CN109679986B

CN109679986B - 植物作为宿主在表达凝血七因子中的应用

Info

Publication number: CN109679986B
Application number: CN201710979579.4A
Authority: CN
Inventors: 王跃驹; 马洁
Original assignee: Sagacity Faithful Convergence Health Technology Ltd
Current assignee: Sagacity Faithful Convergence Health Technology Ltd
Priority date: 2017-10-19
Filing date: 2017-10-19
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2037-10-19
Also published as: CN109679986A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物作为宿主在表达凝血七因子中的应用。本发明利用重组载体以及农杆菌介导真空渗透方法来表达人凝血七因子(anti‑hemophilic factor(AHF),FVII，FVIIa,proconvertin)。该表达体系确定植物外源蛋白在农杆菌侵染4d后就可以收集。利用SDS‑PAGE法、免疫印迹法(Western法)确定重组FVII成功表达。凝血实验证明生菜生产的FVII具有生物学活性。本发明提供了一种低成本、方便、大量生产具有活性重组人FVII的方法。

Description

植物作为宿主在表达凝血七因子中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物作为宿主在表达凝血七因子中的应用。

背景技术

人凝血七因子(FVII，血液凝固因子FVIIa，活化血液凝固因子VII，以前称为替康宁素proconvertin)是一种丝氨酸蛋白水解酶，可以引起凝血级联反应的蛋白质之一。FVII缺乏症(先天性替康康宁缺乏症)是罕见疾病，表现为血友病样出血性疾病，而且是隐性遗传的。先天性FVII缺乏的患者病情是终身的。有这种情况的病人家庭成员，也可能有病情或携带基因。通常，患病人数为30万到50万人中约为1人。也可能比率更高，因为并非所有个体都可能表现出来疾病症状并被诊断出来。

FVII缺乏症中也可以因为某些肝脏疾病，维生素K缺乏症或某些药物(即，柯马丁)从而导致肝脏产生的因子VII量不足。症状可能会有很大差异，一些受影响的个体很少显现或没有症状，而有些个体可能出血过多而危机生命。通常，这种出血病症本身就表现为容易瘀伤，鼻出血，月经过重和延长，牙科或外科手术后出血过多的倾向。新生儿可能在头部，脐部出血或割礼后过度流血。肠道，肌肉或关节或大脑可能会发生其他出血，血尿也可能发生。

目前，人类因子FVII供应量远远落后于需求，导致价格居高不下，导致很多车祸创伤，手术性出血，颅内出血的伤者和脑溢血，血友病患者买不到药或者买不起药。植物作为药物蛋白质的表达和生产系统，已经研究了近三十年。除了低成本和产量高等的优点外，基于植物的表达系统还降低了人和动物病原体从产生蛋白质的过程中传播到人类的风险。此外，植物真核蛋白内膜表达系统和分泌途径类似于哺乳动物细胞。植物表达系统可大量生产大分子量以及多亚基的药物蛋白质，且大大优于原核生物表达系统，比如大肠杆菌表达系统。如需要翻译后修饰的，糖基化的蛋白，以及需要组装的单克隆抗体，其不能用原核系统实现。利用植物生产的药用蛋白作为生物试剂已经商业化，或用作家禽的疫苗添加剂。2012年，美国食品和药物管理局(FDA)批准了用于治疗遗传疾病1型戈谢病的蛋白ELELYSO^TM(taliglucerase alfa)，而这种蛋白是利用胡萝卜生产的。在过去十年中，人们对药物蛋白质的需求急剧增加，所以FDA批准用于临床试验的植物药用蛋白质的数量也在不断增加。

植物瞬时表达系统可以大量生产重组蛋白用于临床研究或者应对突发性疾病。2014年，唯一用于有效抵抗埃博拉病毒爆发的抗体治疗药物，ZMappTM，就是农杆菌渗透方法在烟草叶片中生产。ZMapp的功效和安全性为推动植物制药业的行业开辟了道路。目前，烟草瞬间蛋白表达最常见的宿主植物，并且已经开发了各种载体和农杆菌渗透方法，用于在短时间内进行大规模生产。然而，烟草具有高纤维含量和潜在的有毒化合物，如生物碱尼古丁，显著增加了下游纯化过程中的成本，极大地阻碍了植物外源蛋白药物的进一步发展。与烟叶系统相比，生菜中含有更少的酚类和有毒化合物，因此，将生菜作为宿主在表达人凝血七因子具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供植物尤其是生菜作为宿主在表达凝血七因子中的应用。本发明利用生菜作为重组蛋白生产的有效平台，消除了植物生长周期，大大节省了前期培育植物的时间。本发明用生菜系统表达了凝血七因子(FVII)，并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明生菜表达平台可以用来生产重组人凝血七因子。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了植物作为宿主在表达凝血七因子中的应用；所述植物选自生菜、烟草、白菜、水稻、玉米、大豆或小麦；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述凝血七因子为人FVII。

本发明还提供了一种表达载体，包括凝血七因子的核苷酸序列和双元植物载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体中所述凝血七因子为人FVII。

在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体的构建方法包括如下步骤：

步骤1：在凝血七因子的核苷酸序列的5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入Sacl限制性酶切位点；所述人凝血七因子包括FVII；

步骤2：克隆到载体pUC57载体中，获得克隆载体pUC57-FVII；

步骤3：通过Xbal/Sacl从步骤2所得的克隆载体中获得基因片段FVII，克隆至双元植物载体pCam35S，分别获得表达载体p35S-FVII。

具体的，本发明提供的表达载体的构建方法为：将人FVII(GenBank Accession号：)密码子优化为植物偏好的密码子，由GeneArt^TM GeneOptimizer^TM(ThermoFisher)设计并由金斯瑞公司合成。在优化的FVII序列5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入Sacl位点，并由金斯瑞公司克隆到pUC57载体中，得到克隆载体pUC57-FVII(图1A))。人凝血七因子基因片段FVII通过Xbal/Sacl从pUC57-FVII中分离(图1B)，并克隆到双元植物载体pCam35S，分别产生瞬时表达载体p35S-FVII(图2)。将植物表达构建体分别通过用Multiporator(Eppendorf，Hamburg，Germany)电穿孔转化到根癌土壤杆菌GV3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/L)的选择性LB平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取单菌落接种到0.5L YEB(酵母提取物肉汤，5g/L蔗糖，5g/L胰蛋白胨，6g/L酵母提取物，0.24g/L MgSO4，pH7.2)并补充抗生素液体培养基(50mg/L卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通过添加YEB培养基测量OD600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10mMMES，10mM MgSO₄)中至O.D.600为0.5。

在本发明中，FVII cDNA序列(GenBank:AY212252.1)如SEQ ID No.1所示；FVII氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；密码子优化后的FVII cDNA序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了所述表达载体在表达人凝血七因子中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，所述人凝血七因子包括FVII。

本发明还提供了一种生菜作为宿主表达人凝血七因子的方法，将所述的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入生菜组织后，提取、分离蛋白质，获得人凝血七因子。

在本发明的一些具体实施方案中，所述方法中所述人凝血七因子包括FVII。

在本发明的一些具体实施方案中，所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：

步骤1：抽真空25～45s；

步骤2：保持真空(-95kPa)压力30～60s；

步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；

重复上述步骤2～3次，避光处理4d。

在本发明的一些具体实施方案中，所述农杆菌为根癌土壤杆菌GV3101。

具体的，农杆菌介导真空渗透的方法为：将制备好的农杆菌培养悬浮液置于2L烧杯，并置于干燥器中。将本实验室保存的生菜倒置(核心向上)并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(Welch Vacuum，Niles，IL，USA)打开以抽空，并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60s。快速打开该系统以释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2～3次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4d。

渗透后，绝大多数生菜组织在真空浸润过程中淹没，除了坚固的中肋区域外，其余部分均在真空渗透4天后显示淡黄褐色区域。为了增加浸入叶组织的土壤农杆菌的数量，使用剪刀将10％的生菜从头切掉使得生菜叶组织尽可能的浸润在渗透液中，和释放。与更长的真空暴露时间相比，该方法减少了叶片组织坏死。

在本发明的一些具体实施方案中，提取、分离蛋白质具体为：

经农杆菌真空渗透的生菜样品用搅拌器搅拌，并用体积比为1:1比例的提取缓冲液(100mM KPi，pH7.8；5mM EDTA；10mM β-巯基乙醇)搅拌机中高速匀浆1～2min。将匀浆物调节至pH为8.0，用纱布过滤，过滤物在4℃以10,000g离心15min以除去细胞碎片。收集上清液，与硫酸铵(50％)混合，并在冰上摇动孵育60min。通过离心机(10,000g)在4℃下再次分离15min。将得到的上清液进行第二轮硫酸铵(70％)沉淀，冰上摇动悬浮60min，再次在4℃下以10,000g离心15min。然后，弃去上清液，将处理样品沉淀蛋白质溶于5mL缓冲液(20mMKPi，pH 7.8；2mM EDTA；10m β-巯基乙醇)中并在4℃下储存。

收集从农杆菌真空渗透生菜提取的纯化蛋白质，取样品(5uL)热变性(95℃)加载缓冲液(Biorad，Hercules，CA，USA)在4～12％

Plus SDS-凝胶(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)跑电泳，然后用考马斯蓝G250(Biorad)染色后再次对凝胶进行拍照。对于重组FVII的Western Blot蛋白印迹杂交，10ul的重组样品以及人FVII标准品(Biovision)分别在10～20％

Plus聚丙烯酰胺凝胶上分离，并将其电泳转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用抗FVII的抗体(Abcam)分别进行免疫反应，稀释1：10000和辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(Beyotime)，稀释度分别为1:20000，并使用ECL plus(Amersham Biosciences)显现，对显示图像进行拍照。

植物来源的重组蛋白质的下游加工通常难于并且昂贵，因为纤维素细胞壁难以裂解以及次级植物代谢产物。本发明用搅拌机搅拌匀浆，大大节省匀浆成本以及工艺。重组FVII经过SDS-PAGE分离我们在泳道中观察到估计分子量大约为45kDa的条带(图3A，泳道1)，与阳性FVII条带一致(图3A，泳道1)。在隐形对照泳道中没有明显的对应条带(图3A，泳道2)。基于Bradford测定法和光密度测定对照组测定纯化样品的蛋白含量0.13mg/kg。另外，Western印迹分析也检测到大约45kDa的条带(图3B，泳道1)，观察到的蛋白分子量(45kDa)预测分子量一致，相反，隐形对照泳道中没有明显的对应条带(图3B，泳道2)。

在新鲜血浆中加入人凝血七因子1ug。5分钟后检查血浆凝固情况。检查血浆结果表明，没有任何处理的血浆没有任何凝血反应。相比之下，使用纯化的重组FVII或相等的阳性对照FVII标准处理的凝血良好(图4)。这些结果表明，通过生菜系统瞬间表达的外源FVII具有生物学活性，生菜系统可能是生物活性重组药物蛋白质批量生产的合适的生物反应器。

用于真空农杆菌渗透的烟草植物的生长时间通常为4至6周。本发明利用生菜作为重组蛋白生产的有效平台，消除了植物生长周期，大大节省了前期培育植物的时间。本发明用生菜系统表达了FVII，并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明生菜表达平台可以用来生产人凝血七因子。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1(A)示FVII克隆载体(金斯瑞公司构建合成)；

图1(B)示FVII基因片段酶切(XbaI/SacI)鉴定；

图2示植物瞬时表达载体p35S-FVII构建流程；利用限制性内切酶(XbaI/SacI)双酶切，从图1克隆载体分别切下FVII片段，连接入pCam35S的XbaI/SacI位点，生成植物瞬时表达载体p35S-FVII；

其中，35S，具有烟草花叶病毒(TMV)5‘UTR的CaMV 35S启动子；NPTII，用于卡那霉素抗性的编码nptII基因的表达；Nos 3’，终止子；

图3(A)示利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测纯化的重组人经生长因子(FVII)；泳道1:纯化重组FVII(1μg)；泳道2：非真空渗透叶片洗脱液阴性对照；

图3(B)示Western印记杂交检测纯化的重组人凝血七因子；泳道1:纯化重组FVII(1μg)；泳道2：非真空渗透叶片洗脱液阴性对照；

图4示凝血七因子显著促进凝血实验；使用纯化的FVII处理血浆，观察血浆凝固反应；5分钟后，重组人凝血七因子明显促进血浆凝血。

具体实施方式

本发明公开了植物尤其是生菜作为宿主在表达凝血七因子中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明研究表明，生菜系统可以是有效的表达平台，为快速，瞬时表达重组蛋白质提供了方法。真空农杆菌渗透方法简单，快速，减少叶片坏死，而且可以提高重组蛋白产量。生菜可以通过承受真空压力而增加蛋白质产量，并允许每片叶子更完整的渗透。由于生菜易于生长并且可商业上大量生产，因此比其他瞬时表达植物，如烟草等更容易获得并且更便宜。并且由于不需要特殊设备或液氮，成本效益更高。本发明证明该方法可以用于短时间内大规模生产FVII重组蛋白质。

本发明提供了植物作为宿主在表达凝血七因子中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1植物瞬时表达载体的构建

为了提供外援蛋白在植物中的高效表达，本发明将人FVII(GenBank Accession号：AY212252.1)密码子优化为植物偏好的密码子，由GeneArt^TM GeneOptimizer^TM(ThermoFisher)设计并由金斯瑞公司合成。在优化的FVII序列5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入Sacl位点，并由金斯瑞公司克隆到pUC57载体中。人凝血七因子基因片段FVII通过Xbal/Sacl从pUC57-FVII中分离，并克隆到双元植物载体pCam35S，分别产生瞬时表达载体p35S-FVII。将植物表达构建体分别通过用Multiporator(Eppendorf，Hamburg，Germany)电穿孔转化到根癌土壤杆菌GV3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/L)的选择性LB平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取单菌落接种到0.5L YEB(酵母提取物肉汤，5g/L蔗糖，5g/L胰蛋白胨，6g/L酵母提取物，0.24g/L MgSO4，pH7.2)并补充抗生素液体培养基(50mg/L卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通过添加YEB培养基测量OD600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10mM MES，10mM MgSO₄)中至O.D.600为0.5。

实施例2农杆菌介导的真空渗透

本发明优化了农杆菌真空渗透的方法。将制备好的农杆菌培养悬浮液置于2L烧杯，并置于干燥器中。将本实验室保存的生菜倒置(核心向上)并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(Welch Vacuum，Niles，IL，USA)打开以抽空，并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60s。快速打开该系统以释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2～3次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4d。

实施例3蛋白质提取和分离

经农杆菌真空渗透的生菜样品用搅拌器搅拌，并用体积比为1:1比例的提取缓冲液(100mM KPi，pH7.8；5mM EDTA；10m M β-巯基乙醇)搅拌机中高速匀浆1～2min。将匀浆物调节至pH为8.0，用纱布过滤，过滤物在4℃以10,000g离心15min以除去细胞碎片。收集上清液，与硫酸铵(50％)混合，并在冰上摇动孵育60分钟。通过离心机(10,000g)在4℃下再次分离15min。将得到的上清液进行第二轮硫酸铵(70％)沉淀，冰上摇动悬浮60min，再次在4℃下以10,000g离心15min。然后，弃去上清液，将处理样品沉淀蛋白质溶于5mL缓冲液(20mMKPi，pH 7.8；2mM EDTA；10mM β-巯基乙醇)中并在4℃下储存。

实施例4SDS-PAGE凝胶电泳以及Western Blot蛋白印迹杂交

Plus SDS-凝胶(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)跑电泳，然后用考马斯蓝G250(Biorad)染色后再次对凝胶进行拍照。对于重组FVII的Western Blot蛋白印迹杂交，10ul的重组样品以及hFVII和标准品(Biovision)分别在10～20％

Plus聚丙烯酰胺凝胶上分离，并将其电泳转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用抗hFVII的抗体(Abcam)分别进行免疫反应，稀释1：10000和辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(Beyotime)，稀释度分别为1:20000，并使用ECL plus(Amersham Biosciences)显现，对显示图像进行拍照。

植物来源的重组蛋白质的下游加工通常难于并且昂贵，因为纤维素细胞壁难以裂解以及次级植物代谢产物。我们用搅拌机搅拌匀浆，大大节省匀浆成本以及工艺。重组FVII经过SDS-PAGE分离我们在泳道中观察到估计分子量大约为45kDa的条带(图3A，泳道1)，在隐形对照泳道中没有明显的对应条带(图3A，泳道2)。基于Bradford测定法和光密度测定对照组测定纯化样品的蛋白含量为0.13mg/kg。另外，Western印迹分析也检测到大约45kDa的条带(图3B，泳道1)，观察到的蛋白分子量(45kDa)预测分子量一致，相反，隐形对照泳道中没有明显的对应条带(图3B，泳道2)。

实施例5凝血七因子凝血实验

实施例6

对照组：利用烟叶生产人凝血七因子；

实验组：本发明提供的生菜生产人凝血七因子；

表1人凝血七因子

^*示与对照组相比P≤0.05；^#示与对照组相比P≤0.01；

由表1可知，与对照组的烟叶系统相比，生菜瞬时表达人凝血七因子(FVII)显著(P≤0.05)缩短了生产周期，显著(P≤0.05)提高了蛋白含量，显著(P≤0.05)提高了蛋白活性，简化了蛋白纯化的难易程度，极显著(P≤0.01)降低了生产成本。

综合上述试验结果表明，植物系统尤其是生菜系统是更加经济、高效的表达平台。能够快速瞬时表达重组蛋白质，可以在短时间内大规模生产人凝血七因子。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京惠升生物工程科技有限公司

<120> 植物作为宿主在表达凝血七因子中的应用

<130> MP1721571

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1452

<212> DNA

<213> FVII

<400> 1

agtcccatgg ggaatgtcaa caggcagggg cagcactgca gagatttcat catggtctcc 60

caggccctca ggctcctctg ccttctgctt gggcttcagg gctgcctggc tgcaggcggg 120

gtcgctaagg cctcaggagg agaaacacgg gacatgccgt ggaagccggg gcctcacaga 180

gtcttcgtaa cccaggagga agcccacggc gtcctgcacc ggcgccggcg cgccaacgcg 240

ttcctggagg agctgcggcc gggctccctg gagagggagt gcaaggagga gcagtgctcc 300

ttcgaggagg cccgggagat cttcaaggac gcggagagga cgaagctgtt ctggatttct 360

tacagtgatg gggaccagtg tgcctcaagt ccatgccaga atgggggctc ctgcaaggac 420

cagctccagt cctatatctg cttctgcctc cctgccttcg agggccggaa ctgtgagacg 480

cacaaggatg accagctgat ctgtgtgaac gagaacggcg gctgtgagca gtactgcagt 540

gaccacacgg gcaccaagcg ctcctgtcgg tgccacgagg ggtactctct gctggcagac 600

ggggtgtcct gcacacccac agttgaatat ccatgtggaa aaatacctat tctagaaaaa 660

agaaatgcca gcaaacccca aggccgaatt gtggggggca aggtgtgccc caaaggggag 720

tgtccatggc aggtcctgtt gttggtgaat ggagctcagt tgtgtggggg gaccctgatc 780

aacaccatct gggtggtctc cgcggcccac tgtttcgaca aaatcaagaa ctggaggaac 840

ctgatcgcgg tgctgggcga gcacgacctc agcgagcacg acggggatga gcagagccgg 900

cgggtggcgc aggtcatcat ccccagcacg tacgtcccgg gcaccaccaa ccacgacatc 960

gcgctgctcc gcctgcacca gcccgtggtc ctcactgacc atgtggtgcc cctctgcctg 1020

cccgaacgga cgttctctga gaggacgctg gccttcgtgc gcttctcatt ggtcagcggc 1080

tggggccagc tgctggaccg tggcgccacg gccctggagc tcatggtcct caacgtgccc 1140

cggctgatga cccaggactg cctgcagcag tcacggaagg tgggagactc cccaaatatc 1200

acggagtaca tgttctgtgc cggctactcg gatggcagca aggactcctg caagggggac 1260

agtggaggcc cacatgccac ccactaccgg ggcacgtggt acctgacggg catcgtcagc 1320

tggggccagg gctgcgcaac cgtgggccac tttggggtgt acaccagggt ctcccagtac 1380

atcgagtggc tgcaaaagct catgcgctca gagccacgcc caggagtcct cctgcgagcc 1440

ccatttccct ag 1452

<210> 2

<211> 466

<212> PRT

<213> FVII

<400> 2

Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln

1 5 10 15

Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr

20 25 30

Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gln

35 40 45

Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe

50 55 60

Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu

65 70 75 80

Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg

85 90 95

Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser

100 105 110

Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr

115 120 125

Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His

130 135 140

Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln

145 150 155 160

Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu

165 170 175

Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu

180 185 190

Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys

195 200 205

Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys

210 215 220

Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly

225 230 235 240

Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp

245 250 255

Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp

260 265 270

Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val

275 280 285

Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala

290 295 300

Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro

305 310 315 320

Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val

325 330 335

Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala

340 345 350

Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln

355 360 365

Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr

370 375 380

Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys

385 390 395 400

Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp

405 410 415

Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly

420 425 430

His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln

435 440 445

Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro

450 455 460

Phe Pro

465

<210> 3

<211> 1452

<212> DNA

<213> The password is optimized for the FVII cDNA sequence

<400> 3

agtccaatgg gaaacgtaaa caggcaaggc caacactgtc gtgattttat aatggtttcc 60

caagctctgc gacttctttg cttattattg ggcttacagg gatgccttgc cgcagggggc 120

gtggcaaagg ccagtggtgg tgagactcgt gatatgcctt ggaagcctgg accccatcga 180

gtgtttgtaa cgcaagagga agcccacgga gtcttacacc gtcgtcgtcg agccaatgcc 240

ttcttagaag agttgcgacc tggtagcctc gagcgagaat gcaaggaaga gcaatgcagc 300

ttcgaagaag caagagagat tttcaaagac gctgaaagga caaagctgtt ctggatctca 360

tattctgacg gtgaccagtg tgcatcatca ccgtgccaaa atgggggctc atgcaaagac 420

cagctccaat cttatatttg tttctgcttg cccgccttcg agggacgaaa ctgtgagacc 480

cacaaagatg accagctcat ctgcgtgaat gagaacggag gttgcgagca gtactgctcc 540

gatcataccg ggaccaagag aagttgtaga tgtcatgaag gttatagctt gttagcagac 600

ggggtcagtt gtacgccgac agtcgagtac ccttgcggca agatccctat tttggaaaaa 660

cgtaacgcct caaagccaca gggtcgaata gtgggaggaa aagtatgccc caagggtgag 720

tgcccatggc aagttctttt acttgtaaac ggggctcaac tctgtggggg cacacttatc 780

aatactatat gggttgtctc cgccgctcac tgtttcgata agatcaagaa ttggagaaat 840

ctgatcgcag ttctgggaga gcatgacctt agcgaacatg acggagacga gcagtcaagg 900

cgtgtcgctc aggtgattat accgtctact tacgtgcctg gcacaaccaa ccacgatata 960

gcccttctta gactgcatca gcccgttgtc ttaacagatc acgtagttcc cttatgcctc 1020

cccgaaagga cctttagtga aaggacactc gcatttgtcc gtttctcact cgttagcgga 1080

tggggacagt tattagacag aggtgccact gctcttgagt taatggtcct caacgttcca 1140

cgtcttatga cacaagattg cttacaacaa tcccgtaaag tgggagattc accgaacatt 1200

acagaataca tgttctgtgc tggttacagc gacggtagca aagactcatg taagggtgat 1260

agcgggggtc cacacgcaac ccactatcgt ggaacgtggt accttacagg cattgtatct 1320

tggggccagg gttgcgcaac cgtaggccat tttggggtct acacacgtgt ttctcagtat 1380

atagagtggc ttcaaaaatt aatgcgttca gagcctaggc ctggagttct tctgcgtgcc 1440

ccgttcccgt ag 1452

Claims

1.一种植物作为宿主表达凝血七因子的方法，其特征在于，将表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入植物组织后，提取、分离蛋白质，获得人凝血七因子；

所述凝血七因子为人FVII；

所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：

步骤1：抽真空25～45s；

步骤2：保持真空-95kPa压力30～60s；

步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；

重复上述步骤2～3次，避光处理4d；

所述植物为生菜；

所述表达载体，包括凝血七因子的核苷酸序列和双元植物载体；

所述凝血七因子为人FVII；

其构建方法包括如下步骤：

步骤1：在凝血七因子的核苷酸序列的5’末端加入Xbal限制性酶切位点，在3’末端加入Sacl限制性酶切位点；

步骤2：克隆到载体pUC57载体中，获得克隆载体pUC57-FVII；

步骤3：通过Xbal/Sacl从步骤2所得的克隆载体中获得基因片段FVII，克隆至双元植物载体pCam35S，分别获得表达载体p35S-FVII；

所述人FVII的密码子优化后的FVII cDNA序列如SEQ ID No.3所示。