KR20000047835A

KR20000047835A - 혈액 응고 인자 및 ｐ-셀렉틴의 ｄｎａ 작제물

Info

Publication number: KR20000047835A
Application number: KR1019990054238A
Authority: KR
Inventors: 네그리에르클라우드; 플랑띠에르장뤽
Original assignee: 모저 하., 라우페 하. 페.; 아벤티스 베링 게엠베하
Priority date: 1998-12-02
Filing date: 1999-12-01
Publication date: 2000-07-25
Also published as: US6419921B1; CA2291453A1; EP1026250A1; JP2000166579A; AU6180199A

Abstract

본 발명은 인자 IX 같은 혈액 응고 인자의 아미노산 서열 및 P-셀렉틴(P-selectin)의 세포질 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 DNA 작제물에 관한 것이다. 상기 작제물은 혈액 응고 인자 결핍으로부터 고통받는 환자의 체내 유전자 치료용으로 사용될 수 있다.

Description

혈액 응고 인자 및 Ｐ-셀렉틴의 ＤＮＡ 작제물 {DNA constructs of blood clotting factors and P-Selectin}

본 발명은 혈액 응고 인자 및 P-셀렉틴의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 DNA 작제물에 관한 것이다.

P-셀렉틴은 내피 세포 및 혈소판에서 발현되는 통합 트랜스막 당단백질이다. P-셀렉틴은 세포-세포 부착에 관여하는 유도성 분자이다. 상기 분자는 휴지기 세포, 특히 세포내 구획들, 즉 내피 세포내 바이벨-팔라데체(Weibel-Palade body) 및 혈소판내 a-과립내에 저장된다. P-셀렉틴(psel)의 세포내 도메인은 상이한 구획들, 즉 저장 과립, 라이소좀, 중핵체 과립 및 시냅스-유사-미소포체내에서 분자 표적화에 관여하는 것으로 보인다[문헌 참조: 2, 4 및 5]. 상기 도메인을 사용하여 두 개의 키메라 분자(조직-인자-psel 및 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-psel)를 제조한다. 두 경우, 분비-조절된 세포주(AtT20 및 PC12)를 사용하여, 키메라 분자를 분비 과립 및 라이소좀내로 지시한다[문헌 참조: 2 및 6]. 세포내 꼬리부는 표적화에 관여하는 두 개의 독특한 아미노산 신장부를 갖는다. 라이소좀에서 세포질막에 인접한 10개의 아미노산은 P-셀렉틴 및 HRP-psel을 지시하는 반면, 3' 말단은 시냅스-유사-미소포체, 즉 분비 과립에서 표적화를 위해 필요하다[문헌 참조: 1 및 6]. 세포질내 꼬리부의 표적화 잠재력은 또한 트랜스막 도메인의 존재하에서 증가되는 것으로 나타난다. 두 도메인이 모두 존재하는 경우, 키메라 E-셀렉틴-P-셀렉틴은 보다 효과적으로 과립내로 지시된다[문헌 참조: 3].

P-셀렉틴 꼬리부의 부가는 치료학적 관심의 대상인 유전적 인자들을 이들이 체내 유전자 치료에 유용할 수 있는 세포내 저장 구획내로 표적화시키기 위한 흥미로운 도구의 일례가 되는 것으로 보인다. 본 발명은 인자 IX 같은 혈액 응고 인자 및 P-셀렉틴의 DNA 작제물이 혈액 응고 인자 결핍으로부터 고통받는 환자의 치료를 위한 신규한 가능성을 제시한다는 것을 나타낸다. 이는 그중에서도 P-셀렉틴의 세포질 도메인과 융합된 FIX-DNA 작제물을 포함하는 키메라 분자에 관한 것이다.

본 발명은 첨부된 도 1 내지 도 11에 의해 예증된다.

도 1은 pcDNA3-FIX(-46) 작제물 및 pcDNA3-FIX WT 작제물을 나타낸다.

도 2는 양측에 ScaI을 사용하여 말단 절단된 사람 FIX 유전자의 제1 인트론(인트론 I)을 나타낸다.

도 3은 pcDNA-FIX(-46.I1) 및 pcDNA-FIX(WT.I1) 작제물을 나타낸다.

도 4는 pcDNA3-FIX(-46)psel 및 pcDNA-FIX(WT)psel 작제물을 나타낸다.

도 5는 pcDNA3-FIX(-46-I1)psel 및 pcDNA-FIX(WT-I.1)psel 작제물을 나타낸다.

도 6은 상이한 작제물 풀(pool)에서 FIX의 분비를 나타낸다.

도 7은 CHO 세포-용해물에서 FIX의 면역블롯팅을 나타낸다.

도 8은 CHO-세포에 의해 분비된 FIX의 양에 대한 psel 서열 효과를 나타낸다.

도 9a 및 9b는 CHO 세포에서 FIX, FIX-psel 및 FIX-pselmut 단백질의 발현 수준을 나타낸다.

도 10a 및 10b는 AtT20 세포주에서 FIX 및 FIX-psel의 발현 수준을 나타낸다.

도 11은 8-Br-cAMP 자극 후 FIX 및 FIX-psel 방출 증가를 나타낸다.

본원에 이르러, 혈액 응고 인자의 아미노산 서열 및 사람 P-셀렉틴의 세포질 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 DNA 작제물이 완전한 혈액 응고 활성을 가지며 인자 IX 같은 혈액 응고 인자 결핍으로부터 고통받는 환자의 체내 유전자 치료에 유용한 귀중한 특성들을 갖는 것으로 확인되었다.

A. 키메라 분자의 작제

1. FIX cDNA의 제조

전체 RNA를 사람 간으로부터 Promega^TMmRNA 추출 키트를 사용하여 제조한다. 인자 FIX(-46) cDNA는 역전사효소(제조원 :Promega^TM, France) 및 Taq 폴리머라제(제조원: Appligene-Oncor^TM, France)를 사용하는 RT-PCR에 의해 수득한다. 두 개의 FIX 프라이머를 사용한다: 5'에서 NcoI 부위를 만드는 5'FIX(-46)[코작 개질(Kozak modification)을 사용, 문헌 참조: 7] 및 cDNA FIX(-46)의 3' 말단에 XhoI 부위를 만드는 3'FIX Stop(표 1 참조). 상기 FIX cDNA를 pUT535(Cayla, Toulouse, France)라고 불리는 개시 중간체 벡터내에 클로닝한다. FIX(-46)을 서열 분석한 결과 단일 점 돌연변이 CGC → CCC(시그날 펩타이드: Pro-44Arg에 상응하는 서열내)가 존재하는 것으로 보인다. 그러나, pcDNA3.1 벡터(제조원: Invitrogen, the Netherlands)는 보다 많은 제한 절단 부위 및 네오마이신 내성 유전자를 보유하기 때문에, 상기 벡터는 이후 연구에 보다 편리한 것으로 보인다. FIX(-46) cDNA를 PstI 및 XhoI으로 절단하고, pBlueScript(제조원: Stratagene^TM)내에 클로닝한 후, BamHI 및 XhoI 절단 후 발현 벡터 pcDNA3에 삽입하여 pcDNA3-FIX(-46)을 수득한다(도 1).

FIX 야생형을 수득하기 위해서, 신규한 프라이머를 디자인한다: 어떠한 코작 개질도 없고 Pro-44Arg 돌연변이를 바로잡은 프레임내에 3개의 ATG를 함유하는 5'FIXWT. 3' 프라이머는 FIX cDNA의 AvaI 부위상에 위치하는 3'FIX AvaI이다(표 1 참조). 679bp PCR 생성물을 수득하고 PCR 2.1 벡터(제조원: Invitrogen)내에 클로닝하고 서열 분석을 수행한다. 부분적인 BamHI-EcoRV 절단에 의해 상기 PCR 생성물의 484bp 단편을 직접적으로 pcDNA3-FIX(-46)내로 클로닝하여 pcDNA3-FIX WT를 수득한다(도 1).

2. FIX.I1 cDNA의 제조

FIX 작제물을 개선시키기 위한 시도 동안, 인트론 I의 존재로 인해 FIX를 생성시키는 세포의 능력이 극적으로 증가되는 것으로 보인다. 수 많은 포유동물 유전자의 효과적인 발현은 하나 이상의 인트론의 존재에 따른다. 사람 FIX 유전자의 제1 인트론(인트론 I)은 발현-증가 활성을 갖는 것으로 이전에 제시되어져 왔다[문헌 참조: 8]. 따라서, 도 2에서 나타낸 바와 같이, 두 개의 ScaI 부위를 사용하여 말단 절단된 상기 제1 인트론을 FIX-46 cDNA내로 클로닝한다. 상기 작제물은 하기와 같이 제조된다.

FIX 인트론 I의 5' 부분을 엑손 I의 ATG-46의 5' 말단(5'FIX-46 프라이머) 및 인트론 I의 5' 말단에서 PvuII 부위(5' FIX 인트론 I 프라이머) 사이에서 게놈 DNA로부터 PCR로 증폭시킨다(표 1 참조). 제2 단편을 인트론 I의 3' 말단(3' FIX 인트론 I 프라이머) 및 엑손 II의 5' 말단(3' FIX 엑손 II 프라이머) 사이에서 증폭시킨다(표 1 참조). 이후, 두 개의 PCR 단편을 PvuII 부위에서 결합시키고 추가로 ScaI으로 절단하여 300bp 단편을 수득한다. 상기 300bp 단편을 서열 분석한 결과 돌연변이가 존재하지 않는 것으로 나타난다. 상기 300bp 인트론 I를 추가로 EcoRV 절단을 사용하여 pcDNA3-FIX(-46) 및 pcDNA3-FIX(WT)의 작제물에 클로닝하여 pcDNA3-FIX(-46.I1) 및 pcDNA3-FIX(WT.I1)을 수득한다(도 3).

3. 3' 말단 개질된 FIX 제조 및 하이브리드 psel cDNA의 제조

FIX의 3' 말단을 psel 단편에 융합시키기 위해서, AvaI 부위(FIX 5' AvaI 프라이머) 및 종결 코돈 사이에서 FIX(-46) cDNA를 증폭시켜 700bp 단편을 수득한다(표 1 참조). 3' 안티센스 올리고뉴클레오타이드(FIX 3' MluI 프라이머)는 종결 코돈을 아르기닌 코돈으로 교체시키는 MluI 부위를 함유한다(표 1 참조).

사람 P-셀렉틴의 3'-말단에 위치하는 35개 아미노산에 상응하는 111bp 서열을 사람 혈소판 mRNA로부터 RT-PCR에 의해 증폭시킨다(프라이머: 5' GMP MluI 및 3' GMP XhoI)(표 1 참조).

psel 아미노산 서열:RKRFRQKDDGKCPLNPHSHLGTYGVFTNAAFDPSP(서열 1)

상기 서열을 MluI 부위에 의해 3'-말단-개질된 FIX(-46) 서열 뒤에 융합시킨다. 상기 융합은 FIX 및 psel 사이에 두 개의 아미노산(Thr-Arg)의 부가를 필요로한다. 추가의 클로닝을 위해서 WhoI 부위를 종결 코돈 뒤의 3'-말단에 부가한다.

모든 기타 FIX 작제물내에 상기 111bp psel을 도입하기 위해서, BstBI에 의해 절단시킨 3'-말단 개질된 FIX/psel 단편을 pcDNA3-FIX(-46.psel)로부터 수득하고 추가로 동일한 효소로 개환시킨 상이한 FIX 벡터내로 도입시킨다(도 4). 상기 전략을 사용하여, pcDNA3-FIX(-46.I1.psel), pcDNA3-FIX.WT-psel 및 pcDNA3-FIX.WT.I1.psel을 수득한다(도 5).

FIX 작제물의 프라이머 서열(자세한 설명은 첨부된 서열 목록 참조)

프라이머	서열(5' → 3')	서열 번호
5'FIX(-46)	ACACCCATGGAGCGCGTGAACATGATCATGG	2
5'FIX WT	TGGATCCATGCAGCGCGTGAACATGATCATGG	3
3'FIX Stop	AAAACTCGAGTTAAGTGAGCTTTGTTTTTTCC	4
3'FIX MluI	AAAAACGCGTAGTGAGCTTTGTTTTTTCCTTAA	5
3'FIX AvaI	AACAACCCGAGTGAAGTC	6
5'FIX AvaI	AATGACTTCACTCGGGTTGTTGG	7
5'GMP MluI	AAAAACGCGTAGAAAGCGTTTCAGACAAAAAG	8
3'GMP XhoI	AAAACTCGAGTTAAGGACTCGGGTCAAATGC	9
5'FIX 인트론 I	ATTTCACAGCTGACATCATGTCTGG	10
3'FIX 인트론 I	ACCAGCTGCAATGAAAATAAGGG	11
3'FIX 엑손 II	ATTTTGTTGGCGTTTTCATGATCAAG	12

FIX C-말단부, 세포내 도메인의 P-셀렉틴 5' 부분 및 융합된 단백질의 아미노산 서열

P-셀렉틴 트랜스막 도메인의 3' 말단은 굵은 글씨체로 나타낸다.

FIX 3' 말단	THR LYS LEU THR STOP
P-SEL 5' 꼬리부	ALA LEU LEU ARG LYS ARG
FIX-psel	THR LYS LEU THR THR ARG ARG LYS ARG

4. 랜덤 펩타이드성 단편을 함유하는 대조군 FIX 분자의 제조

프레임-이동과 함께 사람 인자 VIII cDNA로부터 유도된 랜덤 서열을 Expand System(제조원: Roche Molecular Diagnostics, Meylan, France)을 사용하는 PCR로 증폭시킨다. 상기 106bp 길이의 서열을 올리고뉴클레오타이드 12C(5'-AAC GCG TAT TCT TTT ACA TTT CAG GTC TAT GGA TTC TGG GGT GCC ACA AC)(서열 13) 및 pselmut 3'(5'-ACT CGA GTC ACA ACT TGA AAC CTT C)(서열 14)로 제조한다. FIX 카복시 말단에 부가된 생성된 아미노산 서열은 TRILLHPRSMDSGVPNLRLSENRHDRLTESPKI(서열 15)이며 NCBI 데이터베이스에서 지금까지 확인된 기술된 단백질과 어떠한 상동성도 나타내지 않는다. 상기 PCR 단편은 5'-말단에서 MluI 부위 및 3'-말단에서 XhoI 부위를 갖는다. 상기 단편을 psel 단편을 제거한 후 pcDNA3-FIX WT-psel의 3' 말단에 클로닝한다.

B. 키메라 분자의 특성화

1. CHO 세포에서 FIX Psel의 안정한 발현

모든 작제물들을 전기천공법으로 CHO 세포(ECACC로부터 구입)내로 형질감염시킨다. 6 x 10⁶개 세포를 ScaI 또는 PvuI(인트론 I이 존재하는 경우)으로 선형화시킨 DNA 10㎎으로 형질감염시킨다. 형질감염 16시간 후, 배지를 제거하고 G418 0.6㎎/㎖를 함유하는 신선한 배지로 교체시킨다. 상기 농도는 이전에 비-형질감염된 CHO 세포 상에서 가장 무효한 농도인 것으로 나타났다. 형질감염 7일 후, G418 내성 클론이 나타난다. 따라서, 두 가지 전략이 수행된다. 제1 전략은 신장을 위해 10개의 개별적인 콜로니를 픽업(pickup)하는 것으로 이루어진다. 제2 전략에서, 전체 90㎜ 디쉬에 존재하는 콜로니들을 하나의 풀(pool)로 모으며, 이는 대략적으로 20 내지 100개 클론에 상응한다. 이후, 상기 풀을 신장시키고 각각의 작제물에 대해 두 개의 풀(A 및 B)이 수행된다. 이후, 클론 및 세포성 풀을 동결시킨다. 세포 배양 상등액을 수거하고 -80℃에서 저장한다.

도 7은 CHO CMV/FIX WT +/- psel 용해물에서 FIX의 면역블롯팅을 나타낸다. 지수적으로 성장하는 세포로부터의 용해물을 SDS-PAGE/10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동시키고 니트로셀룰로오스 막 상에서 반-건조 블롯팅시킨다. FIX는 폴리클로날 래빗 항-사람 FIX 항체(제조원: Dako, Trappes, France)를 사용하여 확인한다. 상기 단백질을 ECL 시스템(제조원: Amersham)을 사용하여 검출한다.

도 8은 CHO CMV/FIX WT 또는 CMV/FIS-46 +/- psel에 의해 분비되는 FIX 양에 대한 psel 서열 효과를 나타낸다. FIX 축적은 배양 3일 후 독립적인 실험자에 의하여 2회에 걸쳐 두 개의 풀로부터 측정된다. FIX 항원은 ELISA 키트(제조원: Asserachrom IX: Ag, Stago, Asniesres, France)를 사용하여 상등액에서 정량화한다.

2. psel 제조의 역학

FIX-46-psel이 분비되는 능력은 FIX-46과 비교되는 FIX 제조에 대한 역학적 연구로 수행된다. FIX-46-psel 및 FIX-46 II-psel이 모두 사용된다. 35㎜ 페트리 디쉬에 4 x 10⁵개 세포 및 비타민 보충된 배지 2㎖를 사용하여 씨딩한다. 컨디셔닝 1 내지 4일 후, 컨디셔닝된 배지를 수거한다. 각각의 상등액에 대하여, FIX 항원 축적을 ELISA(제조원: Asserachrom VIIIC.AG, Dianostica Stago, Asnieres, France)를 사용하여 평가한다. FIX-psel의 역학은 매우 균일한 결과를 제공한다. 반대로, 두 개의 FIX-46-psel 풀은 완전히 상이한 결과를 제공한다: 풀 B는 어떠한 FIX-psel 분비도 나타내지 않는 반면, 풀 A는 기타 작제물과 유사한 제조 수준을 나타낸다. 이러한 중요한 차이로 인해 이들의 각각의 단백질 산물은 혼합하지 않는다. 거의 모든 작제물들(풀 B 제외)은 상등액에서 유사한 FIX 항원 제조를 야기한다(도 6 참조).

3. FIX-psel은 혈액 응고를 유도할 수 있다

응혈촉진제 활성을 인자 IX-결핍된 혈장을 사용하는 1-단계 응고 분석법을 사용하여 CHO, FIX-46, FIX-46-psel 및 FIX-46 II-psel 형질감염된 세포로부터 측정한다. 상기 활성은 모든 FIX 함유 상등액에서 거의 유사하다. 그러나, 측정이 정제되지 않은 시료(10% FCS, 기타 CHO 분비 및 분해 생성물 함유)에서 수행되기 때문에, 상이한 생산 수준에 대한 수치와 관련된 어떠한 명확한 결론도 유추할 수는 없다. 주요 관점은 FIX-psel 단백질의 응혈촉진제 특성을 조사하는 것이다.

상이한 FIX 분자의 특정 활성

세포 유형	Fix-46	Fix-46 P-sel	Fix-46 I1P-sel
활성(mU/ng 항원)	4.4+/-3.2	4.4+/-2.5	3.2+/-0.8

상기 수치들은 모든 풀 A상에서 3회 이상 측정한 평균을 나타낸다.

4. CHO 세포중 보다 높은 양으로 존재하는 FIX-Psel

면역블롯팅

모든 세포주의 샘플을 용해시키고 동일량의 전체 세포 용해물(60㎎)을 DA(래빗)으로부터의 항-FIX 항체(항-사람 인자 IX 참조번호 제A0300호)를 사용하여 면역블롯팅시킨다. FIX-46을 발현하는 CHO 세포는 검출가능한 단백질을 거의 나타내지 않는 반면 키메라 단백질을 암호화하는 모든 작제물은 높은 세포내 FIX 수준을 갖는다. 이때 또한 FIX-46-psel 풀 B는 가장 낮지만, 검출 가능한 단백질 제조를 나타내며, 이는 제조의 역학과 일치한다.

두 개의 FIX-46 II-psel 풀에서, 항-FIX 항체는 두 개의 밴드를 나타낸다. 세포 상등액에서 수행된 면역침전은 이러한 두 개의 화합물이 모두 분비됨을 나타낸다.

면역 침전

상이한 형질감염된 세포로부터의 동일량의 트리톤-가용성 용해물(850㎎)을 면역침전시키고 면역블롯팅 실험에서와 같은 동일한 항체로 분석한다. 예상한 바와 같이, 대조군 CHO 세포는 FIX를 발현하지 못한다. 형질감염된 세포로부터의 FIX-46은 면역 침전 후 나타나지만, FIX-46-psel보다는 더 낮은 수준이며, 이는 직접적인 면역블롯팅 결과와 일치한다. 부가적으로, psel의 부가로 인한 분자량의 증가에 기인하는 FIX-46-psel의 이동에서 약간의 변화가 검출된다.

FAC 스캐닝 분석

이후, FIX-psel의 세포내 양을 FACS 분석으로 대조군과 비교한다. 세포를 트립신 처리로 분리시키고, 세척하고 0.5% 파라포름알데하이드(PFA)로 고정시키고 제1 항체와 항온 처리하는 동안 0.5% 트윈-20에 의해 투과 가능해진다. 제2 항체를 단독으로 사용하는 경우, 각각의 집단에서 어떠한 표지된 세포도 검출되지 않는다. 상기 두 개의 항체를 비-투과성 세포 상에서 사용하는 경우(래빗 항-사람 FIX 처리 후 FITC-결합된 항 래빗), 키메라 단백질을 발현하는 세포에서 형광의 약간의 변화가 관찰된다. 이러한 미약한 시그날은 PFA에 의한 세포의 부분적인 투과에 기인할 수 있다. 세포가 투과성이 되는 경우, 형광의 독특한 주요 피크가 FIX 형질감염된 세포에서 관찰된다. 키메라로 형질감염된 세포에서, 보다 강하게 표지된 세포의 혼합 집단에 상응하는 견부(shoulder) 피크와 함께 대조군 피크에 유사한 평균 형광 강도를 나타내는 주요 피크가 관찰된다. 이러한 결과는 키메라 분자를 발현하는 세포가 FIX psel 산물의 일부를 보유한다는 것을 제시하는 면역블롯팅 실험에서 수득된 데이터와 일치한다.

면역 형광

FIX 항원을 면역 형광으로 검출한다. 본 실험은 세포 풀 상에서 수행한다. 따라서, 표지된 세포의 퍼센트는 풀 마다 40 내지 60%로 다양하며 상이한 수준의 발현이 단일 집단내에 존재한다. 표지된 세포 중에서, 시그날 강도의 일부 상이점이 상이한 형질감염된 세포주 사이에서 관찰된다. FIX-46 발현 세포에서, 매우 미약한 시그날이 관찰되지만 비-투과성 세포로부터의 시그날에 비해서는 매우 높다. FIX-46-psel 및 FIX-46 II-psel에서, 일부 세포는 비-투과성 세포 또는 FIX-46 발현 세포 중 하나와 비교해서 명확한 시그날을 나타낸다. 형광은 모든 세포질 상에 존재할 때 검출된다. 상기 패턴은 또한 일부 FIX-46 세포에서 발견되지만 보다 덜 밝은 정도로 나타난다. 이는 psel이 CHO 세포에서 바이벨-팔라데체 같은 독특한 구조를 그 자체로 생성시킬 수 없다는 것을 나타낸다.

5. P-셀렉틴 세포내 도메인은 CHO 세포에서 특히 FIX-WT을 보유한다

모든 cDNA 작제물(pcDNA3, FIX WT, FIX-psel 및 FIX-pselmut)을 CHO 세포에 안정적으로 형질감염시킨다. 분비된 인자 IX의 양은 도 9a에 나타낸다. 예상한 바와 같이, 상기 벡터 단독으로 형질감염시킨 CHO 세포로부터의 상등액에서는 어떠한 FIX 항원도 발견되지 않는다. 최대 FIX 제조는 야생형 FIX를 발현시키는 세포에서 수득된다(36.1ng/㎖ +/- 4.2, 평균 +/- 표준편차). 상등액에서, 인자 IX-psel 발현 수준은 P-sel 단편 없이 FIX WT를 사용한 인자의 양과 비교해 볼 때 7.7배 감소한다(4.7ng/㎖ +/- 1.1). FIX 및 임의 서열 사이의 키메라(FIX-pselmut)는 거의 검출되지 않는다(0.4ng/㎖ +/- 0.03).

FIX-psel 및 FIX-pselmut의 감소된 분비가 인자 IX 생합성의 손상의 결과인지를 평가하기 위해서, 세포 용해물 상에서 면역블롯팅을 수행한다(도 9b). 세포 상등액으로부터의 데이터와는 반대로, FIX와 비교해서 보다 대량의 FIX-psel이 세포 용해물에서 발견된다. FIX 및 FIX-psel의 이동 패턴은 FIX-psel의 이동에서 약간의 변화와 유사하다. 이러한 변화는 반복적으로 관찰되며 psel 단편의 부가에 기인한다. 반대로, FIX-pselmut는 세포 용해물에서 거의 검출되지 않는다. 이러한 결과는 FIX-psel이 P-셀렉틴 꼬리의 특정한 특성을 통해 CHO 세포에 보유됨을 명확하게 나타낸다.

6. FIX WT-psel은 AtT20 세포의 저장 과립내로 특이적으로 지시된다.

마우스 뇌하수체 전엽 유도된 세포주(AtT20)는 로사 제이 피 박사(INSERM U 348, Paris)로부터 기증받았다. 상기 세포주를 10% 태 송아지 혈청 및 비타민 K 1ng/㎖로 보충시킨 DME 배지, pH 7.8(제조원: Gibco BRL Life Technologies) 중에서 10% CO₂하에서 37℃에서 유지시킨다. AtT20 세포(3.5 x 10⁶개)를 PvuI으로 선형화시킨 pcDNA3-FIX, pcDNA3-FIX-psel 또는 pcDNA3-FIX-11-psel 벡터의 DNA 2㎎을 사용하여 Fugene 6(제조원: Roche Molecular Diagnostics)에 의해 형질감염시킨다. 형질감염 6시간 후, 배지를 제거하고 신선한 배지로 교체시킨다. 0.6㎎/㎖의 제네티신을 16시간 후 부가한다. 각각의 작제물의 30개 클론을 선택하고 상등액 중 FIX 항원을 측정함으로써 FIX 발현에 대해서 스크리닝한다. 2 내지 4개의 최상의 FIX-생산 클론에 대해서 추가로 상세한 분석을 수행한다.

CHO 세포에서와 같이, 두 개의 FIX 및 두 개의 FIX-psel 발현 클론 사이에서 FIX 생산량의 극적인 차이가 검출된다(510 +/- 93 및 277 +/- 9.6ng/㎖ vs. 39 +/- 5.8 및 2.23 +/- 0.07ng/㎖, 평균 +/- 표준편차)(도 10a). 세포 용해물에 대해 면역블롯팅 분석을 수행한다. 두 개의 FIX 발현 클론은 유사량의 세포내 FIX를 나타내지만, FIX-psel 클론에 의해 생산되는 단백질 양은 불균일하다(도 10b). 한 가지 경우(도 10b 레인 4), 세포내에 보유된 FIX-psel 양은 FIX 대조군보다 훨씬 많다(도 10b 레인 2 및 3). 다른 경우(도 10b 레인 5)에, 세포 용해물에서 검출되는 FIX-psel의 양은 대조군보다 약간 낮다. 그러나, 저장된 FIX 항원 대 분비된 FIX의 비율은, FIX에 대해서 보다 FIX psel에 대해서 세포내/세포외 비율이 15배 이상이기 때문에 두 클론 모두에서 FIX-psel이 세포내에 바람직하게 보유됨을 나타낸다(표 3).

세포내 FIX 항원 대 분비된 FIX 항원의 비율

	분비된 Fix(ng/㎖)	세포내 양(상대적인 단위)	비율(세포내/세포외)
FIX-6	510+/-93	70	0.14
FIX-7	277+/-9.6	93	0.33
FIX-pselCT 15	39+/-5.8	188	5
FIX-pselCT 19	2.23+/-0.07	62	25

2 x 10⁵개 세포를 35㎜ 페트리 디쉬에 씨딩한다. 3일 후 세포가 지수적으로 성장할 때, 상등액을 수거한다. 분비된 FIX 항원 농도를 ELISA로 측정한다. 나타낸 결과는 2회의 독립적인 실험(각각 n=3)의 전형이다. FIX 세포내 양을 결정하기 위해서, 세포를 용해시키고 면역블롯팅을 수행한다. FIX 시그날을 NIH 이미지 1.61 소프트웨어를 사용하여 통합한다. 나타낸 데이터는 2회의 독립적인 세포 용해물(각각 n=2)을 사용해 생성된 면역블롯팅의 전형이다.

야생형 FIX 및 FIX-psel 형질감염된 AtT20 세포를 FIX 면역전자 현미경 검사를 하는 경우, 다음 결과가 관찰된다: 야생형 FIX는 식별할 수 있는 구조에서 FIX에 대해 일관된 표지화를 전혀 나타내지 않는다. 때때로 금 입자들이 세포질 바탕에 산재하기는 하지만 한정된 구조를 정확하게 표지하지는 못한다(데이터 미첨부). 반대로, FIX-psel AtT20 형질감염된 세포는 분비 과립의 전구체 구조체들인 골지체 관련된 소포 및 응축 액포의 시스터내(cisternae)에서 FIX 표지화를 나타낸다(Disdier et al., 1992). 전자 밀도 과립은 또한 매트릭스내에서 금 표지화를 나타내며 ACTH 면역표지화와 함께 공-위치한 상기 표지화는 이러한 구조들이 분비 과립임을 확인시켜 준다(데이터 미첨부).

FIX-psel 형질감염된 클론에 의한 FIX의 세포외 제조는 일반적으로 미약하기 때문에, 본 발명자들은 상기 단백질 제조를 개선시키기 위해서 pcDNA3-FIX I1-psel 작제물을 사용한다. FIX cDNA에서 FIX 말단 절단된 인트론 1의 부가는 진정으로 HepG2 및 CHO 세포(문헌 8 및 9)에서 거의 10배 더 많은 FIX 제조를 유도하는 것으로 나타난다. psel 꼬리를 상기 작제물의 3' 말단에 부가하는 경우, 생성되는 단백질은 pcDNA3-FIX-psel과 비교해서 훨씬 더 많은 양이 분비되지만, 또한 FIXpsel이 사용되는 경우 발견되는 것과 동일한 정도로 바람직하게 저장된다.

FIX 및 FIX-psel이 AtT20 저장 과립으로부터 분비될 수 있는지를 평가하기 위해서, 8개 상이한 클론(4개 FIX, 2개 FIX-psel 및 2개 FIX 11-psel)을 8-Br-cAMP로 자극시킨다(참고 문헌 5). 모든 클론을 우선 ACTH 방출을 측정하여 분비에 대한 반응을 조사한다. 8-Br-cAMP의 부가 후, 비-처리된 세포와 비교해서 분비된 ACTH에서 67% +/- 23; 평균 +/- 표준편차(41 내지 100% 범위)의 평균 증가가 관찰된다. 이러한 자극 후, FIX 및 FIX-psel 항원 모두가 상등액에서 증가된다. 그러나, FIX-psel 평균 증가는 FIX 보다 훨씬 높으며(14.9% +/- 6.9 대 4.43% +/- 2.9; 평균 +/- 표준편차), 이는 FIX-psel이 8-Br-cAMP 자극 후 효과적으로 분비될 수 있음을 나타낸다(도 11).

결론적으로, CHO- 및 AtT20-형질감염된 세포는 저장 없이 FIX 단백질을 분비하지만, P-셀렉틴 세포질 꼬리가 FIX에 융합되는 경우, 키메라 분자는 저장 및 분비가 모두 일어난다. 임의 단편은 기능적인 FIX 분자의 제조를 가능하게 하지 못하기 때문에, FIX-psel의 저장은 특히 psel 꼬리에 기인하는 것이다. FIX-psel은 야생형에 비교할 만한 응혈촉진제 활성을 가지며 P-셀렉틴 꼬리에 기인하는 약간의 분자량 증가를 나타낸다. AtT20 세포주에서, FIX-psel은 특히 내인성 저장 과립으로 지시되며 세포성 자극 후 이러한 과립으로부터 방출될 수 있다. 따라서, P-셀렉틴 꼬리의 부가는 세포내 저장 구획들에서 FIX 또는 기타 분자를 표적화하기 위한 흥미로운 도구이다. 이는 최초로 가용성 분자(트랜스막 도메인 결핍)를 P-셀렉틴 세포내 도메인에 의해 표적화시키는 것이다. 추가로, 상기 분자의 활성은 보유된다.

본 발명은 P-셀렉틴의 세포질 도메인과 융합된 FIX-DNA 작제물을 포함하는 키메라 분자에 관한 것으로, 치료학적 관심의 대상인 유전 인자들을 체내 유전자 치료에 유용한 세포내 저장 구획내로 표적화시키는 유용한 도구로서 사용될 수 있으며, 그 예로서 인자 IX 같은 혈액 응고 인자 및 P-셀렉틴의 DNA 작제물은 혈액 응고 인자 결핍으로부터 고통받는 환자의 치료를 위한 신규한 가능성을 제시한다.

문헌 참조

(1) Blagoveshchenskaya, A.D., Norcott, i.P. & Cultler, D.F.(1988). Lysosomal targeting of P-selectin is mediated by a novel sequence within its cytoplasmic tail. J. Biol. Chem. 273, 2729-2737.

(2) Disdier, M., Morrissey, J.H., Fugate, R.D., Bainton, D.F. & McEver, R.P. (1992). Cytoplasmic domain of P-selectin(CD62) contains the signal for sorting into the regulated secretory pathway. Mol. Biol. Cell. 3, 309-21.

(3) Fleming, J.C., Berger, G., Guichard, J., Cramer, E.M. & Wagner, D.D.(1998). The transmembrane domain enhances granular targeting of P-selectin. Eur. i. Cell. Biol. 75, 331343.

(4) Green, S.A., Setiadi, H., McEver, R.P. & Kelly, R.B.(1994). The cytoplasmic domain of P-selectin contains a sorting determinant that mediates rapid degradation in lysosomes. J. Cell. Biol. 124, 434-48.

(5) Koedam, J.A., Cramer, E.M., Briend, E., Furie, B.C. & Wagner, D.D.(1992). P-selectin, a granule membrane protein of platelets and endothelial cells, follows the regulated secretory pathway in AtT-20 cells. J. Cell. Biol. 116, 617-25.

(6) Norcott, J. P., Solari, R. & Cutler, D.F.(1996). Targeting of P-selectin to two regulated secretory organelles in PC12 cells. J. Cell. Biol. 134, 1229-1240.

(7) Kozak, M.(1986). Point Mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulares translation by eukariotic ribosomes. Cell 44, 283-292.

(8) Kurachi, S., Hitomi, Y., Furukawa, M. & Kurachi, K.(1995). Role of Intron 1 in the expression of the human factor IX gene. J. Biol. Chem. 270, 5276-5281.

(9) Enjolras N., Rodriguez M-H., Plantier J-L., Maurice M., Attali O. and Negrier C, The three in frame ATG of FIX are required for an optimal protein production. Thromb. Haemost. 1999(in press).

Claims

혈액 응고 인자의 아미노산 서열 및 P-셀렉틴의 세포질 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 DNA 작제물.
제1항에 있어서, 혈액 응고 인자 IX의 아미노산 서열을 포함하는 DNA 작제물.
제2항에 있어서, FIX-DNA의 3' 말단이 세포질성 P-셀렉틴-상응하는 cDNA의 5' 말단에 융합되는 DNA 작제물.
제2항 또는 제3항에 있어서, FIX-DNA의 서열 및 P-셀렉틴-DNA의 서열 사이에 두 개의 아미노산 Thr-Arg가 삽입되는 DNA 작제물.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 부가적으로 사람 FIX 유전자의 제1 인트론(인트론 I)이 삽입되는 DNA 작제물.
제5항에 있어서, 제1 인트론이 양 말단에서 ScaI을 사용하여 말단 절단된 DNA 작제물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 DNA 작제물에 의해 발현된 융합 단백질.
인자 IX 같은 혈액 응고 인자 결핍으로부터 고통받는 환자의 체내 유전자 치료를 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 DNA 작제물의 용도.