KR20210100661A - 인자 ix를 발현하는 렌티바이러스 벡터의 용도 - Google Patents

인자 ix를 발현하는 렌티바이러스 벡터의 용도 Download PDF

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KR20210100661A
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통야오 리우
수잔나 파타로요-화이트
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알레씨오 칸토레
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바이오버라티브 테라퓨틱스 인크.
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Abstract

본 개시는 인자 IX(FIX) 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터, 및 이러한 렌티바이러스 벡터를 사용하는 방법을 제공한다. 본원에 개시된 간-표적화된 렌티바이러스 벡터는 유전자 요법에 사용될 수 있으며, 여기서 렌티바이러스 유전자 전달은 소아(예를 들어, 신생아) 또는 성체 대상체의 표적화된 세포(예를 들어, 간세포) 게놈 내로 트랜스진 발현 카세트의 안정적 통합을 가능하게 하며, 낮은 렌티바이러스 벡터 용량에서 FIX 발현의 개선을 달성한다. 본 개시는 낮은 투여량으로 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 간-표적화된 렌티바이러스 벡터를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 혈우병(예를 들어, 혈우병 B)과 같은 출혈 장애를 치료하는 방법을 또한 제공한다.

Description

인자 IX를 발현하는 렌티바이러스 벡터의 용도
관련 출원
본 출원은 2018년 12월 6일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/776,393호에 대한 우선권의 이익을 주장하는데, 이의 전체 개시는 본원에 참고로 포함된다.
전자 제출된 서열 목록에 대한 언급
ASCII 텍스트 파일 형태의 전자 제출된 서열 목록(파일명: SA9-468TW_SequenceListing_ST25; 크기: 28,470 바이트; 및 생성일: 2019년 12월 2일)의 내용은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.
배경 기술
혈액 응고 경로는 부분적으로, 혈소판 표면 상에서의 인자 VIIIa(FVIIIa) 및 인자 IXa(FIXa)의 효소 복합체(Xase 복합체)의 형성을 포함한다. FIXa는 그의 보조 인자 FVIIIa 없이는 상대적으로 약한 촉매 활성을 갖는 세린 프로테아제이다. Xase 복합체는 인자 X(FX)를 인자 Xa(FXa)로 절단하고, 이는 다시 인자 Va(FVa)와 상호작용하여 프로트롬빈을 절단하여 트롬빈을 생성한다. 혈우병 B는 FIX 활성의 결핍으로 이어지는 상기 FIX 유전자의 돌연변이 및/또는 결실에 의해 야기되는 출혈 장애이다.
혈우병에서는, 특정 혈장 혈액 응고 인자의 부족에 의해 혈액 응고가 방해된다. 혈우병 B(크리스마스 질환으로도 알려짐)는 세계에서 가장 흔한 유전성 출혈 장애 중 하나이다. 이는 인자 IX 단백질의 합성 감소 또는 활성이 감소된 결함 분자에 기인할 수 있는 인자 IX의 결손으로 인해 유발된다. 이는 생체내 및 시험관내 혈액 응고 활성 감소를 초래하고 병에 걸린 개인의 평생에 걸친 광범위한 의료적 모니터링을 필요로 한다. 효과적인 예방이 없이, 재발하는 혈관절증은 진행성 및 장애 초래 관절증의 발달 및 불량한 삶의 질로 이어진다(Giangrande P., Expert Opin Pharmacother. 2005; 6: 1517-24).
혈우병 B의 치료는 결손된 응고 인자를 인자 IX가 고도로 강화된 외인성 인자 농축물로 대체함으로써 일어난다. 그러나, 혈액으로부터 이러한 농축물을 생성하는 것은 기술적인 어려움을 내포한다. 따라서, 현재의 대체 요법의 어려움 및 한계를 극복하는 FIX 요법에 대한 필요가 당업계에 존재한다. 유전자 요법은 표적화된 세포의 게놈 내로 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스진 발현 카세트를 안정적으로 통합시킴으로써, 혈우병 B의 지속적인 치료를 위한 잠재적 접근으로서 위치해 있다.
본 개시의 개요
본 개시는 인자 IX(FIX) 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터의 유효 용량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 렌티바이러스 벡터는 비 변형된 HEK293T 세포(ATCC® CRL-11268™)에서 생산된 대조군 렌티바이러스 벡터보다 더 높은 수준의 표면 CD47 단백질 발현을 포함하는 CD47 과발현 HEK293T 세포 내에서 패키징되며, 여기서 유효 용량은 렌티바이러스 벡터와 동일한 FIX 활성을 유도하는 데 필요한 대조군 렌티바이러스 벡터의 대조군 용량 대비 감소된다.
일부 실시 형태에서, 대조군 렌티바이러스 벡터는 대조군 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 19 분자/μm2의 CD47을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 HEK293T 세포(ATCC® CRL-11268™)에서 생산된 대조군 렌티바이러스 벡터보다 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3.0배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4.0배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5.0배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6.0배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7.0배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8.0배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9.0배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배 더 많은 CD47 단백질을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 유효 용량은 약 5x1010 형질도입 단위/kg (TU/kg) 미만, 4x1010 TU/kg 미만, 3x1010 TU/kg 미만, 2x1010 TU/kg 미만, 1x1010 TU/kg 미만, 9x109 TU/kg 미만, 8x109 TU/kg 미만, 7x109 TU/kg 미만, 6x109 TU/kg 미만, 5x109 TU/kg 미만, 4x109 TU/kg 미만, 3x109 TU/kg 미만, 2x109 TU/kg 미만, 1x109 TU/kg 미만, 약 9x108 TU/kg 미만, 또는 약 8x108 TU/kg 미만이다.
일부 실시 형태에서, 대상체는 투여 후 다음 특성 중 하나 이상을 나타낸다: (a) 대조군 렌티바이러스 벡터 대비 렌티바이러스 벡터의 대식세포 형질 도입 감소; (b) 대조군 렌티바이러스 벡터 대비 렌티바이러스 벡터에 대한 이종(allo-specific) 면역 반응 감소; (c) 투여 후 적어도 3주에 정상 FIX 활성 대비, 적어도 30%의 FIX 활성; (d) 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두에서 렌티바이러스 벡터의 조직 특이적 발현; 및 (e) (a) 내지 (d)의 임의의 조합.
일부 실시 형태에서, 이종 면역 반응은 렌티바이러스 벡터에 반응한 사이토카인의 방출을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 사이토카인은 MIP-1a, MIP-1b, MCP-1, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 대조군 렌티바이러스 벡터의 투여 후 MIP-1a의 발현 대비 렌티바이러스 벡터의 투여 후 더 낮은 수준의 MIP-1a 발현을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 대조군 렌티바이러스 벡터의 투여 후 MIP-1b의 발현 대비 렌티바이러스 벡터의 투여 후 더 낮은 수준의 MIP-1b 발현을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 대조군 렌티바이러스 벡터의 투여 후 MCP-1의 발현 대비 렌티바이러스 벡터의 투여 후 더 낮은 수준의 MCP-1 발현을 나타낸다.
일부 실시 형태에서, 대상체는 렌티바이러스 벡터 투여 후 적어도 3주에, 정상 FIX 활성 대비, 적어도 약 75%, 적어도 약 100%, 적어도 약 125%, 적어도 약 150%, 적어도 약 175%, 적어도 약 200%, 적어도 약 225%, 적어도 약 250%, 적어도 약 275%, 또는 적어도 약 300%의 FIX 활성을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 렌티바이러스 벡터 투여 후 적어도 3주에, 정상 FIX 활성 대비, 적어도 약 150%의 FIX 활성을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 투여 후 24시간 내지 48시간에서의 혈장 FIX 활성은 대조군 렌티바이러스 벡터의 대조군 용량이 투여된 대상체 대비 증가된다. 일부 실시 형태에서, 혈장 FIX 활성은, 대조군 렌티바이러스 벡터의 대조 용량을 투여받은 대상체에 비해, 투여 후에 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 적어도 약 100배, 적어도 약 110배, 적어도 약 120배, 적어도 약 130배, 적어도 약 140배, 적어도 약 150배, 적어도 약 160배, 적어도 약 170배, 적어도 약 180배, 적어도 약 190배, 또는 적어도 약 200배 증가된다.
일부 실시 형태에서, 대상체는 대상체의 간 및 비장 외의 기관 대비, 렌티바이러스 벡터의 투여 후 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두로의 렌티바이러스 벡터의 국소화 증가를 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 국소화 증가는, 대상체의 간 및 비장 외의 기관 대비, 렌티바이러스 벡터의 투여 후 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두에서 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 적어도 약 100배, 적어도 약 110배, 적어도 약 120배, 적어도 약 130배, 적어도 약 140배, 적어도 약 150배, 적어도 약 160배, 적어도 약 170배, 적어도 약 180배, 적어도 약 190배, 또는 적어도 약 200배 더 높은 렌티바이러스 벡터의 벡터 카피 수(VCN)인 것을 특징으로 한다. 일부 실시 형태에서, 국소화 증가는, 대상체의 간 및 비장 외의 기관 대비, 렌티바이러스 벡터의 투여 후 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두에서 적어도 10배 더 높은 렌티바이러스 벡터의 VCN인 것을 특징으로 한다. 일부 실시 형태에서, 국소화 증가는, 대상체의 간 및 비장 외의 기관 대비, 렌티바이러스 벡터의 투여 후 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두에서 적어도 50배 더 높은 렌티바이러스 벡터의 VCN인 것을 특징으로 한다. 일부 실시 형태에서, 국소화 증가는, 대상체의 간 및 비장 외의 기관 대비, 렌티바이러스 벡터의 투여 후 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두에서 적어도 100배 더 높은 렌티바이러스 벡터의 VCN인 것을 특징으로 한다.
일부 실시 형태에서, CD47은 인간 CD47이다. 일부 실시 형태에서, 인간 CD47은 SEQ ID NO: 14에 제시된 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 약 70%, 적어도 70%, 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 약 90%, 적어도 95%, 적어도 약 96%, 적어도 97%, 적어도 약 98%, 적어도 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 MHC-I 폴리펩티드를 포함하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 HEK293T 세포(ATCC® CRL-11268™)와 비교하여 고농도의 CD47을 발현하는 숙주 세포에서 생산된다.
일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, 또는 SEQ ID NO: 7에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는다.
본 개시는 또한 인자 IX(FIX) 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 5x1010 형질 도입 단위/kg(TU/kg) 미만을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, 또는 SEQ ID NO: 7에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 3에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 용량은 약 5x1010 TU/kg, 약 4.5x1010 TU/kg, 약 4x1010 TU/kg, 약 3.5x1010 TU/kg, 약 3x1010 TU/kg, 약 2.5x1010 TU/kg, 약 2x1010 TU/kg, 약 1.5x1010 TU/kg, 약 1x1010 TU/kg, 약 9.5x109 TU/kg, 약 9x109 TU/kg, 약 8.5x109 TU/kg, 약 8x109 TU/kg, 약 7.5x109 TU/kg, 약 7x109 TU/kg, 약 6.5x109 TU/kg, 약 6x109 TU/kg, 약 5.5x109 TU/kg, 약 5x109 TU/kg, 약 4.5x109 TU/kg, 약 4x109 TU/kg, 약 3.5x109 TU/kg, 약 3x109 TU/kg, 약 2.5x109 TU/kg, 약 2x109 TU/kg, 약 1.5x109 TU/kg, 약 1x109 TU/kg, 약 9.5x108 TU/kg, 약 9x108 TU/kg, 약 8.5x108 TU/kg, 약 8x108 TU/kg, 약 7.5x108 TU/kg, 약 7x108 TU/kg, 약 6.5x108 TU/kg, 약 6x108 TU/kg, 약 5.5x108 TU/kg, 약 5x108 TU/kg, 약 4.5x108 TU/kg, 약 4x108 TU/kg, 약 3.5x108 TU/kg, 약 3x108 TU/kg, 약 2.5x108 TU/kg, 약 2x108 TU/kg, 약 1.5x108 TU/kg, 또는 약 1x108 TU/kg이다. 일부 실시 형태에서, 용량은 5x1010 TU/kg 미만, 4.5x1010 TU/kg 미만, 4x1010 TU/kg 미만, 3.5x1010 TU/kg 미만, 3x1010 TU/kg 미만, 2.5x1010 TU/kg 미만, 2x1010 TU/kg 미만, 1.5x1010 TU/kg 미만, 1x1010 TU/kg 미만, 9.5x109 TU/kg 미만, 9x109 TU/kg 미만, 8.5x109 TU/kg 미만, 8x109 TU/kg 미만, 7.5x109 TU/kg 미만, 7x109 TU/kg 미만, 6.5x109 TU/kg 미만, 6x109 TU/kg 미만, 5.5x109 TU/kg 미만, 5x109 TU/kg 미만, 4.5x109 TU/kg 미만, 4x109 TU/kg 미만, 3.5x109 TU/kg 미만, 3x109 TU/kg 미만, 2.5x109 TU/kg 미만, 2x109 TU/kg 미만, 1.5x109 TU/kg 미만, 1x109 TU/kg 미만, 약 9.5x108 TU/kg 미만, 약 9x108 TU/kg 미만, 약 8.5x108 TU/kg 미만, 약 8x108 TU/kg 미만, 약 7.5x108 TU/kg 미만, 약 7x108 TU/kg 미만, 약 6.5x108 TU/kg 미만, 약 6x108 TU/kg 미만, 약 5.5x108 TU/kg 미만, 약 5x108 TU/kg 미만, 약 4.5x108 TU/kg 미만, 약 4x108 TU/kg 미만, 약 3.5x108 TU/kg 미만, 약 3x108 TU/kg 미만, 약 2.5x108 TU/kg 미만, 약 2x108 TU/kg 미만, 약 1.5x108 TU/kg 미만, 또는 약 1x108 TU/kg 미만이다. 일부 실시 형태에서, 용량은 1x108 내지 5x1010 TU/kg, 1x108 내지 5x109 TU/kg, 1x108 내지 1x109 TU/kg, 1x108 내지 1x1010 TU/kg, 1x109 내지 5x1010 TU/kg, 2x109 내지 5x1010 TU/kg, 3x109 내지 5x1010 TU/kg, 4x109 내지 5x1010 TU/kg, 5x109 내지 5x1010 TU/kg, 1x109 내지 6x109 TU/kg, 2x109 내지 6x109 TU/kg, 3x109 내지 6x109 TU/kg, 4x109 내지 6x109 TU/kg, 5x109 내지 6x109 TU/kg, 6x109 내지 5x1010 TU/kg, 7x109 내지 5x1010 TU/kg, 8x109 및 5x1010 TU/kg, 9x109 내지 5x1010 TU/kg, 1010 내지 5x1010 TU/kg, 1.5x1010 내지 5x1010 TU/kg, 2x1010 내지 5x1010 TU/kg, 2.5x1010 내지 5x1010 TU/kg, 3x1010 내지 5x1010 TU/kg, 3.5x1010 내지 5x1010 TU/kg, 4x1010 내지 5x1010 TU/kg, 또는 4.5x1010 내지 5x1010 TU/kg이다. 일부 실시 형태에서, 용량은 1x109 내지 5x1010 TU/kg, 1x109 내지 4.5x1010 TU/kg, 1x109 내지 4x1010 TU/kg, 1x109 내지 3.5x1010 TU/kg, 1x109 내지 3x1010 TU/kg, 1x109 내지 2.5x1010 TU/kg, 1x109 내지 2x1010 TU/kg, 1x109 내지 1.5x1010 TU/kg, 1x109 내지 1010 TU/kg, 1x109 내지 9x109 TU/kg, 1x109 내지 8x109 TU/kg, 1x109 내지 7x109 TU/kg, 1x109 내지 6x109 TU/kg, 1x109 내지 5x109 TU/kg, 1x109 내지 4x109 TU/kg, 1x109 내지 3x109 TU/kg, 및 1x109 내지 2x109 TU/kg이다. 일부 실시 형태에서, 용량은 1x1010 내지 2x1010 TU/kg, 1.1x1010 내지 1.9x1010 TU/kg, 1.2x1010 내지 1.8x1010 TU/kg, 1.3x1010 내지 1.7x1010 TU/kg, 또는 1.4x1010 내지 1.6x1010 TU/kg이다. 일부 실시 형태에서, 용량은 약 4x109 TU/kg 내지 약 6x109 TU/kg이다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 단회 용량 또는 다회 용량으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 정맥내 주사를 통하여 투여된다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 소아 대상체이다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 성인 대상체이다.
일부 실시 형태에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 12에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 12에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조직 특이적 프로모터는 표적 간 세포에서 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 선택적으로 향상시킨다. 일부 실시 형태에서, 표적 간 세포에서 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 선택적으로 향상시키는 조직 특이적 프로모터는 APOA2 프로모터, SERPINA1(hAAT) 프로모터, mTTR 프로모터, MIR122 프로모터, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적 간 세포는 간세포이다. 일부 실시 형태에서, 단리된 핵산 분자는 간세포의 게놈 내로 안정적으로 통합된다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 스플라이스 공여자 부위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 스플라이스 수용자 부위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 gag 서열, pol 서열, rev 서열, rev 반응성 요소(RRE), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, gag 서열은 전장 또는 절단형 gag 서열이다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 인핸서, 마이크로RNA에 대한 표적 서열, 전사-후 조절 요소, 패키징 신호, 폴리-A 서열, 인트론 서열, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 한 번에 투여되거나 적어도 2개의 하위-용량으로 나누어진다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 적어도 2회 반복된다.
일부 실시 형태에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 다음과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다: (i) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 1 내지 84; (ii) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오티드 1 내지 84; (iii) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 1 내지 84; (iv) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 1 내지 84; (v) SEQ ID NO: 6의 뉴클레오티드 1 내지 84; 또는 (vi) SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 1 내지 84. 일부 실시 형태에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 다음과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다: (i) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 85 내지 138; (ii) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오티드 85 내지 138; (iii) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 85 내지 138; (iv) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 85 내지 138; (v) SEQ ID NO: 6의 뉴클레오티드 85 내지 138; 또는 (vi) SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 85 내지 138.
일부 실시 형태에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 이종 기원 아미노산 서열을 인코딩하는 이종 기원 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종 기원 아미노산 서열은 알부민, 면역글로불린 Fc 영역, XTEN 서열, 인간 융모성 고나도트로핀의 β 서브유닛의 C-말단 펩티드(CTP), PAS 서열, HAP 서열, CTP 펩티드 서열, 트랜스페린, 알부민-결합 모이어티, 또는 이들 폴리펩티드의 임의의 단편, 유도체, 변이체, 또는 조합이다. 일부 실시 형태에서, 이종 기원 아미노산 서열은 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 연결되거나 아미노산 서열 내 2개의 아미노산 사이에 삽입된다. 일부 실시 형태에서, 이종 기원 모이어티는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 103, SEQ ID NO: 2의 아미노산 105, SEQ ID NO: 2의 아미노산 142, SEQ ID NO: 2의 아미노산 149, SEQ ID NO: 2의 아미노산 162, SEQ ID NO: 2의 아미노산 166, SEQ ID NO: 2의 아미노산 174, SEQ ID NO: 2의 아미노산 224, SEQ ID NO: 2의 아미노산 226, SEQ ID NO: 2의 아미노산 228, SEQ ID NO: 2의 아미노산 413, 또는 이들의 임의의 조합에 상응하는 아미노산의 바로 하류에서 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드 내에 삽입된다. 일부 실시 형태에서, FIX 폴리펩티드는 R338L 변이체 FIX 폴리펩티드이다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 숙주 세포에서 생산된다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 CD47을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 CD47을 과발현하도록 변형된다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 MHC-I을 발현하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 CD47고/MHC-I-이다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 CD47고/MHC-I- HEK 293T 세포이다.
본 개시는 또한 (i) 조직 특이적 프로모터, 및 (ii) SEQ ID NO: 1에 제시된 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 제공하며, 여기서 조직 특이적 프로모터는 간 세포에서의 핵산 서열 발현을 추진한다.
본 개시는 또한 (i) 스플라이스 공여자 부위; (ii) 스플라이스 수용자 부위; (iii) gag 서열; (iv) Rev 반응성 요소; (v) 인핸서; (vi) 전사-후 조절 요소, (vii) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, 또는 SEQ ID NO: 7에 제시된 뉴클레오티드 서열에 대한 서열 동일성과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, 및 (viii) 마이크로RNA에 대한 표적 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 제공한다.
일부 실시 형태에서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 12에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 실시 형태에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 12에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 표면은 HEK293T 세포(ATCC® CRL-11268™)에서 생산된 대조군 렌티바이러스 벡터보다 더 높은 수준의 CD47 단백질을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 표면은 MHC-I을 포함하지 않는다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 유효 용량의 렌티바이러스 벡터를 대상체에 투여하는 단계를 포함하여, 혈우병 치료가 필요한 대상체에서 혈우병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 유효 용량은 약 5x1010 형질도입 단위/kg (TU/kg) 미만, 4x1010 TU/kg 미만, 3x1010 TU/kg 미만, 2x1010 TU/kg 미만, 1x1010 TU/kg 미만, 9x109 TU/kg 미만, 8x109 TU/kg 미만, 7x109 TU/kg 미만, 6x109 TU/kg, 5x109 TU/kg 미만, 4x109 TU/kg 미만, 3x109 TU/kg 미만, 2x109 TU/kg 미만, 1x109 TU/kg 미만, 약 9x108 TU/kg 미만, 또는 약 8x108 TU/kg 미만이다. 일부 실시 형태에서, 유효 용량은 약 5x1010 TU/kg, 약 4.5x1010 TU/kg, 약 4x1010 TU/kg, 약 3.5x1010 TU/kg, 약 3x1010 TU/kg, 약 2.5x1010 TU/kg, 약 2x1010 TU/kg, 약 1.5x1010 TU/kg, 약 1x1010 TU/kg, 약 9.5x109 TU/kg, 약 9x109 TU/kg, 약 8.5x109 TU/kg, 약 8x109 TU/kg, 약 7.5x109 TU/kg, 약 7x109 TU/kg, 약 6.5x109 TU/kg, 약 6x109 TU/kg, 약 5.5x109 TU/kg, 약 5x109 TU/kg, 약 4.5x109 TU/kg, 약 4x109 TU/kg, 약 3.5x109 TU/kg, 약 3x109 TU/kg, 약 2.5x109 TU/kg, 약 2x109 TU/kg, 약 1.5x109 TU/kg, 약 1x109 TU/kg, 약 9.5x108 TU/kg, 약 9x108 TU/kg, 약 8.5x108 TU/kg, 약 8x108 TU/kg, 약 7.5x108 TU/kg, 약 7x108 TU/kg, 약 6.5x108 TU/kg, 약 6x108 TU/kg, 약 5.5x108 TU/kg, 약 5x108 TU/kg, 약 4.5x108 TU/kg, 약 4x108 TU/kg, 약 3.5x108 TU/kg, 약 3x108 TU/kg, 약 2.5x108 TU/kg, 약 2x108 TU/kg, 약 1.5x108 TU/kg, 또는 약 1x108 TU/kg이다. 일부 실시 형태에서, 유효 용량은 5x1010 TU/kg 미만, 4.5x1010 TU/kg 미만, 4x1010 TU/kg 미만, 3.5x1010 TU/kg 미만, 3x1010 TU/kg 미만, 2.5x1010 TU/kg 미만, 2x1010 TU/kg 미만, 1.5x1010 TU/kg 미만, 1x1010 TU/kg 미만, 9.5x109 TU/kg 미만, 9x109 TU/kg 미만, 8.5x109 TU/kg 미만, 8x109 TU/kg 미만, 7.5x109 TU/kg 미만, 7x109 TU/kg 미만, 6.5x109 TU/kg 미만, 6x109 TU/kg 미만, 5.5x109 TU/kg 미만, 5x109 TU/kg 미만, 4.5x109 TU/kg 미만, 4x109 TU/kg 미만, 3.5x109 TU/kg 미만, 3x109 TU/kg 미만, 2.5x109 TU/kg 미만, 2x109 TU/kg 미만, 1.5x109 TU/kg 미만, 1x109 TU/kg 미만, 약 9.5x108 TU/kg 미만, 약 9x108 TU/kg 미만, 약 8.5x108 TU/kg 미만, 약 8x108 TU/kg 미만, 약 7.5x108 TU/kg 미만, 약 7x108 TU/kg 미만, 약 6.5x108 TU/kg 미만, 약 6x108 TU/kg 미만, 약 5.5x108 TU/kg 미만, 약 5x108 TU/kg 미만, 약 4.5x108 TU/kg 미만, 약 4x108 TU/kg 미만, 약 3.5x108 TU/kg 미만, 약 3x108 TU/kg 미만, 약 2.5x108 TU/kg 미만, 약 2x108 TU/kg 미만, 약 1.5x108 TU/kg 미만, 또는 약 1x108 TU/kg 미만이다. 일부 실시 형태에서, 유효 용량은 1x108 내지 5x1010 TU/kg, 1x108 내지 5x109 TU/kg, 1x108 내지 1x109 TU/kg, 1x108 내지 1x1010 TU/kg, 1x109 내지 5x1010 TU/kg, 2x109 내지 5x1010 TU/kg, 3x109 내지 5x1010 TU/kg, 4x109 내지 5x1010 TU/kg, 5x109 내지 5x1010 TU/kg, 1x109 내지 6x109 TU/kg, 2x109 내지 6x109 TU/kg, 3x109 내지 6x109 TU/kg, 4x109 내지 6x109 TU/kg, 5x109 내지 6x109 TU/kg, 6x109 내지 5x1010 TU/kg, 7x109 내지 5x1010 TU/kg, 8x109 내지 5x1010 TU/kg, 9x109 내지 5x1010 TU/kg, 1010 내지 5x1010 TU/kg, 1.5x1010 내지 5x1010 TU/kg, 2x1010 내지 5x1010 TU/kg, 2.5x1010 내지 5x1010 TU/kg, 3x1010 내지 5x1010 TU/kg, 3.5x1010 내지 5x1010 TU/kg, 4x1010 내지 5x1010 TU/kg, 또는 4.5x1010 내지 5x1010 TU/kg이다. 일부 실시 형태에서, 유효 용량은 1x109 내지 5x1010 TU/kg, 1x109 내지 4.5x1010 TU/kg, 1x109 내지 4x1010 TU/kg, 1x109 내지 3.5x1010 TU/kg, 1x109 내지 3x1010 TU/kg, 1x109 내지 2.5x1010 TU/kg, 1x109 내지 2x1010 TU/kg, 1x109 내지 1.5x1010 TU/kg, 1x109 내지 1010 TU/kg, 1x109 내지 9x109 TU/kg, 1x109 내지 8x109 TU/kg, 1x109 내지 7x109 TU/kg, 1x109 내지 6x109 TU/kg, 1x109 내지 5x109 TU/kg, 1x109 내지 4x109 TU/kg, 1x109 내지 3x109 TU/kg, 및 1x109 내지 2x109 TU/kg이다. 일부 실시 형태에서, 유효 용량은 1x1010 내지 2x1010 TU/kg, 1.1x1010 내지 1.9x1010 TU/kg, 1.2x1010 내지 1.8x1010 TU/kg, 1.3x1010 내지 1.7x1010 TU/kg, 또는 1.4x1010 내지 1.6x1010 TU/kg. 일부 실시 형태에서, 유효 용량은 약 4x109 TU/kg 내지 약 6x109 TU/kg이다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 단일 용량 또는 다회 용량으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 정맥내 주사를 통해 투여된다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 소아 대상체이다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 성체 대상체이다.
일부 실시 형태에서, SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열. 본 개시는 또한 본원에 개시된 핵산 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조직 특이적 프로모터는 표적 간 세포에서 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 선택적으로 향상시킨다. 일부 실시 형태에서, 표적 간 세포에서 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 선택적으로 향상시키는 조직 특이적 프로모터는 APOA2 프로모터, SERPINA1(hAAT) 프로모터, mTTR 프로모터, MIR122 프로모터, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적 간 세포는 간세포이다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 스플라이스 공여자 부위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 스플라이스 수용자 부위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 gag 서열, pol 서열, rev 서열, rev 반응성 요소(RRE), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, gag 서열은 전장 또는 절단형 gag 서열이다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 인핸서, 마이크로RNA에 대한 표적 서열, 전사-후 조절 요소, 패키징 신호, 폴리-A 서열, 인트론 서열, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본 개시는 또한 본원에 개시된 핵산 서열 또는 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 세포는 포유류 세포이다. 일부 실시 형태에서, 세포는 CHO 세포, HEK293 세포, BHK21 세포, PER.C6® 세포, NS0 세포, 및 CAP 세포이다. 일부 실시 형태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시 형태에서, 세포는 CD47 단백질을 발현한다. 일부 실시 형태에서, 세포는 CD47을 과발현하도록 변형된다. 일부 실시 형태에서, 세포는 세포 표면 상에 CD47을 과발현하도록 변형되지 않은 대조군 세포와 비교하여 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3.0배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4.0배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5.0배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6.0배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7.0배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8.0배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9.0배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배 더 많은 CD47 단백질을 포함한다. 일부 실시 형태에서, CD47은 인간 CD47이다. 일부 실시 형태에서, 세포는 MHC-I을 발현하지 않는다.
본 개시는 또한 적합한 조건 하에 본원에 개시된 세포를 배양하는 것을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 렌티바이러스 벡터("LV-coFIX-1-R338L")의 벡터 지도이다.
도 2a 내지 도 2b는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 8주차에 투여한 후 HemB 마우스에 대한 혈장 FIX 활성을 그래프로 나타낸 것이다. 도 2a는 3E9, 7.5E9, 2E10, 또는 6E10 TU/kg의 용량으로 꼬리 정맥 주사를 통해 LV-coFIX-1-R338L 투여된 혈장 FIX 활성을 나타낸다. 도 2b는 상응하는 용량 반응 곡선을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다(도 2b).
도 3a 내지 도 3b는 7.5E9(원), 2E10(사각형), 또는 6E10(삼각형) TU/kg의 용량으로 꼬리 정맥 주사를 통해 8주차에 LV-coFIX-1-R338L 투여된 HemB 마우스에 대해 6개월까지 다양한 시점에서의 혈장 FIX 활성(도 3a) 및 혈장 FIX 항원(도 3b)을 그래프로 나타낸 것이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다(도 3a 내지 도 3b).
도 4a 내지 도 4b는 신생아, 청소년, 또는 성체 단계에서 6개월까지 다양한 시점에서의 지속적인 FIX 발현(도 4a) 및 유사한 용량을 이용한 LV-FIX 용량 반응(도 4b)을 그래프로 나타낸 것이다. HemB 마우스에 8주차(사각형) 또는 2일차(원)에서 7.5E9, 2E10, 또는 6E10 TU/kg의 용량으로 LV-coFIX-1-R338L 정맥내 주사로 투여하거나; HemB 마우스에, 표시된 바와 같이, 2주령(삼각형)에서 3E9, 7.5E9, 또는 2E10 TU/kg의 용량으로 LV-coFIX-1-R338L 정맥내 주사로 투여하였다(도 4a). 용량 반응은 8주차(사각형), 2주차(삼각형), 및 2일차(원)의 HemB 마우스에서 도 4a에서 테스트된 다양한 용량으로 FIX 활성을 통해 측정하였다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다(도 4a 내지 도 4b).
도 5는 대조군 렌티바이러스 벡터(LV; 검은색 원) 또는 CD47의 높은 표면 수준을 갖는 렌티바이러스 벡터(CD47hi LV; 회색 원)의 투여 후 NOD 마우스 대식세포에서 렌티바이러스 벡터의 벡터 카피 수(VCN)를 도시하는 도표이고, 대식세포에 존재하는 렌티바이러스 벡터 분자의 수를 결정하였다. HEK293T 세포 VCN 데이터는 대조군으로 나타난다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 6a 내지 도 6c는 대조군 렌티바이러스 벡터(LV-FIX; #1, #2, 및 #3), CD47의 높은 표면 수준을 갖는 렌티바이러스 벡터(CD47hi LV-FIX; #4, #5, 및 #6), 또는 비히클 대조군(#7)에 패키징된 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터의 투여 후 마카카 네메스트리나(Macaca nemestrina) 원숭이에서의 혈장 FIX 활성(도 6a), 혈장 FIX 항원(도 6b), 및 FIX 기능(APTT 시간으로 표시; 도 6c)을 그래프로 나타낸 것이다.
도 7a 내지 도 7b는, 혈장 FIX 활성(도 7a) 및 혈장 FIX 항원(도 7b)으로 표시된, E9 TU/kg의 용량으로 투여되는, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포함하는 CD47고 렌티바이러스 벡터의 투여 후 마카카 네메스트리나 원숭이에서의 정상 상태 렌티바이러스 벡터-매개 FIX 발현을 그래프로 나타낸 것이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다(도 7a 내지 도 7b).
도 8a 내지 도 8d는 비히클(흰색 원), 대조군 렌티바이러스 벡터(LV; 검은색 원) 또는 CD47의 높은 표면 수준을 갖는 렌티바이러스 벡터(CD47hi LV; 회색 원) 렌티바이러스 벡터는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포함 투여 후 마카카 네메스트리나 원숭이에서의 ALT 수준(도 8a), AST 수준(도 8b), 림프 수준(도 8c), 및 체온(도 8d)을 그래프로 나타낸 것이다.
도 9a 내지 도 9c는 비히클(검은색 원), 대조군 렌티바이러스 벡터(LV; 검은색 사각형) 또는 CD47의 높은 표면 수준을 갖는 렌티바이러스 벡터(CD47hi LV; 열린 사각형) 렌티바이러스 벡터는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포함 투여 후 마카카 네메스트리나 원숭이에서의 MIP-1a(9a), MIP-1b(9b), 및 MCP-1(9c)의 발현 수준을 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 비히클(삼각형), 대조군 렌티바이러스 벡터(변경된 삼각형) 또는 CD47hi LV(원)의, 마카카 네메스트리나 원숭이로의 투여 후 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터의 조직 특이적 분포(VCN으로 나타남)를 도시하는 산점도이다. 각각의 데이터 세트는 개별 마카카 네메스트리나 원숭이를 나타낸다.
도 11a 및 도 11b는, 혈장 FIX 활성(도 11a) 및 혈장 FIX 항원(도 11b)으로 표시된, 2.5 E9 TU/kg의 용량으로 투여되는, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포함하는 CD47고 렌티바이러스 벡터의 투여 후 마카카 네메스트리나 원숭이에서의 정상 상태 렌티바이러스 벡터-매개 FIX 발현을 그래프로 나타낸 것이다.
본 개시의 상세한 설명
본 개시는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 렌티바이러스 벡터, 및 이를 사용하는 방법을 기술한다. 따라서, 일부 양태에서, 본 발명은 인자 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 투여를 포함하는 유전자 요법에 관한 것이다. 특정 양태에서, 본 발명은 간(예를 들어, 간세포)에 표적화된 코돈 최적화 인자 FIX 핵산 서열을 포함하는 렌티 바이러스 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 혈우병(예를 들어, 혈우병 B)과 같은 출혈 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스진 발현 카세트를 표적 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합시키는 유전자 요법 접근법을 통해 당업계의 중요한 요구를 충족시킨다.
이 시스템은 렌티바이러스 벡터가 대상체에게 5x1010의 형질도입 단위/kg(TU/kg) 이하, 예를 들어, 약 1.5x1010 TU/kg 이하, 또는 약 1.5x109 TU/kg 이하, 또는 약 1x108 TU/kg 이하의 적어도 1회 용량으로 투여되는 경우의 표적화 세포(예를 들어, 간세포)에서의 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 증가된 장시간 발현을 보여준다.
본 발명의 예시적 구축물은 첨부된 도면 및 서열 목록에 예시되어 있다.
명세서 및 청구범위에 대한 명확한 이해를 제공하기 위해, 다음 정의가 아래에 제공된다.
I. 정의
용어 "하나"("a" 또는 "an")의 엔티티는 그 엔티티의 하나 이상을 지칭함이 주목되어야 하며, 예를 들어, "뉴클레오티드 서열"은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 그러므로, 용어 "하나", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다.
용어 "약(about)"은 본원에서 대략적으로, 대강, 가량, 또는 ~한 정도를 의미하도록 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 관련하여 사용되는 경우, 이것은 기재된 수치의 위와 아래로 경계를 확장함으로써 그 범위를 수식한다. 일반적으로, 용어 "약"은 본원에서 10% 위 또는 아래의(더 높거나 더 낮은) 변량만큼 언급된 값보다 높고 낮은 수치를 수식하도록 사용된다.
본 발명의 목적상, 용어 "단리된"은 생물학적 물질(세포, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체)을 그의 원래의 환경(그것이 자연에서 존재하는 환경)으로부터 꺼낸 것을 나타낸다. 예를 들어, 식물 또는 동물에서 자연 상태에 존재하는 폴리뉴클레오티드는 단리된 것이 아니지만, 인접 핵산(여기에는 상기 폴리뉴클레오티드가 자연적으로 존재함)으로부터 분리된 상기 폴리뉴클레오티드는 "단리된" 것으로 간주된다. 특정 정제 수준은 필요하지 않다. 재조합적으로 생성된 폴리펩티드 및 단백질(숙주 세포에서 발현됨)은, 임의의 적합한 기술에 의해 분리되거나, 분획화되거나 또는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드가 그러하듯이, 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다.
"핵산", "핵산 분자", "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호교환가능하게 사용되고, 리보뉴클레오시드(아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 사이티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오시드(데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시타이미딘 또는 데옥시사이티딘; "DNA 분자")의 포스페이트 에스테르 중합체 형태, 또는 임의의 이의 포스포에스테르 유사체, 예컨대 포스포로티오에이트 및 티오에스테르(단일 가닥 형태, 또는 이중 가닥 나선)를 지칭한다. 이중 가닥 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 나선이 가능하다. 용어 핵산 분자, 및 특히 DNA 또는 RNA 분자는 오직 분자의 1차 및 2차 구조를 의미하고, 이것을 임의의 특정한 3차 형태로 제한하지 않는다. 따라서, 이 용어는 선형 또는 원형 DNA 분자(예를 들어, 제한 단편)로 특히 발견되는 이중 가닥 DNA, 플라스미드, 슈퍼코일 DNA 및 염색체를 포함한다. 특정한 이중 가닥 DNA 분자의 구조를 논의하는 데 있어서, 서열은 DNA의 비전사된 가닥(즉, mRNA에 서열 상동성을 갖는 가닥)을 따라 오직 5'→3' 방향의 서열을 주는 일반 관계에 따라 본 명세서에 기술될 수 있다. "재조합 DNA 분자"는 분자 생물학적 조작을 겪은 DNA 분자이다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 합성 DNA 및 반합성 DNA를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 "핵산 조성물"은 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 핵산을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "코딩 영역" 또는 "코딩 서열"은 아미노산으로 번역 가능한 코돈으로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 부분이다. "종결 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 전형적으로 아미노산으로 번역되지 않음에도 불구하고 코딩 영역의 부분인 것으로 간주될 수 있지만, 임의의 플랭킹 서열, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결자, 인트론 등은 코딩 영역의 부분이 아니다. 코딩 영역의 경계는 전형적으로 생성된 폴리펩티드의 아미노 말단을 인코딩하는 5' 말단에서의 출발 코돈 및 생성된 폴리펩티드의 카르복실 말단을 인코딩하는 3' 말단에서의 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 2개 이상의 코딩 영역은 단일 폴리뉴클레오티드 구축물에서, 예를 들어 단일 벡터 상에, 또는 별개의 폴리뉴클레오티드 구축물에서, 예를 들어 별개의(상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 이후, 단일 벡터가 단지 단일 코딩 영역을 함유할 수 있거나, 2개 이상의 코딩 영역을 포함하는 것이 된다.
포유류 세포에 의해 분비된 특정한 단백질은 조면 소포체에 걸쳐 성장하는 단백질 사슬의 배출이 개시되면 성숙 단백질로부터 절단되는 분비 신호 펩티드와 회합된다. 당업계의 숙련자는 신호 펩티드가 일반적으로 폴리펩티드의 N-말단에 융합되고, 완전한 또는 "전장" 폴리펩티드로부터 절단되어서 폴리펩티드의 분비된 또는 "성숙" 형태를 생성한다는 것을 알고 있다. 특정한 실시 형태에서, 천연 신호 펩티드 또는 그 서열의 기능성 유도체는 이것과 작동가능하게 회합된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 능력을 보유한다. 대안적으로, 비상동성 포유류 신호 펩티드, 예를 들어 인간 조직 플라스미노겐 활성자(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다아제 신호 펩티드, 또는 이의 기능성 유도체를 사용할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "FIX 활성을 갖는 폴리펩티드"는 응고 인자 IX와 관련된 하나 이상의 활성을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. FIX: 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 테스트, 발색 분석, ROTEM® 분석, 프로트롬빈 시간(PT) 테스트(INR 결정에도 사용됨), 피브리노겐 테스트(종종 클라우스(Clauss) 방법에 의함), 혈소판 계수, 혈소판 기능 테스트(종종 PFA-100에 의함), TCT, 출혈 시간, 혼합 테스트(환자의 혈장이 정상 혈장과 혼합되는 경우 이상이 교정되는지 여부), 응고 인자 분석, 항인지질 항체, D-이량체, 유전자 테스트(예를 들어, 인자 V 라이덴(Leiden), 프로트롬빈 돌연변이 G20210A), 희석 러셀사(Russell’s viper) 독 시간(dRVVT), 기타 혈소판 기능 테스트, 혈전 탄성 묘사도(TEG 또는 소노클로트(Sonoclot)), 혈전 탄성 측정(TEM®, 예를 들어 ROTEM®), 또는 유글로불린 용해 시간(ELT)을 포함하는, 다수의 테스트가 응고 시스템의 기능을 평가하기 위해 사용 가능하다.
aPTT 테스트는 "내재성"(접촉 활성화 경로로도 지칭됨) 및 통상적 응고 경로 둘 모두의 효능을 측정하는 성능 지표이다. 이 테스트는 통상적으로 상업적으로 이용 가능한 재조합 응고 인자, 예를 들어 FIX의 응고 활성을 측정하는 데 사용된다. 외인성 경로를 측정하는, 프로트롬빈 시간(PT)과 함께 사용된다.
ROTEM® 분석은 지혈의 전체 동역학: 응고 시간, 혈전 형성, 혈전 안정성 및 용해에 대한 정보를 제공한다. 혈전 탄성 측정의 상이한 파라미터들은 혈장 응고 시스템의 활성, 혈소판 기능, 섬유소 용해, 또는 이들 상호 작용에 영향을 미치는 많은 인자에 의존한다. 이 분석은 이차 지혈에 대한 완전한 관점을 제공할 수 있다.
용어 "하류"는 기준 뉴클레오티드 서열에 대하여 3'에 위치한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 특정한 실시 형태에서, 하류 뉴클레오티드 서열은 전사의 출발점 뒤의 서열과 관련된다. 예를 들어, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사의 시작 부위의 하류에 위치한다.
용어 "상류"는 기준 뉴클레오티드 서열에 대하여 5'에 위치한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 특정한 실시 형태에서, 상류 뉴클레오티드 서열은 코딩 영역의 5'측 또는 전사의 출발점에 위치한 서열과 관련된다. 예를 들어, 대부분의 프로모터는 전사의 시작 부위의 상류에 위치한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자 조절 영역" 또는 "조절 영역"은 코딩 영역의 상류(5' 비코딩 서열)에, 내에 또는 하류(3' 비코딩 서열)에 위치하고, 회합된 코딩 영역의 전사, RNA 프로세싱, 안정성 또는 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 영역은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 프로세싱 부위, 이펙터 결합 부위 및 스템-루프 구조를 포함할 수 있다. 코딩 영역이 진핵 세포에서의 발현용으로 의도되는 경우, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 보통 코딩 서열에 대하여 3'에 위치할 것이다.
유전자 산물, 예를 들어 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 코딩 영역과 작동가능하게 회합된 프로모터 및/또는 다른 발현(예를 들어, 전사 또는 번역) 제어 요소를 포함할 수 있다. 작동가능한 회합에서, 유전자 산물, 예를 들어 폴리펩티드에 대한 코딩 영역은 조절 영역(들)의 영향 또는 제어 하에 유전자 산물의 발현을 두는 방식으로 하나 이상의 조절 영역과 회합된다. 예를 들어, 코딩 영역 및 프로모터는, 프로모터 기능의 유도가 코딩 영역에 의해 인코딩된 유전자 산물을 인코딩하는 mRNA의 전사를 발생시키는 경우, 및 프로모터와 코딩 영역 사이의 연결의 성질이 전사되는 DNA 주형의 능력을 방해하거나 유전자 산물의 발현을 지시하는 프로모터의 능력을 방해하는 것이 아닌 경우 "작동가능하게 회합"된 것이다. 프로모터 외에 다른 발현 제어 요소, 예를 들어 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서 및 전사 종결 신호도 유전자 산물 발현을 지시하도록 코딩 영역과 작동가능하게 회합될 수 있다.
"전사 제어 서열"은 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 제공하는 DNA 조절 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 종결자 등을 지칭한다. 다양한 전사 제어 영역은 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다. 이것은, 제한 없이, 척추동물 세포에서 기능하는 전사 제어 영역, 예컨대 사이토메갈로바이러스(인트론-A와 함께인 극초기 프로모터), 시미안 바이러스 40(초기 프로모터) 및 레트로바이러스(예컨대, 라우스 육종 바이러스)(이에 한정되지 않음)로부터의 프로모터 및 인핸서 절편을 포함한다. 다른 전사 제어 영역은 액틴, 열 쇼크 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 β-글로빈과 같은 척추동물 유전자로부터 유래된 것, 및 진핵 세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 서열을 포함한다. 추가의 적합한 전사 제어 영역은 조직 특이적 프로모터 및 인핸서, 및 림포카인 유도성 프로모터(예를 들어, 인터페론 또는 인터류킨에 의해 유도 가능한 프로모터)를 포함한다.
유사하게, 다양한 번역 제어 요소는 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다. 이것은 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈 및 피코르나바이러스로부터 유래된 요소(특히 내부 리보솜 진입 부위 또는 IRES, CITE 서열이라고도 칭함)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 유전자 산물, 예를 들어 RNA 또는 폴리펩티드를 생산하는 과정을 지칭한다. 이것은 제한 없이 메신저 RNA(mRNA), 운반 RNA(tRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 임의의 다른 RNA 산물로의 폴리뉴클레오티드의 전사, 및 폴리펩티드로의 mRNA의 번역을 포함한다. 발현은 "유전자 산물"을 생산한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 유전자 산물은 핵산, 예를 들어 유전자의 전사에 의해 생산된 메신저 RNA 또는 전사체로부터 번역된 폴리펩티드일 수있다. 본원에 기술된 유전자 산물은 전사 후 변형, 예를 들어 폴리아데닐화 또는 스플라이싱을 갖는 핵산 또는 번역 후 변형, 예를 들어 메틸화, 글리코실화, 지질의 부가, 다른 단백질 서브유닛과의 회합 또는 단백질 분해 절단을 갖는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "수율"은 유전자의 발현에 의해 생성된 폴리펩티드의 양을 지칭한다.
"벡터"는 숙주 세포로의 핵산의 운반 및/또는 클로닝을 위한 임의의 비히클을 지칭한다. 벡터는 부착된 절편의 복제를 발생시키도록 또 다른 핵산 절편이 부착될 수 있는 레플리콘일 수 있다. "레플리콘"은 생체 내 복제의 자율 단위로서의 기능을 하는, 즉 그 자체의 제어 하에 복제할 수 있는 임의의 유전 요소(예를 들어, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 지칭한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 세포 외 또는 생체 내 세포로 핵산을 도입하기 위한 바이러스 비히클 및 비바이러스 비히클 둘 다를 포함한다. 많은 수의 벡터는 당업계에서 공지되고 사용되며, 이는 예를 들어 플라스미드, 변형된 진핵생물 바이러스 또는 변형된 박테리아 바이러스를 포함한다. 적합한 벡터로의 폴리뉴클레오티드의 삽입은 상보성 응착성 말단을 갖는 선택된 벡터로 적절한 폴리뉴클레오티드 단편을 결찰함으로써 달성될 수 있다.
벡터는 벡터가 혼입된 세포의 선별 또는 확인을 제공하는 선별가능한 마커 또는 리포터를 인코딩하도록 조작될 수 있다. 선별가능한 마커 또는 리포터의 발현은 벡터에 함유된 다른 코딩 영역이 혼입되고 이를 발현하는 숙주 세포의 확인 및/또는 선별을 허용한다. 당업계에서 공지되고 사용된 선별가능한 마커 유전자의 예는 암피실린, 스트렙타비딘, 겐타마이신, 카나마이신, 하이그로마이신, 비알라포스 제초제, 술폰아미드 등에 대한 내성을 제공하는 유전자; 및 표현형 마커로서 사용되는 유전자, 즉 안토시아닌 조절 유전자, 이소펜타닐 트랜스퍼라아제 유전자 등을 포함한다. 당업계에서 공지되고 사용된 리포터의 예는 루시퍼라아제(Luc), 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), β-갈락토시다아제(LacZ), β-글루쿠로니다아제(Gus) 등을 포함한다. 선별가능한 마커는 또한 리포터인 것으로 생각될 수 있다.
용어 "선별 가능한 마커"는 확인 인자, 보통 마커 유전자의 효과(즉 항생제에 대한 내성, 제초제에 대한 내성)에 기초하여 선택될 수 있는 항생제 또는 화학물질 내성 유전자, 비색 마커, 효소, 형광 마커 등을 의미하고, 여기서 효과는 관심 대상의 핵산의 유전성을 추적하고/하거나, 관심 대상의 핵산을 유전시킨 세포 또는 유기체를 확인하도록 이용된다. 당업계에서 공지되고 사용된 선별가능한 마커 유전자의 예는 암피실린, 스트렙타비딘, 겐타마이신, 카나마이신, 하이그로마이신, 비알라포스 제초제, 술폰아미드 등에 내성을 제공하는 유전자; 및 표현형 마커로서 사용되는 유전자, 즉 안토시아닌 조절 유전자, 이소펜타닐 트랜스퍼라아제 유전자 등을 포함한다.
용어 "리포터 유전자"는 리포터 유전자의 효과에 기초하여 확인될 수 있는 확인 인자를 인코딩하는 핵산을 지칭하고, 여기서 효과는 관심 대상의 핵산의 유전성을 추적하고/하거나, 관심 대상의 핵산을 유전시킨 세포 또는 유기체를 확인하고/하거나, 유전자 발현 유도 또는 전사를 측정하는 데 이용된다. 당업계에서 공지되고 사용된 리포터 유전자의 예는 루시퍼라아제(Luc), 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), β-갈락토시다아제(LacZ), β-글루쿠로니다아제(Gus) 등을 포함한다. 선별가능한 마커 유전자는 또한 리포터 유전자인 것으로 생각될 수 있다.
"프로모터" 및 "프로모터 서열"은 상호교환가능하게 사용되고, 코딩 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열에 대하여 3'에 위치한다. 프로모터는 그 전체가 천연 유전자로부터 유래될 수 있거나, 자연에서 발견된 상이한 프로모터로부터 유래된 상이한 요소로 구성될 수 있거나, 심지어 합성 DNA 절편을 포함할 수 있다. 당업계의 숙련자에 의해 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 또는 상이한 발생 단계에서, 또는 상이한 환경학적 또는 생리학적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있는 것이 이해된다. 대부분의 세포 유형에서 유전자가 발현되게 하는 프로모터는 대부분의 때에 "구성적 프로모터"라 흔히 칭해진다. 특이적 세포 유형에서 유전자가 발현되게 하는 프로모터는 "세포 특이적 프로모터" 또는 "조직 특이적 프로모터"라 흔히 칭해진다. 특정한 발생 또는 세포 분화 단계에서 유전자가 발현되게 하는 프로모터는 "발생적 특이적 프로모터" 또는 "세포 분화 특이적 프로모터"라 흔히 칭해진다. 프로모터를 유도하는 에이전트, 생물학적 분자, 화학물질, 리간드, 광 등에 의한 세포의 노출 또는 처리 후 유전자가 발현되게 하거나 유도되는 프로모터는 "유도성 프로모터" 또는 "조절 가능한 프로모터"라 흔히 칭해진다. 대부분의 경우에 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 한정되지 않으므로, 상이한 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있는 것으로 추가로 인식된다.
프로모터 서열은 전형적으로 전사 개시 부위에 의해 이의 3' 말단에서 결합되고, 배경 위의 검출 가능한 수준에서 전사를 개시시키기 위해 필요한 염기 또는 요소의 최소 수를 포함하도록 상류(5' 방향)로 연장한다. (편리하게는 예를 들어 뉴클레아제 S1에 의한 맵핑에 의해 한정된) 전사 개시 부위, 및 RNA 중합효소의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인(콘센서스 서열)이 프로모터 서열 내에서 발견될 것이다.
용어 "플라스미드"는 보통 원형 이중 가닥 DNA 분자의 형태의 세포의 중추 대사의 부분이 아닌 유전자를 흔히 운반하는 염색체외 요소를 지칭한다. 이러한 요소는, 세포로 적절한 3' 비번역된 서열을 따라 선택된 유전자 산물에 대한 DNA 서열 및 프로모터 단편을 도입할 수 있는, 독특한 구성으로 다수의 뉴클레오티드 서열이 연결되거나 재조합된, 임의의 공급원로부터 유래된, 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA의 선형, 원형 또는 슈퍼코일링된, 자율 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
"클로닝 벡터"는 순차적으로 복제하는 핵산의 단위 길이이고, 부착된 절편의 복제를 발생시키도록 또 다른 핵산 절편이 부착할 수 있는 복제 기점, 예컨대 플라스미드, 파지 또는 코스미드를 포함하는 "레플리콘"을 지칭한다. 특정한 클로닝 벡터는 하나의 세포 유형, 예를 들어 박테리아에서의 복제 및 또 다른, 예를 들어 진핵 세포에서의 발현을 할 수 있다. 클로닝 벡터는 전형적으로 벡터를 포함하는 세포의 선택에 사용될 수 있는 하나 이상의 서열 및/또는 관심 대상의 핵산 서열의 삽입을 위한 하나 이상의 다수의 클로닝 부위를 포함한다.
용어 "발현 벡터"는 숙주 세포로의 삽입 후 삽입된 핵산 서열의 발현을 허용하도록 설계된 비히클을 지칭한다. 삽입된 핵산 서열은 상기 기술된 바와 같은 조절 영역과 회합되어 작동가능하게 위치한다.
벡터는 당업계에 널리 공지된 방법, 예를 들어 형질감염, 전기천공, 미량주입, 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침전, 리포펙션(리소좀 융합), 유전자 총의 사용 또는 DNA 벡터 운반체에 의해 숙주 세포로 도입된다. 본원에 사용된 "렌티바이러스 벡터"는 복제-결함 하이브리드 바이러스 입자를 지칭한다. 일부 맥락에서, 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 입자 및 둘러싸인 렌티바이러스 게놈을 지칭한다. 일부 맥락에서, 렌티바이러스 벡터는, 이의 임의의 변형을 포함하는, 렌티바이러스 게놈을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "배양", "에 대한 배양" 및 "배양하는"은 세포 성장 또는 분열을 허용하는 시험관 내 조건 하에 세포를 배양하거나, 세포를 살아 있는 상태로 유지시키는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "배양된 세포"는 시험관 내 증식된 세포를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 단일 "폴리펩티드", 및 복수 "폴리펩티드들"을 포함하도록 의도되고, 아미드 결합(펩티드 결합으로도 공지됨)에 의해 직선으로 연결된 단량체(아미노산)로 이루어진 분자를 의미한다. 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산의 임의의 사슬 또는 사슬들을 의미하고, 생성물의 특정한 길이를 의미하지 않는다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 사슬" 또는 2개 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 의미하기 위해 사용된 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩티드"는 임의의 이들 용어 대신에 또는 이것과 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 제한 없이 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 또는 천연 비발생 아미노산에 의한 변형을 포함하는 폴리펩티드의 발현 후 변형의 산물을 의미하는 것으로 또한 의도된다. 폴리펩티드는 자연 생물학적 공급원 또는 제조된 재조합 기술로부터 유래될 수 있지만, 지정된 핵산 서열로부터 반드시 번역되지 않는다. 이것은 화학 합성을 포함하는 임의의 방식에 의해 생산될 수 있다.
용어 "아미노산"은 알라닌(Ala 또는 A); 아르기닌(Arg 또는 R); 아스파라긴(Asn 또는 N); 아스파르트산(Asp 또는 D); 시스테인(Cys 또는 C); 글루타민(Gln 또는 Q); 글루탐산(Glu 또는 E); 글리신(Gly 또는 G); 히스티딘(His 또는 H); 이소류신(Ile 또는 I): 류신(Leu 또는 L); 라이신(Lys 또는 K); 메티오닌(Met 또는 M); 페닐알라닌(Phe 또는 F); 프롤린(Pro 또는 P); 세린(Ser 또는 S); 트레오닌(Thr 또는 T); 트립토판(Trp 또는 W); 티로신(Tyr 또는 Y); 및 발린(Val 또는 V)을 포함한다. 비전통적인 아미노산은 또한 본 발명의 범위 내에 있고, 노르류신, 오미틴, 노르발린, 호모세린 및 다른 아미노산 잔기 유사체, 예컨대 문헌[Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)]에 기술된 것을 포함한다. 이러한 천연 비발생 아미노산 잔기를 생성하기 위해, 문헌[Noren et al. Science 244:182 (1989)] 및 상기 Ellman 등의 문헌의 절차를 이용할 수 있다. 간단히 말하면, 이 절차는 천연 비발생 아미노산 잔기에 의한 억제자 tRNA의 화학 활성화, 이어서 RNA의 시험관 내 전사 및 번역을 수반한다. 비전통적인 아미노산의 도입은 당업계에 공지된 펩티드 화학을 이용하여 또한 달성될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "극성 아미노산"은 0의 순 전하를 갖지만 이의 측쇄의 상이한 부분에서 0이 아닌 부분 전하를 갖는 아미노산(예를 들어, M, F, W, S, Y, N, Q, C)을 포함한다. 이 아미노산은 소수성 상호작용 및 정전기 상호작용에 참여할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "하전된 아미노산"은 이의 측쇄에서 0이 아닌 순 전하를 가질 수 있는 아미노산(예를 들어, R, K, H, E, D)을 포함한다. 이 아미노산은 소수성 상호작용 및 정전기 상호작용에 참여할 수 있다.
폴리펩티드의 단편 또는 변이체, 및 이들의 임의의 조합이 본 발명에 또한 포함된다. 용어 "단편" 또는 "변이체"는, 본 발명의 폴리펩티드 결합 도메인 또는 결합 분자를 언급할 때, 기준 폴리펩티드의 적어도 약간의 특성(예를 들어, FcRn 결합 도메인 또는 Fc 변이체에 대한 FcRn 결합 친화도, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드에 대한 응고 활성)을 보유하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드의 단편은 본 명세서에서 그 외 기술된 특이적 항체 단편 이외에 단백질분해 단편, 및 결실 단편을 포함하지만, 천연 발생 전장 폴리펩티드(또는 성숙 폴리펩티드)를 포함하지 않는다. 본 발명의 폴리펩티드 결합도메인 또는 결합 분자의 변이체는 상기 기술된 바와 같은 단편, 및 또한 아미노산 치환, 결실 또는 삽입으로 인해 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 변이체는 천연 또는 천연 비발생일 수 있다. 천연 비발생 변이체는 분야 공지된 돌연변이유발 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 보존적또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함할 수 있다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기에 의해 대체된 것이다. 염기성측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하는 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 따라서, 폴리펩티드에서의 아미노산이 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산에 의해 대체되는 경우, 치환은 보존적인 것으로 생각된다. 또 다른 실시 형태에서, 아미노산의 스트링은 측쇄 패밀리 구성원의 조성 및/또는 순서가 다른 구조적으로 유사한 스트링에 의해 보존적으로 대체될 수 있다.
당업계에 공지된 바와 같은 용어 "동일성 백분율"은, 서열을 비교함으로써 결정된 바와 같은, 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계이다. 당업계에서, "동일성"은 또한, 이러한 서열의 스트링 사이의 매치에 의해 결정된 바와 같이, 그 경우에서처럼, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성"은 문헌[Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); 및 Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991)]에 기술된 것(이에 한정되지 않음)을 포함하는 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험된 서열 사이의 최고의 매치를 주도록 설계된다. 동일성을 결정하기 위한 방법은 공공으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램에서 코드화된다. 서열 정렬 및 동일성 백분율 계산은 서열 분석 소프트웨어, 예컨대 LASERGENE bioinformaticscomputing suite의 Megalign 프로그램(DNASTAR Inc.(위스콘신주 매디슨)), 프로그램의 GCG 스위트(Wisconsin Package 버전 9.0, Genetics Computer Group (GCG)(위스콘신주 매디슨)), BLASTP, BLASTN, BLASTX(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)) 및 DNASTAR(DNASTAR, Inc.(미국 위스콘신주 53715 매디슨 스트리트 에스. 파크 1228))을 이용하여 수행될 수 있다.
본 출원의 맥락 내에, 서열 분석 소프트웨어가 분석에 사용되는 경우, 분석의 이 결과가, 달리 기술되지 않는 한, 언급된 프로그램의 "디폴트 값"에 기초한다고 이해될 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "디폴트 값"은 처음에 초기설정될 때 소프트웨어에 의해 원래 로딩하는 값 또는 매개변수의 임의의 세트를 의미할 것이다.
"융합" 또는 "키메라" 단백질은 성질상 자연에서 연결되지 않는 제2 아미노산 서열에 연결된 제1 아미노산 서열을 의미한다. 별개의 단백질에 보통 존재하는 아미노산 서열은 융합 폴리펩티드에 함께 놓일 수 있거나, 동일한 단백질에 보통 존재하는 아미노산 서열은 융합 폴리펩티드에서의 새로운 배열에, 예를 들어 Ig Fc 도메인에 의한 본 발명의 인자 FIX 도메인의 융합에 위치할 수 있다. 융합 단백질은 예를 들어 화학 합성에 의해 또는 펩티드 영역이 원하는 관계에서 인코딩된 폴리뉴클레오티드를 생성하고 번역함으로써 생성된다. 키메라 단백질은 공유, 비펩티드 결합 또는 비공유 결합에 의해 제1 아미노산 서열과 회합된 제2 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "삽입 부위"는 비상동성 모이어티가 삽입될 수 있는 위치의 바로 상류인 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 변이체 또는 유도체에서의 위치를 의미한다. "삽입 부위"는 숫자로서 지정되고, 달리 기재하지 않은 경우, 숫자는 삽입의 위치에 바로 N-말단인 삽입 부위가 상응하는 인간 FIX R338L 변이체(SEQ ID NO: 11 및 12)에서의 아미노산의 수이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 구절 "아미노산의 바로 하류"는 아미노산의 말단 카르복실기의 바로 옆의 위치를 의미한다. 유사하게, 구절 "아미노산의 바로 상류"는 아미노산의 말단 아민기의 바로 옆의 위치를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "삽입된", "삽입되는", "로 삽입된" 또는 문법상 관련된 용어는 천연 성숙 인간 FIX에서 유사한 위치에 대한 재조합 FIX 폴리펩티드에서의 비상동성 모이어티의 위치를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 천연 성숙 인간 FIX에 대한 재조합 FIX 폴리펩티드의 특징을 의미하고, 재조합 FIX 폴리펩티드가 제조되는 임의의 방법 또는 공정을 표시하거나 함축하거나 암시하지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "반감기"는 생체 내 특정한 폴리펩티드의 생물학적 반감기를 의미한다. 반감기는 순환으로부터 청소되는 대상체 및/또는 동물에서의 다른 조직에 투여되는 분량의 반에 필요한 시간에 의해 표시될 수 있다. 특정한 폴리펩티드의 청소율 곡선이 시간의 함수로서 작도될 때, 곡선은 보통 신속한 α-상 및 더 긴 β-상에 의해 이상성이다. α-상은 전형적으로 혈관내 공간과 혈관외 공간 사이의 투여된 Fc 폴리펩티드의 평형을 나타내고, 부분적으로 폴리펩티드의 크기에 의해 결정된다. β-상은 전형적으로 혈관내 공간에서의 폴리펩티드의 이화작용을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, FIX 및 FIX를 포함하는 키메라 단백질은 단상성이고, 이에 따라 알파 상을 갖지 않고, 단지 단일 베타 상을 갖는다. 따라서, 특정한 실시 형태에서, 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 반감기는 β-상에서의 폴리펩티드의 반감기를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "연결된"은 각각 제2 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열에 공유로 또는 비공유로 연결된 제1 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 제1 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에 직접적으로 연결되거나 병치될 수 있거나, 대안적으로 중재하는 서열은 제1 서열을 제2 서열에 공유로 연결할 수 있다. 용어 "연결된"은 C 말단 또는 N-말단에서의 제2 아미노산 서열에 대한 제1 아미노산 서열의 융합을 의미할 뿐만 아니라, 제2 아미노산 서열(또는 각각 제1 아미노산 서열)에서의 임의의 2개의 아미노산으로의 전체 제1 아미노산 서열(또는 제2 아미노산 서열)의 삽입을 포함한다. 일 실시 형태에서, 제1 아미노산 서열은 펩티드 결합 또는 링커에 의해 제2 아미노산 서열에 연결될 수 있다. 제1 뉴클레오티드 서열은 포스포디에스테르 결합 또는 링커에 의해 제2 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있다. 링커는 펩티드 또는 폴리펩티드(폴리펩티드 사슬의 경우) 또는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 사슬(뉴클레오티드 사슬의 경우) 또는 임의의 화학 모이어티(폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 사슬둘 다의 경우)일 수 있다. 용어 "연결된"은 또한 하이폰(-)으로 표시된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "회합된"은 제1 아미노산 사슬과 제2 아미노산 사슬 사이에 형성된 공유 또는 비공유 결합을 의미한다. 일 실시 형태에서, 용어 "회합된"은 공유, 비펩티드 결합 또는 비공유 결합을 의미한다. 이 회합은 콜론, 즉 (:)으로 표시될 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 이것은 펩티드 결합을 제외한 공유 결합을 의미한다. 예를 들어, 아미노산 시스테인은 디술피드 결합을 형성할 수 있는 티올기 또는 제2 시스테인 잔기에서의 티올기와의 브릿지를 포함한다. 대부분의 천연 발생 IgG 분자에서, CH1 및 CL 영역은 디술피드 결합에 의해 회합되고, 2개의 중쇄는 Kabat 넘버링 시스템(226번 또는 229번 위치, EU 넘버링 시스템)을 이용하여 239번 및 242번에 상응하는 위치에서 2개의 디술피드 결합에 의해 회합된다. 공유 결합의 예는 펩티드 결합, 디술피드 결합, 시그마 결합, pi 결합, 델타 결합, 글리코시드 결합, 아그노스트 결합(agnostic bond), 굽은 결합, 이극성 결합, Pi 백본, 이중 결합, 삼중 결합, 사중 결합, 오중 결합, 육중 결합, 공액, 초공액, 아로마시티, 합티시티(hapticity) 또는 반결합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 비공유결합의 비제한적인 예는 이온성 결합(예를 들어, 양이온-pi 결합 또는 염 결합), 금속 결합, 수소 결합(예를 들어, 이수소 결합, 이수소 복합체, 저장벽 수소 결합, 또는 대칭 수소 결합), 반 데르 발스 힘, 런던 분산 힘, 기계적 결합, 할로겐 결합, 친금성(aurophilicity), 치윤, 스태킹, 엔트로프 힘 또는 화학 극성을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "단량체-이량체 하이브리드"는 디술피드 결합에 의해 서로 회합된 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는 키메라 단백질을 의미하고, 제1 사슬은 응고 인자, 예를 들어 FIX 및 제1 Fc 영역을 포함하고, 제2 사슬은 응고 인자가 없는 제2 Fc 영역을 포함하거나, 본질적으로 이것으로 이루어지거나, 이것으로 이루어진다. 단량체-이량체 하이브리드 구축물은 따라서 적어도 하나의 응고 인자를 갖는 단량체 양태 및 2개의 Fc 영역을 갖는 이량체 양태를 포함하는 하이브리드이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 지혈은 출혈 또는 대출혈의 중지 또는 느려짐; 또는 혈관 또는 신체 부분을 통한 혈류의 느려짐 또는 저속을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 지혈 장애는 자발적으로 또는 외상의 결과로서, 피브린 혈전을 형성하는 것의 손상된 능력 또는 불능으로 인해 대출혈에 대한 경향을 특징으로 하는 유전적인 선천적 또는 후천적 병태를 의미한다. 3개의 주요 형태는 A 혈우병(인자 VIII 결핍증), B 혈우병(인자 IX 결핍증 또는 "크리스마스 질환") 및 C 혈우병(XI 인자 결핍증, 경증 출혈 경향)이다. 다른 지혈 장애는 예를 들어 폰 빌레브란트 질환, 인자 XI 결핍증(PTA 결핍증), 인자 XII 결핍증, 피브리노겐, 프로트롬빈, 인자 V, 인자 VII, 인자 X 또는 인자 XIII에서의 결핍증 또는 구조적 비정상, GPIb에서의 결함 또는 결핍증인 베르나르-술리에(Bernard-Soulier) 증후군을 포함한다. vWF에 대한 수용체인 GPIb는 결함성일 수 있고, 1차 혈전 형성(1차 지혈)의 부족 및 증가한 출혈 경향, 및 글랜즈먼(Glanzman) 및 네젤리(Naegeli)의 혈소판기능저하증(글랜즈먼 혈소판기능저하증)을 발생시켰다. 간부전(급성 및 만성 형태)에서, 간에 의한 응고 인자의 불충분한 생성이 존재하고; 이는 출혈 위험을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 단리된 핵산 분자를 포함하는 렌티바이러스 벡터가 예방적으로 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "예방적 치료"는 출혈 에피소드 전의 분자의 투여를 의미한다. 일 실시 형태에서, 일반 지혈제를 필요로 하는 대상체는 수술을 수술을 받고 있거나 곧 받을 예정이다. 예를 들어, 본 발명의 렌티바이러스 벡터는 예방적으로 수술 전에 또는 후에 투여될 수 있다. 본 발명의 렌티바이러스 벡터는 급성 출혈 에피소드를 제어하기 위해 수술 동안에 또는 후에 투여될 수 있다. 수술은 간 이식, 간 절제, 치과 시술 또는 줄기 세포 이식을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터는 대증적 치료에 또한 사용된다. 용어 "대증적 치료"는 출혈 에피소드의 증상에 반응하거나 출혈을 야기할 수 있는 활동 전에 본원에 개시된 렌티바이러스 벡터를 투여하는 것을 지칭한다. 일 양태에서, 대증적 치료는 출혈이 시작할 때, 예컨대 손상 후 또는 출혈이 예상될 때, 예컨대 수술 전 대상체에게 주어질 수 있다. 또 다른 양태에서, 대증적 치료는 접촉 스포츠와 같은 출혈의 위험을 증가시키는 활동 전에 주어질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "급성 출혈"은 기초하는 원인과 무관하게 출혈 에피소드를 의미한다. 예를 들어, 대상체는 외상, 요독증, 유전성 출혈 장애(예를 들어, FIX 결핍증) 혈소판 장애 또는 응고 인자에 대한 항체의 발생으로 인한 내성을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 치료한다, 치료, 치료하는 것은 예를 들어 질환 또는 병태의 중증도의 감소; 질환 과정의 기간의 감소; 질환 또는 병태와 연관된 하나 이상의 증상의 경감; 질환 또는 병태를 반드시 치유할 필요 없이 질환 또는 병태를 갖는 대상체에 대한 유리한 효과의 제공; 또는 질환 또는 병태와 연관된 하나 이상의 증상의 예방책을 의미한다. 일 실시 형태에서, 용어 "치료하는 것" 또는 "치료"는 본 발명의 렌티바이러스 벡터를 투여함으로써 대상체에서 적어도 약 1 IU/dL, 2 IU/dL, 3 IU/dL, 4 IU/dL, 5 IU/dL, 6 IU/dL, 7 IU/dL, 8 IU/dL, 9 IU/dL, 10 IU/dL, 11 IU/dL, 12 IU/dL, 13 IU/dL, 14 IU/dL, 15 IU/dL, 16 IU/dL, 17 IU/dL, 18 IU/dL, 19 IU/dL, 또는 20 IU/dL의 FIX 최저 수준을 유지시키는 것을 의미한다. 또 다른 실시 형태에서, 치료하는 것 또는 치료는 약 1 내지 약 20 IU/dL, 약 2 내지 약 20 IU/dL, 약 3 내지 약 20 IU/dL, 약 4 내지 약 20 IU/dL, 약 5 내지 약 20 IU/dL, 약 6 내지 약 20 IU/dL, 약 7 내지 약 20 IU/dL, 약 8 내지 약 20 IU/dL, 약 9 내지 약 20 IU/dL, 또는 약 10 내지 약 약 20 IU/dL의 FIX 최저 수준을 유지시키는 것을 의미한다. 질환 또는 병태의 치료 또는 치료하는 것은 또한 대상체에서 FIX 활성을, 비혈우병 대상체에서의 FIX 활성의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%에 필적하는 수준으로 유지시키는 것을 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 용어 “치료하는” 또는 “치료”는 본 발명의 렌티바이러스 벡터를 투여함으로써 대상체에서 FIX 최저 수준을 적어도 약 30 IU/dL, 40 IU/dL, 50 IU/dL, 60 IU/dL, 70 IU/dL, 80 IU/dL, 90 IU/dL, 100 IU/dL, 110 IU/dL, 120 IU/dL, 130 IU/dL, 140 IU/dL, 또는 150 IU/dL로 유지함을 의미한다. 또 다른 실시 형태에서, 치료하는 또는 치료는 FIX 최저 수준을 약 10 내지 약 20 IU/dL, 약 20 내지 약 23 IU/dL, 약 30 내지 약 40 IU/dL, 약 40 내지 약 50 IU/dL, 약 50 내지 약 60 IU/dL, 약 60 내지 약 70 IU/dL, 약 70 내지 약 80 IU/dL, 약 80 내지 약 90 IU/dL, 약 90 내지 약 100 IU/dL, 약 110 내지 약 120 IU/dL, 약 120 내지 약 130 IU/dL, 약 130 내지 약 140 IU/dL, 또는 약 140 내지 약 150 IU/dL로 유지함을 의미한다. 질환 또는 병태의 치료 또는 치료하는 것은 또한 대상체에서 FIX 활성을, 비혈우병 대상체에서의 FIX 활성의 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145% 또는 150%에 필적하는 수준으로 유지시키는 것을 포함할 수 있다. 치료에 필요한 최소 최저 수준은 하나 이상의 공지된 방법에 의해 측정될 수 있고, 각각의 사람에 대해 조정(증가 또는 감소)될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "투여하는"은 제약상 허용가능한 경로를 통해 대상체에게 제약상 허용가능한 FIX 인코딩 핵산 분자, FIX 폴리펩티드 또는 본 발명의 FIX 인코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 주는 것을 의미한다. 투여 경로는 정맥내, 예를 들어 정맥내 주사 및 정맥내 점적주사일 수 있다. 추가 투여 경로는 예를 들어 피하, 근육내, 경구, 비강 및 폐 투여를 포함한다. 핵산 분자, 폴리펩티드 및 벡터는 적어도 하나의 부형제를 포함하는 제약 조성물의 부분으로 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 구절 "이를 필요로 하는 대상체"는, 예를 들어 지혈을 개선하도록, 본 발명의 핵산 분자, 폴리펩티드 또는 벡터의 투여로부터 이익일 수 있는 대상체, 예컨대 포유류 대상체를 포함한다. 일 실시 형태에서, 대상체는 혈우병을 갖는 개인을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또 다른 실시 형태에서, 대상체는 FIX 저해제를 발생시키지 않고 이에 따라 우회 치료를 요하는 개인을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 대상체는 성인 또는 미성년자(예를 들어, 12세 미만)일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 여성이다. 다른 실시 형태에서, 대상체는 남성이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "응고 인자"는 대상체에서의 출혈 에피소드를 예방하거나 이의 기간을 감소시키는, 천연 발생 또는 재조합으로 생산된, 분자, 또는 이의 유사체를 의미한다. 즉, 이것은 응고촉진 활성을 갖는 분자를 의미하고, 즉 혈액이 응고되거나 혈전형성하도록 불용성 피브린의 메쉬로 피브리노겐의 전환을 담당한다. "활성화 가능한 응고 인자"는 활성 형태로 전환될 수 있는 불활성 형태의(예를 들어, 이의 지모겐 형태의) 응고 인자이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 응고 활성은 피브린 혈전의 형성에서 절정을 이루고/이루거나, 대출혈 또는 출혈 에피소드의 중증도, 기간 또는 빈도를 감소시키는 생화학적 반응의 캐스케이드에 참여하는 능력을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비상동성" 또는 "외인성"은 특정한 환경, 예를 들어 세포 또는 폴리펩티드에서 보통 발견되지 않는 분자를 의미한다. 예를 들어, 외인성 또는 비상동성 분자는 세포로 도입될 수 있고, 예를 들어 형질감염 또는 유전자 조작의 다른 형태에 의해 세포의 조작 후 오직 존재하거나, 비상동성 아미노산 서열은 이것이 자연에서 발견되지 않는 단백질에 존재할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비상동성 뉴클레오티드 서열"은 특정한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 자연에서 발생하지 않는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 일 실시 형태에서, 비상동성 뉴클레오티드 서열은 FIX의 반감기를 연장시킬 수 있는 폴리펩티드를 인코딩한다. 또 다른 실시 형태에서, 비상동성 뉴클레오티드 서열은 FIX의 수력학적 반경을 증가시키는 폴리펩티드를 인코딩한다. 다른 실시 형태에서, 비상동성 뉴클레오티드 서열은 이의 생물학적 활성 또는 기능(예를 들어, 이의 응혈 활성)에 유의미하게 영향을 미치지 않으면서 FIX의 하나 이상의 약동역학 특성을 개선하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 실시 형태에서, FIX는 링커에 의해 비상동성 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 결합되거나 연결된다. 비상동성 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드 모이어티의 비제한적인 예는 면역글로불린 불변 영역 또는 이의부분, 알부민 또는 이의 단편, 알부민 결합 모이어티, 트랜스페린, 미국 특허 출원 제20100292130호의 PAS 폴리펩티드, HAP 서열, 트랜스페린 또는 이의 단편, 인간 융모성 고나도트로핀의 β 서브유닛의 C 말단 펩티드(CTP), 알부민 결합 소분자, XTEN 서열, FcRn 결합 모이어티(예를 들어, FcRn에 결합하는 완전한 Fc 영역 또는 이의 일부분), 단쇄 Fc 영역(예를 들어, 미국 특허 제2008/0260738호, 국제 공개 제2008/012543호 또는 국제 공개 제2008/1439545호에 기술된 바와 같은 ScFc 영역), 폴리글리신 링커, 폴리세린 링커, 펩티드 및 무엇보다도 50% 미만 내지 50% 초과의 다양한 정도의 2차 구조를 갖는 글리신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P)으로부터 선택된 아미노산의 2개의 유형의 6개 내지 40개의 아미노산의 짧은 폴리펩티드, 또는 2개 이상의 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 비상동성 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드는 비폴리펩티드 모이어티에 연결된다. 비폴리펩티드 모이어티의 비제한적인 예는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG), 알부민 결합 소분자, 폴리시알산(PAS), 하이드록시에틸 전분(HES), 이의 유도체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Fc 영역"은 천연 Ig의 Fc 영역에 상응하는 폴리펩티드의 부분, 즉 이의 2개의 중쇄의 각각의 Fc 도메인의 이량체 회합에 의해 형성된 것으로 정의된다. 천연 Fc 영역은 또 다른 Fc 영역과 동종이량체를 형성한다. 반대로, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자 융합된 Fc 영역" 또는 "단쇄 Fc 영역"(scFc 영역)은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 유전자 연결된(즉, 단일 인접한 유전자 서열에서 인코딩된) Fc 도메인으로 이루어진 합성 이량체 Fc 영역을 의미한다.
일 실시 형태에서, "Fc 영역"은 파파인 절단 부위(즉, IgG에서의 잔기 216, 중쇄 불변 영역의 제1 잔기를 114번으로 취함)의 바로 상류에 힌지 영역에서 출발하고 항체의 C 말단에서 끝나는 단일 Ig 중쇄의 부분을 의미한다. 따라서, 완전한 Fc 도메인은 적어도 힌지 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
Ig 불변 영역의 Fc 영역은, Ig 이소타입에 따라, CH2, CH3 및 CH4 도메인, 및 힌지 영역을 포함할 수 있다. Ig의 Fc 영역을 포함하는 키메라 단백질은 증가한 안정성, 증가한 혈청 반감기(문헌[Capon et al., 1989, Nature 337:525] 참조), 및 Fc 수용체, 예컨대 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합(미국 특허 제6,086,875호, 제6,485,726호, 제6,030,613호; 국제 공개 제03/077834호; 미국 특허 제2003-0235536A1호)(본원에 그 전체가 참고로 포함됨)을 포함하는 키메라 단백질에 대한 몇몇 원하는 특성을 부여한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 뉴클레오티드 서열과 관련하여, 용어 "최적화된"은 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미하고, 폴리뉴클레오티드 서열은 그 폴리뉴클레오티드 서열의 특성을 증대시키도록 돌연변이된다. 일부 실시 형태에서, 최적화는 전사 수준을 증가시키거나, 번역 수준을 증가시키거나, 정상 상태 mRNA 수준을 증가시키거나, 조절 단백질, 예컨대 일반적인 전사 인자의 결합을 증가 또는 감소시키거나, 스플라이싱을 증가 또는 감소시키거나, 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 생성된 폴리펩티드의 수율을 증가시키기 위해 수행된다. 폴리뉴클레오티드 서열을 최적화하기 위해 이것에 이루어질 수 있는 변경의 예는 코돈 최적화, G/C 함량 최적화, 반복 서열의 제거, AT 풍부 요소의 제거, 은성(cryptic) 스플라이스 부위의 제거, 전사 또는 번역을 억제하는 시스 작용성 요소의 제거, 폴리-T 또는 폴리-A 서열의 부가 또는 제거, 전사를 증대시키는 전사 시작 부위 주의의 서열, 예컨대 Kozak 콘센서스 서열의 부가, 줄기 루프 구조를 형성하는 서열의 제거, 불안정화 서열의 제거, 및 2개 이상의 이들의 조합을 포함한다.
II. FIX 렌티바이러스 유전자 요법
체세포 유전자 요법은 출혈 장애, 특히 혈우병에 대한 가능한 치료법으로 연구되었다. 유전자 요법은 FIX를 인코딩하는 벡터의 단회 투여 후 FIX의 계속적인 내인성 생성을 통해 질환을 치유할 수 있는 잠재력 때문에 혈우병에 특히 매력적인 치료법이다. 혈우병 B는 임상 증상이 기능성 FIX의 감소된 발현에 기인하기 때문에 유전자 대체 접근법에 적합하다.
렌티바이러스 벡터는 큰 용량과 통합을 통해 트랜스진 발현을 유지하는 능력으로 인해 유전자 전달 비히클로서 두드러지고 있다. 렌티바이러스 벡터는 수많은 생체 외 세포 요법 임상 프로그램에서 평가되었으며, 유망한 효능 및 안전성 프로파일을 갖는다.
본 개시는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터의 유효 용량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 대조군 렌티바이러스 벡터, 예를 들어, 높은 수준의 표면 CD47 단백질 발현을 갖지 않은, 즉 정상(자연-발생) 수준의 표면 CD47 단백질 발현의 HEK293 세포(ATCC® CRL-1573™)에서 생산된 대조군 렌티바이러스 벡터보다 더 높은 수준의 표면 CD47 단백질 발현을 포함하는 렌티바이러스 입자 내에 패키징된다. 일부 실시 형태에서, 유효 용량은 렌티바이러스 벡터와 동일한 FIX 활성을 유도하는 데 필요한 대조군 렌티바이러스 벡터의 대조군 용량 대비 감소된다.
본 개시의 다른 양태는 인자 IX(FIX) 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터의 5x1010 형질 도입 단위/kg(TU/kg) 미만을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, 또는 SEQ ID NO: 7에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95 %, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 대상체는 대조군 렌티바이러스 벡터 대비, 투여 후 렌티바이러스 벡터의 대식세포 형질 도입 감소를 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 대조군 렌티바이러스 벡터 대비, 투여 후 렌티바이러스 벡터에 대한 이종 면역 반응 감소를 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 투여 후 적어도 3주에, 정상 FIX 활성 대비, 적어도 30%의 FIX 활성을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 투여 후 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두에서 렌티바이러스 벡터의 조직 특이적 발현을 나타낸다.
일부 실시 형태에서, 이종 반응은 투여된 렌티바이러스 벡터에 반응한 사이토카인의 방출을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 대조군 렌티바이러스 벡터의 투여 후의 사이토카인의 발현 대비 렌티바이러스 벡터의 투여 후 이종 반응 관련된 사이토카인의 더 낮은 발현을 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 사이토카인은 전-염증성 사이토카인이다. 특정 실시 형태에서, 사이토카인은 MIP-1a, MIP-1b, MCP-1, 인터루킨-2(IL-2), 인터페론 감마, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 실시 형태에서, 대상체는 대조군 렌티바이러스 벡터의 투여 후의 MIP-1a 발현 대비 렌티바이러스 벡터의 투여 후 더 낮은 수준의 MIP-1a 발현을 나타낸다. 특정 실시 형태에서, 대상체는 대조군 렌티바이러스 벡터의 투여 후의 MIP-1b 발현 대비 렌티바이러스 벡터의 투여 후 더 낮은 수준의 MIP-1b 발현을 나타낸다. 특정 실시 형태에서, 대상체는 대조군 렌티바이러스 벡터의 투여 후의 MCP-1 발현 대비 렌티바이러스 벡터의 투여 후 더 낮은 수준의 MCP-1 발현을 나타낸다. 특정 실시 형태에서, 대상체는 대조군 렌티바이러스 벡터의 투여 후의 IL-2 발현 대비 렌티바이러스 벡터의 투여 후 더 낮은 수준의 IL-2 발현을 나타낸다. 특정 실시 형태에서, 대상체는 대조군 렌티바이러스 벡터의 투여 후의 인터페론 감마 발현 대비 렌티바이러스 벡터의 투여 후 더 낮은 수준의 인터페론 감마 발현을 나타낸다.
일부 실시 형태에서, 사이토카인의 발현은, 대조군 렌티바이러스 벡터의 투여 후 사이토카인의 발현 대비, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75 %, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100% 만큼 감소된다. 특정 실시 형태에서, 사이토카인의 발현은 렌티바이러스 벡터의 투여 후 검출할 수 없다. 특정 실시 형태에서, 대상체는 렌티바이러스 벡터 투여 후 MIP-1a, MIP-1b, MCP-1, 인터루킨-2(IL-2), 인터페론 감마, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 사이토카인의 검출할 수 없는 발현을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 대상체는 투여 전 혈장 FIX 활성 대비 렌티바이러스 벡터의 투여 후 혈장 FIX 활성 증가를 나타낸다. 일부 실시 형태에서, 증가는 투여 후 적어도 1일, 적어도 약 2일, 적어도 약 3일, 적어도 약 4일, 적어도 약 5일, 적어도 약 6일, 적어도 약 7일, 적어도 약 8일, 적어도 약 9일, 적어도 약 10일, 적어도 약 11일, 적어도 약 12일, 적어도 약 13일, 적어도 약 14일, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주, 적어도 약 5주, 적어도 약 6주, 적어도 약 7주, 또는 적어도 약 8주에 관찰된다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 투여 후 약 12시간 내지 약 60시간, 약 12시간 내지 약 48시간, 약 12시간 내지 약 36시간, 약 12시간 내지 약 24시간, 약 24시간 내지 약 60시간, 약 24시간 내지 약 48시간, 약 24시간 내지 약 36시간, 약 36시간 내지 약 60시간, 약 36시간 내지 약 48시간, 또는 약 48시간 내지 약 60시간에서의 혈장 FIX 활성은 대조군 렌티바이러스 벡터의 대조군 용량을 투여받은 대상체 대비 증가된다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터 투여 후 FIX 활성은, 렌티바이러스 벡터의 투여 후 적어도 1주, 2주, 또는 3주에, 정상 FIX 활성 대비, 적어도 약 75%, 적어도 약 100%, 적어도 약 125%, 적어도 약 150%, 적어도 약 175%, 적어도 약 200%, 적어도 약 225%, 적어도 약 250%, 적어도 약 275%, 또는 적어도 약 300%이다. 특정 실시 형태에서, 대상체는 렌티바이러스 벡터의 투여 후 적어도 3주에, 정상 FIX 활성 대비, 적어도 약 150%의 FIX 활성을 나타낸다. 특정 실시 형태에서, 대상체는 렌티바이러스 벡터 투여 후 적어도 3주에, 정상 FIX 활성 대비, 적어도 약 200%의 FIX 활성을 나타낸다. 특정 실시 형태에서, 대상체는 렌티바이러스 벡터 투여 후 적어도 3주에, 정상 FIX 활성 대비, 적어도 약 225%의 FIX 활성을 나타낸다.
일부 실시 형태에서, 혈장 FIX 활성은 대조군 렌티바이러스 벡터의 대조군 용량을 투여받은 대상체 대비, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 적어도 약 100배, 적어도 약 110배, 적어도 약 120배, 적어도 약 130배, 적어도 약 140배, 적어도 약 150배, 적어도 약 160배, 적어도 약 170배, 적어도 약 180배, 적어도 약 190배, 또는 적어도 약 200배 만큼 투여 후 증가된다.
일부 실시 형태에서, 투여 후, 렌티바이러스 벡터는 대상체의 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두에 특이적으로 국소화되며, 여기서 렌티바이러스 벡터의 더 큰 농도가 대상체의 신체 중 다른 기관보다 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두에서 발견된다. 일부 실시 형태에서, 대상체의 신체 중 다른 기관은 고환, 림프-절, 근육, 흉선, 신장, 폐, 심장, 전두 피질, 시상, 꼬리 핵, 둔덕, 소뇌, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 대상체의 간 및 비장 외의 기관 대비, 렌티바이러스 벡터의 투여 후 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두로의 렌티바이러스 벡터 국소화 증가를 나타낸다. 렌티바이러스 벡터의 국소화는 당업계에 알려진 임의의 방법 및/또는 단위를 사용하여 측정 및/또는 표현될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 국소화 증가는, 대상체의 간 및 비장 외의 기관 대비, 렌티바이러스 벡터의 투여 후 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두에서 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 적어도 약 100배, 적어도 약 110배, 적어도 약 120배, 적어도 약 130배, 적어도 약 140배, 적어도 약 150배, 적어도 약 160배, 적어도 약 170배, 적어도 약 180배, 적어도 약 190배, 적어도 약 200배, 적어도 약 250배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 또는 적어도 약 500배 더 높은 렌티바이러스 벡터의 벡터 카피 수(VCN)를 특징으로 한다.
특정 실시 형태에서, 대상체는 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두로의 렌티바이러스 벡터 국소화 증가를 나타내며, 여기서 국소화 증가는, 대상체의 간 및 비장 외의 기관 대비, 렌티바이러스 벡터의 투여 후 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두에서 적어도 10배 더 높은 렌티바이러스 벡터의 VCN을 특징으로 한다. 특정 실시 형태에서, 대상체는 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두로의 렌티바이러스 벡터 국소화 증가를 나타내며, 여기서 국소화 증가는, 대상체의 간 및 비장 외의 기관 대비, 렌티바이러스 벡터의 투여 후 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두에서 적어도 50배 더 높은 렌티바이러스 벡터의 VCN을 특징으로 한다. 특정 실시 형태에서, 대상체는 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두로의 렌티바이러스 벡터 국소화 증가를 나타내며, 여기서 국소화 증가는, 대상체의 간 및 비장 외의 기관 대비, 렌티바이러스 벡터의 투여 후 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두에서 적어도 100배 더 높은 렌티바이러스 벡터의 VCN을 특징으로 한다. 특정 실시 형태에서, 대상체는 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두로의 렌티바이러스 벡터 국소화 증가를 나타내며, 여기서 국소화 증가는, 대상체의 간 및 비장 외의 기관 대비, 렌티바이러스 벡터의 투여 후 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두에서 적어도 150배 더 높은 렌티바이러스 벡터의 VCN을 특징으로 한다.
A. 면역 반응 저해
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 입자는 인간 대상체로의 투여 후 렌티바이러스 벡터에 대한 면역 반응을 저해하는 하나 이상의 폴리펩티드를 그의 표면 상에 함유한다. 본 개시의 특정 양태는 렌티바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 대상체에게 투여하는 방법에 관한 것이며, 여기서 렌티바이러스 벡터는 그의 표면에 CD47을 함유한다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 표면은 하나 이상의 CD47 분자를 포함한다. CD47은 인간 세포 상에서 편재적으로 발현되는, "자기 마커" 단백질이다. CD47의 표면 발현은 CD47과 대식세포 발현-SIRPα의 상호 작용을 통해 내인성 세포의 대식세포-유도된 식세포 작용을 저해한다. 높은 수준의 CD47을 발현하는 세포는 생체내에서 인간 대식세포에 의해 표적화되고 파괴될 가능성이 적다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 그의 표면 상에 고농도의 CD47 폴리펩티드 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 CD47 단백질을 인코딩하는 이종 기원 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 CD47을 인코딩하는 이종 기원 폴리뉴클레오티드는 발현된다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 CD47 단백질을 인코딩하는 이종 기원 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 여기서 CD47을 인코딩하는 이종 기원 폴리뉴클레오티드는 발현된다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 CD47의 높은 발현 수준을 갖는 세포주에서 생산되기 때문에 더 높은 수준의 CD47 단백질을 갖는다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 CD47고 세포에서 생산되며, 여기서 세포는 세포막 상에 CD47의 높은 발현을 갖는다. 구체적인 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 CD47고 HEK 293T 세포에서 생산되며, 여기서 HEK 293T는 변형되지 않은 HEK293T 세포에서의 CD47의 발현 대비 CD47의 증가된 발현을 갖도록 변형된다. 일부 실시 형태에서, HEK 293T 세포는 변형되지 않은 HEK 293T 세포 대비 내인성 CD47을 과발현하도록 변형된다. 일부 실시 형태에서, HEK 293T 세포는 이종 기원 CD47-발현 벡터를 이용하여 HEK293T 세포를 형질 도입함으로써 변형된다. 일부 실시 형태에서, 이종 기원 CD47-발현 벡터는 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 레트로바이러스 벡터는 γ-레트로바이러스 벡터이다. 일부 실시 형태에서, 이종 기원 CD47-발현 벡터는 렌티바이러스 벡터에 의해 교차 패키징될 수 없다.
특정 양태에서, 본 개시는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유효 용량의 렌티바이러스 벡터를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 렌티바이러스 벡터는 HEK293 세포(ATCC® CRL-1573™)에서 생산된 대조군 렌티바이러스 벡터보다 더 높은 수준의 표면 CD47 단백질 발현을 포함하며 여기서 유효 용량은 렌티바이러스 벡터와 동일한 FIX 활성을 유도하는 데 필요한 대조군 렌티바이러스 벡터의 대조군 용량 대비 감소된다. 어떤 메커니즘에도 얽매이지 않고, 렌티바이러스 벡터의 표면 상에서의 CD47 발현은 대상체의 면역 시스템에 의한 렌티바이러스 벡터 형태 분해 및/또는 제거를 보호하고 렌티바이러스 벡터에 대한 면역 반응을 방지 및/또는 감소시키는 것으로 여겨진다.
일부 실시 형태에서, CD47은 인간 CD47(NCBI 수탁 번호 NP_001768.1)이다. 특정 실시 형태에서, CD47은 SEQ ID NO: 14에 제시된 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 약 70%, 적어도 70%, 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 약 90%, 적어도 95%, 적어도 약 96%, 적어도 97%, 적어도 약 98%, 적어도 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 구체적인 실시 형태에서, 인간 CD47은 SEQ ID NO: 14에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, CD47은 렌티바이러스 벡터에 의해 발현된다. 다른 실시 형태에서, CD47은 렌티바이러스 벡터에 의해 발현되지 않는다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 숙주 세포에서 발현되며, 여기서 숙주 세포는 CD47을 발현하도록 변형된다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 CD47을 과발현하도록 변형된다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 HEK293 세포(ATCC® CRL-1573™)와 비교하여 고농도의 CD47을 발현하는 숙주 세포에서 생산된다. 구체적인 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 변형되지 않은 HEK293T 세포 대비 CD47을 과발현하도록 변형된 HEK293T 세포에서 생산된다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 대조군 렌티바이러스 벡터보다 더 높은 수준의 표면 CD47 단백질 발현을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 대조군 렌티바이러스 벡터는, 19 분자/μm2를 생산하는 것으로 알려진, HEK293 세포(ATCC® CRL-1573™)에서 생성된다(예를 들어, 도 S1(d)의 문헌[Sosale et al., Methods & Clinical Development 3: 16080(2016)] 참고). 일부 실시 형태에서, 대조군 렌티바이러스 벡터는 대조군 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 20 분자/μm2 미만의 CD47을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 HEK293 세포(ATCC® CRL-1573™)에서 생산된 대조군 렌티바이러스 벡터의 표면 상에서보다 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 적어도 약 2배 내지 적어도 약 100배, 적어도 약 2배 내지 적어도 약 75배, 적어도 약 2배 내지 적어도 약 50배, 적어도 약 2배 내지 적어도 약 40배, 적어도 약 2배 내지 적어도 약 30배, 적어도 약 2배 내지 적어도 약 20배, 적어도 약 2배 내지 적어도 약 10배, 적어도 약 10배 내지 적어도 약 100배, 적어도 약 10배 내지 적어도 약 75배, 적어도 약 10배 내지 적어도 약 50배, 적어도 약 10배 내지 적어도 약 40배, 적어도 약 10배 내지 적어도 약 30배, 적어도 약 10배 내지 적어도 약 20배, 적어도 약 20배 내지 적어도 약 100배, 적어도 약 20배 내지 적어도 약 75배, 적어도 약 20배 내지 적어도 약 50배, 적어도 약 20배 내지 적어도 약 40배, 또는 적어도 약 20배 내지 적어도 약 30배 더 많은 CD47 단백질을 포함한다. 구체적인 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 HEK293 세포(ATCC® CRL-1573™)에서 생산된 대조군 렌티바이러스 벡터의 표면 상에서보다 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 적어도 약 10배 내지 적어도 약 30배 더 많은 CD47 단백질을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 HEK293 세포(ATCC® CRL-1573™)에서 생산된 대조군 렌티바이러스 벡터의 표면 상에서보다 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3.0배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4.0배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5.0배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6.0배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7.0배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8.0배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9.0배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 또는 적어도 약 100배 더 많은 CD47 단백질을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 HEK293 세포(ATCC® CRL-1573™)에서 생산된 대조군 렌티바이러스 벡터의 표면 상에서보다 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 적어도 약 10배 더 많은 CD47 단백질을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 HEK293 세포(ATCC® CRL-1573™)에서 생산된 대조군 렌티바이러스 벡터의 표면 상에서보다 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 적어도 약 15배 더 많은 CD47 단백질을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 HEK293 세포(ATCC® CRL-1573™)에서 생산된 대조군 렌티바이러스 벡터의 표면 상에서보다 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 적어도 약 20배 더 많은 CD47 단백질을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 HEK293 세포(ATCC® CRL-1573™)에서 생산된 대조군 렌티바이러스 벡터의 표면 상에서보다 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 적어도 약 25배 더 많은 CD47 단백질을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 HEK293 세포(ATCC® CRL-1573™)에서 생산된 대조군 렌티바이러스 벡터의 표면 상에서보다 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 적어도 약 30배 더 많은 CD47 단백질을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 표면 상에 적어도 20 분자/μm2, 적어도 약 25 분자/μm2, 적어도 약 30 분자/μm2, 적어도 약 35 분자/μm2, 적어도 약 40 분자/μm2, 적어도 약 45 분자/μm2, 적어도 약 50 분자/μm2, 적어도 약 55 분자/μm2, 적어도 약 60 분자/μm2, 적어도 약 65 분자/μm2, 적어도 약 70 분자/μm2, 적어도 약 75 분자/μm2, 적어도 약 80 분자/μm2, 적어도 약 85 분자/μm2, 적어도 약 90 분자/μm2, 적어도 약 95 분자/μm2, 적어도 약 100 분자/μm2, 적어도 약 125 분자/μm2, 적어도 약 150 분자/μm2, 적어도 약 175 분자/μm2, 적어도 약 200 분자/μm2의 CD47 단백질을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 적어도 약 225 분자/μm2, 적어도 약 250 분자/μm2, 적어도 약 275 분자/μm2, 적어도 약 300 분자/μm2, 적어도 약 325 분자/μm2, 적어도 약 350 분자/μm2, 적어도 약 375 분자/μm2, 적어도 약 400 분자/μm2, 적어도 약 425 분자/μm2, 적어도 약 450 분자/μm2, 적어도 약 475 분자/μm2, 적어도 약 500 분자/μm2, 적어도 약 525 분자/μm2, 적어도 약 550 분자/μm2, 적어도 약 575 분자/μm2, 적어도 약 600 분자/μm2, 적어도 약 625 분자/μm2, 적어도 약 650 분자/μm2, 적어도 약 675 분자/μm2, 적어도 약 700 분자/μm2, 적어도 약 725 분자/μm2, 적어도 약 750 분자/μm2, 적어도 약 800 분자/μm2, 적어도 약 850 분자/μm2, 적어도 약 900 분자/μm2, 적어도 약 950 분자/μm2, 또는 적어도 약 1000 분자/μm2의 CD47 단백질을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 적어도 약 400 분자/μm2의 CD47 단백질을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 적어도 약 450 분자/μm2의 CD47 단백질을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 적어도 약 500 분자/μm2의 CD47 단백질을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 적어도 약 600 분자/μm2의 CD47 단백질을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 적어도 약 700 분자/μm2의 CD47 단백질을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 적어도 약 800 분자/μm2의 CD47 단백질을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 적어도 약 900 분자/μm2의 CD47 단백질을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 적어도 약 1000 분자/μm2의 CD47 단백질을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 생성된 렌티바이러스 벡터의 면역원성을 감소시키기 위해 추가로 변형된 숙주 세포에서 발현된다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 표면-노출 주요 조직 적합성 복합체 클래스 I(MHC-I)을 거의 갖지 않거나 갖지 않는다. 표면-노출 MHC-I은, 감염을 표시하는 단백질 단편과 같은, 세포 내로부터의 "비-자기"단백질의 펩티드 단편을 전시하여, 세포에 대한 면역 반응을 용이하게 한다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 MHC-I저 세포에서 생산되며, 여기서 세포는 세포막 상에 감소된 표면-노출 MHC-I을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 MHC-I-(또는 "MHC-I없음", "MHC-1neg” 또는 "MHC-음성") 세포에서 생산되며, 여기서 세포는 표면-노출 MHC-I을 갖지 않는다.
MHC-I- 또는 MHC-I저 세포는 당업계에 알려진 임의의 수단을 사용하여 생성될 수 있다. 일부 실시 형태에서, MHC-I- 또는 MHC-I저 세포는 MHC에서 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현을 방해함으로써 생성된다. 일부 실시 형태에서, MHC-I- 또는 MHC-I저 세포는 베타-2-마이크로글로불린(B2M; Ensembl ENSG00000166710; NCBI 단백질 수탁 번호 ABB01003)을 인코딩하는 유전자의 발현을 방해함으로써 생성된다. 일부 실시 형태에서, MHC-I- 또는 MHC-I저 세포는 베타-2-마이크로글로불린(B2M)을 인코딩하는 유전자의 발현을 영구적으로 방해함으로써 생성된다. 일부 실시 형태에서, MHC-I- 또는 MHC-I저 세포는 베타-2-마이크로글로불린(B2M)을 인코딩하는 유전자의 발현을 차단함으로써 생성된다. 일부 실시 형태에서, MHC-I- 또는 MHC-I저 세포는 베타-2-마이크로글로불린(B2M)을 인코딩하는 유전자에 돌연변이를 도입함으로써 생성되며, 여기서 돌연변이는 B2M을 인코딩하는 유전자의 발현 상실을 초래한다. 일부 실시 형태에서, MHC-I- 또는 MHC-I저 세포는 베타-2-마이크로글로불린(B2M)을 인코딩하는 유전자를 녹아웃시킴으로써 생성된다. 특정 실시 형태에서, MHC-I- 또는 MHC-I저 세포는 HECK 293T 세포를 변형시켜 표면-노출 MHC-I을 차단하거나 감소시킴으로써 생성된다. 변형되지 않은 HEK293-T 세포는 표면-노출 MHC-I을 갖는다. 예를 들어, 문헌[Dellgren et al., PLoS One 10(8): e0135385(2015)] 참고.
일부 실시 형태에서, 세포는 MHC-I- HEK293T 세포이며, 여기서 세포는 표면-노출 MHC-I을 갖지 않는다. 특정 실시 형태에서, MHC-I- 세포는, 비변형 HEK293T 세포 대비, 1% 미만의 표면 노출 MHC-1을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 세포는 MHC-I저 HEK293T 세포이며, 여기서 HEK293T 세포는, 비변형 HEK293T 세포 대비, 약 90% 미만, 약 85% 미만, 약 80% 미만, 약 75% 미만, 약 70% 미만, 약 65% 미만, 약 60% 미만, 약 55% 미만, 약 50% 미만, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만의 표면 노출 MHC-I을 갖도록 변형된다. 특정 실시 형태에서, MHC-I저 세포는, 비변형 HEK293T 세포 대비, 5% 미만의 표면 노출 MHC-1을 갖는다. 특정 실시 형태에서, MHC-I저 세포는, 비변형 HEK293T 세포 대비, 4% 미만의 표면 노출 MHC-1을 갖는다. 특정 실시 형태에서, MHC-I저 세포는, 비변형 HEK293T 세포 대비, 3% 미만의 표면 노출 MHC-1을 갖는다. 특정 실시 형태에서, MHC-I저 세포는, 비변형 HEK293T 세포 대비, 2% 미만의 표면 노출 MHC-1을 갖는다.
구체적인 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 고농도의 CD47 폴리펩티드를 포함하고 표면-노출 MHC-I이 결여된 지질 외막(coat)을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 CD47고/MHC-I저 세포주, 예를 들어 CD47고/MHC-I저 HEK 293T 세포주에서 생산된다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 CD47고/MHC-I- 세포주, 예를 들어 CD47고/MHC-I- HEK 293T 세포주에서 생산된다.
또 다른 실시 형태에서, 본원에 개시된 렌티바이러스 벡터의 투여 및/또는 그 후의 FIX 단백질 트랜스진의 발현은 대상체에서 면역 반응을 유도하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 면역 반응은 FIX에 대한 항체의 발생을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 면역 반응은 사이토카인 분비를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 면역 반응은 B 세포, T 세포, 또는 B 세포 및 T 세포 둘 모두의 활성화를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 면역 반응은 저해성 면역 반응이며, 여기서 대상체에서의 면역 반응은 면역 반응이 발생하지 않은 대상체에서의 FIX의 활성 대비 FIX 단백질 활성을 감소시킨다. 특정 실시 형태에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터를 투여함에 의한 FIX 단백질의 발현은 FIX 단백질 또는 단리된 핵산 분자 또는 렌티바이러스 벡터로부터 발현된 FIX 단백질에 대한 저해성 면역 반응을 방지한다.
B. 투약
본 개시의 렌티바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 입자, 및 그의 사용 방법은 HEK293 세포(ATCC® CRL-1573™)에서 생산된 대조군 렌티바이러스 벡터보다에서 생산된 대조군 렌티바이러스 벡터에서보다 더 낮은 용량의 렌티바이러스 벡터를 사용하여 혈우병의 예방 및/또는 치료를 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터와 동일한 FIX 활성을 유도하는 데 필요한 대조군 렌티바이러스 벡터의 대조군 용량 대비 감소된 용량에서 효과적이다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 대조군 렌티바이러스 벡터의 대조군 용량의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 25%이다. 일부 실시 형태에서, 용량은 대조군 렌티바이러스 벡터의 대조군 용량의 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 또는 적어도 약 50%이다. 일부 실시 형태에서, 용량은 대조군 렌티바이러스 벡터의 대조군 용량의 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 75%이다. 일부 실시 형태에서, 용량은 대조군 렌티바이러스 벡터의 대조군 용량의 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%이다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 약 5.0x1010 TU/kg, 약 4.9x1010 TU/kg, 약 4.8x1010 TU/kg, 약 4.7x1010 TU/kg, 약 4.6x1010 TU/kg, 약 4.5x1010 TU/kg, 약 4.4x1010 TU/kg, 약 4.3x1010 TU/kg, 약 4.2x1010 TU/kg, 약 4.1x1010 TU/kg, 약 4.0x1010 TU/kg, 약 3.9x1010 TU/kg, 약 3.8x1010 TU/kg, 약 3.7x1010 TU/kg, 약 3.6x1010 TU/kg, 약 3.5x1010 TU/kg, 약 3.4x1010 TU/kg, 약 3.3x1010 TU/kg, 약 3.2x1010 TU/kg, 약 3.1x1010 TU/kg, 약 3.0x1010 TU/kg, 약 2.9x1010 TU/kg, 약 2.8x1010 TU/kg, 약 2.7x1010 TU/kg, 약 2.6x1010 TU/kg, 약 2.5x1010 TU/kg, 약 2.4x1010 TU/kg, 약 2.3x1010 TU/kg, 약 2.2x1010 TU/kg, 약 2.1x1010 TU/kg, 약 2.0x1010 TU/kg, 약 1.9x1010 TU/kg, 약 1.8x1010 TU/kg, 약 1.7x1010 TU/kg, 약 1.6x1010 TU/kg, 약 1.5x1010 TU/kg, 약 1.4x1010 TU/kg, 약 1.3x1010 TU/kg, 약 1.2x1010 TU/kg, 약 1.1x1010 TU/kg, 또는 약 1.0x1010 TU/kg이다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 약 9.9x109 TU/kg, 약 9.8x109 TU/kg, 약 9.7x109 TU/kg, 약 9.6x109 TU/kg, 약 9.5x109 TU/kg, 약 9.4x109 TU/kg, 약 9.3x109 TU/kg, 약 9.2x109 TU/kg, 약 9.1x109 TU/kg, 약 9.0x109 TU/kg, 약 8.9x109 TU/kg, 약 8.8x109 TU/kg, 약 8.7x109 TU/kg, 약 8.6x109 TU/kg, 약 8.5x109 TU/kg, 약 8.4x109 TU/kg, 약 8.3x109 TU/kg, 약 8.2x109 TU/kg, 약 8.1x109 TU/kg, 약 8.0x109 TU/kg, 약 7.9x109 TU/kg, 약 7.8x109 TU/kg, 약 7.7x109 TU/kg, 약 7.6x109 TU/kg, 약 7.5x109 TU/kg, 약 7.4x109 TU/kg, 약 7.3x109 TU/kg, 약 7.2x109 TU/kg, 약 7.1x109 TU/kg, 약 7.0x109 TU/kg, 약 6.9x109 TU/kg, 약 6.8x109 TU/kg, 약 6.7x109 TU/kg, 약 6.6x109 TU/kg, 약 6.5x109 TU/kg, 약 6.4x109 TU/kg, 약 6.3x109 TU/kg, 약 6.2x109 TU/kg, 약 6.1x109 TU/kg, 약 6.0x109 TU/kg, 약 5.9x109 TU/kg, 약 5.8x109 TU/kg, 약 5.7x109 TU/kg, 약 5.6x109 TU/kg, 약 5.5x109 TU/kg, 약 5.4x109 TU/kg, 약 5.3x109 TU/kg, 약 5.2x109 TU/kg, 약 5.1x109 TU/kg, 약 5.0x109 TU/kg, 약 4.9x109 TU/kg, 약 4.8x109 TU/kg, 약 4.7x109 TU/kg, 약 4.6x109 TU/kg, 약 4.5x109 TU/kg, 약 4.4x109 TU/kg, 약 4.3x109 TU/kg, 약 4.2x109 TU/kg, 약 4.1x109 TU/kg, 약 4.0x109 TU/kg, 약 3.9x109 TU/kg, 약 3.8x109 TU/kg, 약 3.7x109 TU/kg, 약 3.6x109 TU/kg, 약 3.5x109 TU/kg, 약 3.4x109 TU/kg, 약 3.3x109 TU/kg, 약 3.2x109 TU/kg, 약 3.1x109 TU/kg, 약 3.0x109 TU/kg, 약 2.9x109 TU/kg, 약 2.8x109 TU/kg, 약 2.7x109 TU/kg, 약 2.6x109 TU/kg, 약 2.5x109 TU/kg, 약 2.4x109 TU/kg, 약 2.3x109 TU/kg, 약 2.2x109 TU/kg, 약 2.1x109 TU/kg, 약 2.0x109 TU/kg, 약 1.9x109 TU/kg, 약 1.8x109 TU/kg, 약 1.7x109 TU/kg, 약 1.6x109 TU/kg, 약 1.5x109 TU/kg, 약 1.4x109 TU/kg. about 1.3x109 TU/kg, 약 1.2x109 TU/kg, 약 1.1x109 TU/kg, 또는 약 1.0x109 TU/kg이다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 약 9.9x108 TU/kg, 약 9.8x108 TU/kg, 약 9.7x108 TU/kg, 약 9.6x108 TU/kg, 약 9.5x108 TU/kg, 약 9.4x108 TU/kg, 약 9.3x108 TU/kg, 약 9.2x108 TU/kg, 약 9.1x108 TU/kg, 약 9.0x108 TU/kg, 약 8.9x108 TU/kg, 약 8.8x108 TU/kg, 약 8.7x108 TU/kg, 약 8.6x108 TU/kg, 약 8.5x108 TU/kg, 약 8.4x108 TU/kg, 약 8.3x108 TU/kg, 약 8.2x108 TU/kg, 약 8.1x108 TU/kg, 약 8.0x108 TU/kg, 약 7.9x108 TU/kg, 약 7.8x108 TU/kg, 약 7.7x108 TU/kg, 약 7.6x108 TU/kg, 약 7.5x108 TU/kg, 약 7.4x108 TU/kg, 약 7.3x108 TU/kg, 약 7.2x108 TU/kg, 약 7.1x108 TU/kg, 약 7.0x108 TU/kg, 약 6.9x108 TU/kg, 약 6.8x108 TU/kg, 약 6.7x108 TU/kg, 약 6.6x108 TU/kg, 약 6.5x108 TU/kg, 약 6.4x108 TU/kg, 약 6.3x108 TU/kg, 약 6.2x108 TU/kg, 약 6.1x108 TU/kg, 약 6.0x108 TU/kg, 약 5.9x108 TU/kg, 약 5.8x108 TU/kg, 약 5.7x108 TU/kg, 약 5.6x108 TU/kg, 약 5.5x108 TU/kg, 약 5.4x108 TU/kg, 약 5.3x108 TU/kg, 약 5.2x108 TU/kg, 약 5.1x108 TU/kg, 약 5.0x108 TU/kg, 약 4.9x108 TU/kg, 약 4.8x108 TU/kg, 약 4.7x108 TU/kg, 약 4.6x108 TU/kg, 약 4.5x108 TU/kg, 약 4.4x108 TU/kg, 약 4.3x108 TU/kg, 약 4.2x108 TU/kg, 약 4.1x108 TU/kg, 약 4.0x108 TU/kg, 약 3.9x108 TU/kg, 약 3.8x108 TU/kg, 약 3.7x108 TU/kg, 약 3.6x108 TU/kg, 약 3.5x108 TU/kg, 약 3.4x108 TU/kg, 약 3.3x108 TU/kg, 약 3.2x108 TU/kg, 약 3.1x108 TU/kg, 약 3.0x108 TU/kg, 약 2.9x108 TU/kg, 약 2.8x108 TU/kg, 약 2.7x108 TU/kg, 약 2.6x108 TU/kg, 약 2.5x108 TU/kg, 약 2.4x108 TU/kg, 약 2.3x108 TU/kg, 약 2.2x108 TU/kg, 약 2.1x108 TU/kg, 약 2.0x108 TU/kg, 약 1.9x108 TU/kg, 약 1.8x108 TU/kg, 약 1.7x108 TU/kg, 약 1.6x108 TU/kg, 약 1.5x108 TU/kg, 약 1.4x108 TU/kg. about 1.3x108 TU/kg, 약 1.2x108 TU/kg, 약 1.1x108 TU/kg, 또는 약 1.0x108 TU/kg이다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 약 5.0x1010 TU/kg 미만, 약 4.9x1010 TU/kg 미만, 약 4.8x1010 TU/kg 미만, 약 4.7x1010 TU/kg 미만, 약 4.6x1010 TU/kg 미만, 약 4.5x1010 TU/kg 미만, 약 4.4x1010 TU/kg 미만, 약 4.3x1010 TU/kg 미만, 약 4.2x1010 TU/kg 미만, 약 4.1x1010 TU/kg 미만, 약 4.0x1010 TU/kg 미만, 약 3.9x1010 TU/kg 미만, 약 3.8x1010 TU/kg 미만, 약 3.7x1010 TU/kg 미만, 약 3.6x1010 TU/kg 미만, 약 3.5x1010 TU/kg 미만, 약 3.4x1010 TU/kg 미만, 약 3.3x1010 TU/kg 미만, 약 3.2x1010 TU/kg 미만, 약 3.1x1010 TU/kg 미만, 약 3.0x1010 TU/kg 미만, 약 2.9x1010 TU/kg 미만, 약 2.8x1010 TU/kg 미만, 약 2.7x1010 TU/kg 미만, 약 2.6x1010 TU/kg 미만, 약 2.5x1010 TU/kg 미만, 약 2.4x1010 TU/kg 미만, 약 2.3x1010 TU/kg 미만, 약 2.2x1010 TU/kg 미만, 약 2.1x1010 TU/kg 미만, 약 2.0x1010 TU/kg 미만, 약 1.9x1010 TU/kg 미만, 약 1.8x1010 TU/kg 미만, 약 1.7x1010 TU/kg 미만, 약 1.6x1010 TU/kg 미만, 약 1.5x1010 TU/kg 미만, 약 1.4x1010 TU/kg 미만, 약 1.3x1010 TU/kg 미만, 약 1.2x1010 TU/kg 미만, 약 1.1x1010 TU/kg 미만, 또는 약 1.0x1010 TU/kg 미만이다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 약 9.9x109 TU/kg 미만, 약 9.8x109 TU/kg 미만, 약 9.7x109 TU/kg 미만, 약 9.6x109 TU/kg 미만, 약 9.5x109 TU/kg 미만, 약 9.4x109 TU/kg 미만, 약 9.3x109 TU/kg 미만, 약 9.2x109 TU/kg 미만, 약 9.1x109 TU/kg 미만, 약 9.0x109 TU/kg 미만, 약 8.9x109 TU/kg 미만, 약 8.8x109 TU/kg 미만, 약 8.7x109 TU/kg 미만, 약 8.6x109 TU/kg 미만, 약 8.5x109 TU/kg 미만, 약 8.4x109 TU/kg 미만, 약 8.3x109 TU/kg 미만, 약 8.2x109 TU/kg 미만, 약 8.1x109 TU/kg 미만, 약 8.0x109 TU/kg 미만, 약 7.9x109 TU/kg 미만, 약 7.8x109 TU/kg 미만, 약 7.7x109 TU/kg 미만, 약 7.6x109 TU/kg 미만, 약 7.5x109 TU/kg 미만, 약 7.4x109 TU/kg 미만, 약 7.3x109 TU/kg 미만, 약 7.2x109 TU/kg 미만, 약 7.1x109 TU/kg 미만, 약 7.0x109 TU/kg 미만, 약 6.9x109 TU/kg 미만, 약 6.8x109 TU/kg 미만, 약 6.7x109 TU/kg 미만, 약 6.6x109 TU/kg 미만, 약 6.5x109 TU/kg 미만, 약 6.4x109 TU/kg 미만, 약 6.3x109 TU/kg 미만, 약 6.2x109 TU/kg 미만, 약 6.1x109 TU/kg 미만, 약 6.0x109 TU/kg 미만, 약 5.9x109 TU/kg 미만, 약 5.8x109 TU/kg 미만, 약 5.7x109 TU/kg 미만, 약 5.6x109 TU/kg 미만, 약 5.5x109 TU/kg 미만, 약 5.4x109 TU/kg 미만, 약 5.3x109 TU/kg 미만, 약 5.2x109 TU/kg 미만, 약 5.1x109 TU/kg 미만, 약 5.0x109 TU/kg 미만, 약 4.9x109 TU/kg 미만, 약 4.8x109 TU/kg 미만, 약 4.7x109 TU/kg 미만, 약 4.6x109 TU/kg 미만, 약 4.5x109 TU/kg 미만, 약 4.4x109 TU/kg 미만, 약 4.3x109 TU/kg 미만, 약 4.2x109 TU/kg 미만, 약 4.1x109 TU/kg 미만, 약 4.0x109 TU/kg 미만, 약 3.9x109 TU/kg 미만, 약 3.8x109 TU/kg 미만, 약 3.7x109 TU/kg 미만, 약 3.6x109 TU/kg 미만, 약 3.5x109 TU/kg 미만, 약 3.4x109 TU/kg 미만, 약 3.3x109 TU/kg 미만, 약 3.2x109 TU/kg 미만, 약 3.1x109 TU/kg 미만, 약 3.0x109 TU/kg 미만, 약 2.9x109 TU/kg 미만, 약 2.8x109 TU/kg 미만, 약 2.7x109 TU/kg 미만, 약 2.6x109 TU/kg 미만, 약 2.5x109 TU/kg 미만, 약 2.4x109 TU/kg 미만, 약 2.3x109 TU/kg 미만, 약 2.2x109 TU/kg 미만, 약 2.1x109 TU/kg 미만, 약 2.0x109 TU/kg 미만, 약 1.9x109 TU/kg 미만, 약 1.8x109 TU/kg 미만, 약 1.7x109 TU/kg 미만, 약 1.6x109 TU/kg 미만, 약 1.5x109 TU/kg 미만, 약 1.4x109 TU/kg 미만, 약 1.3x109 TU/kg 미만, 약 1.2x109 TU/kg 미만, 약 1.1x109 TU/kg 미만, 또는 약 1.0x109 TU/kg 미만이다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 약 9.9x108 TU/kg 미만, 약 9.8x108 TU/kg 미만, 약 9.7x108 TU/kg 미만, 약 9.6x108 TU/kg 미만, 약 9.5x108 TU/kg 미만, 약 9.4x108 TU/kg 미만, 약 9.3x108 TU/kg 미만, 약 9.2x108 TU/kg 미만, 약 9.1x108 TU/kg 미만, 약 9.0x108 TU/kg 미만, 약 8.9x108 TU/kg 미만, 약 8.8x108 TU/kg 미만, 약 8.7x108 TU/kg 미만, 약 8.6x108 TU/kg 미만, 약 8.5x108 TU/kg 미만, 약 8.4x108 TU/kg 미만, 약 8.3x108 TU/kg 미만, 약 8.2x108 TU/kg 미만, 약 8.1x108 TU/kg 미만, 약 8.0x108 TU/kg 미만, 약 7.9x108 TU/kg 미만, 약 7.8x108 TU/kg 미만, 약 7.7x108 TU/kg 미만, 약 7.6x108 TU/kg 미만, 약 7.5x108 TU/kg 미만, 약 7.4x108 TU/kg 미만, 약 7.3x108 TU/kg 미만, 약 7.2x108 TU/kg 미만, 약 7.1x108 TU/kg 미만, 약 7.0x108 TU/kg 미만, 약 6.9x108 TU/kg 미만, 약 6.8x108 TU/kg 미만, 약 6.7x108 TU/kg 미만, 약 6.6x108 TU/kg 미만, 약 6.5x108 TU/kg 미만, 약 6.4x108 TU/kg 미만, 약 6.3x108 TU/kg 미만, 약 6.2x108 TU/kg 미만, 약 6.1x108 TU/kg 미만, 약 6.0x108 TU/kg 미만, 약 5.9x108 TU/kg 미만, 약 5.8x108 TU/kg 미만, 약 5.7x108 TU/kg 미만, 약 5.6x108 TU/kg 미만, 약 5.5x108 TU/kg 미만, 약 5.4x108 TU/kg 미만, 약 5.3x108 TU/kg 미만, 약 5.2x108 TU/kg 미만, 약 5.1x108 TU/kg 미만, 약 5.0x108 TU/kg 미만, 약 4.9x108 TU/kg 미만, 약 4.8x108 TU/kg 미만, 약 4.7x108 TU/kg 미만, 약 4.6x108 TU/kg 미만, 약 4.5x108 TU/kg 미만, 약 4.4x108 TU/kg 미만, 약 4.3x108 TU/kg 미만, 약 4.2x108 TU/kg 미만, 약 4.1x108 TU/kg 미만, 약 4.0x108 TU/kg 미만, 약 3.9x108 TU/kg 미만, 약 3.8x108 TU/kg 미만, 약 3.7x108 TU/kg 미만, 약 3.6x108 TU/kg 미만, 약 3.5x108 TU/kg 미만, 약 3.4x108 TU/kg 미만, 약 3.3x108 TU/kg 미만, 약 3.2x108 TU/kg 미만, 약 3.1x108 TU/kg 미만, 약 3.0x108 TU/kg 미만, 약 2.9x108 TU/kg 미만, 약 2.8x108 TU/kg 미만, 약 2.7x108 TU/kg 미만, 약 2.6x108 TU/kg 미만, 약 2.5x108 TU/kg 미만, 약 2.4x108 TU/kg 미만, 약 2.3x108 TU/kg 미만, 약 2.2x108 TU/kg 미만, 약 2.1x108 TU/kg 미만, 약 2.0x108 TU/kg 미만, 약 1.9x108 TU/kg 미만, 약 1.8x108 TU/kg 미만, 약 1.7x108 TU/kg 미만, 약 1.6x108 TU/kg 미만, 약 1.5x108 TU/kg 미만, 약 1.4x108 TU/kg 미만, 약 1.3x108 TU/kg 미만, 약 1.2x108 TU/kg 미만, 약 1.1x108 TU/kg 미만, 또는 약 1.0x108 TU/kg 미만이다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 약 1x108 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 1.5x108 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 2x108 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 2.5x108 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 3x108 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 3.5x108 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 4x108 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 4.5x108 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 5x108 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 5.5x108 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 6x108 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 6.5x108 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 7x108 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 7.5x108 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 8x108 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 8.5x108 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 9x108 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 9.5x108 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 1x109 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 1.5x109 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 2x109 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 2.5x109 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 3x109 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 3.5x109 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 4x109 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 4.5x109 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 5x109 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 5.5x109 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 6x109 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 6.5x109 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 7x109 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 7.5x109 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 8x109 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 8.5x109 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 9x109 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 9.5x109 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 1x109 내지 약 6x109 TU/kg, 약 2x109 내지 약 6x109 TU/kg, 약 3x109 내지 약 6x109 TU/kg, 약 4x109 내지 약 6x109 TU/kg, 약 5x109 내지 약 6x109 TU/kg, 약 1010 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 1.5x1010 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 2x1010 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 2.5x1010 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 3x1010 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 3.5x1010 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 4x1010 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 또는 약 4.5x1010 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg이다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 약 1x108 TU/kg 내지 약 5x1010 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 4.5x1010 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 4x1010 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 3.5x1010 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 3x1010 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 2.5x1010 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 2x1010 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 1.5x1010 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 1010 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 9x109 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 8.5x109 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 8x109 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 7.5x109 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 7x109 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 6.5x109 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 6x109 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 5.5x109 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 5x109 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 4.5x109 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 4x109 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 3.5x109 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 3x109 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 2.5x109 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 2x109, 약 1x108 TU/kg 내지 약 1.5x109 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 1x109 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 9.5x108 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 9x108 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 8.5x108 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 8x108 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 7.5x108 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 7x108 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 6.5x108 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 6x108 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 5.5x108 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 5x108 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 4.5x108 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 4x108 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 3.5x108 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 3x108 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 2.5x108 TU/kg, 약 1x108 TU/kg 내지 약 2x108, 또는 약 1x108 TU/kg 내지 약 1.5x108 TU/kg이다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 약 1x1010 TU/kg 내지 약 2x1010 TU/kg, 약 1.1x1010 TU/kg 내지 약 1.9x1010 TU/kg, 약 1.2x1010 TU/kg 내지 약 1.8x1010 TU/kg, 약 1.3x1010 TU/kg 내지 약 1.7x1010 TU/kg, 또는 약 1.4x1010 TU/kg 내지 약 1.6x1010 TU/kg이다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 1.5x1010 TU/kg이다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 약 2x1010 TU/kg이다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 2x1010 TU/kg이다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 약 6x1010 TU/kg이다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 6x1010 TU/kg이다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 약 1x109 TU/kg 내지 약 2x109 TU/kg, 약 1.1x109 TU/kg 내지 약 1.9x109 TU/kg, 약 1.2x109 TU/kg 내지 약 1.8x109 TU/kg, 약 1.3x109 TU/kg 내지 약 1.7x109 TU/kg, 또는 약 1.4x109 TU/kg 내지 약 1.6x109 TU/kg이다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 약 4x109 내지 약 6x109 TU/kg이다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 1.5x109 TU/kg이다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 4x109 TU/kg이다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 4.5x109 TU/kg이다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 5x109 TU/kg이다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 5.5x109 TU/kg이다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 약 6x109 TU/kg이다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 6x109 TU/kg이다.
특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 약 2.5x109 TU/kg이다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 2.5x109 TU/kg이다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 약 3.0x109 TU/kg이다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 3.0x109 TU/kg이다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 약 7.5x109 TU/kg이다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 7.5x109 TU/kg이다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 약 2x1010 TU/kg이다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 2x1010 TU/kg이다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 약 6x1010 TU/kg이다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 6x1010 TU/kg이다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 단회 용량 또는 다회 용량으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 한 번에 투여되거나 다회의 하위 용량, 예를 들어, 2개의 하위 용량, 3개의 하위 용량, 4개의 하위 용량, 5개의 하위 용량 또는 6개의 하위 용량으로 나뉘어진다. 일부 실시 형태에서, 하나 초과의 렌티바이러스 벡터가 투여된다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 적어도 6회, 적어도 7회, 적어도 8회, 적어도 9회, 또는 적어도 10회 투여된다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 약 매주 1회, 약 2주마다 1회, 약 3주마다 1회, 또는 약 4주마다 1회 투여된다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 약 10일마다 1회, 약 14일마다 1회, 약 2주마다 1회, 약 15일마다 1회, 약 3주마다 1회, 약 20일마다 1회, 약 4주마다 1회, 약 1개월마다 1회, 약 1개월마다 2회, 약 5주마다 1회, 약 6주마다 1회, 약 7주마다 1회, 약 8주마다 1회, 약 2개월마다 1회, 약 9주마다 1회, 약 10주마다 1회, 약 11주마다 1회, 약 12주마다 1회, 약 3개월마다 1회, 약 13주마다 1회, 약 14주마다 1회, 약 15주마다 1회, 약 16주마다 1회, 약 4개월마다 1회, 약 17주마다 1회, 약 18주마다 1회, 약 19주마다 1회, 약 20주마다 1회, 약 5개월마다 1회, 약 21주마다 1회, 약 22주마다 1회, 약 23주마다 1회, 약 24주마다 1회, 약 25주마다 1회, 약 26주마다 1회, 또는 약 6개월마다 1회 투여된다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 제1 용량이 투여되고, 대상체는 트랜스진 발현에 대해 모니터링되며, 대상체가 미리 결정된 임계값 미만의 트랜스진 발현을 갖는 경우 제2 용량이 대상체에게 투여된다. 특정 실시 형태에서, 대상체는 표적 세포의 약 100% 미만, 약 95% 미만, 약 90% 미만, 약 85% 미만, 약 80% 미만, 약 75% 미만, 약 70% 미만, 약 65% 미만, 약 60% 미만, 약 55% 미만, 약 50% 미만, 약 45% 미만, 약 40% 미만, 약 35% 미만, 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 3% 미만, 또는 약 1% 미만이 트랜스진을 발현하는 경우 대상체는 렌티바이러스 벡터의 제2(제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 또는 제10) 용량으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 표적 세포의 약 50% 미만이 트랜스진을 발현하는 경우 대상체는 렌티바이러스 벡터의 제2(제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 또는 제10) 용량으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 표적 세포의 약 25% 미만이 트랜스진을 발현하는 경우 대상체는 렌티바이러스 벡터의 제2(제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 또는 제10) 용량으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 표적 세포의 약 10% 미만이 트랜스진을 발현하는 경우 대상체는 렌티바이러스 벡터의 제2(제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 또는 제10) 용량으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 표적 세포의 약 5% 미만이 트랜스진을 발현하는 경우 대상체는 렌티바이러스 벡터의 제2(제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 또는 제10) 용량으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 표적 세포의 약 4% 미만이 트랜스진을 발현하는 경우 대상체는 렌티바이러스 벡터의 제2(제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 또는 제10) 용량으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 표적 세포의 약 3% 미만이 트랜스진을 발현하는 경우 대상체는 렌티바이러스 벡터의 제2(제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 또는 제10) 용량으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 표적 세포의 약 2% 미만이 트랜스진을 발현하는 경우 대상체는 렌티바이러스 벡터의 제2(제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 또는 제10) 용량으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, 표적 세포의 약 1% 미만이 트랜스진을 발현하는 경우 대상체는 렌티바이러스 벡터의 제2(제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 또는 제10) 용량으로 투여된다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 정맥내 주사를 통해 투여된다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 비-정맥내 주사를 통해(예를 들어, 피하 또는 피내) 투여된다.
일부 실시 형태에서, 대상체는 소아 대상체인 반면, 다른 양태에서 대상체는 성체 대상체이다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 남성이다. 다른 실시 형태에서, 대상체는 여성이다.
본원에 개시된 렌티바이러스 벡터는 출혈 응고 장애, 혈관절증, 근육 출혈, 구강 출혈, 대출혈, 근육으로의 대출혈, 구강 대출혈, 외상, 두부 외상, 위장 출혈, 두개내 대출혈, 복부내 대출혈, 흉곽내 대출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 후인두 공간에서의 출혈, 후복막 공간에서의 출혈, 및 장요근초에서의 출혈로 이루어진 군으로부터 선택되는 출혈 질환 또는 장애의 치료에 대한 유전자 요법 접근법을 이용하여, 포유류, 예를 들어 인간 환자에서 생체 내에서 낮거나 감소된 투여량(예를 들어, 1010 TU/kg 이하, 109 TU/kg 이하 또는 108 TU/kg 이하)으로 사용될 수 있다. 일 실시 형태에서, 출혈 질환 또는 장애는 혈우병이다. 또 다른 실시 형태에서, 출혈 질환 또는 장애는 혈우병 A이다.
일부 실시 형태에서, 표적 세포(예를 들어, 간세포)는 환자에게 투여되기 전에, 저용량(예를 들어, 1010 TU/kg 이하, 109 TU/kg 이하, 또는 108 TU/kg 이하)의 본원에 개시된 렌티바이러스 벡터로 시험관 내에서 처리된다. 특정 실시 형태에서, 표적 세포(예를 들어, 간세포)는 환자에게 투여되기 전에, 약 3.0 x 109 TU/kg의 본원에 개시된 렌티바이러스 벡터로 시험관 내에서 처리된다. 또 다른 실시 형태에서, 환자로부터의 세포(예를 들어, 간세포)는 환자에게 투여되기 전에, 저용량(예를 들어, 1010 TU/kg 이하, 109 TU/kg 이하, 또는 108 TU/kg 이하)의 본원에 개시된 렌티바이러스 벡터로 생체 외에서 처리된다.
일부 실시 형태에서, 본원에 개시된 렌티바이러스 벡터(예를 들어, 1010 TU/kg 이하, 109 TU/kg 이하, 또는 108 TU/kg 이하로 투여됨)의 투여 후 혈장 FIX 활성은 생리학적 정상 순환 FIX 수준에 비해 적어도 약 100%, 적어도 약 110%, 적어도 약 120%, 적어도 약 130%, 적어도 약 140%, 적어도 약 150%, 적어도 약 160%, 적어도 약 170%, 적어도 약 180%, 적어도 약 190%, 적어도 약 200%, 적어도 약 210%, 적어도 약 220%, 적어도 약 230%, 적어도 약 240%, 적어도 약 250%, 적어도 약 260%, 적어도 약 270%, 적어도 약 280%, 적어도 약 290%, 또는 적어도 약 300% 증가된다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 렌티바이러스 벡터의 투여 후 혈장 FIX 활성은 생리학적 정상 순환 FIX 수준에 비해 적어도 약 3,000% 내지 약 5,000% 증가된다. 일부 실시 형태에서, 본원에 기술된 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-최적화된 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 투여 후 21일에, 혈장 FIX 활성이 SEQ ID NO: 8 또는 SEQ ID NO: 9를 포함하는 기준 핵산 분자를 포함하는 상응하는 렌티바이러스 벡터를 투여받은 대상체에 비해 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 적어도 약 100배, 적어도 약 110배, 적어도 약 120배, 적어도 약 130배, 적어도 약 140배, 적어도 약 150배, 적어도 약 160배, 적어도 약 170배, 적어도 약 180배, 적어도 약 190배, 또는 적어도 약 200배 증가된다.
본 발명은 또한 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 치료 적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여 지혈 장애(예를 들어, 혈우병 A와 같은 출혈 장애)의 치료, 예방 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서 지혈 장애(예를 들어, 혈우병 A와 같은 출혈 장애)를 치료, 예방 또는 개선하는 방법을 제공한다(여기서, 렌티바이러스 벡터는 5x1010 TU/kg 이하, 109 TU/kg 이하, 또는 108 TU/kg 이하의 적어도 1회 용량으로 투여된다).
본 발명의 렌티바이러스 벡터에 의한 치료, 개선 및 예방은 우회 요법일 수 있다. 우회 요법을 받는 대상체는 이미 응고 인자, 예를 들어 FIX에 대한 억제제가 생겼거나 응고 인자 억제제가 생기게 한다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터는 섬유소 응고의 형성을 촉진함으로써 지혈 장애를 치료 또는 예방한다. 본 발명의 핵산 분자에 의해 인코딩된 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드는 응고 캐스케이드의 구성원을 활성화할 수 있다. 응고 인자는 외인성 경로, 내인성 경로 또는 이들 둘 다에 참여할 수 있다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터는 FIX로 치료가능한 것으로 알려진 지혈 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 지혈 장애는 혈우병 A, 혈우병 B, 폰 빌레브란트병, 인자 XI 결핍(PTA 결핍), 인자 XII 결핍과, 피브리노겐, 프로트롬빈, 인자 V, 인자 VII, 인자 X 또는 인자 XIII의 결핍 또는 구조적 이상, 혈관절증, 근육 출혈, 구강 출혈, 대출혈, 근육으로의 대출혈, 구강 대출혈, 외상, 두부 외상, 위장 출혈, 두개내 대출혈, 복부내 대출혈, 흉곽내 대출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 후인두 공간에서의 출혈, 후복막 공간에서의 출혈, 및 장요근초에서의 출혈을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시 형태에서, 지혈 장애는 유전성 장애이다. 일 실시 형태에서, 대상체는 혈우병 A를 갖는다. 다른 실시 형태에서, 지혈 장애는 FIX 결핍의 결과이다. 다른 실시 형태에서, 지혈 장애는 FIX 응고 인자 결함의 결과일 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 지혈 장애는 후천성 장애일 수 있다. 후천성 장애는 기저 이차 질환 또는 병태로 인해 발생할 수 있다. 비관련 병태는 예를 들어, (한정하지 않고서) 암, 자가 면역 질환 또는 임신일 수 있다. 후천성 장애는 노령이나 기저 이차 장애를 치료하기 위한 약물(예를 들어, 암 화학 요법)로 인해 발생할 수 있다.
본 발명은 또한 지혈 장애 또는 지혈 장애의 획득을 초래하는 이차 질환 또는 병태를 갖지 않는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 따라서 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 렌티바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 일반 지혈제를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 일 실시 형태에서, 일반 지혈제를 필요로 하는 대상체는 수술을 받고 있거나 곧 받을 예정이다. 본 발명의 렌티바이러스 벡터는 예방제로서 수술 전 또는 후에 투여될 수 있다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터는 급성 출혈 에피소드를 제어하기 위해 수술 중에 또는 수술 후에 투여될 수 있다. 수술은 간 이식, 간 절제 또는 줄기 세포 이식을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
또 다른 실시 형태에서, 본 발명의 렌티바이러스 벡터는 지혈 장애가 없는 급성 출혈 에피소드를 갖는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다. 급성 출혈 에피소드는 중증 외상, 예를 들어 수술, 자동차 사고, 상처, 열상 총상 또는 제어되지 않는 출혈을 초래하는 기타 외상성 이벤트로 인해 발생할 수 있다.
렌티바이러스 벡터는 지혈 장애가 있는 대상체를 예방적으로 치료하는 데 사용될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 또한 지혈 장애가 있는 대상체에서 급성 출혈 에피소드를 치료하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 렌티바이러스 벡터는 지혈을 촉진하는 적어도 하나의 다른 약제와 조합되어 투여된다. 지혈을 촉진하는 상기 다른 약제로는 응고 활성이 입증된 치료제가 있다. 예로서(그러나 한정하는 것이 아님), 지혈제는 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 프로트롬빈 또는 피브리노겐 또는 전술한 것의 활성화된 형태를 포함할 수 있다. 응고 인자 또는 지혈제는 또한 항-섬유소 용해제, 예를 들어 엡실론-아미노-카프르산, 트라넥삼산을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 조성물(예를 들어, 렌티바이러스 벡터)은 FIX이 대상체에게 투여되는 경우 활성화가능한 형태로 존재하는 것이다. 이러한 활성화가능한 분자는 대상체에게 투여한 후 응고 부위에서 생체 내에서 활성화될 수 있다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터는 정맥내, 피하, 근육내 또는 임의의 점막 표면을 통해, 예를 들어, 경구, 설하, 협측, 설하, 비강, 직장, 질 또는 폐 경로를 통해 투여될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 원하는 부위로의 벡터의 느린 방출을 허용하는 바이오폴리머 고체 지지체 내에 임플란트될 수 있거나 상기 고체 지지체에 연결될 수 있다.
일 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 투여 경로는 비경구이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 비경구라는 용어는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장 또는 질 투여를 포함한다. 정맥내 형태의 경구 투여가 바람직하다. 상기 모든 형태의 투여가 본 발명의 범주 내인 것으로 명백히 고려되나, 투여를 위한 형태는, 특히 정맥내 또는 동맥내 주사 또는 점적주입을 위한 주사용수일 것이다. 보통, 주사를 위한 적합한 제약 조성물은 완충제(예를 들어, 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충제), 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트), 임의로 안정화제(예를 들어, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본원의 교시내용과 상용되는 다른 방법에서, 렌티바이러스 벡터는 유해한 세포 집단 부위에 직접 전달됨으로써 치료제에 대한 병든 조직의 노출을 증가시킬 수 있다.
C. 렌티바이러스 벡터
본 개시의 특정 양태는 렌티바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 입자, 및/또는 이의 사용 방법에 관한 것이며, 여기서 렌티바이러스 벡터는 인자 IX(FIX) 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 12에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 12에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드는 인간 FIX이다. 일부 실시 형태에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드는 인간 FIX의 변이체이다. 특정 실시 형태에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드는 인간 FIX의 R338L 변이체이다. 특정 실시 형태에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드는 파두아(Padua) 변이체이다.
일부 실시 형태에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드는 FIX를 포함하는 단량체-이량체 하이브리드 분자이다. 본원에 사용된 용어 "단량체-이량체 하이브리드"는, 디설파이드 결합에 의해 서로와 결합된, 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하는 키메라 단백질을 지칭하며, 여기서 제1 사슬은 FIX 및 제1 Fc 영역을 포함하고 제2 사슬은 FIX 없이 제2 Fc 영역을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 따라서 단량체-이량체 하이브리드 작제물은 단 하나의 응고 인자를 갖는 단량체 양태 및 2개의 Fc 영역을 갖는 이량체 양태를 포함하는 하이브리드이다.
C.1. FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열
일부 실시 형태에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된다. 특정 실시 형태에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, 또는 SEQ ID NO: 7에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 85% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 91% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 92% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 93% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 94% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 96% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 97% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 98% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 동일하다.
일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 85% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 91% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 92% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 93% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 94% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 96% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 97% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 98% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 동일하다.
일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 3에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 3에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 85% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 3에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 3에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 91% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 3에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 92% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 3에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 93% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 3에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 94% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 3에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 3에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 96% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 3에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 97% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 3에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 98% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 3에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 3에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 동일하다.
일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 85% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 91% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 92% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 93% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 94% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 96% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 97% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 98% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 동일하다.
일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 85% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 91% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 92% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 93% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 94% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 96% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 97% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 98% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 동일하다.
일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 85% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 91% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 92% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 93% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 94% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 96% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 97% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 98% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 동일하다.
일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 85% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 91% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 92% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 93% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 94% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 96% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 97% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 98% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 동일하다.
특정 실시 형태에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 다음과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다: (i) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 1 내지 84; (ii) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오티드 1 내지 84; (iii) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 1 내지 84; (iv) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 1 내지 84; (v) SEQ ID NO: 6의 뉴클레오티드 1 내지 84; 또는 (vi) SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 1 내지 84. 일부 실시 형태에서, 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 1 내지 84; (ii) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오티드 1 내지 84; (iii) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 1 내지 84; (iv) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 1 내지 84; (v) SEQ ID NO: 6의 뉴클레오티드 1 내지 84; 또는 (vi) SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 1 내지 84에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시 형태에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 다음과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다: (i) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 85 내지 138; (ii) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오티드 85 내지 138; (iii) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 85 내지 138; (iv) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 85 내지 138; (v) SEQ ID NO: 6의 뉴클레오티드 85 내지 138; 또는 (vi) SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 85 내지 138. 일부 실시 형태에서, 프로펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 (i) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 85 내지 138; (ii) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오티드 85 내지 138; (iii) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 85 내지 138; (iv) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 85 내지 138; (v) SEQ ID NO: 6의 뉴클레오티드 85 내지 138; 또는 (vi) SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 85 내지 138에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
C.1.a. 이종 기원 모이어티
일부 실시 형태에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 분자는 적어도 하나의 이종 기원 모이어티를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 이종 기원 모이어티는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 C-말단 또는 N-말단에 융합되며, 여기서 폴리펩티드는 응혈원 활성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 이종 기원 모이어티는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드 내의 하나 이상의 부위에 삽입되며, 여기서 폴리펩티드는 응혈원 활성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 이종 기원 모이어티는 이종 기원 폴리펩티드이다. 특정 양태에서, 이종 기원 모이어티는 XTEN이다. 일부 양태에서, 이종 기원 모이어티는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드 내의 하나 이상의 부위에 삽입된 적어도 하나의 XTEN을 포함한다. 다른 양태에서, 이종 기원 모이어티는 반감기 연장 모이어티(예를 들어, 생체내 반감기 연장 모이어티)이며, 이는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드 내에 삽입된다. 일부 실시 형태에서, 이종 기원 모이어티는, 그 전체가 본원에 참조로서 포함되는, 국제 출원 공개 번호 WO 2017/024060에 개시된 삽입 부위에서 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드 내에 삽입된다. 특정 실시 형태에서, 이종 기원 모이어티는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 103, SEQ ID NO: 2의 아미노산 105, SEQ ID NO: 2의 아미노산 142, SEQ ID NO: 2의 아미노산 149, SEQ ID NO: 2의 아미노산 162, SEQ ID NO: 2의 아미노산 166, SEQ ID NO: 2의 아미노산 174, SEQ ID NO: 2의 아미노산 224, SEQ ID NO: 2의 아미노산 226, SEQ ID NO: 2의 아미노산 228, SEQ ID NO: 2의 아미노산 413, 또는 이들의 임의의 조합에 상응하는 아미노산의 바로 하류에서 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드 내에 삽입된다.
일부 실시 형태에서, 이종 기원 모이어티는 FcRn 결합 파트너(예를 들어, Fc, 및 알부민, 또는 이의 단편)이다. 일부 실시 형태에서, 이종 기원 모이어티는, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 C-말단 또는 N-말단에 융합된, FcRn 결합 파트너이다.
이종 기원 모이어티(예를 들어, 반감기 연장 모이어티)의 비-제한적 예로는 알부민, 알부민 단편, 면역글로불린의 Fc 단편, FcRn 결합 파트너, 인간 융모성 고나도트로핀의 β 서브유닛의 C-말단 펩티드(CTP), HAP 서열, 트랜스페린, 미국 특허 출원 번호 20100292130의 PAS 폴리펩티드, 폴리글리신 링커, 폴리세린 링커, 다른 것들 중에서, 50% 미만 내지 50% 초과의 다양한 정도의 이차 구조를 갖는 글리신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P)으로부터 선택되는 2 가지 유형의 아미노산 6 내지 40 개 아미노산의 펩티드 및 짧은 폴리펩티드.
특정 양태에서 이종 기원 모이어티는 본 개시의 렌티바이러스 벡터로부터 생산된 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 생체내 또는 시험관내 반감기를 증가시킨다. 다른 양태에서 이종 기원 모이어티는 본 개시의 렌티바이러스 벡터로부터 생산된 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 시각화 또는 국소화를 용이하게 한다. FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 시각화 및/또는 위치는 생체내, 시험관내, 생체외, 또는 이들의 조합일 수 있다. 다른 양태에서, 이종 기원 모이어티는 본 개시의 렌티바이러스 벡터로부터 생산된 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 안정성을 증가시킨다. 본원에서 사용된, 용어 "안정성"은 환경 조건(예를 들어, 상승 또는 하강된 온도)에 반응한 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 하나 이상의 물리적 특성의 유지에 대한 당업계에서-인정된 측정을 지칭한다. 특정 양태에서, 물리적 특성은 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 공유 결합 구조의 유지(예를 들어, 단백질 분해 절단, 원치 않는 산화 또는 탈아미드화의 부재)이다. 다른 양태에서, 물리적 특성은 또한 제대로 접힌 상태의 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 존재(예를 들어, 가용성 또는 불용성 집합체 또는 침전물의 부재)일 수 있다.
특정 양태에서, 본 개시의 FIX 융합 단백질의 반감기를 증가시키는 이종 기원 모이어티는, 제한없이, 알부민, 면역글로불린 Fc 영역, XTEN 서열, 인간 융모성 고나도트로핀 β 서브유닛의 C-말단 펩티드(CTP), PAS 서열, HAP 서열, CTP 펩티드 서열, 트랜스페린, 알부민-결합 모이어티, 또는 이들 폴리펩티드의 임의의 단편, 유도체, 변이체, 또는 조합과 같은 이종 기원 폴리펩티드를 포함한다. 다른 관련된 양태에서 이종 기원 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 하이드록시에틸 전분(HES), 폴리시알산, 또는 이들 모이어티의 임의의 유도체, 변이체, 또는 조합과 같은 비-폴리펩티드 모이어티에 대한 부착 부위를 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 본 개시의 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드는, 각각 동일하거나 상이한 분자일 수 있는, 1, 2, 3개 또는 그 이상의 이종 기원 모이어티를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 XTEN을 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 XTEN 및 하나 이상의 Fc 도메인을 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 하나의 구체적인 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입된 XTEN을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 C-말단을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부에 융합된 Fc를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
C.1.a.i. XTEN
일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 이종 기원 모이어티는 XTEN이다. 본원에서 사용된 "XTEN 서열"은, 주로 작은 친수성 아미노산으로 구성된 비-자연 발생하는, 실질적으로 비-반복적 서열을 갖는 연장된 길이의 폴리펩티드를 지칭하며, 서열은 생리학적 조건 하에서 낮은 정도의 2 차 또는 3 차 구조를 갖거나 없다. 융합 단백질 파트너로서, XTEN은 융합 단백질을 생성하기 위해 본 개시의 FIX 서열에 연결될 때 특정 바람직한 약동학적, 물리 화학적 및 약학적 특성을 부여하는, 담체로서 작용할 수 있다. 이러한 바람직한 특성으로는 향상된 약동학적 파라미터 및 용해도 특성이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 본원에서 사용된 "XTEN"은 항체 또는 단일-사슬 항체 또는 경쇄 또는 중쇄의 Fc 단편과 같은 항체 단편을 명확히 제외한다.
특정 양태에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 XTEN 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 XTEN을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 삽입되며, 여기서 생성된 융합 폴리펩티드는 응혈원 활성을 갖는다. 특정 양태에서, 이종 기원 모이어티 중 2개는 XTEN 서열이다. 일부 양태에서, 이종 기원 모이어티 중 3개는 XTEN 서열이다. 일부 양태에서, 이종 기원 모이어티 중 4개는 XTEN 서열이다. 일부 양태에서, 이종 기원 모이어티 중 5개는 XTEN 서열이다. 일부 양태에서, 이종 기원 모이어티 중 6개 이상은 XTEN 서열이다.
일부 실시 형태에서, XTEN 서열은 약 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 150개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 550개, 600개, 650개, 700개, 750개, 800개, 850개, 900개, 950개, 1000개, 1200개, 1400개, 1600개, 1800개, 또는 2000개 초과의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 특정 실시 형태에서, XTEN은 약 20개 초과 내지 약 3000개의 아미노산 잔기, 30개 초과 내지 약 2500개의 잔기, 40개 초과 내지 약 2000개의 잔기, 50개 초과 내지 약 1500개의 잔기, 60개 초과 내지 약 1000개의 잔기, 70개 초과 내지 약 900개의 잔기, 80개 초과 내지 약 800개의 잔기, 90개 초과 내지 약 700개의 잔기, 100개 초과 내지 약 600개의 잔기, 110개 초과 내지 약 500개의 잔기 또는 120개 초과 내지 약 400개의 잔기를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 특정한 일 실시 형태에서, XTEN은 42개보다 긴 아미노산 및 144개보다 짧은 아미노산의 길이의 아미노산 서열을 포함한다.
XTEN 서열은 서열 모티프와 적어도 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 5개 내지 14개(예를 들어, 9개 내지 14개)의 아미노산 잔기 또는 아미노산 서열의 하나 이상의 서열 모티프를 포함할 수 있고, 여기서 모티프는 글리신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P)으로 이루어진 군으로부터 선택된 4개 내지 6개 유형의 아미노산(예를 들어, 5개의 아미노산)을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어진다. 미국 특허 출원 공개 공보 제2010-0239554 A1호를 참조한다.
본 개시에 따라 사용될 수 있는 XTEN 서열의 예는 미국 특허 공개 번호 2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1, 또는 2011/0172146 A1, 또는 국제 특허 공개 번호 WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1, WO 2011028344 A2, WO 2014/011819 A2, WO 2015/023891, 또는 WO 2017/024060에 개시되어 있으며, 그 각각은 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
C.1.a.ii. Fc 영역 또는 FcRn 결합 파트너
일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 이종 기원 모이어티는 Fc 영역(예를 들어, FcRn 결합 파트너) 또는 이의 단편이다. 특정 양태에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 Fc 영역(예를 들어, FcRn 결합 파트너)을 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되거나, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 C-말단을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부에 융합되거나, 둘 모두이며, 여기서 생성된 융합 폴리펩티드는 응혈원 활성을 갖는다. 본원에서 사용된 "Fc” 또는 "Fc 영역"은, 달리 명시되지 않는 한, Fc 도메인, 이의 변이체, 또는 단편을 포함하는 기능성 신생아 Fc 수용체(FcRn) 결합 파트너일 수 있다. FcRn 결합 파트너는 알부민을 포함하나 이에 한정되지 않는, FcRn 수용체에 의해 특이적으로 결합되어 결과적으로 FcRn 결합 파트너의 FcRn 수용체에 의해 활성 수송될 수 있는 임의의 분자이다. 따라서, 용어 Fc는 기능적인 IgG Fc의 임의의 변이체를 포함한다. FcRn 수용체에 결합하는 IgG의 Fc 부분의 영역은 X-선 결정학을 기반으로 기술되었다(Burmeister et al., Nature 372: 379(1994), 그 전체가 본원에 참조로서 포함됨). Fc의 FcRn과의 주요 접촉 구역은 CH2 및 CH3 도메인의 접합부 근처이다. Fc-FcRn 접촉은 모두 단일 Ig 중쇄 내에 있다. FcRn 결합 파트너로는 전체 IgG, IgG의 Fc 단편, 및 FcRn의 완전한 결합 영역을 포함하는 IgG의 다른 단편이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. Fc는 면역글로불린의 힌지 영역이 있거나 없는 면역글로불린의 CH2 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 또한 융합 단백질에서 Fc 영역의 바람직한 특성, 예를 들어 반감기, 예를 들어 생체 내 반감기, 증가를 유지하는 Fc 단편, 변이체, 또는 유도체가 포함된다. 무수히 많은 돌연변이체, 단편, 변이체, 및 유도체가, 예를 들어 PCT 공개 번호 WO 2011/069164 A2, WO 2012/006623 A2, WO 2012/006635 A2, 또는 WO 2012/006633 A2에 기재되어 있으며, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
하나 이상의 Fc 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되거나, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 C-말단을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부에 융합되거나, 둘 모두일 수 있다. 일부 실시 형태에서, Fc 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 융합된다. 일부 실시 형태에서, Fc 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 융합된다. 일부 실시 형태에서, Fc 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은, XTEN과 같은, 다른 이종 기원 모이어티를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 융합되며, 이는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되거나 XTEN을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 C-말단을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부에 융합된다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 제2 Fc 도메인을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 발현된 제2 Fc 도메인은, 예를 들어 하나 이상의 공유 결합을 통해, 제1 Fc 도메인과 결합될 수 있다.
C.1.a.iii. 알부민
일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 이종 기원 모이어티는 알부민, 알부민 결합 도메인, 또는 알부민 결합 소분자, 또는 이의 변이체, 유도체, 또는 단편이다. 특정 양태에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 알부민 폴리펩티드 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되거나 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 C-말단을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부에 융합되거나 둘 모두이며, 여기서 생성된 융합 폴리펩티드는 응혈원 활성을 갖는다. 전장 형태의 609개의 아미노산의 단백질인 인간 혈청 알부민(HSA, 또는 HA)은 혈청의 삼투압의 유의한 비율을 담당하고, 또한 내인성 및 외인성 리간드의 캐리어로서의 기능을 한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "알부민"은 전장 알부민, 또는 이의 기능적 단편, 변이체, 유도체 또는 유사체를 포함한다. 알부민 또는 이의 단편 또는 변이체의 예는 미국 특허 출원 공개 공보 제2008/0194481 A1호, 미국 특허 출원 공개 공보 제2008/0004206 A1호, 미국 특허 출원 공개 공보 제2008/0161243 A1호, 미국 특허 출원 공개 공보 제2008/0261877 A1호 또는 미국 특허 출원 공개 공보 제2008/0153751 A1호, 또는 국제 공개 제2008/033413 A2호, 국제 공개 제2009/058322 A1호 또는 국제 공개 제2007/021494 A2호(본원에 그 전체가 참고로 포함됨)에 개시되어 있다.
알부민-결합 폴리펩티드(ABP)는, 제한 없이, 알부민에 결합할 수 있는 박테리아 알부민-결합 도메인, 알부민-결합 펩티드, 또는 알부민-결합 항체 단편을 손상시킬 수 있다. 문헌[Krauliset al., FEBS Lett. 378:190-194 (1996)] 및 문헌[Linhultet al., Protein Sci. 11:206-213 (2002)]에 개시된 바와 같은 연쇄상 구균 단백질 G로부터의 도메인 3은 박테리아 알부민 결합 도메인의 예이다. 알부민 결합 펩티드의 예는 코어 서열 DICLPRWGCLW(SEQ ID NO: 15)를 갖는 일련의 펩티드를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Dennis et al., J. Biol. Chem. 2002, 277: 35035-35043 (2002)]을 참조한다. 알부민 결합 항체 단편의 예는 문헌[Muller and Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther. 9:319-326 (2007)]; 문헌[Roovers et al., Cancer Immunol. Immunother. 56:303-317 (2007)], 및 문헌[Holt et al., Prot. Eng. Design Sci., 21:283-288 (2008)](본원에 그 전체가 참고로 포함됨)에 개시되어 있다.
특정 양태에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 알부민에 결합할 수 있는 비-폴리펩티드 소분자, 이의 변이체, 또는 유도체(예를 들어, 알부민 결합 소분자)에 대한 부착 부위를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되거나, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 C-말단을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부에 융합되거나, 둘 모두이며, 여기서 생성된 융합 폴리펩티드는 응혈원 활성을 갖는다. 이러한 알부민-결합 모이어티의 예는 문헌[Trussel et al., Bioconjugate Chem. 20: 2286-2292(2009)]에 의해 개시된 2-(3-말레이미도프로판아미도)-6-(4-(4-요오도페닐)부탄아미도)헥사노에이트("알부" 태그)이다.
일부 실시 형태에서, 발현된 폴리펩티드에서의 알부민-결합 폴리펩티드 서열은, C-말단, N-말단, 또는 양 말단에서, Gly-Ser 펩티드 링커 서열이 옆에 있다. 일부 실시 형태에서, Gly-Ser 펩티드 링커는 Gly4Ser(SEQ ID NO: 16)이다. 다른 실시 형태에서, Gly-Ser 펩티드 링커는 (Gly4Ser)2(SEQ ID NO: 17)이다.
C.1.a.iv. CTP
일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 이종 기원 모이어티는 인간 융모성 고나도트로핀 β 서브유닛의 C-말단 펩티드(CTP) 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체이다. 특정 양태에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 CTP 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되거나, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 C-말단을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부에 융합되거나 둘 모두이며, 여기서 생성된 융합 폴리펩티드는 응혈원 활성을 갖는다. 하나 이상의 CTP 펩티드의 재조합 단백질로의 삽입은 해당 단백질의 반감기를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 그 전체가 본원에 참조로서 포함된, 미국 특허 번호 5,712,122를 참고. 예시적인 CTP 펩티드로는 DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(SEQ ID NO: 18) 또는 SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO: 19)가 포함된다. 예를 들어, 참조로서 포함된, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2009/0087411 A1을 참고. 일부 실시 형태에서, 발현된 폴리펩티드에서의 CTP 서열은, C-말단, N-말단, 또는 양 말단에서, Gly-Ser 펩티드 링커 서열이 옆에 있다. 일부 실시 형태에서, Gly-Ser 펩티드 링커는 Gly4Ser(SEQ ID NO: 16)이다. 다른 실시 형태에서, Gly-Ser 펩티드 링커는 (Gly4Ser)2(SEQ ID NO: 17)이다.
C.1.a.v. PAS
일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 이종 기원 모이어티는 PAS 펩티드이다. 특정 양태에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 PAS 펩티드 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되거나, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 C-말단을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부에 융합되거나 둘 모두이며, 여기서 생성된 융합 폴리펩티드는 응혈원 활성을 갖는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, “PAS 펩티드” 또는 “PAS 서열”은 알라닌 및 세린 잔기를 주로 포함하거나 알라닌, 세린 및 프롤린 잔기를 주로 포함하는 아미노산 서열을 의미하고, 상기 아미노산 서열은 생리학적 조건 하에 랜덤 코일 배좌를 형성한다. 따라서, PAS 서열은 융합 단백질에서 비상동성 모이어티의 부분으로 사용될 수 있는 알라닌, 세린 및 프롤린을 포함하거나, 본질적으로 이들로 이루어지거나, 이들로 이루어진 빌딩 블록, 아미노산 중합체 또는 서열 카세트이다. 알라닌, 세린 및 프롤린 이외의 잔기가 PAS 서열에서 부차적 구성성분으로서 부가되는 경우 아미노산 중합체가 또한 랜덤 코일 배좌를 형성할 수 있다. "부차적 구성성분"은 알라닌, 세린 및 프롤린 이외의 아미노산이 소정의 정도로, 예를 들어 최대 약 12%, 즉 PAS 서열의 100개 중 약 12개의 아미노산, 최대 약 10%, 최대 약 9%, 최대 약 8%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 즉 약 2%, 또는 약 1%의 아미노산까지 PAS 서열에서 부가될 수 있다는 것을 의미한다. 알라닌, 세린 및 프롤린과는 다른 아미노산은 Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr, 및 Val로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 생리학적 조건 하에, PAS 펩티드는 랜덤 코일 배좌를 형성하고 이에 의해 증가된 생체 내 및/또는 시험관 내 안정성을 매개할 수 있다.
PAS 펩티드의 비제한적인 예는 ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(SEQ ID NO: 20), AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(SEQ ID NO: 21), APSSPSPSAPSSPSPASPSS(SEQ ID NO: 22), APSSPSPSAPSSPSPASPS(SEQ ID NO: 23), SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(SEQ ID NO: 24), AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(SEQ ID NO: 25), ASAAAPAAASAAASAPSAAA(SEQ ID NO: 26) 또는 이들의 임의의 변이체, 유도체, 단편 또는 조합을 포함한다. PAS 서열의 추가 예는 예를 들어 미국 특허 출원 공개 공보 제2010/0292130 A1호 및 국제 공개 제2008/155134 A1호. 유럽 특허 공보 제EP2173890호에 공지되어 있다.
일부 실시 형태에서, 발현된 폴리펩티드에서의 PAS 서열은, C-말단, N-말단, 또는 양 말단에서, Gly-Ser 펩티드 링커 서열이 옆에 있다. 일부 실시 형태에서, Gly-Ser 펩티드 링커는 Gly4Ser(SEQ ID NO: 16)이다. 다른 실시 형태에서, Gly-Ser 펩티드 링커는 (Gly4Ser)2(SEQ ID NO: 17)이다.
C.1.a.vi. HAP
일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 이종 기원 모이어티는 호모-아미노산 중합체(HAP) 펩티드 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체이다. 특정 양태에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 호모-아미노산 중합체(HAP) 펩티드 또는 이의 단편, 변이체, 또는 유도체를 인코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이는 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에 삽입되거나, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 C-말단을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 일부에 융합되거나 둘 모두이며, 여기서 생성된 융합 폴리펩티드는 응혈원 활성을 갖는다. HAP 펩티드는 적어도 50개의 아미노산, 적어도 100개의 아미노산, 120개의 아미노산, 140개의 아미노산, 160개의 아미노산, 180개의 아미노산, 200개의 아미노산, 250개의 아미노산, 300개의 아미노산, 350개의 아미노산, 400개의 아미노산, 450개의 아미노산 또는 500개의 아미노산의 길이를 갖는 글리신의 반복 서열을 포함할 수 있다. HAP 서열은 HAP 서열에 융합되거나 연결된 모이어티의 반감기를 연장시킬 수 있다. HAP 서열의 비제한적인 예는 (Gly)n, (Gly4Ser)n 또는 S(Gly4Ser)n(여기서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20임)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일 실시 형태에서, n은 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40이다. 또 다른 실시 형태에서, n은 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200이다. 예를 들어, 문헌[Schlapschy M et al., Protein Eng. Design Selection, 20: 273-284 (2007)]을 참조한다.
C.2. 조절 요소
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 유전자 발현 제어 요소를 포함한다. 유전자 발현 제어 서열은 예를 들어 포유류 또는 바이러스 프로모터, 예컨대 구성적 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 구성적 포유류 프로모터는 하기 유전자: 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라아제(HPRT), 아데노신 데아미나아제, 피루베이트 키나아제의 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 및 다른 구성적 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 진핵 세포에서 구성적으로 기능하는 예시적인 바이러스 프로모터는 예를 들어 사이토메갈로바이러스(CMV), 시미안 바이러스(예를 들어, SV40), 파필로마 바이러스, 아데노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 라우스 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 몰로니 백혈병 바이러스의 긴 말단 반복체(LTR) 및 다른 레트로바이러스로부터의 프로모터, 및 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나아제 프로모터를 포함한다.
다른 구성적 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 유전자 발현 서열로서 유용한 프로모터는 또한 유도성 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터는 유도제의 존재 하에 발현된다. 예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터는 특정 금속 이온의 존재 하에 전사 및 번역을 촉진하도록 유도된다. 다른 유도성이 사용될 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 조직 특이적 프로모터 및/또는 인핸서의 제어 하에서의 트랜스진의 발현을 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 프로모터 또는 다른 발현 제어 서열은 선택적으로 간 세포에서의 트랜스진의 발현을 향상시킨다. 간 특이적 프로모터의 예는 마우스 타이레틴 프로모터(mTTR), 내인성 인간 인자 VIII 프로모터(F8), 인간 알파-1-안티트립신 프로모터(hAAT), 인간 알부민 최소 프로모터 및 마우스 알부민 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정한 실시 형태에서, 프로모터는 mTTR 프로모터를 포함한다. mTTR 프로모터는 문헌[R. H. Costa et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:4697]에 기술되어 있다. F8 프로모터는 문헌[Figueiredo and Brownlee, 1995, J. Biol. Chem. 270:11828-11838]에 기술되어 있다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 적어도 하나의 조직 특이적 프로모터, 즉 구체적인 조직 또는 세포 유형에서 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 조절할 프로모터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터 내 조직 특이적 프로모터는 표적 간 세포에서 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 선택적으로 향상시킨다. 일부 실시 형태에서, 표적 간 세포에서 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 선택적으로 향상시키는 조직 특이적 프로모터는 APOA2 프로모터, SERPINA1(hAAT) 프로모터, mTTR 프로모터, MIR122 프로모터, ET 프로모터(젠뱅크(GenBank) 번호 AY661265; 또한 문헌[Vigna et al., Molecular Therapy 11(5): 763(2005)] 참고), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적 간 세포는 간세포이다.
발현 수준은 하나 이상의 인핸서를 사용하여 치료적 효능을 달성하도록 추가로 향상될 수 있다. 하나 이상의 인핸서는 단독으로 또는 하나 이상의 프로모터 요소와 함께 제공될 수 있다. 전형적으로, 발현 제어 서열은 복수의 인핸서 요소 및 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 일 실시 형태에서, 인핸서는 α-1-마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서의 하나 이상의 카피를 포함한다(문헌[Rouet et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:20765-20773]; 문헌[Rouet et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:395-404]; 문헌[Rouet et al., 1998, Biochem. J. 334:577-584]; 문헌[Ill et al., 1997, Blood Coagulation Fibrinolysis 8:S23-S30]). 또 다른 실시 형태에서, 인핸서는 EBP, DBP, HNF1, HNF3, HNF4, HNF6과 같은 간 특이적 전사 인자의 결합 부위로부터 유래되며, 이때 Enh1은 HNF1, (센스)-HNF3, (센스)-HNF4, (안티센스)-HNF1, (안티센스)-HNF6, (센스)-EBP, (안티센스)-HNF4(안티센스)를 포함한다.
다른 적합한 벡터 및 유전자 조절 요소의 예가 국제 공개 제02/092134호, 유럽 특허 제1395293호, 또는 미국 특허 제6,808,905호, 미국 특허 제7,745,179호 또는 미국 특허 제7,179,903호(이들은 본원에 그 전체가 참고로 포함됨)에 기술되어 있다.
일반적으로, 발현 제어 서열은, 필요한 경우, 각각 전사 및 번역의 개시에 관여된 5' 비전사 및 5' 비번역 서열, 예컨대 TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 등을 포함해야 한다. 특히, 이러한 5' 비전사 서열은 작동가능하게 연결된 코딩 핵산의 전사 제어를 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함할 것이다. 유전자 발현 서열은 원할 경우 선택적으로 인핸서 서열 또는 상류 활성자 서열을 포함한다.
렌티바이러스 벡터는 모든 간 세포 유형에 형질 도입할 수 있으므로, 상이한 세포 유형에서의 트랜스진(예를 들어 FIX)의 발현은 렌티바이러스 벡터 내 상이한 프로모터를 사용함으로써 제어될 수 있다. 따라서, 렌티바이러스 벡터는, 상이한 간 조직 또는 세포 유형과 같은, 상이한 조직 또는 세포 유형에서 FIX 트랜스진의 발현을 제어할 특정 프로모터를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 간 내피 조직에서 FIX 트랜스진의 발현을 제어할 내피 특이적 프로모터, 또는 간세포에서 FIX 트랜스진의 발현을 제어할 간세포 특이적 프로모터, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 간 외의 조직에서 FIX 트랜스진의 발현을 제어하는 조직-특이적 프로모터 또는 조직-특이적 프로모터들을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 단리된 핵산 분자는 표적 세포 또는 표적 조직의 게놈, 예를 들어 간세포의 게놈 또는 간 내피 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합된다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 적어도 하나의 스플라이스 공여자 부위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 적어도 하나의 스플라이스 수용자 부위를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 gag 서열, pol 서열, rev 서열, rev 반응성 요소(RRE), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 전장 gag 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 절단형 gag 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 전장 pol 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 절단형 pol 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 전장 rev 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 절단형 rev 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 전장 RRE 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 절단형 RRE 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 인핸서, 프로모터, 마이크로RNA(miRNA)에 대한 표적 서열, 전사-후 조절 요소, 패키징 신호, 폴리-A 서열, 인트론 서열, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 간 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 촉진하는 인핸서를 포함한다.
특정 실시 형태에서, 예를 들어 FIX 트랜스진에 작동 가능하게 연결되는, 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 렌티바이러스 벡터 내에 포함시키는 것이 유용할 것이다. 따라서, 본 개시는 또한 FIX 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되거나 달리 렌티바이러스 벡터 내에 삽입되는 적어도 하나의 miRNA 서열 표적을 제공한다. 렌티바이러스 벡터 내에 포함된 1개 초과 카피(copy)의 miRNA 표적 서열은 시스템의 효과를 증가시킬 수 있다.
또한 상이한 miRNA 표적 서열이 포함된다. 예를 들어, 1개 초과의 트랜스진을 발현하는 렌티바이러스 벡터는, 동일하거나 상이할 수 있는, 1개 초과의 miRNA 표적 서열의 제어 하에 트랜스진을 가질 수 있다. miRNA 표적 서열들은 나란히 있을 수 있으나, 다른 배열도 또한 포함된다. miRNA 표적 서열을 함유하는, 트랜스진 발현 카세트는 또한 안티센스 배향으로 렌티바이러스 벡터 내에 삽입될 수 있다. 안티센스 배향은 그렇지 않으면 생산자 세포에 독성일 수 있는 유전자 산물의 발현을 피하기 위해 바이러스 입자 생산에 유용할 수 있다.
다른 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 동일하거나 상이한 miRNA 표적 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 카피를 포함한다. 그러나, 다른 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 어떠한 miRNA 표적 서열도 포함하지 않을 것이다. miRNA 표적 서열을 포함할지 여부(및 얼마나 많이)의 선택은 의도되는 조직 표적, 필요한 발현 수준 등과 같은 파라미터에 의해 안내될 것이다.
일 실시 형태에서, 표적 서열은 골수 수임성 전구 세포에서 발현을 가장 효과적으로 보다 초기의 HSPC에서 적어도 부분적으로 발현을 차단하는 것으로 보고된 miR-223 표적이다. miR-223 표적은 과립구, 단핵구, 대식세포, 골수 수지상 세포를 포함하는 분화된 골수 세포에서 발현을 차단할 수 있다. miR-223 표적은 또한 림프 또는 적혈구 계통에서의 강력한 트랜스진 발현에 의존하는 유전자 요법 적용에 적합할 수 있다. miR-223 표적은 또한 인간 HSC에서 매우 효과적으로 발현을 차단할 수 있다.
다른 실시 형태에서, 표적 서열은 miR142 표적(tccataaagt aggaaacact aca(SEQ ID NO: 27))이다. 일 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개 카피의 miR-142 표적 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 4개 카피의 miR-142 표적 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, miR-142(142T) 또는 "142-3pT"와 같은, 조혈-특이적 마이크로RNA의 상보적 서열이 렌티바이러스 벡터의 3' 비번역 영역 내로 포함되어, 트랜스진-인코딩 전사물이 miRNA-매개 하향-조절에 영향을 받기 쉽도록 만든다. 이 방법에 의해, 트랜스진 발현은 조혈-계통 항원 제시 세포(APC)에서 방지될 수 있는 반면, 비-조혈 세포에서는 유지될 수 있다(Brown et al., Nat Med 2006). 이 전략은 트랜스진 발현에 엄격한 전사-후 제어를 부과할 수 있으므로 트랜스진의 안정적인 전달 및 장기 발현을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, miR-142 조절은 형질 도입된 세포의 면역-매개된 청소를 방지하고/하거나 트랜스진-인코딩된 항원에 대한 항원-특이적 조절 T 세포(T reg)를 유도하고 강력한 면역 내성을 매개한다.
일부 실시 형태에서, 표적 서열은 miR181 표적이다. 문헌[Chen C-Z and Lodish H, Seminars in Immunology(2005) 17(2): 155-165]은 마우스 골수 내 B 세포에서 특이적으로 발현되는 miRNA인, miR-181을 개시한다(Chen and Lodish, 2005). 또한 일부 인간 miRNA가 백혈병에 연관됨을 개시한다.
표적 서열은 miRNA와 완전히 또는 부분적으로 상보적일 수 있다. 용어 "완전히 상보적"은 표적 서열이 이를 인식하는 miRNA의 서열에 100% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것을 의미한다. 용어 "부분적으로 상보적"은 표적 서열이 이를 인식하는 miRNA의 서열에 부분적으로만 상보적이며, 이에 의해 부분적으로 상보적인 서열이 여전히 miRNA에 의해 인식됨을 의미한다. 다시 말해서, 본 개시의 맥락에서 부분적으로 상보적인 표적 서열은 상응하는 miRNA를 인식하고 그 miRNA를 발현하는 세포에서 트랜스진 발현의 방지 또는 감소를 가져오는 데 효과적이다. miRNA 표적 서열의 예는 WO2007/000668, WO2004/094642, WO2010/055413, 또는 WO2010/125471에 기재되어 있으며, 이는 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
다른 실시 형태에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터 내 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 coFIX-1-R338L(SEQ ID NO: 1)을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 포함하거나, 이로 구성되거나, 이로 본질적으로 구성된다.
C.3. 렌티바이러스 벡터
렌티바이러스에는 소 렌티바이러스 그룹, 말 렌티바이러스 그룹, 고양이 렌티바이러스 그룹, 양 염소 렌티바이러스 그룹, 및 영장류 렌티바이러스 그룹의 구성원이 포함된다. 유전자 요법을 위한 렌티바이러스 벡터의 개발은 문헌[Klimatcheva et al.(1999) Frontiers in Bioscience 4: 481-496]에서 검토되었다. 유전자 요법에 적합한 렌티바이러스 벡터의 설계 및 사용은 예를 들어 미국 특허 번호 6,207,455 및 6,615,782에 기술되어 있다. 렌티바이러스의 예로는 HIV-1, HIV-2, HIV-1/HIV-2 위형, HIV-1/SIV, FIV, 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV), 말 감염성 빈혈 바이러스, 및 소 면역 결핍 바이러스가 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
본 개시의 렌티바이러스 벡터의 개략적 묘사가 도 1에 제시된다. 일부 실시 형태에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 "3-세대" 렌티바이러스 벡터이다. 본원에서 사용되는 용어 "3-세대" 렌티바이러스 벡터는 2-세대 벡터 시스템의 특징을 갖고, 추가로 tat 유전자가 결실되거나 비활성화된 것과 같은, 기능적 tat 유전자가 결여된 렌티바이러스 패키징 시스템을 지칭한다. 전형적으로, rev를 인코딩하는 유전자는 별도의 발현 작제물 상에 제공된다. 예를 들어, 문헌[Dull et al.(1998) J. Virol. 72: 8463-8471] 참고. 본원에서 사용된 "2-세대" 렌티바이러스 벡터 시스템은, 부수적 유전자 vif, vpr, vpu, 및 nef가 결실되거나 비활성화된 것과 같은, 기능적 부수적 유전자가 결여된 렌티바이러스 패키징 시스템을 지칭한다. 예를 들어, 문헌[Zufferey et al.(1997) Nat. Biotechnol. 15: 871-875] 참고. 본원에서 사용된 "패키징 시스템"은 재조합 바이러스 패키징에 관여하는 바이러스 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 바이러스 작제물의 세트를 지칭한다. 전형적으로, 패키징 시스템의 작제물은 궁극적으로 패키징 세포 내로 포함될 것이다.
일부 실시 형태에서, 본 개시의 3-세대 렌티바이러스 벡터는 자가-비활성화 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 VSV.G 위형 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 트랜스진 발현을 위한 포유류-특이적 프로모터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 포유류-특이적 프로모터는 거대 세포 바이러스(CMV) 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 트랜스진 발현을 위한 간세포-특이적 프로모터를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 간세포-특이적 프로모터는 향상된 트랜스티레틴 프로모터이다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 트랜스진 산물에 대한 면역 반응을 감소시키기 위해 miR-142에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, miR-142에 대한 하나 이상의 표적 서열을 본 개시의 렌티바이러스 벡터 내로 포함시키는 것은 원하는 트랜스진 발현 프로파일을 가능하게 한다. 예를 들어, miR-142에 대한 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 것은 혈관내 및 혈관외 조혈 계통에서 트랜스진 발현을 억제할 수 있는 반면, 트랜스진 발현은 비 조혈 세포에서 유지된다. 본 개시의 렌티바이러스 벡터 시스템으로 처리된 종양 경향이 있는 마우스에서 어떤 종양 형성도 검출되지 않았다. 문헌[Brown et al.(2007) Blood 110: 4144-52, Brown at al.(2006) Nat. Ned. 12: 585-91, 및 Cantore et al.(2015) Sci. Transl. Med. 7(277): 277ra28] 참고.
본 개시의 렌티바이러스 벡터는 본원에 기재된 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일 실시 형태에서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드는 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다. 본원에서 사용된, 2개의 핵산 서열은 각각의 성분 핵산 서열이 그 기능성을 보유하는 것을 허용하는 방식으로 그들이 공유 결합으로 연결될 때 작동 가능하게 연결된다. 코딩 서열 및 유전자 발현 제어 서열은 유전자 발현 제어 서열의 영향 또는 제어 하에 코딩 서열의 발현 또는 전사 및/또는 번역을 배치하는 방식으로 그들이 공유 결합으로 연결될 때 작동 가능하게 연결된 것이라고 한다. 2개의 DNA 서열은 5' 유전자 발현 서열에서의 프로모터의 유도가 코딩 서열의 전사를 초래하는 경우 및 두 DNA 서열 사이의 연결 본질이 (1) 프레임-시프트 돌연변이 도입을 초래하지 않거나, (2) 코딩 서열의 전사를 지시하는 프로모터 영역의 능력을 방해하지 않거나, (3) 단백질로 번역될 상응하는 RNA 전사물의 능력을 방해하지 않는 경우 작동 가능하게 연결된 것이라고 한다. 따라서, 유전자 발현 서열이 그 코딩 핵산 서열의 전사를 가져올 수 있어 생성된 전사물이 원하는 단백질 또는 폴리펩티드로 번역되는 경우 유전자 발현 서열은 코딩 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 것일 것이다.
특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 형질 도입할 수 있는 재조합 렌티바이러스의 벡터이다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 간 세포(예를 들어, 간세포)에 형질 도입할 수 있는 재조합 렌티바이러스의 벡터이다. 렌티바이러스 게놈 및 프로바이러스 DNA는 전형적으로 레트로바이러스에서 발견되는 세 가지 유전자: gag, pol 및 env를 가지며, 이는 2개의 긴 말단 반복(LTR) 서열이 옆에 있다. gag 유전자는 내부 구조(매트릭스, 캡시드 및 뉴클레오캡시드) 단백질을 인코딩하고; pol 유전자는 RNA-안내된 DNA 폴리메라제(역 전사 효소), 프로테아제 및 인테그라제를 인코딩하고; env 유전자는 바이러스 외피 당단백질을 인코딩한다. 5' 및 3' LTR은 비리온 RNA의 전사 및 폴리아데닐화를 촉진하는 작용을 한다. LTR은 바이러스 복제에 필요한 다른 모든 시스(cis)-작용 서열을 함유한다. 렌티바이러스는 vif, vpr, tat, rev, vpu, nef 및 vpx(HIV-1, HIV-2 및/또는 SIV에서)를 포함하는 추가 유전자를 갖는다.
게놈의 역전사(tRNA 프라이머 결합 부위) 및 바이러스 RNA를 입자 내로 효율적으로 캡시드 둘러싸기(encapsidation)(Psi 부위)에 필요한 서열이 5' LTR에 인접하여 있다. 캡시드로 둘러싸기(또는 레트로바이러스 RNA를 감염성 비리온 내로 패키징)에 필요한 서열이 바이러스 게놈에서 누락된 경우, 시스 결함은 게놈 RNA를 캡시드로 둘러싸기를 방지한다.
그러나, 생성된 돌연변이체는 모든 비리온 단백질의 합성을 지시할 수 있는 상태로 남아있다. 본 개시는 패키징 기능, 즉 gag, pol 및 env 뿐만 아니라 rev 및 tat를 보유하는 2개 이상의 벡터로 적합한 숙주 세포를 형질 감염시키는 것을 포함하는, 비-분열 세포를 형질 도입할 수 있는 재조합 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법을 제공한다. 본원 하기에 개시될 바와 같이, 기능적 tat 유전자가 결여된 벡터는 특정 응용에 바람직하다. 따라서, 예를 들어, 제1 벡터는 바이러스 gag 및 바이러스 pol을 인코딩하는 핵산을 제공할 수 있고 다른 벡터는 패키징 세포를 생산하기 위해 바이러스 env를 인코딩하는 핵산을 제공할 수 있다. 본원에서 수송 벡터로서 인정된, 이종 기원 유전자를 제공하는 벡터를 그 패키징 세포 내로 도입하는 것은 관심 외래 유전자를 보유하는 감염성 바이러스 입자를 방출하는 생산자 세포를 산출한다.
벡터 및 외래 유전자의 상기-나타난 배치에 따라, 제2 벡터는 바이러스 외피(env) 유전자를 인코딩하는 핵산을 제공할 수 있다. env 유전자는, 레트로바이러스를 포함하는, 거의 임의의 적합한 바이러스로부터 유래될 수 있다. 일부 실시 형태에서, env 단백질은 인간 및 다른 종 세포의 형질 도입을 가능하게 하는 암포트로픽(amphotropic) 외피 단백질이다.
레트로바이러스-유래 env 유전자의 예로는: 몰로니(Moloney) 쥐 백혈병 바이러스(MoMuLV 또는 MMLV), 하비(Harvey) 쥐 육종 바이러스(HaMuSV 또는 HSV), 쥐 유방 종양 바이러스(MuMTV 또는 MMTV), 긴팔 원숭이 유인원 백혈병 바이러스(GaLV 또는 GALV), 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 및 라우스(Rous) 육종 바이러스(RSV)가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 수포성 구내염 바이러스(VSV) 단백질 G(VSV G)와 같은 다른 env 유전자, 간염 바이러스의 그것 및 인플루엔자의 것도 또한 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 바이러스 env 핵산 서열은 본원의 다른 곳에서 기술된 조절 서열과 작동 가능하게 회합된다.
특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 형질 도입하는 벡터의 능력을 손상시키지 않고 HIV 병독성 유전자 env, vif, vpr, vpu 및 nef가 결실된다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 3' LTR의 U3 영역의 결실을 포함한다. U3 영역의 결실은 완전 결실 또는 부분 결실일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본원에 기재된 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드 뉴클레오티드 서열을 포함하는 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 (a) gag, pol, 또는 gag 및 pol 유전자를 포함하는 제1 뉴클레오티드 서열 및 (b) 이종 기원 env 유전자를 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열을 갖는 세포 내에 형질 감염될 수 있으며; 여기서 렌티바이러스 벡터는 기능적 tat 유전자가 결여되어 있다. 다른 실시 형태에서, 세포는 rev 유전자를 포함하는 제4 뉴클레오티드 서열로 추가로 형질 감염된다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 vif, vpr, vpu, vpx 및 nef, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 기능적 유전자가 결여되어 있다.
특정 실시 형태에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 gag 단백질, Rev-반응성 요소, 중심 폴리퓨린 트랙(central polypurine track, cPPT), 또는 이들의 임의의 조합을 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 그의 표면 상에 렌티바이러스 벡터 또는 FIX 활성을 갖는 인코딩되는 폴리펩티드의 표적화 및/또는 활성을 개선하는 하나 이상의 폴리펩티드를 함유한다. 숙주 세포로부터의 렌티바이러스 벡터의 출아 동안 하나 이상의 폴리펩티드가 포함될 수 있다. 렌티바이러스 생산 동안, 바이러스 입자는 생산 숙주 세포로부터 출아하여 갈라져 나온다. 출아 과정 동안, 바이러스 입자는, 숙주 세포의 지질 막으로부터 유래된, 지질 외막을 취한다. 그 결과, 바이러스 입자의 지질 외막은 이전에 숙주 세포의 표면 상에 존재했던 막 결합 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 인간 대상체로의 투여 후 렌티바이러스 벡터에 대한 면역 반응을 저해하는 하나 이상의 폴리펩티드를 그의 표면 상에 발현한다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 표면은 하나 이상의 CD47 분자를 포함한다. CD47은 인간 세포 상에서 편재적으로 발현되는, "자기 마커" 단백질이다. CD47의 표면 발현은 CD47과 대식세포 발현-SIRPα의 상호 작용을 통해 내인성 세포의 대식세포-유도된 식세포 작용을 저해한다. 높은 수준의 CD47을 발현하는 세포는 생체내에서 인간 대식세포에 의해 표적화되고 파괴될 가능성이 적다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 그의 표면 상에 고농도의 CD47 폴리펩티드 분자를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 CD47의 높은 발현 수준을 갖는 세포주에서 생산된다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 CD47고 세포에서 생산되며, 여기서 세포는 세포막 상에 CD47의 높은 발현을 갖는다. 구체적인 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 CD47고 HEK 293T 세포에서 생산되며, 여기서 HEK 293T는 세포막 상에 CD47의 높은 발현을 갖는다. 일부 실시 형태에서, HEK 293T 세포는 변형되지 않은 HEK293T 세포 대비 CD47의 증가된 발현을 갖도록 변형된다. 특정 실시 형태에서, CD47은 인간 CD47이다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 14에 제시된 아미노산 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD47을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 주요 조직 적합성 복합체 클래스 I(MHC-I)의 표면 발현을 거의 갖지 않거나 갖지 않는다. 표면 발현된 MHC-I은, 감염을 표시하는 단백질 단편과 같은, 세포 내로부터의 "비-자기"단백질의 펩티드 단편을 전시하여, 세포에 대한 면역 반응을 용이하게 한다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 MHC-I저 세포에서 생산되며, 여기서 세포는 세포막 상에 감소된 MHC-I 발현을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 MHC-I-(또는 "MHC-I없음", "MHC-1neg” 또는 "MHC-음성") 세포에서 생산되며, 여기서 세포는 MHC-I 발현이 결여되어 있다.
구체적인 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 고농도의 CD47 폴리펩티드를 포함하고 MHC-I 폴리펩티드가 결여된 지질 외막을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 CD47고/MHC-I저 세포주, 예를 들어 CD47고/MHC-I저 HEK 293T 세포주에서 생산된다. 일부 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 CD47고/MHC-I없음 세포주, 예를 들어 CD47고/MHC-I없음 HEK 293T 세포주에서 생산된다. 렌티바이러스 벡터의 예는 미국 특허 번호 9,050,269 및 국제 공개 번호 WO9931251, W09712622, W09817815, W09817816, 및 WO9818934에 개시되어 있으며, 이는 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
III. 약학적 조성물
본 개시의 렌티바이러스 벡터, 핵산 분자, 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩티드, 또는 숙주 세포를 함유하는 조성물은 적합한 약학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 예를 들어, 그들은 작용 부위로의 전달을 위해 설계된 조제물로 활성 화합물을 가공하는 것을 용이하게 하는 부형제 및/또는 보조제를 함유할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 개시는 (a) 본원에 개시된 핵산 분자, 렌티바이러스 벡터, 폴리펩티드, 또는 숙주 세포; 및 (b) 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
제약 조성물은 볼루스 주사에 의한 비경구 투여(즉, 정맥내, 피하 또는 근육내)용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 단위 투여 형태, 예를 들어 보존제가 첨가된 앰풀 또는 다용량 용기로 제시될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중 현탁액, 용액 또는 에멀션과 같은 형태를 취할 수 있고, 제형화제, 예컨대 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 적합한 비히클, 예를 들어 발열원 비함유 물을 이용한 구성을 위한 분말 형태일 수 있다.
일 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터의 투여 경로는 비경구이다. 본원에서 사용된 용어 비경구는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장 또는 질 투여를 포함한다. 정맥내 형태의 비경구 투여가 선호된다. 이들 모든 형태의 투여는 본 개시의 범위 내에 있는 것으로 명확하게 고려되지만, 투여를 위한 형태는, 구체적으로 정맥내 또는 동맥내 주사 또는 점적을 위한, 주사 용액일 것이다. 일반적으로, 주사에 적합한 약학적 조성물은 완충제(예를 들어 아세테이트, 포스페이트 또는 시트레이트 완충제), 계면활성제(예를 들어 폴리소르베이트), 선택적으로 안정화제(예를 들어 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본원의 교시 내용과 양립될 수 있는 다른 방법으로, 렌티바이러스 벡터는 유해 세포 집단의 부위로 직접 전달될 수 있으며 이로써 병든 조직의 치료제로의 노출을 증가시킬 수 있다.
비경구 투여를 위한 조제물로는 멸균 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 및 에멀션이 포함된다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레에이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르이다. 수성 담체로는, 식염수 및 완충된 매질을 포함하여, 물, 알코올성/수성 용액, 에멀션 또는 현탁액이 포함된다. 본 개시에서, 약학적으로 허용되는 담체로는 0.01 내지 0.1 M 및 바람직하게는 0.05 M 포스페이트 완충액 또는 0.8% 식염수가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 다른 통상적인 비경구 비히클로는 소듐 포스페이트 용액, 링거(Ringer) 덱스트로스, 덱스트로스 및 소듐 클로라이드, 락테이티드(lactated) 링거, 또는 고정된 오일이 포함된다. 정맥내 비히클로는 체액 및 영양 보충제, 전해질 보충제, 예를 들어 링거 덱스트로스 기반의 것, 등이 포함된다. 예를 들어, 항균제, 산화 방지제, 킬레이트 제제, 및 불활성 기체 등과 같은 보존제 및 기타 첨가제가 또한 존재할 수 있다.
보다 구체적으로, 주사 가능한 용도에 적합한 약학적 조성물로는 멸균 수성 용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사 가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 이러한 경우, 조성물은 멸균이어야 하고 용이한 주사 가능성이 존재할 정도로 유체여야 한다. 그것은 제조 및 보관 조건 하에서 안정되어야 하며 바람직하게는, 박테리아 및 진균과 같은, 미생물의 오염 작용에 대항하여 보존될 것이다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성이 유지될 수 있다.
미생물 작용의 방지는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들어 당, 만니톨, 소르비톨과 같은, 다가 알코올, 또는 소듐 클로라이드를 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능 조성물의 장기적 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 초래될 수 있다.
임의의 경우에, 멸균 주사 가능 용액은 본원에 열거된 성분 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매 내에 필요한 양의 활성 화합물(예를 들어, 폴리펩티드 자체 또는 다른 활성 제제와 조합하여)을 포함시키고, 필요에 따라, 이후 여과된 멸균화 함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을, 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 다른 필요한 성분을 함유하는, 멸균 비히클 내에 포함시킴으로써 제조된다. 멸균 주사 가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 선호되는 제조 방법은 진공 건조 및 동결-건조이며, 이는 활성 성분 더하기 이전에 멸균-여과된 이의 용액으로부터의 임의의 추가 원하는 성분의 분말을 생산한다. 주사용 조제물은 가공되고, 앰풀, 백(bag), 병, 시린지 또는 바이알과 같은 용기 내로 충전되고, 당업계에 알려진 방법에 따라 무균 조건 하에서 밀봉된다. 추가로, 조제물은 키트 형태로 포장 및 판매될 수 있다. 이러한 제조 물품은 바람직하게는 관련된 조성물이 응고 장애를 앓거나, 이에 취약한 대상체를 치료하는 데 유용함을 표시하는 라벨 또는 패키지 삽입물을 가질 것이다.
주사용 데포 제형은 생분해성 중합체, 예컨대 폴리락티드-폴리글리콜리드 중의 약물의 마이크로캡슐화된 매트릭스의 형성에 의해 제조될 수 있다. 약물 대 중합체의 비 및 사용된 중합체의 성질에 따라, 약물 방출 속도가 제어될 수 있다. 다른 예시적인 생분해성 중합체로는 폴리오르토에스테르 및 폴리언하이드라이드가 있다. 데포 주사용 제형은 또한 리포솜 또는 마이크로에멀션 중에 약물을 포획함으로써 제조될 수 있다.
약학적 조성물은 또한, 예를 들어 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드와 같은 종래의 좌약 베이스를 함유하는, 좌약 또는 정체 관장으로서 직장 투여용으로 제형화될 수 있다.
보충적 활성 화합물이 조성물 내로 혼입될 수 있다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 응고 인자, 또는 이의 변이체, 단편, 유사체 또는 유도체를 이용하여 제형화된다. 예를 들어, 응고 인자는 인자 V, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 프로트롬빈, 피브리노겐, 폰 빌레브란트 인자 또는 재조합 가용성 조직 인자(rsTF) 또는 임의의 전술한 것의 활성화 형태를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 지혈제의 응고 인자는 항-섬유소용해 약물, 예를 들어 엡실론-아미노-카프르산, 트라넥삼산을 또한 포함할 수 있다.
투여 섭생은 원하는 최적의 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있거나, 몇몇 분할 용량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 용량은 치료적 상황의 응급성에 의해 표시된 바대로 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 단위 투여 형태의 비경구 조성물을 제형화하는 것이 유리하다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa. 1980)]을 참조한다.
상기 범위 내 중간 용량 또한 본 개시의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 대상체는 매일, 둘 가운데 선택하는 날에, 매주 또는 실험적 분석에 의해 결정된 임의의 다른 일정에 따라 이러한 용량을 투여받을 수 있다. 예시적인 치료는, 예를 들어 적어도 6개월의 장기간에 걸친 다회 투여량으로의 투여를 수반한다.
본 개시의 렌티바이러스 벡터는 상이한 발달 단계의 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 인간의 경우, 상이한 발달 단계는 신생아(예를 들어 1개월령 미만), 유아(1개월령 내지 2세), 아동(2세 내지 12세), 청소년(12세 내지 16세 미만), 또는 성인(16세 초과)으로 분류될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 인간 신생아에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 약 1개월령 미만의 인간 대상체에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 인간 유아에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 약 1개월령 내지 약 2세 미만의 인간 대상체에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 인간 아동에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 약 2세 내지 약 12세의 인간 대상체에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 인간 청소년에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 약 12세 내지 약 16세의 인간 대상체에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 인간 성인에게 투여된다. 일부 실시 형태에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 약 16세 초과의 인간 대상체에게 투여된다. 당업자는 다른 생물에서 발달 단계를 결정할 수 있을 것이다. 예를 들어, 당업자는 2주차 마우스가 청소년임을 이해할 것이다.
본 개시의 렌티바이러스 벡터의 투여량 및 빈도는 당업자에게 알려진 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다.
본 개시의 렌티바이러스 벡터는 선택적으로 치료(예를 들어, 예방적 또는 치료적)를 필요로 하는 장애 또는 상태를 치료하는 데 효과적인 다른 제제와 조합하여 투여될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 부속 요법과 함께 또는 조합하는 본 개시의 렌티바이러스 벡터의 투여는 요법 및 개시된 폴리펩티드의 순차적인, 동시의, 동일한 시간에 걸친, 공존하는, 수반되는 또는 동시에 발생하는 투여 또는 적용을 의미한다. 당업자는 치료의 전반적인 효과를 향상시키기 위해 조합된 치료 요법의 다양한 성분의 투여 또는 적용 시간이 맞춰질 수 있음을 인식할 것이다. 당업자(예를 들어, 의사)는 선택된 부속 요법 및 본 명세서의 교시에 기초하여 과도한 실험없이 효과적인 조합 치료 요법을 용이하게 식별할 수 있을 것이다.
본 개시의 렌티바이러스 벡터는 (예를 들어, 조합 치료 요법을 제공하기 위해) 제제 또는 제제들과 함께 또는 이와 조합하여 사용될 수 있음이 추가로 인식될 것이다. 본 개시의 렌티바이러스 벡터가 조합될 수 있는 예시적인 제제는 치료될 구체적인 장애에 대한 현재의 표준 치료에 해당하는 제제를 포함한다. 이러한 제제는 사실상 화학적 또는 생물학적일 수 있다. 용어 "생물학적” 또는 "생물학적 제제"는 살아있는 유기체 및/또는 치료제로서의 사용을 위해 의도되는 그의 생산물로부터 제조된 임의의 약학적 활성 제제를 지칭한다.
본 개시의 렌티바이러스 벡터와 조합하여 사용되는 제제의 양은 대상체에 따라 달라질 수 있거나 당업계에 알려진 것에 따라 투여될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Bruce A Chabner et al., Antineoplastic Agents, in GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 1233-1287((Joel G. Hardman et al., eds., 9th ed. 1996)) 참고. 다른 실시 형태에서, 표준 치료와 일관된 이러한 약제의 양이 투여된다.
특정 실시 형태에서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 면역 억제제, 항-알레르기, 또는 항-염증 제제와 함께 투여된다. 이들 제제는 일반적으로 본원에서 치료되는 대상체의 면역 시스템을 억제하거나 차폐하는 작용을 하는 물질을 지칭한다. 이들 제제로는 사이토카인 생산을 억제하거나, 자가-항원 발현을 하향 조절하거나 억제하거나, MHC 항원을 차폐하는 물질이 포함된다. 이러한 제제의 예로는 2-아미노-6-아릴-5-치환된 피리미딘; 아자티오프린; 사이클로포스파미드; 브로모크립틴; 다나졸; 답손; 글루타르알데히드; MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-이디오타입 항체; 사이클로스포린 A; 글루코코르티코스테로이드와 같은 스테로이드, 예를 들어 프레드니손, 메틸프레드니솔론, 및 덱사메타손; 항-인터페론-γ, -β, 또는 -α 항체, 항-종양 괴사 인자-α 항체, 항-종양 괴사 인자-β 항체, 항-인터루킨-2 항체 및 항-IL-2 수용체 항체를 포함하는 사이토카인 또는 사이토카인 수용체 길항제; 항-CD11a 및 항-CD18 항체를 포함하는, 항-LFA-1 항체; 항-L3T4 항체; 이종 기원 항-림프구 글로불린; 범(pan)-T 항체; LFA-3 결합 도메인을 함유하는 가용성 펩티드; 스트렙토키나제; TGF-β; 스트렙토도르나제; FK506; RS-61443; 데옥시스페르구알린; 및 라파마이신이 포함된다. 특정 실시 형태에서, 제제는 항히스타민이다. 본원에서 사용된 "항히스타민"은 히스타민의 생리학적 효과를 길항하는 제제이다. 항히스타민의 예는 클로르페니라민, 디펜하이드라민, 프로메타진, 크로몰린 소듐, 아스테미졸, 아자타딘 말레에이트, 브로페니라민 말레에이트, 카르비녹사민 말레에이트, 세티리진 하이드로클로라이드, 클레마스틴 푸마레이트, 사이프로헵타딘 하이드로클로라이드, 덱스브롬페니라민 말레에이트, 덱스클로르페니라민 말레에이트, 디멘하이드리네이트, 디펜하이드라민 하이드로클로라이드, 독실아민 석시네이트, 펙소펜다딘 하이드로클로라이드, 테르페나딘 하이드로클로라이드, 하이드록시진 하이드로클로라이드, 로라티딘, 메클리진 하이드로클로라이드, 트리펠란나민 시트레이트, 트리펠렌나민 하이드로클로라이드, 및 트리프롤리딘 하이드로클로라이드이다.
면역 억제제, 항-알레르기, 또는 항-염증 제제는 렌티바이러스 벡터 투여 요법 내로 포함될 수 있다. 예를 들어, 면역 억제제 또는 항-염증 제제의 투여는 개시된 렌티바이러스 벡터의 투여 전에 시작할 수 있고 그 후 1회 이상의 용량으로 계속될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 면역 억제제 또는 항-염증 제제는 렌티바이러스 벡터에 대한 예비 투약으로서 투여된다.
이전에 논의된 바와 같이, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는, 응고 장애의 생체내 치료를 위해 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 활성 제제의 투여를 용이하게 하고 안정성을 촉진하도록 제형화될 수 있음이 인식될 것이다. 바람직하게는, 본 개시에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는, 생리 식염수, 무-독성 완충제, 보존제 등과 같은 무-독성 멸균 담체를 포함한다. 물론, 본 개시의 약학적 조성물은 약학적 유효량의 폴리펩티드를 제공하기 위해 단일 또는 다회 용량으로 투여될 수 있다.
활성 화합물에 더하여, 액체 투여 형태는 불활성 성분, 예컨대 물, 에틸 알코올, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일, 글리세롤, 테트라히드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르를 함유할 수 있다.
적합한 제약적 담체의 비제한적인 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin]에 또한 기술되어 있다. 부형제의 몇몇 예는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은 pH 완충 시약, 및 습윤제 또는 유화제를 또한 함유할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 조성물은 국소 투여, 안구내 투여, 척추강내 투여 및 경막하 투여로 이루어진 군으로부터 선택되는 경로에 의해 투여된다. 비경구 투여는 정맥내 또는 피하 투여일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 조성물은 출혈 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 출혈 질환 또는 병태를 치료하기 위해 사용된다. 출혈 질환 또는 병태는 출혈 응고 장애, 혈관절증, 근육 출혈, 구강 출혈, 대출혈, 근육으로의 대출혈, 구강 대출혈, 외상, 두부 외상, 위장 출혈, 두개내 대출혈, 복부내 대출혈, 흉곽내 대출혈, 골절, 중추 신경계 출혈, 후인두 공간에서의 출혈, 후복막 공간에서의 출혈, 장요근초에서의 출혈 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시 형태에서, 대상체는 수술을 받을 예정이다. 또 다른 실시 형태에서, 치료는 예방적 치료 또는 대중적 치료이다.
응고 시스템의 기능을 평가하기 위해 다수의 테스트가 사용 가능하다: 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 테스트, 발색 분석, ROTEM® 분석, 프로트롬빈 시간(PT) 테스트(INR 결정에도 사용됨), 피브리노겐 테스트(종종 클라우스 방법에 의함), 혈소판 계수, 혈소판 기능 테스트(종종 PFA-100에 의함), TCT, 출혈 시간, 혼합 테스트(환자의 혈장이 정상 혈장과 혼합되는 경우 이상이 교정되는지 여부), 응고 인자 분석, 항인지질 항체, D-이량체, 유전자 테스트(예를 들어, 인자 V 라이덴, 프로트롬빈 돌연변이 G20210A), 희석 러셀사 독 시간(dRVVT), 기타 혈소판 기능 테스트, 혈전 탄성 묘사도(TEG 또는 소노클로트), 혈전 탄성 측정(TEM®, 예를 들어 ROTEM®), 또는 유글로불린 용해 시간(ELT).
aPTT 테스트는 "내재성"(접촉 활성화 경로로도 지칭됨) 및 통상적 응고 경로 둘 모두의 효능을 측정하는 성능 지표이다. 이 테스트는 통상적으로 상업적으로 이용 가능한 재조합 응고 인자, 예를 들어 FVIII 또는 FIX의 응고 활성을 측정하는 데 사용된다. 외인성 경로를 측정하는, 프로트롬빈 시간(PT)과 함께 사용된다.
ROTEM® 분석은 지혈의 전체 동역학: 응고 시간, 혈전 형성, 혈전 안정성 및 용해에 대한 정보를 제공한다. 혈전 탄성 측정의 상이한 파라미터들은 혈장 응고 시스템의 활성, 혈소판 기능, 섬유소 용해, 또는 이들 상호 작용에 영향을 미치는 많은 인자에 의존한다. 이 분석은 이차 지혈에 대한 완전한 관점을 제공할 수 있다.
IV. 핵산 분자
본 개시는 또한 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 특정 실시 형태에서, 단리된 산 분자는 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 단리된 산 분자는 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 85% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 91% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 92% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 93% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 94% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 96% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 97% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 98% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 동일하다.
특정 실시 형태에서, 단리된 산 분자는 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 다음과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다: (i) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 1 내지 84; (ii) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오티드 1 내지 84; (iii) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 1 내지 84; (iv) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 1 내지 84; (v) SEQ ID NO: 6의 뉴클레오티드 1 내지 84; 또는 (vi) SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 1 내지 84. 일부 실시 형태에서, 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 다음에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (i) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 1 내지 84; (ii) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오티드 1 내지 84; (iii) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 1 내지 84; (iv) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 1 내지 84; (v) SEQ ID NO: 6의 뉴클레오티드 1 내지 84; 또는 (vi) SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 1 내지 84.
특정 실시 형태에서, 단리된 산 분자는 프로펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프로펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 다음과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다: (i) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 85 내지 138; (ii) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오티드 85 내지 138; (iii) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 85 내지 138; (iv) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 85 내지 138; (v) SEQ ID NO: 6의 뉴클레오티드 85 내지 138; 또는 (vi) SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 85 내지 138. 일부 실시 형태에서, 프로펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 다음에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함한다 (i) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 85 내지 138; (ii) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오티드 85 내지 138; (iii) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 85 내지 138; (iv) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 85 내지 138; (v) SEQ ID NO: 6의 뉴클레오티드 85 내지 138; 또는 (vi) SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 85 내지 138.
본 개시는 또한 본원에 기재된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터, 예를 들어 본원에 개시된 임의의 렌티바이러스 벡터이다. 특정 실시 형태에서, 벡터는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, 또는 SEQ ID NO: 7에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 85% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 91% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 92% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 93% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 94% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 95% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 96% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 97% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 98% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 벡터는 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 벡터는 본원에 기재된 하나 이상의 조절 요소를 추가로 포함한다. 특정 실시 형태에서, 벡터는 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 조직 특이적 프로모터는 표적 간 세포에서 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 선택적으로 향상시킨다. 특정 실시 형태에서, 표적 간 세포에서 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 선택적으로 향상시키는 조직 특이적 프로모터는 APOA2 프로모터, SERPINA1(hAAT) 프로모터, mTTR 프로모터, MIR122 프로모터, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 표적 간 세포는 간세포이다.
V. 조직 특이적 발현
특정 실시 형태에서, 예를 들어 최적화된 FIX 트랜스진에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 렌티바이러스 벡터 내에 포함시키는 것이 유용할 것이다. 따라서, 본 개시는 또한 최적화된 FIX 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결되거나 달리 렌티바이러스 벡터 내에 삽입된 적어도 하나의 miRNA 서열 표적을 제공한다. 렌티바이러스 벡터 내에 포함된 1개 초과 카피의 miRNA 표적 서열은 시스템의 효과를 증가시킬 수 있다.
또한 상이한 miRNA 표적 서열이 포함된다. 예를 들어, 1개 초과의 트랜스진을 발현하는 렌티바이러스 벡터는, 동일하거나 상이할 수 있는, 1개 초과의 miRNA 표적 서열의 제어 하에 트랜스진을 가질 수 있다. miRNA 표적 서열들은 나란히 있을 수 있으나, 다른 배열도 또한 포함된다. miRNA 표적 서열을 함유하는, 트랜스진 발현 카세트는 또한 안티센스 배향으로 렌티바이러스 벡터 내에 삽입될 수 있다. 안티센스 배향은 그렇지 않으면 생산자 세포에 독성일 수 있는 유전자 산물의 발현을 피하기 위해 바이러스 입자 생산에 유용할 수 있다.
다른 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 동일하거나 상이한 miRNA 표적 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 카피를 포함한다. 그러나, 다른 특정 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 어떠한 miRNA 표적 서열도 포함하지 않을 것이다. miRNA 표적 서열을 포함할지 여부(및 얼마나 많이)의 선택은 의도되는 조직 표적, 필요한 발현 수준 등과 같은 알려진 파라미터에 의해 안내될 것이다.
일 실시 형태에서, 표적 서열은 골수 수임성 전구 세포에서 발현을 가장 효과적으로 및 보다 초기의 HSPC에서 적어도 부분적으로 발현을 차단하는 것으로 보고된 miR-223 표적이다. miR-223 표적은 과립구, 단핵구, 대식세포, 골수 수지상 세포를 포함하는 분화된 골수 세포에서 발현을 차단할 수 있다. miR-223 표적은 또한 림프 또는 적혈구 계통에서의 강력한 트랜스진 발현에 의존하는 유전자 요법 적용에 적합할 수 있다. miR-223 표적은 또한 인간 HSC에서 매우 효과적으로 발현을 차단할 수 있다.
다른 실시 형태에서, 표적 서열은 miR142 표적(tccataaagt aggaaacact aca(SEQ ID NO: 27))이다. 일 실시 형태에서, 렌티바이러스 벡터는 4개 카피의 miR-142 표적 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, miR-142(142T)와 같은, 조혈-특이적 마이크로RNA의 상보적 서열이 렌티바이러스 벡터의 3' 비번역 영역 내로 포함되어, 트랜스진-인코딩 전사물이 miRNA-매개 하향-조절에 영향을 받기 쉽도록 만든다. 이 방법에 의해, 트랜스진 발현은 조혈-계통 항원 제시 세포(APC)에서 방지될 수 있는 반면, 비-조혈 세포에서는 유지될 수 있다(Brown et al., Nat Med 2006). 이 전략은 트랜스진 발현에 엄격한 전사-후 제어를 부과할 수 있으므로 트랜스진의 안정적인 전달 및 장기 발현을 가능하게 한다. 일부 실시 형태에서, miR-142 조절은 형질 도입된 세포의 면역-매개된 청소를 방지하고/하거나 트랜스진-인코딩된 항원에 대한 항원-특이적 조절 T 세포(T reg)를 유도하고 강력한 면역 내성을 매개한다.
일부 실시 형태에서, 표적 서열은 miR181 표적이다. 문헌[Chen C-Z and Lodish H, Seminars in Immunology(2005) 17(2): 155-165]은 마우스 골수 내 B 세포에서 특이적으로 발현되는 miRNA인, miR-181을 개시한다(Chen and Lodish, 2005). 또한 일부 인간 miRNA가 백혈병에 연관됨을 개시한다.
표적 서열은 miRNA와 완전히 또는 부분적으로 상보적일 수 있다. 용어 "완전히 상보적"은 표적 서열이 이를 인식하는 miRNA의 서열에 100% 상보적인 핵산 서열을 갖는 것을 의미한다. 용어 "부분적으로 상보적"은 표적 서열이 이를 인식하는 miRNA의 서열에 부분적으로만 상보적이며, 이에 의해 부분적으로 상보적인 서열이 여전히 miRNA에 의해 인식됨을 의미한다. 다시 말해서, 본 개시의 맥락에서 부분적으로 상보적인 표적 서열은 상응하는 miRNA를 인식하고 그 miRNA를 발현하는 세포에서 트랜스진 발현의 방지 또는 감소를 가져오는 데 효과적이다. miRNA 표적 서열의 예는 WO2007/000668, WO2004/094642, WO2010/055413, 또는 WO2010/125471에 기재되어 있으며, 이는 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
VI. 숙주 세포 및 제조 방법
본 개시는 또한 본 개시의 핵산 분자 또는 렌티바이러스 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 개시의 특정 양태는 본원에 개시된 렌티바이러스 벡터로 숙주 세포를 형질 감염 및/또는 형질 전환시키는 것을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 제조하는 또는 생산하는 것에 관한 것이다. 본원에서 사용된 용어 "형질 전환"은 넓은 의미로 사용되어 유전자형을 변화시켜 결과적으로 수용자 세포에서의 변화를 초래하는 수용자 숙주 세포로의 DNA 도입을 지칭해야 한다.
"숙주 세포"는 본원에 개시된 렌티바이러스 벡터로 형질 전환된 세포를 지칭한다. 본 개시의 숙주 세포는 바람직하게는 포유류 기원이고; 가장 바람직하게는 인간 또는 마우스 기원이다. 당업자는 그들의 목적에 가장 적합한 구체적인 숙주 세포주를 우선적으로 결정하는 능력을 갖는 것으로 여겨진다. 예시적인 숙주 세포주로는 CHO, DG44 및 DUXB11(중국 햄스터 난소 주, DHFR 음성), HELA(인간 자궁 경부 암종), CVI(원숭이 신장 주), COS(SV40 T 항원을 갖는 CVI의 유도체), R1610(중국 햄스터 섬유모세포) BALBC/3T3(마우스 섬유모세포), HAK(햄스터 신장 주), SP2/O(마우스 골수종), P3 X 63-Ag3.653(마우스 골수종), BFA-1c1BPT(소 내피 세포), RAJI(인간 림프구), PER.C6®, NS0, CAP, BHK21, 및 HEK 293(인간 신장)이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 구체적인 일 실시 형태에서, 숙주 세포는 CHO 세포, HEK293 세포(예를 들어, HEK293T 세포), BHK21 세포, PER.C6® 세포, NS0 세포, CAP 세포 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 본 개시의 숙주 세포는 곤충 기원이다. 구체적인 일 실시 형태에서, 숙주 세포는 SF9 세포이다. 숙주 세포주는 전형적으로 상업적 서비스, 미국 조직 배양 수집처(American Tissue Culture Collection), 또는 간행 문헌으로부터 이용 가능하다.
본 개시의 핵산 분자 또는 벡터의 숙주 세포로의 도입은 당업자에게 잘 알려진 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다. 이들에는 형질 감염(전기 영동 및 전기 천공 포함), 원형질체 융합, 칼슘 포스페이트 침전, 외피로 싸인 DNA와의 세포 융합, 미세 주입, 및 온전한 바이러스를 사용한 감염이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 문헌[Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988)] 참고. 가장 바람직하게는, 숙주로의 플라스미드 도입이 전기 천공을 통한다. 형질 전환된 세포는 경쇄 및 중쇄의 생산에 적합한 조건 하에서 성장되고, 중쇄 및/또는 경쇄 단백질 합성에 대해 분석된다. 예시적인 분석 기술로는 효소-결합 면역 흡착 분석(ELISA), 방사선 면역 분석(RIA), 또는 형광-활성화 세포 분류기 분석(FACS), 면역 조직 화학 등이 포함된다.
본 개시의 단리된 핵산 분자 또는 렌티바이러스 벡터를 포함하는 숙주 세포는 적절한 성장 배지에서 성장된다. 본원에서 사용된 용어 "적절한 성장 배지"는 세포의 성장에 필요한 영양소를 함유하는 배지를 의미한다. 세포 성장에 필요한 영양소로는 탄소원, 질소원, 필수 아미노산, 비타민, 미네랄, 및 성장 인자가 포함될 수 있다. 선택적으로, 배지는 하나 이상의 선택 인자를 함유할 수 있다. 선택적으로 배지는 송아지 혈청 또는 태아 송아지 혈청(FCS)을 함유할 수 있다. 일 실시 형태에서, 배지는 실질적으로 IgG를 함유하지 않는다. 성장 배지는 일반적으로, 예를 들어 DNA 작제물 상의 또는 DNA 작제물과 공동-형질 감염된 선별 가능한 마커에 의해 보완되는 약물 선택 또는 필수 영양소의 결핍에 의해 DNA 작제물을 함유하는 세포를 선택할 것이다. 배양된 포유류 세포는 일반적으로 상업적으로 이용 가능한 혈청-함유 또는 무-혈청 배지(예를 들어 MEM, DMEM, DMEM/F12)에서 성장한다. 일 실시 형태에서, 배지는 CDoptiCHO(Invitrogen, Carlsbad, CA)이다. 다른 실시 형태에서, 배지는 CD17(Invitrogen, Carlsbad, CA)이다. 사용되는 구체적인 세포주에 적절한 배지의 선택은 당업자의 수준 내에 있다.
일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 본원에 기재된 바와 같이 추가로 변형된다. 예를 들어, 숙주 세포는, 본원에 기재된 바와 같이, CD47을 과발현하도록 변형될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는 표면-노출된 MHC-I이 결여되도록 변형된다. 일부 실시 형태에서, 숙주 세포는, 비변형 숙주 세포 대비, 감소된 표면-노출 MHC-I을 갖도록 변형된다. 특정 실시 형태에서, 숙주 세포는 CD47고/MHC-I저 HEK 293T 세포이다.
본 개시의 특정 양태는 적합한 조건 하에 본원에 기재된 숙주 세포를 배양하는 것 및 렌티바이러스 벡터를 단리하는 것을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법에 관한 것이다. 특정 양태에서, 본 개시는 적합한 조건 하에 본원에 기재된 숙주 세포를 배양하는 것 및 렌티바이러스 벡터를 단리하는 것을 포함하는, 본원에 개시된 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본원에 기술된 모든 다양한 양태, 실시 형태 및 옵션은 임의의 및 모든 변형으로 조합될 수 있다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 포함된 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
본 발명이 일반적으로 기술되어 있지만, 추가의 이해가 본원에 제공된 실시예를 참조하여 얻어질 수 있다. 이 실시예는 단지 예시의 목적을 위한 것이고 제한인 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: 성체 HemB 마우스에서의 LV-coFIX-1-R338L 매개 장기 FIX 발현 및 용량 반응
R338L("파두아") 치환을 갖는 인간 FIX 변이체를 인코딩하는 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열(coFIX-1-R338L; SEQ ID NO: 1)을 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝하여 LV-coFIX-1-R338L(도 1)을 생성하였다. 동물 모델에서 LV-FIX의 용량 반응 프로파일을 결정하기 위해, 293T 세포에서 생성된 LV-coFIX-1-R338L을 성체 HemB 마우스에서 평가하였다. 8주차 HemB 마우스를 꼬리 정맥 주사를 통해 3E9, 7.5E9, 2E10, 또는 6E10 TU/kg의 용량으로 LV-coFIX-1-R338L을 사용하여 처리하였다(n=2 내지 10 마리 동물/용량 수준). LV-FIX 매개 혈장 FIX 활성 및 항원 수준은 FIX 발색 및 ELISA 분석으로 모니터링하였다. 각각의 동물의 정상 상태 FIX 혈장 수준은 도 2a에 나타나고, LV-coFIX-1-R338L 용량 반응 곡선은 도 2b에 나타난다. HemB 마우스 모델에서, LV-coFIX-1-R338L은 로그-로그 용량 반응 프로파일을 입증했으며, 정상 순환 FIX 활성의 10 내지 200%를 달성하는 데 필요한 LV-coFIX-1-R338L 용량 수준은 HemB 마우스에서 5E9 내지 2E10 TU/kg 범위인 것으로 결정하였다.
3개의-더 높은 용량 수준 그룹에서 LV-coFIX-1-R338L 처리된 동물의 장기 FIX 발현 프로파일을 LV 처리 후 6-개월 동안 모니터링하였다. 순환 FIX 활성(도 3a) 및 항원(도 3b) 수준을 도표화하였다. 모든 실험 동물에서 일관된 수준의 LV 매개 FIX 발현을 관찰하였으며, 통합 유전자 요법 치료의 장기 안정성을 입증한 연구 기간 내에 FIX 발현에 대한 손실을 검출하지 않았다. 또한, FIX 활성(도 3b)의 그것에 비해 더 낮은 백분율의 정상 FIX 항원 수준을 관찰하였으며(도 3a), 이는 FIX 트랜스진 내 기능 획득 R338L 돌연변이의 사용을 반영한다.
실시예 2: 성체 및 신생아 동물에서 LV-coFIX-1-R338L은 유사한 형질 도입 효율을 갖는다
렌티바이러스 벡터는 숙주 게놈 내로 통합되어 오래-지속되는 트랜스진 발현을 매개할 수 있으므로, 신생아 처리 후 AAV 매개 트랜스진 발현의 빠른 손실과는 달리, 렌티바이러스 매개 트랜스진 발현은 성체 동물뿐만 아니라 LV-FIX로 처리된 신생아 동물에서도 지속적인 트랜스진 발현 프로파일을 유지할 것으로 예상된다. 신생아 처리 후 렌티바이러스 FIX의 형질 도입 효율 및 트랜스진 발현 프로파일을 평가하기 위해, 2일차 HemB 새끼를 7.5E9, 2E10 및 6E10 TU/kg로 측두 정맥 주사를 통해 LV-coFIX-1-R338L을 사용하여 처리하였다. 성체 단계에서의 처리(8주에 투여됨)와 비교하여, 전신 투여된 LV-coFIX-1-R338L은 각각의 용량 수준에서 6개월의 연구 기간에 걸쳐 지속적이고, 유사한 수준의 FIX 발현을 매개하였으며, 이는 렌티바이러스 FIX 투여가 성체 및 소아 환자 둘 모두를 효과적으로 치료할 수 있음을 시사한다. 3E9, 7.5E9, 또는 2E10 TU/kg 용량으로 측두 정맥 주사를 통해 LV-coFIX-1-R338L을 사용한 청소년 마우스 처리(2주에 투여됨)를 또한 평가하였다. 각각의 용량 수준에서 FIX 발현 수준은 8주 또는 2일에 처치를 투여받은 마우스에서의 비슷한 용량보다 더 높았다(n=6 마리 동물/용량 수준/연령; 도 4a).
7.5E9, 2E10, 및 6E10 TU/kg 용량으로 측두 정맥 주사를 통해 8주 및 2일에, 및 3E9, 7.5E9, 또는 2E10 TU/kg 용량으로 2주에 투여된 HemB 마우스에서 LV-coFIX-1-R338L의 용량 반응을 결정하기 위해 FIX 활성을 측정하였다. 도 4a의 장기적 데이터와 일관되게, 2주에 처치를 투여받은 마우스(청소년 마우스)는 2일 또는 8주에 처치를 투여받은 마우스에 비해 더 높은 FIX 활성을 나타냈다(도 4b).
실시예 3: 비-인간 영장류에서의 CD47고 LV-coFIX-1-R338L의 평가
렌티바이러스 벡터의 면역 특성을 조절하기 위해 인간 CD47을 과발현하는 HEK293T 세포주를 생성하였다. 인간 CD47의 높은 표면 수준을 갖는 렌티바이러스 벡터 입자는 NOD 마우스에서 더 낮은 쿠퍼(Kupffer) 세포 흡수 및 더 높은 간세포 형질 도입을 나타냈다(NOD 마우스는 인간 CD47을 인식할 수 있음). 또한, 대식세포는, CD47을 과발현하지 않는 대조군 렌티바이러스 벡터 대비, 높은 표면 인간 CD47 발현을 갖는 렌티바이러스 벡터 입자를 더 적게 흡수하였다(도 5).
생체내 간 형질 도입에 대한 높은 표면 수준의 인간 CD47 효과를 추가로 평가하기 위해, 7.5 E9 TU/kg 용량으로 정맥내 투여 후 비-인간 영장류(NHP)에서 CD47고 LV-coFIX-1-R338L을 LV-coFIX-1-R338L과 비교하였다. n=3 마리/처리군. 처리 후 NHP에서의 렌티바이러스 벡터 제한을 피하기 위해 마카카 네메스트리나 원숭이를 사용하였다.
렌티바이러스 벡터 처리 후 순환 인간 FIX 수준을 인간 FIX 비 활성(specific activity)(도 6a) 및 항원 분석(도 6b)으로 측정하였다. CD47고 LV-coFIX-1-R338L은, 각각 정상 FIX 활성 수준의 200 내지 300% 및 50 내지 150%로, LV-coFIX-1-R338L과 비교하여 렌티바이러스 벡터 처리 후 3배 더 높은 인간 FIX 발현을 부여한다(도 6a). CD47고 LV-coFIX-1-R338L의 사용은 잠재적으로 LV-FIX를 낮추고 렌티바이러스 벡터 치료와 관련된 급성 독성을 감소시킬 수 있다.
인간 FIX 발현 수준에 추가하여, 처리된 동물의 지혈 또한 APTT 분석으로 모니터링하였다(도 6c). 비히클 처리된 동물의 APTT 시간은 동일한 범위에 남아 있었던 반면, 모든 LV-FIX 처리된 동물에 대해 유의미하게 단축된 APTT 시간을 관찰하였으며(도 6c), 이는 렌티바이러스 벡터 처리로 인한 인간 FIX 단백질이 기능적으로 활성임을 나타낸다.
실시예 4: 비-인간 영장류에서의 CD47고 LV-coFIX-1-R338L 용량 반응
NHP에서 CD47고 LV-coFIX-1-R338L의 용량 반응 프로파일을 결정하기 위해, 2개의 더 낮은 용량의 CD47고 LV-coFIX-1-R338L을 1.5E9 및 3E9 TU/kg에서 테스트하였다(n=3/용량 수준). 렌티바이러스 벡터-매개 인간 FIX 발현은 정상 상태 순환된 인간 FIX 비 활성(도 7a) 및 항원 수준(도 7b)을 분석함으로써 모니터링하였다.
HemB 마우스에서 관찰한 결과와 일관되게, NHP에서 LV-coFIX-1-R338L에 대해 로그/로그 용량 반응 곡선도 관찰하였다. 정상 순환 FIX 수준의 10 내지 100%를 달성하는 데 필요한 CD47고 LV-coFIX-1-R338L의 용량 범위는 HemB 마우스에서의 그것보다 더 낮은 3.5 내지 6E9 TU/kg이다. 치료 용량 범위의 변화는 동일한 용량 수준에서 HemB 마우스에 비해 NHP에서의 5 내지 10배 더 높은 인간 FIX 발현 수준에 기인하며, 이는 동물 종 및 인간 CD47의 인식(인간 CD47은 HemB 마우스에서 인식되지 않는다)의 변동의 결과로 볼 수 있다.
LV-coFIX-1-R338L이 투여된 동물은, 투여 후 ALT 수준(도 8a), AST 수준(도 8b), 림프 수준(도 8c) 및 체온(도 8d)으로 표시되는, 매우 경미한 급성 면역 반응을 나타냈다. LV 대조군 벡터 대비 CD47고 LV-coFIX-1-R338L의 투여 후에 감소된 사이토카인 반응을 관찰하였다(도 9a 내지 도 9c). 대조군 LV의 투여 후 MIP-1a, MIP-1b, 및 MCP-1의 경미한 증가를 관찰한 반면, CD47고 LV-coFIX-1-R338L 투여 후 MIP-1a, MIP-1b, 및 MCP-1 발현은 더 낮았고 일부 경우에는 검출 불가능했다. 예상대로, LV-coFIX-1-R338L은 주로 간 및 비장으로 국소화되어, 간 및 비장에서 다른 기관보다 100배 초과로 더 높은 벡터 카피 수(VCN)를 가졌다(도 10). 이들 데이터는 CD47고 LV-coFIX-1-R338L이, 식세포 작용에 대한 저항성을 증가시키고 간세포 유전자 전달을 개선하여, 이종 면역 반응 감소를 유도함을 시사한다.
실시예 5: 비-인간 영장류에서의 CD47고 LV-coFIX-1-R338L 용량 반응에 대한 추가 테스트
추가 마카카 네메스트리나를 정맥내 투여를 통해 2.5E9 TU/kg 용량의 CD47고 LV-coFIX-1-R338L로 처리하였다. 렌티바이러스 벡터-매개 인간 FIX 발현은 정상 상태 순환된 인간 FIX 비 활성(도 11a) 및 항원 수준(도 11b)을 분석함으로써 모니터링하였다. LV 처리 후, 정상 상태 순환 인간 FIX 활성은 정상의 약 33%이고 순환 인간 FIX 항원 양은 정상 FIX 항원 수준의 14%와 상관 관계 있는 700 ng/mL이다.
특정 실시 형태에 대한 전술한 설명은 당업계 내의 지식을 적용함으로써 다른 사람이 본 발명의 일반적인 개념을 벗어나지 않고도 과도한 실험 없이 이러한 특정 실시 형태를 다양한 응용예에 맞도록 용이하게 수정 및/또는 개조할 수 있는 본 발명의 일반적인 속성을 완전히 밝힐 것이다. 따라서, 이러한 개조 및 수정은 본원에 제시된 교시 및 지침에 기초하여, 개시된 실시 형태의 등가물의 의미 및 범주 내에 있는 것으로 의도된다. 본원에서의 표현 또는 용어는 본 명세서의 용어 또는 표현이 본 발명의 교시 및 지침에 비추어 당업자에 의해 해석될 수 있도록 기술하기 위한 것이며 한정하기 위한 것이 아님을 이해해야 한다.
본 발명의 다른 실시 형태는 본 명세서의 고려 및 본원에 개시된 본 발명의 실시에 의해 당업자에게 명백해질 것이다. 본 명세서 및 실시예는 단지 예시적인 것으로서 간주되는 것으로 의도되며, 이때 본 발명의 실제 범주 및 사상은 하기 청구범위로 나타낸다.
본원에 인용된 모든 특허 및 간행물은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> BIOVERATIV THERAPEUTICS INC. <120> LENTIVIRAL VECTORS EXPRESSING FACTOR IX <130> SA9-468PC <150> US 62/776,393 <151> 2018-12-06 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1248 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> coFIX-1-R338L <400> 1 tacaatagtg ggaagctgga ggaatttgtg cagggcaacc tggagagaga atgcatggag 60 gaaaagtgta gcttcgagga agcccgcgag gtgtttgaaa atacagagcg aaccacagag 120 ttctggaagc agtatgtgga cggcgatcag tgcgagagca acccctgtct gaatggcgga 180 agttgcaaag acgatatcaa ctcatacgaa tgctggtgtc ctttcgggtt tgaaggcaaa 240 aattgcgagc tggacgtgac atgtaacatt aagaatggac ggtgcgagca gttttgtaaa 300 aactctgccg ataataaggt ggtgtgcagc tgtactgaag gatatcgcct ggctgagaac 360 cagaagtcct gcgaaccagc agtgcccttc ccttgtggga gggtgagcgt ctcccagact 420 tcaaaactga ccagagcaga gacagtgttt cccgacgtgg attacgtcaa cagcactgag 480 gccgaaacca tcctggacaa cattactcag tctacccaga gtttcaatga ctttactcgg 540 gtggtcgggg gcgaggatgc taaaccaggc cagttcccct ggcaggtggt cctgaacgga 600 aaggtggatg cattttgcgg 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caatagtggg aagctggagg aatttgtgca gggcaacctg 180 gagagagaat gcatggagga aaagtgtagc ttcgaggaag cccgcgaggt gtttgaaaat 240 acagagcgaa ccacagagtt ctggaagcag tatgtggacg gcgatcagtg cgagagcaac 300 ccctgtctga atggcggaag ttgcaaagac gatatcaact catacgaatg ctggtgtcct 360 ttcgggtttg aaggcaaaaa ttgcgagctg gacgtgacat gtaacattaa gaatggacgg 420 tgcgagcagt tttgtaaaaa ctctgccgat aataaggtgg tgtgcagctg tactgaagga 480 tatcgcctgg ctgagaacca gaagtcctgc gaaccagcag tgcccttccc ttgtgggagg 540 gtgagcgtct cccagacttc aaaactgacc agagcagaga cagtgtttcc cgacgtggat 600 tacgtcaaca gcactgaggc cgaaaccatc ctggacaaca ttactcagtc tacccagagt 660 ttcaatgact ttactcgggt ggtcgggggc gaggatgcta aaccaggcca gttcccctgg 720 caggtggtcc tgaacggaaa ggtggatgca ttttgcggag ggtctatcgt gaatgagaaa 780 tggattgtca ccgccgctca ctgcgtggaa accggagtca agatcacagt ggtcgctggg 840 gagcacaaca ttgaggaaac agaacatact gagcagaagc ggaatgtgat ccgcatcatt 900 cctcaccata actacaatgc agccatcaac aaatacaatc atgacattgc cctgctggaa 960 ctggatgagc ctctggtgct gaacagctac gtcactccaa tctgcattgc tgacaaagag 1020 tataccaata tcttcctgaa gtttggatca gggtacgtga gcggctgggg aagagtcttc 1080 cacaagggca ggagcgccct ggtgctccag tatctgcgag tgcctctggt cgatcgagct 1140 acctgtctgc tgtctaccaa gtttacaatc tacaacaaca tgttctgcgc tgggtttcac 1200 gagggaggac gagactcctg tcagggcgat tctgggggcc cacatgtgac agaggtcgaa 1260 ggcaccagct tcctgactgg catcatttcc tggggagagg aatgtgcaat gaagggaaaa 1320 tacgggatct acaccaaagt gagccgctat gtgaactgga tcaaggaaaa aaccaaactg 1380 acctaa 1386 <210> 3 <211> 1386 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> coFIX-2-R338L <400> 3 atgcagaggg tgaacatgat catggccgag agccccggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60 ggctacctgc tgagcgccga gtgcaccgtg ttcctggacc acgagaacgc caacaagatc 120 ctgaacaggc ccaagaggta caacagcggc aagctggagg agttcgtgca gggcaacctg 180 gagagggagt gcatggagga gaagtgcagc ttcgaggagg ccagggaggt gttcgagaac 240 accgagagga ccaccgagtt ctggaagcag tacgtggacg gcgaccagtg cgagagcaac 300 ccctgcctga acggcggcag ctgcaaggac gacatcaaca gctacgagtg ctggtgcccc 360 ttcggcttcg agggcaagaa ctgcgagctg gacgtgacct gcaacatcaa gaacggcagg 420 tgcgagcagt tctgcaagaa cagcgccgac aacaaggtgg tgtgcagctg caccgagggc 480 tacaggctgg ccgagaacca gaagagctgc gagcccgccg tgcccttccc ctgcggcagg 540 gtgagcgtga gccagaccag caagctgacc agggccgaga ccgtgttccc cgacgtggac 600 tacgtgaaca gcaccgaggc cgagaccatc ctggacaaca tcacccagag cacccagagc 660 ttcaacgact tcaccagagt ggtggggggc gaggacgcca agcccggcca gttcccctgg 720 caggtcgtgc tgaatggcaa agtcgatgcc ttctgcgggg gcagcatcgt caacgagaag 780 tggattgtga ctgccgccca ttgcgtggaa accggggtga agatcactgt ggtggctggg 840 gagcacaaca tcgaggaaac cgagcacacc gagcagaaga ggaacgtgat caggattatc 900 ccccatcaca actacaatgc cgccatcaat aagtacaacc atgatattgc cctgctggag 960 ctggatgaac ccctggtcct gaacagctat gtgactccca tctgcattgc cgacaaggag 1020 tataccaaca tcttcctgaa atttggcagc ggctatgtct ctggctgggg cagggtgttc 1080 cataagggga ggagcgccct ggtcctgcag tacctgagag tgcccctggt ggacagggcc 1140 acctgcctgc tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaata tgttttgcgc tggcttccat 1200 gaggggggca gggacagctg ccagggggac agcgggggcc cccatgtgac tgaggtggag 1260 ggcaccagct tcctgaccgg catcatcagc tggggggagg agtgcgccat gaaggggaag 1320 tatggcatct acaccaaagt ctccagatac gtcaactgga tcaaggagaa gaccaagctg 1380 acctaa 1386 <210> 4 <211> 1386 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> coFIX-3-R338L <400> 4 atgcagaggg tgaacatgat catggccgag agccccggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60 ggctacctgc tgagcgccga gtgcaccgtg ttcctggacc acgagaacgc caacaagatc 120 ctgaacaggc ccaagaggta caacagcggc aagctggagg agttcgtgca gggcaacctg 180 gagagggagt gcatggagga gaagtgcagc ttcgaggagg ccagggaggt gttcgagaac 240 accgagagga ccaccgagtt ctggaagcag tacgtggacg gcgaccagtg cgagagcaac 300 ccctgcctga acggcggcag ctgcaaggac gacatcaaca gctacgagtg ctggtgcccc 360 ttcggcttcg agggcaagaa ctgcgagctg gacgtgacct gcaacatcaa gaacggcagg 420 tgcgagcagt tctgcaagaa cagcgccgac aacaaggtgg tgtgcagctg caccgagggc 480 tacaggctgg ccgagaacca gaagagctgc gagcccgccg tgcccttccc ctgcggcagg 540 gtgagcgtga gccagaccag caagctgacc agggccgaga ccgtgttccc cgacgtggac 600 tacgtgaaca gcaccgaggc cgagaccatc ctggacaaca tcacccagag cacccagagc 660 ttcaacgact tcaccagggt ggtgggcggc gaggacgcca agcccggcca gtttccctgg 720 caggtggtgc tgaacggcaa ggtggacgcc ttctgcggcg gcagcatcgt gaacgagaag 780 tggatcgtga ccgctgccca ttgcgtggaa accggcgtga agatcaccgt ggtggccggc 840 gagcacaaca tcgaagagac cgagcacacc gaacagaaaa ggaacgtgat caggatcatc 900 cctcaccata actacaatgc cgccattaac aagtacaatc acgacatcgc tctgctggaa 960 ctggatgaac ccctggtgct gaacagctac gtgaccccta tctgcatcgc cgacaaggag 1020 tatactaaca tctttctgaa gtttggcagc ggctatgtga gcggctgggg cagggtgttc 1080 cacaaaggca ggagcgccct ggtgctgcag tacctgaggg tgcccctggt ggatagggct 1140 acctgcctgc tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaaca tgttctgtgc cggcttccac 1200 gaaggcggca gggactcttg ccagggcgac agcggcggcc cccatgtgac cgaggtggaa 1260 ggcactagct ttctgaccgg catcatcagc tggggcgagg agtgcgccat gaagggcaag 1320 tacggcatct acactaaggt gagcaggtac gtgaactgga tcaaagaaaa gaccaagctg 1380 acctaa 1386 <210> 5 <211> 1386 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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gagcacaaca tcgaggagac cgagcacacc gagcagaaga ggaacgtgat caggatcatc 900 ccccaccaca actacaacgc cgccatcaac aagtacaacc acgacatcgc cctgctggag 960 ctggacgagc ccctggtgct gaacagctac gtgaccccca tctgcatcgc cgacaaggag 1020 tacaccaaca tcttcctgaa gttcggcagc ggctacgtga gcggctgggg cagggtgttc 1080 cacaagggca ggagcgccct ggtgctgcag tacctgaggg tgcccctggt ggacagggcc 1140 acctgcctgc tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaaca tgttctgcgc cggcttccac 1200 gagggcggca gggacagctg ccagggcgac agcggcggcc cccacgtgac cgaggtggag 1260 ggcaccagct tcctgaccgg catcatcagc tggggcgagg agtgcgccat gaagggcaag 1320 tacggcatct acaccaaggt gagcaggtac gtgaactgga tcaaggagaa gaccaagctg 1380 acctaa 1386 <210> 6 <211> 1386 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> coFIX-5-R338L <400> 6 atgcagaggg tcaacatgat catggctgag tctcctggcc tgatcaccat ctgcctgctg 60 ggctatctgc tgtccgctga gtgcactgtc ttcctggacc acgagaacgc caacaagatc 120 ctgaacaggc ccaagaggta taactctggc aagctggagg agtttgtgca ggggaacctg 180 gagagggagt gcatggagga gaagtgcagc ttcgaggagg ccagggaggt gtttgagaac 240 actgagagga ccaccgagtt ctggaagcag tatgtggacg gggaccagtg cgagtctaac 300 ccttgcctga acgggggcag ctgcaaggat gacatcaaca gctatgagtg ctggtgccct 360 ttcggcttcg agggcaagaa ctgcgagctg gatgtgacct gcaacatcaa gaacggcagg 420 tgcgagcagt tctgcaagaa ctctgccgac aacaaggtgg tgtgcagctg cactgagggc 480 tataggctgg ctgagaacca gaagagctgt gagcctgctg tgcccttccc ctgcggcaga 540 gtgtctgtga gccagaccag caagctgacc agagctgaga ctgtcttccc cgacgtggac 600 tatgtgaaca gcaccgaggc tgagaccatc ctggacaaca tcacccagtc tacccagtct 660 ttcaacgact tcaccagagt ggtggggggc gaggacgcca agcctggcca gttcccctgg 720 caggtcgtgc tgaacggcaa agtggacgcc ttctgcgggg gcagcatcgt caacgagaag 780 tggatcgtga ctgctgctca ctgcgtggaa accggggtga agatcaccgt ggtggccggc 840 gagcacaaca tcgaggagac cgagcacacc gagcagaaga ggaacgtgat caggatcatc 900 ccccaccaca actacaacgc cgccatcaac aagtacaacc acgacatcgc cctgctggag 960 ctggacgagc ccctggtgct gaacagctac gtgaccccca tctgcatcgc cgacaaggag 1020 tacaccaaca tcttcctgaa gttcggcagc ggctacgtga gcggctgggg cagggtgttc 1080 cacaagggca ggagcgccct ggtgctgcag tacctgaggg tgcccctggt ggacagggcc 1140 acctgcctgc tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaaca tgttctgcgc cggcttccac 1200 gagggcggca gggacagctg ccagggcgac agcggcggcc cccacgtgac cgaggtggag 1260 ggcaccagct tcctgaccgg catcatcagc tggggcgagg agtgcgccat gaagggcaag 1320 tacggcatct acaccaaggt gagcaggtac gtgaactgga tcaaggagaa gaccaagctg 1380 acctaa 1386 <210> 7 <211> 1386 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> coFIX-6-R338L <400> 7 atgcagaggg tcaacatgat catggctgag tctcctggcc tgatcactat ctgcctgctg 60 ggctacctgc tgagcgccga gtgcactgtc ttcctggacc acgagaacgc caacaagatc 120 ctgaacaggc ccaagagata caactctggc aagctggagg agtttgtgca ggggaacctg 180 gagagggagt gcatggagga gaagtgcagc ttcgaggagg ccagggaggt gtttgagaac 240 actgagagga ccactgagtt ctggaagcag tatgtggacg gggaccagtg cgagtctaac 300 ccttgcctga acgggggcag ctgcaaggat gacatcaaca gctacgagtg ctggtgccct 360 ttcggcttcg agggcaagaa ctgcgagctg gatgtgactt gcaacatcaa gaacggcagg 420 tgcgagcagt tctgcaagaa ctctgccgac aacaaagtcg tgtgcagctg cactgagggc 480 tacagactgg ctgagaacca gaagagctgt gagcctgctg tgcccttccc ctgcggcaga 540 gtgtctgtga gccagaccag caagctgacc agagccgaaa ccgtgttccc cgacgtggac 600 tatgtgaaca gcactgaggc tgagaccatc ctggacaaca tcactcagtc tacccagtct 660 ttcaacgact tcaccagagt ggtggggggc gaggacgcca agcctggcca gttcccctgg 720 caggtcgtgc tgaacggcaa ggtggacgcc ttctgcgggg gcagcatcgt caacgagaag 780 tggatcgtga ctgccgccca ctgcgtggag actggggtga agatcactgt ggtggctggg 840 gagcacaaca tcgaggaaac cgagcacact gagcagaaga ggaacgtgat caggattatc 900 ccccaccaca actacaacgc cgccatcaac aagtacaacc acgacatcgc cctgctggag 960 ctggatgaac ccctggtgct gaacagctac gtgaccccta tctgcatcgc cgacaaggag 1020 tacactaaca tcttcctgaa gttcggcagc ggctacgtga gcggctgggg cagggtgttc 1080 cacaagggca ggagcgccct ggtgctgcag tacctgaggg tgcccctggt ggacagggcc 1140 acctgcctgc tgagcaccaa gttcaccatc tacaacaaca tgttctgcgc cggcttccac 1200 gagggcggca gggacagctg ccagggcgac agcggcggcc cccacgtgac cgaggtggag 1260 ggcaccagct tcctgaccgg catcatcagc tggggcgagg agtgcgccat gaagggcaag 1320 tacggcatct acaccaaggt gagcaggtac gtgaactgga tcaaggagaa gaccaagctg 1380 acctaa 1386 <210> 8 <211> 1389 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> factor IX nucleotide sequence <400> 8 atgcagcgcg tgaacatgat catggcagaa tcaccaggcc tcatcaccat ctgcctttta 60 ggatatctac tcagtgctga atgtacagtt tttcttgatc atgaaaacgc caacaaaatt 120 ctgaatcggc caaagaggta taattcaggt aaattggaag agtttgttca agggaatcta 180 gagagagaat gtatggaaga aaagtgtagt tttgaagaag cacgagaagt ttttgaaaac 240 actgaaagaa caactgaatt ttggaagcag tatgttgatg gagatcagtg tgagtccaat 300 ccatgtttaa atggcggcag ttgcaaggat gacattaatt cctatgaatg ttggtgtccc 360 tttggatttg aaggaaagaa ctgtgaatta gatgtaacat gtaacattaa gaatggcaga 420 tgcgagcagt tttgtaaaaa tagtgctgat aacaaggtgg tttgctcctg tactgaggga 480 tatcgacttg cagaaaacca gaagtcctgt gaaccagcag tgccatttcc atgtggaaga 540 gtttctgttt cacaaacttc taagctcacc cgtgctgaga ctgtttttcc tgatgtggac 600 tatgtaaatt ctactgaagc tgaaaccatt ttggataaca tcactcaaag cacccaatca 660 tttaatgact tcactcgggt tgttggtgga gaagatgcca aaccaggtca attcccttgg 720 caggttgttt tgaatggtaa agttgatgca ttctgtggag gctctatcgt taatgaaaaa 780 tggattgtaa ctgctgccca ctgtgttgaa actggtgtta aaattacagt tgtcgcaggt 840 gaacataata ttgaggagac agaacataca gagcaaaagc gaaatgtgat tcgaattatt 900 cctcaccaca actacaatgc agctattaat aagtacaacc atgacattgc ccttctggaa 960 ctggacgaac ccttagtgct aaacagctac gttacaccta tttgcattgc tgacaaggaa 1020 tacacgaaca tcttcctcaa atttggatct ggctatgtaa gtggctgggg aagagtcttc 1080 cacaaaggga gatcagcttt agttcttcag taccttagag ttccacttgt tgaccgagcc 1140 acatgtcttc gatctacaaa gttcaccatc tataacaaca tgttctgtgc tggcttccat 1200 gaaggaggta gagattcatg tcaaggagat agtgggggac cccatgttac tgaagtggaa 1260 gggaccagtt tcttaactgg aattattagc tggggtgaag agtgtgcaat gaaaggcaaa 1320 tatggaatat ataccaaggt atcccggtat gtcaactgga ttaaggaaaa aacaaagctc 1380 acttgataa 1389 <210> 9 <211> 1389 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> coFIX-1 <400> 9 atgcagagag tcaacatgat tatggctgag tcacctgggc tgattactat ttgcctgctg 60 ggctacctgc tgtccgccga gtgtaccgtg ttcctggacc atgagaacgc aaataagatc 120 ctgaacaggc ccaaaagata caatagtggg aagctggagg aatttgtgca gggcaacctg 180 gagagagaat gcatggagga aaagtgtagc ttcgaggaag cccgcgaggt gtttgaaaat 240 acagagcgaa ccacagagtt ctggaagcag tatgtggacg gcgatcagtg cgagagcaac 300 ccctgtctga atggcggaag ttgcaaagac gatatcaact catacgaatg ctggtgtcct 360 ttcgggtttg aaggcaaaaa ttgcgagctg gacgtgacat gtaacattaa gaatggacgg 420 tgcgagcagt tttgtaaaaa ctctgccgat aataaggtgg tgtgcagctg tactgaagga 480 tatcgcctgg ctgagaacca gaagtcctgc gaaccagcag tgcccttccc ttgtgggagg 540 gtgagcgtct cccagacttc aaaactgacc agagcagaga cagtgtttcc cgacgtggat 600 tacgtcaaca gcactgaggc cgaaaccatc ctggacaaca ttactcagtc tacccagagt 660 ttcaatgact ttactcgggt ggtcgggggc gaggatgcta aaccaggcca gttcccctgg 720 caggtggtcc tgaacggaaa ggtggatgca ttttgcggag ggtctatcgt gaatgagaaa 780 tggattgtca ccgccgctca ctgcgtggaa accggagtca agatcacagt ggtcgctggg 840 gagcacaaca ttgaggaaac agaacatact gagcagaagc ggaatgtgat ccgcatcatt 900 cctcaccata actacaatgc agccatcaac aaatacaatc atgacattgc cctgctggaa 960 ctggatgagc ctctggtgct gaacagctac gtcactccaa tctgcattgc tgacaaagag 1020 tataccaata tcttcctgaa gtttggatca gggtacgtga gcggctgggg aagagtcttc 1080 cacaagggca ggagcgccct ggtgctccag tatctgcgag tgcctctggt cgatcgagct 1140 acctgtctga ggtctaccaa gtttacaatc tacaacaaca tgttctgcgc tgggtttcac 1200 gagggaggac gagactcctg tcagggcgat tctgggggcc cacatgtgac agaggtcgaa 1260 ggcaccagct tcctgactgg catcatttcc tggggagagg aatgtgcaat gaagggaaaa 1320 tacgggatct acaccaaagt gagccgctat gtgaactgga tcaaggaaaa aaccaaactg 1380 acctaatga 1389 <210> 10 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FIX Signal Peptide <400> 10 Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr 1 5 10 15 Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys 20 25 <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FIX Propeptide <400> 11 Thr Val Phe Leu Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro 1 5 10 15 Lys Arg <210> 12 <211> 415 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FIX R338L <400> 12 Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg 1 5 10 15 Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe 20 25 30 Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly 35 40 45 Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp 50 55 60 Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys 65 70 75 80 Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu 85 90 95 Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr 100 105 110 Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val 115 120 125 Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr 130 135 140 Arg Ala Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu 145 150 155 160 Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn 165 170 175 Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe 180 185 190 Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly 195 200 205 Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu 210 215 220 Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu 225 230 235 240 Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His 245 250 255 His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu 260 265 270 Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile 275 280 285 Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser 290 295 300 Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala 305 310 315 320 Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys 325 330 335 Leu Leu Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly 340 345 350 Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro 355 360 365 His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser 370 375 380 Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys 385 390 395 400 Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr 405 410 415 <210> 13 <400> 13 000 <210> 14 <211> 323 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD47 <400> 14 Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly 1 5 10 15 Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe 20 25 30 Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala 35 40 45 Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp 50 55 60 Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp 65 70 75 80 Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala 85 90 95 Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr 100 105 110 Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu 115 120 125 Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu 130 135 140 Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Ala Ile Leu Leu Phe Trp Gly Gln Phe 145 150 155 160 Gly Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Arg Ser Gly Gly Met Asp Glu Lys Thr 165 170 175 Ile Ala Leu Leu Val Ala Gly Leu Val Ile Thr Val Ile Val Ile Val 180 185 190 Gly Ala Ile Leu Phe Val Pro Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Asn Ala Thr 195 200 205 Gly Leu Gly Leu Ile Val Thr Ser Thr Gly Ile Leu Ile Leu Leu His 210 215 220 Tyr Tyr Val Phe Ser Thr Ala Ile Gly Leu Thr Ser Phe Val Ile Ala 225 230 235 240 Ile Leu Val Ile Gln Val Ile Ala Tyr Ile Leu Ala Val Val Gly Leu 245 250 255 Ser Leu Cys Ile Ala Ala Cys Ile Pro Met His Gly Pro Leu Leu Ile 260 265 270 Ser Gly Leu Ser Ile Leu Ala Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Val Tyr 275 280 285 Met Lys Phe Val Ala Ser Asn Gln Lys Thr Ile Gln Pro Pro Arg Lys 290 295 300 Ala Val Glu Glu Pro Leu Asn Ala Phe Lys Glu Ser Lys Gly Met Met 305 310 315 320 Asn Asp Glu <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> albumin binding peptide core sequence <400> 15 Asp Ile Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 1 5 10 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker <400> 16 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide linker <400> 17 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 18 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CTP peptide <400> 18 Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser 1 5 10 15 Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu 20 25 30 <210> 19 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CTP PEPTIDE <400> 19 Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg 1 5 10 15 Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln 20 25 <210> 20 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAS peptide <400> 20 Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ser Ala Pro Ala 20 <210> 21 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAS peptide <400> 21 Ala Ala Pro Ala Ser Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15 Ala Ala Pro Ser 20 <210> 22 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAS Peptide <400> 22 Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ala 1 5 10 15 Ser Pro Ser Ser 20 <210> 23 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAS Peptide <400> 23 Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ser Ala Pro Ser Ser Pro Ser Pro Ala 1 5 10 15 Ser Pro Ser <210> 24 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PAS Peptide <400> 24 Ser Ser Pro Ser Ala Pro Ser Pro Ser Ser Pro Ala Ser Pro Ser Pro 1 5 10 15 Ser Ser Pro Ala 20 <210> 25 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pas Peptide <400> 25 Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ser Ala Pro Pro Ala Ala Ala Ser Pro 1 5 10 15 Ala Ala Pro Ser Ala Pro Pro Ala 20 <210> 26 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Pas Peptide <400> 26 Ala Ser Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ser Ala Pro 1 5 10 15 Ser Ala Ala Ala 20 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR142 Target <400> 27 tccataaagt aggaaacact aca 23

Claims (111)

  1. 인자 IX(FIX) 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터의 유효 용량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 렌티바이러스 벡터는 비 변형된 HEK293T 세포(ATCC® CRL-11268™)에서 생산된 대조군 렌티바이러스 벡터보다 더 높은 수준의 표면 CD47 단백질 발현을 포함하는 CD47 과발현 HEK293T 세포 내에서 패키징되며, 유효 용량은 렌티바이러스 벡터와 동일한 FIX 활성을 유도하는 데 필요한 대조군 렌티바이러스 벡터의 대조군 용량 대비 감소되는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 대조군 렌티바이러스 벡터는 대조군 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 19 분자/μm2의 CD47을 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터의 표면 상에 HEK293T 세포(ATCC® CRL-11268™)에서 생산된 대조군 렌티바이러스 벡터보다 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3.0배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4.0배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5.0배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6.0배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7.0배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8.0배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9.0배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배 더 많은 CD47 단백질을 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유효 용량은 약 5x1010 형질도입 단위/kg(TU/kg) 미만, 4x1010 TU/kg 미만, 3x1010 TU/kg 미만, 2x1010 TU/kg 미만, 1x1010 TU/kg 미만, 9x109 TU/kg 미만, 8x109 TU/kg 미만, 7x109 TU/kg 미만, 6x109 TU/kg 미만, 5x109 TU/kg 미만, 4x109 TU/kg 미만, 3x109 TU/kg 미만, 2x109 TU/kg 미만, 1x109 TU/kg 미만, 약 9x108 TU/kg 미만, 또는 약 8x108 TU/kg 미만인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 투여 후 다음 특성 중 하나 이상을 나타내는, 방법:
    (a) 대조군 렌티바이러스 벡터 대비 렌티바이러스 벡터의 대식세포 형질 도입 감소;
    (b) 대조군 렌티바이러스 벡터 대비 렌티바이러스 벡터에 대한 이종(allo-specific) 면역 반응 감소;
    (c) 투여 후 적어도 3주에 정상 FIX 활성 대비, 적어도 30%의 FIX 활성;
    (d) 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두에서 렌티바이러스 벡터의 조직 특이적 발현; 및
    (e) (a) 내지 (d)의 임의의 조합.
  6. 제5항에 있어서, 이종 면역 반응은 렌티바이러스 벡터에 반응한 사이토카인의 방출을 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 사이토카인은 MIP-1a, MIP-1b, MCP-1, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 대조군 렌티바이러스 벡터의 투여 후 MIP-1a의 발현 대비 렌티바이러스 벡터의 투여 후 더 낮은 수준의 MIP-1a 발현을 나타내는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 대조군 렌티바이러스 벡터의 투여 후 MIP-1b의 발현 대비 렌티바이러스 벡터의 투여 후 더 낮은 수준의 MIP-1b 발현을 나타내는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 대조군 렌티바이러스 벡터의 투여 후 MCP-1의 발현 대비 렌티바이러스 벡터의 투여 후 더 낮은 수준의 MCP-1 발현을 나타내는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 렌티바이러스 벡터 투여 후 적어도 3주에, 정상 FIX 활성 대비, 적어도 약 75%, 적어도 약 100%, 적어도 약 125%, 적어도 약 150%, 적어도 약 175%, 적어도 약 200%, 적어도 약 225%, 적어도 약 250%, 적어도 약 275%, 또는 적어도 약 300%의 FIX 활성을 나타내는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 렌티바이러스 벡터 투여 후 적어도 3주에, 정상 FIX 활성 대비, 적어도 약 150%의 FIX 활성을 나타내는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터의 투여 후 24시간 내지 48시간에서의 혈장 FIX 활성은 대조군 렌티바이러스 벡터의 대조군 용량이 투여된 대상체 대비 증가되는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 혈장 FIX 활성은, 대조군 렌티바이러스의 대조 용량을 투여받은 대상체에 비해, 투여 후에 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 적어도 약 100배, 적어도 약 110배, 적어도 약 120배, 적어도 약 130배, 적어도 약 140배, 적어도 약 150배, 적어도 약 160배, 적어도 약 170배, 적어도 약 180배, 적어도 약 190배, 또는 적어도 약 200배 증가되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 대상체의 간 및 비장 외의 기관 대비, 렌티바이러스 벡터의 투여 후 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두로의 렌티바이러스 벡터의 국소화 증가를 나타내는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 국소화 증가는, 대상체의 간 및 비장 외의 기관 대비, 렌티바이러스 벡터의 투여 후 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두에서 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 적어도 약 100배, 적어도 약 110배, 적어도 약 120배, 적어도 약 130배, 적어도 약 140배, 적어도 약 150배, 적어도 약 160배, 적어도 약 170배, 적어도 약 180배, 적어도 약 190배, 또는 적어도 약 200배 더 높은 렌티바이러스 벡터의 벡터 카피 수(VCN)를 특징으로 하는, 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 국소화 증가는, 대상체의 간 및 비장 외의 기관 대비, 렌티바이러스 벡터의 투여 후 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두에서 적어도 10배 더 높은 렌티바이러스 벡터의 VCN을 특징으로 하는, 방법.
  18. 제15항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 국소화 증가는, 대상체의 간 및 비장 외의 기관 대비, 렌티바이러스 벡터의 투여 후 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두에서 적어도 50배 더 높은 렌티바이러스 벡터의 VCN을 특징으로 하는, 방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 국소화 증가는, 대상체의 간 및 비장 외의 기관 대비, 렌티바이러스 벡터의 투여 후 간, 비장, 또는 간과 비장 둘 모두에서 적어도 100배 더 높은 렌티바이러스 벡터의 VCN을 특징으로 하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, CD47은 인간 CD47인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 인간 CD47은 SEQ ID NO: 14에 제시된 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 약 70%, 적어도 70%, 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 약 90%, 적어도 95%, 적어도 약 96%, 적어도 97%, 적어도 약 98%, 적어도 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 MHC-I 폴리펩티드를 포함하지 않는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 HEK293T 세포(ATCC® CRL-11268™)와 비교하여 고농도의 CD47을 발현하는 숙주 세포에서 생산되는, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, 또는 SEQ ID NO: 7에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는, 방법.
  25. 인자 IX(FIX) 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 5x1010 형질 도입 단위/kg(TU/kg) 미만을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체에서 혈우병을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 렌티바이러스 벡터는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, 또는 SEQ ID NO: 7에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 2에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 3에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 4에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 5에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 6에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 7에 제시된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 139 내지 1386과 적어도 85% 서열 동일성을 갖는, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 용량은 약 5x1010 TU/kg, 약 4.5x1010 TU/kg, 약 4x1010 TU/kg, 약 3.5x1010 TU/kg, 약 3x1010 TU/kg, 약 2.5x1010 TU/kg, 약 2x1010 TU/kg, 약 1.5x1010 TU/kg, 약 1x1010 TU/kg, 약 9.5x109 TU/kg, 약 9x109 TU/kg, 약 8.5x109 TU/kg, 약 8x109 TU/kg, 약 7.5x109 TU/kg, 약 7x109 TU/kg, 약 6.5x109 TU/kg, 약 6x109 TU/kg, 약 5.5x109 TU/kg, 약 5x109 TU/kg, 약 4.5x109 TU/kg, 약 4x109 TU/kg, 약 3.5x109 TU/kg, 약 3x109 TU/kg, 약 2.5x109 TU/kg, 약 2x109 TU/kg, 약 1.5x109 TU/kg, 약 1x109 TU/kg, 약 9.5x108 TU/kg, 약 9x108 TU/kg, 약 8.5x108 TU/kg, 약 8x108 TU/kg, 약 7.5x108 TU/kg, 약 7x108 TU/kg, 약 6.5x108 TU/kg, 약 6x108 TU/kg, 약 5.5x108 TU/kg, 약 5x108 TU/kg, 약 4.5x108 TU/kg, 약 4x108 TU/kg, 약 3.5x108 TU/kg, 약 3x108 TU/kg, 약 2.5x108 TU/kg, 약 2x108 TU/kg, 약 1.5x108 TU/kg, 또는 약 1x108 TU/kg인, 방법.
  34. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 용량은 5x1010 TU/kg 미만, 4.5x1010 TU/kg 미만, 4x1010 TU/kg 미만, 3.5x1010 TU/kg 미만, 3x1010 TU/kg 미만, 2.5x1010 TU/kg 미만, 2x1010 TU/kg 미만, 1.5x1010 TU/kg 미만, 1x1010 TU/kg 미만, 9.5x109 TU/kg 미만, 9x109 TU/kg 미만, 8.5x109 TU/kg 미만, 8x109 TU/kg 미만, 7.5x109 TU/kg 미만, 7x109 TU/kg 미만, 6.5x109 TU/kg 미만, 6x109 TU/kg 미만, 5.5x109 TU/kg 미만, 5x109 TU/kg 미만, 4.5x109 TU/kg 미만, 4x109 TU/kg 미만, 3.5x109 TU/kg 미만, 3x109 TU/kg 미만, 2.5x109 TU/kg 미만, 2x109 TU/kg 미만, 1.5x109 TU/kg 미만, 1x109 TU/kg 미만, 약 9.5x108 TU/kg 미만, 약 9x108 TU/kg 미만, 약 8.5x108 TU/kg 미만, 약 8x108 TU/kg 미만, 약 7.5x108 TU/kg 미만, 약 7x108 TU/kg 미만, 약 6.5x108 TU/kg 미만, 약 6x108 TU/kg 미만, 약 5.5x108 TU/kg 미만, 약 5x108 TU/kg 미만, 약 4.5x108 TU/kg 미만, 약 4x108 TU/kg 미만, 약 3.5x108 TU/kg 미만, 약 3x108 TU/kg 미만, 약 2.5x108 TU/kg 미만, 약 2x108 TU/kg 미만, 약 1.5x108 TU/kg 미만, 또는 약 1x108 TU/kg 미만인, 방법.
  35. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 용량은 1x108 내지 5x1010 TU/kg, 1x108 내지 5x109 TU/kg, 1x108 내지 1x109 TU/kg, 1x108 내지 1x1010 TU/kg, 1x109 내지 5x1010 TU/kg, 2x109 내지 5x1010 TU/kg, 3x109 내지 5x1010 TU/kg, 4x109 내지 5x1010 TU/kg, 5x109 내지 5x1010 TU/kg, 1x109 내지 6x109 TU/kg, 2x109 내지 6x109 TU/kg, 3x109 내지 6x109 TU/kg, 4x109 내지 6x109 TU/kg, 5x109 내지 6x109 TU/kg, 6x109 내지 5x1010 TU/kg, 7x109 내지 5x1010 TU/kg, 8x109 및 5x1010 TU/kg, 9x109 내지 5x1010 TU/kg, 1010 내지 5x1010 TU/kg, 1.5x1010 내지 5x1010 TU/kg, 2x1010 내지 5x1010 TU/kg, 2.5x1010 내지 5x1010 TU/kg, 3x1010 내지 5x1010 TU/kg, 3.5x1010 내지 5x1010 TU/kg, 4x1010 내지 5x1010 TU/kg, 또는 4.5x1010 내지 5x1010 TU/kg인, 방법.
  36. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 용량은 1x109 내지 5x1010 TU/kg, 1x109 내지 4.5x1010 TU/kg, 1x109 내지 4x1010 TU/kg, 1x109 내지 3.5x1010 TU/kg, 1x109 내지 3x1010 TU/kg, 1x109 내지 2.5x1010 TU/kg, 1x109 내지 2x1010 TU/kg, 1x109 내지 1.5x1010 TU/kg, 1x109 내지 1010 TU/kg, 1x109 내지 9x109 TU/kg, 1x109 내지 8x109 TU/kg, 1x109 내지 7x109 TU/kg, 1x109 내지 6x109 TU/kg, 1x109 내지 5x109 TU/kg, 1x109 내지 4x109 TU/kg, 1x109 내지 3x109 TU/kg, 및 1x109 내지 2x109 TU/kg인, 방법.
  37. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 용량은 1x1010 내지 2x1010 TU/kg, 1.1x1010 내지 1.9x1010 TU/kg, 1.2x1010 내지 1.8x1010 TU/kg, 1.3x1010 내지 1.7x1010 TU/kg, 또는 1.4x1010 내지 1.6x1010 TU/kg인, 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 용량은 약 4x109 TU/kg 내지 약 6x109 TU/kg인, 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터를 단회 용량 또는 다회 용량으로 투여하는, 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터를 정맥내 주사를 통하여 투여하는, 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 소아 대상체인, 방법.
  42. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 성인 대상체인, 방법.
  43. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 청소년 대상체인, 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 12에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 조직 특이적 프로모터를 포함하는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 조직 특이적 프로모터는 표적 간 세포(liver cell)에서 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 선택적으로 향상시키는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 표적 간 세포에서 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 선택적으로 향상시키는 조직 특이적 프로모터는 APOA2 프로모터, SERPINA1(hAAT) 프로모터, mTTR 프로모터, MIR122 프로모터, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 표적 간 세포는 간세포(hepatocyte)인, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 단리된 핵산 분자는 간세포의 게놈 내에 안정적으로 통합되는, 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 스플라이스 공여자 부위를 포함하는, 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 스플라이스 수용자 부위를 포함하는, 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 gag 서열, pol 서열, rev 서열, rev 반응성 요소(RRE), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, gag 서열은 전장 또는 절단형 gag 서열인, 방법.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 인핸서, 마이크로RNA에 대한 표적 서열, 전사-후 조절 요소, 패키징 신호, 폴리-A 서열, 인트론 서열, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 한 번에 투여되거나 적어도 2개의 하위-용량으로 나누어지는, 방법.
  57. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터의 용량은 적어도 2회 반복되는, 방법.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 신호 펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 다음과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는, 방법:
    (i) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 1 내지 84;
    (ii) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오티드 1 내지 84;
    (iii) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 1 내지 84;
    (iv) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 1 내지 84;
    (v) SEQ ID NO: 6의 뉴클레오티드 1 내지 84; 또는
    (vi) SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 1 내지 84.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 프로펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 프로펩티드를 인코딩하는 핵산 서열은 다음과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는, 방법:
    (i) SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 85 내지 138;
    (ii) SEQ ID NO: 3의 뉴클레오티드 85 내지 138;
    (iii) SEQ ID NO: 4의 뉴클레오티드 85 내지 138;
    (iv) SEQ ID NO: 5의 뉴클레오티드 85 내지 138;
    (v) SEQ ID NO: 6의 뉴클레오티드 85 내지 138; 또는
    (vi) SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 85 내지 138.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 이종 기원 아미노산 서열을 인코딩하는 이종 기원 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 이종 기원 아미노산 서열은 알부민, 면역글로불린 Fc 영역, XTEN 서열, 인간 융모성 고나도트로핀의 β 서브유닛의 C-말단 펩티드(CTP), PAS 서열, HAP 서열, CTP 펩티드 서열, 트랜스페린, 알부민-결합 모이어티, 또는 이들 폴리펩티드의 임의의 단편, 유도체, 변이체, 또는 조합인, 방법.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 이종 기원 아미노산 서열은 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 연결되거나 아미노산 서열 내 2개의 아미노산 사이에 삽입되는, 방법.
  65. 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 기원 모이어티는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 103, SEQ ID NO: 2의 아미노산 105, SEQ ID NO: 2의 아미노산 142, SEQ ID NO: 2의 아미노산 149, SEQ ID NO: 2의 아미노산 162, SEQ ID NO: 2의 아미노산 166, SEQ ID NO: 2의 아미노산 174, SEQ ID NO: 2의 아미노산 224, SEQ ID NO: 2의 아미노산 226, SEQ ID NO: 2의 아미노산 228, SEQ ID NO: 2의 아미노산 413, 또는 이들의 임의의 조합에 상응하는 아미노산의 바로 하류에서 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드 내에 삽입되는, 방법.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, FIX 폴리펩티드는 R338L 변이체 FIX 폴리펩티드인, 방법.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 숙주 세포에서 생산되는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 숙주 세포는 CD47을 발현하는, 방법.
  69. 제68항에 있어서, 숙주 세포는 CD47을 과발현하도록 변형되는, 방법.
  70. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 MHC-I을 발현하지 않는, 방법.
  71. 제67항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 CD47고/MHC-I-인, 방법.
  72. 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 CD47고/MHC-I- HEK 293T 세포인, 방법.
  73. (i) 조직 특이적 프로모터, 및 (ii) SEQ ID NO: 1에 제시된 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터로서, 조직 특이적 프로모터는 간 세포에서의 핵산 서열 발현을 추진하는, 렌티바이러스 벡터.
  74. (i) 스플라이스 공여자 부위; (ii) 스플라이스 수용자 부위; (iii) gag 서열; (iv) Rev 반응성 요소; (v) 인핸서; (vi) 전사-후 조절 요소; (vii) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, 또는 SEQ ID NO: 7에 제시된 뉴클레오티드 서열에 대한 서열 동일성과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열; 및 (viii) 마이크로RNA에 대한 표적 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID NO: 12에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는, 렌티바이러스 벡터.
  76. 제75항에 있어서, FIX 활성을 갖는 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 12에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 렌티바이러스 벡터.
  77. 제74항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터의 표면은 HEK293T 세포(ATCC® CRL-11268™)에서 생산된 대조군 렌티바이러스 벡터보다 더 높은 수준의 CD47 단백질을 포함하는, 렌티바이러스 벡터.
  78. 제77항에 있어서, 렌티바이러스 벡터의 표면은 MHC-I을 포함하지 않는, 렌티바이러스 벡터.
  79. 제73항 내지 제78항 중 어느 한 항의 렌티바이러스 벡터 유효 용량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 혈우병을 치료하는 방법.
  80. 제79항에 있어서, 유효 용량은 약 5x1010 형질도입 단위/kg(TU/kg) 미만, 4x1010 TU/kg 미만, 3x1010 TU/kg 미만, 2x1010 TU/kg 미만, 1x1010 TU/kg 미만, 9x109 TU/kg 미만, 8x109 TU/kg 미만, 7x109 TU/kg 미만, 6x109 TU/kg 미만, 5x109 TU/kg 미만, 4x109 TU/kg 미만, 3x109 TU/kg 미만, 2x109 TU/kg 미만, 1x109 TU/kg 미만, 약 9x108 TU/kg 미만, 또는 약 8x108 TU/kg 미만인, 방법.
  81. 제79항 또는 제80항에 있어서, 유효 용량은 약 5x1010 TU/kg, 약 4.5x1010 TU/kg, 약 4x1010 TU/kg, 약 3.5x1010 TU/kg, 약 3x1010 TU/kg, 약 2.5x1010 TU/kg, 약 2x1010 TU/kg, 약 1.5x1010 TU/kg, 약 1x1010 TU/kg, 약 9.5x109 TU/kg, 약 9x109 TU/kg, 약 8.5x109 TU/kg, 약 8x109 TU/kg, 약 7.5x109 TU/kg, 약 7x109 TU/kg, 약 6.5x109 TU/kg, 약 6x109 TU/kg, 약 5.5x109 TU/kg, 약 5x109 TU/kg, 약 4.5x109 TU/kg, 약 4x109 TU/kg, 약 3.5x109 TU/kg, 약 3x109 TU/kg, 약 2.5x109 TU/kg, 약 2x109 TU/kg, 약 1.5x109 TU/kg, 약 1x109 TU/kg, 약 9.5x108 TU/kg, 약 9x108 TU/kg, 약 8.5x108 TU/kg, 약 8x108 TU/kg, 약 7.5x108 TU/kg, 약 7x108 TU/kg, 약 6.5x108 TU/kg, 약 6x108 TU/kg, 약 5.5x108 TU/kg, 약 5x108 TU/kg, 약 4.5x108 TU/kg, 약 4x108 TU/kg, 약 3.5x108 TU/kg, 약 3x108 TU/kg, 약 2.5x108 TU/kg, 약 2x108 TU/kg, 약 1.5x108 TU/kg, 또는 약 1x108 TU/kg인, 방법.
  82. 제79항 또는 제80항에 있어서, 유효 용량은 5x1010 TU/kg 미만, 4.5x1010 TU/kg 미만, 4x1010 TU/kg 미만, 3.5x1010 TU/kg 미만, 3x1010 TU/kg 미만, 2.5x1010 TU/kg 미만, 2x1010 TU/kg 미만, 1.5x1010 TU/kg 미만, 1x1010 TU/kg 미만, 9.5x109 TU/kg 미만, 9x109 TU/kg 미만, 8.5x109 TU/kg 미만, 8x109 TU/kg 미만, 7.5x109 TU/kg 미만, 7x109 TU/kg 미만, 6.5x109 TU/kg 미만, 6x109 TU/kg 미만, 5.5x109 TU/kg 미만, 5x109 TU/kg 미만, 4.5x109 TU/kg 미만, 4x109 TU/kg 미만, 3.5x109 TU/kg 미만, 3x109 TU/kg 미만, 2.5x109 TU/kg 미만, 2x109 TU/kg 미만, 1.5x109 TU/kg 미만, 1x109 TU/kg 미만, 약 9.5x108 TU/kg 미만, 약 9x108 TU/kg 미만, 약 8.5x108 TU/kg 미만, 약 8x108 TU/kg 미만, 약 7.5x108 TU/kg 미만, 약 7x108 TU/kg 미만, 약 6.5x108 TU/kg 미만, 약 6x108 TU/kg 미만, 약 5.5x108 TU/kg 미만, 약 5x108 TU/kg 미만, 약 4.5x108 TU/kg 미만, 약 4x108 TU/kg 미만, 약 3.5x108 TU/kg 미만, 약 3x108 TU/kg 미만, 약 2.5x108 TU/kg 미만, 약 2x108 TU/kg 미만, 약 1.5x108 TU/kg 미만, 또는 약 1x108 TU/kg 미만인, 방법.
  83. 제79항 또는 제80항에 있어서, 유효 용량은 1x108 내지 5x1010 TU/kg, 1x108 내지 5x109 TU/kg, 1x108 내지 1x109 TU/kg, 1x108 내지 1x1010 TU/kg, 1x109 내지 5x1010 TU/kg, 2x109 내지 5x1010 TU/kg, 3x109 내지 5x1010 TU/kg, 4x109 내지 5x1010 TU/kg, 5x109 내지 5x1010 TU/kg, 1x109 내지 6x109 TU/kg, 2x109 내지 6x109 TU/kg, 3x109 내지 6x109 TU/kg, 4x109 내지 6x109 TU/kg, 5x109 내지 6x109 TU/kg, 6x109 내지 5x1010 TU/kg, 7x109 내지 5x1010 TU/kg, 8x109 및 5x1010 TU/kg, 9x109 내지 5x1010 TU/kg, 1010 내지 5x1010 TU/kg, 1.5x1010 내지 5x1010 TU/kg, 2x1010 내지 5x1010 TU/kg, 2.5x1010 내지 5x1010 TU/kg, 3x1010 내지 5x1010 TU/kg, 3.5x1010 내지 5x1010 TU/kg, 4x1010 내지 5x1010 TU/kg, 또는 4.5x1010 내지 5x1010 TU/kg인, 방법.
  84. 제79항 또는 제80항에 있어서, 유효 용량은 1x109 내지 5x1010 TU/kg, 1x109 내지 4.5x1010 TU/kg, 1x109 내지 4x1010 TU/kg, 1x109 내지 3.5x1010 TU/kg, 1x109 내지 3x1010 TU/kg, 1x109 내지 2.5x1010 TU/kg, 1x109 내지 2x1010 TU/kg, 1x109 내지 1.5x1010 TU/kg, 1x109 내지 1010 TU/kg, 1x109 내지 9x109 TU/kg, 1x109 내지 8x109 TU/kg, 1x109 내지 7x109 TU/kg, 1x109 내지 6x109 TU/kg, 1x109 내지 5x109 TU/kg, 1x109 내지 4x109 TU/kg, 1x109 내지 3x109 TU/kg, 및 1x109 내지 2x109 TU/kg인, 방법.
  85. 제79항 또는 제80항에 있어서, 유효 용량은 1x1010 내지 2x1010 TU/kg, 1.1x1010 내지 1.9x1010 TU/kg, 1.2x1010 내지 1.8x1010 TU/kg, 1.3x1010 내지 1.7x1010 TU/kg, 또는 1.4x1010 내지 1.6x1010 TU/kg인, 방법.
  86. 제79항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 유효 용량은 약 4x109 TU/kg 내지 약 6x109 TU/kg인, 방법.
  87. 제79항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터를 단회 용량 또는 다회 용량으로 투여하는 방법.
  88. 제79항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 렌티바이러스 벡터를 정맥내 주사를 통하여 투여하는 방법.
  89. 제79항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 소아 대상체인, 방법.
  90. 제79항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 성인 대상체인, 방법.
  91. SEQ ID NO: 1에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열.
  92. 제91항의 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  93. 제92항에 있어서, 조직 특이적 프로모터를 포함하는, 벡터.
  94. 제93항에 있어서, 조직 특이적 프로모터는 표적 간 세포에서 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 선택적으로 향상시키는, 벡터.
  95. 제94항에 있어서, 표적 간 세포에서 FIX 활성을 갖는 폴리펩티드의 발현을 선택적으로 향상시키는 조직 특이적 프로모터는 APOA2 프로모터, SERPINA1(hAAT) 프로모터, mTTR 프로모터, MIR122 프로모터, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 벡터.
  96. 제94항 또는 제95항에 있어서, 표적 간 세포는 간세포인, 벡터.
  97. 제94항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 스플라이스 공여자 부위를 포함하는, 벡터.
  98. 제94항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 스플라이스 수용자 부위를 포함하는, 벡터.
  99. 제94항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, gag 서열, pol 서열, rev 서열, rev 반응성 요소(RRE), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 벡터.
  100. 제99항에 있어서, gag 서열은 전장 또는 절단형 gag 서열인, 벡터.
  101. 제92항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 인핸서, 마이크로RNA에 대한 표적 서열, 전사-후 조절 요소, 패키징 신호, 폴리-A 서열, 인트론 서열, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 벡터.
  102. 제91항의 핵산 서열 또는 제92항 내지 제101항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 세포.
  103. 제102항에 이어서, 포유류 세포인, 세포.
  104. 제102항에 있어서, CHO 세포, HEK293 세포, BHK21 세포, PER.C6® 세포, NS0 세포, 및 CAP 세포인, 세포.
  105. 제102항 또는 제103항에 있어서, 세포는 인간 세포인, 세포.
  106. 제102항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 CD47 단백질을 발현하는, 세포.
  107. 제106항에 있어서, 세포는 CD47을 과발현하도록 변형되는, 세포.
  108. 제107항에 있어서, 세포는 세포 표면 상에 CD47을 과발현하도록 변형되지 않은 대조군 세포와 비교하여 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3.0배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4.0배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5.0배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6.0배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7.0배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8.0배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9.0배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 11배, 적어도 약 12배, 적어도 약 13배, 적어도 약 14배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배 더 많은 CD47 단백질을 포함하는, 세포.
  109. 제106항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, CD47은 인간 CD47인, 세포.
  110. 제102항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 MHC-I을 발현하지 않는, 세포.
  111. 적합한 조건 하에 제102항 내지 제110항 중 어느 한 항의 세포를 배양하는 것을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법.
KR1020217020427A 2018-12-06 2019-12-05 인자 ix를 발현하는 렌티바이러스 벡터의 용도 KR20210100661A (ko)

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