JP3750136B2 - インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼ▲ＩＩ▼（ＩＣＥ▲下ｒｅｌ▼−▲ＩＩ▼）の前駆体をコードするＤＮＡ - Google Patents
インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼ▲ＩＩ▼（ＩＣＥ▲下ｒｅｌ▼−▲ＩＩ▼）の前駆体をコードするＤＮＡ Download PDFInfo
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Description
発明の背景
インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）は慢性及び急性炎症を媒介する主要物質である。ヒト単球は、ＩＬ−１βの他に、ＩＬ−１遺伝子ファミリーの別の２つの物質；インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）及びＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−ＲＡ）を産生する。３種全てのタンパク質は標的細胞上にある膜固定形態の１型及び２型ＩＬ−１レセプター（ＩＬ１Ｒ）に結合する。ＩＬ−１α及びＩＬ−１βは実質的に同一の生物学的反応を誘発するが、ＩＬ−１ＲＡはこのような作用を阻害する。ＩＬ−１α及びＩＬ−１βは共に、機能的疎水性シグナル配列の欠如した３１ｋＤａ一次翻訳産物として合成される。３１ｋＤａ形態のＩＬ−１αは更なるプロセシングなしでも十分に活性を示すが、細胞から活発に放出されるとは思えない。活性化された単球から放出される主要形態のＩＬ−１であるＩＬ−１βは不活性３１ｋＤａ前駆体（ｐＩＬ−１β）として合成され、この前駆体は、新規なシステインプロテイナーゼであるインターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）によってプロセシングされて成熟１７．５ｋＤａ形態（ｍＩＬ−１β）となる。ＩＣＥは、プロホルモンプロセシング用の単一部位であるＡｌａ117とＡｓｐ116との間でｐＩＬ−１βを切断することによって完全に活性なｍＩＬ−１βを生成する。この切断部位周辺の配列：−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−は、公知である全てのｐＩＬ−１βポリペプチドでは進化的に保存されている。
従来のＨＰＬＣ技術及び親和性精製技術によって示されるような活性ヒトＩＣＥは、１９，８６６Ｄａ（ｐ２０）サブユニットと１０，２４４Ｄａ（ｐ１０）サブユニットとの１：１化学量論的複合体からなるヘテロダイマーである。ＩＣＥが、１４ｋＤａプロドメイン、活性部位Ｃｙｓ285を含むｐ２０、成熟酵素内に存在しない１９残基接続ペプチド、及び活性酵素の必須成分であるｐ１０からなる４５ｋＤａプロ酵素（ｐ４５）として構成的に発現されることがクローン化ｃＤＮＡにより判明した。成熟サブユニットにはＡｓｐ−Ｘ配列が隣接している。上記部位の突然変異分析及び異種系での発現は活性酵素の産生が自己触媒的であることを示している。マウス及びラットＩＣＥもクローニングされ、これらは上記構造モチーフを含め高度の配列類似性を示している。
最近、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓ ｂｒｉｇｇｓａｅ及びＣａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓ ｖｕｌｇａｒｉｓの線虫細胞死異常遺伝子（ＣＥＤ−３）や、マウスニューロン前駆体細胞の胚発生でダウンレギュレートされた（ＮＥＤＤ−２）遺伝子を含むＩＣＥ様遺伝子ファミリーが明らかにされ始めた。これらの遺伝子の予想されるポリペプチド配列はそれぞれヒトＩＣＥとは２９％及び２７％の配列同一性を示す。ＣＥＤ−３とＩＣＥとの配列同一性は、成熟ヒトＩＣＥのｐ２０サブユニット及びｐ１０サブユニットに相当する領域でより高くなっている。ＩＣＥ及びＣＥＤ−３について公知の全ての配列は、ＩＣＥの触媒システインを包囲するペンタペプチド配列−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−を、ＣＥＤ−３ではそれと等価の配列を含んでいる。
ＣＥＤ−３及びマウスＩＣＥは共に、線維芽細胞系でのトランスフェクション又は神経細胞内へのマイクロインジェクションによって発現されると、プログラミングされた細胞死（アポトーシス）を生じる。ＣＥＤ−３又はＩＣＥのプロアポトーシス作用は、細胞死抑制遺伝子として機能するように思える哺乳動物の原腫瘍遺伝子（ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ）ｂｃｌ−２、又はＩＣＥのセルピン（ｓｅｒｐｉｎ）様阻害剤であるサイトカイン応答モディファイアーＡ（ｃｒｍＡ）遺伝子産物、で同時トランスフェクトすることによって阻止される。
発明の要約
ＩＣＥrel−II（インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII）と称する新規なヒトチオールプロテイナーゼを単離、精製した。全長前駆体形態のＩＣＥrel−IIタンパク質をコードするＤＮＡ分子を単離、精製し、ヌクレオチド配列を決定した。組換え宿主での発現のために、ＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡをクローニングした。ＤＮＡクローンは組換え全長ＩＣＥrel−II及び成熟形態酵素の個々のサブユニットを産生する。組換えＩＣＥrel−IIはＩＣＥrel−II活性のモジュレーター、従ってＩＣＥrel−IIの前炎症性作用又はプロアポトーシス作用に関連する病的状態のモディファイアーを同定するのに有用である。ＩＣＥrel−IIアンチセンス分子はＩＣＥrel−IIの前炎症性作用又はプロアポトーシス作用を治療によって抑制又は排除するのに有用であり、ＩＣＥrel−IIによる遺伝子移植又は遺伝子療法はＩＣＥrel−IIの前炎症性作用又はプロアポトーシス作用を高めるのに有用である。これらの療法は、非制限的ではあるが、（エイズのような）免疫不全症候群、自己免疫性疾患、病原性感染症、心血管及び神経障害、脱毛症、老化、ガン、パーキンソン病、アルツハイマー病を含む免疫性、増殖性及び変性疾病の治療に有益である。
【図面の簡単な説明】
図１。ヒトＩＣＥrel−II（ｃＤＮＡクローンＰ１０１．１．１）のヌクレオチド配列、その相補的ヌクレオチド配列、及び推定されるアミノ酸配列。
図２。ヒトＩＣＥrel−IIのアミノ酸配列とヒトＩＣＥのアミノ酸配列とを並置する。同一のアミノ酸は並置した配列間に垂直線を引いて示す。高度保存性アミノ酸の相違は並置した配列間に２つの点で示し、保存性アミノ酸の相違は１つの点で示す。
図３。ヒトＩＣＥrel−IIのアミノ酸配列とＣａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＣＥＤ−３のアミノ酸配列とを並置する。同一のアミノ酸は並置した配列間に垂直線を引いて示す。高度保存性アミノ酸の相違は並置した配列間の２つの点で示し、保存性アミノ酸の相違は１つの点で示す。
図４。ヒトＩＣＥrel−IIのアミノ酸配列とマウスＮＥＤＤ−２のアミノ酸配列とを並置する。同一のアミノ酸は並置した配列間に垂直線を引いて示す。高度保存性アミノ酸の相違は並置した配列間の２つの点で示し、保存性アミノ酸の相違は１つの点で示す。
発明の詳細な説明
全長形態のＩＣＥrel−IIをコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を同定し、配列決定し、単離した。組換え宿主での発現のために、ｃＤＮＡを発現ベクター内にクローニングした。ｃＤＮＡは組換え全長ＩＣＥrel−IIを産生するのに有用である。ｃＤＮＡ及びそのｃＤＮＡから誘導される組換えＩＣＥrel−IIタンパク質は、抗体、診断キット、実験室試薬及びアッセイの生産に有用である。ｃＤＮＡ及び組換えＩＣＥrel−IIタンパク質は、ＩＣＥrel−IIの機能、炎症及び細胞アポトーシスに影響する化合物の同定のために使用される。ＩＣＥrel−IIアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンス類似物質は、ＩＣＥrel−IIタンパク質の発現を抑制し、かくしてＩＣＥrel−IIの前炎症作用又はプロアポトーシス作用を抑制するのに臨床学的に有用である。同様に、ＩＣＥrel−IIをコードする配列を使用して、ＩＣＥrel−IIを標的細胞内に導入してＩＣＥrel−IIの前炎症作用又はプロアポトーシス作用を高める遺伝子療法を行うことができる。
様々な細胞や細胞系がＩＣＥrel−II ｃＤＮＡの単離での使用に適し得る。適切な細胞は、慣用的な技術を用いて細胞抽出物又は調整培地中のＩＣＥrel−II活性をスクリーニングすることによって選択される。このアッセイでＩＣＥrel−II活性を示す細胞がＩＣＥrel−II ｃＤＮＡの単離に適する。
様々な手順を使用して、ＩＣＥrel−II ｃＤＮＡを分子クローニングすることができる。これらの方法には、非制限的ではあるが、適切な発現ベクター系でのＩＣＥrel−II含有ｃＤＮＡライブラリー構築後のＩＣＥrel−II遺伝子の直接機能的発現が含まれる。他の方法は、バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクター内に構築されたＩＣＥrel−II含有ｃＤＮＡライブラリーを、ＩＣＥrel−IIのアミノ酸配列から設計された標識オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングすることである。
細胞から構築された様々なライブラリーが、ＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡの単離に有用であり得る。適切なライブラリーは、ＩＣＥrel−II活性を有する細胞又は細胞系から作製される。
ｃＤＮＡライブラリーの作製は当業界で公知の標準的な技術によって実施され得る。このようなｃＤＮＡライブラリー構築技術及び他の標準的な分子生物学的技術は例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２）又はＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．，Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）に記載されている。
ＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡは適切なゲノムＤＮＡライブラリーから単離してもよい。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は、当業界で公知の標準的な技術によって実施され得る。公知のゲノムＤＮＡライブラリー構築技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．等（上掲）及びＡｕｓｕｂｅｌ等（上掲）に記載されている。
適切なプロモータ及び他の適切な転写調節要素を含む発現ベクター内への分子クローニングによってクローン化したＩＣＥrel−II ｃＤＮＡを原核生物又は真核生物宿主細胞に移入して組換え技術で発現させ、組換えＩＣＥrel−IIを産生することができる。
本明細書では、発現ベクターは、クローン化した遺伝子コピーの転写及び適切な宿主でのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列であると定義する。このようなベクターを使用して、細菌、酵母、藍藻類、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞のような様々な宿主で真核細胞遺伝子を発現させることができる。
特別設計されたベクターによって、細菌−酵母又は細菌−動物細胞のような宿主間でのＤＮＡのシャトリングが可能となる。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞内での自律複製のための複製起源、選択可能マーカー、数の限定された有用な制限酵素部位、高コピー数のための可能な要素（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）及び活性プロモーターを含み得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させてＲＮＡ合成を開始するよう指令するＤＮＡ配列であると定義する。強いプロモーターはｍＲＮＡを高頻度で開始させるものである。発現ベクターには、非制限的ではあるが、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特別設計されたプラスミド又はウイルスが含まれる。
様々な哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞で組換えＩＣＥrel−IIを発現させることができる。組換えＩＣＥrel−IIの発現に適し得る市販の哺乳動物発現ベクターには、非制限的ではあるが、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ ３７４６０）及びＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ ３７５６５）が含まれる。
ＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡを組換え宿主細胞内での発現のために発現ベクター内にクローニングすることもできる。組換え宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよく、これらの細胞には非制限的ではあるが、細菌、酵母、哺乳動物細胞及び昆虫細胞が含まれる。市販されている適切な哺乳動物種由来の細胞系には非制限的ではあるが、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）が含まれる。
発現ベクターは、非制限的ではあるが、形質転換、トランスフェクション、感染、プロトプラスト融合及びエレクトロポレーションを含む幾つかの技術のいずれかによって宿主細胞内に導入され得る。発現ベクターを含む細胞をクローニングによって増殖させ、個々に分析して、これらの細胞がＩＣＥrel−IIタンパク質を産生するかどうかを調べる。ＩＣＥrel−IIを発現する宿主細胞クローンの同定は、非制限的ではあるが、抗ＩＣＥrel−II抗体との免疫反応性や、宿主細胞関連ＩＣＥrel−II活性の存在を含む幾つかの手段によって実施され得る。
ＩＣＥrel−II ｃＤＮＡの発現は更に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生された合成ｍＲＮＡを用いて実施され得る。合成ｍＲＮＡは、非制限的ではあるが、コムギ胚芽抽出物及び網状赤血球抽出物を含む種々の無細胞系で効率的に翻訳されると共に、非制限的ではあるが、カエル卵母細胞内へのマイクロインジェクションを含む細胞をベースとする系で効率的に翻訳され得る。
最適レベルの酵素活性及び／又はＩＣＥrel−IIタンパク質が得られるＩＣＥrel−II ｃＤＮＡを調べるために、改変ＩＣＥrel−II ｃＤＮＡ分子を構築する。宿主細胞をｃＤＮＡ分子で形質転換し、ＩＣＥrel−II ＲＮＡ及びタンパク質のレベルを測定する。
宿主細胞内でのＩＣＥrel−IIタンパク質の量は、免疫親和性技術及び／又はリガンド親和性技術のような様々な方法によって定量される。ＩＣＥrel−II特異的親和性ビーズ又はＩＣＥrel−II特異抗体を使用して、35Ｓ−メチオニン標識した又は非標識のＩＣＥrel−IIタンパク質を単離する。標識ＩＣＥrel−IIタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析される。非標識ＩＣＥrel−IIタンパク質は、ＩＣＥrel−II特異抗体を使用するウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡアッセイによって検出される。
組換え宿主細胞内でのＩＣＥrel−IIの発現後に、ＩＣＥrel−IIタンパク質を回収して、活性形態のＩＣＥrel−IIを提供することができる。数種のＩＣＥrel−II精製手順が利用可能であり、使用に適している。組換えＩＣＥrel−IIは、当業界で公知の分画又はクロマトグラフィーステップを個々に適用して又は様々に組み合わせて、細胞溶解物又は調整培養培地から精製することができる。
更には、発生期の全長ＩＣＥrel−II又はＩＣＥrel−IIのポリペプチド断片に特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体を用いて作製した免疫親和性カラムを使用して、組換えＩＣＥrel−IIを他の細胞タンパク質から分離することができる。
組換えタンパク質を使用して、抗体を産生してもよい。本明細書で使用する「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体並びにその断片（例えば抗原又はハプテンに結合し得るＦｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）2断片）を包含する。
ＩＣＥrel−IIに対する単一特異性抗体は、ＩＣＥrel−IIと反応性の抗体を含む哺乳動物抗血清から精製されるか、又は標準的な技術を用いてＩＣＥrel−IIと反応性のモノクローナル抗体として産生される。本明細書で使用する単一特異性抗体は、ＩＣＥrel−IIに対して均一（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）結合特性を示す単一抗体種又は多重抗体種であると定義する。本明細書で使用する均一結合とは、抗体種が、上述したようなＩＣＥrel−IIに関連する特異抗原又はエピトープに結合する能力を指す。酵素特異抗体は、免疫アジュバントを用いるか又は用いずに、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマ等のような動物、好ましくはウサギを適切な濃度のＩＣＥrel−IIで免疫感作することによって産生される。
ＩＣＥrel−IIに反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、近交系マウスをＩＣＥrel−IIで免疫感作するような慣用的な方法によって産生され得る。約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、好ましくは約１ｍｇのＩＣＥrel−IIを含む約０．５ｍｌの緩衝液又は食塩水を同一容量の許容可能なアジュバントに導入したものでマウスへの免疫感作を行う。フロイントの完全アジュバントが好ましい。０日目にマウスに初期免疫感作して、約３〜約３０週間置く。免疫感作したマウスに、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のような緩衝溶液中の約０．１〜約１０ｍｇのＩＣＥrel−IIを静脈内（ＩＶ）経路から投与して、１回以上の追加免疫感作を行う。免疫感作したマウスから当業界で公知の標準的な手順で脾臓を取り出すことにより、抗体陽性マウス由来のリンパ球が得られる。安定なハイブリドーマの形成を可能にする条件下で脾臓リンパ球を適切な融合パートナーと混合するとハイブリドーマ細胞が生成される。ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）内にて当業界で公知の手順で増殖させることにより、融合ハイブリドーマ細胞を選択する。約１４日目、１８日目及び２１日目に上清液を増殖陽性ウェルから採取し、ＩＣＥrel−IIを抗原として用いる固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）のようなイムノアッセイによって抗体産生をスクリーニングする。培養液もオクタロニー沈降アッセイで試験して、ｍＡｂのイソタイプを調べる。ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｓｏｆｔ Ａｇａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｋｒｕｓｅ及びＰａｔｅｒｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９７３の軟寒天技術のような技術によって、抗体陽性ウェルのハイブリドーマ細胞をクローニングする。
十分量の特異的ｍＡｂを得るようにハイブリドーマを約２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で増殖させて抗ＩＣＥrel−IIをｉｎ ｖｉｔｒｏで産生する。ｍＡｂを当業界で公知の技術で精製する。
非制限的ではあるが、沈降、受動凝集、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）技術及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術を含む様々な血清学的又は免疫学的アッセイによって、腹水又はハイブリドーマ培養液の抗体力価を調べる。同様のアッセイを使用して、体液又は組織や細胞抽出物中のＩＣＥrel−IIの存在を検出する。
単一特異的抗体産生のための上記方法を使用して、ＩＣＥrel−IIポリペプチド断片又は発生期全長ＩＣＥrel−IIポリペプチドに特異的な抗体を産生することができる。
Ａｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）のようなゲル支持体に抗体を加えてＩＣＥrel−II抗体親和性カラムを製造する。ゲル支持体は、抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで予め活性化させる。次いで、スペーサーアームとのアミド結合により、抗体をゲルに結合する。次いで、残存する活性化エステルを１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）でクエンチする。カラムを水、次いで０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄して、非接合抗体又は生体外タンパク質を除去する。次いで、カラムをリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．３）で平衡化し、ＩＣＥrel−II又はＩＣＥrel−II断片を含む細胞培養上清又は細胞抽出物をカラムにゆっくりと通す。次いで、カラムを洗浄し、タンパク質を溶離させる。次いで、精製ＩＣＥrel−IIタンパク質をリン酸緩衝食塩水に対して透析する。
ＩＣＥrel−II ｃＤＮＡ、ＩＣＥrel−IIに対する抗体又はＩＣＥrel−IIタンパク質を含むキットを製造することができる。このようなキットを使用して、ＩＣＥrel−II ＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡを検出するか、又は試料中でのＩＣＥrel−IIタンパク質もしくはペプチド断片の存在を検出する。このような特性分析は、非制限的ではあるが、法廷用分析及び疫学調査を含む様々な目的に有用である。
本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質及び抗体を使用して、ＩＣＥrel−II ＤＮＡ、ＩＣＥrel−II ＲＮＡ又はＩＣＥrel−IIタンパク質の量をスクリーニングして、測定することができる。組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子及び抗体は、ＩＣＥrel−IIの検出や型決定（ｔｙｐｉｎｇ）に適したキットを製造するのに適している。このようなキットは、少なくとも１個の容器を厳重に密閉して保持するのに適した区画化されたキャリヤーからなる。このキャリヤーは更に、ＩＣＥrel−IIの検出に適した組換えＩＣＥrel−IIタンパク質又は抗ＩＣＥrel−II抗体のような試薬を含んでいる。キャリヤーは更に、標識抗原又は酵素基質等のような検出手段を含み得る。
ＩＣＥrel−IIをコードするｃＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列がアンチセンス療法のために合成され得る。これらのアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートのような安定なＤＮＡ誘導体、ＲＮＡ、２′−Ｏ−アルキルＲＮＡのような安定なＲＮＡ誘導体、又は他のＩＣＥrel−IIアンチセンスオリゴヌクレオチド類似物質であり得る。ＩＣＥrel−IIアンチセンス分子は、マイクロインジェクション、リポソームカプセル化、又はアンチセンス配列を有するベクターからの発現によって細胞内に導入され得る。ＩＣＥrel−IIアンチセンス療法は、ＩＣＥrel−II活性の抑制が有益である疾病の治療に特に有用であり得る。
ＩＣＥrel−II遺伝子療法を使用して、標的器官の細胞内にＩＣＥrel−IIを導入することができる。ＩＣＥrel−II遺伝子を、受容体（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）である宿主細胞の感染によってＩＣＥrel−II ＤＮＡの転移を媒介するウイルスベクター内に連結することができる。適切なウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス等が含まれる。或いは、リガンド−ＤＮＡ接合体又はアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ接合体を用いる受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）によって媒介されターゲッティングされるＤＮＡ転移、リポフェクション膜融合又は直接マイクロインジェクションを含む非ウイルス技術によって、ＩＣＥrel−II ＤＮＡを遺伝子療法のために細胞内に転移させることができる。上記手順及びその変形手順はｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏＩＣＥrel−II遺伝子療法に適している。ＩＣＥrel−II遺伝子療法は、ＩＣＥrel−II活性を高めることが有益である疾病の治療に特に有益であり得る。
ＩＣＥrel−II ＤＮＡ又はＩＣＥrel−IIタンパク質を含む医薬的に有用な組成物は、医薬的に許容可能な担体の混合のような公知の方法に従って処方され得る。該担体及び処方方法の例は、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。効果的な投与に適した医薬的に許容可能な組成物を生成するために、このような組成物は有効量のタンパク質又はＤＮＡを含んでいる。
ＩＣＥrel−II関連疾病を治療又は診断するのに十分な量の本発明の治療用又は診断用組成物をヒトに投与する。有効量は、ヒトの症状、体重、性別及び年齢のような様々な要因によって異なり得る。他の要因としては投与方法が含まれる。
医薬組成物は、皮下、局所、経口及び筋肉内のような様々な経路により個体に投与され得る。
遺伝暗号の縮重により、特定のアミノ酸をコードするのに２種以上のコドンを使用することができる場合には、アミノ酸配列は、１組の類似ＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかによってコードされ得る。この組の中で１個のメンバーだけがＩＣＥrel−II配列と同一であるが、ミスマッチを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でもＩＣＥrel−II ＤＮＡにハイブリダイズし得る。ミスマッチＤＮＡオリゴヌクレオチドは尚ＩＣＥrel−II ＤＮＡにハイブリダイズするので、ＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡを同定して単離することができる。
特定の生物に由来するＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡを使用して、他の生物に由来するＩＣＥrel−IIの同族体を単離、精製することができる。これを達成するために、適切なハイブリダイゼーション条件下で、第１のＩＣＥrel−II ＤＮＡを、ＩＣＥrel−IIの同族体をコードするＤＮＡを含む試料と混合することができる。ハイブリダイズしたＤＮＡ複合体を単離し、同種ＤＮＡをコードするＤＮＡをこの複合体から精製することができる。
特定のアミノ酸をコードするのに様々なコドンが実質量で重複（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）し得ることは公知である。従って、本発明は更に、同一のアミノ酸の任意の翻訳をコードする代替コドンを含むＤＮＡ配列に関する。本明細書の目的のために、１個以上の代替コドンを有する配列は縮重変種であると定義する。発現タンパク質の最終的な物理的特性を実質的に変化させないＤＮＡ配列又は被翻訳タンパク質での突然変異も本発明の範囲に包含される。例えば、ロイシンをバリン、リシンをアルギニン又はグルタミンをアスパラギンに置換しても、ポリペプチドの機能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）は変化し得ない。
天然ペプチドとは異なる特性を有するペプチドをコードするように、ペプチドをコードするＤＮＡ配列を変化させることができることは公知である。ＤＮＡ配列を変える方法には、非制限的ではあるが、特定部位の突然変異誘発が含まれる。変化する特性の例には、非制限的ではあるが、酵素の基質に対する親和性の変化が含まれる。
本明細書で使用するＩＣＥrel−IIの「機能的誘導体」は、ＩＣＥrel−IIの生物活性と実質的に同様の（機能的又は構造的な）生物活性を有する化合物である。「機能的誘導体」という用語は、ＩＣＥrel−IIの「断片」、「変異体」、「縮重変異体」、「類似体」及び「同族体」又は「化学的誘導体」を包含するものとする。「断片」という用語はＩＣＥrel−IIの任意のポリペプチドのサブセットを指す。「変異体」という用語は、構造及び機能が全ＩＣＥrel−II分子又はその断片と実質的に同様である分子を指す。ある分子とＩＣＥrel−IIとが実質的に同様の構造を有するか又は同様の生物活性を有するならば、この分子はＩＣＥrel−IIと「実質的に同様」である。従って、これら２個の分子が実質的に同様の活性を有するならば、一方の分子の構造が他方の分子になくても又は２個のアミノ酸配列が同一でなくても変異体であるとみなされる。
「類似体」という用語は、機能が全ＩＣＥrel−II分子又はその断片と実質的に同様である分子を指す。
「化学的誘導体」という用語は、通常は基本分子の一部分ではない付加的な化学的部分を含んでる分子を示す。このような分子は、基本分子の溶解性、半減期、吸収等を改善させ得る。或いは、この化学的部分は、基本分子の望ましくない副作用を抑制するか又は基本分子の毒性を低下させ得る。このような部分の例はＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓのような様々な文献に記載されている。
本発明は更に、ＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡ又はＲＮＡの発現及びＩＣＥrel−IIタンパク質の機能をｉｎ ｖｉｖｏで調節する化合物のスクリーニング方法に関する。このような活性を調節する化合物はＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質又は非タンパク性有機分子であり得る。化合物は、ＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現又はＩＣＥrel−IIタンパク質の機能を増大させるか又は低下させることによって調整され得る。ＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現又はＩＣＥrel−IIタンパク質の機能を調節する化合物は、様々なアッセイによって検出され得る。このアッセイは、発現又は機能に変化があるかどうかを調べる単純な「イエス／ノー」アッセイであり得る。試験試料の発現又は機能を標準試料の発現又は機能のレベルと比較することによって、アッセイを定量的にすることができる。
以下の実施例で本発明を非制限的に説明する。
実施例１
ＩＣＥ rel −IIの分子クローニング
「32Ｐ」標識合成オリゴヌクレオチドプローブ：
を用いてバクテリオファージλｇｔ１０内のＴＨＰ−１細胞（急性単球白血病細胞系；ＡＴＣＣ ＴＩＢ ２０２）ｃＤＮＡライブラリーをレプリカ−フィルタースクリーニングすることによりＩＣＥrel−IIの部分長ｃＤＮＡクローンを同定した。
Ｔ１０．３．１と称するこの最初の７４８ｂｐクローンは、本明細書に記載する全長ＩＣＥrel−IIクローンの塩基５４４−１２９１に相当した。Ｅｃｏ ＲＩ制限酵素部位を含むｃＤＮＡインサートのそれぞれ左側及び右側のλｇｔ１０の配列に相当する合成オリゴヌクレオチドプライマー：
によるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いるＤＮＡ増幅により、個々のλｇｔ１０プラークからクローンを回収した。得られた増幅産物をプラスミドベクターｐＣＲ−II（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、コンピテント大腸菌細胞内に形質転換し、コロニーを精製し、得られた形質転換細胞を液体培養物中で成長させることにより増殖させた。この細胞からプラスミドＤＮＡを精製し、クローンＴ１０．３．１インサートのヌクレオチド配列をジデオキシＤＮＡ配列決定法により調べた。このクローンの配列に基づいて、クローンＴ１０．３．１の配列に特異的な合成オリゴヌクレオチドを調製し、これを［32Ｐ］標識した後に使用して、ＴＨＰ−１細胞λｇｔ１０ ｃＤＮＡライブラリーを再度スクリーニングした。レプリカフィルタースクリーニングに使用したプローブは、
であった。
Ｔ１５．１．１と称する同定された最大クローンは１２０７ｂｐで、本明細書に記載する全長ＩＣＥrel−IIクローンの塩基６４−１２７０に相当した。大腸菌を含むアガロースプレート上で培養してλバクテリオファージを増殖させた後にクローンをλｇｔ１０から回収し、次いで、ポリエチレングリコール沈殿、多孔質（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）シリカゲルクロマトグラフィー及びアルコール沈殿を組み合わせてλバクテリオファージＤＮＡを精製した。Ｔ１５．１．１ ＤＮＡ断片を部分Ｅｃｏ ＲＩ制限消化によって切り出し（Ｔ１５．１．１配列の内部Ｅｃｏ ＲＩ部位のために部分消化が必要であった）、その後１．２Ｋｂ断片をアガロースゲルで精製し、次いで精製した断片をプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏ ＲＩ部位に連結した。コンピテント大腸菌細胞内に形質転換し、コロニーを精製し、得られた形質転換細胞を液体培養物中で増殖させた後にプラスミドＤＮＡを精製し、クローンＴ１５．１．１断片のヌクレオチド配列を調べた。
バクテリオファージλｇｔ１１内のヒト末梢血単球ｃＤＮＡライブラリーのレプリカフィルタースクリーニングによって、全長ＩＣＥrel−IIクローン（Ｐ１０１．１．１）を同定した。全長ＩＣＥrel−II配列の塩基１４２−７０２に相当する断片を生成するプライマー：
を用いてＴ１５．１．１ ＩＣＥrel−IIクローンを増幅させることにより生成された［32Ｐ］標識ＰＣＲ断片でフィルターをプロービングした。（このプローブはＩＣＥとの配列同一性が低く、従って同定されるＩＣＥクローンの数が最小限になるためにこれを選択した）。クローンＴ１５．１．１について上述したように精製λバクテリオファージＤＮＡからＥｃｏ ＲＩ切り出しすることにより、１２９７ｂｐ全長ＩＣＥrel−IIクローン（Ｐ１０１．１．１）を回収した。Ｐ１０１．１．１ ＩＣＥrel−IIクローンのＤＮＡ配列は、同じレプリカフィルタースクリーン中に単離された他の４個のクローンと同一であった。
ＩＣＥrel−II（クローンＰ１０１．１．１）の完全ｃＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を図１に示す。ＩＣＥrel−IIクローンＰ１０１．１．１の最長読み取り枠（塩基３８〜１１６８）は、ヒトインターロイキン−１β変換酵素とは５３％の配列同一性（６８％の配列類似性）を示し（図２）、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＣＥＤ−３ポリペプチドとは２６％の配列同一性（５２％の配列類似性）を示し（図３）、マウスＮＥＤＤ−２ポリペプチドとは２３％の配列同一性（４１％の配列類似性）を示す（図４）４３．３ｋＤａポリペプチドをコードする。触媒システイン残基（ＩＣＥrel−IIのＣｙｓ258、ヒトインターロイキン−１β変換酵素のＣｙｓ285、ＣＥＤ−３のＣｙｓ358）及びポリペプチド全体の他の構造モチーフ周辺では配列がとりわけ高度に保存されており、これはＩＣＥrel−IIがチオールプロテイナーゼであることに対応している。
実施例２
ＩＣＥ rel −II ｃＤＮＡの発現ベクター内へのサブクローニング
トランスフェクトした宿主細胞内でのＩＣＥrel−IIタンパク質の発現及びｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳のために、ＩＣＥrel−IIをコードするｃＤＮＡを数個のベクター内にサブクローニングした。これらのベクターには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋（発現はＴ７又はＴ３プロモーターによって駆動される）、ｐｃＤＮＡ Ｉ／Ａｍｐ（発現はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動される）、ｐＳＺ９０１６−１（発現はＨＩＶ末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターによって駆動される）、及びＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡ配列を含む組換えバキュロウイルスを生成するためのバキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ１３９３（発現はポリヘドリン（ＰＨ）プロモーターによって駆動される）が含まれる。Ｍａｎｉａｔｉｓ（上掲）及びＡｕｓｕｂｅｌ（上掲）に記載されているような技術を使用して、ＩＣＥrel−IIを、細菌又は酵母又は他の発現系での発現に適したベクター内にサブクローニングすることができる。ＩＣＥrel−IIの推定される／実際のアミノ酸配列を図１に示す。
ａ）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋：ＩＣＥ rel −II。「ＩＣＥrel−IIの分子クローニング」の項で上述したように、制限Ｅｃｏ ＲＩ消化によってλバクテリオファージから全長ＩＣＥrel−II ｃＤＮＡクローンを回収し、Ｅｃｏ ＲＩ切断しＣＩＰ処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋に連結した。ＩＣＥrel−IIのセンスオリエンテーションがＴ７又はＴ３プロモーターの後に来る個々のサブクローンを回収した。
ｂ）ｐｃＤＮＡ Ｉ／Ａｍｐ：ＩＣＥ rel −II。ダイレクショナル（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）クローニングを可能とするために、ＩＣＥrel−II ＤＮＡ配列がＴ７プロモーターの下流にあるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋：ＩＣＥrel−IIの精製プラスミド調製物（上記「ａ」）からＩＣＥrel−IIをＥｃｏ ＲＶ及びＸｂａ Ｉを用いて切り出した。得られたＥｃｏ ＲＶ，Ｘｂａ Ｉ ＩＣＥrel−II断片を精製し、Ｅｃｏ ＲＶ切断しＸｂａ Ｉ切断しＣＩＰ処理したｐｃＤＮＡ Ｉ／Ａｍｐに連結して、ＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡをＣＭＶプロモーターの下流にした。
ｃ）ｐＳＺ９０１６−１：ＩＣＥ rel −II。制限Ｅｃｏ ＲＩ消化によりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋：ＩＣＥrel−II（上記「ａ」）からＩＣＥrel−IIを切り出し、次いで１．３Ｋｂ断片をアガロースゲルから精製した。得られたＥｃｏ ＲＩ ＩＣＥrel−II断片を、Ｅｃｏ ＲＩ切断しＣＩＰ処理したｐＳＺ９０１６−１に連結した。ＩＣＥrel−IIのセンスオリエンテーションがＨＩＶＬＴＲプロモーターの下流にあるサブクローンを選択した。
ｄ）ｐＶＬ１３９３：ＩＣＥ rel −II及びｐＶＬ１３９３：Ｔ７ ＩＣＥ rel −II ＨＡ。Ｂａｍ ＨＩ及びＸｂａ Ｉを用いてｐｃＤＮＡ Ｉ／Ａｍｐ：ＩＣＥrel−II（上記「ｂ」）からＩＣＥrel−IIを切り出し、次いで得られた１．３Ｋｂ断片を、Ｂａｍ ＨＩ切断しＸｂａ Ｉ切断しＣＩＰ処理したｐＶＬ１３９３内に連結してｐＶＬ１３９３：ＩＣＥrel−IIを生成することによって、ＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡの、バキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ１３９３内へのダイレクショナルクローニングを媒介した。同様に、ＩＣＥrel−II読み取り枠の５’アミノ末端にＴ７タグを、３’カルボキシ末端にＦｌｕＨＡエピトープを作製することにより、ＩＣＥrel−IIをエピトープタグ化（ｅｐｉｔｏｐｅ ｔａｇｇｅｄ）した。このようにして改変させたＩＣＥrel−II ＤＮＡをｐＶＬ１３９３のＢａｍ ＨＩ／Ｘｂａ Ｉ部位に連結して、ｐＶＬ１３９３：Ｔ７ ＩＣＥrel−II ＨＡを生成した。
実施例３
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ転写／翻訳及び宿主細胞内へのトランスフェクションによるＩＣＥ rel −IIポリペプチドの発現
ＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡ配列を含むベクターを使用して、ウサギ網状赤血球溶解物、哺乳動物宿主細胞及びバキュロウイルス感染昆虫細胞でＩＣＥrel−IIポリペプチドの翻訳を駆動した。実験手順は本質的に製造業者の指示書に記載されている通りであった。
ａ）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ転写／翻訳。ＩＣＥrel−IIインサート下流でのＢａｍ ＨＩ消化によって、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ IIＳＫ＋：ＩＣＥrel−IIプラスミドＤＮＡ（Ｔ７の配向にＩＣＥrel−IIを含む）を線状化した。線状化したプラスミドを精製し、これを、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇの存在下でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いるランオフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）転写用の鋳型として使用した。得られたキャップされたＩＣＥrel−II転写体を塩化リチウム沈殿により精製し、これを使用してＬ−［35Ｓ］メチオニンの存在下、ヌクレアーゼ前処理したウサギ網状赤血球溶解物中でＩＣＥrel−IIの翻訳を駆動した。得られた翻訳混合物は、見掛け分子量が４５±２ｋＤａでＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上を移動する放射性標識ＩＣＥrel−IIタンパク質を含んでいた。
ｂ）哺乳動物細胞での発現。ＩＣＥrel−IIタンパク質を、ｐｃＤＮＡ Ｉ／Ａｍｐ：ＩＣＥrel−II（ＣＭＶプロモーターの制御下）又はｐＳＺ９０１６−１：ＩＣＥrel−II（ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの制御下）でトランスフェクトした後の哺乳動物宿主細胞で発現させた。後者（ｐＳＺ９０１６−１：ＩＣＥrel−II）の場合、細胞を、ＴＡＴを発現するプラスミドｐＳＺ９０１６１：ＴＡＴで同時トランスフェクトした。いずれのＩＣＥrel−II発現プラスミドの場合も、ＤＥＡＥ−デキストラン又はリポフェクタミン（ＢＲＬ）によるリポフェクションを用いてＣＯＳ−７細胞をトランスフェクトした。
ｃ）昆虫細胞での発現。ＩＣＥrel−IIを含むバキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ１３９３：Ｔ７ ＩＣＥrel−II ＨＡを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏ相同的組換えによって組換えバキュロウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）を生成した。次いで、エピトープタグ化したＩＣＥrel−IIを、ＩＣＥrel−IIを含む組換えバキュロウイルスに感染させた後に懸濁培養物中で増殖させたｓｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞で発現させた。
実施例４
他の宿主細胞系でのＩＣＥ rel −IIポリペプチドの発現のためのＩＣＥ rel −IIのクローニング
ａ）ＩＣＥ rel −II ｃＤＮＡの細菌発現ベクター内へのクローニング。異種タンパク質の発現を指令するように設計された発現ベクター内に最適なＩＣＥrel−II ｃＤＮＡ配列を挿入した後に、大腸菌のような細菌で組換えＩＣＥrel−IIを産生する。上記ベクターは、組換えＩＣＥrel−IIが単独で又はその後の操作のための融合タンパク質として合成されるように構築される。発現は、組換えＩＣＥrel−IIが可溶性タンパク質として又は不溶性封入体内で回収されるように制御され得る。ｐＢＲ３２２、ｐＳＫＦ、ｐＵＲ、ｐＡＴＨ、ｐＧＥＸ、ｐＴ７−５、ｐＴ７−６、ｐＴ７−７、ｐＥＴ、ｐＩＢＩ（ＩＢＩ）、ｐＳＰ６／Ｔ７−１９（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＴＺ１８Ｒ、ｐＴＺ１９Ｒ（ＵＳＢ）、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等のようなベクターが上記目的に適している。
ｂ）ＩＣＥ rel −II ｃＤＮＡの酵母発現ベクター内へのクローニング
異種タンパク質の細胞内又は細胞外発現を指令するように設計された発現ベクター内に最適なＩＣＥrel−II ｃＤＮＡシストロンを挿入した後に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母で組換えＩＣＥrel−IIを産生する。細胞内発現の場合、ＥｍＢＬｙｅｘ４等のようなベクターをＩＣＥrel−IIシストロンに連結する［Ｒｉｎａｓ，Ｕ．等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：５４３−５４５（１９９０）；Ｈｏｒｏｗｉｔｚ Ｂ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：４１８９−４１９２（１９８９）］。細胞外発現の場合は、分泌シグナル（酵母又は哺乳動物ペプチド）をＩＣＥrel−IIタンパク質のアミノ末端に融合する酵母発現ベクター内にＩＣＥrel−IIシストロンを連結する［Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，Ｇｅｎｅ ８５：５１１−５１６（１９８９）；Ｒｉｅｔｔ Ｌ．及びＢｅｌｌｏｎ Ｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２９４１−２９４９（１９８９）］。
ｃ）ＩＣＥ rel −II ｃＤＮＡのウイルス発現ベクター内へのクローニング
ＨｅＬａ Ｓ３細胞のような哺乳動物宿主細胞をＩＣＥrel−II ｃＤＮＡ配列を含むワクシニアウイルスに感染させると、組換えＩＣＥrel−IIが産生される。ＩＣＥrel−II：ワクシニアウイルスを生成するためにまず、ＩＣＥrel−II ｃＤＮＡをｐＣＳ１１、ｐＴＫｇｐｔＦ１ｓ、ｐＭＪ６０１のような転移ベクター又は他の適切なベクターに連結し、次いで相同的組換えによってワクシニアウイルスに転移させる。プラークを精製し、ウイルスを増幅させた後に、ＩＣＥrel−II：ワクシニアウイルスを使用して哺乳動物宿主細胞に感染させ、組換えＩＣＥrel−IIタンパク質を産生する。
実施例５
インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIポリペプチドの製造方法：
組換えＩＣＥrel−IIは、
ａ）宿主細胞をＩＣＥrel−IIタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換して組換え宿主細胞を生成し、
ｂ）インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIの生成を可能とする条件下で組換え宿主細胞を培養し、
ｃ）インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIを回収する
ことによって産生される。
組換えインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIを標準的な方法で精製して、特性分析する。
実施例６
インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII活性を調節する化合物を様々な方法で検出することができる。インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIに影響を及ぼす化合物の同定方法は、
（ａ）試験化合物をインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII含有溶液と混合して、混合物を生成し、
（ｂ）混合物中のインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII活性を測定し、
（ｃ）混合物のインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII活性を標準と比較する
ことからなる。
インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII活性を調節する化合物を配合して医薬組成物とすることができる。このような医薬組成物は、インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII活性の変化を特徴とする疾病又は症状の治療に有用であり得る。インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII活性が増加する疾病の例としては、免疫不全症候群、病原性感染症、心血管及び神経障害、脱毛症、老化、パーキンソン病及びアルツハイマー病が含まれる。このような疾病の治療は、インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII活性を低下させる化合物による治療からなる。インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII活性が低下する疾病の例としては、自己免疫性疾患、白血病、リンパ腫、及び他のガンが含まれる。このような疾病の治療は、インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII活性を増加させる化合物による治療からなる。
実施例７
インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIをコードするＤＮＡと構造的に関連するＤＮＡはプローブによって検出される。適切なプローブは、図１のヌクレオチド配列の全てもしくは一部分を有するＤＮＡ、図１のヌクレオチド配列の全てもしくは一部分を有するＤＮＡによってコードされるＲＮＡ、図１のアミノ酸配列の一部分に由来する縮重オリゴヌクレオチド、又はインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIに対する抗体から誘導され得る。
実施例８
インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ、又はインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIの検出や特性分析に有用なキットは慣用的な方法によって製造される。キットは、インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIをコードするＤＮＡ、組換えインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII、インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIをコードするＤＮＡに対応するＲＮＡ、又はインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIに対する抗体を含み得る。このキットを使用して、法廷用試料及び疫学試料のような試験試料の特性を分析することができる。
実施例９
ヒトＩＣＥ rel −II遺伝子を用いた他のＩＣＥ rel −II遺伝子のクローニング
ＩＣＥrel−II遺伝子の部分に相当するＤＮＡを、他の生物から単離したゲノムＤＮＡとクロスハイブリダイズすると、親生物から同種遺伝子をクローニングすることができる。このために、慣用的な方法に従って、サルのような他の霊長類に由来するゲノムライブラリーをゲノムＤＮＡから構築する。例えばＥＭＢＬベクターを用いてＥＭＢＬゲノムライブラリーを作製し、平板培養し、32Ｐ標識ＤＮＡプローブによるハイブリダイゼーションでスクリーニングする。陽性プラークを選択し、精製した交差反応プラークが選択されるまで更なるスクリーニングを行う。制限マッピング、サザンハイブリダーゼーション及びＤＮＡ配列決定のような物理学的方法によって、陽性クローン内に含まれるＤＮＡを更に特性分析する。
例えば、ストリンジェンシィの低い条件下で、適切な試料をインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIをコードする核酸でハイブリダイズすることによって、上記動物に由来する機能的インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIをコードする精製核酸を単離することができる。
実施例１０
突然変異を起こしたＩＣＥ rel −IIの使用
標準的な方法を用いてＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡを突然変異させて、改変ＩＣＥrel−II遺伝子を産生する。宿主細胞を改変ＩＣＥrel−IIで形質転換して、改変ＩＣＥrel−IIタンパク質を産生する。改変ＩＣＥrel−IIタンパク質を単離、精製し、これを使用して、ＩＣＥrel−IIタンパク質の機能特性を分析することができる。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：１５７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
配列番号：２
配列の長さ：８２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
配列番号：３
配列の長さ：８６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
配列番号：４
配列の長さ：７５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
配列番号：５
配列の長さ：８１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
配列番号：６
配列の長さ：７４塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
配列番号：７
配列の長さ：７８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
配列番号：８
配列の長さ：１２９９塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
配列番号：９
配列の長さ：８１２アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）は慢性及び急性炎症を媒介する主要物質である。ヒト単球は、ＩＬ−１βの他に、ＩＬ−１遺伝子ファミリーの別の２つの物質；インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）及びＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−ＲＡ）を産生する。３種全てのタンパク質は標的細胞上にある膜固定形態の１型及び２型ＩＬ−１レセプター（ＩＬ１Ｒ）に結合する。ＩＬ−１α及びＩＬ−１βは実質的に同一の生物学的反応を誘発するが、ＩＬ−１ＲＡはこのような作用を阻害する。ＩＬ−１α及びＩＬ−１βは共に、機能的疎水性シグナル配列の欠如した３１ｋＤａ一次翻訳産物として合成される。３１ｋＤａ形態のＩＬ−１αは更なるプロセシングなしでも十分に活性を示すが、細胞から活発に放出されるとは思えない。活性化された単球から放出される主要形態のＩＬ−１であるＩＬ−１βは不活性３１ｋＤａ前駆体（ｐＩＬ−１β）として合成され、この前駆体は、新規なシステインプロテイナーゼであるインターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）によってプロセシングされて成熟１７．５ｋＤａ形態（ｍＩＬ−１β）となる。ＩＣＥは、プロホルモンプロセシング用の単一部位であるＡｌａ117とＡｓｐ116との間でｐＩＬ−１βを切断することによって完全に活性なｍＩＬ−１βを生成する。この切断部位周辺の配列：−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−は、公知である全てのｐＩＬ−１βポリペプチドでは進化的に保存されている。
従来のＨＰＬＣ技術及び親和性精製技術によって示されるような活性ヒトＩＣＥは、１９，８６６Ｄａ（ｐ２０）サブユニットと１０，２４４Ｄａ（ｐ１０）サブユニットとの１：１化学量論的複合体からなるヘテロダイマーである。ＩＣＥが、１４ｋＤａプロドメイン、活性部位Ｃｙｓ285を含むｐ２０、成熟酵素内に存在しない１９残基接続ペプチド、及び活性酵素の必須成分であるｐ１０からなる４５ｋＤａプロ酵素（ｐ４５）として構成的に発現されることがクローン化ｃＤＮＡにより判明した。成熟サブユニットにはＡｓｐ−Ｘ配列が隣接している。上記部位の突然変異分析及び異種系での発現は活性酵素の産生が自己触媒的であることを示している。マウス及びラットＩＣＥもクローニングされ、これらは上記構造モチーフを含め高度の配列類似性を示している。
最近、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓ ｂｒｉｇｇｓａｅ及びＣａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓ ｖｕｌｇａｒｉｓの線虫細胞死異常遺伝子（ＣＥＤ−３）や、マウスニューロン前駆体細胞の胚発生でダウンレギュレートされた（ＮＥＤＤ−２）遺伝子を含むＩＣＥ様遺伝子ファミリーが明らかにされ始めた。これらの遺伝子の予想されるポリペプチド配列はそれぞれヒトＩＣＥとは２９％及び２７％の配列同一性を示す。ＣＥＤ−３とＩＣＥとの配列同一性は、成熟ヒトＩＣＥのｐ２０サブユニット及びｐ１０サブユニットに相当する領域でより高くなっている。ＩＣＥ及びＣＥＤ−３について公知の全ての配列は、ＩＣＥの触媒システインを包囲するペンタペプチド配列−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−を、ＣＥＤ−３ではそれと等価の配列を含んでいる。
ＣＥＤ−３及びマウスＩＣＥは共に、線維芽細胞系でのトランスフェクション又は神経細胞内へのマイクロインジェクションによって発現されると、プログラミングされた細胞死（アポトーシス）を生じる。ＣＥＤ−３又はＩＣＥのプロアポトーシス作用は、細胞死抑制遺伝子として機能するように思える哺乳動物の原腫瘍遺伝子（ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ）ｂｃｌ−２、又はＩＣＥのセルピン（ｓｅｒｐｉｎ）様阻害剤であるサイトカイン応答モディファイアーＡ（ｃｒｍＡ）遺伝子産物、で同時トランスフェクトすることによって阻止される。
発明の要約
ＩＣＥrel−II（インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII）と称する新規なヒトチオールプロテイナーゼを単離、精製した。全長前駆体形態のＩＣＥrel−IIタンパク質をコードするＤＮＡ分子を単離、精製し、ヌクレオチド配列を決定した。組換え宿主での発現のために、ＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡをクローニングした。ＤＮＡクローンは組換え全長ＩＣＥrel−II及び成熟形態酵素の個々のサブユニットを産生する。組換えＩＣＥrel−IIはＩＣＥrel−II活性のモジュレーター、従ってＩＣＥrel−IIの前炎症性作用又はプロアポトーシス作用に関連する病的状態のモディファイアーを同定するのに有用である。ＩＣＥrel−IIアンチセンス分子はＩＣＥrel−IIの前炎症性作用又はプロアポトーシス作用を治療によって抑制又は排除するのに有用であり、ＩＣＥrel−IIによる遺伝子移植又は遺伝子療法はＩＣＥrel−IIの前炎症性作用又はプロアポトーシス作用を高めるのに有用である。これらの療法は、非制限的ではあるが、（エイズのような）免疫不全症候群、自己免疫性疾患、病原性感染症、心血管及び神経障害、脱毛症、老化、ガン、パーキンソン病、アルツハイマー病を含む免疫性、増殖性及び変性疾病の治療に有益である。
【図面の簡単な説明】
図１。ヒトＩＣＥrel−II（ｃＤＮＡクローンＰ１０１．１．１）のヌクレオチド配列、その相補的ヌクレオチド配列、及び推定されるアミノ酸配列。
図２。ヒトＩＣＥrel−IIのアミノ酸配列とヒトＩＣＥのアミノ酸配列とを並置する。同一のアミノ酸は並置した配列間に垂直線を引いて示す。高度保存性アミノ酸の相違は並置した配列間に２つの点で示し、保存性アミノ酸の相違は１つの点で示す。
図３。ヒトＩＣＥrel−IIのアミノ酸配列とＣａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＣＥＤ−３のアミノ酸配列とを並置する。同一のアミノ酸は並置した配列間に垂直線を引いて示す。高度保存性アミノ酸の相違は並置した配列間の２つの点で示し、保存性アミノ酸の相違は１つの点で示す。
図４。ヒトＩＣＥrel−IIのアミノ酸配列とマウスＮＥＤＤ−２のアミノ酸配列とを並置する。同一のアミノ酸は並置した配列間に垂直線を引いて示す。高度保存性アミノ酸の相違は並置した配列間の２つの点で示し、保存性アミノ酸の相違は１つの点で示す。
発明の詳細な説明
全長形態のＩＣＥrel−IIをコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を同定し、配列決定し、単離した。組換え宿主での発現のために、ｃＤＮＡを発現ベクター内にクローニングした。ｃＤＮＡは組換え全長ＩＣＥrel−IIを産生するのに有用である。ｃＤＮＡ及びそのｃＤＮＡから誘導される組換えＩＣＥrel−IIタンパク質は、抗体、診断キット、実験室試薬及びアッセイの生産に有用である。ｃＤＮＡ及び組換えＩＣＥrel−IIタンパク質は、ＩＣＥrel−IIの機能、炎症及び細胞アポトーシスに影響する化合物の同定のために使用される。ＩＣＥrel−IIアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンス類似物質は、ＩＣＥrel−IIタンパク質の発現を抑制し、かくしてＩＣＥrel−IIの前炎症作用又はプロアポトーシス作用を抑制するのに臨床学的に有用である。同様に、ＩＣＥrel−IIをコードする配列を使用して、ＩＣＥrel−IIを標的細胞内に導入してＩＣＥrel−IIの前炎症作用又はプロアポトーシス作用を高める遺伝子療法を行うことができる。
様々な細胞や細胞系がＩＣＥrel−II ｃＤＮＡの単離での使用に適し得る。適切な細胞は、慣用的な技術を用いて細胞抽出物又は調整培地中のＩＣＥrel−II活性をスクリーニングすることによって選択される。このアッセイでＩＣＥrel−II活性を示す細胞がＩＣＥrel−II ｃＤＮＡの単離に適する。
様々な手順を使用して、ＩＣＥrel−II ｃＤＮＡを分子クローニングすることができる。これらの方法には、非制限的ではあるが、適切な発現ベクター系でのＩＣＥrel−II含有ｃＤＮＡライブラリー構築後のＩＣＥrel−II遺伝子の直接機能的発現が含まれる。他の方法は、バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクター内に構築されたＩＣＥrel−II含有ｃＤＮＡライブラリーを、ＩＣＥrel−IIのアミノ酸配列から設計された標識オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングすることである。
細胞から構築された様々なライブラリーが、ＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡの単離に有用であり得る。適切なライブラリーは、ＩＣＥrel−II活性を有する細胞又は細胞系から作製される。
ｃＤＮＡライブラリーの作製は当業界で公知の標準的な技術によって実施され得る。このようなｃＤＮＡライブラリー構築技術及び他の標準的な分子生物学的技術は例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２）又はＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．，Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）に記載されている。
ＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡは適切なゲノムＤＮＡライブラリーから単離してもよい。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は、当業界で公知の標準的な技術によって実施され得る。公知のゲノムＤＮＡライブラリー構築技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．等（上掲）及びＡｕｓｕｂｅｌ等（上掲）に記載されている。
適切なプロモータ及び他の適切な転写調節要素を含む発現ベクター内への分子クローニングによってクローン化したＩＣＥrel−II ｃＤＮＡを原核生物又は真核生物宿主細胞に移入して組換え技術で発現させ、組換えＩＣＥrel−IIを産生することができる。
本明細書では、発現ベクターは、クローン化した遺伝子コピーの転写及び適切な宿主でのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列であると定義する。このようなベクターを使用して、細菌、酵母、藍藻類、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞のような様々な宿主で真核細胞遺伝子を発現させることができる。
特別設計されたベクターによって、細菌−酵母又は細菌−動物細胞のような宿主間でのＤＮＡのシャトリングが可能となる。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞内での自律複製のための複製起源、選択可能マーカー、数の限定された有用な制限酵素部位、高コピー数のための可能な要素（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）及び活性プロモーターを含み得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させてＲＮＡ合成を開始するよう指令するＤＮＡ配列であると定義する。強いプロモーターはｍＲＮＡを高頻度で開始させるものである。発現ベクターには、非制限的ではあるが、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特別設計されたプラスミド又はウイルスが含まれる。
様々な哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞で組換えＩＣＥrel−IIを発現させることができる。組換えＩＣＥrel−IIの発現に適し得る市販の哺乳動物発現ベクターには、非制限的ではあるが、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ ３７４６０）及びＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ ３７５６５）が含まれる。
ＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡを組換え宿主細胞内での発現のために発現ベクター内にクローニングすることもできる。組換え宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよく、これらの細胞には非制限的ではあるが、細菌、酵母、哺乳動物細胞及び昆虫細胞が含まれる。市販されている適切な哺乳動物種由来の細胞系には非制限的ではあるが、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）が含まれる。
発現ベクターは、非制限的ではあるが、形質転換、トランスフェクション、感染、プロトプラスト融合及びエレクトロポレーションを含む幾つかの技術のいずれかによって宿主細胞内に導入され得る。発現ベクターを含む細胞をクローニングによって増殖させ、個々に分析して、これらの細胞がＩＣＥrel−IIタンパク質を産生するかどうかを調べる。ＩＣＥrel−IIを発現する宿主細胞クローンの同定は、非制限的ではあるが、抗ＩＣＥrel−II抗体との免疫反応性や、宿主細胞関連ＩＣＥrel−II活性の存在を含む幾つかの手段によって実施され得る。
ＩＣＥrel−II ｃＤＮＡの発現は更に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生された合成ｍＲＮＡを用いて実施され得る。合成ｍＲＮＡは、非制限的ではあるが、コムギ胚芽抽出物及び網状赤血球抽出物を含む種々の無細胞系で効率的に翻訳されると共に、非制限的ではあるが、カエル卵母細胞内へのマイクロインジェクションを含む細胞をベースとする系で効率的に翻訳され得る。
最適レベルの酵素活性及び／又はＩＣＥrel−IIタンパク質が得られるＩＣＥrel−II ｃＤＮＡを調べるために、改変ＩＣＥrel−II ｃＤＮＡ分子を構築する。宿主細胞をｃＤＮＡ分子で形質転換し、ＩＣＥrel−II ＲＮＡ及びタンパク質のレベルを測定する。
宿主細胞内でのＩＣＥrel−IIタンパク質の量は、免疫親和性技術及び／又はリガンド親和性技術のような様々な方法によって定量される。ＩＣＥrel−II特異的親和性ビーズ又はＩＣＥrel−II特異抗体を使用して、35Ｓ−メチオニン標識した又は非標識のＩＣＥrel−IIタンパク質を単離する。標識ＩＣＥrel−IIタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析される。非標識ＩＣＥrel−IIタンパク質は、ＩＣＥrel−II特異抗体を使用するウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡアッセイによって検出される。
組換え宿主細胞内でのＩＣＥrel−IIの発現後に、ＩＣＥrel−IIタンパク質を回収して、活性形態のＩＣＥrel−IIを提供することができる。数種のＩＣＥrel−II精製手順が利用可能であり、使用に適している。組換えＩＣＥrel−IIは、当業界で公知の分画又はクロマトグラフィーステップを個々に適用して又は様々に組み合わせて、細胞溶解物又は調整培養培地から精製することができる。
更には、発生期の全長ＩＣＥrel−II又はＩＣＥrel−IIのポリペプチド断片に特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体を用いて作製した免疫親和性カラムを使用して、組換えＩＣＥrel−IIを他の細胞タンパク質から分離することができる。
組換えタンパク質を使用して、抗体を産生してもよい。本明細書で使用する「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体並びにその断片（例えば抗原又はハプテンに結合し得るＦｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）2断片）を包含する。
ＩＣＥrel−IIに対する単一特異性抗体は、ＩＣＥrel−IIと反応性の抗体を含む哺乳動物抗血清から精製されるか、又は標準的な技術を用いてＩＣＥrel−IIと反応性のモノクローナル抗体として産生される。本明細書で使用する単一特異性抗体は、ＩＣＥrel−IIに対して均一（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）結合特性を示す単一抗体種又は多重抗体種であると定義する。本明細書で使用する均一結合とは、抗体種が、上述したようなＩＣＥrel−IIに関連する特異抗原又はエピトープに結合する能力を指す。酵素特異抗体は、免疫アジュバントを用いるか又は用いずに、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマ等のような動物、好ましくはウサギを適切な濃度のＩＣＥrel−IIで免疫感作することによって産生される。
ＩＣＥrel−IIに反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、近交系マウスをＩＣＥrel−IIで免疫感作するような慣用的な方法によって産生され得る。約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、好ましくは約１ｍｇのＩＣＥrel−IIを含む約０．５ｍｌの緩衝液又は食塩水を同一容量の許容可能なアジュバントに導入したものでマウスへの免疫感作を行う。フロイントの完全アジュバントが好ましい。０日目にマウスに初期免疫感作して、約３〜約３０週間置く。免疫感作したマウスに、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のような緩衝溶液中の約０．１〜約１０ｍｇのＩＣＥrel−IIを静脈内（ＩＶ）経路から投与して、１回以上の追加免疫感作を行う。免疫感作したマウスから当業界で公知の標準的な手順で脾臓を取り出すことにより、抗体陽性マウス由来のリンパ球が得られる。安定なハイブリドーマの形成を可能にする条件下で脾臓リンパ球を適切な融合パートナーと混合するとハイブリドーマ細胞が生成される。ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）内にて当業界で公知の手順で増殖させることにより、融合ハイブリドーマ細胞を選択する。約１４日目、１８日目及び２１日目に上清液を増殖陽性ウェルから採取し、ＩＣＥrel−IIを抗原として用いる固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）のようなイムノアッセイによって抗体産生をスクリーニングする。培養液もオクタロニー沈降アッセイで試験して、ｍＡｂのイソタイプを調べる。ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｓｏｆｔ Ａｇａｒ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｋｒｕｓｅ及びＰａｔｅｒｓｏｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９７３の軟寒天技術のような技術によって、抗体陽性ウェルのハイブリドーマ細胞をクローニングする。
十分量の特異的ｍＡｂを得るようにハイブリドーマを約２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で増殖させて抗ＩＣＥrel−IIをｉｎ ｖｉｔｒｏで産生する。ｍＡｂを当業界で公知の技術で精製する。
非制限的ではあるが、沈降、受動凝集、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）技術及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術を含む様々な血清学的又は免疫学的アッセイによって、腹水又はハイブリドーマ培養液の抗体力価を調べる。同様のアッセイを使用して、体液又は組織や細胞抽出物中のＩＣＥrel−IIの存在を検出する。
単一特異的抗体産生のための上記方法を使用して、ＩＣＥrel−IIポリペプチド断片又は発生期全長ＩＣＥrel−IIポリペプチドに特異的な抗体を産生することができる。
Ａｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）のようなゲル支持体に抗体を加えてＩＣＥrel−II抗体親和性カラムを製造する。ゲル支持体は、抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで予め活性化させる。次いで、スペーサーアームとのアミド結合により、抗体をゲルに結合する。次いで、残存する活性化エステルを１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）でクエンチする。カラムを水、次いで０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄して、非接合抗体又は生体外タンパク質を除去する。次いで、カラムをリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．３）で平衡化し、ＩＣＥrel−II又はＩＣＥrel−II断片を含む細胞培養上清又は細胞抽出物をカラムにゆっくりと通す。次いで、カラムを洗浄し、タンパク質を溶離させる。次いで、精製ＩＣＥrel−IIタンパク質をリン酸緩衝食塩水に対して透析する。
ＩＣＥrel−II ｃＤＮＡ、ＩＣＥrel−IIに対する抗体又はＩＣＥrel−IIタンパク質を含むキットを製造することができる。このようなキットを使用して、ＩＣＥrel−II ＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡを検出するか、又は試料中でのＩＣＥrel−IIタンパク質もしくはペプチド断片の存在を検出する。このような特性分析は、非制限的ではあるが、法廷用分析及び疫学調査を含む様々な目的に有用である。
本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質及び抗体を使用して、ＩＣＥrel−II ＤＮＡ、ＩＣＥrel−II ＲＮＡ又はＩＣＥrel−IIタンパク質の量をスクリーニングして、測定することができる。組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子及び抗体は、ＩＣＥrel−IIの検出や型決定（ｔｙｐｉｎｇ）に適したキットを製造するのに適している。このようなキットは、少なくとも１個の容器を厳重に密閉して保持するのに適した区画化されたキャリヤーからなる。このキャリヤーは更に、ＩＣＥrel−IIの検出に適した組換えＩＣＥrel−IIタンパク質又は抗ＩＣＥrel−II抗体のような試薬を含んでいる。キャリヤーは更に、標識抗原又は酵素基質等のような検出手段を含み得る。
ＩＣＥrel−IIをコードするｃＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列がアンチセンス療法のために合成され得る。これらのアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートのような安定なＤＮＡ誘導体、ＲＮＡ、２′−Ｏ−アルキルＲＮＡのような安定なＲＮＡ誘導体、又は他のＩＣＥrel−IIアンチセンスオリゴヌクレオチド類似物質であり得る。ＩＣＥrel−IIアンチセンス分子は、マイクロインジェクション、リポソームカプセル化、又はアンチセンス配列を有するベクターからの発現によって細胞内に導入され得る。ＩＣＥrel−IIアンチセンス療法は、ＩＣＥrel−II活性の抑制が有益である疾病の治療に特に有用であり得る。
ＩＣＥrel−II遺伝子療法を使用して、標的器官の細胞内にＩＣＥrel−IIを導入することができる。ＩＣＥrel−II遺伝子を、受容体（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）である宿主細胞の感染によってＩＣＥrel−II ＤＮＡの転移を媒介するウイルスベクター内に連結することができる。適切なウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス等が含まれる。或いは、リガンド−ＤＮＡ接合体又はアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ接合体を用いる受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）によって媒介されターゲッティングされるＤＮＡ転移、リポフェクション膜融合又は直接マイクロインジェクションを含む非ウイルス技術によって、ＩＣＥrel−II ＤＮＡを遺伝子療法のために細胞内に転移させることができる。上記手順及びその変形手順はｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏＩＣＥrel−II遺伝子療法に適している。ＩＣＥrel−II遺伝子療法は、ＩＣＥrel−II活性を高めることが有益である疾病の治療に特に有益であり得る。
ＩＣＥrel−II ＤＮＡ又はＩＣＥrel−IIタンパク質を含む医薬的に有用な組成物は、医薬的に許容可能な担体の混合のような公知の方法に従って処方され得る。該担体及び処方方法の例は、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。効果的な投与に適した医薬的に許容可能な組成物を生成するために、このような組成物は有効量のタンパク質又はＤＮＡを含んでいる。
ＩＣＥrel−II関連疾病を治療又は診断するのに十分な量の本発明の治療用又は診断用組成物をヒトに投与する。有効量は、ヒトの症状、体重、性別及び年齢のような様々な要因によって異なり得る。他の要因としては投与方法が含まれる。
医薬組成物は、皮下、局所、経口及び筋肉内のような様々な経路により個体に投与され得る。
遺伝暗号の縮重により、特定のアミノ酸をコードするのに２種以上のコドンを使用することができる場合には、アミノ酸配列は、１組の類似ＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかによってコードされ得る。この組の中で１個のメンバーだけがＩＣＥrel−II配列と同一であるが、ミスマッチを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でもＩＣＥrel−II ＤＮＡにハイブリダイズし得る。ミスマッチＤＮＡオリゴヌクレオチドは尚ＩＣＥrel−II ＤＮＡにハイブリダイズするので、ＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡを同定して単離することができる。
特定の生物に由来するＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡを使用して、他の生物に由来するＩＣＥrel−IIの同族体を単離、精製することができる。これを達成するために、適切なハイブリダイゼーション条件下で、第１のＩＣＥrel−II ＤＮＡを、ＩＣＥrel−IIの同族体をコードするＤＮＡを含む試料と混合することができる。ハイブリダイズしたＤＮＡ複合体を単離し、同種ＤＮＡをコードするＤＮＡをこの複合体から精製することができる。
特定のアミノ酸をコードするのに様々なコドンが実質量で重複（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）し得ることは公知である。従って、本発明は更に、同一のアミノ酸の任意の翻訳をコードする代替コドンを含むＤＮＡ配列に関する。本明細書の目的のために、１個以上の代替コドンを有する配列は縮重変種であると定義する。発現タンパク質の最終的な物理的特性を実質的に変化させないＤＮＡ配列又は被翻訳タンパク質での突然変異も本発明の範囲に包含される。例えば、ロイシンをバリン、リシンをアルギニン又はグルタミンをアスパラギンに置換しても、ポリペプチドの機能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）は変化し得ない。
天然ペプチドとは異なる特性を有するペプチドをコードするように、ペプチドをコードするＤＮＡ配列を変化させることができることは公知である。ＤＮＡ配列を変える方法には、非制限的ではあるが、特定部位の突然変異誘発が含まれる。変化する特性の例には、非制限的ではあるが、酵素の基質に対する親和性の変化が含まれる。
本明細書で使用するＩＣＥrel−IIの「機能的誘導体」は、ＩＣＥrel−IIの生物活性と実質的に同様の（機能的又は構造的な）生物活性を有する化合物である。「機能的誘導体」という用語は、ＩＣＥrel−IIの「断片」、「変異体」、「縮重変異体」、「類似体」及び「同族体」又は「化学的誘導体」を包含するものとする。「断片」という用語はＩＣＥrel−IIの任意のポリペプチドのサブセットを指す。「変異体」という用語は、構造及び機能が全ＩＣＥrel−II分子又はその断片と実質的に同様である分子を指す。ある分子とＩＣＥrel−IIとが実質的に同様の構造を有するか又は同様の生物活性を有するならば、この分子はＩＣＥrel−IIと「実質的に同様」である。従って、これら２個の分子が実質的に同様の活性を有するならば、一方の分子の構造が他方の分子になくても又は２個のアミノ酸配列が同一でなくても変異体であるとみなされる。
「類似体」という用語は、機能が全ＩＣＥrel−II分子又はその断片と実質的に同様である分子を指す。
「化学的誘導体」という用語は、通常は基本分子の一部分ではない付加的な化学的部分を含んでる分子を示す。このような分子は、基本分子の溶解性、半減期、吸収等を改善させ得る。或いは、この化学的部分は、基本分子の望ましくない副作用を抑制するか又は基本分子の毒性を低下させ得る。このような部分の例はＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓのような様々な文献に記載されている。
本発明は更に、ＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡ又はＲＮＡの発現及びＩＣＥrel−IIタンパク質の機能をｉｎ ｖｉｖｏで調節する化合物のスクリーニング方法に関する。このような活性を調節する化合物はＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質又は非タンパク性有機分子であり得る。化合物は、ＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現又はＩＣＥrel−IIタンパク質の機能を増大させるか又は低下させることによって調整され得る。ＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現又はＩＣＥrel−IIタンパク質の機能を調節する化合物は、様々なアッセイによって検出され得る。このアッセイは、発現又は機能に変化があるかどうかを調べる単純な「イエス／ノー」アッセイであり得る。試験試料の発現又は機能を標準試料の発現又は機能のレベルと比較することによって、アッセイを定量的にすることができる。
以下の実施例で本発明を非制限的に説明する。
実施例１
ＩＣＥ rel −IIの分子クローニング
「32Ｐ」標識合成オリゴヌクレオチドプローブ：
Ｔ１０．３．１と称するこの最初の７４８ｂｐクローンは、本明細書に記載する全長ＩＣＥrel−IIクローンの塩基５４４−１２９１に相当した。Ｅｃｏ ＲＩ制限酵素部位を含むｃＤＮＡインサートのそれぞれ左側及び右側のλｇｔ１０の配列に相当する合成オリゴヌクレオチドプライマー：
Ｔ１５．１．１と称する同定された最大クローンは１２０７ｂｐで、本明細書に記載する全長ＩＣＥrel−IIクローンの塩基６４−１２７０に相当した。大腸菌を含むアガロースプレート上で培養してλバクテリオファージを増殖させた後にクローンをλｇｔ１０から回収し、次いで、ポリエチレングリコール沈殿、多孔質（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）シリカゲルクロマトグラフィー及びアルコール沈殿を組み合わせてλバクテリオファージＤＮＡを精製した。Ｔ１５．１．１ ＤＮＡ断片を部分Ｅｃｏ ＲＩ制限消化によって切り出し（Ｔ１５．１．１配列の内部Ｅｃｏ ＲＩ部位のために部分消化が必要であった）、その後１．２Ｋｂ断片をアガロースゲルで精製し、次いで精製した断片をプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏ ＲＩ部位に連結した。コンピテント大腸菌細胞内に形質転換し、コロニーを精製し、得られた形質転換細胞を液体培養物中で増殖させた後にプラスミドＤＮＡを精製し、クローンＴ１５．１．１断片のヌクレオチド配列を調べた。
バクテリオファージλｇｔ１１内のヒト末梢血単球ｃＤＮＡライブラリーのレプリカフィルタースクリーニングによって、全長ＩＣＥrel−IIクローン（Ｐ１０１．１．１）を同定した。全長ＩＣＥrel−II配列の塩基１４２−７０２に相当する断片を生成するプライマー：
ＩＣＥrel−II（クローンＰ１０１．１．１）の完全ｃＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を図１に示す。ＩＣＥrel−IIクローンＰ１０１．１．１の最長読み取り枠（塩基３８〜１１６８）は、ヒトインターロイキン−１β変換酵素とは５３％の配列同一性（６８％の配列類似性）を示し（図２）、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＣＥＤ−３ポリペプチドとは２６％の配列同一性（５２％の配列類似性）を示し（図３）、マウスＮＥＤＤ−２ポリペプチドとは２３％の配列同一性（４１％の配列類似性）を示す（図４）４３．３ｋＤａポリペプチドをコードする。触媒システイン残基（ＩＣＥrel−IIのＣｙｓ258、ヒトインターロイキン−１β変換酵素のＣｙｓ285、ＣＥＤ−３のＣｙｓ358）及びポリペプチド全体の他の構造モチーフ周辺では配列がとりわけ高度に保存されており、これはＩＣＥrel−IIがチオールプロテイナーゼであることに対応している。
実施例２
ＩＣＥ rel −II ｃＤＮＡの発現ベクター内へのサブクローニング
トランスフェクトした宿主細胞内でのＩＣＥrel−IIタンパク質の発現及びｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳のために、ＩＣＥrel−IIをコードするｃＤＮＡを数個のベクター内にサブクローニングした。これらのベクターには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋（発現はＴ７又はＴ３プロモーターによって駆動される）、ｐｃＤＮＡ Ｉ／Ａｍｐ（発現はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動される）、ｐＳＺ９０１６−１（発現はＨＩＶ末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターによって駆動される）、及びＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡ配列を含む組換えバキュロウイルスを生成するためのバキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ１３９３（発現はポリヘドリン（ＰＨ）プロモーターによって駆動される）が含まれる。Ｍａｎｉａｔｉｓ（上掲）及びＡｕｓｕｂｅｌ（上掲）に記載されているような技術を使用して、ＩＣＥrel−IIを、細菌又は酵母又は他の発現系での発現に適したベクター内にサブクローニングすることができる。ＩＣＥrel−IIの推定される／実際のアミノ酸配列を図１に示す。
ａ）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋：ＩＣＥ rel −II。「ＩＣＥrel−IIの分子クローニング」の項で上述したように、制限Ｅｃｏ ＲＩ消化によってλバクテリオファージから全長ＩＣＥrel−II ｃＤＮＡクローンを回収し、Ｅｃｏ ＲＩ切断しＣＩＰ処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋に連結した。ＩＣＥrel−IIのセンスオリエンテーションがＴ７又はＴ３プロモーターの後に来る個々のサブクローンを回収した。
ｂ）ｐｃＤＮＡ Ｉ／Ａｍｐ：ＩＣＥ rel −II。ダイレクショナル（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）クローニングを可能とするために、ＩＣＥrel−II ＤＮＡ配列がＴ７プロモーターの下流にあるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋：ＩＣＥrel−IIの精製プラスミド調製物（上記「ａ」）からＩＣＥrel−IIをＥｃｏ ＲＶ及びＸｂａ Ｉを用いて切り出した。得られたＥｃｏ ＲＶ，Ｘｂａ Ｉ ＩＣＥrel−II断片を精製し、Ｅｃｏ ＲＶ切断しＸｂａ Ｉ切断しＣＩＰ処理したｐｃＤＮＡ Ｉ／Ａｍｐに連結して、ＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡをＣＭＶプロモーターの下流にした。
ｃ）ｐＳＺ９０１６−１：ＩＣＥ rel −II。制限Ｅｃｏ ＲＩ消化によりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋：ＩＣＥrel−II（上記「ａ」）からＩＣＥrel−IIを切り出し、次いで１．３Ｋｂ断片をアガロースゲルから精製した。得られたＥｃｏ ＲＩ ＩＣＥrel−II断片を、Ｅｃｏ ＲＩ切断しＣＩＰ処理したｐＳＺ９０１６−１に連結した。ＩＣＥrel−IIのセンスオリエンテーションがＨＩＶＬＴＲプロモーターの下流にあるサブクローンを選択した。
ｄ）ｐＶＬ１３９３：ＩＣＥ rel −II及びｐＶＬ１３９３：Ｔ７ ＩＣＥ rel −II ＨＡ。Ｂａｍ ＨＩ及びＸｂａ Ｉを用いてｐｃＤＮＡ Ｉ／Ａｍｐ：ＩＣＥrel−II（上記「ｂ」）からＩＣＥrel−IIを切り出し、次いで得られた１．３Ｋｂ断片を、Ｂａｍ ＨＩ切断しＸｂａ Ｉ切断しＣＩＰ処理したｐＶＬ１３９３内に連結してｐＶＬ１３９３：ＩＣＥrel−IIを生成することによって、ＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡの、バキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ１３９３内へのダイレクショナルクローニングを媒介した。同様に、ＩＣＥrel−II読み取り枠の５’アミノ末端にＴ７タグを、３’カルボキシ末端にＦｌｕＨＡエピトープを作製することにより、ＩＣＥrel−IIをエピトープタグ化（ｅｐｉｔｏｐｅ ｔａｇｇｅｄ）した。このようにして改変させたＩＣＥrel−II ＤＮＡをｐＶＬ１３９３のＢａｍ ＨＩ／Ｘｂａ Ｉ部位に連結して、ｐＶＬ１３９３：Ｔ７ ＩＣＥrel−II ＨＡを生成した。
実施例３
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ転写／翻訳及び宿主細胞内へのトランスフェクションによるＩＣＥ rel −IIポリペプチドの発現
ＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡ配列を含むベクターを使用して、ウサギ網状赤血球溶解物、哺乳動物宿主細胞及びバキュロウイルス感染昆虫細胞でＩＣＥrel−IIポリペプチドの翻訳を駆動した。実験手順は本質的に製造業者の指示書に記載されている通りであった。
ａ）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ転写／翻訳。ＩＣＥrel−IIインサート下流でのＢａｍ ＨＩ消化によって、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ IIＳＫ＋：ＩＣＥrel−IIプラスミドＤＮＡ（Ｔ７の配向にＩＣＥrel−IIを含む）を線状化した。線状化したプラスミドを精製し、これを、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇの存在下でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いるランオフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）転写用の鋳型として使用した。得られたキャップされたＩＣＥrel−II転写体を塩化リチウム沈殿により精製し、これを使用してＬ−［35Ｓ］メチオニンの存在下、ヌクレアーゼ前処理したウサギ網状赤血球溶解物中でＩＣＥrel−IIの翻訳を駆動した。得られた翻訳混合物は、見掛け分子量が４５±２ｋＤａでＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上を移動する放射性標識ＩＣＥrel−IIタンパク質を含んでいた。
ｂ）哺乳動物細胞での発現。ＩＣＥrel−IIタンパク質を、ｐｃＤＮＡ Ｉ／Ａｍｐ：ＩＣＥrel−II（ＣＭＶプロモーターの制御下）又はｐＳＺ９０１６−１：ＩＣＥrel−II（ＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの制御下）でトランスフェクトした後の哺乳動物宿主細胞で発現させた。後者（ｐＳＺ９０１６−１：ＩＣＥrel−II）の場合、細胞を、ＴＡＴを発現するプラスミドｐＳＺ９０１６１：ＴＡＴで同時トランスフェクトした。いずれのＩＣＥrel−II発現プラスミドの場合も、ＤＥＡＥ−デキストラン又はリポフェクタミン（ＢＲＬ）によるリポフェクションを用いてＣＯＳ−７細胞をトランスフェクトした。
ｃ）昆虫細胞での発現。ＩＣＥrel−IIを含むバキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ１３９３：Ｔ７ ＩＣＥrel−II ＨＡを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏ相同的組換えによって組換えバキュロウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）を生成した。次いで、エピトープタグ化したＩＣＥrel−IIを、ＩＣＥrel−IIを含む組換えバキュロウイルスに感染させた後に懸濁培養物中で増殖させたｓｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞で発現させた。
実施例４
他の宿主細胞系でのＩＣＥ rel −IIポリペプチドの発現のためのＩＣＥ rel −IIのクローニング
ａ）ＩＣＥ rel −II ｃＤＮＡの細菌発現ベクター内へのクローニング。異種タンパク質の発現を指令するように設計された発現ベクター内に最適なＩＣＥrel−II ｃＤＮＡ配列を挿入した後に、大腸菌のような細菌で組換えＩＣＥrel−IIを産生する。上記ベクターは、組換えＩＣＥrel−IIが単独で又はその後の操作のための融合タンパク質として合成されるように構築される。発現は、組換えＩＣＥrel−IIが可溶性タンパク質として又は不溶性封入体内で回収されるように制御され得る。ｐＢＲ３２２、ｐＳＫＦ、ｐＵＲ、ｐＡＴＨ、ｐＧＥＸ、ｐＴ７−５、ｐＴ７−６、ｐＴ７−７、ｐＥＴ、ｐＩＢＩ（ＩＢＩ）、ｐＳＰ６／Ｔ７−１９（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＴＺ１８Ｒ、ｐＴＺ１９Ｒ（ＵＳＢ）、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等のようなベクターが上記目的に適している。
ｂ）ＩＣＥ rel −II ｃＤＮＡの酵母発現ベクター内へのクローニング
異種タンパク質の細胞内又は細胞外発現を指令するように設計された発現ベクター内に最適なＩＣＥrel−II ｃＤＮＡシストロンを挿入した後に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母で組換えＩＣＥrel−IIを産生する。細胞内発現の場合、ＥｍＢＬｙｅｘ４等のようなベクターをＩＣＥrel−IIシストロンに連結する［Ｒｉｎａｓ，Ｕ．等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：５４３−５４５（１９９０）；Ｈｏｒｏｗｉｔｚ Ｂ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：４１８９−４１９２（１９８９）］。細胞外発現の場合は、分泌シグナル（酵母又は哺乳動物ペプチド）をＩＣＥrel−IIタンパク質のアミノ末端に融合する酵母発現ベクター内にＩＣＥrel−IIシストロンを連結する［Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，Ｇｅｎｅ ８５：５１１−５１６（１９８９）；Ｒｉｅｔｔ Ｌ．及びＢｅｌｌｏｎ Ｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２９４１−２９４９（１９８９）］。
ｃ）ＩＣＥ rel −II ｃＤＮＡのウイルス発現ベクター内へのクローニング
ＨｅＬａ Ｓ３細胞のような哺乳動物宿主細胞をＩＣＥrel−II ｃＤＮＡ配列を含むワクシニアウイルスに感染させると、組換えＩＣＥrel−IIが産生される。ＩＣＥrel−II：ワクシニアウイルスを生成するためにまず、ＩＣＥrel−II ｃＤＮＡをｐＣＳ１１、ｐＴＫｇｐｔＦ１ｓ、ｐＭＪ６０１のような転移ベクター又は他の適切なベクターに連結し、次いで相同的組換えによってワクシニアウイルスに転移させる。プラークを精製し、ウイルスを増幅させた後に、ＩＣＥrel−II：ワクシニアウイルスを使用して哺乳動物宿主細胞に感染させ、組換えＩＣＥrel−IIタンパク質を産生する。
実施例５
インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIポリペプチドの製造方法：
組換えＩＣＥrel−IIは、
ａ）宿主細胞をＩＣＥrel−IIタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換して組換え宿主細胞を生成し、
ｂ）インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIの生成を可能とする条件下で組換え宿主細胞を培養し、
ｃ）インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIを回収する
ことによって産生される。
組換えインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIを標準的な方法で精製して、特性分析する。
実施例６
インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII活性を調節する化合物を様々な方法で検出することができる。インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIに影響を及ぼす化合物の同定方法は、
（ａ）試験化合物をインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII含有溶液と混合して、混合物を生成し、
（ｂ）混合物中のインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII活性を測定し、
（ｃ）混合物のインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII活性を標準と比較する
ことからなる。
インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII活性を調節する化合物を配合して医薬組成物とすることができる。このような医薬組成物は、インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII活性の変化を特徴とする疾病又は症状の治療に有用であり得る。インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII活性が増加する疾病の例としては、免疫不全症候群、病原性感染症、心血管及び神経障害、脱毛症、老化、パーキンソン病及びアルツハイマー病が含まれる。このような疾病の治療は、インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII活性を低下させる化合物による治療からなる。インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII活性が低下する疾病の例としては、自己免疫性疾患、白血病、リンパ腫、及び他のガンが含まれる。このような疾病の治療は、インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII活性を増加させる化合物による治療からなる。
実施例７
インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIをコードするＤＮＡと構造的に関連するＤＮＡはプローブによって検出される。適切なプローブは、図１のヌクレオチド配列の全てもしくは一部分を有するＤＮＡ、図１のヌクレオチド配列の全てもしくは一部分を有するＤＮＡによってコードされるＲＮＡ、図１のアミノ酸配列の一部分に由来する縮重オリゴヌクレオチド、又はインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIに対する抗体から誘導され得る。
実施例８
インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ、又はインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIの検出や特性分析に有用なキットは慣用的な方法によって製造される。キットは、インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIをコードするＤＮＡ、組換えインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII、インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIをコードするＤＮＡに対応するＲＮＡ、又はインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIに対する抗体を含み得る。このキットを使用して、法廷用試料及び疫学試料のような試験試料の特性を分析することができる。
実施例９
ヒトＩＣＥ rel −II遺伝子を用いた他のＩＣＥ rel −II遺伝子のクローニング
ＩＣＥrel−II遺伝子の部分に相当するＤＮＡを、他の生物から単離したゲノムＤＮＡとクロスハイブリダイズすると、親生物から同種遺伝子をクローニングすることができる。このために、慣用的な方法に従って、サルのような他の霊長類に由来するゲノムライブラリーをゲノムＤＮＡから構築する。例えばＥＭＢＬベクターを用いてＥＭＢＬゲノムライブラリーを作製し、平板培養し、32Ｐ標識ＤＮＡプローブによるハイブリダイゼーションでスクリーニングする。陽性プラークを選択し、精製した交差反応プラークが選択されるまで更なるスクリーニングを行う。制限マッピング、サザンハイブリダーゼーション及びＤＮＡ配列決定のような物理学的方法によって、陽性クローン内に含まれるＤＮＡを更に特性分析する。
例えば、ストリンジェンシィの低い条件下で、適切な試料をインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIをコードする核酸でハイブリダイズすることによって、上記動物に由来する機能的インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIをコードする精製核酸を単離することができる。
実施例１０
突然変異を起こしたＩＣＥ rel −IIの使用
標準的な方法を用いてＩＣＥrel−IIをコードするＤＮＡを突然変異させて、改変ＩＣＥrel−II遺伝子を産生する。宿主細胞を改変ＩＣＥrel−IIで形質転換して、改変ＩＣＥrel−IIタンパク質を産生する。改変ＩＣＥrel−IIタンパク質を単離、精製し、これを使用して、ＩＣＥrel−IIタンパク質の機能特性を分析することができる。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：１５７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
配列の長さ：８２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
配列の長さ：８６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
配列の長さ：７５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
配列の長さ：８１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
配列の長さ：７４塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
配列の長さ：７８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
配列の長さ：１２９９塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列
配列の長さ：８１２アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
Claims (13)
- 配列番号８：
に示されるヌクレオチド配列からなる、単離ＤＮＡ。 - 請求項１に記載の単離ＤＮＡ又はその相補的配列によってコードされる単離ＲＮＡ。
- 請求項１に記載の単離ＤＮＡを含む発現ベクター。
- 請求項３に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
- 組換えインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIポリペプチドの製造方法であって、
ａ）宿主細胞を請求項１に記載の単離ＤＮＡで形質転換して組換え宿主細胞を生成し、
ｂ）組換えインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIの生成を可能とする条件下で組換え宿主細胞を培養し、
ｃ）組換えインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIを回収する
ことからなる前記方法。 - 請求項５に記載の方法によって製造された組換えインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII。
- 請求項１に記載のＤＮＡによってコードされる単離、精製されたインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII。
- 配列番号９：
で示されるアミノ酸配列からなる請求項７に記載の単離、精製されたインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII。 - インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIを調節する化合物の同定方法であって、
（ａ）試験化合物を、請求項７に記載のインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII含有溶液と混合して、混合物を生成し、
（ｂ）混合物中のインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII活性を測定し、
（ｃ）混合物のインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII活性を標準と比較する
ことからなる前記方法。 - 組換えインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIをコードする請求項１に記載の単離ＤＮＡ、請求項７に記載の組換えインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII、及び請求項７に記載の組換えインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIに対する抗体からなる群の中から選択される試薬を含むキット。
- 請求項７に記載のインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIと免疫反応性の抗体。
- 請求項１に記載のＤＮＡに関連するＤＮＡを同定するためのプローブであって、
ａ）配列番号８に示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ；
ｂ）ａ）のＤＮＡによってコードされるＲＮＡ；及び
ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列をコードする縮重オリゴヌクレオチド
からなる群の中から選択される前記プローブ。 - インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼII活性を変化させるために使用する請求項１に記載のＤＮＡ。
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