CN101906438B - 一种重组人凝血因子ⅶ在动物细胞内的表达和生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组人凝血因子VII在动物细胞内的表达和生产方法，具体地，本发明提供了可用于在动物细胞内表达外源蛋白的表达载体，它含有表达外源蛋白的表达盒，所述的表达盒从5’至3’依次具有以下元件：(a)第一启动子；(b)多克隆位点以及任选的外源蛋白的编码序列；(c)第一polyA序列；(d)第二启动子；(e)选择标记基因；和(f)第二polyA信号序列。本发明的表达载体特别适合在动物细胞中高效表达FVII。

Description

一种重组人凝血因子Ⅶ在动物细胞内的表达和生产方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明涉及一种重组人凝血因子VII在动物细胞内的表达和生产方法。本发明还提供了特别适合在动物细胞中高效表达FVII的表达载体。

背景技术

凝血因子VII(FVII)是一个维生素K依赖性的具有丝氨酸蛋白水解酶作用的酶原，它主要在肝脏中合成。血浆中的大部分FVII是单链无活性的酶原，浓度为0.5ug/ml(10nmol/l)的浓度。血浆中具有痕量的活化FVIIa，浓度为10-110pmol/l。

在血管受损后，组织因子(TF)暴露，FVII或活化FVII(FVIIa)能与TF形成复合物，并在FXa、凝血酶等作用下，在FVII链的精氨酸152和异亮氨酸153位点处裂解成双链而被活化。原丙氨酸1～精氨酸152位的残基组成FVIIa的轻链，分子量为20kD；异亮氨酸153～脯氨酸406位的残基组成FVIIa的重链，分子量为30kD。轻链和重链由一个二硫键连接(135和262位半胱氨酸间的二硫键)。

自凝血瀑布学说提出以来，FVII一直被看作外源性凝血途径的起始酶。在钙离子、磷脂存在的条件下，FVIIa可与组织因子(TF)结合形成复合物(FVIIa-TF)，并将FX活化为FXa。随即相继激活凝血酶原和纤维蛋白原，导致血凝块形成。

以后的研究还发现FVIIa-TF可激活FIX。大量的研究结果证明FVIIa激活FIX的途径与激活FX的途径具有同等重要的意义。FVIIa除通过活化FX启动凝血瀑布外，还通过活化FIX放大凝血的酶促反应。从而在血凝块生成的内、外途径中均扮演了必不可少的角色。

传统的血源性FVIIa因含量低，并有传播血液传染病的危险，从而迫使人们转向基因重组产品。重组凝血因子VIIa(rFVIIa)在1999年由美国FDA批准上市，用于治疗血友病及伴有抑制物患者的出血治疗。此后rFVIIa被证明能增加已被激活的血小板上凝血酶的生成，可用于血小板减少症及血小板功能障碍患者出血时的治疗。rFVIIa也被证实可以成功地用于治疗手术时的急性出血情况。因此rFVIIa在临床止血方面的应用越来越受到人们的重视。

为了治疗患有威胁生命的凝血系统缺陷病人以及手术期大量失血的患者，人们需要开发出低成本的治疗性重组FVII。

虽然目前已发展了多种蛋白质表达系统来生产生物体的外源蛋白，比如大肠埃希氏菌表达系统，酵母表达系统，高等真核细胞表达系统等，但这些系统仍存在某些有待改进的缺陷。如何应用这些新的表达系统来高效表达所需目的基因，也是本领域中急需摸索和研究的问题。

例如大肠杆菌作为宿主可表达多种蛋白，但是其存在(1)缺少真核生物的蛋白翻译后的修饰和加工，如剪切、糖基化、形成二硫键等；(2)表达的蛋白多形成不溶性包涵体，需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性；(3)菌体蛋白较不利于纯化等缺点。

而酿酒酵母系统也具有局限性：(1)产量通常较低；(2)表达质粒易于丢失；(3)缺乏强有力的受严格调控的启动子；(4)外源蛋白过度糖基化修饰会严重的改变蛋白质的免疫原性、降低活性、缩短滞留时间；(5)分泌效率差，纯化困难。

综上所述，目前人类的糖基化蛋白质在动物细胞中表达存在表达量较低、生产成本高，或在细菌中表达时活性较低的技术难点。因此，本领域迫切需要开发一种在动物细胞中高效表达人类糖基化蛋白(尤其是FVII)的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种在动物细胞中高效表达人类糖基化蛋白(尤其是FVII)的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种可用于在动物细胞内表达外源蛋白的表达载体，其特征在于，所述的载体含有表达外源蛋白的表达盒，所述的表达盒从5’至3’依次具有以下元件：

(a)第一启动子，所述的第一启动子选自：CMV启动子；

(b)多克隆位点以及任选的位于多克隆位点之中、之前或之后的外源蛋白的编码序列；

(c)第一polyA序列，所述的第一polyA序列选自：牛生长因子polyA(bovine growth factor hormone polyA)；

(d)第二启动子，所述的第二启动子选自：SV40早期启动子；

(e)选择标记基因，所述的选择标记基因选自：Neo(R)基因；和

(f)第二polyA信号序列，所述的第二polyA信号序列选自：SV40 polyA信号序列。

在另一优选例中，所述的表达载体还含有增强子。

在另一优选例中，所示的表达载体在元件(a)和(b)之间还具有用于mRNA测序的T7启动子序列。

在另一优选例中，所述的增强子位于外源蛋白的编码序列的上游。

在另一优选例中，所述的外源蛋白的编码序列和所述选择标记基因含有起始密码子ATG和终止密码子。

在另一优选例中，所述的外源蛋白选自下组：促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子、垂体肽激素、绝经期促性腺激素、胰岛素样生长因子(如生长调节素-C)、角化细胞生长因子、神经胶质细胞系产生的神经营养因子、血栓调节蛋白、碱性纤维母细胞生长因子、胰岛素、因子VII、因子VIII、生长激素、骨形态形成蛋白-2、血小板产生的生长因子、水蛭素、及它们突变蛋白、片段、可溶性形式、功能性衍生物、融合蛋白。

在另一优选例中，所述的外源蛋白是凝血因子VII。

在另一优选例中，所述的凝血因子VII来源于人。

在另一优选例中，所述的凝血因子VII具有天然序列、变异序列或重组序列。更佳地，所述的凝血因子VII具有SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列

在另一优选例中，所述的抗性基因选自：腺苷脱氨酶(ADA)、新霉素(neo)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素B磷酸转移酶(HPH)、胸苷激酶(tk)、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)、多重耐药基因(MDR)、鸟氨酸脱羧酶(ODC)和N-(磷酸乙酰)-L-天冬氨酸抗性(CAD)、或嘌呤霉素-乙酰转移酶(PAC)

在另一优选例中，所述的标记基因是新霉素抗性基因(Neo)。

在另一优选例中，所述的标记基因具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的载体还含有用于在大肠杆菌中扩增载体的复制起点(pUC)、以及用于在大肠杆菌中进行筛选的另一筛选基因。其中，所述的筛选基因、所述的标记基因和所述的编码外源蛋白的基因各不相同。

在另一优选例中，所述的表达载体是包含序列如SEQ ID NO：1所示外源蛋白编码序列和序列如SEQ ID NO：2所示的标记基因的表达载体(pSA/FVII)。

在本发明的第二方面，提供了由本发明第一方面中任一所述的表达载体所转化的宿主细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞是动物细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞选自幼仓鼠肾细胞(BHK)和人胚胎肾细胞(HEK)。

在另一优选例中，所述的宿主细胞中具有3-20个所述的表达载体、3-20个所述的表达盒、或、3-20个拷贝的所述外源基因的编码序列。

在另一优选例中，所述的宿主细胞表达外源蛋白的速度≥1.5pg/细胞/天，较佳地≥2.0pg/细胞/天，更佳地≥3.0pg/细胞/天，更佳地≥4.0pg/细胞/天，≥5.0pg/细胞/天。

在本发明的第三方面，提供了一种制备外源蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括：

(a)培养本发明第二方面中所述的宿主细胞，从而表达所述的外源蛋白；

(b)分离出表达的所述的外源蛋白。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。例如，就某一大范围(如10-100)的上限可以与另一优选的较小范围(如20-80)的下限20进行组合，从而构成另一范围(例如20-100)，反之亦然。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1：pSA载体和pSA/FVII载体构建过程示意图。

其中，各元件如下：

元件	功能
		pCMV(CMV启动子)	转录起始
pT7(T7启动子)	体外mRNA测序起始
		MCS(多克隆酶切位点)	克隆目的基因所用
BGH PolyA(牛生长因子polyA位点)	转录终止和转录后RNA加工信号
		SV40早期启动子	启动Neo(R)选择标记基因的表达
Neo(R)基因	用于细胞株筛选的选择标记基因
		pUC	在大肠杆菌中扩增载体的复制起点

图2：pSA/FVII酶切图谱。

图3：pSA/FVII转化动物细胞所得高表达细胞株的免疫活性结果，后者采用的抗体是鼠源抗人FVII的单克隆抗体。

具体实施方式

在重组蛋白表达领域，要获得高表达量的表达载体更是取决于众多因素。例如所采用的表达方式有关、所采用的表达盒中的各元件、各元件的组合位置、基因拷贝数等。

本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了将待表达的外源基因与一抗性的标记基因偶联(或配对连接)，从而构成一“偶联的”、整体性的双基因表达盒。在该表达盒中，外源基因的翻译和标记基因(如Neo)的翻译是相对独立，但又有联系。在宿主细胞的培养(或筛选)条件下，标记基因的表达是为了保证外源基因的表达，从而使外源基因随选择标记基因拷贝数在基因扩增过程中的增加而增加，从而获得高表达外源蛋白的细胞株。在此基础上完成了本发明。

外源蛋白

如本文所用，术语“外源蛋白的编码序列”、“异源编码序列”、“异源基因序列”、“异源基因”、“重组基因”、“感兴趣的基因”、“目的基因”和“转基因”可互换使用。这些术语用于DNA序列时指编码重组或异源基因产物的DNA序列。所述异源基因序列在宿主细胞中天然不存在而且来自不同种的生物。可使本发明的重组或异源基因产物在哺乳动物细胞中表达和大量收集。所述基因产物可以是肽或多肽，可以是任何感兴趣的蛋白质，如治疗蛋白质(如白介素)或酶或多聚蛋白质的亚单元(如抗体或其片段)。所述重组产物的基因可包含信号序列，其编码的信号肽可使宿主生产细胞表达的多肽分泌出来的。在本发明的进一步优选的实施方式中，产物蛋白是为分泌蛋白质。

代表性的外源蛋白包括(但并不限于)：促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子、垂体肽激素、绝经期促性腺激素、胰岛素样生长因子(如生长调节素-C)、角化细胞生长因子、神经胶质细胞系产生的神经营养因子、血栓调节蛋白、碱性纤维母细胞生长因子、胰岛素、因子VII、因子VIII、生长激素、骨形态形成蛋白-2、血小板产生的生长因子、水蛭素、及它们突变蛋白、片段、可溶性形式、功能性衍生物、融合蛋白。

一种特别优选外源蛋白是凝血因子VII，例如氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的凝血因子VII。

如本文所用，术语“人凝血因子VII基因”、“FVII基因”可互换使用，均指包含本发明SEQ ID NO：1所示的序列或GenBank号NM_019616所示的序列，且可表达产生本发明的人凝血因子VII的核苷酸序列。该术语还包括FVII基因的天然序列、变异序列或重组序列。

在本发明的一个实施方式中，可通过常规分子生物学方法获得所述的外源基因(例如人凝血因子VII基因)，所述方法可按照常规条件如Sambrook等人，《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行，或者按照CN200710045279.5中所述的方法进行。

其他元件

在本发明中，可使用的标记基因没有特别限制，代表性的标记基因选自下组：二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性基因。

在本发明中，可使用的启动子(包括第一启动子和第二启动子)没有特别限制，代表性的启动子选自(但并不限于)：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。特别优选的第一启动子是CMV启动子。

在本发明中，可以选用各种常规的多克隆位点(MCS)，以便插入外源蛋白的编码序列。当然，插入的外源蛋白的编码序列可以位于在多克隆位点之中、之前或之后。

在本发明中，可使用的polyA序列(包括第一polyA序列和第二polyA序列)没有特别限制，代表性的polyA序列选自(但并不限于)：牛生长因子polyA(bovine growth factor hormone polyA)，SV40早期启动子。

优选的第一polyA序列是牛生长因子polyA。

另外，第二启动子宜与第二polyA序列来源于同一物种，或来源于同一基因，例如当第二启动子是SV40早期启动子，则第二polyA序列为SV40 polyA信号序列；

如本文所用，术语“间隔序列”指位于各元件之间的起到间隔作用的序列。在本发明中，优选地，间隔序列位于元件外源蛋白的编码序列和SV40启动子之间。间隔序列可以源自天然序列或人工合成的序列。源自天然序列的间隔序列的例子是基因的非翻译区，代表性的例子包括：Histone H3.3 putativetranscription pause site的非翻译区，和脑心肌炎病毒(EncephaloMycardiatis Virus，EMCV)的5’非翻译区等。

本发明的外源基因以及其他元件(如启动子、标记基因、polyA序列、间隔序列)的核苷酸全长序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。以外源基因为例，对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列片段。然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、酵母质粒、植物细胞病毒、或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。

通常，将获得的用于构成本发明表达盒的各元件，按正确的顺序连接在一起，就可形成本发明的表达盒。然后，将本发明的表达盒插入常规的或市售的表达载体，即可形成本发明的表达载体。

本发明的适合在动物细胞中高效表达人类糖基化蛋白(尤其是FVII)的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。优选的宿主细胞是肝细胞、肾细胞、CHO。更佳地，宿主细胞是肾细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

哺乳动物细胞系的合适培养液和培养方法是本领域熟知的，例如可见US5,633,162中的描述。用于实验室烧瓶培养或低密度细胞培养可满足特定类型细胞需要的标准细胞培养液的例子包括但不限于：Roswell Park MemorialInstitute(RPMI)1640培养液(Morre，G，The journal of the American MedicalAssociation，199：519，1967)、L-15培养液(Leibovitz，A等，Amer.J.ofHygiene，78：173，1963)、Dulbecco改良Eagle培养液、Eagle最简单基础培养液(Eagle’s minimal essential medium，MEM)、Ham F12培养液(Ham，R等，Proc.Natl.Acad.Sc.53：288，1965)或缺少白蛋白、运铁蛋白和卵磷脂的Iscoves改良DMEM(Iscoves等，J.Exp.med.1：923，1978)。例如，Ham F10或F12培养液是专门为CHO细胞培养设计的。特别适合于CHO细胞培养的其它培养液见EP-481791中所述。已知此类培养液中可增添胎牛血清(FBS，也称为胎小牛血清FCS)，后者提供了天然来源的丰富激素和生长因子。目前哺乳动物细胞的培养是常规操作，在科学教科书和手册中有全面的描述，细节可参见R.IanFresney，《动物细胞的培养》(Culture of Animal cells)，手册，第4版，Wiley-Liss/N.Y.，2000。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

在本发明的一个优选例中，提供了一种pSA/FVII表达载体。在该载体中，外源基因和作为选择的标记基因(新霉素抗性基因，Neo(R))这两个基因由Histone H3.3 putative transcription pause site的非翻译区相互连接。在该非翻译区之后还含有另外一个SV40启动子，保证目的基因的翻译和Neo(R)的翻译是独立进行的。Neo(R)基因的表达是为了保证目的基因的表达。表达载体pSA/FVII表达动物细胞分泌型的人FVII，所分泌表达重组的人FVII具有同天然的人FVII相同的氨基酸序列，并具有足够临床使用的效价，因此适用于商业化。

本发明的主要优点包括：

(i)使外源基因随选择标记基因拷贝数在基因扩增过程中的增加而增加，从而获得高表达外源蛋白的细胞株。

(ii)可以快速地获得高表达外源蛋白的细胞株

(iii)所获得的表达外源蛋白的细胞株的表达速度高。通常，所述的细胞株表达外源蛋白的速度≥2.0pg/细胞/天，甚至≥5.0pg/细胞/天。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

pSA载体和pSA/FVII载体构建

参见图1，先用常规PCR方法获得FVII基因以及下表中所示的各元件：

元件	功能
		pCMV(CMV启动子)	转录起始
pT7(T7启动子)	体外mRNA测序起始
		MCS(多克隆酶切位点)	克隆目的基因所用
BGH PolyA(牛生长因子polyA位点)	转录终止和转录后RNA加工信号
		SV40早期启动子	启动Neo(R)选择标记基因的表达
Neo(R)基因	用于细胞株筛选的选择标记基因
		SV40polyA位点	转录终止和转录后RNA加工信号

将pCMV(CMV启动子)、pT7(T7启动子)、MCS(多克隆酶切位点)、BGHPolyA(牛生长因子polyA位点)、SV40早期启动子、Neo(R)基因、和SV40polyA位点用连接酶依次连接，形成表达盒。

然后，将表达盒插入含pUC复制起点和Amp(R)抗性基因的质粒，形成表达载体pSA。

将FVII基因插入用表达载体pSA的多克隆位点，形成质粒pSA/FVII。

pSA/FVII的酶切图谱结果如图2所示，显示质粒构建正确。

接着，将表达载体pSA/FVII用常规方法转化自幼仓鼠肾细胞(BHK)，用在含新霉素的条件下筛选，获得多株高表达凝血因子FVII的细胞株。

对于所得高表达凝血因子FVII的细胞株，用常规方法(ELISA)进行免疫活性检测，其中采用的抗体是鼠源抗人FVII的单克隆抗体。

结果如图3所示，转化的FVII细胞株培养24小时后取上清500倍稀释ELISA测量，并计数其细胞数量，计算表达量为2.0pg/细胞/天

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>苏州泽璟生物制药有限公司

<120>一种重组人凝血因子VII在动物细胞内的表达和生产方法

<130>093119

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1380

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

atggggaatg tcaacaggca ggggcagcac tgcagagatt tcatcatggt ctcccaggcc    60

ctcaggctcc tctgccttct gcttgggctt cagggctgcc tggctgcagt cttcgtaacc    120

caggaggaag cccacggcgt cctgcaccgg cgccggcgcg ccaacgcgtt cctggaggag    180

ctgcggccgg gctccctgga gagggagtgc aaggaggagc agtgctcctt cgaggaggcc    240

cgggagatct tcaaggacgc ggagaggacg aagctgttct ggatttctta cagtgatggg    300

gaccagtgtg cctcaagtcc atgccagaat gggggctcct gcaaggacca gctccagtcc    360

tatatctgct tctgcctccc tgccttcgag ggccggaact gtgagacgca caaggatgac    420

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accaagcgct cctgtcggtg ccacgagggg tactctctgc tggcagacgg ggtgtcctgc    540

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ctgggcgagc acgacctcag cgagcacgac ggggatgagc agagccggcg ggtggcgcag    840

gtcatcatcc ccagcacgta cgtcccgggc accaccaacc acgacatcgc gctgctccgc    900

ctgcaccagc ccgtggtcct cactgaccat gtggtgcccc tctgcctgcc cgaacggacg    960

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ttctgtgccg gctactcgga tggcagcaag gactcctgca agggggacag tggaggccca    1200

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tgcgcaaccg tgggccactt tggggtgtac accagggtct cccagtacat cgagtggctg    1320

caaaagctca tgcgctcaga gccacgccca ggagtcctcc tgcgagcccc atttccctag    1380

<210>2

<211>795

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>新霉素抗性基因

<400>2

atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc    60

ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca    120

gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg    180

caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg    240

ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag    300

gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg    360

cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc    420

atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa    480

gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac    540

ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat    600

ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac    660

atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc    720

ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt    780

gacgagttct tctga                                                     795

<210>3

<211>459

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

Met Gly Asn Val Asn Arg Gln Gly Gln His Cys Arg Asp Phe Ile Met

1               5                   10                  15

Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln Gly

             20                 25                  30Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val Leu

         35                  40                  45

His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly

     50                  55                  60

Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala

 65                  70                  75                  80

Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser

                 85                  90                  95

Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly

            100                 105                 110

Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala

        115                 120                 125

Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys

    130                 135                 140

Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly

145                 150                 155                 160

Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp

                165                 170                 175

Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro

            180                 185                 190

Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly

        195                 200                 205

Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu

    210                 215                 220

Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp

225                 230                 235                 240

Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn

                245                 250                 255

Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp

            260                 265                 270

Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val

        275                 280                 285

Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro

    290                 295                 300

Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr

305                 310                 315                 320

Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly

                325                 330                 335

Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val

            340                 345                 350

Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg

        355                 360                 365

Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly

    370                 375                 380

Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro

385                 390                 395                 400

His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser

                405                 410                 415

Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg

            420                 425                 430

Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro

        435                 440                 445

Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro

455

Claims (13)

1.一种可用于在动物细胞内表达外源蛋白的表达载体，其特征在于，所述的载体含有表达外源蛋白的表达盒，所述的表达盒从5’至3’依次具有以下元件：

(a)第一启动子，所述的第一启动子选自：CMV启动子；

(b)多克隆位点以及任选的位于多克隆位点之中、之前或之后的外源蛋白的编码序列，且所述的外源蛋白是凝血因子VII；

(c)第一polyA序列，所述的第一polyA序列选自：牛生长因子polyA；

(d)第二启动子，所述的第二启动子选自：SV40早期启动子；

(e)选择标记基因，所述的选择标记基因选自：新霉素抗性基因，即Neo基因；和

(f)第二polyA信号序列，所述的第二polyA信号序列选自：SV40polyA信号序列。

2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的凝血因子VII来源于人。

3.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的凝血因子VII的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的标记基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

5.一种由权利要求1-4中任一所述的表达载体所转化的宿主细胞。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞选自幼仓鼠肾细胞BHK和人胚胎肾细胞HEK。

7.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中具有3-20个表达载体、3-20个表达盒、或3-20个拷贝的外源基因的编码序列，且所述的外源基因编码以下外源蛋白：凝血因子VII，

其中，所述的表达载体和表达盒如权利要求1中所定义。

8.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞表达所述外源蛋白的速度≥1.5pg/细胞/天。

9.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞表达所述外源蛋白的速度≥2.0pg/细胞/天。

10.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞表达所述外源蛋白的速度≥3.0pg/细胞/天。

11.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞表达所述外源蛋白的速度≥4.0pg/细胞/天。

12.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞表达所述外源蛋白的速度≥5.0pg/细胞/天。

13.一种制备外源蛋白的方法，其特征在于，所述的方法包括：

(a)培养权利要求5所述的宿主细胞，从而表达所述的外源蛋白，且所述的外源蛋白是凝血因子VII；

(b)分离出表达的所述的外源蛋白。

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