野生型ｖＷＦのアミノ酸配列およびｃＤＮＡ配列は、Collins et al. 1987. Proc Natl. Acad. Sci. USA 84:4393-4397に記載されている。用語「フォン−ビルブランド因子」は、野生型ｖＷＦの生物活性の、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも７５％を有する野生型ｖＷＦのあらゆる突然変異体および変異体を含む。野生型ｖＷＦの生物活性は、当業者によって、リストセチン補因子活性分析（Federici AB et al. 2004. Haematologica 89:77-85）、ｖＷＦの血小板糖タンパク質複合体Ｉｂ−Ｖ−ＩＸのＧＰＩｂαへの結合分析（Sucker et al. 2006. Clin Appl Thromb Hemost. 12:305-310）、またはコラーゲン結合分析（Kallas & Talpsep. 2001. Annals of Hematology 80:466-471）の方法を用いて決定することができる。

１つまたはそれ以上のＨＬＥＰが、ｖＷＦ分子に挿入されていてもよい。ＨＬＥＰ挿入は、ｖＷＦの、例えばＦＶＩＩＩ、血小板、ヘパリンまたはコラーゲンへの結合性能に干渉しないように選択される。適切な挿入部位としては、これらに限定されないが、Ｄ３−Ａ１ジャンクション、Ｄ４−Ｂ１ジャンクション、Ｃ２−ＣＫジャンクション、加えて、Ａ２（Ａ２ドメインを部分的または完全に除去する際に、そこにＨＬＥＰ部分を挿入することができる）が挙げられる。ｖＷＦの機能的な活性は、上記で説明されているようにして評価してもよい。

プロトロンビン因子
プロトロンビン因子は、例えば第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、プロテインＣ（ＰＣ）、プロテインＳ、プロテインＺ、およびプロトロンビン（ＰＴ）であり、これらは、軽鎖のγ−カルボキシル化されたグルタミン酸残基、およびＥＧＦまたはクリングル領域を含むｇｌａドメインを特徴とするタンパク質のファミリーであり、このｇｌａドメインは、タンパク質が活性化されると切断される短い介在配列によってトリプシンプロテアーゼドメイン（プロテインＳに関する２つのラミニン−Ｇドメイン）を含む重鎖から分離される。

これらの凝固因子のアミノ酸配列およびｃＤＮＡ配列は当技術で既知であり、例えば、ＰｕｂＭｅｄタンパク質配列ライブラリー（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Protein）において、登録番号ＮＰ＿０００１２２（ＦＶＩＩ）、ＮＰ＿０００１２４（ＦＩＸ）、ＮＰ＿０００４９５（ＦＸ）、ＮＰ＿０００３０３（ＰＣ）、ＮＰ＿０００３０４（プロテインＳ）、ＮＰ＿００３８８２（プロテインＺ）、およびＮＰ＿０００４９７（プロトロンビン）として開示されている。

またプロトロンビン因子は、本発明で説明されているようなＨＬＥＰ部分の挿入で安定化することもできる。プロトロンビン因子としては、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、プロテインＣ（ＰＣ）、プロテインＳ、プロテインＺ、およびプロトロンビン（ＰＴ）が挙げられる。上記で説明されているように、プロトロンビン因子は、軽鎖にγ−カルボキシレート化グルタミン酸残基、およびＥＧＦまたはクリングル領域を含むｇｌａドメインを特徴とし、このｇｌａドメインは、タンパク質が活性化されると切断される短い介在配列によってトリプシンプロテアーゼドメイン（プロテインＳの場合は２ラミニン−Ｇドメイン）を含む重鎖から分離される。このペプチド配列は、ＨＬＥＰ部分に関して好ましい組込部位である。好ましくは、ＨＬＥＰは、天然の活性化配列を維持することによって、あるいは、ＰＡＣＥ／フューリン切断部位（Nakayama 1997. Biochem. J. 327:625-635）、人工トロンビン切断部位（例えばＷＯ２００４／００５３４７で説明されているもの）、またはその他の適切なプロテアーゼによる切断部位のような人工の切断部位を挿入することによって、活性化による切断が妨害されないように挿入される。ＨＬＥＰ挿入後にそれぞれのプロトロンビン因子の活性の保存は、当業者既知の分析によって評価することができる。ＦＶＩＩ活性は、Seligsohn等（1978. Blood 52:978-988）によって説明された方法に基き、市販のクロモジェニック試験キット（クロモジェニックス・コアセットＦＶＩＩ（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｓｅｔ ＦＶＩＩ）を用いて決定してもよいし、ＦＶＩＩａ活性は、スタクロット（ＳＴＡＣＬＯＴ）（Ｒ）ＦＶＩＩａ−ｒＴＦキット（ダイアグノスティカ・スターゴ）を用いて、Morissey et al.(1993. Blood 81:734-744)で記載されている方法に基づき決定することができる。ＦＩＸ活性は、Chavin & Weidner(1984. J. Biol. Chem. 259:3387-3390)によって説明されているような凝固分析によって評価することもできる。ＦＸ活性は、Van Wijk et al.(1981. Thromb. Res. 22:681-686)によって記載されているような発色分析を用いて測定することもできる。プロテインＣ活性は、Comb et al.(1984. Blood 63:15-21)で説明されている方法に基づき、インスツルメンテーション・ラボラトリーが供給しているような発色分析（ＨａｅｍｏｓＩＬプロテインＣ）によって評価することもでき、さらに、プロテインＳ活性は、Heeb et al.(2006. J. Thromb. Haemost. 4:385-391)で説明されている方法によって評価することもできる。Petrovan et al.(1999. Am. J. Clin. Pathol. 112:705-711は、プロトロンビンの活性分析を説明しており、Tabatabai et al.(2001. Thromb. Haemost. 85:655-660)は、プロテインＺの活性分析を公開している。

凝固因子Ｖ
凝固因子Ｖ（ＦＶ）は、高分子量の血漿糖タンパク質であり、Ｘａ因子によるプロトロンビンの活性化において補因子として関与する。これは第ＶＩＩＩ因子、およびセルロプラスミンと相同であり、Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２で示される類似のドメイン構造を有する。野生型ＦＶのアミノ酸配列およびｃＤＮＡ配列は、ＰｕｂＭｅｄにおいて、例えばそれぞれ登録番号ＮＰ＿０００１２１、および、ＮＭ＿０００１３０として開示されている。

第ＶＩＩＩ因子に関して上述したように、半減期を延長させるために、ＨＬＥＰ成分をＦＶ分子に挿入してもよく、これは、同等のドメイン間部位で、好ましくはＢドメインに挿入されるか、または、Ｂドメインの部分または全部を置換してもよい。ＦＶ活性は、Bick et al.(1973. Beitr. Pathol. 150:311-315)によって記載されているようにして評価することができる。

ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本願において説明されているような修飾された凝固因子、好ましくは修飾されたＦＶＩＩＩ変異体をコードするポリヌクレオチドに関する。用語「ポリヌクレオチド」は、一般的に、あらゆるポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味し、例えば、未修飾のＲＮＡもしくはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡでもよいし、または二本鎖ＤＮＡでもよく、一本鎖ＤＮＡでもよいし、または二本鎖ＲＮＡでもよい。また本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」は、１個またはそれ以上の修飾された塩基および／または通常とは異なる塩基（例えばイノシン）を含むＤＮＡまたはＲＮＡも含む。当然のことながら、ＤＮＡおよびＲＮＡに、当業者既知の多くの有用な目的に役立つ様々な改変を施してもよい。用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書において用いられる場合、このような化学的、酵素的または代謝的に修飾されたポリヌクレオチドの形態、ならびにウイルスおよび細胞（例えば単細胞および多細胞）に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学形態を包含する。

当業者であれば当然に理解していることであるが、遺伝子コードの縮重のために、所定のポリペプチドは、異なるポリヌクレオチドによってコードされることもある。これらの「変異体」も本発明に包含される。

好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。用語「単離された」ポリヌクレオチドは、例えば、これらに限定されないが、他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡなどの他の核酸配列を実質的に含まないポリヌクレオチドを意味する。単離されたポリヌクレオチドは、宿主細胞から精製することもできる。当業者既知の従来の核酸精製法を用いて、単離されたポリヌクレオチドを得てもよい。この用語はまた、組換えポリヌクレオチド、および化学合成されたポリヌクレオチドも含む。

本発明はさらに、本発明の修飾された凝固因子を一緒にコードするポリヌクレオチド群に関する。ポリヌクレオチド群中の第一のポリヌクレオチドは、修飾された凝固因子のＮ末端部分をコードしていてもよいし、第二のポリヌクレオチドは、修飾された凝固因子のＣ末端部分をコードしていてもよい。

本発明のさらにその他の形態は、本発明に係るポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはベクターである。好ましくは、本プラスミドまたはベクターは、発現ベクターである。具体的な実施態様において、本ベクターは、ヒトの遺伝子治療に使用するためのトランスファーベクターである。

本発明はまた、上記のポリヌクレオチド群を含むプラスミドまたはベクター群にも関する。第一のプラスミドまたはベクターは、前記第一のポリヌクレオチドを含んでいてもよく、第二のプラスミドまたはベクターは、前記第二のポリヌクレオチドを含んでいてもよい。一例として、第ＶＩＩＩ凝固因子について言えば、第一の発現ベクターに、シグナルペプチド、Ａ１およびＡ２ドメイン、Ｂドメイン配列の残り、ならびにＨＬＥＰのコード配列をクローニングしてもよく、第二の発現ベクターに、適切なシグナルペプチド配列を有するＡ３、Ｃ１およびＣ２のコード配列をクローニングしてもよい（図２ｏ）。これら両方の発現ベクターが適切な宿主細胞に共にトランスフェクションされると、本発明のＦＶＩＩＩ分子の軽鎖および重鎖の発現、ならびに機能的なタンパク質の形成が起こる。

あるいは、ＦＶＩＩＩシグナルペプチド、Ａ１およびＡ２ドメインのコード配列が、第一の発現ベクターにクローニングされ、適切なシグナルペプチド配列を含むＨＬＥＰ、ＦＶＩＩＩＡ３、Ｃ１およびＣ２のコード配列が、第二の発現ベクターにクローニングされる（図２ｐ）。両方の発現ベクターは、適切な宿主細胞に共にトランスフェクションされると、本発明のＦＶＩＩＩ分子の軽鎖および重鎖の発現、および、機能的なタンパク質の形成が起こる。

あるいは、両方のコード配列を１つの発現ベクターにクローニングしてもよく、両方のＦＶＩＩＩ鎖の発現を稼働させることは、２つの別々のプロモーター配列を用いるか、または１つのプロモーターと、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）要素とを用いるかのいずれかによってなされる。

本発明のさらにその他の形態は、本明細書において説明されているような本発明のポリヌクレオチド、プラスミドもしくはベクター、またはポリヌクレオチド群、またはプラスミドもしくはベクター群を含む宿主細胞である。

本発明の宿主細胞は、修飾された凝固因子の製造方法、好ましくは修飾されたＦＶＩＩＩ分子の製造方法において用いてもよく、これも本発明の一部である。本方法は、以下を含む：
（ａ）本発明の宿主細胞を、所望の挿入タンパク質が発現されるような条件下で培養すること；および、
（ｂ）場合により、宿主細胞または培地から所望の挿入タンパク質を回収すること。

本発明の修飾された凝固因子を精製して、８０％以上の純度にすることが好ましく、より好ましくは９５％以上の純度であり、特に好ましくは、高分子（具体的には他のタンパク質および核酸）の混入に関して９９．９％よりも高い純度を有し、感染性のおよび発熱性の物質を含まない製薬学的に純粋な状態である。好ましくは、単離された、または、精製された本発明の修飾された凝固因子は、他の無関係のポリペプチドを実質的に含まない。

様々な本発明の生産物が薬剤として有用である。従って、本発明は、本明細書において説明されているような修飾された凝固因子、好ましくは修飾されたＦＶＩＩＩ分子、本発明のポリヌクレオチド、または、本発明のプラスミドまたはベクターを含む薬剤組成物に関する。

本発明はまた、血友病ＡまたはＢのような血液凝固障害に罹った個体の治療方法に関する。本方法は、前記個体に、本明細書において説明されているような修飾された凝固因子、好ましくは修飾されたＦＶＩＩＩまたはＦＩＸの有効量を投与することを含む。その他の実施態様において、本方法は、個体に、有効量の本発明のポリヌクレオチド、または本発明のプラスミドまたはベクターを投与することを含む。あるいは本方法は、個体に有効量の本明細書において説明される本発明の宿主細胞を投与することを含んでもよい。

本発明はまた、上述のような修飾されたｖＷＦおよびプロトロンビン因子変異体をコードするポリヌクレオチド、およびそれらの使用にも関する。

提案の突然変異体の発現
適切な宿主細胞中での組換え突然変異タンパク質の高レベルの生産は、当業者既知の方法に従って、様々な発現系で増殖することができる組換え発現ベクターで、上述の修飾されたｃＤＮＡを、適切な調節因子と共に効率的な転写単位に構築することを必要とする。効率的な転写調節要素は、ウイルスを有する動物細胞（それらの天然宿主として）から、または、動物細胞の染色体ＤＮＡから誘導することができる。好ましくは、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、ヒトサイトメガロウイルスまたはラウス肉腫ウイルスのロングターミナルリピートから誘導されたプロモーターとエンハンサーとの組み合わせを用いてもよいし、またはベータ−アクチンまたはＧＲＰ７８のような動物細胞中で強く構成的に転写される遺伝子を含むプロモーターとエンハンサーとの組み合わせを用いてもよい。ｃＤＮＡから転写された安定した高レベルのｍＲＮＡを達成するためには、転写単位の３’近傍に、転写終結−ポリアデニル化配列をコードするＤＮＡ領域を含ませるべきである。好ましくは、この配列は、シミアンウイルス４０の初期転写領域、ウサギベータ−グロビン遺伝子、または、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子の遺伝子から誘導される。

続いてｃＤＮＡは、第ＶＩＩＩ因子タンパク質を発現させるのに適した宿主細胞系のゲノムに組込まれる。この細胞系は、好ましくは正しいフォールディング、ジスルフィド結合の形成、アスパラギン結合型糖付加およびその他の翻訳後修飾、および培地への分泌を確実にするために、脊椎動物起源の動物細胞系である。他の翻訳後修飾の例は、チロシンＯ−硫酸化、および新生のポリペプチド鎖のタンパク質分解によるプロセシングである。使用可能な細胞系の例は、サルＣＯＳ−細胞、マウスＬ−細胞、マウスＣ１２７−細胞、ハムスターＢＨＫ−２１細胞、ヒト胎児腎臓２９３細胞、およびハムスターＣＨＯ−細胞である。

それに対応するｃＤＮＡをコードする組換え発現ベクターは、多種多様な方法で動物細胞系に導入することができる。例えば、組換え発現ベクターは、様々な動物ウイルスに基づくベクターから作製することができる。これらの例は、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスをベースとしたベクターであり、好ましくはウシパピローマウイルスをベースとしたベクターである。

また、組換えＤＮＡがそれらのゲノムに統合された特定の細胞クローンの単離を容易にするために、それに対応するＤＮＡをコードするの転写単位を、これらの細胞中で優勢な選択マーカーとして機能する可能性があるその他の組換え遺伝子と共に動物細胞に導入してもよい。このタイプの優勢な選択マーカー遺伝子の例は、ゲネチシン（Ｇ４１８）に対する耐性を付与するＴｎ５アミノ配糖体ホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンに対する耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、およびピューロマイシンに対する耐性を付与するピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼである。このような選択マーカーをコードする組換え発現ベクターは、所望のタンパク質ｃＤＮＡをコードするものとして同じベクターに存在していてもよいし、または一緒に導入されて宿主細胞のゲノムに組込まれた別々のベクターにコードされていてもよく、その場合は、異なる転写単位間の強い物理的な結合が生じることが多い。

所望のタンパク質のｃＤＮＡと共に使用可能な他のタイプの選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）をコードする様々な転写単位をベースとしたものである。このタイプの遺伝子を、内因性ｄｈｆｒ−活性が欠失した細胞に、好ましくはＣＨＯ−細胞（ＤＵＫＸ−Ｂ１１、ＤＧ−４４）に導入すると、それによりこれらの細胞のヌクレオシドが欠失した培地中での成長が可能になる。このような培地の例は、ヒポキサンチン、チミジンおよびグリシンを含まないＨａｍ’ｓＦ１２である。これらのｄｈｆｒ−遺伝子は、上記のタイプのＣＨＯ−細胞に、第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡ転写単位と共に導入することができ、それにより、同じベクターに連結されるか、または、異なるベクターに連結されることによって、組換えタンパク質を生産するｄｈｆｒ陽性の細胞系が作出される。

細胞毒性のｄｈｆｒ−阻害剤であるメトトレキセートの存在下で上記の細胞系を増殖させる場合、メトトレキセート耐性の新しい細胞系が出現する。これらの細胞系は、連結されたｄｈｆｒの増幅数、および所望のタンパク質の転写単位のために、組換えタンパク質を高い割合で生産する可能性がある。これらの細胞系を高濃度のメトトレキセート中で（１〜１００００ｎＭ）増殖させることによって、所望のタンパク質を極めて高い割合で生産する新しい細胞系を得ることができる。

上記の所望のタンパク質を生産する細胞系は、懸濁培養中で、または様々な固体支持体上のいずれかでのラージスケールでの増殖が可能である。これらの支持体の例は、デキストランもしくはコラーゲンマトリックスベースのマイクロキャリアー、または中空糸の形態の固体支持体、または様々なセラミック材料である。細胞懸濁培養で、またはマイクロキャリアー上で増殖させた場合、上記の細胞系の培養は、バッチ（bath）培養として行ってもよいし、または調整培地を長期間にわたり連続生産するかん流（perfusion）培養として行ってもよい。従って、本発明によれば、上記の細胞系は、所望の組換え突然変異タンパク質を生産するための工業用プロセスの開発によく適している。

精製および調合物
上記のタイプの分泌細胞の溶媒中に蓄積する組換え突然変異タンパク質は、様々な生化学的方法やクロマトグラフィーによる方法によって、濃縮して精製することができ、このような方法としては、細胞培地中の望ましいタンパク質とその他の物質との、大きさ、電荷、疎水性、溶解性、特異的な親和性などの差を利用する方法が挙げられる。

このような精製の例は、例えばＨＬＥＰ、好ましくはヒトアルブミンに向けた、またはそれぞれの凝固因子に向けた固体支持体に固定したモノクローナル抗体への組換え突然変異タンパク質の吸着である。ＦＶＩＩＩ突然変異体を支持体に吸着させた後、上記の特性に基づいた様々なクロマトグラフィー技術によってタンパク質を洗浄し脱離させることによって、さらに精製することができる。精製工程の順番は、例えば、工程の能力および選択性、支持体またはその他の形態の安定性に従って選択される。好ましい精製工程としては、例えばこれらに限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー工程、免疫アフィニティークロマトグラフィー工程、アフィニティークロマトグラフィー工程、疎水性相互作用クロマトグラフィー工程、色素クロマトグラフィー工程、およびサイズ排除クロマトグラフィー工程が挙げられる。

ウイルス汚染の理論上の危険性を最小化するために、上記プロセス中に、ウイルスの有効な不活性化または除去を可能にする追加の工程を含んでいてもよい。このような工程は、例えば、液体または固体状態での熱処理、溶媒および／または洗浄剤での処理、可視光またはＵＶスペクトルにおける放射線、ガンマ放射線、または、ナノろ過である。

また、本発明の修飾されたポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）は、ヒトの遺伝子治療に使用するためのトランスファーベクターに組込まれていてもよい。

本明細書において説明される様々な実施態様は、互いに組み合わせてもよい。以下に記載のそれらの実施例で本発明をさより詳細に説明する。この本発明の具体的な実施態様を、添付の図を参照しながら説明する。

治療用途のための薬剤に、本発明で説明されているような挿入タンパク質を製剤化することができる。精製されたタンパク質は、従来の生理学的に適合する水性緩衝溶液中に溶解させてもよく、さらにここに、薬剤を提供するために場合により薬剤添加剤を添加してもよい。

このような製薬キャリアーおよび添加剤、ならびに適切な医薬製剤は当業界公知である（例えば、“Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins”, Frokjaer et al., Taylor & Francis(2000)、または、“Handbook of Pharmaceutical Excipients”, 第3版, Kibbe et al., Pharmaceutical Press(2000)を参照）。具体的には、本発明のポリペプチド変異体を含む医薬組成物は、凍結乾燥した形態、または安定した液状の形態で製剤化してもよい。ポリペプチド変異体は、当業界既知の様々な手法で凍結乾燥することができる。凍結乾燥製剤は、使用前に、１種またはそれ以上の製薬上許容できる希釈剤、例えば滅菌注射用水、または滅菌生理食塩水の添加によって再溶解される。

本組成物の製剤は、あらゆる製薬的に適切な投与手段によって個体に送達される。様々な送達システムが既知であり、任意の便利な経路によって組成物を投与するのに用いることができる。好ましくは、本発明の組成物は全身投与される。全身使用の場合、本発明の挿入タンパク質は、従来の方法に従って、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、大脳内、肺内、鼻腔内、または、経皮）、または、経腸（例えば、経口、経膣または直腸）送達用に製剤化される。最も好ましい投与経路は、静脈内および皮下投与である。本製剤は、注入またはボーラス注射によって連続投与することができる。いくつかの製剤は、遅延放出系を包含する。

本発明の挿入タンパク質は、治療上有効な用量で患者に投与されるが、この治療上有効な用量は、耐え難い副作用を引き起こす用量に達することなく治療される状態もしくは徴候の重症度または拡大を予防または軽減するといった望ましい作用を生じさせるのに十分な用量を意味する。正確な用量は、適応症、製剤、投与様式などの多くの要因に依存し、それぞれの適応症ごとに臨床前試験および臨床試験で決定しなければならない。

本発明の医薬組成物は、単独で投与してもよいし、または他の治療剤と共に投与してもよい。これらの治療剤は、同じ薬剤の一部として組み込まれていてもよい。このような治療剤の一例は、フォン−ビルブランド因子である。

図１は、ＦＶＩＩＩのＢドメインのアルブミンによる置換を示す。ＦＶＩＩＩ野生型（ＦＶＩＩＩｗｔ）、およびＢドメインがアルブミンで置換されたＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ−ＨＡ）のｃＤＮＡの構成（organisation）を概説している。ＦＶＩＩＩ−ＨＡコンストラクトにおけるＢドメインの転移配列および残存するアミノ酸を示す。アミノ酸の番号付けは、配列番号２で概説したＦＶＩＩＩ野生型配列に従う。ＤＮＡｐＦ８−１２１１におけるＣ１６３６Ｓアミノ酸の変更、およびｐＦ８−１４１３におけるＲ７４０の欠失が示されている。

図２は、本発明の修飾された第ＶＩＩＩ因子ポリペプチドをコードするｃＤＮＡの様々な実施態様を模式的に示す。上記で説明されているように、ＨＬＥＰはＦＶＩＩＩ配列内の様々な位置に挿入が可能である。

図３は、野生型ＦＶＩＩＩと比較して、組込まれたアルブミン、およびＢドメインの部分的な欠失（ＤＮＡｐＦ８−１２１１およびｐＦ８−１４１３、図１を参照）を有する２つの修飾されたＦＶＩＩＩ分子の薬物動態プロファイルを示す（実施例５を参照）。

実施例１：ＦＶＩＩＩのＢドメインがアルブミンでを置換されたＦＶＩＩＩ分子のための発現ベクターの生成
まず、複数のクローニング部位（ｐＦ８−ＦＬ）に全長ＦＶＩＩＩのｃＤＮＡ配列を含むｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３をベースとした発現プラスミド（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用いて、Ｂドメイン配列の大半を欠失させ、外来配列の挿入のための制限部位を作出した。そのために、Ａ２ドメインの一部およびＢドメインのＮ末端（フラグメント１）を増幅するために、テンプレートとしてｐＦ８−ＦＬを用いたＰＣＲ反応に、オリゴヌクレオチドＷｅ１３５６およびＷｅ１３５７（配列番号５および６）を用い、さらに、ＢドメインのＣ末端、Ａ３ドメインおよびＣ１ドメインの一部（フラグメント２）を増幅するために、テンプレートとしてｐＦ８−ＦＬを用いた他のＰＣＲ反応に、オリゴヌクレオチドＷｅ１３５８およびＷｅ１３５９（配列番号７および８）を用いた。両方のフラグメントをゲル精製した。その後フラグメント１を制限エンドヌクレアーゼＰｉｎＡＩおよびＢａｍＨ１で消化し、フラグメント２を制限エンドヌクレアーゼＰｉｎＡＩおよびＢｓｐＥＩで消化した；続いて両方のフラグメントを精製し、ｐＦ８−ＦＬにライゲーションしたが、ここでＡ２ドメインの一部、ＢおよびＡ３ドメインならびにＣ１ドメインの一部を包含するＢａｍＨ１／ＢｓｐＥＩフラグメントが除去されている。得られたプラスミドｐＦ８−ＤＢは、基本的には、主要なＢドメインの欠失を含み、ＰｉｎＡＩ部位により接合されたＮおよびＣ末端のＢドメイン配列の残りを伴った。この部位にヒトアルブミンフラグメントを挿入したが、このフラグメントは、プライマーＷｅ２５０２およびＷｅ２５０３（配列番号９および１０）、ＰｉｎＡＩ消化および精製を用いて、アルブミンｃＤＮＡでのＰＣＲ増幅によって生成されたものである。ＰｉｎＡＩ部位を除去するために、得られたプラスミドを、標準的なプロトコール（クイックチェンジＸＬ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ）部位特異的変異誘発キット，ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に従って２回の部位特異的変異誘発にかけた。このため、１回目の変異誘発に、突然変異誘発プライマーとしてオリゴヌクレオチドＷｅ２５０４およびＷｅ２５０５（配列番号１１および１２）を用い、さらに、２回目の変異誘発に、オリゴヌクレオチドＷｅ２５０６およびＷｅ２５０７（配列番号１３および１４）を用いた。最終的な発現プラスミドを、ｐＦ８−１２１０と名付けた。遊離のシステイン残基（アミノ酸１６３６、配列番号２、および、図１）を除去するために、オリゴヌクレオチドＷｅ２５０８およびＷｅ２５０９（配列番号１５および１６）を用いて部位特異的変異誘発を適用して、プラスミドｐＦ８−１２１１を得た。

標準的なプロトコール（クイックチェンジＸＬ部位特異的変異誘発キット、ストラタジーン）に従って部位特異的変異誘発を適用し、プラスミドｐＦ８−１２１１における７４０位のアルギニンを欠失させた。このため、突然変異誘発プライマーとしてオリゴヌクレオチドＷｅ２７６８およびＷｅ２７６９（配列番号１７および１８）を用いた。得られた発現プラスミドを、ｐＦ８−１４１３と名付けた。

野生型ＦＶＩＩＩコントロールとして、Ｂドメインがアミノ酸配列ＲＲＧＲで置換されたＦＶＩＩＩ分子を用い、それをコードするプラスミドをｐＦ８−４５７と名付けた。

上述のプロトコールおよびプラスミドを用いて、さらに、当業者既知の分子生物学の技術（および、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM et al.(eds.)including supplement 80, 2007年10月, ジョン・ワイリー＆サンズ社(John Wiley & Sons, Inc.)；http://www.currentprotocols.com/WileyCDA/で説明されているようにして）を適用することによって、技術者は、図２で説明された位置にＨＬＥＰ分子、および図１ｂ〜ｅで典型例として示したリンカー配列が挿入された他のコンストラクトを作製することができる。

実施例２：ＦＶＩＩＩのＢドメインが免疫グロブリン定常領域で置換されたＦＶＩＩＩ分子のための発現ベクターの作製
ＩｇＧＦｃドメインのＢドメインの大半を置換するＦＶＩＩＩ分子への挿入を、上述のプロトコールおよび参考文献と同様にして行った。得られたプラスミドをｐＦ８−１５１８と名付け、これから翻訳された成熟タンパク質を配列番号１９に示す。

新生Ｆｃ受容体によるＩｇＧの再利用はＦｃが二量体である場合にのみ行われるため、ＨＥＫ−２９３細胞に、ｐＦ８−１５１８を、ヒト免疫グロブリンＧ重鎖領域をコードするプラスミド（ｐ１３３５、配列番号２０）と共にトランスフェクションした。プラスミドｐＦ８−１５１８とｐ１３３５との共発現により、機能的なＦＶＩＩＩ分子の発現が起こった（表１）。

コンストラクトのその他のセットで、ＦＶＩＩＩ重鎖および軽鎖を別々に発現させた。そのため、ＩｇＧ重鎖配列の３’末端の先端に停止コドンを導入することによってｐＦ８−１５１８を突然変異させた。このようなコンストラクト（ｐＦ８−１５１５）の発現により、Ｂドメインの数個のアミノ酸、続いてＩｇＧ重鎖を有するＦＶＩＩＩ重鎖（Ａ１およびＡ２ドメイン）が得られた（配列番号２１）。またＦＶＩＩＩ軽鎖コンストラクトも、プラスミドｐＦ８−１５１８をベースとしており、この場合、Ａ１およびＡ２ドメインのコード配列が、シグナルペプチドで置換されている。このようなコンストラクト（ｐＦ８−１５１７）の発現により、Ｎ末端に結合したＩｇＧ重鎖を有するＦＶＩＩＩ軽鎖が得られた（配列番号２２）。プラスミドｐＦ８−１５１５およびｐＦ８−１５１７の共発現により、機能的なＦＶＩＩＩ分子が発現された（表１）。

実施例３：ＦＶＩＩＩ突然変異体のトランスフェクションおよび発現
Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で発現プラスミドを増殖させ、標準的なプロトコール（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて精製した。ＨＥＫ−２９３細胞をリポフェクトアミン２０００試薬（インビトロジェン）を用いてトランスフェクションし、無血清培地（インビトロジェン２９３エクスプレス（Ｅｘｐｒｅｓｓ））中で、４μｇ／ｍｌのピューロマイシン、および場合により０．５ＩＵ／ｍｌのｖＷＦの存在下で増殖させた。トランスフェクションされた細胞群をＴ−フラスコを介してローラーボトルまたは小規模の発酵槽内に広げ、それから精製のために上清を採取した。

表１に、図１および２で概説し、実施例１および２で説明した多数のコンストラクトの発現データを掲記した。特に他の指定がない限り、用いられるＨＬＥＰはアルブミンである。

実施例４：第ＶＩＩＩ因子の突然変異体の精製
キメラの第ＶＩＩＩ因子分子を含む発現上清に、ＦＶＩＩＩ活性がほぼ完全に結合するのに十分な量の免疫アフィニティー樹脂を添加した。適切な抗ＦＶＩＩＩＭＡｂを、支持体として用いられるセファクリルＳ１０００樹脂に共有結合させて、免疫アフィニティー樹脂を調製した。樹脂を洗浄した後に、クロマトグラフィーカラムに樹脂を充填し、再度洗浄した。２５０ｍＭのＣａＣｌ₂、および、５０％エチレングリコールを含む緩衝液を用いて溶離を行った。

ＦＶＩＩＩ：Ｃ活性を含む免疫アフィニティークロマトグラフィー（ＩＡＣ）分画をプールし、調整緩衝液（賦形剤：塩化ナトリウム、スクロース、ヒスチジン、塩化カルシウム、およびトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０）に対して透析し、濃縮した。サンプルを凍結保存するか、または適切な凍結乾燥サイクルを用いて凍結乾燥させた。表２は、ＦＶＩＩＩ突然変異体（ＨＥＫ−２９３由来のｐＦ８−１２１１）、および主要な精製工程としてＩＡＣを用いた精製を行った結果を示す。

あるいは、ＦＶＩＩＩを含む細胞培養上清を、第一のイオン交換クロマトグラフィーによって濃縮／精製し、続いて免疫アフィニティークロマトグラフィー（ＩＡＣ）を用いてさらに精製した。この場合、イオン交換クロマトグラフィーの溶出液を上述の樹脂を用いてＩＡＣカラムにローディングした。

実施例５：キメラ第ＶＩＩＩ因子の活性および抗原の分析
インビトロでのＦＶＩＩＩ：Ｃの活性を決定するために、凝固分析（例えば、パトロムチンＳＬ（Ｐａｔｈｒｏｍｔｉｎ ＳＬ）試薬およびＦＶＩＩＩ欠乏血漿、ドイツのデイド・ベーリングから送付された）、または発色分析（例えば、コアマティック（Ｃｏａｍａｔｉｃ）ＦＶＩＩＩ：Ｃアッセイ、ヘモクロム（Ｈａｅｍｏｃｈｒｏｍ）から送付された）のいずれかを用いた。これらの分析を製造元の説明書に従って行った。

ＦＶＩＩＩ抗原（ＦＶＩＩＩ：Ａｇ）をＥＬＩＳＡによって決定したが、ＥＬＩＳＡの性能は当業者公知である。簡単に言えば、マイクロプレートを、１００μＬ／ウェルのキャプチャー抗体（ヒツジ抗ヒトＦＶＩＩＩ ＩｇＧ、セダレーン（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）ＣＬ２００３５Ｋ−Ｃ、これを緩衝液Ａ［シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｃ３０４１］で１：２００に希釈した）と周囲温度で２時間インキュベートした。プレートを緩衝液Ｂ（シグマＰ３５６３）で３回洗浄した後、サンプル希釈用緩衝液（セダレーン）を用いた試験サンプルの連続希釈液、加えて、サンプル希釈用緩衝液（１ウェルあたりの量は１００μＬ）を用いたＦＶＩＩＩ標準（ＺＬＢベーリング（ＺＬＢ Ｂｅｈｒｉｎｇ）；２００〜２ｍＵ／ｍＬ）の連続希釈液を周囲温度で２時間インキュベートした。緩衝液Ｂで３回洗浄する工程の後、各ウェルに、検出抗体（ヒツジ抗ヒトＦＶＩＩＩＩｇＧ、セダレーン（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）ＣＬ２００３５Ｋ−Ｄ、ペルオキシダーゼ標識）の緩衝液Ｂでの１：２希釈液１００μＬを添加し、周囲温度でさらに１時間インキュベートした。緩衝液Ｂで３回洗浄する工程の後、基質溶液（１：１０（ｖ／ｖ）ＴＭＢ ＯＵＶＦ：ＴＭＢ緩衝液ＯＵＶＧ、デイド・ベーリング）１００μＬ／ウェルを添加し、暗所で周囲温度で３０分間インキュベートした。停止溶液（デイド・ベーリング、ＯＳＦＡ）１００μＬを添加することによって、適切なマイクロプレートリーダーで波長４５０ｎｍで読み取るためのサンプルを製造した。次に、参照としてＦＶＩＩＩ標準を用いた標準曲線を用いて、試験サンプルの濃度を計算した。

実施例６：ラットにおける第ＶＩＩＩ因子の突然変異体の薬物動態学
麻酔したＣＤ／ルイスラット（物質１種あたり６匹のラット）に、ＦＶＩＩＩ突然変異体を１００ＩＵ／ｋｇ体重の用量で静脈内投与した。血液サンプルを、試験物質を投与してから５分後から開始して適切な間隔で採取した。その後ＦＶＩＩＩ抗原含量を、ヒト第ＶＩＩＩ因子に特異的なＥＬＩＳＡ分析によって、または、アルブミンおよびＦＶＩＩＩそれぞれに特異的な混合型のＥＬＩＳＡによって、定量した（上記を参照）。処理群の平均値を用いて、５分後のインビボでの回収を計算した。式：ｔ_1/2＝ｌｎ２／ｋ（式中ｋは回帰線の傾きである）に従って、除去のベータ相のタイムポイントを用いて各タンパク質に関する半減期を計算した。図３に結果を示す。

２〜２４時間のキメラＦＶＩＩＩ−ＨＡコンストラクトに関して計算した最終的な半減期は、１４１３では４．９７時間であり、１２１１では６．８６時間であり、２〜８時間の野生型ＦＶＩＩＩに関して計算した最終的な半減期は、２．１７時間であった。従って、キメラＦＶＩＩＩ−ＨＡ分子に関して最終的な半減期の明らかな増加が示され、ＦＶＩＩＩの半減期が２〜３倍に増加した。

表３に示されるキメラＦＶＩＩＩ−ＨＡコンストラクト、および、野生型ＦＶＩＩＩの生物学的利用能によれば、本発明のＦＶＩＩＩ−ＨＡタンパク質の優れた生物学的利用能が示された。

実施例７：ラットにおける第ＶＩＩＩ因子の突然変異体の機能的な半減期
麻酔したＣＤ／ルイスラット（物質１種あたり６匹のラット）に、ＦＶＩＩＩ突然変異体ｐＦ８−１２１１（ＨＥＫ−２９３細胞で発現させ、ＩＡＣによって精製した）、加えて、コントロール標準（野生型ＦＶＩＩＩヘリキセートであるネクスゲン（ＮｅｘＧｅｎ））を１００ＩＵ／ｋｇ体重の用量で静脈内投与した。血液サンプルを、試験物質を投与してから５分後から開始して適切な間隔で採取した。その後、コントロール群に関して、ヒト第ＶＩＩＩ因子に特異的なＥＬＩＳＡ分析を用いてＦＶＩＩＩ抗原含量を定量した（実施例４を参照）。ラット血漿中のＦＶＩＩＩ突然変異体のＦＶＩＩＩ：Ｃ活性を測定するために、ＦＶＩＩＩ突然変異体活性を特異的に決定する分析を確立した。原則的に、ＦＶＩＩＩ突然変異体が、ラット血漿サンプルからヒトアルブミンに対して向けられた抗体を介してマイクロタイタープレートに結合したら、ＦＶＩＩＩ活性を、クロモジェニックＦＶＩＩＩ：Ｃ分析（コーテスト（Ｃｏａｔｅｓｔ）ＶＩＩＩ：Ｃ／４）によって決定した。簡単に言えば、９６−ウェルのマイクロタイタープレートを、周囲温度で一晩、キャプチャー抗体（マウス抗ヒトアルブミンＭａｂ３Ｅ８、カーボネート／ビカーボネート緩衝液で５μｇ／ｍＬに希釈した）でコーティングした。洗浄緩衝液（ＰＢＳＴ＝リン酸、０．０５％トゥイーン２０、シグマＰ３５６３を含む緩衝生理食塩水）でプレートを洗浄した後、プレートをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中の無脂肪乳を用いてブロックし、洗浄緩衝液で、続いて希釈用緩衝液（５０ｍＭのトリス×ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２の０，０５％トゥイーン２０）で再度洗浄した。サンプルを体積４０μＬ／ウェルで適用し、３７℃で１時間インキュベートした。３００ｍＭのＣａＣｌ₂を含む希釈用緩衝液、続いて希釈用緩衝液を用いて洗浄を行った。ＦＶＩＩＩ：Ｃ活性の決定は、コーテストＶＩＩＩ：Ｃ／４試薬を用いて行われた。ウェルに希釈用緩衝液１０μＬ、およびコーテストＦＩＸａ（５０μＬ）、およびＦＸ試薬を適用し、３７℃で５分間インキュベートした。次に、ＣａＣｌ₂溶液２５μＬを添加し、再度３７℃で１０分間インキュベートした。基質溶液５０μＬを添加し、さらに３７℃で１０分間インキュベートした。この工程の後、停止溶液（２０％酢酸）２５μＬを添加した。マイクロタイタープレートリーダーを用いて、４０５ｎｍにおける吸光度を読み取った。参照としてＦＶＩＩＩ突然変異体ｐＦ８−１２１１を用いて作製された標準曲線を用いて、サンプルのＦＶＩＩＩ：Ｃ濃度を計算した。

処理群のＦＶＩＩＩ：ＣそれぞれのＦＶＩＩＩ抗原の結果を用いて、それらに対応するタンパク質の最終的な半減期を計算した。２〜２４時間のキメラＦＶＩＩＩ−ＨＳＡコンストラクトであるｐＦ８−１２１１に関して計算された最終的な機能的な半減期は、４．４４時間であり、２〜８時間の野生型ＦＶＩＩＩに関して計算されたＦＶＩＩＩ抗原の最終的な半減期は、２．７５時間であった。従って、キメラＦＶＩＩＩ−ＨＳＡ分子に関してＦＶＩＩＩ：Ｃ活性の機能的な半減期の明らかな増加が示された（野生型ＦＶＩＩＩのＦＶＩＩＩ：Ａｇの最終的な半減期と比較して６１％の増加）。

実施例８：インビトロでのＦＶＩＩＩアルブミン挿入タンパク質の安定性
表４に、無血清細胞培養におけるＦＶＩＩＩアルブミン挿入タンパク質の発現試験の結果を要約する。ＨＥＫ−２９３細胞をそれぞれｐＦ８−１４３９（ＦＶＩＩＩアルブミン挿入）およびｐＦ８−４５７（ＦＶＩＩＩ野生型）で３連でトランスフェクションし、これらを等しいセル数を有するＴ８０フラスコに播種し、安定化したｖＷＦの非存在下で増殖させた。続いて、９６、１２０および１４４時間後に培養上清を採取し、ＦＶＩＩＩ活性および抗原含量に関して試験した。

この結果から、アルブミンが細胞培養中でＦＶＩＩＩ分子の組込部分として存在すると、アルブミンの安定化作用が示される。挿入タンパク質の場合、生産性は必ずしも高くなるわけではないが、ＦＶＩＩＩタンパク質の特異的な活性（活性／抗原の比率で示す）は、アルブミンがＦＶＩＩＩ分子の組込み部分である場合（図３）、野生型ＦＶＩＩＩと比較して有意に高い。

Claims (32)

1. 凝固因子の一次翻訳ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸とＣ末端のアミノ酸との間の内部領域で半減期を増強するポリペプチド（ＨＬＥＰ）の挿入を有する、修飾された凝固因子。
2. 凝固因子の一次翻訳ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸とＣ末端のアミノ酸との間の内部領域で半減期を増強するポリペプチド（ＨＬＥＰ）の挿入を有する、修飾された凝固因子であって、該修飾された凝固因子は、上記挿入がない凝固因子の機能的な半減期と比較して長い機能的な半減期を有することを特徴とする、上記因子。
3. 凝固因子の一次翻訳ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸とＣ末端のアミノ酸との間の内部領域で半減期を増強するポリペプチド（ＨＬＥＰ）の挿入を有する、修飾された凝固因子であって、該修飾された凝固因子は、上記挿入がない凝固因子の抗原の半減期と比較して、凝固因子の抗原の長い半減期を有することを特徴とする、上記因子。
4. ＨＬＥＰの挿入がない凝固因子の機能的な半減期と比較して少なくとも２５％高い機能的な半減期を有する、請求項１または２に記載の修飾された凝固因子。
5. ＨＬＥＰの挿入がない凝固因子の機能的な半減期と比較して少なくとも２５％高い凝固因子の抗原の半減期を有する、請求項３に記載の修飾された凝固因子。
6. 凝固因子が、生体内のタンパク質分解的切断による内因性活性化の間にＨＬＥＰから分離される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の修飾された凝固因子。
7. 凝固因子の一次翻訳ポリペプチドのＮ末端のアミノ酸とＣ末端のアミノ酸との間の内部領域で半減期を増強するポリペプチド（ＨＬＥＰ）の挿入を有する、修飾された凝固因子であって、該修飾された凝固因子は、上記挿入がない凝固因子のインビボでの回収と比較して改善されたインビボでの回収を示すことを特徴とする、上記因子。
8. 凝固因子のインビボでの回収が、ＨＬＥＰの挿入がない前記凝固因子のインビボでの回収と比較して少なくとも１０％高い、請求項７に記載の修飾された凝固因子。
9. 無血清培地および／または動物タンパク質を含まない培地中で、挿入がない凝固因子と比較して高い安定性を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の修飾された凝固因子。
10. 凝固因子が、ＦＶＩＩＩ、フォン−ビルブランド因子、ＦＶ、およびプロトロンビン因子からなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の修飾された凝固因子。
11. プロトロンビン因子が、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、およびプロトロンビンからなる群より選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾された凝固因子。
12. 凝固因子が、ＦＶＩＩＩである、請求項１０に記載の修飾された凝固因子。
13. ＨＬＥＰの挿入が、ＦＶＩＩＩのＢドメイン内にある、請求項１２に記載の修飾された凝固因子。
14. ＨＬＥＰの挿入が、ＦＶＩＩＩのＢドメイン内にあり、Ｂドメインの７５％より多くが欠失しているか、またはリンカーペプチドで置換されている、請求項１３に記載の修飾された凝固因子。
15. 挿入がない凝固因子の生物活性の少なくとも１０％を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の修飾された凝固因子。
16. 半減期を増強するポリペプチドが、アルブミンファミリーのタンパク質および免疫グロブリンの定常領域からなる群より選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の修飾された凝固因子。
17. 半減期を増強するポリペプチドが、アルブミンまたはそのフラグメントである、請求項１６に記載の修飾された凝固因子。
18. 凝固因子が、ＦＶＩＩＩであり、ここでＢドメインは、部分的にまたは完全にヒトアルブミンで置換されている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の修飾された凝固因子。
19. 請求項１〜１８のいずれか一項に記載の修飾された凝固因子をコードする、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド群。
20. 請求項１９に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミドもしくはベクターまたはプラスミドもしくはベクター群であって、該群が請求項１９に記載のポリヌクレオチド群を含む、プラスミドもしくはベクターまたはプラスミドもしくはベクター群。
21. プラスミドまたはベクターが、発現ベクターである、請求項２０に記載のプラスミドもしくはベクターまたはプラスミドもしくはベクター群。
22. ヒトの遺伝子治療に使用するためのトランスファーベクターである、請求項２１に記載のベクターまたはベクター群。
23. 請求項１９に記載のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド群、または請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のプラスミドもしくはベクター、もしくはプラスミドもしくはベクター群を含む宿主細胞。
24. 修飾された凝固因子の生産方法であって：
    （ａ）請求項２３に記載の宿主細胞を、修飾された凝固因子が発現されるような条件下で培養すること；および
    （ｂ）場合により、宿主細胞または培地から修飾された凝固因子を回収すること、
    を含む、上記方法。
25. 請求項１〜１８のいずれか一項に記載の修飾された凝固因子、請求項１９に記載のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド群、または請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のプラスミドもしくはベクター、もしくはプラスミドもしくはベクター群を含む薬学組成物。
26. 血液凝固障害を治療または予防する薬剤を製造するための、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の修飾された凝固因子、請求項１９に記載のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド群、または請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のプラスミドもしくはベクター、もしくはプラスミドもしくはベクター群、または請求項２３に記載の宿主細胞の使用。
27. 血液凝固障害が、血友病Ａである、請求項２６に記載の使用。
28. 治療が、ヒトの遺伝子治療を含む、請求項２６または２７に記載の使用。
29. 長い機能的な半減期を有する修飾された凝固因子の製造方法であって、前記凝固因子のアミノ酸配列の内部領域で、半減期を増強するポリペプチドを挿入することを含む、上記方法。
30. 凝固因子の機能的な半減期を増加させる方法であって、前記凝固因子のアミノ酸配列の内部領域で、半減期を増強するポリペプチドを挿入することを含む、上記方法。
31. 血清および動物タンパク質を含まない培地中で凝固因子の安定性を増加させる方法であって、前記凝固因子のアミノ酸配列の内部領域で、半減期を増強するポリペプチドを挿入することを含む、上記方法。
32. ＦＶＩＩＩのＢドメインまたはその部分を、半減期を増強するポリペプチドで置換することを含む、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。

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