WO2017214948A1 - 一种敲低人 miRNA-148a 表达的慢病毒载体的构建及其应用 - Google Patents

一种敲低人 miRNA-148a 表达的慢病毒载体的构建及其应用 Download PDF

Info

Publication number
WO2017214948A1
WO2017214948A1 PCT/CN2016/086075 CN2016086075W WO2017214948A1 WO 2017214948 A1 WO2017214948 A1 WO 2017214948A1 CN 2016086075 W CN2016086075 W CN 2016086075W WO 2017214948 A1 WO2017214948 A1 WO 2017214948A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sequence
cells
medium
vector
mir
Prior art date
Application number
PCT/CN2016/086075
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
毛侃琅
Original Assignee
毛侃琅
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 毛侃琅 filed Critical 毛侃琅
Priority to PCT/CN2016/086075 priority Critical patent/WO2017214948A1/zh
Publication of WO2017214948A1 publication Critical patent/WO2017214948A1/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/867—Retroviral vectors

Definitions

  • the present invention relates to the field of gene editing and epigenetics, and in particular to the construction and application of a lentiviral vector which knocks down the expression of human miRNA-148a.
  • MicroRNAs are a class of endogenous, non-coding RNAs found in eukaryotes, typically between 22 and 25 nt in size. miRNAs are widely distributed in plants, animals, and multicellular organisms, and can Play an important regulatory role, and in the study of human miRNAs, it is found that the expression of miRNA in normal tissues and tumor tissues is significantly different, some miRNAs are lowly expressed in tumor tissues, and some are highly expressed in tumor tissues. This suggests that miRNAs play a crucial role in tumorigenesis. technical problem
  • RNA-148a Small molecule RNA-148a (miR-148a) is a microRNA that has been studied more in recent years. It has been reported that miR-148a is closely related to exogenous substance metabolism, apoptosis, occurrence, development and epigenetics of various cancers, so it is important to study the function of miR-148a. At present, miRNA function research is generally achieved by miRNA overexpression and silencing. miRNA silencing is the presentation of artificially synthesized oligonucleotide small molecules into cells, forming heteroduplexes with endogenous miRNAs, and reducing miRNAs to target genes. Inhibition to achieve regulation of gene function.
  • silencing of miRNAs is currently difficult to achieve.
  • the commonly used methods for silencing miRNA are anti-miR, antagomiR, miRNA sponge, etc.
  • anti-miR and antagomiR are transient transfection techniques, and the interference effect cannot be stably maintained, while the mi RNA sponge effect is far from optimal.
  • Tough Decoy RNA is a novel miRNA-inhibiting miRNA that inhibits miRNA by introducing double-stranded RNA to adsorb target miRNAs. Since the inserted RNA is double-stranded and has a secondary structure of a stem loop, it is resistant to intracellular nuclease degradation and can inhibit miRNA for a long time, stably and efficiently. Problem solution
  • the object of the present invention is to provide a Tumor RNA for constructing miR-148a interference and construct a lentiviral vector capable of stably maintaining interference effects, and apply it to the field of gene editing, in view of the deficiencies in the prior art.
  • the gene interference sequence of miR-148a corresponding TuD RNA was designed and synthesized, and the nucleotide sequence thereof is shown in SEQ ID ⁇ .: 1. This sequence was ligated to the lentiviral vector pLKO.l-puro to obtain a lentiviral vector pLKO-Tud-148a lentiviral vector capable of stably maintaining the interference effect, the nucleotide sequence of which is shown in SEQ ID NO.: 2
  • the present invention is designed to synthesize the gene interference sequence of the corresponding TuD RNA of miR-148a, and is ligated to the lentiviral vector pLKO.l-puro, and the resulting vector has the function of interfering with miR-148a, and the specific integration steps as follows:
  • S20 The synthesized sequence is two complementary single-stranded DNA. Dissolve two single-stranded DNA in ddH20
  • the digested vector was recovered using the MinElute Reaction Cleanup Kit, and the TuD obtained in the previous step was further treated with T4 DNA ligase.
  • RNA sequence was ligated into the vector pLKO.l-puro to form the recombinant vector pLKO-TuD-148a, and finally the ligation product was transformed into competent E. coli ToplO and plated onto a plate containing ampicillin LB medium, 37 ° C culture for 14 h. Five single colonies were picked from the plates and added to 5 tubes of ampicillin-containing liquid LB medium for 8 hours at 37 °C. The bacteria were sent to Shanghai Biotech for sequencing. Take the correct sequencing strain and extract it with the endotoxin-free plasmid extraction kit. The extracted plasmid is required by the invention. The plasmid that interferes with miR-148a.
  • miR-148a designed by the present invention interferes with TuD
  • FIG. 1 is a schematic view showing the structure of a pLKO-TuD-148a lentiviral expression vector according to an embodiment
  • FIG. 2 is a flow diagram showing the steps required to transform the lentiviral expression vector shown in FIG. 1 into the lentiviral vector of the present invention
  • Example 3 is the expression level of miR-148a of 16HBE cells and TuD-148a cells in Example 6.
  • the lentiviral plasmid pLKO. l-puro vector used in the present invention was purchased from Addgene; the human bronchial epithelial cells (16HBE cell strain) used in the present invention were purchased from the United States ATCC; S-Poly(T) hsa-miR- 148a qPCR-assay primer set miRNA reverse transcription and fluorescence quantification kit was purchased from Shenzhen Anran Biotechnology Co., Ltd.
  • RNA design sequence and the sequence information of miR-148a provided in miRBase designed the TuD RNA oligonucleotide sequence targeting miR-148a, the sequence of which is shown in SEQ ID NO.: l, commissioned by Shanghai Biotech to synthesize the gene. Way to synthesize.
  • the synthesized sequence is two complementary single-stranded DNAs.
  • the two single-stranded DNAs were dissolved in ddH20, mixed at an equimolar ratio, treated at 95 ° C for 5 min, and allowed to cool to room temperature by allowing them to stand at room temperature.
  • the vector pLK0.1-puro was extracted and digested with Age I and Eco RI for 16 h, and the digested vector was recovered with MinElute Reaction Cleanup Kit, and then T4 DNA was used.
  • RNA sequence was ligated into the vector pLKO.l-puro to form the recombinant vector pLKO-Tud-148a, and finally the ligation product was transformed into competent E. coli ToplO and plated onto a plate containing ampicillin LB medium, 37 ° C culture for 14 h. Five single colonies were picked from the plate and added to 5 test tubes of liquid LB medium containing ampicillin for 8 h at 37 °C. The bacteria were sent to Shanghai Biotech for sequencing. The sequencing results were completely correct. This is the pLKO-Tud-148a lentiviral recombinant vector.
  • the dilution ratio of the solution of the recombinant lentivirus is 1, 10, 100, 1000, 10000, 1
  • the solution of the recombinant lentivirus was serially diluted with a medium, and then 100 gradient-diluted solutions of the recombinant lentivirus and 10 (L perforated plate in a cell culture medium in a multiwell plate) Mixed transfection in different wells, 24 h after transfection, aspirate the medium and replace with 50 (L containing 5 U DNasel in fresh medium, incubate at 37 °C for 30 min to remove residual plasmid DNA that may attach to the cell surface Then, the medium was changed to 1 mL of normal medium, and the cultivation was continued for 48 hours;
  • T 20000 x R, where T is the lentivirus titer, T is in units of TU/mL, and R is the dilution factor.
  • the lentivirus titer of the package is greater than 10000000 TU/mL, indicating that the packaging of the lentivirus is successful.
  • 16HBE cells were seeded in 6-well plates, 1000000 cells per well, and the cell density was about 50% after 12 hours.
  • the virus solution was taken separately, and the virus was diluted 10 times with DMEM complete medium, and then polyglycolamine was added.
  • the medium in the 6-well plate was removed, and the virus-containing DMEM complete medium (containing 10% fetal bovine serum) was added. After 24 hours, the virus-containing DMEM complete medium was discarded, and the fresh DMEM complete medium was replaced. After 24 hours, 0.5 was used.
  • the cells were screened at a g/ml concentration of puromycin. After 10 days of screening, the medium was changed once every 3 days, and the concentration of puromycin was continuously increased to 1.0 g/ml.
  • the cell line obtained by screening was named TuD-148a cell line.
  • the miRNA extraction and isolation kit extracts the miRNAs of these cells, and then uses S-Poly(T) hsa-miR-148a qPCR-assay primer
  • the set kit reverse-transcribes and tails the miRNA to obtain the corresponding cDNA.
  • the cDNA of 2 kinds of cells was used as a template, and the expression level of h Sa -miR-148a was detected by real-time PCR. The experiment was repeated 3 times, and 3 parallel samples were set per well to snord.
  • RNA sequence with stem-loop structure not easy to degrade, double-stranded Tud RNA relative to currently used single-stranded miRNAs

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

一种特异抑制人miRNA-148a表达的慢病毒载体的构建及其应用，包括pLKO.1-puro表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和靶向miRNA-148a的寡核苷酸序列。所述多克隆位点包括Age I酶切位点和EcoR I酶切位点；所述靶向miRNA-148a的寡核苷酸序列正向插入所述多克隆位点中。pLKO-Tud-148a慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少，可持续、高效、稳定、特异地抑制人miRNA-148a表达的优点，可作为有力工具应用于制备治疗miRNA-148a表达异常相关疾病的药物。

Description

一种敲氐人 miRNA-148a表达的慢病毒载体的构建及其 应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因编辑领域和表观遗传领域研究， 具体地涉及一种敲低人 miRNA - 148a表达的慢病毒载体的构建及其应用。
背景技术
[0002] MicroRNA (miRNA) 是在真核生物中发现的一类内源性的非编码 RNA， 大小 一般在 22-25 nt之间， miRNA广泛分布于植物、 动物和多细胞生物中， 并且能发 挥重要的调节作用， 而在人类 miRNA的研究中， 发现 miRNA在正常组织和肿瘤 组织中的表达有着显著差异， 有些 miRNA会在肿瘤组织中有低表达， 有些则在 肿瘤组织中有高表达， 这说明 miRNA在肿瘤发生过程中起了至关重要的作用。 技术问题
[0003] 小分子 RNA- 148a (miR-148a) 是近几年研究得较多的一种 microRNA。 据报道 ， miR-148a与外源性物质代谢、 细胞凋亡、 多种癌症的发生、 发展和表观遗传 等都密切有关， 因此研究 miR-148a的功能至关重要。 目前 miRNA功能研究一般 通过 miRNA过表达和沉默来实现， miRNA沉默是把人工合成的寡核苷酸小分子 提呈到细胞内， 与内源性 miRNA形成异源双链， 使 miRNA降低对靶基因的抑制 作用， 以实现对基因功能的调控。 miRNA沉默， 特别是长期稳定沉默目前较难 以实现。 常用的沉默 miRNA的方法主要有 anti-miR， antagomiR, miRNA sponge 等， 其中 anti-miR和 antagomiR为瞬吋转染技术， 其干扰效果不能稳定保持， 而 m iRNA sponge效果远未达到最优， 目前也未出现针对 miR- 148a干扰进行优化提升 其效果的报道。
[0004] Tough Decoy RNA (Tud RNA) 是一种新幵发出的 miRNA抑制手段， 其通过引 入双链 RNA对目标 miRNA进行吸附， 达到抑制 miRNA的目的。 由于弓 |入的 RNA 为双链并且带有茎环的二级结构， 因此其够抵抗胞内核酸酶的降解， 能长期、 稳定和高效地抑制 miRNA。 问题的解决方案
技术解决方案
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中的不足， 提供一种用于构建 miR-148a干扰的 Tu D RNA, 并构建能稳定保持干扰效果的慢病毒载体， 将其应用到基因编辑领域
[0006] 为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案如下：
[0007] 设计并合成 miR-148a相应 TuD RNA的基因干扰序列， 其核苷酸序列如 SEQ ID ΝΟ.: 1所示。 将该序列与慢病毒载体 pLKO.l-puro连接， 获得能稳定保持干扰效 果的慢病毒载体 pLKO-Tud-148a慢病毒载体， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.: 2所示
[0008] [0008]本发明通过设计并合成 miR-148a相应 TuD RNA的基因干扰序列， 与慢病 毒载体 pLKO.l-puro连接， 形成的载体具有能干扰 miR-148a的作用， 具体整合的 步骤如下：
[0009] S10、 miR-148a TuD的设计与合成： 根据 TuD
设计序列和 miRBase中提供的 miR-148a的序列信息， 设计出针对 miR- 148a的 TuD RNA寡核苷酸序列， 其序列如 SEQ ID NO.: 1所示， 委托上海生工以引物的方式 合成该序列。
[0010] S20、 合成好的序列是两条互补的单链 DNA。 将两条单链 DNA溶解于 ddH20中
， 按照等摩尔比混合后， 95°C处理 5 min， 再将其置于室温使其自然冷却至室温
[0011] S30、 提取载体 pLKO.l-puro, 使用 Age I和 Eco RI酶双酶切处理 16
h后， 用 MinElute Reaction Cleanup Kit回收酶切后的载体， 再用 T4 DNA连接酶将 上一步得到的 TuD
RNA序列连接到载体 pLKO.l-puro中， 形成重组载体 pLKO-TuD- 148a， 最后将连 接产物转化到感受态大肠杆菌 ToplO中， 并涂布到含氨苄青霉素 LB培养基的平板 上， 37 °C培养 14 h。 从平板中挑取 5个单菌落， 分别加入到 5支含氨苄青霉素的液 体 LB培养基的试管中 37 °C振荡培养 8 h后， 将菌液送至上海生工测序。 取测序正 确的菌株里并用无内毒素质粒小量提取试剂盒提取， 提取的质粒为本发明所需 的干扰 miR- 148a的质粒。
发明的有益效果
有益效果
[0012] 本发明设计的 miR-148a干扰 TuD
RNA序列带有茎环结构， 不容易降解， 双链的 Tud
RNA相对目前常用的单链的 miRNA
sponge, 其结合效率更高， 能更好地实现 miR-148a的干扰。
对附图的简要说明
附图说明
[0013] 图 1为一实施方式所述 pLKO-TuD-148a慢病毒表达载体的结构示意图；
[0014] 图 2为将图 1所示的慢病毒表达载体改造为本发明所述慢病毒载体所需步骤的流 程图；
[0015] 图 3为实施例六中 16HBE细胞与 TuD-148a细胞的 miR-148a的表达水平情况。
实施该发明的最佳实施例
本发明的最佳实施方式
[0016] 根据下述实施例， 可以更好地理解本发明。 然而， 本领域的技术人员容易理解 ， 实施例所描述的具体的物料配比、 工艺条件及其结果仅用于说明本发明， 而 不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。 下述实施例中所用的方 法如无特别说明均为常规方法； 所述试剂如无特殊说明， 均为市售产品。 具体 步骤可参见： 《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook, J., Russell, David W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor) °
[0017] 本发明所使用的慢病毒质粒 pLKO. l-puro载体购自 Addgene; 本发明所使用的人 支气管上皮细胞 （16HBE细胞株） 购自美国 ATCC; S-Poly(T) hsa-miR-148a qPCR-assay primer set miRNA逆转录和荧光定量试剂盒购自深圳市盎然生物科技 有限公司。
[0018] 实施例一 miR-148a TuD RNA的设计与合成 [0019] 根据 TuD
RNA设计序列和 miRBase中提供的 miR-148a的序列信息， 设计出针对 miR- 148a的 TuD RNA寡核苷酸序列， 其序列如 SEQ ID NO.:l所示， 委托上海生工以基因合 成的方式合成。
[0020] 实施例二序列的退火
[0021] 合成好的序列是两条互补的单链 DNA。 将两条单链 DNA溶解于 ddH20中， 按 照等摩尔比混合后， 95°C处理 5 min， 再将其置于室温使其自然冷却至室温。
[0022] 实施例三重组 pLKO-Tud-148a慢病毒重组载体的构建
[0023] 提取载体 pLK0.1-puro， 使用 Age I和 Eco RI酶双酶切处理 16 h后， 用 MinElute Reaction Cleanup Kit回收酶切后的载体， 再用 T4 DNA
连接酶将上一步得到的 TuD
RNA序列连接到载体 pLKO.l-puro中， 形成重组载体 pLKO-Tud- 148a， 最后将连 接产物转化到感受态大肠杆菌 ToplO中， 并涂布到含氨苄青霉素 LB培养基的平板 上， 37 °C培养 14 h。 从平板中挑取 5个单菌落， 分别加入到 5支含氨苄青霉素的液 体 LB培养基的试管中 37 °C振荡培养 8 h后， 将菌液送至上海生工测序， 测序结果 完全正确的即为 pLKO-Tud- 148a慢病毒重组载体。
[0024] 实施例四慢病毒滴度测定
[0025] 第一天， 将 293FT细胞接种到多孔板中， 每个孔接种 200000个细胞， 每个孔加 入 500 培养基， 37°C、 5<¾C02培养过夜；
[0026] 第二天， 按所述重组慢病毒的溶液的稀释比例为 1、 10、 100、 1000、 10000、 1
00000、 1000000、 10000000和 100000000， 用培养基将所述重组慢病毒的溶液梯 度稀释， 接着分别将 100 梯度稀释的所述重组慢病毒的溶液与 10( L多孔板中 的细胞培养液在多孔板的不同孔中混合转染， 转染幵始后 24h， 吸去培养基并换 成 50( L含 5U DNasel的新鲜培养基， 37°C下培养 30min以去除可能附着于细胞表 面的残余质粒 DNA， 然后将培养基换成 l mL正常培养基， 继续培养 48h;
[0027] 第四天， 吸去所述多孔板的每个孔中的培养基， 加入 50( L胰酶 -EDTA溶液消 化细胞， 在 37°C反应 1分钟， 接着加入培养基终止消化反应并将细胞吹洗下， 离 心收集每个孔的细胞， 抽提每孔细胞的总 RNA， 接着逆转录得到每孔细胞的总 c DNA; 以及分别对得到的所述每孔细胞的总 cDNA进行荧光定量 PCR， 得到每孔 细胞的 ct值， 选择与对照组 α值差异最小但超过 2的实验组， 得到其稀释倍数， 按照以下公式计算慢病毒滴度：
[0028] T=20000xR, 其中， T为慢病毒滴度， T的单位为 TU/mL， R为稀释倍数。
[0029] 经计算， 本次包装的慢病毒滴度大于 10000000 TU/mL， 表明此次慢病毒的包装 是成功的。
[0030] 实施例五慢病毒转导 16HBE细胞
[0031] 接种 16HBE细胞于 6孔板中， 每孔 1000000个细胞， 12h后细胞密度约为 50% ， 分别取病毒液， 用 DMEM完全培养基 10倍稀释病毒， 再加入聚凝胺
(polybrene)至终浓度为 8 g/mL。 去除 6孔板中的培养基， 加入含病毒的 DMEM 完全培养基（含 10%胎牛血清)， 24h后弃去含病毒的 DMEM完全培养基， 更换新 鲜的 DMEM完全培养基， 24h后用 0.5 g/ml浓度的嘌呤霉素筛选细胞。 筛选 10d, 每隔 3d更换培养基一次， 并不断的增加嘌呤霉素的浓度至 1.0 g/ml。 筛 选获得的细胞株命名为 TuD-148a细胞株。
[0032] 实施例六荧光定量 PCR检测 miR- 148a的表达水平变化
[0033] 分别接种正常 16HBE细胞、 TuD- 148a细胞至 6孔板 （每孔约 300000个） ， 培养 细胞约 24 h后至融合度 80%。 用 miRcute
miRNA提取分离试剂盒提取这些细胞的 miRNA, 然后用 S-Poly(T) hsa-miR-148a qPCR-assay primer
set试剂盒对 miRNA进行逆转录和加尾， 得到相应的 cDNA。 取 2种细胞的 cDNA 各 2 μί为模板， 荧光定量 PCR检测 hSa-miR-148a表达水平的变化， 实验重复 3次， 每孔设置 3个平行样，以 snord
44作为内参。 结果如图 3所示， 可以看到与 TuD-148a细胞的 miR-148a的表达水平 比 16HBE细胞低 44%， 差异有统计学意义 （p<0.01) ， 说明 TuD- 148a细胞株构建 成功。
工业实用性
[0034] 本发明设计的 miR-148a干扰 TuD
RNA序列带有茎环结构， 不容易降解， 双链的 Tud RNA相对目前常用的单链的 miRNA
sponge, 其结合效率更高， 能更好地实现 miR-148a的干扰。

Claims

权利要求书
[权利要求 1] 一种特异抑制人 miRNA- 148a表达的慢病毒载体， 其特征在于包括 pLKO.l-puro表达载体的基本序列、 抗性基因序列、 多克隆位点序列 、 启动子序列和靶向 miR-148a的寡核苷酸序列。 所述多克隆位点包括 Age I酶切位点和 EcoR I酶切位点； 所述靶向 miR- 148a的寡核苷酸序 列由 Age I酶切位点 +颈 I序列 +靶核苷酸序列 +颈 II序列 +环 +颈 II 序列互补序列 +靶核苷酸序列互补序列 +颈 I序列互补序列 +终止位 点序列 +EcoR I酶切位点组成。 。
[权利要求 2] 根据权利要求 1所述的一种特异抑制人 miRNA-148a表达的慢病毒载体 ， 其特征在于所述靶向 miR-148a的寡核苷酸序列正向插入所述多克隆 位点中， 其核苷酸序列为 5'-
TTC -3' (SEQ ID NO.: 1) 。
[权利要求 3] 根据权利要求 1-2所述的一种特异抑制人 miRNA-148a表达的慢病毒载 体， 其特征在于将所述靶向 miR-148a的寡核苷酸序列插入到 pLKO.l- puro表达载体中的步骤如下：
SI. miR- 148a TuD的设计与合成： 根据 TuD设计序列和 miRBase中提 供的 miR-148a的序列信息， 设计出针对 miR-148a的 TuD RNA寡核苷 酸序列， 其序列如 SEQ ID NO.: 1所示， 委托上海生工以引物的方式 合成该序列； 合成好的序列是两条互补的单链 DNA。 将两条单链 DNA溶解于 ddH2 0中， 按照等摩尔比混合后， 95°C处理 5 min， 再将其置于室温使其自 然冷却至室温。
S3.提取载体 pLK0.1-puro， 使用 Age I和 Eco RI酶双酶切处理 16 h后， 用 MinElute Reaction Cleanup Kit回收酶切后的载体， 再用 T4 DNA连 接酶将上一步得到的 TuD RNA序列连接到载体 pLKO.1-puro中， 形成 重组载体 PLKO-TuD-148a， 最后将连接产物转化到感受态大肠杆菌 T oplO中， 并涂布到含氨苄青霉素 LB培养基的平板上， 37 °C培养 14 h 。 从平板中挑取 5个单菌落， 分别加入到 5支含氨苄青霉素的液体 LB 培养基的试管中 37 °C振荡培养 8 h后， 将菌液送至上海生工测序。 取 测序正确的菌株里并用无内毒素质粒小量提取试剂盒提取， 提取的质 粒为本发明所需的干扰 miR-148a的质粒。 。
[权利要求 4] 根据权利要求 1所述的一种特异抑制人 miRNA-148a表达的慢病毒载体 的应用方法， 其特征在于包含以下步骤：
51.将含有 pLKO-TuD-148a载体的 ToplO大肠杆菌置于 10 mL LB培养 基中， 恒温空气摇床上 37°C， 300 rpm培养 12-16 h至 OD600=0.6-0.8， 将得到的菌液置于离心机中， 10000 rpm离心 1 min， 弃上清， 获得所 需菌体， 并用 E.Z.N.A. Endo-free Plasmid DNA Mini Kit I提取其中的质 粒。
52.培养 293FT细胞。 取生长状态良好的 293FT细胞接种到 10 cm培养 皿中， 每个皿接种 5000000个细胞， 加入 DMEM无双抗培养基培养细 胞约 18 h后至融合度达到 80-90%后， 取上一步得到的所需慢病毒载体 10 g、 pMDLg/pRRE、 pRSV-Rev和 pMD-G载体各 5
g， 用 Lipofectamine 2000转染至 293FT细胞中， 转染后 4-6 h更换成 DMEM完全培养基， 继续培养 48h后收集含病毒的上清培养 基， 6000 g离心 lO min后， 取上清液再用 0.45μηι过滤头进行过滤， 获 得慢病毒液。
53.培养 293FT细胞， 取生长状态良好的 293FT细胞接种到 24孔板中， 每个孔接种 200000个细胞， 加入 500 培养基， 3TC, 5<¾C02培养过 夜。 第二天， 按病毒原液： 培养基的稀释比例为 10-10000000。 分别 制备病慢毒梯度稀释液各 100 μL! 然后吸取各孔原培养基各 100 μL! 再加入慢病毒稀释液各 100 幵始转染。 转染幵始后 24 h， 吸出含慢 病毒的培养基， 换成 500 含 5 U DNasel 的新鲜培养基， 37°C下培养 30 min以去除可能附着于细胞表面的残余 质粒 DNA。 然后将培养基换成 l mL正常培养基， 继续培养 48 h。 S4.小心吸走每个孔的全部培养基， 加入 500 胰酶 -EDTA溶液消化 细胞， 在 37°C反应 1分钟。 接着加入培养基终止消化反应并将细胞吹 洗下， 离心收集每个孔的细胞。 抽提每孔细胞的总 RNA， 接着逆转 录为 cDNA。 以分别对得到的所述每孔细胞的总 cDNA进行荧光定量 P CR， 得到每孔细胞的 Ct值， 选择与对照组 Ct值差异最小但超过 2的实 验组， 得到其稀释倍数， 按照以下公式计算慢病毒滴度：
T=20000xR , 其中， T为慢病毒滴度， T的单位为 TU/mL， R为稀释倍 数。
只要慢病毒滴度达到 10000000 TU/mL以上， 即认为成功获得所需慢 病毒液。
PCT/CN2016/086075 2016-06-16 2016-06-16 一种敲低人 miRNA-148a 表达的慢病毒载体的构建及其应用 WO2017214948A1 (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2016/086075 WO2017214948A1 (zh) 2016-06-16 2016-06-16 一种敲低人 miRNA-148a 表达的慢病毒载体的构建及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2016/086075 WO2017214948A1 (zh) 2016-06-16 2016-06-16 一种敲低人 miRNA-148a 表达的慢病毒载体的构建及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017214948A1 true WO2017214948A1 (zh) 2017-12-21

Family

ID=60662926

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2016/086075 WO2017214948A1 (zh) 2016-06-16 2016-06-16 一种敲低人 miRNA-148a 表达的慢病毒载体的构建及其应用

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2017214948A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108517335A (zh) * 2018-04-20 2018-09-11 深圳市疾病预防控制中心（深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所） 一种肝细胞miR-199b低表达的慢病毒表达载体及其构建方法
CN109355162A (zh) * 2018-04-24 2019-02-19 济宁医学院 一种实时荧光定量pcr加样96孔板暂存盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102703507A (zh) * 2012-05-18 2012-10-03 深圳市疾病预防控制中心 特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用
WO2015164786A1 (en) * 2014-04-25 2015-10-29 University Of Massachusetts Recombinant aav vectors useful for reducing immunity against transgene products

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102703507A (zh) * 2012-05-18 2012-10-03 深圳市疾病预防控制中心 特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用
WO2015164786A1 (en) * 2014-04-25 2015-10-29 University Of Massachusetts Recombinant aav vectors useful for reducing immunity against transgene products

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DANGWAL, S. ET AL.: "MicroRNA Therapeutics in Cardiovascular Disease Models", ANNU. REV. PHARMACOL. TOXICOL., vol. 54, no. 1, 6 January 2014 (2014-01-06), pages 185 - 203, XP055449738 *
HARAGUCHI, T. ET AL.: "Vectors Expressing Efficient RNA Decoys Achieve The Long-term Suppression of Specific MicroRNA Activity in Mammalian Cells", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 37, no. 6, 17 February 2009 (2009-02-17), pages 1 - 13, XP002656483 *
XIE, XING ET AL.: "Construction of A Human Bronchial Epithelial Hsa-miR-148a-3p Knockdown Cell Line", CARCINOGENESIS, TERATOGENESIS & MUTAGENESIS, vol. 26, no. 3, 31 May 2014 (2014-05-31), pages 204 - 212, XP055447857 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108517335A (zh) * 2018-04-20 2018-09-11 深圳市疾病预防控制中心（深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所） 一种肝细胞miR-199b低表达的慢病毒表达载体及其构建方法
CN108517335B (zh) * 2018-04-20 2019-11-26 深圳市疾病预防控制中心（深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所） 一种肝细胞miR-199b低表达的慢病毒表达载体及其构建方法
CN109355162A (zh) * 2018-04-24 2019-02-19 济宁医学院 一种实时荧光定量pcr加样96孔板暂存盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2925866B1 (en) Circular rna for inhibition of microrna
CN107502608B (zh) 用于敲除人ALDH2基因的sgRNA、ALDH2基因缺失细胞株的构建方法及应用
EP2937417A1 (en) MiRNAs enhancing cell productivity
Ellis et al. A cis-encoded sRNA, Hfq and mRNA secondary structure act independently to suppress IS 200 transposition
WO2017214948A1 (zh) 一种敲低人 miRNA-148a 表达的慢病毒载体的构建及其应用
WO2017214952A1 (zh) 特异抑制人 miRNA-185 表达的慢病毒载体的构建及其应用
CN104031916B (zh) 新型RNAi前体及其制备和应用
WO2017214951A1 (zh) 一种抑制人miRNA-152表达的慢病毒载体的构建及其应用
WO2017214953A1 (zh) 一种特异抑制人 miRNA-424 表达的慢病毒载体的构建及其应用
WO2017214949A1 (zh) 一种抑制 miRNA-29a 表达的慢病毒载体的构建及其应用
WO2017219166A1 (zh) 一种同时抑制双 miRNA 表达的慢病毒载体及其应用
WO2017214950A1 (zh) 敲低人miRNA-140表达的慢病毒载体的构建及其应用
WO2018165929A1 (zh) 一种双miRNA抑制表达载体及其构建方法和应用
CN110564743B (zh) 一种六盘山黄牛circR-UQCC1基因及其过表达载体、构建方法和应用
CN110229816B (zh) 用于敲除RBP4基因的sgRNA、RBP4基因缺失细胞株的构建方法及应用
WO2016145608A1 (zh) 一种小激活rna及其制备方法和应用
WO2017219168A1 (zh) 一种 miRNA-29a 和 miR-152 表达敲低的慢病毒载体及其应用
WO2017219170A1 (zh) 特异抑制人 miRNA-29a 和 miR-424 表达的慢病毒载体的构建及其应用
WO2017219165A1 (zh) 特异敲低人 miRNA-29a 和 miR-140 表达的慢病毒载体及其应用
WO2017219171A1 (zh) 抑制双 MicroRNA 表达的慢病毒载体的构建及其应用
WO2017219172A1 (zh) 敲低 miRNA-140 和 miR-152 表达的慢病毒载体的构建及其应用
WO2017219167A1 (zh) 特异抑制双 miRNA 表达的慢病毒载体的构建及其应用
WO2017219169A1 (zh) 一种抑制 miRNA-29a 和 miR-185 表达的慢病毒载体及其应用
WO2010007797A1 (ja) 高活性ｓｈＲＮＡ及びその製造方法
WO2021154809A1 (en) Cell specific, self-inactivating genomic editing crispr-cas systems having rnase and dnase activity

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16905063

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 16905063

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1