JP3815572B2

JP3815572B2 - インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼ▲ＩＩＩ▼（ＩＣＥ▲下ｒｅｌ▼−▲ＩＩＩ▼）の前駆体をコードするＤＮＡ

Info

Publication number: JP3815572B2
Application number: JP52599195A
Authority: JP
Inventors: ニコルソン，ドナルド・ダブリユ; アリ，アンブレーン; マンデイ，ニール・エイ; バイヤンクール，ジヨン・ペー
Original assignee: メルクフロストカナダリミテッド
Priority date: 1994-04-08
Filing date: 1995-04-04
Publication date: 2006-08-30
Anticipated expiration: 2021-08-30
Also published as: CA2187162A1; EP0759079B1; DE69510791D1; JPH09511645A; WO1995027792A1; ATE182177T1; CA2187162C; GR3031474T3; ES2136284T3; EP0759079A1; US5552536A; DK0759079T3; US5760180A; DE69510791T2

Description

発明の背景
インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）は慢性及び急性炎症を媒介する主要物質である。ヒト単球は、ＩＬ−１βの他に、ＩＬ−１遺伝子ファミリーの別の２つの物質；インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）及びＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−ＲＡ）を産生する。３種全てのタンパク質は標的細胞上にある膜固定形態の１型及び２型ＩＬ−１レセプター（ＩＬ１Ｒ）に結合する。ＩＬ−１α及びＩＬ−１βは実質的に同一の生物学的反応を誘発するが、ＩＬ−１ＲＡはこのような作用を阻害する。ＩＬ−１α及びＩＬ−１βは共に、機能的疎水性シグナル配列の欠如した３１ｋＤａ一次翻訳産物として合成される。３１ｋＤａ形態のＩＬ−１αは更なるプロセシングなしでも十分に活性を示すが、細胞から活発に放出されるとは思えない。活性化された単球から放出される主要形態のＩＬ−１であるＩＬ−１βは不活性３１ｋＤａ前駆体（ｐＩＬ−１β）として合成され、この前駆体は、新規なシステインプロテイナーゼであるインターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）によってプロセシングされて成熟１７．５ｋＤａ形態（ｍＩＬ−１β）となる。ＩＣＥは、プロホルモンプロセシング用の単一部位であるＡｌａ₁₁₇とＡｓｐ₁₁₆との間でｐＩＬ−１βを切断することによって完全に活性なｍＩＬ−１βを生成する。この切断部位周辺の配列：−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−は、公知である全てのｐＩＬ−１βポリペプチドでは進化的に保存されている。
従来のＨＰＬＣ技術及び親和性精製技術によって示されるような活性ヒトＩＣＥは、１９，８６６Ｄａ（ｐ２０）サブユニットと１０，２４４Ｄａ（ｐ１０）サブユニットとの１：１化学量論的複合体からなるヘテロダイマーである。ＩＣＥが、１４ｋＤａプロドメイン、活性部位Ｃｙｓ₂₈₅を含むｐ２０、成熟酵素内に存在しない１９残基接続ペプチド、及び活性酵素の必須成分であるｐ１０、からなる４５ｋＤａプロ酵素（ｐ４５）として構成的に発現されることがクローン化ｃＤＮＡにより判明した。成熟サブユニットにはＡｓｐ−Ｘ配列が隣接している。上記部位の突然変異分析及び異種系での発現は活性酵素の産生が自己触媒的であることを示している。マウス及びラットＩＣＥもクローニングされ、これらは上記構造モチーフを含め高度の配列類似性を示している。
最近、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓｂｒｉｇｇｓａｅ及びＣａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓｖｕｌｇａｒｉｓの線虫細胞死異常遺伝子（ＣＥＤ−３）や、マウスニューロン前駆体細胞の胚発生でダウンレギュレートされた（ＮＥＤＤ−２）遺伝子を含むＩＣＥ様遺伝子ファミリーが明らかにされ始めた。これらの遺伝子の予想されるポリペプチド配列はそれぞれヒトＩＣＥとは２９％及び２７％の配列同一性を示す。ＣＥＤ−３とＩＣＥとの配列同一性は、成熟ヒトＩＣＥのｐ２０サブユニット及びｐ１０サブユニットに相当する領域でより高くなっている。ＩＣＥ及びＣＥＤ−３について公知の全ての配列は、ＩＣＥの触媒システインを包囲するペンタペプチド配列−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−を、ＣＥＤ−３ではそれと等価の配列を含んでいる。
ＣＥＤ−３及びマウスＩＣＥは共に、線維芽細胞系でのトランスフェクション又は神経細胞内へのマイクロインジェクションによって発現されると、プログラミングされた細胞死（アポトーシス）を生じる。ＣＥＤ−３又はＩＣＥのプロアポトーシス作用は、細胞死抑制遺伝子として機能するように思える哺乳動物の原腫瘍遺伝子（ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ）ｂｃｌ−２、又はＩＣＥのセルピン（ｓｅｒｐｉｎ）様阻害剤であるサイトカイン応答モディファイアーＡ（ｃｒｍＡ）遺伝子産物、で同時トランスフェクトすることによって阻止される。
発明の要約
ＩＣＥ_rel−III（インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIII）と称する新規なヒトチオールプロテイナーゼを単離、精製した。全長前駆体形態のＩＣＥ_rel−IIIタンパク質をコードするＤＮＡ分子を単離、精製し、ヌクレオチド配列を決定した。組換え宿主での発現のために、ＩＣＥ_rel−IIIをコードするＤＮＡをクローニングした。ＤＮＡクローンは組換え全長ＩＣＥ_rel−III及び成熟形態酵素の個々のサブユニットを産生する。組換えＩＣＥ_rel−IIIはＩＣＥ_rel−III活性のモジュレーター、従ってＩＣＥ_rel−IIIの前炎症作用又はプロアポトーシス作用に関連する病的状態のモディファイアーを同定するのに有用である。ＩＣＥ_rel−IIIアンチセンス分子はＩＣＥ_rel−IIIの前炎症作用又はプロアポトーシス作用を治療によって抑制又は排除するのに有用であり、ＩＣＥ_rel−IIIによる遺伝子移植又は遺伝子療法はＩＣＥ_rel−IIIの前炎症作用又はプロアポトーシス作用を高めるのに有用である。これらの療法は、非制限的ではあるが、（エイズのような）免疫不全症候群、自己免疫性疾患、病原性感染症、心血管及び神経障害、脱毛症、老化、ガン、パーキンソン病、アルツハイマー病を含む免疫性、増殖性及び変性疾病の治療に有益である。
【図面の簡単な説明】
図１。ヒトＩＣＥ_rel−III（ｃＤＮＡクローンＴ１７．１．１）のヌクレオチド配列、その相補的ヌクレオチド配列、及び推定されるアミノ酸配列。
図２。ヒトＩＣＥ_rel−IIIのアミノ酸配列とヒトＩＣＥのアミノ酸配列とを並置する。同一のアミノ酸は並置した配列間に垂直線を引いて示す。高度保存性アミノ酸の相違は並置した配列間に２つの点で示し、保存性アミノ酸の相違は１つの点で示す。
図３。ヒトＩＣＥ_rel−IIIのアミノ酸配列とＣａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓＣＥＤ−３のアミノ酸配列とを並置する。同一のアミノ酸は並置した配列間に垂直線を引いて示す。高度保存性アミノ酸の相違は並置した配列間に２つの点で示し、保存性アミノ酸の相違は１つの点で示す。
図４。ヒトＩＣＥ_rel−IIIのアミノ酸配列とマウスＮＥＤＤ−２のアミノ酸配列とを並置する。同一のアミノ酸は並置した配列間に垂直線を引いて示す。高度保存性アミノ酸の相違は並置した配列間に２つの点で示し、保存性アミノ酸の相違は１つの点で示す。
発明の詳細な説明
全長形態のＩＣＥ_rel−IIIをコードする相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を同定し、配列決定し、単離した。組換え宿主での発現のために、ｃＤＮＡを発現ベクター内にクローニングした。ｃＤＮＡは組換え全長ＩＣＥ_rel−IIIを産生するのに有用である。ｃＤＮＡ及びそのｃＤＮＡから誘導される組換えＩＣＥ_rel−IIIタンパク質は、抗体、診断キット、実験室試薬及びアッセイの生産に有用である。ｃＤＮＡ及び組換えＩＣＥ_rel−IIIタンパク質は、ＩＣＥ_rel−IIIの機能、炎症及び細胞アポトーシスに影響する化合物の同定のために使用される。ＩＣＥ_rel−IIIアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンス類似物質は、ＩＣＥ_rel−IIIタンパク質の発現を抑制し、かくしてＩＣＥ_rel−IIIの前炎症作用又はプロアポトーシス作用を抑制するのに臨床学的に有用である。同様に、ＩＣＥ_rel−IIIをコードする配列を使用して、ＩＣＥ_rel−IIIを標的細胞内に導入してＩＣＥ_rel−IIIの前炎症作用又はプロアポトーシス作用を高める遺伝子療法を行うことができる。
様々な細胞や細胞系がＩＣＥ_rel−III ｃＤＮＡの単離での使用に適し得る。適切な細胞は、慣用的な技術を用いて細胞抽出物又は調整培地中のＩＣＥ_rel−III活性をスクリーニングすることによって選択される。このアッセイでＩＣＥ_rel−III活性を示す細胞がＩＣＥ_rel−IIIｃＤＮＡの単離に適する。
様々な手順を使用して、ＩＣＥ_rel−III ｃＤＮＡを分子クローニングすることができる。これらの方法には、非制限的ではあるが、適切な発現ベクター系でのＩＣＥ_rel−III含有ｃＤＮＡライブラリー構築後のＩＣＥ_rel−III遺伝子の直接機能的発現が含まれる。他の方法は、バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクター内に構築されたＩＣＥ_rel−III含有ｃＤＮＡライブラリーを、ＩＣＥ_rel−IIIのアミノ酸配列から設計された標識オリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングすることである。
細胞から構築された様々なライブラリーが、ＩＣＥ_rel−IIIをコードするＤＮＡの単離に有用であり得る。適切なライブラリーは、ＩＣＥ_rel−III活性を有する細胞又は細胞系から作製される。
ｃＤＮＡライブラリーの作製は標準的な技術によって実施され得る。このようなｃＤＮＡライブラリー構築技術及び他の標準的な分子生物学的技術は例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８２）又はＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．，Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９）に記載されている。
ＩＣＥ_rel−IIIをコードするＤＮＡは適切なゲノムＤＮＡライブラリーから単離してもよい。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．等（上掲）及びＡｕｓｕｂｅｌ等（上掲）に記載されているような標準的な公知の方法によって実施され得る。
適切なプロモータ及び他の適切な転写調節要素を含む発現ベクター内への分子クローニングによってクローン化したＩＣＥ_rel−III ｃＤＮＡを原核生物又は真核生物宿主細胞に移入して組換え技術で発現させ、組換えＩＣＥ_rel−IIIを産生することができる。
本明細書では、発現ベクターは、クローン化した遺伝子コピーの転写及び適切な宿主でのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列であると定義する。このようなベクターを使用して、細菌、酵母、藍藻類、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞のような様々な宿主で真核細胞遺伝子を発現させることができる。
特別設計されたベクターによって、細菌−酵母又は細菌−動物細胞のような宿主間でのＤＮＡのシャトリングが可能となる。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞内での自律複製のための複製起源、選択可能マーカー、数の限定された有用な制限酵素部位、高コピー数のための可能な要素（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）、及び活性プロモーターを含み得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させてＲＮＡ合成を開始するよう指令するＤＮＡ配列であると定義する。強いプロモーターはｍＲＮＡを高頻度で開始させるものである。発現ベクターには、非制限的ではあるが、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特別設計されたプラスミド又はウイルスが含まれる。
様々な哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞で組換えＩＣＥ_rel−IIIを発現させることができる。組換えＩＣＥ_rel−IIIの発現に適し得る市販の哺乳動物発現ベクターには、非制限的ではあるが、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）及びＩＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）が含まれる。
ＩＣＥ_rel−IIIをコードするＤＮＡを組換え宿主細胞内での発現のために発現ベクター内にクローニングすることもできる。組換え宿主細胞は原核細胞であっても真核細胞であってもよく、これらの細胞には非制限的ではあるが、細菌、酵母、哺乳動物細胞及び昆虫細胞が含まれる。市販されている適切な哺乳動物種由来の細胞系には非制限的ではあるが、ＣＶ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ２６）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１）が含まれる。
発現ベクターは、非制限的ではあるが、形質転換、トランスフェクション、感染、プロトプラスト融合及びエレクトロポレーションを含む幾つかの技術のいずれかによって宿主細胞内に導入され得る。発現ベクターを含む細胞をクローニングによって増殖させ、個々に分析して、これらの細胞がＩＣＥ_rel−IIIタンパク質を産生するかどうかを調べる。ＩＣＥ_rel−IIIを発現する宿主細胞クローンの同定は、非制限的ではあるが、抗ＩＣＥ_rel−III抗体との免疫反応性や、宿主細胞関連ＩＣＥ_rel−III活性の存在を含む幾つかの手段によって実施され得る。
ＩＣＥ_rel−III ｃＤＮＡの発現は更に、ｉｎｖｉｔｒｏで産生された合成ｍＲＮＡを用いて実施され得る。合成ｍＲＮＡは、非制限的ではあるが、コムギ胚芽抽出物及び網状赤血球抽出物を含む種々の無細胞系で効率的に翻訳されると共に、非制限的ではあるが、カエル卵母細胞内へのマイクロインジェクションを含む細胞をベースとする系で効率的に翻訳され得る。
最適レベルの酵素活性及び／又はＩＣＥ_rel−IIIタンパク質が得られるＩＣＥ_rel−III ｃＤＮＡを調べるために、改変ＩＣＥ_rel−III ｃＤＮＡ分子を構築する。宿主細胞をｃＤＮＡ分子で形質転換し、ＩＣＥ_rel−III ＲＮＡ及びタンパク質のレベルを測定する。
宿主細胞内でのＩＣＥ_rel−IIIタンパク質の量は、免疫親和性技術及び／又はリガンド親和性技術のような様々な方法によって定量される。ＩＣＥ_rel−III特異的親和性ビーズ又はＩＣＥ_rel−III特異抗体を使用して、³⁵Ｓ−メチオニン標識した又は非標識のＩＣＥ_rel−IIIタンパク質を単離する。標識ＩＣＥ_rel−IIIタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析される。非標識ＩＣＥ_rel−IIIタンパク質は、ＩＣＥ_rel−III特異抗体を使用するウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ又はＲＩＡアッセイによって検出される。
組換え宿主細胞内でのＩＣＥ_rel−IIIの発現後に、ＩＣＥ_rel−IIIタンパク質を回収して、活性形態のＩＣＥ_rel−IIIを提供することができる。数種のＩＣＥ_rel−III精製手順が利用可能であり、使用に適している。組換えＩＣＥ_rel−IIIは、当業界で公知の分画又はクロマトグラフィーステップを個々に適用して又は様々に組み合わせて、細胞溶解物又は調整培養培地から精製することができる。
更には、発生期の全長ＩＣＥ_rel−III又はＩＣＥ_rel−IIIのポリペプチド断片に特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体を用いて作製した免疫親和性カラムを使用して、組換えＩＣＥ_rel−IIIを他の細胞タンパク質から分離することができる。
組換えタンパク質を使用して、抗体を産生してもよい。本明細書で使用する「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体並びにその断片（例えば抗原又はハプテンに結合し得るＦｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）₂断片）を包含する。
ＩＣＥ_rel−IIIに対する単一特異性抗体は、ＩＣＥ_rel−IIIと反応性の抗体を含む哺乳動物抗血清から精製されるか、又は標準的な技術を用いてＩＣＥ_rel−IIIと反応性のモノクローナル抗体として産生される。本明細書で使用する単一特異性抗体は、ＩＣＥ_rel−IIIに対して均一（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）結合特性を示す単一抗体種又は多重抗体種であると定義する。本明細書で使用する均一結合とは、抗体種が、上述したようなＩＣＥ_rel−IIIに関連する特異抗原又はエピトープに結合する能力を指す。酵素特異抗体は、免疫アジュバントを用いるか又は用いずに、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマ等のような動物、好ましくはウサギを適切な濃度のＩＣＥ_rel−IIIで免疫感作することによって産生される。
ＩＣＥ_rel−IIIに反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、近交系マウスをＩＣＥ_rel−IIIで免疫感作するような慣用的な方法によって産生され得る。約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、好ましくは約１ｍｇのＩＣＥ_rel−IIIを含む約０．５ｍｌの緩衝液又は食塩水を同一容量の許容可能なアジュバントに導入したものでマウスへの免疫感作を行う。フロイントの完全アジュバントが好ましい。０日目にマウスに初期免疫感作して、約３〜約３０週間置く。免疫感作したマウスに、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のような緩衝溶液中の約０．１〜約１０ｍｇのＩＣＥ_rel−IIIを静脈内（ＩＶ）経路から投与して、１回以上の追加免疫感作を行う。免疫感作したマウスから当業界で公知の標準的な手順で脾臓を取り出すことにより、抗体陽性マウス由来のリンパ球が得られる。安定なハイブリドーマの形成を可能にする条件下で脾臓リンパ球を適切な融合パートナーと混合するとハイブリドーマ細胞が生成される。ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）内にて当業界で公知の手順で増殖させることにより、融合ハイブリドーマ細胞を選択する。約１４日目、１８日目及び２１日目に上清液を増殖陽性ウェルから採取し、ＩＣＥ_rel−IIIを抗原として用いる固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）のようなイムノアッセイによって抗体産生をスクリーニングする。培養液もオクタロニー沈降アッセイで試験して、ｍＡｂのイソタイプを調べる。ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，ＳｏｆｔＡｇａｒＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｋｒｕｓｅ及びＰａｔｅｒｓｏｎ編，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，１９７３の軟寒天技術のような技術によって、抗体陽性ウェルのハイブリドーマ細胞をクローニングする。
十分量の特異的ｍＡｂを得るようにハイブリドーマを約２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で増殖させて抗ＩＣＥ_rel−III ｍＡｂをｉｎｖｉｔｒｏで産生する。ｍＡｂを当業界で公知の技術で精製する。
非制限的ではあるが、沈降、受動凝集、酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）技術及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）技術を含む様々な血清学的又は免疫学的アッセイによって、腹水又はハイブリドーマ培養液の抗体力価を調べる。同様のアッセイを使用して、体液又は組織や細胞抽出物中のＩＣＥ_rel−IIIの存在を検出する。
単一特異的抗体産生のための上記方法を使用して、ＩＣＥ_rel−IIIポリペプチド断片又は発生期全長ＩＣＥ_rel−IIIポリペプチドに特異的な抗体を産生することができる。
Ａｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）のようなゲル支持体に抗体を加えてＩＣＥ_rel−III抗体親和性カラムを製造する。ゲル支持体は、抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで予め活性化させる。次いで、スペーサーアームとのアミド結合により、抗体をゲルに結合する。次いで、残存する活性化エステルを１ＭエタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）でクエンチする。カラムを水、次いで０．２３ＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で洗浄して、非接合抗体又は生体外タンパク質を除去する。次いで、カラムをリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．３）で平衡化し、ＩＣＥ_rel−III又はＩＣＥ_rel−III断片を含む細胞培養上清又は細胞抽出物をカラムにゆっくりと通す。次いで、カラムを洗浄し、タンパク質を溶離させる。次いで、精製ＩＣＥ_rel−IIIタンパク質をリン酸緩衝食塩水に対して透析する。
ＩＣＥ_rel−III ｃＤＮＡ、ＩＣＥ_rel−III ＲＮＡ、ＩＣＥ_rel−IIIに対する抗体又はＩＣＥ_rel−IIIタンパク質を含むキットを製造することができる。このようなキットを使用して、ＩＣＥ_rel−III ＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡもしくはＲＮＡを検出するか、又は試料中でのＩＣＥ_rel−IIIタンパク質もしくはペプチド断片の存在を検出する。このような特性分析は、非制限的ではあるが、法廷用分析及び疫学調査を含む様々な目的に有用である。
本発明のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、組換えタンパク質及び抗体を使用して、ＩＣＥ_rel−III ＤＮＡ、ＩＣＥ_rel−III ＲＮＡ又はＩＣＥ_rel−IIIタンパク質の量をスクリーニングして、測定することができる。組換えタンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子及び抗体は、ＩＣＥ_rel−IIIの検出や型決定（ｔｙｐｉｎｇ）に適したキットを製造するのに適している。このようなキットは、少なくとも１個の容器を厳重に密閉して保持するのに適した区画化されたキャリヤーからなる。このキャリヤーは更に、ＩＣＥ_rel−IIIの検出に適した組換えＩＣＥ_rel−IIIタンパク質又は抗ＩＣＥ_rel−III抗体のような試薬を含んでいる。キャリヤーは更に、標識抗原又は酵素基質等のような検出手段を含み得る。
ＩＣＥ_rel−IIIをコードするｃＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列がアンチセンス療法のために合成され得る。これらのアンチセンス分子は、ＤＮＡ、ホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートのような安定なＤＮＡ誘導体、ＲＮＡ、２′−Ｏ−アルキルＲＮＡのような安定なＲＮＡ誘導体、又は他のＩＣＥ_rel−IIIアンチセンスオリゴヌクレオチド類似物質であり得る。ＩＣＥ_rel−IIIアンチセンス分子は、マイクロインジェクション、リポソームカプセル化、又はアンチセンス配列を有するベクターからの発現によって細胞内に導入され得る。ＩＣＥ_rel−IIIアンチセンス療法は、ＩＣＥ_rel−III活性の抑制が有益である疾病の治療に特に有用であり得る。
ＩＣＥ_rel−III遺伝子療法を使用して、標的器官の細胞内にＩＣＥ_rel−IIIを導入することができる。ＩＣＥ_rel−III遺伝子を、受容体（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）である宿主細胞の感染によってＩＣＥ_rel−III ＤＮＡの転移を媒介するウイルスベクター内に連結することができる。適切なウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス等が含まれる。或いは、リガンド−ＤＮＡ接合体又はアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ接合体を用いる受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）によって媒介されターゲッティングされるＤＮＡ転移、リポフェクション膜融合又は直接マイクロインジェクションを含む非ウイルス技術によって、ＩＣＥ_rel−III ＤＮＡを遺伝子療法のために細胞内に転移させることができる。上記手順及びその変形手順はｅｘｖｉｖｏ及びｉｎｖｉｖｏＩＣＥ_rel−III遺伝子療法に適している。ＩＣＥ_rel−III遺伝子療法は、ＩＣＥ_rel−III活性を高めることが有益である疾病の治療に特に有益であり得る。
ＩＣＥ_rel−III ＤＮＡ又はＩＣＥ_rel−IIIタンパク質を含む医薬的に有用な組成物は、医薬的に許容可能な担体の混合のような公知の方法に従って処方され得る。該担体及び処方方法の例は、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。効果的な投与に適した医薬的に許容可能な組成物を生成するために、このような組成物は有効量のタンパク質又はＤＮＡを含んでいる。
ＩＣＥ_rel−III関連疾病を治療又は診断するのに十分な量の本発明の治療用又は診断用組成物をヒトに投与する。有効量は、ヒトの症状、体重、性別及び年齢のような様々な要因によって異なり得る。他の要因としては投与方法が含まれる。
医薬組成物は、皮下、局所、経口及び筋肉内のような様々な経路により個体に投与され得る。
遺伝暗号の縮重により、特定のアミノ酸をコードするのに２種以上のコドンを使用することができる場合には、アミノ酸配列は、１組の類似ＤＮＡオリゴヌクレオチドのいずれかによってコードされ得る。この組の中で１個のメンバーだけがＩＣＥ_rel−III配列を同一であるが、ミスマッチを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの存在下でもＩＣＥ_rel−III ＤＮＡにハイブリダイズし得る。ミスマッチＤＮＡオリゴヌクレオチドは尚ＩＣＥ_rel−III ＤＮＡにハイブリダイズするので、ＩＣＥ_rel−IIIをコードするＤＮＡを同定して単離することができる。
特定の生物に由来するＩＣＥ_rel−IIIをコードするＤＮＡを使用して、他の生物に由来するＩＣＥ_rel−IIIの同族体を単離、精製することができる。これを達成するために、適切なハイブリダイゼーション条件下で、第１のＩＣＥ_rel−III ＤＮＡを、ＩＣＥ_rel−IIIの同族体をコードするＤＮＡを含む試料と混合することができる。ハイブリダイズしたＤＮＡ複合体を単離し、同種ＤＮＡをコードするＤＮＡをこの複合体から精製することができる。
特定のアミノ酸をコードするのに様々なコドンが実質量で重複（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）し得ることは公知である。従って、本発明は更に、同一のアミノ酸の任意の翻訳をコードする代替コドンを含むＤＮＡ配列に関する。本明細書の目的のために、１個以上の代替コドンを有する配列は縮重変種であると定義する。発現タンパク質の最終的な物理的特性を実質的に変化させないＤＮＡ配列又は被翻訳タンパク質での突然変異も本発明の範囲に包含される。例えば、ロイシンをバリン、リシンをアルギニン又はグルタミンをアスパラギンに置換しても、ポリペプチドの機能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）は変化し得ない。
天然ペプチドとは異なる特性を有するペプチドをコードするように、ペプチドをコードするＤＮＡ配列を変化させることができることは公知である。ＤＮＡ配列を変える方法には、非制限的ではあるが、特定部位の突然変異誘発が含まれる。変化する特性の例には、非制限的ではあるが、酵素の基質に対する親和性の変化が含まれる。
本明細書で使用するＩＣＥ_rel−IIIの「機能的誘導体」は、ＩＣＥ_rel−IIIの生物活性と実質的に同様の（機能的又は構造的な）生物活性を有する化合物である。「機能的誘導体」という用語は、ＩＣＥ_rel−IIIの「断片」、「変異体」、「縮重変異体」、「類似体」及び「同族体」又は「化学的誘導体」を包含するものとする。「断片」という用語はＩＣＥ_rel−IIIの任意のポリペプチドサブセットを指す。「変異体」という用語は、構造及び機能が全ＩＣＥ_rel−III分子又はその断片と実質的に同様である分子を指す。ある分子とＩＣＥ_rel−IIIとが実質的に同様の構造を有するか又は同様の生物活性を有するならば、この分子はＩＣＥ_rel−IIIと「実質的に同様」である。従って、これら２個の分子が実質的に同様の活性を有するならば、一方の分子の構造が他方の分子になくても又は２個のアミノ酸配列が同一でなくても変異体であるとみなされる。
「類似体」という用語は、機能が全ＩＣＥ_rel−III分子又はその断片と実質的に同様である分子を指す。
「化学的誘導体」という用語は、通常は基本分子の一部分ではない付加的な化学的部分を含んでいる分子を示す。このような分子は、基本分子の溶解性、半減期、吸収等を改善させ得る。或いは、この化学的部分は、基本分子の望ましくない副作用を抑制するか又は基本分子の毒性を低下させ得る。このような部分の例はＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓのような様々な文献に記載されている。
本発明は更に、ＩＣＥ_rel−IIIをコードするＤＮＡ又はＲＮＡの発現及びＩＣＥ_rel−IIIタンパク質の機能をｉｎｖｉｖｏで調節する化合物のスクリーニング方法に関する。このような活性を調節する化合物はＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質又は非タンパク性有機分子であり得る。化合物は、ＩＣＥ_rel−IIIをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現又はＩＣＥ_rel−IIIタンパク質の機能を増大させるか又は低下させることによって調整され得る。ＩＣＥ_rel−IIIをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡの発現又はＩＣＥ_rel−IIIタンパク質の機能を調節する化合物は、様々なアッセイによって検出され得る。このアッセイは、発現又は機能に変化があるかどうかを調べる単純な「イエス／ノー」アッセイであり得る。試験試料の発現又は機能は標準試料の発現又は機能のレベルと比較することによって、アッセイを定量的にすることができる。
以下の実施例で本発明を非制限的に説明する。
実施例１
ＩＣＥ _rel −IIIの分子クローニング
「³²Ｐ」標識合成オリゴヌクレオチドプローブ：
（５’）ＡＧＧＣＣＡＣＴＴＣＣＡＡＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡ（３’）；配列番号１、一方のレプリカフィルター用、及び
（５’）ＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＴＣＡＴＡＡＡＧＣＡＧＣ（３’）；配列番号２、他方のレプリカフィルター用
を用いてバクテリオファージλｇｔ１０内のＴＨＰ１細胞（急性単球白血病細胞系；ＡＴＣＣＴＩＢ２０２）ｃＤＮＡライブラリーをレプリカ−フィルタースクリーニングすることによりＩＣＥ_rel−IIIの全長ｃＤＮＡクローンを同定した。
同定された最大クローンＴ１７．１．１は１４１４ｂｐであった。大腸菌を含むアガロースプレート上で培養してｌバクテリオファージを増殖させた後にクローンをｌｇｔ１０から回収し、次いでポリエチレングリコール沈殿、多孔質（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）シリカゲルクロマトグラフィー及びアルコール沈殿を組み合わせてｌバクテリオファージＤＮＡを精製した。Ｔ１７．１．１ＤＮＡ断片を部分ＥｃｏＲＩ制限消化によって切り出し（Ｔ１７．１．１配列の内部ＥｃｏＲＩ部位のために部分消化が必要であった）、その後１．４Ｋｂ断片をアガロースゲルで精製し、次いで精製した断片をプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＩ部位に連結した。コンピテント大腸菌細胞内に形質転換し、コロニーを精製し、得られた形質転換細胞を液体培養物中で増殖させた後にプラスミドＤＮＡを精製し、クローンＴ１７．１．１インサートのヌクレオチド配列をジデオキシＤＮＡ配列決定法により調べた。
ＩＣＥ_rel−III（クローンＴ１７．１．１）の完全ｃＤＮＡ配列及び対応するアミノ酸配列を図１に示す。ＩＣＥ_rel−IIIクローンＴ１７．１．１の最長読み取り枠（塩基３５〜１２８８）は、ヒトインターロイキン−１β変換酵素とは５１％の配列同一性（６５％の配列類似性）を示し（図２）、ＣａｅｎｏｒｈａｂｉｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓＣＥＤ−３ポリペプチドとは２４％の配列同一性（４９％の配列類似性）を示し（図３）、マウスＮＥＤＤ−２ポリペプチドとは２４％の配列同一性（４５％の配列類似性）を示す（図４）４７．７ｋＤａポリペプチドをコードする。触媒システイン残基（ＩＣＥ_rel−IIIのＣｙｓ₂₉₉、ヒトインターロイキン−１β変換酵素のＣｙｓ₂₈₅、ＣＥＤ−３のＣｙｓ₃₅₈）及びポリペプチド全体の他の構造モチーフ周辺では配列がとりわけ高度に保存されており、これはＩＣＥ_rel−IIIがチオールプロテイナーゼであることに対応している。
実施例２
ＩＣＥ _rel −III ｃＤＮＡの発現ベクター内へのサブクローニング
トランスフェクトした宿主細胞でのＩＣＥ_rel−IIIタンパク質の発現及びｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳のために、ＩＣＥ_rel−IIIをコードするｃＤＮＡを数個のベクター内にサブクローニングした。これらのベクターには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋（発現はＴ７又はＴ３プロモーターによって駆動される）、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（発現はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動される）、ｐＳＺ９０１６−１（発現はＨＩＶ末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターによって駆動される）、及びＩＣＥ_rel−IIIをコードするＤＮＡ配列を含む組換えバキュロウイルスを生成するためのバキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ１３９３（発現はポリヘドリン（ＰＨ）プロモーターによって駆動される）が含まれる。ＩＣＥ_rel−IIIの推定される／実際のアミノ酸配列を図１に示す。
ａ）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋：ＩＣＥ _rel −III。制限ＥｃｏＲＩ消化によってλバクテリオファージから全長ＩＣＥ_rel−III ｃＤＮＡクローンを回収し、ＥｃｏＲＩ切断しＣＩＰ処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋に連結した。ＩＣＥ_rel−IIIのセンスオリエンテーションがＴ７又はＴ３プロモーターの後に来る個々のサブクローンを回収した。
ｂ）ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ：ＩＣＥ _rel −III。ダイレクショナル（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）クローニングを容易にするために、ＩＣＥ_rel−III ＤＮＡ配列がＴ７プロモーターの下流にあるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋：ＩＣＥ_rel−IIIの精製プラスミド調製物からＩＣＥ_rel−IIIをＥｃｏＲＶ及びＸｂａＩを用いて切り出した。得られたＥｃｏＲＶ，ＸｂａＩＩＣＥ_rel−III断片を精製し、ＥｃｏＲＶ切断しＸｂａＩ切断しＣＩＰ処理したｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐに連結して、ＩＣＥ_rel−IIIをコードするＤＮＡをＣＭＶプロモーターの下流にした。
ｃ）ｐＳＺ９０１６−１：ＩＣＥ _rel −III。制限ＥｃｏＲＩ消化によりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋：ＩＣＥ_rel−IIIからＩＣＥ_rel−IIIを切り出し、次いで１．３Ｋｂ断片をアガロースゲルから精製した。得られたＥｃｏＲＩＩＣＥ_rel−III断片を、ＥｃｏＲＩ断片しＣＩＰ処理したｐＳＺ９０１６−１に連結した。ＩＣＥ_rel−IIIのセンスオリエンテーションがＨＩＶＬＴＲプロモーターの下流にあるサブクローンを選択した。
ｄ）ｐＶＬ１３９３：ＩＣＥ _rel −III及びｐＶＬ１３９３：Ｔ７ＩＣＥ _rel −III ＨＡ。ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩを用いてｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ：ＩＣＥ_rel−IIIからＩＣＥ_rel−IIIを切り出し、次いで得られた１．３Ｋｂ断片を、ＢａｍＨＩ切断しＸｂａＩ切断しＣＩＰ処理したｐＶＬ１３９３内に連結してｐＶＬ１３９３：ＩＣＥ_rel−IIIを生成することによって、ＩＣＥ_rel−IIIをコードするＤＮＡの、バキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ１３９３内へのダイレクショナルクローニングを媒介した。同様に、ＩＣＥ_rel−III読み取り枠の５’アミノ末端にＴ７タグを、３’カルボキシ末端にＦｌｕＨＡエピトープを作製することにより、ＩＣＥ_rel−IIIをエピトープタグ化（ｅｐｉｔｏｐｅｔａｇｇｅｄ）した。このようにして改変させたＩＣＥ_rel−III ＤＮＡをｐＶＬ１３９３のＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ部位に連結して、ｐＶＬ１３９３：Ｔ７ＩＣＥ_rel−III ＨＡを生成した。
実施例３
ＩｎＶｉｔｒｏ転写／翻訳及び宿主細胞内へのトランスフェクションによるＩＣＥ _rel −IIIポリペプチドの発現
ＩＣＥ_rel−IIをコードするＤＮＡ配列を含むベクターを使用して、ウサギ網状赤血球溶解物、哺乳動物宿主細胞及びバキュロウイルス感染昆虫細胞でＩＣＥ_rel−IIIポリペプチドの翻訳を駆動した。実験手順は本質的に製造業者の指示書に記載されている通りであった。
ａ）ＩｎＶｉｔｒｏ転写／翻訳。ＩＣＥ_rel−IIIインサート下流でのＢａｍＨＩ消化によって、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ IIIＳＫ＋：ＩＣＥ_rel−IIIプラスミドＤＮＡ（Ｔ７の配向にＩＣＥ_rel−IIIを含む）を線状化した。線状化したプラスミドを精製し、これを、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇの存在下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いるランオフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）転写用の鋳型として使用した。得られたキャップされたＩＣＥ_rel−III転写体をＬｉＣｌ沈殿により精製し、これを使用してＬ−［³⁵Ｓ］メチオニンの存在下、ヌクレアーゼ前処理したウサギ網状赤血球溶解物中でＩＣＥ_rel−IIIの翻訳を駆動した。得られた翻訳混合物は、見掛け分子量が４５±２ｋＤａでＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル上を移動する放射性標識ＩＣＥ_rel−IIIタンパク質を含んでいた。
ｂ）哺乳動物細胞での発現。ＩＣＥ_rel−IIIタンパク質を、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ：ＩＣＥ_rel−III（ＣＭＶプロモーターの制御下）又はｐＳＺ９０１６−１：ＩＣＥ_rel−III（ＨＩＶＬＴＲプロモーターの制御下）でトランスフェクトした後の哺乳動物宿主細胞で発現させた。後者（ｐＳＺ９０１６−１：ＩＣＥ_rel−III）の場合、細胞を、ＴＡＴを発現するプラスミドｐＳＺ９０１６１：ＴＡＴで同時トランスフェクトした。いずれのＩＣＥ_rel−III発現プラスミドの場合も、ＤＥＡＥ−デキストラン又はリポフェクタミン（ＢＲＬ）によるリポフェクションを用いてＣＯＳ−７細胞をトランスフェクトした。
ｃ）昆虫細胞での発現。ＩＣＥ_rel−IIIを含むバキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ１３９３：Ｔ７ＩＣＥ_rel−III ＨＡを使用して、ｉｎｖｉｖｏ相同的組換えによって組換えバキュロウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）を生成した。次いで、エピトープタグ化したＩＣＥ_rel−IIIを、ＩＣＥ_rel−IIIを含む組換えバキュロウイルスに感染させた後に混濁培養物中で増殖させたＳｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）昆虫細胞で発現させた。
実施例４
他の宿主細胞系でのＩＣＥ _rel −IIIポリペプチドの発現のためのＩＣＥ _rel −IIIのクローニング
ａ）ＩＣＥ _rel −III ｃＤＮＡの細菌発現ベクター内へのクローニング。異種タンパク質の発現を指令するように設計された発現ベクター内に最適なＩＣＥ_rel−III ｃＤＮＡ配列を挿入した後に、大腸菌のような細菌で組換えＩＣＥ_rel−IIIを産生する。上記ベクターは、組換えＩＣＥ_rel−IIIが単独で又はその後の操作のための融合タンパク質として合成されるように構築され得る。同様に、発現は、組換えＩＣＥ_rel−IIIが可溶性タンパク質として又は不溶性封入体内で回収されるように制御され得る。ｐＢＲ３２２、ｐＳＫＦ、ｐＵＲ、ｐＡＴＨ、ｐＧＥＸ、ｐＴ７−５、ｐＴ７−６、ｐＴ７−７、ｐＥＴ、ｐＩＢＩ（ＩＢＩ）、ｐＳＰ６／Ｔ７−１９（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＴＺ１８Ｒ、ｐＴＺ１９Ｒ（ＵＳＢ）、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）等のようなベクターが上記目的に適している。
ｂ）ＩＣＥ _rel −III ｃＤＮＡの酵母発現ベクター内へのクローニング
異種タンパク質の細胞内又は細胞外発現を指令するように設計された発現ベクター内に最適なＩＣＥ_rel−III ｃＤＮＡシストロンを挿入した後に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母で組換えＩＣＥ_rel−IIIを産生する。細胞内発現の場合、ＥｍＢＬｙｅｘ４等のようなベクターをＩＣＥ_rel−IIIシストロンに連結する［Ｒｉｎａｓ，Ｕ．等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：５４３−５４５（１９９０）；ＨｏｒｏｗｉｔｚＢ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：４１８９−４１９２（１９８９）］。細胞外発現の場合は、分泌シグナル（酵母又は哺乳動物ペプチド）をＩＣＥ_rel−IIIタンパク質のアミノ末端に融合する酵母発現ベクター内にＩＣＥ_rel−IIIシストロンを連結する［Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，Ｇｅｎｅ８５：５１１−５１６（１９８９）；ＲｉｅｔｔＬ．及びＢｅｌｌｏｎＮ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２９４１−２９４９（１９８９）］。
ｃ）ＩＣＥ _rel −III ｃＤＮＡのウイルス発現ベクター内へのクローニング
ＨｅＬａＳ３細胞のような哺乳動物宿主細胞をＩＣＥ_rel−III ｃＤＮＡ配列を含むワクシニアウイルスに感染させると、組換えＩＣＥ_rel−IIIが産生される。ＩＣＥ_rel−III：ワクシニアウイルスを生成するためにまず、ＩＣＥ_rel−III ｃＤＮＡをｐＣＳ１１、ｐＴＫｇｐｔＦ１ｓ、ｐＭＪ６０１のような転移ベクター又は他の適切なベクターに連結し、次いで相同的組換えによってワクシニアウイルスに転移させる。プラークを精製し、ウイルスを増幅させた後に、ＩＣＥ_rel−III：ワクシニアウイルスを使用して哺乳動物宿主細胞に感染させ、組換えＩＣＥ_rel−IIIタンパク質を産生する。
実施例５
インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIIポリペプチドの製造方法：
組換えＩＣＥ_rel−IIIは、
ａ）宿主細胞をＩＣＥ_rel−IIIタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換して組換え宿主細胞を生成し、
ｂ）インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIIの生成を可能とする条件下で組換え宿主細胞を培養し、
ｃ）インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIIを回収する
ことによって産生される。
組換えインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIIを標準的な方法で精製して、特性分析する。
実施例６
インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIII活性に影響を及ぼす化合物を様々な方法で検出することができる。インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIIに影響を及ぼす化合物の同定方法は、
（ａ）試験化合物をインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIII含有溶液と混合して、混合物を生成し、
（ｂ）混合物中のインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIII活性を測定し、
（ｃ）混合物中のインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIII活性を標準と比較する
ことからなる。
インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIII活性に影響を及ぼす化合物を配合して医薬組成物とすることができる。このような医薬組成物は、インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIII活性の変化を特徴とする疾病又は症状の治療に有用であり得る。インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIII活性が増加する疾病の例としては、免疫不全症候群、病原性感染症、心血管及び神経障害、脱毛症、老化、パーキンソン病及びアルツハイマー病が含まれる。このような疾病の治療は、インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIII活性を低下させる化合物による治療からなる。インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIII活性が低下する疾病の例としては、自己免疫性疾患、白血病、リンパ腫、及びインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIII活性が低下する他のガンが含まれる。このような疾病の治療は、インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIII活性を増加させる化合物による治療からなる。
実施例７
インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIIをコードするＤＮＡと構造的に関連するＤＮＡはプローブによって検出される。適切なプローブは、図１のヌクレオチド配列の全てもしくは一部分を有するＤＮＡ、図１のヌクレオチド配列の全てもしくは一部分を有するＤＮＡによってコードされるＲＮＡ、図１のアミノ酸配列の一部分に由来する縮重オリゴヌクレオチド、又はインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIIに対する抗体から誘導され得る。
実施例８
インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIIをコードするＤＮＡもしくはＲＮＡ、又はインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIIの検出や特性分析に有用なキットは慣用的な方法によって製造される。キットは、インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIIをコードするＤＮＡ、組換えインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIII、インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIIをコードするＤＮＡに対応するＲＮＡ、又はインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIIに対する抗体を含み得る。このキットを使用して、法廷用試料及び疫学試料のような試験試料の特性を分析することができる。
実施例９
ヒトＩＣＥ _rel −III遺伝子を用いた他のＩＣＥ _rel −III遺伝子のクローニング
ＩＣＥ_rel−III遺伝子の部分に相当するＤＮＡを、他の生物から単離したゲノムＤＮＡとクロスハイブリダイズすると、親生物から同種遺伝子をクローニングすることができる。このために、慣用的な方法に従って、サルのような他の霊長類に由来するゲノムライブラリーをゲノムＤＮＡから構築する。例えばＥＭＢＬベクターを用いてＥＭＢＬゲノムライブラリーを作製し、平板培養し、³²Ｐ標識ＤＮＡプローブによるハイブリダイゼーションでスクリーニングする。陽性プラークを選択し、精製した交差反応プラークが選択されるまで更なるスクリーニングを行う。制限マッピング、サザンハイブリダーゼーション及びＤＮＡ配列決定のような物理学的方法によって、陽性クローン内に含まれるＤＮＡを更に特性分析する。
例えば、ストリンジェンシィの低い条件下で、適切な試料をインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIIをコードする核酸でハイブリダイズすることによって、上記動物に由来する機能的インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIIをコードする精製核酸を単離することができる。
実施例１０
突然変異を起こしたＩＣＥ _rel −IIIの使用
標準的な方法を用いてＩＣＥ_rel−IIIをコードするＤＮＡを突然変異させて、改変ＩＣＥ_rel−III遺伝子を産生する。宿主細胞を改変ＩＣＥ_rel−IIIで形質転換して、改変ＩＣＥ_rel−IIIタンパク質を産生する。改変ＩＣＥ_rel−IIIタンパク質を単離、精製し、これを使用して、ＩＣＥ_rel−IIIタンパク質の機能特性を分析することができる。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：２３塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列

配列番号：２
配列の長さ：２５塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列

配列番号：３
配列の長さ：１４１４塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列

配列番号：４
配列の長さ：４１８アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列

Claims

アミノ酸配列：

を有する単離、精製されたインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIII、或いは配列番号４に表されるアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加を有する配列から成り且つインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIII活性を示すその類似体。
請求項１に記載のインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIII又は請求項１に記載の前記類似体をコードする単離ＤＮＡ。
ヌクレオチド配列：

を有する請求項２に記載の単離ＤＮＡ。
請求項２に記載の単離ＤＮＡ又はその相補体によってコードされる単離ＲＮＡ。
請求項２に記載の単離ＤＮＡを含む発現ベクター。
請求項５に記載の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
組換えインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIIポリペプチドの製造方法であって、
ａ）宿主細胞を請求項２に記載のＤＮＡで形質転換して組換え宿主細胞を生成し、
ｂ）インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIIの生成を可能とする条件下で組換え宿主細胞を培養し、
ｃ）組換えインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIIを回収する
ことからなる前記方法。
請求項７に記載の方法によって製造される組換えインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIII。
インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIIを調節する化合物の同定方法であって、
（ａ）試験化合物を請求項１に記載のインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIII又は請求項１に記載の前記類似体含有溶液と混合して、混合物を生成し、
（ｂ）混合物中のインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIII活性を測定し、
（ｃ）混合物中のインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIII活性を標準と比較する
ことからなる前記方法。
請求項２に記載の組換えインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIIをコードする単離ＤＮＡを含む、試料中のインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIIをコードするＤＮＡ又はＲＮＡを検出するためのキット。
請求項１に記載のインターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIIと免疫反応性の抗体。
インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIIをコードするＤＮＡを同定するためのプローブであって、
ａ）配列番号３のヌクレオチド配列の全て又は一部分を有するＤＮＡ；
ｂ）ａ）のＤＮＡによってコードされるＲＮＡ；及び
ｃ）配列番号４のアミノ酸配列の一部分に由来する縮重オリゴヌクレオチドからなる群の中から選択される前記プローブ。
インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIIタンパク質をコードするＤＮＡの単離方法であって、
（ａ）請求項２に記載のＤＮＡを、インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIIIをコードするＤＮＡを含む試料にハイブリダイズして、複合体を生成し、
（ｂ）この複合体を精製する
ことを含む前記方法。
インターロイキン−１β変換酵素関連システインプロテイナーゼIII活性を変化させるために使用する請求項２に記載のＤＮＡ。