CN102703507A - 特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体，包括PLKO.1-puro表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和靶向CYP2E1基因的shRNA寡核苷酸序列，所述shRNA寡核苷酸序列正向插入所述多克隆位点中。本发明提供的shRNA慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少，可持续、高效、稳定、特异地抑制肝细胞CYP2E1基因表达的优点，可作为有力工具应用于制备治疗CYP2E1基因表达异常相关疾病的药物。

Description

特异抑制肝细胞 CYP2E1 基因表达的 shRNA 慢病毒表达载体及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用。

背景技术

CYP2E1是细胞色素氧化酶(cytochrome，CYP)超家族重要成员之一，占CYP总量7%。CYP2E1的代谢底物很广泛，现已知代谢底物有70余种，主要包括三氯乙烯、四氯乙烯、乙醇、苯胺、亚硝酸类化合物等环境污染物，这些环境污染物大部分是前致癌物，经过CYP2E1催化代谢转化为最终致癌活性物质。许多研究表明，CYP2E1介导了多种化合物致肝损伤，如三氯乙烯、乙醇、氯仿等。CYP2E1介导化合物代谢产生细胞损伤的方式有两种：①CYP2E1代谢分解底物产生的中间代谢物与核酸和蛋白质等大分子物质结合，引起细胞损伤；②对还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)具有较高的氧化活性，不依赖配体产生自由基，导致DNA损伤、基因突变。

RNA干扰(RNAi)是大部分生物体存在的一种普遍现象，在转录水平调控基因表达，广泛应用于特异抑制基因的表达及其功能研究。现有技术中，徐芸等将siRNA连接到载体pmU6上，形成重组载体，转染E47细胞，构建了抑制CYP2E1基因转录位点的siRNA表达载体，虽然该siRNA表达载体可以在短时间内沉默CYP2E1基因的表达，但其存在干扰效果不够明显，转染效率低，细胞毒性大，且无法实现长效稳定干扰的缺点。RNA干扰基因表达功能的实现依赖于siRNA序列的选择与高效表达载体的构建，但现有技术中尚无转染效率高且可长效稳定表达、特异抑制CYP2E1基因表达的shRNA表达载体。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，发明人在干扰序列的选择以及载体的选择、重组构建方法等方面进行了大量的探索研究，预料不到地发现，将包含AgeⅠ 酶切位点和EcoRⅠ 酶切位点的shRNA寡核苷酸序列插入PLKO.1-puro表达载体的多克隆位点中可成功构建靶向CYP2E1基因的shRNA慢病毒表达载体，从而完成本发明。

本发明提供一种特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体，包括PLKO.1-puro表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和靶向CYP2E1基因的shRNA寡核苷酸序列；所述多克隆位点包括AgeⅠ 酶切位点和EcoRⅠ 酶切位点，所述shRNA寡核苷酸序列由AgeⅠ 酶切位点+靶核苷酸序列+茎环结构序列+靶核苷酸序列互补序列+终止位点序列+EcoRⅠ 酶切位点组成，所述shRNA寡核苷酸序列正向插入所述多克隆位点中。

采用上述技术方案，本发明提供的shRNA寡核苷酸序列插入PLKO.1-puro表达载体构建得到的shRNA慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少，可持续、高效、稳定、特异地抑制肝细胞CYP2E1基因表达的优点，抑制效果好，可作为有力工具应用于制备治疗CYP2E1基因表达异常相关疾病的药物。

作为本发明的进一步改进，所述靶核苷酸序列为5’-GCTCCAGCTTTACAATAAT-3’（SEQ ID NO：1），所述shRNA寡核苷酸序列包括正义链序列和反义链序列，所述正义链序列为：5’-CCGGTGCTCCAGCTTTACAATAATTTCAAGAGAATTATTGTAAAGCTGGA

GCTTTTTTG-3’（SEQ ID NO：2），所述反义链序列为：5’-AATTCAAAAAAGCTCCAG

CTTTACAATAATTCTCTTGAAATTATTGTAAAGCTGGAGCA-3’（SEQ ID NO：3）。采用上述序列，shRNA寡核苷酸可成功插入至PLKO.1-puro表达载体中，对CYP2E1基因表达的抑制效果显著、持续且稳定。

作为本发明的进一步改进，所述靶核苷酸序列为5’-GACCTCAGCCCTATACATA-3’（SEQ ID NO：4），所述shRNA寡核苷酸序列包括正义链序列和反义链序列，所述正义链序列为：5’-CCGGTGACCTCAGCCCTATACATATTCAAGAGATATGTATAGGGCTGAGG

TCTTTTTTG-3’（SEQ ID NO：5），所述反义链序列为：5’-AATTCAAAAAAGACCTC

AGCCCTATACATATCTCTTGAATATGTATAGGGCTGAGGTCA-3’（SEQ ID NO：6）。 采用上述序列，shRNA寡核苷酸可成功插入至PLKO.1-puro表达载体中，对CYP2E1基因表达的抑制效果显著、持续且稳定。

作为本发明的进一步改进，所述靶核苷酸序列为5’-GCCAGAACACTTCCTGAAT-3’（SEQ ID NO：7），所述shRNA寡核苷酸序列包括正义链序列和反义链序列，所述正义链序列为：5’-CCGGTGCCAGAACACTTCCTGAATTTCAAGAGAATTCAGGAAGTGTTC

GTGCTTTTTTG-3’（SEQ ID NO：8），所述反义链序列为：5’-AATTCAAAAAAGCCAG

AACACTTCCTGAATTCTCTTGAA ATTCAGGAAGTGTTCGTGCA-3’（SEQ ID NO：9）。 采用上述序列，shRNA寡核苷酸可成功插入至PLKO.1-puro表达载体中，对CYP2E1基因表达的抑制效果显著、持续且稳定。

相应的，本发明还提供特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

A） shRNA寡核苷酸序列的设计：根据CYP2E1的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4.4软件对靶mRNA序列的二级结构进行评估得到靶核苷酸序列，设计并合成靶向CYP2E1基因的shRNA寡核苷酸序列；

B） shRNA慢病毒表达载体的构建和鉴定：将合成的shRNA寡核苷酸单链等量混合，退火形成双链的shRNA，提取质粒PLKO.1-puro，用限制性内切酶AgeⅠ、EcoRⅠ双酶切，电泳、切胶回收载体，再用T4 DNA ligase分别将双链shRNA连接到PLKO.1-puro表达载体中，得到连接产物；将连接产物转化到感受态大肠杆菌JM107中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存并进行PCR鉴定，将初步鉴定结果说明shRNA寡核苷酸序列插入成功的菌液进行测序鉴定；

C） shRNA慢病毒表达载体的抽提：将测序结果证实shRNA寡核苷酸序列插入成功的菌液扩增培养，进行大量抽提重组质粒，得到特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体。

本发明利用RNA干扰技术构建靶向肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体，经鉴定构建成功后，包装成病毒转导入L-02肝细胞，嘌呤霉素筛选细胞后，使用实时荧光定量PCR和Western Blot技术分别从mRNA和蛋白水平验证CYP2E1基因表达的抑制效果，实验结果证明本发明提供的shRNA寡核苷酸可成功插入至PLKO.1-puro表达载体中，且对CYP2E1基因表达的抑制效果显著、持续且稳定。

酶切和传统菌落PCR是重组载体是否构建成功的初步鉴定方法，然后将鉴定结果为阳性的菌液测序就可以证实重组载体的构建成功。本发明所采用的起始载体全长为7032bp，而插入的双链shRNA只有59bp；传统菌落PCR鉴定重组载体是在插入片段上设计引物，而本发明中插入的双链shRNA形成发卡结构，因此，酶切和传统菌落PCR都不适合用来鉴定RNAi载体是否构建成功。长期以来，只能依靠测序的鉴定RNAi载体是否构建成功，而在载体构建过程中存在的假阳性菌落会增加实验的费用，延长实验的时间。本发明在PLKO.1-puro载体双链shRNA插入位点两端设计引物，通过重组质粒PCR产物和原质粒PCR产物大小的比较鉴定重组载体是否构建成功，具有灵敏度高、准确性好、快捷且成本低等优点，可广泛应用于RNAi载体构建的鉴定。

本发明还提供特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体在制备治疗CYP2E1基因表达异常相关疾病的药物中的用途。

另一方面，本发明还提供一种特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的沉默细胞的构建方法，包括如下步骤：

A） 培养293FT细胞并接种到六孔板中，每孔10⁶个细胞，使用如权利要求1至4中任一项所述的shRNA慢病毒表达载体，与pCMV-VSV-G、pCMV-dR8.91共转染293FT细胞；

B） 48h、72h分别收集含病毒的上清培养基，过滤病毒液，检测病毒的滴度；

C） 培养L-02肝细胞并接种到六孔板中，每孔10 ⁶ 个细胞，加入用RPMI-1640完全培养基以1：10稀释的病毒液，再加入聚凝胺至终浓度为5μg/mL；

D） 培养24h后，弃去含病毒的RPMI-1640完全培养基，加入新鲜的RPMI-1640完全培养基，培养24h后用嘌呤霉素筛选细胞，得到特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的沉默细胞。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明提供的shRNA慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少，可持续、高效、稳定、特异地抑制肝细胞CYP2E1基因表达的优点，可作为有力工具应用于制备治疗CYP2E1基因表达异常相关疾病的药物；本发明提供的shRNA慢病毒表达载体以及沉默细胞的构建方法，操作效果好，可排除假阳性菌落的干扰，避免了不必要的测序花费，可高效、特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达。

附图说明

图1 为PLKO.1-puro表达载体的质粒图谱。

图2 为PLKO.1-puro重组质粒单克隆菌落示意图；其中，A为pLKO-2E1shRNAc组，B为pLKO-2E1shRNA1组，C为pLKO-2E1shRNA2组，D为pLKO-2E1shRNA3组。

图3 为菌落PCR鉴定结果示意图；其中，M：DNA marker，01~03：pLKO-2E1shRNAc；11~13：pLKO-2E1shRNA1；+：质粒PLKO.1-puro；21~23：pLKO-2E1shRNA2；31~33：pLKO-2E1shRNA3。

图4 为重组载体测序结果示意图；其中，a：pLKO-2E1shRNAc，b：pLKO-2E1shRNA1，c：pLKO-2E1shRNA2，d：pLKO-2E1shRNA3。

图5 为嘌呤霉素筛选细胞后荧光定量PCR检测结果示意图。

图6 为嘌呤霉素筛选细胞后Western blot检测结果示意图。

图7 为嘌呤霉素筛选细胞连续培养20代后Western blot检测结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步的说明。

L-02肝细胞购自上海生命科学院细胞资源中心，293FT细胞、Lipofectamine™ 2000均购自Invitrogen公司，慢病毒表达载体PLKO.1-puro、包膜蛋白质粒pCMV-VSV-G和包装辅助质粒pCMV-dR8.91均购自Biovector公司， RNeasy Mini Kit购自Qiagen 公司，Lenti-X GoStix试剂盒购自TAKARA生物技术公司。

实施例一 靶向肝细胞 CYP2E1 基因的 shRNA 寡核苷酸序列的设计。

在GenBank查找到CYP2E1的mRNA全序列（NM_000773.3），经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4.4软件对靶mRNA序列的二级结构进行评估，最后筛选出3条19nt靶核苷酸序列，具体序列见表1。

根据靶核苷酸序列设计合成两条shRNA的DNA模板单链。设计如下：AgeⅠ 酶切位点+19 nt靶核苷酸序列+茎环结构（TTCAAGAGA）+靶序列互补序列+RNA PolyⅢ聚合酶转录中止位点（TTTTTT）+EcoRⅠ 酶切位点六个区域，分别命名为shRNA1、shRNA2 、shRNA3，另外再设计一对对照序列siRNAc，具体序列见表2。设计的shRNA寡核苷酸链由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

实施例二 shRNA 慢病毒表达载体的构建。

将合成的shRNA寡核苷酸单链等量混合，退火形成双链的shRNA，提取质粒PLKO.1-puro（图谱如图1所示），用限制性内切酶AgeⅠ、EcoRⅠ双酶切，电泳、切胶回收载体，再用T4 DNA ligase分别将双链shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNAc连接到载体PLKO.1-puro中，形成重组质粒pLKO-2E1shRNA1、pLKO-2E1shRNA2、pLKO-2E1shRNA3、pLKO-2E1shRNAc。将连接产物转化到感受态大肠杆菌JM107中，涂布到含氨苄青霉素LB培养基的平板上，于37℃培养14h，同时设置阴性对照组1（将感受态细胞均匀涂布在不含氨苄青霉素的平板上）、阴性对照组2（将感受态细胞均匀涂布在含100 μg/ml氨苄青霉素的平板上）、阳性对照组1（将双酶切空载体的连接产物均匀涂布在含100 μg/ml氨苄青霉素的平板上）、阳性对照组2（将空载体均匀涂布在含100 μg/mL氨苄青霉素的平板上）。各实验组均长出了单菌落，如图2所示，阴性对照组1长出了菌落；阴性对照组2、阳性对照组1、阳性对照组2没长出菌落。

在慢病毒载体PLKO.1-puro的AgeⅠ 酶切位点和EcoRⅠ 酶切位点两端设计一对PCR引物，PLKO-F: 5’-TATCTTGTGGAAAGGACGA-3’（SEQ ID NO：12）；PLKO-R: 5’-TGTCTACTATTCTTTCCCCTG-3’（SEQ ID NO：13），以PLKO.1-puro载体为模板进行PCR扩增，当外源shRNA没有插入载体时，其PCR产物为148bp；当有外源shRNA（59bp）插入时，其PCR产物为207bp。从各实验组平板分别挑取单菌落培养保存后，再挑取3个单菌落PCR初步鉴定外源shRNA是否成功地插入载体PLKO.1-puro中，结果如图3所示，图3说明外源shRNA1、shRNA2、shRNA3和shRNAc均已插入载体中。在菌落PCR初步鉴定成功的基础上，将重组载体送至上海生工公司测序，结果如图4所示。将测序结果与预先设计的shRNA比对，准确率为100%，证实CYP2E1基因shRNA慢病毒表达载体的构建成功。取出之前保存的重组质粒菌液，各取20 μl接种到10 ml LB培养基（含100 μg/ml氨苄青霉素）中，37℃，300 rpm，扩增培养16 h，用Endo-free Plasmid Maxi Kit分别进行大量抽提重组质粒pLKO-2E1shRNA1、pLKO-2E1shRNA2、pLKO-2E1shRNA3、pLKO-2E1shRNAc，测其纯度和浓度，结果如表3所示。

实施例三 慢病毒包装。

培养293FT细胞，取生长状态良好的细胞接种到六孔板中，每孔10⁶个细胞，利用Lipofectamine™ 2000将提取的重组质粒pLKO-2E1shRNA1、pLKO-2E1shRNA2、pLKO-2E1shRNA3、pLKO-2E1shRNAc各2μg分别和慢病毒包装质粒pCMV-VSV-G 1 μg和pCMV-dR8.91 2μg共转染到293FT细胞，48h、72h分别收集含病毒的上清培养基，用0.45μm的筛子过滤病毒液，用于转导L-02肝细胞，Lenti-X GoStix试剂盒检测病毒的滴度为5×10⁶～5×10⁷IFU。

实施例四 慢病毒转导 L-02 肝细胞。

培养L-02肝细胞，取生长状态良好的细胞接种到六孔板中，每孔10 ⁶ 个细胞，12h后细胞密度约为50%，分别取病毒液，用RPMI-1640完全培养基10倍稀释病毒，再加入聚凝胺（polybrene）至终浓度为5μg/mL。去六孔板中的培养基，加入含病毒的RPMI-1640完全培养基（含10%胎牛血清），24h后弃去含病毒的RPMI-1640完全培养基，更换新鲜的RPMI-1640完全培养基，24h后用0.5μg/ml浓度的嘌呤霉素筛选细胞。筛选10d，每隔3d更换培养基一次，并不断的增加嘌呤霉素的浓度至1.00 μg/ml。

实施例五 荧光定量 PCR 检测 CYP2E1 基因表达量。

根据CYP2E1和β-actting基因mRNA序列，利用引物设计软件Primer 5.0 和Oligo 7.0设计引物如表4所示。

分别接种L-02肝细胞、pLKO-2E1shRNA1沉默细胞、pLKO-2E1shRNA2沉默细胞、pLKO-2E1shRNA3沉默细胞以及pLKO-2E1shRNAc沉默对照细胞至6孔板。细胞密度达到80%-90%时，用RNeasy Mini Kit提取各组细胞的总RNA，利用PrimeScrip RT reagent Kit将mRNA逆转录为cDNA，逆转录条件：37℃，15min；85℃，5s；4℃，∞。反转录结束后，加入90μl的RNase Free dH₂O稀释cDNA，-20℃保存，以便后面检测使用。取各组细胞的cDNA 1μl为模板，以β-acting为内参，实时荧光定量PCR（QPCR）检测CYP2E1相对表达量，设置反应条件：95℃ 30s，1循环，55℃ 30s 40循环，95℃ 5s，60℃ 1min，95℃ 15s，利用SYBR Primescript RT-PCR Kit检测各组细胞CYP2E1基因相对表达量，结果如图5所示。结果显示携带CYP2E1基因干扰片段shRNA病毒转导L02细胞，CYP2E1基因表达明显受到抑制，其中干扰片段shRNA1、shRNA2、shRNA3的抑制效率分别为73.6%±0.05%、84.4%±0.06%、86.9%±0.08%，而对照干扰片段shRNAc对CYP2E1基因表达几乎无影响，从而证明本实验中采用的PLKO.1-puro载体携带shRNA能特异抑制CYP2E1基因的表达，且抑制效果非常显著。

实施例六 Western blot 检测 CYP2E1 蛋白质表达量。

分别取L-02肝细胞、pLKO-2E1shRNA1沉默细胞、pLKO-2E1shRNA2沉默细胞、pLKO-2E1shRNA3沉默细胞以及pLKO-2E1shRNAc沉默对照细胞1瓶（25cm² 细胞培养瓶），去培养基，用冷PBS洗3次，加入200μl细胞裂解液，并用细胞刮将裂解的细胞快速从瓶壁刮下，收集蛋白至500μl的EP管中，4℃继续裂解30min，12000rpm，4℃离心20min，最后加入5×SDS-PAGE Sample Loading Buffer，100℃变性5min, 进行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1h；分别加入CYP2E1抗体、GAPDH抗体，4℃室温孵育过夜， TBST洗膜3次，每10min一次，再加入二抗，室温孵育1h, TBST洗膜3次，每10min一次，加入Western blot化学发光试剂后进行成像分析，结果如图6所示。以GAPDH为内参，结果表明携带CYP2E1基因干扰片段shRNA病毒转导L-02细胞能明显抑制CYP2E1基因的蛋白质表达，其中干扰片段shRNA3的抑制效果最高，各个干扰片段shRNA对CYP2E1基因表达抑制效果见图5。而对照干扰片段shRNAc组细胞CYP2E1基因表达几乎没变化，以上结果和QPCR检测的结果相符合，说明本实验中采用的PLKO.1-puro载体携带shRNA能特异抑制CYP2E1基因的表达。

连续培养细胞20代后，分别提取各组沉默型细胞及其对照组细胞，Western blotting 分析CYP2E1基因表达量，结果如图7所示，shRNA1组、shRNA2组和shRNA3组都能有效的抑制CYP2E1基因的表达，而阴性对照组shRNAc对CYP2E1基因表达几乎没有影响。说明本发明构建的shRNA慢病毒表达载体能够持续、高效的抑制CYP2E1的表达。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市疾病预防控制中心

<120> 特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应

用

<130> 2012

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

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<213> 人工序列

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gctccagctt tacaataat 19

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ccggtgctcc agctttacaa taatttcaag agaattattg taaagctgga gcttttttg 59

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aattcaaaaa agctccagct ttacaataat tctcttgaaa ttattgtaaa gctggagca 59

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ccggtgacct cagccctata catattcaag agatatgtat agggctgagg tcttttttg 59

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gccagaacac ttcctgaat 19

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ccggtgccag aacacttcct gaatttcaag agaattcagg aagtgttcgt gcttttttg 59

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aattcaaaaa agccagaaca cttcctgaat tctcttgaaa ttcaggaagt gttcgtgca 59

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aattcaaaaa agcttcgaca tttaaccaat tctcttgaaa ttggttaaat gtcgaagca 59

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tgtctactat tctttcccct g 21

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cacgatggag gggccggact catc 24

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ctctgagata tgggctcctg att 23

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aatggtgtct cgggttgctt c 21

Claims (7)

1.一种特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征在于：包括PLKO.1-puro表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和靶向CYP2E1基因的shRNA寡核苷酸序列；所述多克隆位点包括AgeⅠ 酶切位点和EcoRⅠ 酶切位点，所述shRNA寡核苷酸序列由AgeⅠ 酶切位点+靶核苷酸序列+茎环结构序列+靶核苷酸序列互补序列+终止位点序列+EcoRⅠ 酶切位点组成，所述shRNA寡核苷酸序列正向插入所述多克隆位点中。

2.根据权利要求1所述的特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征在于：所述靶核苷酸序列为5’-GCTCCAGCTTTACAATAAT-3’（SEQ ID NO：1），所述shRNA寡核苷酸序列包括正义链序列和反义链序列，所述正义链序列为：5’-CCGGTGCTCCAGCTTTACAATAATTTCAAGAGAATTATTGTAAAGCTGGAGCTTTTTTG-3’（SEQ ID NO：2），所述反义链序列为：5’-AATTCAAAAAAGCTCCAGCTTTACAAT

AATTCTCTTGAAATTATTGTAAAGCTGGAGCA-3’（SEQ ID NO：3）。

3.根据权利要求1所述的特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征在于：所述靶核苷酸序列为5’-GACCTCAGCCCTATACATA-3’（SEQ ID NO：4），所述shRNA寡核苷酸序列包括正义链序列和反义链序列，所述正义链序列为：5’-CCGGTGACCTCAGCCCTATACATATTCAAGAGATATGTATAGGGCTGAGGTCTTTTTTG-3’（SEQ ID NO：5），所述反义链序列为：5’-AATTCAAAAAAGACCTCAGCCCTATAT

CTCTTGAATATGTATAGGGCTGAGGTCA-3’（SEQ ID NO：6）。

4.根据权利要求1所述的特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体，其特征在于：所述靶核苷酸序列为5’-GCCAGAACACTTCCTGAAT-3’（SEQ ID NO：7），所述shRNA寡核苷酸序列包括正义链序列和反义链序列，所述正义链序列为：5’-CCGGTGCCAGAACACTTCCTGAATTTCAAGAGAATTCAGGAAGTGTTCGTGCTTTTT

TG-3’（SEQ ID NO：8），所述反义链序列为：5’-AATTCAAAAAAGCCAGAACACTT

CCTGAATTCTCTTGAA ATTCAGGAAGTGTTCGTGCA-3’（SEQ ID NO：9）。

5.根据权利要求1至4中任一项中所述的特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

A）shRNA寡核苷酸序列的设计：根据CYP2E1的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4.4软件对靶mRNA序列的二级结构进行评估得到靶核苷酸序列，设计并合成靶向CYP2E1基因的shRNA寡核苷酸序列；

B）shRNA慢病毒表达载体的构建和鉴定：将合成的shRNA寡核苷酸单链等量混合，退火形成双链的shRNA，提取质粒PLKO.1-puro，用限制性内切酶AgeⅠ、EcoRⅠ双酶切，电泳、切胶回收载体，再用T4 DNA ligase分别将双链shRNA连接到PLKO.1-puro表达载体中，得到连接产物；将连接产物转化到感受态大肠杆菌JM107中，均匀涂布到含氨苄青霉素LB培养基平板上，挑取阳性单克隆菌落培养保存菌液并进行PCR初步鉴定，将初步鉴定结果说明shRNA寡核苷酸序列插入成功的菌液进行测序鉴定；

C）shRNA慢病毒表达载体的抽提：将测序结果证实shRNA寡核苷酸序列插入成功的菌液扩增培养，进行大量抽提重组质粒，得到靶向CYP2E1基因的shRNA慢病毒表达载体。

6.根据权利要求1至4中任一项中所述的特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的shRNA慢病毒表达载体在制备治疗CYP2E1基因表达异常相关疾病的药物中的用途。

7.一种特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的沉默细胞的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

A）培养293FT细胞并接种到六孔板中，每孔10⁶个细胞，使用如权利要求1至4中任一项所述的shRNA慢病毒表达载体，与pCMV-VSV-G、pCMV-dR8.91共转染293FT细胞；

B）48h、72h分别收集含病毒的上清培养基，过滤病毒液，检测病毒的滴度；

C）培养L-02肝细胞并接种到六孔板中，每孔10 ⁶ 个细胞，加入用RPMI-1640完全培养基以1：10稀释的病毒液，再加入聚凝胺至终浓度为5μg/mL；

D）培养24h后，弃去含病毒的RPMI-1640完全培养基，加入新鲜的RPMI-1640完全培养基，培养24h后用嘌呤霉素筛选细胞，得到特异抑制肝细胞CYP2E1基因表达的沉默细胞。

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