CN1539979A - 具有绿色荧光蛋白示踪和抗性筛选标记的RNAi载体pGO - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药分子生物学技术领域，是一种可用于特异性抑制靶基因表达的具有绿色荧光蛋白示踪和真核细胞抗性筛选标记的RNA干扰(RNAi)载体pGO。本发明RNAi载体pGO是对pEGFP－C2载体的改造，去除了其原有的多克隆位点，在SV40 polyA和fl原核复制起点之间插入带有相应多克隆位点的U6启动子构成。只要在U6启动子下游的多克隆位点中的适当位点插入针对靶基因的siRNA模板，转染细胞后就可特异并有效地抑制该基因的表达。因而本发明的RNAi载体pGO可用于制备研究基因功能的试剂或用于抗肿瘤药物的研究和开发。
Description
技术领域
本发明涉及医药分子生物学技术领域，是一种可用于特异性抑制靶基因表达的具有绿色荧光蛋白示踪和抗性筛选标记的RNA干扰(RNAi)载体pGO。
背景技术
RNA干扰(RNAi)是指双链RNA(dsRNA)特异性地诱发与其同源序列的mRNA分子被降解，导致相应基因表达被抑制的现象，是一种特殊的转录后基因表达沉默现象。RNA干扰(RNAi)现象是1998年由Fire等在线虫中首次发现并报道。他们观察到在线虫中双链RNA(dsRNA)可在转录后水平特异性抑制基因表达。随后许多学者对线虫、果蝇、植物和动物细胞进行了大量研究，证实RNAi是相当保守的生物模式。对果蝇的研究使RNAi机制基本被阐明：当长链的dsRNA进入细胞时，被一种称之为Dicer的核酸水解酶所识别，并被剪切成21-23核苷酸(nt)的siRNA，双链的siRNA被RNA解链酶解链，以单链形式与另一核酸酶结合形成RNA酶复合体，复合体中的RNA链象向导一样引导酶复合体识别序列与之互补的mRNA，并将该mRNA水解，从而特异性地抑制基因翻译表达。2001年，Tuchl等首先发现合成21bp的siRNA可在哺乳动物细胞中特异并有效的抑制基因表达(Elbashir S.M.et al.Nature 411，494-498；2001)。不久，运用含有19-29bp反向重复序列的表达载体在哺乳动物细胞内转录成发夹样RNA也成功实现了RNAi(Brummelkamp T.R.et al.Science 296，550-553；2002)。随后RNAi技术很快被应用于抗病毒、抗肿瘤和对基因功能的研究中并取得了大量令人鼓舞的结果。
所谓RNAi技术是指基于RNAi现象而开发的抑制特定基因表达或降解特定RNA分子的分子生物学技术，其根据RNAi的基本原理，可针对致病基因的DNA核苷酸序列，选择其中一段与其它基因同源性较低的序列作为靶序列，通过体外合成或体内转录形成具有21-29个碱基的互补寡核苷酸短链(siRNA)，在细胞中与靶基因的mRNA特异性结合，激活细胞自身的机制使其降解，从而特异性抑制该致病基因的表达。同样，也可用RNAi对基因的功能进行研究。体外合成是根据靶序列直接化学合成一对互补寡核苷酸短链(siRNA)；而体内转录是将siRNA模板克隆入带有RNA聚合酶III类启动子(U6或H1)的载体中，在细胞中转录形成具有发夹样结构的siRNA而发挥作用。
虽然载体介导的RNAi技术诞生不到一年时间，然而由于其便捷、高效和低成本的特点，已经成为研究使致病基因失活和研究基因功能的有力工具。目前实验室通常使用的是早期开发的RNAi载体，如pSUPER、pSilencer、pSHAG和psiRNA等。它们的结构相对简单，通常仅带有原核复制元件和基本的U6或H1启动子转录单位，U6或H1启动子是RNA聚合酶III家族启动子，在体内能很好地介导发夹样siRNA的合成，是RNAi载体不可缺少的元件，但由于这些载体没有示踪和抗性筛选标记，因此给研究工作带来许多不便。比如在转染细胞时对转染的细胞量很难估计，通常需要共转染大量荧光蛋白报告基因或采用荧光标记的转染试剂来分选出被转染的细胞，从而增加了实验的难度和成本。另一方面，当载体转染细胞后有一部分会整合入细胞基因组中，可随着细胞染色体的复制而复制，如果载体上带有抗性基因就可通过药物筛选出这部分细胞进行扩增，从而在这些细胞中使靶基因永久沉默。然而由于这些载体没有携带真核细胞的抗性筛选标记，无法筛选出在基因组上稳定整合RNAi载体的细胞，因此只能在短时间内观察靶基因表达的抑制(5-7天)而无法使其永久沉默。
发明内容
本发明提供一种能示踪转染细胞并能长期抑制靶基因表达的RNAi载体pGO，其携带绿色荧光蛋白基因和新霉素抗性基因。现有绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2真核细胞表达载体(Clontech公司产品)是携带经改良而更适合哺乳动物细胞表达的增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)的载体，通常用于与目的基因融合来显示该基因在细胞中的表达和定位情况，是常用的示踪工具。该载体也带有新霉素基因，其表达产物新霉素可抵抗药物G418的毒性作用，因此，通过G418的作用可筛选出在基因组上稳定整合了载体的细胞，从而使目的基因持续表达。本发明正是利用了该载体的这两个特性，对pEGFP-C2作适当改造后将带有U6启动子的转录元件插入该载体中构成具有绿色荧光蛋白示踪和抗性筛选标记的RNAi载体。如果在该载体中插入针对目的基因的siRNA模板，就可在细胞内抑制该目的基因的表达。因此本发明载体可用于制备治疗肿瘤的药物或用于制备研究基因功能的试剂。本发明RNAi载体对pEGFP-C2载体作如下改造：
1、去除多克隆位点
pEGFP-C2载体主要构件(见图2)包括pUC复制起点(pUC ori)、CMV启动子(CMV promoter)、增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)、多克隆位点(MCS)、SV40 PolyA、fl复制起点(fl ori)、细菌启动子(P)、SV40早期启动子(SV40epromoter)、卡那霉素/新霉素抗性基因(Kan/Neo)、HSV-TK PolyA等，其中多克隆位点处于绿色荧光蛋白和SV40 PolyA之间，带有多个常用的酶切位点，如BglII、XholI、HindIII、EcoRI、SalI、BamHI等，原用于克隆目的基因与绿色荧光蛋白基因融合。而本发明中EGEP仅用于示踪目的，原有克隆位点不适于克隆siRNA模板，故将其切除。因同尾酶BglII和BamHI恰好位于多克隆位点的两端，故只需通过这两种酶双酶切再自连即可切除原有多克隆位点。
2、制备模板
提取人胚肾细胞系HEK293细胞基因组DNA，作为扩增人源的RNAIII类聚合酶U6启动子的模板。
3、合成引物
针对人源U6启动子并带有特殊酶切位点的核苷酸序列，设计并合成下列引物：
其5’端引入
MluI的酶切位点ACGCGT和BglII的酶切位点AGATCT；
其5’端依次引入MluI的酶切位点ACGCGT，XhoI的酶切位点CTCGAG，EcoRI的酶切位点GAATTC，BamHI的酶切位点GGATCC，SalI的酶切位点GTCGAC和BbsI的酶切位点GAAGAC。
4、PCR扩增人源U6启动子
以HEK293细胞基因组DNA为模板，用上述合成的上游和下游引物，采用高保真的pfu酶扩增，得到带有多克隆位点的人源U6启动子。
5、插入U6启动子，构建RNAi载体
pEGFP-C2载体去除原有的多克隆位点后，还有一个Mlu I酶切位点，由于其位于完整的EGFP转录单位(包括CMV启动子和SV40 polyA)和f1原核复制起点之间，因此外源插入片段不会改变载体上原有结构的功能，同时载体上的结构也不会影响U6启动子转录元件的功能，因此U6启动子就插于此位点中(参见附图1、2)。如此改建后的载体命名为pGO。
pGO克服了常用RNAi载体的无法示踪和不能稳定整合的不足。使用时首先针对靶基因上一段长度21-29nt的核苷酸序列，设计并合成一对具有反向重复序列的互补脱氧寡核苷酸链，作为siRNA的转录模板，其中将反义序列置于正义序列之前，两者之间以核苷酸序列GAAGCTTG间隔，经退火后插入pGO载体。该载体转染细胞后，载体上的U6启动子以其下游插入片段为模板，指导合成具有发夹样结构的siRNA，从而导致目的基因沉默(参见附图3)。
附图说明
图1为本发明RNAi载体pGO的结构示意图。
图2为本发明RNAi载体pGO构建流程图。
图3为RNAi载体介导的发夹样siRNA构建流程图。
图4为针对肿瘤相关基因β-catenin RNA干扰的免疫印记(Westem Blot)图。
图5为针对荧光素酶报告基因(Luciferase)RNA干扰的绿色荧光照片(A)及荧光素酶活性示意图(B)。
具体实施方式
实施例1：具有绿色荧光蛋白示踪和抗性筛选标记的RNAi载体的构建；
一、人源小核RNA(U6)启动子的克隆
1.制备293细胞基因组DNA
按常规将293细胞(购自ATCC公司)培养于含有10％胎牛血清的DMEM培养基中(购自Gibico公司)，离心收集1×107个细胞，应用蛋白酶K和苯酚从细胞中分离基因组DNA(具体操作见分子克隆实验指南)。
2.设计合成引物
上游引物5’-CCGACGCGTAGATCTAAGGTCGGGCAGGAAGAG-3’，下游引物5’-CCGACGCGTCTCGAGGAATTCGGATCCGTCGACAAAAAGAAGACCACGGTGTTTCGTCCTTTC-3’(2OD，上海申能博彩合成)，上游引物中依次引入MluI和BglII酶切位点，下游引物中依次引入MluI，XholI，EcoRI，BamHI，SalI和BbsI酶切位点。用纯净水将引物调整到20μm浓度。
3.PCR扩增U6启动子
以293细胞基因组DNA为模板，用上述引物进行PCR反应。反应体系：模板1μl(100ng/μl)，上下游引物各1μl，dNTP(10mM)2μl，PCR缓冲液5μl，pfu酶0.5μl(10U/μl)，纯净水39.5μl；反应条件：96℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，35个循环，PCR仪购自BioRad，PCR反应用试剂均购自上海申能博彩公司。PCR产物回收，胶回收试剂及回收柱购自上海申能博彩公司，具体操作见上海申能博彩胶回收试剂使用说明。共获得回收产物20μl(100ng/μl)。回收产物用MluI(购自MBI)单酶切，反应体系：PCR回收产物25μl(2.5μg)，MluI(5U/μl)2μl，Y缓冲液3μl，37℃反应3小时，再进行胶回收，操作同前。
二、本发明RNAi载体pGO的构建
pEGFP-C2(购自CLONTECH公司)用BglII和BamHI双酶切，反应体系：PEGFP-C2载体4μl(1μg/μl)，BglII和BamHI各1μl(5U/μl)，Y缓冲液6μl，纯净水18μl，37℃3小时，酶切产物回收同前。酶切产物同尾酶自连，反应体系：酶切回收产物8μl(50ng/μl)，连接缓冲液1μl，T4连接酶(T4连接酶购自上海申能博彩公司，下同)1μl，16℃过夜，连接产物转化感受态DH5α细菌。在卡那霉素的平板上挑单菌落于5ml卡那霉素抗性LB培养液中摇菌过夜。小量提取质粒(具体操作方法见分子克隆实验指南)，BglII单酶切鉴定，反应体系：质粒2μl(0.5μg/μl)，连接缓冲液1μl，BglII(10U/μl)1μl，37℃3小时，1％琼脂糖凝胶电泳，电压90V，短波紫外灯下可见未被切成线形化的环状质粒为阳性克隆。该阳性克隆的质粒用MluI单酶切，反应体系同前，胶回收，操作同前。将U6启动子PCR酶切产物和改造的pEGFP-C2酶切线形产物连接及转化，方法同前。
三、本发明RNAi载体pGO的鉴定
1.酶切鉴定
因U6启动子是从改造的pEGFP-C2 MluI单酶切位点插入，须用酶切鉴定启动子插入方向。因EcoRI酶切位点位于MluI酶切位点的3’方向，AgeI酶切位点位于U6启动子上游，用AgeI和EcoRI双酶切重组载体做鉴定，同时用AgeI和MluI双酶切pEGFP-C2原始载体做参照，如重组载体酶切片段较参照的原始载体酶切片段大时，说明U6启动子插入方向是正向的，如重组载体酶切片段较参照的原始载体酶切片段小时。则说明U6启动子插入方向是反向的。
2.测序
取正向插入U6启动子的重组载体，用BglII和XhoI双酶切反应体系：质粒4μl(1μg/μl)，BglII(5U/μl)1μl，XhoI(5U/μl)1μl，R缓冲液3μl，纯净水21μl，37℃反应3小时，进行胶回收，操作同前。回收产物连入载体PbluescriptSK(-)(购自Stratagen公司)(载体酶切及回收操作同前)，连接体系：目的片段9μl(50ng/μl)，载体3.5μl(50ng/μl)，缓冲液1.5μl，T4连接酶1μl，16℃过夜。连接产物转化感受态DH5α细菌(感受态细菌制备见分子克隆实验指南)，在氨苄青霉素平板上获得的单克隆菌经初步酶切鉴定后送上海申能博彩公司测序，测序引物为T3，测序结果正确，U6启动子全长为265个核苷酸，证实重组载体为pGO。
实施例2：针对肿瘤相关基因β-catenin的RNA干扰
一、RNA干扰片段的选取
β-catenin是Wnt途径的效应分子，该通路的异常激活与许多肿瘤的发生密切相关。我们依据文献提供的经验自
http：//www.ambion.com/techilb/misc/sirna fi nder.html，根据β-catenin基因设计了siRNA片段，核苷酸序列如下：
其中反义序列在前，正义序列在后，两端分别带有Bbs I(ACCG)和BamH I(GATC)酶切位点的粘性末端，连接两序列的环状结构中包含有一个HindIII酶切位点(AAGCTT)，以便鉴定时使用。
二、RNA干扰片段的体外退火方法
siRNA干扰片段由上海申能博彩公司合成(2OD)，溶于50μl纯净水中，互补双链各取10μl混匀，放入100℃沸水中5分钟，并让其在水浴中自然缓慢冷却至20℃，置-20℃保存。
三、RNA干扰片段与载体的连接及鉴定
载体用BbsI和BamHI双酶切，反应体系：载体4μl(1μg/μl)，BbsI和BamHI各1μl(10U/μl)，Y缓冲液6μl，纯净水18μl，37℃3小时。酶切产物回收同前。将酶切回收的上述载体和退火的RNA干扰片段连接转化，具体操作方法同前。转化后的质粒用HindIII单酶切鉴定，如质粒可被切成线性，说明RNA干扰片段连入载体，HindIII酶切位点来自RNA干扰片段环状结构上的酶切位点。将鉴定正确的干扰载体命名为pGO-β。参见图1、2、3。
四、带有catenin基因的真核细胞表达载体和干扰载体共转染293细胞
以2×105/孔的密度在24孔板上铺293细胞，24小时后进行转染操作。将带有β-catenin基因序列的真核细胞表达载体pcDNA3.1-β-catenin和干扰载体pGO-β各200ng共转染293细胞，转染试剂使用Lipotamine(购自Invitrogen)，以空干扰载体pGO作为对照，具体操作步骤见Invitrogen公司脂质体转染使用说明。转染后48小时用1×SDS上样缓冲液裂解细胞(1×SDS上样缓冲液配方见分子克隆实验指南)，细胞裂解液跑8％的SDS-PAGE，100V，2小时30分钟，用半干转膜仪(购自BioRad)将凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，转膜条件：100mA，2小时30分钟。5％脱脂奶粉封闭1小时，一抗为β-catenin单抗(购自Santa Cruze公司)，二抗为带有HRP标记的羊抗鼠抗体(购自华舜公司)，ECL显影剂(购自Santa Cruze公司)显影，显影胶片购自AFGA公司。结果参见图4。如图所示，pcDNA3.1-β-catenin与空干扰载体pGO共转染293细胞后可见到较高水平的β-catenin表达，而pcDNA3.1-β-catenin与干扰载体pGO-β共转染后，β-catenin表达水平显著降低，但作为内参照的β-actin表达不受影响，说明pGO-β可有效并特异的抑制β-catenin基因的表达。图上显示EGFP的表达量相同则说明pGO及pGO-β的转染用量一致，而且其表达与RNA干扰作用互不影响。
实施例3：针对荧光素酶报告基因(Luciferase)的RNA干扰
一、RNA干扰片段的选取
针对荧光素酶报告基因的干扰靶序列根据文献应用的已知有效片段设计(Genes & Development 16，948-958；2002)：
反义序列在前，正义序列在后，两端分别带有Bbs I(ACCG)和BamH I(GATC)酶切位点的粘性末端，连接两序列的环状结构中包含有一个HindIII酶切位点(AAGCTT)，以便鉴定时使用。
二、RNA干扰片段的体外退火方法(具体操作同前)
载体用BbsI和BamHI双酶切并回收，RNA干扰片段体外退火与载体连接及鉴定(具体操作同前)，干扰载体命名为pGO-FF。
三、荧光素酶基因和干扰载体共转染HepG2细胞
以1×105/孔的密度在24孔板上铺HepG2细胞，24小时后进行转染操作。干扰载体pGO-FF及空载体pGO(作为对照)600ng，分别与荧光素酶基因载体pGL3-SV40(200ng)和pRL-TK(20ng)(荧光素酶基因载体购自Promega)共转染HepG2细胞，转染具体操作同前。转染后24小时观察到EGFP的表达；48小时用双荧光素酶报告系统试剂(购自Promega)检测针对荧光素酶的RNA干扰情况，具体操作见Promega双荧光报告系统试剂使用说明，对荧光素酶报告基因的检测显示共转染pGO-FF使报告基因活性下降约80％，参见图5。从图5A看出，转染后24小时后根据EGFP的表达可以方便的分辨出被转染细胞，并说明pGO及pGO-FF的转染用量一致；从图5B看出共转染pGO-FF后可以使荧光素酶活性下降约80％，提示pGO-FF能够显著抑制荧光素酶报告基因的表达。由此可见，本发明的RNAi载体pGO具有绿色荧光蛋白示踪和真核细胞的抗性筛选标记，并能够有效抑制目的基因表达，故可用于制备治疗肿瘤的药物或用于制备研究基因功能的试剂。
Claims (2)
1、一种RNAi载体pGO，包括pUC复制起点pUC ori、fl复制起点fl ori、细菌启动子P、卡那霉素基因Kan、HSV-TK PolyA、U6启动子U6 promoter和多克隆位点MCS，其特征在于还含有用于表达绿色荧光蛋白基因的转录元件，包括CMV启动子CMV promoter、增强绿色荧光蛋白基因EGFP和SV40 PolyA，以及用于表达真核细胞抗性筛选标志的新霉素基因转录元件，包括SV40早期启动子SV40epromoter和新霉素抗性基因Neo。
2、权利要求1所述RNAi载体pGO在制备基因功能研究试剂和抗肿瘤药物中的应用。
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| C19 | Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |