CN101633930B - 小干扰rna快速筛选的载体及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
一种小干扰RNA快速筛选的载体，小干扰RNA快速筛选载体具有一个3.0kb的骨架载体并含有一个多克隆位点，在载体5’端的多克隆位点处存在报告基因及用于插入一个筛选靶基因表达元件的多克隆位点，其下游存在两个相反方向的任意两个不同的pIII启动子，两个启动子之间有两个酶切位点，并在两个酶切位点之间插入一个用于蓝白斑筛选的表达元件，在载体的3’端多克隆位点处插入一个内参报告基因。构建方法包括：构建小干扰RNA载体的基本骨架、构建报告基因-Flag表达元件的载体、构建小干扰RNA表达载体、构建小干扰RNA快速筛选的载体步骤。小干扰RNA快速筛选的载体在筛选小干扰RNA中的用途。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小干扰RNA快速筛选的载体及其构建方法和应用。
技术背景
RNA干扰技术是指小的双链RNA可以引起靶分子mRNA的特异降解。能够引起mRNA的特异降解的长度约19～21碱基的双链RNA称之为小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)。siRNA已被广泛应用于基因表达调控、基因功能及疾病的治疗研究，并成为分子生物学最热点的研究领域之一。在美国小干扰RNA已进入疾病治疗的临床试验一、二期阶段(如老年性黄斑病，age-relatedmacular degeneration，AMD)。预计小干扰RNA也将很快进入其它疾病(如肿瘤，病毒性疾病及神经退行性疾病等)的临床试验治疗阶段。此外，在后基因组时代，小干扰RNA在基因的功能研究中也将会起到非常重要的作用。
在真核细胞中通常是小干扰RNA(19-21碱基双链RNA)发挥作用。筛选有效的小干扰RNA靶片段对于RNA的干扰效果具有重要意义。目前筛选有效干扰RNA片段的方法有多种：(1)Westernblot(2)RT-PCR(3)Northern blot(4)real-time PCR等，所有这些方法都比较费时，复杂，稳定性较差。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题在于提供一种用于小干扰RNA快速筛选的载体。
本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种快速、简便的用于小干扰RNA快速筛选的载体的构建方法。
本发明所要解决的还有一个技术问题在于提供一种用于小干扰RNA快速筛选的载体的用途。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：小干扰RNA快速筛选载体具有一个3.0kb的骨架载体并含有一个多克隆位点，在载体5’端的多克隆位点处存在报告基因及用于插入一个筛选靶基因表达元件的多克隆位点，其下游存在两个相反方向的任意两个不同的pIII启动子，两个启动子之间有两个酶切位点，并在两个酶切位点之间插入一个用于蓝白斑筛选的表达元件，在载体的3’端多克隆位点处插入一个内参报告基因。
本发明的载体5’端多克隆位点处存在的报告基因及插入所筛选靶基因的表达元件为：
1、所采用的报告基因是EGFP-Flag融合蛋白或是荧光素酶-Flag。
2、插入所筛选靶基因是克隆在报告基因终止码之后，两者不能形成一个融合蛋白，所筛选的基因作为3’端非翻译区的一部分。
3、报告基因及插入所筛选靶基因拥有同样一个启动子及poly A。
本发明的任意两个不同的pIII启动子为H1和U6。
本发明的在两个启动子之间插入的一个用于蓝白斑筛选的表达元件为细菌lacz alpha表达元件。
本发明的载体的3’端多克隆位点处插入的内参报告基因为RFP或EGFP基因。
上述小干扰RNA快速筛选的载体的构建方法包括下述步骤：
1、构建小干扰RNA载体的基本骨架
该基本骨架为3.0kb，并含有一个多克隆位点。
2、构建报告基因-Flag表达元件的载体
经过PCR扩增报告基因-Flag融合蛋白基因，PCR扩增25～35个循环，经转化感受态细胞DH5α、挑菌、碱性裂解法提取质粒DNA，经酶切鉴定，将阳性克隆经过NheI+BamHI双酶切与同样的酶切处理后pEAAL-CMV载体连接，获得的载体称之为pEAAL-CMV-报告基因-Flag，PCR扩增SV40pA，经XbaI+KpnI酶切与pEAAL-CMV-报告基因-Flag连接，获得报告基因-Flag表达元件的载体pEAAL-CMV-报告基因-Flag-SV40pA，在FLAG的3’端含有一个终止码，在终止码与pA之间有一多克隆位点，获得eGFP-Flag表达元件的载体。
3、构建小干扰RNA表达载体
报告基因-Flag表达元件的下游，通过PCR的方法将人H1启动子经KpnI+XhoI双酶切后克隆到pEAAL-CMV-报告基因-Flag-SV40pA载体中；在以上载体中将人mU6启动子经SpeI+SfuI双酶切后克隆到载体中，将用于蓝白斑筛选的表达元件经XhoI+SpeI双酶切后克隆到人H1及人mU6启动子之间，获得小干扰RNA表达载体。
4、构建小干扰RNA快速筛选的载体
通过PCR扩增内参报告基因，25-35个循环后收获DNA，经连接、挑菌，碱性裂解法提取质粒DNA，经酶切鉴定，将阳性克隆经过双酶切克隆到中间载体，将表达内参基因的表达元件经SfuI+NotI酶切后克隆在mU6启动子的下游，获得构建小干扰RNA快速筛选的载体。
本发明的步骤2中PCR扩增报告基因不含有终止密码子，并在3’端插入Flag TAA序列。
本发明的步骤2中在同一CMV启动子3’端，依次克隆报告基因和所筛选靶基因的表达元件。
小干扰RNA快速筛选的载体在筛选小干扰RNA中的用途。
小干扰RNA快速筛选的载体的使用方法如下：
1、克隆所筛选靶基因并插入快速筛选载体。
2、设计针对靶基因siRNA片段，并将其克隆插入快速筛选载体。
3、转染293细胞筛选最有效的siRNA干扰片段。
本发明siRNA快速筛选的载体(Rapid screening of siRNA target，pRSST)是在载体中含有一个双启动子(人U6及人H1 pol III启动子)，两个启动子之间有两个单一的酶切位点，用于体外合成表小干扰RNA片段的克隆。同时在载体中含有一个报告基因，如绿色荧光蛋白的表达元件，在此下游有一多克隆位点，可以克隆将要筛选小干扰RNA靶基因，在报告基因与靶基因片段之间有一个终止码。此外在载体中还有一个表达红色荧光蛋白的表达元件。将合成的小干扰RNA片段及相应的靶片段基因克隆到载体后，转染293细胞，根据绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白表达量的比例来判断小干扰RNA干扰效果。此种方法快速、简便筛选有效的小干扰RNA片段。
本发明的优点为：
1、小干扰RNA快速筛选的载体的报告基因与所筛选的靶基因是形成同一转录子，而不是形成融合蛋白，报告基的表达不受所插入靶基因序列的影响。根据报告基因表达的高低，在荧光显微镜下根据GFP荧光强度来直接判断小干扰RNA干扰效率，不需做Western blot、RT-PCR、Northern blot或real-time PCR等，因此快速、简便。
2、小干扰RNA快速筛选的载体含有内参报告基因，可以避免由于转染效率所带来的误判，本发明方法比较客观、正确。
3、使用本载体即可以判断小干扰RNA的干扰效率，不需与其它载体做共转染，转染效率高，便于结果的观察。
4、小干扰RNA快速筛选的载体采用两个pIII启动子表达小干扰RNA，直接使用两个DNA引物退火后将小干扰RNA克隆到两个启动子之间的酶切位点中。在两个启动子之间克隆细菌laczalpha的元件，通过蓝白斑来筛选小干扰片段的阳性克隆，因此本发明方法不仅可以非常容易克隆小干扰RNA而且阳性克隆筛选也非常容易，采用该方法筛选小干扰RNA费用低、省时。
附图说明
图1是pRSST/Hec1快速筛选载体骨架图。
图2是Hec1基因克隆到pRSST快速筛选载体图。
图3是siHec1片段克隆到pRSST/Hec1载体图。
图4是siHec1的PCR扩增片段图。
图5是siHec1克隆到pMirdown hU6载体图。
图6是pMirdown Hu6-siHec1降低GFP的表达图。
图7是pMirdown hU6-siHec1明显降低GFP的蛋白水平表达图。
图8是pRSST/Survivin双酶切鉴定电泳图。
图9是pRSST/Survivin-siRNA酶切鉴定电泳图。
图10是pMirdown-siSurvivin酶切鉴定电泳图。
图11是pMirdown-siSurvivin明显抑制Survivin的表达图。
图12是pMirdown-siSurvivin明显抑制eGFP蛋白水平的表达图。
图13是XIAP基因的克隆图。
图14是XIAP siRNA片段的克隆图。
图15是siXIAP的PCR扩增片段图。
图16是siXIAP的PCR扩增片段的克隆图。
图17是pMirdownhU6-siXIAP酶切鉴定电泳图。
图18是pMirdown-siXIAP明显抑制XIAP的表达图。
图19pMirdown-siXIAP明显抑制eGFP蛋白水平的表达图。
图20是小干扰RNA快速筛选载体的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
以报告基因为eGFP-Flag，pIII启动子为H1和U6启动子，位于pIII启动子为H1和U6启动子之间用于蓝白斑筛选的基因为细菌lacz alpha基因，内参报告基因为RFP的快速筛选为例其构建方法步骤如下：
1、构建小干扰RNA载体基本骨架
peGFPN1载体购自Clontech公司，经过AflII及AseI双酶切后与AseI-NheI-BamHI-PmeI-ClaI-XbaI-KpnI-XhoI-SpeI-SfuI-NotI-AflII linker相连接，其linker的序列为：ATTAATATGCTAGCAGGATCCAGTTTAAACATCGATAATCTAGAAGGTACCCTCGAGATACTAGTTTCGAACGCGGCCGCCTTAAG。
经T4连接酶14.5℃连接过夜，连接产物转化感受态细胞DH5α后，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落，接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，225rpm振荡培养过夜，经碱性裂解法提取质粒DNA，经过ClaI 37℃酶切及测序鉴定后，将阳性克隆载体称为pEAAL载体，即小干扰RNA载体基本骨架载体。将阳性克隆载体菌种-80℃保存，并将相应的载体中量提取DNA保存在-20℃。
2、构建报告基因eGFP-Flag表达元件的载体
经过PCR扩增CMV启动子，经PacI及NheI酶切后克隆到pEAAL载体中，所获得的载体称为pEAAL-CMV。将上游引物及下游引物经以下程序扩增eGFP-Flag融合蛋白基因，PCR扩增条件：94℃、5分钟，94℃、1分钟，55℃、1分钟，72℃、1分钟。使用Biorad PCR扩增仪，30个循环后收获DNA，用质量浓度为1％琼脂糖电泳纯化回收后与pGEMT-easy载体相连接，经转化感受态细胞DH5α后，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落，接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，225rpm振荡培养过夜，经碱性裂解法提取质粒DNA，酶切鉴定，将阳性克隆经过NheI+BamHI双酶切后与同样的酶切处理后pEAAL-CMV载体连接，获得的载体称为pEAAL-CMV-eGFP-Flag。PCR扩增SV40pA，经XbaI+KpnI酶切后与pEAAL-CMV-eGFP-Flag连接，获得eGFP-Flag表达元件的载体pEAAL-CMV-eGFP-Flag-SV40pA。在FLAG的3’端含有一个终止码。在终止码与pA之间有一多克隆位点，用于所筛选靶基因的克隆。以上所有的连接反应均是在T4连接酶的作用下，15℃度连接过夜，连接条件是：2μl酶切纯化片段，1μl 10×T4连接酶缓冲液，1μl酶切载体，0.5μl T4连接酶，5.5μl三蒸水，16℃连接过夜。连接产物转化感受态细胞DH5α，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落，接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，225rpm振荡培养过夜，经碱性裂解法提取质粒DNA，经相应酶切及测序鉴定，将菌种-80℃保存，并将相应的载体中量提取DNA保存在-20℃。
3、构建小干扰RNA表达载体
eGFP-Flag表达元件的下游，通过PCR的方法将人H1启动子经KpnI+XhoI双酶切后克隆到pEAAL-CMV-eGFP-Flag-SV40pA载体中；在以上载体中将人mU6启动子经SpeI+SfuI双酶切后克隆到载体中，将lacza基因经XhoI+SpeI双酶切后克隆到人H1及人mU6启动子之间，构建小干扰RNA表达载体。以上H1和U6启动子的位置可以互相替换。以上所有的连接反应均是在T4连接酶的作用下，15℃连接过夜，连接条件是：2μl酶切纯化片段，1μl 10×T4连接酶缓冲液，1μl酶切载体，0.5μl T4连接酶，5.5μl三蒸水，16℃连接过夜。连接产物转化感受态细胞DH5a，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中，挑取菌落，接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，225rpm振荡培养过夜，经碱性裂解法提取质粒DNA，经过相应酶切及测序鉴定，将菌种-80℃保存，并将相应的载体中量提取DNA保存在-20℃。
4、构建小干扰RNA快速筛选载体
通过PCR扩增RFP内参基因，PCR扩增条件：94℃、5分钟，94℃、1分钟，55℃、1分钟，72℃、1分钟。使用Biorad PCR仪，30个循环后收获DNA，经浓度为1％琼脂糖电泳纯化回收后 与pGEMT-easy载体相连接，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落，接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，225rpm振荡培养过夜，经碱性裂解法提取质粒DNA，经酶切鉴定后，将阳性克隆经过双酶切克隆到中间载体，将表达RFP内参基因的表达元件经SfuI+NotI酶切后克隆在mU6启动子的下游。以上所有的连接反应均是T4连接酶的作用下，15℃连接过夜，连接条件是：2μl酶切纯化片段，1μl 10×T4连接酶缓冲液，1μl酶切载体，0.5μl T4连接酶，5.5μl三蒸水，16℃连接过夜。连接产物转化感受态细胞DH5a，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落，接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，225rpm振荡培养过夜，经碱性裂解法提取质粒DNA，经过相应酶切及测序鉴定，获得小干扰RNA快速筛选载体，命名为pRSST。其结构的示意图可见图20。
实施2
以报告基因为荧光素酶，内参基因为EGFP的小干扰RNA快速筛选为例其构建方法步骤如下：
1、构建小干扰RNA载体基本骨架的方法与实施例1完全相同。
2、构建报告基因荧光素酶-Flag表达元件的载体
经过PCR扩增CMV启动子，经PacI及NheI酶切后克隆到pEAAL载体中，所获得的载体称为pEAAL-CMV。将上游引物及下游引物经以下程序扩增荧光素酶-Flag融合蛋白基因，PCR扩增条件：94℃、30秒，98℃、10秒，55℃、15秒，72℃、1分钟45秒。使用Biorad PCR扩增仪，25个循环后收获DNA，用质量浓度为1％琼脂糖电泳纯化回收后与pGEMT-easy载体相连接，经转化感受态细胞DH5α，涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落，接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，225rpm振荡培养过夜，经碱性裂解法提取质粒DNA，酶切鉴定，将阳性克隆经过NheI+BamHI双酶切后与同样的酶切处理后pEAAL-CMV载体连接，获得的载体称为pEAAL-CMV-荧光素酶-Flag。PCR扩增SV40pA，经XbaI+KpnI酶切后与pEAAL-CMV-荧光素酶-Flag连接，获得荧光素酶-Flag表达元件的载体pEAAL-CMV-荧光素酶-Flag-SV40pA。在FLAG的3’端含有一个终止码。在终止码与pA之间有一多克隆位点，用于所筛选靶基因的克隆。以上所有的连接反应均是在T4连接酶的作用下，15℃度连接过夜，连接条件是：2μl酶切纯化片段，1μl 10×T4连接酶缓冲液，1μl酶切载体，0.5μl T4连接酶，5.5μl三蒸水，16℃连接过夜。连接产物转化感受态细胞DH5α，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落，接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，225rpm振荡培养过夜，经碱性裂解法提取质粒DNA，经相应酶切及测序鉴定，将菌种-80℃保存，并将相应的载体中量提取DNA保存在-20℃。
3、构建小干扰RNA表达载体的方法与实施例1完全相同。
4、构建小干扰RNA快速筛选载体
通过PCR扩增EGFP内参基因，PCR扩增条件：94℃、5分钟，94℃、1分钟，55℃、1分钟，72℃、1分钟。使用Biorad PCR仪，25个循环后收获DNA，经浓度为1％琼脂糖电泳纯化回收后与pGEMT-easy载体相连接，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落，接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，225rpm振荡培养过夜，经碱性裂解法提取质粒DNA，经酶切鉴定后，将阳性克隆经过双酶切克隆到中间载体，将表达EGFP内参基因的表达元件经NheI+NotI酶切后克隆在mU6启动子的下游。以上所有的连接反应均是T4连接酶的作用下，15℃连接过夜，连接条件是：2μl酶切纯化片段，1μl 10×T4连接酶缓冲液，1μl酶切载体，0.5μlT4连接酶，5.5μl三蒸水，16℃连接过夜。连接产物转化感受态细胞DH5a，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。挑取菌落，接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，225rpm振荡培养过夜，经碱性裂解法提取质粒DNA，经过相应酶切及测序鉴定，获得小干扰RNA快速筛选载体。
实施例3
在以上的实施例1、2的构建小干扰RNA快速筛选载体步骤4中，通过PCR扩增EGFP内参基因，PCR扩增条件：94℃、5分钟，94℃、1分钟，55℃、1分钟，72℃、1分钟。使用BioradPCR仪，35个循环后收获DNA，经浓度为1％琼脂糖电泳纯化回收后与pGEMT-easy载体相连接，并涂布于含有100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板中。该步骤中的其它步骤与相应的实施例相同，其它步骤与相应的实施例相同。
实施例4
将实施例1构建的小干扰RNA快速筛选载体用于针对人Hec1 siRNA(siHec1)的快速筛选中的用途如下：
1、所筛选靶基因Hec1克隆插入快速筛选载体
将Hec1基因从pGEMT-easy载体上切下来回收，通过ClaI和SpeI两个酶切位点连接到siRNA快速筛选载体，其连接条件是：5μl酶切纯化片段，1μl 10×T4连接酶缓冲液，1μl酶切载体，0.5μl T4连接酶，2.5μl三蒸水，16℃连接过夜。接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，涂布于100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板上培养过夜，挑取单克隆菌落，接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA。用EcoRI酶切鉴定，切出一条1.2kb的带为阳性克隆，命名为pRSST/Hec1，克隆1-8为阳性，结果可见图2。
2、设计正对Hec1的siRNA片段，并将其克隆至pRSST/Hec1
(1)利用软件设计靶向Hec1基因的siRNA序列
在GenBank中取得Hec1基因全长mRNA序列，共2150个碱基。在siRNA设计网站(http://www.wi.mit.edu/index.html)选择6个不同的干扰靶点，在GenBank数据库中用BLAST检索，确认所设计的6个siRNA序列与靶细胞其它基因无同源性。根据上述结果分别合成6对针对Hec1编码序列的正义和反义的寡聚核苷酸片段。所设计的寡核苷酸序列及其靶向位点见表1。
表16对针对Hec1基因的siRNA寡核苷酸序列及其靶向位点
注：序列中间为所设计19bp siRNA的正义反义序列，最末端以6个T作为RNA聚合酶III的转录终止子，合成的序列两端有设计的XhoI和SpeI酶切位点。
(2)将干扰片段克隆到siRNA快速筛选载体
通过软件设计得到的6对针对人Hec1基因不同靶点的siRNA序列(L1-L12)由上海生工公司合成，合成产物浓度配制成20mM，将相对应的引物各取15μl，混合，在室温退火4小时，合成双链siRNA干扰片段。合成的6个siRNA片段通过XhoI和SpeI两个酶切位点分别克隆到针对人Hec1基因的siRNA快速筛选表达载体pRSST/Hec1中，将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，涂布于100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板上培养过夜，挑取单克隆接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA。质粒经XhoI酶切鉴定，切不动鉴定为阳性克隆，结果如图3所示，图中10至26为阳性克隆。阳性克隆命名为pRSST/Hec1-siRNA。载体结构可见图1。
3、转染293细胞筛选最有效的siRNA干扰片段
在转染前1天，将2×105个293细胞接种于每孔含体积浓度为10％的NCS的500μl DMEM培养基的24孔板中。采用脂质体Lipofectamine 2000TM进行转染293细胞，即在一个1.5ml的离心管中加入50μl OPTI-MEM，再加入3μl的pRSST/Hec1-siRNA混匀；在另一个1.5ml的离心管中加入1.5μl的脂质体，混合后作用5分钟，将DNA管中的溶液加入脂质体管中，混匀后室温静置20分钟，将混合物加入到含有10％NCS DMEM的24孔板中，4小时后换液，加入10％NCSDMEM培养基，24小时后，利用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达量，根据GFP表达量的强弱，最终筛选出最有效干扰片段L3、L4。即针对Hec1基因第962-984的siRNA片段。
4、检测筛选出的siRNA有效片段的干扰效果
(1)采用以下3个引物(P1-P3)进行PCR，其中以P3(靶向962-984的siRNA片段)为模板，P1及P2为上下游引物PCR扩增获得片段，如图4所示，回收纯化PCR产物克隆到pGEMT载体上进行扩增，测序正确后经XhoI及EcoRI酶切纯化，与经相同酶切的siRNA高效表达载体pMirdownhU6连接。连接条件是：2μl酶切纯化片段，1μl 10×T4连接酶缓冲液，1.5μl酶切载体，0.5μl T4连接酶，5μl三蒸水，6℃连接过夜。所获得的针对Hec1的siRNA片段表达载体命名为pMirdownhU6-siHec1，如图5所示，HindIII酶切鉴定为阳性克隆。其中合成的引物如下(划线部分为引入的限制性酶切位点)：
P1：5′mir30 PCR Xho I：CAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTG AGCG；
P2：3′mir30 PCR SpeI：CTAAAGTAGCCCCTTACTAGTCGAGGCAG AGGCA；
P3：5′TGCTGTTGA CAGTGAGCGA GCCATTCTTGACCAGAAATTAGGAAGCCACAGATGTAATTTCTGGTCAAGAATGGCGTGCCTACTGCTCGGA 3′。
(2)通过基因转染检测GFP表达
在转染的前1天，将1×106个293细胞接种于体积浓度为10％的NCS DMEM培养基的60mm培养皿中。采用CaCl2法共转染293细胞，即在一个1.5mL的离心管中加入250μL的pH7.14的2×HBS；在另一个1.5mL的离心管中加入25μL的摩尔浓度为215mol/L的CaCl2，2μg表达GFP的pSilencer-Hec1质粒DNA，8μg pMirdown hU6-siHec1，最后加入去离子水使之总体积为250μL；将DNA管中的液体缓缓加入含2×HBS的管中，然后在室温放置1分钟。最后将体积为500μL的混合物加入到含有2mL的20mL/L NCS DMEM培养基的60mm培养皿中，4小时后换液，加入4mL的体积浓度为10％的NCS DMEM培养基，72小时后检测GFP表达。16μg pMirdown hU6-siHec1和16μg pMirdownHu6-siControl CaCl2法共转染293细 胞方法与上述方法相同。经10倍荧光显微镜照相，如图6所示，图6中A为2μg pSilencer-Hec1和16μg的pMirdownHu6-siControl共转染组，作为对照组；B为2μg pSilencer-Hec1和8μgpMirdown hU6-siHec1共转染组，作为处理组；C为2μg pSilencer-Hec1和16μg pMirdownhU6-siHec1共转染组，作为处理组；结果表明，相比对照组A，处理组B、C荧光强度明显降低。
(3)用免疫印迹法测试蛋白水平的siRNA干扰效果
在细胞转染72小时后，收获细胞，并将细胞沉淀溶于含蛋白酶抑制剂细胞裂解液中，置于冰上裂解40分钟后，离心获得细胞裂解上清，经考马斯亮蓝定量，上样10μg样品，经S DS-PAGE，将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上，用针对Flag或α-GAPDH的单抗，与聚偏二氟乙烯膜反应，经二抗，ECL显影，获得免疫印迹实验结果。如图7所示，图7中37为2μg pSilencer-Hec1和16μgpMirdownHu6-siControl共转染组，作为对照组；38为2μg pSilencer-Hec1和8μg pMirdownhU6-siHec1共转染组，作为对照组；39为2μg pSilencer-Hec1和16μg pMirdown hU6-siHec1共转染组，作为对照组；结果显示，相比对照组37，处理组38，39明显降低了GFP的蛋白表达水平。
实施例5
将实施例1构建的小干扰RNA快速筛选载体用于针对Survivin的有效siRNA片段的快速筛选中的用途如下：
1、所筛选靶基因Survivin克隆插入快速筛选载体
两端克隆有ClaI和XbaI的Survivin基因连接到pGEMT-easy载体上经进一步扩增后，通过ClaI和XbaI双酶切该连接产物，37℃孵育2个小时，进行质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段。将该目的基因片段与siRNA快速筛选载体连接，命名为pRSST/Survivin。连接条件是：5μl酶切纯化片段，1μl 10×T4连接酶缓冲液，2μl酶切载体，0.5μl T4连接酶，1.5μl三蒸水，16℃连接过夜。连接产物pRSST/Survivin转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，涂布于100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板上培养过夜，挑取单克隆接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA。质粒经ClaI与XbaI双酶切鉴定。切出一条约430bp带的为阳性克隆。电泳结果如图8所示，在图8中，M为DNA分子量标准，40-43为pRSST/Survivin，40-43都为阳性克隆。
2、设计针对Survivin的siRNA片段，并将其克隆至pRSST/Survivin
(1)利用软件设计针对靶向Survivin基因的siRNA片段
根据GenBank数据库提供的人Survivin(NM_001168)的cDNA序列，在siRNA设计网站 (http://www.wi.mit.edu/index.html)选择6个不同的干扰位点，在GenBank数据库中用BLAST检索，确认所设计的6个siRNA序列与靶细胞其它基因无同源性。根据上述结果分别合成6对针对Survivin编码序列的正义和反义的寡聚核苷酸片段。序列两端分别为XhoI和SpeI酶切位点，最末端以6个T作为RNA聚合酶III的转录终止子。应用网络所设计的寡核苷酸序列及其靶向位点见表2。
表26对针对Survivin基因的siRNA寡核苷酸序列及其靶向位点
(2)将干扰片段克隆到siRNA快速筛选载体
将利用网络工具设计的针对人Survivin基因不同位点的6个siRNA片段(F1-F6)由上海生工合成。将所合成的6对引物分别稀释到20mMol，分别取每对引物的两条互补寡合苷酸链15μl至离心管中在室温退火4小时，将结合成双链的6个siRNA片段通过XhoI和SpeI两个酶切位点分别连接到快速筛选载体pSilencer-Survivin中，连接产物命名为psilencer-Survivin-siRNA。连接条件是：2μl酶切纯化片段，1μl 10×T4连接酶缓冲液，1μl酶切载体，0.5μl T4连接酶，5.5μl三蒸水，16℃连接过夜。连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，涂布于100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板上培养过夜，挑取单克隆接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA。质粒经XhoI酶切鉴定。结果如图9所示，在图9中，M为DNA分子量标准，44-53为pRSST/Survivin-siRNA，C为pSilencer-Survivin，作为对照质粒，是没有经过酶切的DNA。相比阳性对照C，44-53为酶切不动，鉴定为阳性克隆。阳性克隆命名为 pRSST/Survivin-siRNA
3、转染293细胞筛选最有效的siRNA干扰片段
在转染的前1天，将2×105个293细胞接种于每孔含体积浓度为10％NCS的500μl DMEM培养基的24孔板中。用脂质体Lipofectamine 2000TM进行转染293细胞，即在一个1.5ml的离心管中加入50μl的OPTI-MEM培养基，再加入4μl的pRSST/Survivin-siRNA混匀；在另一个1.5ml的离心管中加入2μl的脂质体，混合后作用5分钟，将DNA管中的溶液加入脂质体管中，混匀后室温静置20分钟，将混合物加入到含有体积浓度为10％的NCS DMEM培养基的24孔板中，各转染组均做复孔，转染后48小时通过观察检测绿色荧光蛋白(eGFP)表达的强弱来筛选沉默效率最高的siRNA片段。确定F6为最有效的干扰片段，即针对Survivin基因第151-173位点的siRNA片断。
4、检测筛选出的siRNA有效片段的干扰效果
(1)pMirdown-siSurvivin载体的构建
根据最终选择的siRNA片段，采用以下3个引物(P1-P3)，其中以P3为模板，P1及P2为上下游引物进行PCR扩增。引物中的下划线部分为引入的限制性酶切位点。
P1：5′mir30PCR XhoI：CAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCG，
P2：3′miR30PCR EcoRI：CTAAAGTAGCCCCTTGAATTCCGAGGCAGTAGGCA，
P3：TGCTGTTGACAGTGAGCGAGCCAGACTTGGCCCAGTGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACACTGGGCCAAGTCTGGCGTGCCTACTGCCTCGGA。
获得的片段与pGEMT-easy载体连接，测序正确后，经XhoI及EcoRI酶切纯化后与根据mir30骨架所设计合成的小干扰RNA表达载体pMirdown连接。经过HindIII酶切鉴定结果，其中切不动为阳性克隆。结果如图10所示，在图10中，M为DNA分子量标准；54-62为pMirdown-siSurvivin；C为pMirdown-siSurvivin clone1作为对照质粒，是没有经过酶切的DNA。相比对照质粒，54-62表现为酶切不动，鉴定为阳性克隆，所获得的针对Survivin的小干扰RNA片段表达载体称为pMirdown-siSurvivin。
(2)通过基因转染检测GFP表达
在转染的前1天，将1×106个293细胞接种于体积浓度为10％的NCS DMEM培养基的60mm培养皿中。采用CaCl2方法转染293细胞，即在一个1.5mL的离心管中加入250μL的pH7.4为2×HBS；在另一个1.5mL的离心管中加入25μL的摩尔浓度为2.5mol/L CaCl2，16μg的psilencer-Survivin及2μg的pMirdown-siSurvivin，最后加入去离子水使之总体积为250μL；将含DNA管中的液体缓慢加入含2×HBS的管中，在室温放置1分钟，将体积为500μL的混合物加入到含有2mL的体积浓度为2％的NCS DMEM培养基的60mm培养皿中，4小时后换液，加入4mL的 体积浓度为10％的NCS DMEM培养基，48小时后通过GFP表达情况检测干扰效果。非相关DNApControl的CaCl2方法与上述方法相同，作为对照组。如图11所示，在图11中，D为pMirdown-siSurvivin组，E为pMirdown hU6-control，作为阴性对照。D组与E组相比，D组可显著抑制Survivin的表达，GFP表达强度明显低于E组。
(3)免疫印迹检测蛋白水平siRNA干扰效果
在细胞转染48小时后，收获细胞，并将细胞沉淀溶于含蛋白酶抑制剂细胞裂解液中，置于冰中裂解40分钟后，离心获得细胞裂解上清，经考马斯亮蓝定量，上样30μg样品，经SDS-PAGE后，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用针对Flag或a-tubulin的单克隆抗体与硝酸纤维素膜反应，经二抗，ECL显影，获得结果。如图12所示，在图12中，63为pMirdownhU6-siControl，作为对照组；64为pMirdown-siSurvivin，免疫印迹实验结果显示，相比对照组，pMirdown-siSurvivin明显抑制eGFP蛋白水平的表达。
实施例6
将实施例1构建的小干扰RNA快速筛选载体用于针对人XIAP的有效siRNA片段的快速筛选中的用途如下：
1、所筛选靶基因Survivin克隆插入快速筛选载体
利用XbaI与ClaI酶将目的基因XIAP从pGEM-T easy载体上切下回收并与siRNA筛选载体连接，连接条件是：2μl酶切纯化片段，1μl 10×T4连接酶缓冲液，1μl酶切载体，0.5μl T4连接酶，5.5μl三蒸水，16℃连接过夜。连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，涂布于100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板上培养过夜，挑取单克隆接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA。质粒经HindIII酶切鉴定，切成线性的为阳性克隆命名为pRSST/XIAP，结果如13所示，在图13中，M为DNA分子量标准.其中除72，均切成线性，为阳性克隆。
2、设计针对人XIAP的siRNA片段，并将其克隆至pRSST/XIAP
(1)针对人XIAP设计不同序列的siRNA序列
根据GenBank数据库提供的人XIAP基因全长序列(2540bp)，选取XIAP编码区(34-1527bp)提交siRNA设计网站(http://www.wi.mit.edu/index.html)选择干扰位点，在GenBank数据库中用BLAST检索，确认所设计siRNA序列与靶细胞其他基因无同源性。根据上述结果分别合成六对针对XIAP编码序列的正义和反义的寡聚核苷酸片段。最末端以6个T作为RNA聚合酶III的转录终止子。
合成的序列两端有设计的XhoI和SpeI酶切位点见表3。
表3 6对人XIAP基因的siRNA寡核苷酸序列及其靶向位点
(2)将干扰片段克隆到siRNA快速筛选载体
将合成的六对引物的正义和反义寡聚核苷酸片段分别各取15μl等比例混合，命名为F1-F6。利用XhoI和SpeI酶切位点连入到pRSST/XIAP中。连接条件是：2μl酶切纯化片段，1μl10×T4连接酶缓冲液，1μl酶切载体，0.5μl T4连接酶，5.5μl三蒸水，16℃连接过夜。连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，涂布于100μg/ml的氨苄青霉素的LB平板上培养过夜，挑取单克隆接种到100μg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14～16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA。质粒经XhoI酶切鉴定，切不动为阳性克隆。阳性克隆命名为pRSST/XIAP-siRNA，如图14所示，在图14中，M为DNA分子量标准；C为对照pSilencer-XIAP，作为对照质粒，是没有经过酶切的DNA。相比对照质粒，74～79为pRSST/Survivin-siRNA，酶切不动为阳性克隆。
3、转染293细胞筛选最有效的siRNA干扰片段
在转染前1天，将2×105个293细胞接种于含有体积浓度为10％的NCS DMEM培养基的24孔板中。采用脂质体法转染293细胞，即在一个1.5ml的离心管中加入50ul OPTI-MEM，加入3μl的DNA，混匀后作用5分钟；在另一个1.5ml的离心管中加入1.5μl的脂质体，混合后作用5分钟，1.5ml的离心管中的溶液加入脂质体管中，混匀后作用20分钟，将混合物加入到体积浓度为10％的NCS DMEM培养基的24孔板中，4小时后换液，加入体积浓度为10％的NCS DMEM培养基，分别在24、48小时后，检测绿色荧光蛋白的表达量，能有效降低绿色荧光蛋白的表达强度的即为最有效的沉默人XIAP的siRNA片段。最终筛选出最有效干扰片段F1。即针对XIAP基因660-682bp的片段。
4、检测筛选出的siRNA有效片段的干扰效果
(1)pMirdownhU6-siXIAP载体的构建
采用以下3个引物(P1-P3)，其中以P3为模板，P1、P2为上下游引物PCR扩增获得片段，如图15所示，在图15中，黑色箭头表PCR产物。连入pGEM-T easy载体，EcoR I酶切鉴定正确，如图16所示，在图16中，M为DNA分子量标准，81-97为阳性克隆。测序正确后经XhoI及EcoRI酶切纯化后与siRNA高效表达载体pMirdownhU6连接，所获得的针对XIAP的siRNA片段表达载体用HindIII酶切，酶切不动为阳性克隆，命名为pMirdownhU6-siXIAP。如图17所示，在图17中，M为DNA分子量标准，88-99为阳性克隆。
合成的引物如下(划线部分为引入的限制性酶切位点)：
P1：5′mir30 PCR XhoI：CAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCG；
P2：3′mir30 PCR Spe I：CTAAAGTAGCCCCTTACTAGTCGAGGCAGTAGGCA；
P3：5′TGCTGTTGACAGTGAGCGA GGCGACACTTTCCTAATTGTAGTGAAGCCACAGATGTACAATTAGGAAAGTGTCGCCGTGCCTACTGCCTCGGA 3′。
(2)通过基因转染检测GFP表达
在转染的前1天，将1×106个293细胞接种于体积浓度为10％的NCS DMEM培养基的60mm培养皿中。用CaCl2方法转染293细胞，即在一个1.5mL的离心管中加入250μL的pH7.14的2×HBS；在另一个1.5mL的离心管中加入25μL的摩尔浓度为2.5mol/L的CaCl2，0.5μgXIAP表达载体，2μgMirdownhU6-siXIAP，最后加入去离子水至250μL；将含DNA的离心管中的液体缓缓加入含2×HBS的管中，室温放置1分钟，将500μL的混合液加入到含有2mL的体积浓度为2％的NCS DMEM培养基的60mm培养皿中，4小时后换液，加入4mL的体积浓度为10％的NCS DMEM，24～48小时后，检测GFP表达。4μg pMirdownhU6-siXIAP以及2μg pMirdownhU6-siControl的CaCl2转染方法与上述方法相同。如图18所示，在图18中，F为pMirdownhU6-siControl，作为对照组；G代表XIAP表达载体与MirdownhU6-siXIAP的质量比例为1∶4的处理组；H代表XIAP表达载体和MirdownhU6-siXIAP的质量比例为1∶8的处理组，相比F组，显示G和H组可显著抑制目的基因XIAP的表达，eGFP表达强度明显低于对照。
(3)免疫印迹检测蛋白水平siRNA干扰效果
细胞转染60小时后，收获细胞，将细胞沉淀溶于含蛋白酶抑制剂细胞裂解液中，置于冰中40分钟，离心得细胞裂解上清，经考马斯亮蓝定量，上样30μg样品，经SDS-PAGE，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用针对GFP-Flag和Alpha-tubulin的单克隆抗体与硝酸纤维素膜反应，经二抗，ECL显影，如图19所示，在图19中，100为pMirdownhU6-siControl，作为对照组；101是 XIAP表达载体与MirdownhU6-siXIAP的质量比例为1∶4的处理组；102是XIAP表达载体和MirdownhU6-siXIAP的质量比例为1∶8的处理组，相比对照组，pMirdownhU6-siXIAP组可显著抑制目的基因XIAP的表达，GFP蛋白水平明显降低。
核苷酸序列
核苷酸序列表
<110>陕西师范大学
<120>小干扰RNA快速筛选的载体及其构建方法和应用
<160>1
<210>1
<211>86
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域；新的或少见的特征
attaatatgc tagcaggatc cagtttaaac atcgataatc 40
tagaaggtac cctcgagata ctagtttcga acgcggccgc 80
cttaag 86
Claims (9)
1.一种小干扰RNA快速筛选的载体，其特征在于：小干扰RNA快速筛选载体具有一个3.0kb的骨架载体并含有一个多克隆位点，在所述的快速筛选载体5’端的多克隆位点处存在报告基因表达原件及用于插入一个筛选靶基因表达元件的多克隆位点，其下游存在两个相反方向的任意两个不同的pIII启动子，两个启动子之间有两个酶切位点，并在两个酶切位点之间插入一个用于蓝白斑筛选的表达元件，在所述的快速筛选载体的3’端多克隆位点处插入一个内参报告基因表达原件；所述的筛选靶基因是克隆在报告基因终止码之后。
2.按照权利要求1所述的小干扰RNA快速筛选的载体，其特征在于所说的快速筛选载体5’端多克隆位点处存在的报告基因及插入所筛选靶基因的表达元件为：
(1)所采用的报告基因是EGFP-Flag融合蛋白或是荧光素酶-Flag；
(2)插入所筛选靶基因是克隆在报告基因终止码之后，两者不能形成一个融合蛋白，所筛选的基因的转录本作为3’端非翻译区的一部分；
(3)报告基因及插入所筛选靶基因拥有同样一个启动子及poly A。
3.按照权利要求1所述的小干扰RNA快速筛选的载体，其特征在于：所说的任意两个不同的pIII启动子为H1和U6。
4.按照权利要求1所述的小干扰RNA快速筛选的载体，其特征在于：所说的在两个启动子之间插入的一个用于蓝白斑筛选的表达元件为细菌lacz alpha表达元件。
5.按照权利要求1所述的小干扰RNA快速筛选的载体，其特征在于：所说的快速筛选载体的3’端多克隆位点处插入的内参报告基因为RFP或EGFP基因。
6.一种小干扰RNA快速筛选的载体的构建方法，其特征在于它包括下述步骤：
(1)构建小干扰RNA载体的基本骨架
该基本骨架为3.0kb，并含有一个多克隆位点；
(2)构建报告基因-Flag表达元件的载体
经过PCR扩增报告基因-Flag融合蛋白基因，PCR扩增25～35个循环，经转化感受态细胞DH5α、挑菌、碱性裂解法提取质粒DNA，经酶切鉴定，将阳性克隆经过NheI+BamHI双酶切与同样的酶切处理后pEAAL-CMV载体连接，获得的载体称之为pEAAL-CMV-报告基因-Flag，PCR扩增SV40pA，经XbaI+KpnI酶切与pEAAL-CMV-报告基因-Flag连接，获得报告基因-Flag表达元件的载体pEAAL-CMV-报告基因-Flag-SV40pA，在FLAG的3’端含有一个终止码，在终止码与pA之间有一多克隆位点，获得eGFP-Flag表达元件的载体；
(3)构建小干扰RNA表达载体
报告基因-Flag表达元件的下游，通过PCR的方法将人H1启动子经KpnI+XhoI双酶切后克隆到pEAAL-CMV-报告基因-Flag-SV40pA载体中；在以上载体中将人mU6启动子经SpeI+SfuI双酶切后克隆到载体中，将用于蓝白斑筛选的表达元件经XhoI+SpeI双酶切后克隆到人H1及人mU6启动子之间，获得小干扰RNA表达载体；
(4)构建小干扰RNA快速筛选的载体
通过PCR扩增内参报告基因，25～35个循环后收获DNA，经连接、挑菌，碱性裂解法提取质粒DNA，经酶切鉴定，将阳性克隆经过双酶切克隆到中间载体，将表达内参报告基因的表达元件经SfuI+NotI酶切后克隆在mU6启动子的下游，获得构建小干扰RNA快速筛选的载体。
7.按照权利要求6所述的小干扰RNA快速筛选的载体的构建方法，其特征在于：所说的步骤(2)中PCR扩增报告基因不含有终止密码子，并在3’端插入Flag TAA序列。
8.按照权利要求6所述的小干扰RNA快速筛选的载体的构建方法，其特征在于：所说的步骤(2)中在同一CMV启动子3’端，依次克隆报告基因和所筛选靶基因的表达元件。
9.权利要求1的小干扰RNA快速筛选的载体在筛选小干扰RNA中的用途。
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| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
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Inventor after: Xia Haibin Inventor after: Zheng Xiaojing Inventor after: Wang Dongyang Inventor after: Bian Ye Inventor after: Sun Xiaocong Inventor after: Feng Zhenzhen Inventor after: Li Jing Inventor before: Xia Haibin Inventor before: Bian Ye Inventor before: Wang Dongyang Inventor before: Sun Xiaocong Inventor before: Feng Zhenzhen Inventor before: Li Jing Inventor before: Zheng Xiaojing |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: XIA HAIBIN BIAN YE WANG DONGYANG SUN XIAOCONG FENG ZHENZHEN LI JING ZHENG XIAOJING TO: XIA HAIBIN ZHENG XIAOJING WANG DONGYANG BIAN YE SUN XIAOCONG FENG ZHENZHEN LI JING |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20121107 Termination date: 20150611 |
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| EXPY | Termination of patent right or utility model |