CN101126176A - PCR高通量构建siRNA全位点分子库制备方法 - Google Patents

PCR高通量构建siRNA全位点分子库制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种PCR高通量构建siRNA全位点分子库制备方法，包括环状磷酸接头－1连接、单引物PCR扩增、III型限制性内切酶消化、粘性补平、与环状磷酸接头－2连接、双引物PCR扩增、FokI消化、克隆到表达载体等步骤。本发明解决了以III型限制性内切酶介导的PCR高通量构建siRNA全位点分子库制备方法，由此产生的siRNA功能片断可控性的分布在19－23bp，这样可完全模仿体内自然的siRNA分子长度多样性，适用于RNAi基因治疗最佳靶点的筛选，克服了目前其它siRNA分子库构建方法存在的瓶颈和盲点。

Description

PCR高通量构建siRNA全位点分子库制备方法
技术领域：
本发明涉及一种siRNA分子库制备方法。
背景技术：
siRNA(small interfering RNA：小片段干扰核糖核酸)是双链短小核酸碱基片断，一般功能长度为19-23bp。其作用是与特定靶基因mRNA结合引起同源mRNA特异性降解失去功能。这种双链介导的高效转录的基因沉默现象称之为RNAi(RNA interference：核糖核酸干扰)，是自然存在于细胞的防御能力：双链RNA进入细胞内被体内Dicer酶切割成21-23个核酸碱基片断的siRNA，先与细胞内的其他成分结合成一个核酸复合体而形成RNA诱导沉默复合体(RNA induced silencing complex，RISC)。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA上并切割而导致mRNA降解，从而清除细胞内特定的基因表达而发挥作用。siRNA不仅广泛应用于生物医学研究，而且在治疗多种疾病如病毒感染、肿瘤、血管神经系统疾病等具有广阔的前景。它是继单克隆抗体之后的一种划时代的能用于治疗多种疾病的生物药分子类型，是当今靶向性基因药物开发的热点。
RNAi靶向性基因药物开发的第一步就是在靶基因的众多的siRNA分子中筛选siRNA的最佳结合位点-即靶点(通常指该基因的沉默效率最高，结构最稳定的且与别的基因不同源的siRNA)。筛选样本中的siRNA分子的代表性和多样性至关重要。靶基因的siRNA是否能多，快，好，省的合成直接影响到RNAi靶向性基因药物开发的进展。
纵观siRNA合成方法可分两大类：即化学合成和生物合成。
siRNA化学合成是用核酸合成仪直接合成核酸碱基片断。可以直接合成RNA碱基小片段(siRNA)或先合成DNA碱基小片段，再克隆到siRNA表达载体，利用载体的RNA聚合酶III启动子(U6或/和H1)在细胞内将DNA片段转录成siRNA。直接合成RNA碱基片段费用昂贵而且RNA片段不能直接进入细胞内发挥作用，必需外加其它的化学修饰才能跨膜传输到细胞内。先合成DNA碱基小片段再克隆到siRNA表达载体细胞内表达，因涉及分子克隆过程，在众多siRNA分子合成时量化极其困难。除此之外，在选择哪段序列进行合成上一直存在盲点。siRNA的最佳靶点是很难被电脑程序“猜”到的。
siRNA生物合成是利用生物酶以全长双链cDNA或双链RNA为底物的一系列催化反应而实现的。而合成的siRNA是分子库的形式出现，理论上具有全部siRNA分子，是靶点筛选的良好工具。
以双链RNA(dsRNA)为底物是凭借T7RNA聚合酶以DNA为摸板在体外转录制备长双链RNA片断，然后用Dicer酶直接将其切割成短小RNA片断。Dicer酶是核糖核酸酶III(Ribonuclease III，RNase III)家族的成员，广泛存在于蠕虫真菌物及哺乳动物细胞内。体外重组Dice酶利用Dicer酶直接将其切割成21-23bp短小RNA片断，模仿体内自然的RNA干扰起始阶段，该酶在市场上已有销售(Ambion，USA)。Dicer酶得到一群siRNA分子，这种siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA“群”有许多不同的位点的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。这种方法有两个缺点：1)短小RNA片断不可能再逆转录成cDNA，无法加以克隆，导致无法分离siRNA“群”中的RNAi分子，无法进行siRNA药物靶点的筛选。2)siRNA分子群体一并投入，容易引发非特异的基因沉默。
以DNA模板(靶基因cDNA；总体cDNA或基因组DNA)构建siRNA分子库可以将siRNA分子各种位点一并加以克隆，克服上述双链RNA为底物的瓶颈，不但可以用于高通量的siRNA介导的功能基因组研究，更重要的是便于实行RNAi基因治疗最佳靶点的筛选。但Dicer酶无法作用于cDNA模板，目前报道的以DNA模板构建siRNA分子库方法都通过II型限制性内切酶Mmel实现的。Mmel能识别和限定切割其相邻任意18-20个核苷酸序列，是II型限制性内切酶的最长识别位点，无法模仿体内Dicer酶自然形成的21-23bp siRNA片断，在实行RNAi基因治疗最佳靶点的筛选上存在盲点与瓶颈。
最近III型限制性内切酶EcoP15I已问世(New England Biolabs；USA)，能识别和限定切割其相邻任意的25-27个核苷酸序列(是目前切割跨度最长的限制性内切酶)。在一个DNA底物分子中必须有两个对立而置EcoP15I的识别序列才能被切割：
----->
5’CAGCA(N)25---------------------------------------------------27(N)GTGCTG3’
3’GTCGT(N)27---------------------------------------------------25(N)CACGAC5’
                                                                   <---------
基于上述限定的条件，目前尚未见有用于siRNA分子库的构建的报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种III型限制性内切酶介导的PCR高通量构建siRNA全位点分子库制备方法。本方法克服了目前其它II型型限制性内切酶介导的siRNA分子库构建方法存在的盲点和瓶颈，产生的siRNA片断能任意控制在16-23bp之间，不但可完全模仿体内自然的siRNA21-23bp长度，而且可以囊括目前II型型限制性内切酶介导的siRNA分子构建长度(18-20bp)，适用于RNAi基因治疗最佳靶点的筛选。
本发明的技术解决方案是：
1、一种PCR高通量构建siRNA全位点分子库的制备方法，其特征是：为依次包括下列步骤和结构：
(1)将起始DNA在Mn2+的缓冲体系中用DNAse I行不完全消化，消化后的DNA和产生16-23bp的siRNA环状磷酸接头-1进行平端连接；
结构上，各环状磷酸接头-1都包含一个III型限制性酶切位点，该位点的近端即近接头平端，与多聚A/T序列相接续，远端即近发夹环部，与一个II型限制性酶切位点相接续，通过加减多聚A/T碱基对的数目，可以控制各环状磷酸接头-1中的III型限制性酶切长度，使siRNA长度呈可控性分布，远端II型限制性酶切位点能介导多聚A/T的克隆方式，一旦克隆能产生U6和H1启动子多聚A和多聚T的转录起始和终止信号，去除启动子和siRNA之间多余的克隆位点序列；
所述的环状磷酸接头-1的通式为：5’pC(n)TTTTN(n)III型内切酶N(n)II型内切酶-PCR锚序列-环3’G(n)AAAAN(n)III型内切酶N(n)II型内切酶-PCR锚序列-环
上述P：磷酸键；N：G，C，T，A任意碱基；n：碱基数(0-20)，可计算上述两种限制性内切酶的距离相应调整；
(2)以上述平端连接反应后的产物为模板，用环状磷酸接头-1的反义链序列为引物进行“单引物”PCR扩增，选择性扩增两个对立而置的III型限制性酶切位点分子，使之能被III型限制性酶消化；
(3)PCR产物用III型限制性内切酶消化，酶切后的DNA呈粘性末端；
(4)上述DNA酶切后的粘端用DNA聚合酶在dNTPs存在下补平，然后与磷酸接头-2进行平端连接。该接头包含一个II型限制性内切酶消化位点(与磷酸接头-1产生相同的粘端)，为进行克隆所用；
(5)将经步骤(4)平端连接后的产物用5’(磷酸接头-1)和3’磷酸接头-2)引物进行PCR扩增；
(6)纯化PCR产物后进行II型限制性内切酶消化，两侧产生AAAA粘端；
(7)分离目的片段后，克隆到带有T5/A1粘端的表达载体构建siRNA分子库或miRNA(microRNA，即：微小RNA)分子库；前者带有U6和H1双启动子，表达双链的siRNA；后者为U6或H1单一启动子，表达单链的miRNA。
一经克隆能产生U6或/和H1启动子多聚A和多聚T的转录起始和终止信号。
在环状磷酸接头-1的转录起始信号多聚A后加一个增强转录效率的“G”碱基。
上述步骤可用以下产生19-23bp的siRNA分子库为例来表示：
Figure A20071002421700091
具体可以解释为：
1.)环状磷酸接头-1的结构和连接：
DNA在锰离子存在下经DNase I不完全消随机消化的片段为平端，可以直接和环状磷酸接头-1进行平端连接。为了构建各种功能长度的siRNA的分子以供靶点的筛选，本发明首先采用III型限制性内切酶构建siRNA分子库的方法。III型限制性内切酶Ecop15I是目前切割跨度最长的限制性内切酶，可以限定切割其相邻任意的25-27个核苷酸序列。为了分别产生固定的19bp；20bp；21bp；22bp和23bp siRNA的长度，本发明设计了各种相应的环状磷酸接头-1。图中所示的19-23bp的环状磷酸接头-1仅为示范，如需要可以继续向下设计到16-18bp。
本发明的环状磷酸接头-1有三大特点：
I)起siRNA分子各种功能长度控制作用：siRNA分子功能长度一般为19-23bp，目前只能依赖核酸仪一一化学合成。以全长基因为原料的生物合成是一系列的酶促反应，目前还没有任何生物合成的方法能指定合成这一长度分布。在图示的环状磷酸接头-1的结构中，本发明的技术方案特点之一是在Ecop15I位点的近端(近接头平端)与多聚A/T序列相接续，通过加减多聚A/T碱基对的数目，可以控制各环状磷酸接头-1中Ecop15I的酶切指定长度，使siRNA长度呈可控性分布于19-23bp，也可根据需要固定在其某一长度。这样不但可以模仿体内DICER酶所产生的自然长度(21-23bp)，也可以囊括目前其它siRNA分子库构建方法所用的II型限制性酶Mmel实现的极限长度(19-20bp)，并能扩展到其它长度(如16-18bp等)。基于Ecop15I是目前切割长度最长的III型限制性内切酶，随着具有更长切割长度的III型限制性内切酶出现，视需要可根据本发明技术路线将siRNA长度向上延伸(如24-29bp)。但目前公认，siRNA长度过长(＞30bp)或过短(＜16bp)都会引起核酸干扰反应失败。前者引起细胞凋亡，后者则反应无效。本发明的所列举的19-23bp的长度是目前公认的siRNA定义长度。
II)多聚A/T序列起克隆位点的和RNA聚合酶III启动和终止信号的作用：
RNA聚合酶III启动子(U6和H1)的起始信号为AAAAA，终止信号为TTTTT。环状磷酸接头-1中Ecop15I的远端(近发夹环部)所设置的II型限制性酶FokI酶能识别和限定切割其相邻任意9-13个核苷酸序列，通过和Ecop15I之间“N”碱基数的调节，切点能产生A4(4个“AAAA”碱基)的粘性末端和表达载体的T5/A1粘性末端连接。当siRNA分子克隆到表达载体后，即产生启动子的AAAAA起始信号和TTTTT终止信号。运用本发明的技术方案，RNA聚合酶III(U6和H1)在启动子的AAAAA起始信号和siRNA之间去除与siRNA无关的多余克隆位点的序列，降低siRNA在靶点筛选中的脱靶现象。除此之外，在U6和H1的起始信号AAAAA之后加碱基“G”可以增强siRNA转录效率。本发明在产生22bp以下的siRNA环状磷酸接头-1结构的多聚A前都含有碱基“G”。克隆后碱基“G”位于AAAAA之后。而产生23bp的siRNA环状磷酸接头-1的结构中，为了Ecop15I保证产生足够的长度，碱基“G”被省略，而被视为特列。如特殊需要，此时碱基“G”可以加在表达载体上。随着具有更长切割长度的III型限制性内切酶出现，产生23bp以上的siRNA环状磷酸接头-1的结构也可列入上述通列中。
III)环状磷酸接头的结构在siRNA构建过程中起保护作用
环状磷酸接头由于是一端呈环状结构(发夹环状)的二级结构，可防磷酸接头充当PCR引物在在后续的PCR扩增中起非特异性扩增的副作用。除此之外，环状结构与DNA片段连接的过程中可以防止形成多个磷酸接头的自身连接。这种自连现象极易发生在双平端磷酸接头而形成磷酸接头的多聚体。磷酸接头多聚体一旦形成，因长度和正常连接的DNA分子相仿，不易被分离而造成siRNA分子库的污染，使有效克隆数严重降低。
2.)单引物PCR扩增：
III型限制性内切酶介导的消化反应的必需条件是在底物(DNA)同一分子内存在两个酶切位点，而且这两个位点必需对立而置。以EcoP15I为例：
(A)
EcoP15I---->
-----CAGCA(N)25(多聚A)------------------------(多聚T)27(N)GTGCTG---
-----GTCGT(N)27(多聚T)-------------------------(多聚A)25(N)CACGAC---
                                                         <----EcoP15I
然而，由于环状磷酸接头-1和DNA的平端连接，除上述可消化分子(A)外，还可以出现其它两种不可消化分子(B和C)：
(B)
---GTCGT(N)27(多聚T)-----------------------------(多聚T)27(N)GTGCTG---
---CAGCA(N)25(多聚A)-----------------------------(多聚A)25(N)CACGAC---
(C)
---CAGCA(N)25(多聚A)------------------------------(多聚A)25(N)CACGAC---
---GTCGT(N)27(多聚T)------------------------------(多聚T)27(N)GTGCTG---
本发明用单一引物PCR选择性扩增III型限制性内切酶可消化的(A)分子：
单一引物
5’------>3’
---CAGCA(N)25(多聚A)---------------------------(多聚T)27(N)GTGCTG---
---GTCGT(N)27(多聚T)---------------------------(多聚A)25(N)CACGAC---
                                                         3’<------5’
                                                        单一引物
由于此单一引物为环状磷酸接头-1的反义链(指环状磷酸接头-1的无磷酸键的链)，只对已获得对立而置的III型限制性内切酶位点(上述A)分子进行特异性的扩增。PCR产物可被III型限制性内切酶EcoP15I消化。上述(B)、(C)分子在PCR过程中被淘汰。
3.)EcoP15I消化：
对PCR产物进行III型限制性内切酶(如EcoP15I)消化，限定切割其相邻任意的25-27个核苷酸序列。5种混合环状磷酸接头-1，由于调节了Ecop5I相邻的多聚A/T碱基数，切割的DNA(除去磷酸接头序列)呈现19-23bp可控性多样分布。
4.)粘性补平，与环状磷酸接头-2连接：
EcoP15I消化后的DNA为粘性末端，用DNA聚合酶在dNTPs存在下将其补平。分离目的片段后与环状磷酸接头-2进行平端连接。环状磷酸接头-2起PCR锚和克隆作用。环状磷酸接头-2的平端连接可随机产生如下两种分子：
(A)：
Fok I                            siRNA                           Fok I
---GGATG--------(多聚A)---------------------------(多聚A)--------GTAGG---
---GCTAC--------(多聚T)----------------------------(多聚T)--------CATCC---
(环状磷酸接头-1)                                          (环状磷酶接头-2)
(B)：
Fok I                             siRNA                            Fok I
---GGATG--------(多聚A)----------------------------(多聚T)---------CATCC---
---GCTAC--------(多聚T)----------------------------(多聚A)---------GTAGG---
(环状磷酸接头-1)                                          (环状磷酸接头-2)
Fok为II型限制性内切酶，限定切割其相邻任意的9-13个核苷酸序列。切割位点设计在磷酸接头多聚A/T序列处，但唯有在正义链和反义链的5’端产生AAAA才能在本系统中进行克隆：
                 siRNA
5’AAAA----------------------------------3’
    3’----------------------------------AAAA5’
以上(B)的接序结构可以满足这种要求。用5’(磷酸接头-1)和3’(磷酸接头-2)引物以选择性扩增(B)分子。
5’------->                   siRNA
---------GGATG----(多聚A)---------------------(多聚T)------CATCC-------
---------GCTAC-----(多聚T)--------------------(多聚A)------GTAGG-------
                                                               <---------3’
(5-7.)双引物PCR扩增，FokI消化，克隆到表达载体：
用5’(磷酸接头-1)和3’(磷酸接头-2)引物行PCR扩增。纯化PCR产物后进行FokI酶消化，分离目的片段，克隆到siRNA表达载体(具有U6和H1双启动子，表达双链的siRNA)，完成siRNA分子库的构建。也可克隆到miRNA(micro RNA)表达载体(具有U6或H1单一启动子；表达单链的miRNA)构建miRNA分子库。
本发明解决了以III型限制性内切酶介导的PCR高通量构建siRNA全位点分子库制备方法，由此产生的siRNA功能片断可控性分布在19-23bp，这样可完全模仿体内自然的siRNA分子多样性，适用于RNAi基因治疗最佳靶点的筛选，克服了目前其它siRNA分子库构建方法存在的盲点和瓶颈。
附图说明：
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1：本实施例的起始DNA：SARS冠状病毒膜蛋白666bpDNA的1％Agarose电泳图。
图2：经DNAse I不完全酶切后1％Agarose电泳图。
图3：单一引物PCR(PCR-1)扩增后的1％Agarose电泳图。
图4：跟踪酚提后DNA回收的1％Agarose胶电泳图。
图5：证实Ecop15I消化后66bpDNA片段的20％PAGE电泳图。
图6：证实PCR-2反应产生109bp特异条的20％PAGE电泳图。
图7：Fok I酶切产物的20％PAGE电泳图。
图8：菌检PCR产物的1％Agarose胶检电泳图。
图9：菌检PCR产物SfiI酶切的1％Agarose胶检电泳图。
图10：菌检PCR产物阳性克隆接菌扩大培养、抽提质粒1％Agarose胶检电泳图。
图11：siRNA表达载体示意图和克隆前后的接续方式。
具体实施方式：
1.1材料、试剂和主要仪器
(1)目的DNA：SARS冠状病毒膜蛋白(NCBI库号：AY536759)全长cDNA由本公司基因合成组合成，见图1，其长度为666bp。
(2)试剂：1kb plus DNA Ladder(invitrogen)；DNase I(Roche)；MnCl2(BBI)；磷酸接头(Sigma-aldrich)；ATP(BBI)；BSA(NEB)；BmsbI(NEB)；T4 DNA Ligase(NEB)；Tag DNA聚合酶(BiocolorShanghai)；Agarose(BBI)；dNTP(上海生工)；酚氯仿抽提试剂(上海生工)；低分子量DNA Ladder(NEB)；EcoP15I(NEB)；T4 DNA聚合酶(NEB)；FokI酶(NEB)；SfiI酶(NEB)；感受态细胞(invitrogen)；PU6H1-GFP表达载体(NT Oimcs，USA)。其他生化试剂均购于Sigma-aldrich。
(3)Oligao序列：
Sigma-aldrich公司合成；(P＝Phosphat：磷酸键)
(A)磷酸接头(以下磷酸接头在Sigma-aldrich公司合成；
(去除P＝Phosphat)
磷酸环状接头-1：
19LP：
5’PCTTTTTTTCTGAACTGGGATCCGTTGGATGTGT
3’GAAAAAAA
Figure A20071002421700162
GACTTGACCCTAGGCAACCTACACA
EcoP15I  FokI
20LP：
-1T             +1G
5’PCTTTTTT
Figure A20071002421700163
G
Figure A20071002421700164
CTGAACTGGGATCCGTTGGATGTGT
3’GAAAAAACGACTTGACCCTAGGCAACCTACACA
EcoP15I    FokI
21LP：
-2T             +2G
5’PCTTTTT
Figure A20071002421700167
GG
Figure A20071002421700168
TGAACTGGGATCCGTTGGATGTGT
3’GAAAAACC
Figure A200710024217001610
ACTTGACCCTAGGCAACCTACACA
EcoP15I    FokI
22LP：
-3T          +3G
5’PCTTTT
Figure A20071002421700171
GGG
Figure A20071002421700172
CTGAACTGGGATCCGTTGGATGTGT
3’GAAAACCC
Figure A20071002421700174
GACTTGACCCTAGGCAACCTACACA
EeoP15I      FokI
23LP：
-1C；-3T     +4G
5’PTTTT
Figure A20071002421700175
GGGG
Figure A20071002421700176
CTGAACTGGGATCCGTTGGATGTGT
3’AAAA
Figure A20071002421700177
CCCCGACTTGACCCTAGGCAACCTACACA
EcoP15I      FokI
磷酸环状接头-2：
5’PCTTTTTGAGACCGA
Figure A20071002421700179
CTCTGCAGACGATCCATCAGAGTCAG
3’GAAAAACTCTGGC TGAGACGTCTGCTAGGTAGTCTCAGTC
FokI
(B)PCR引物(以下PCR引物在invitrogen公司合成)
PCR-1引物(单引物扩增)：
3’BH1：5’ACACATCCA ACGGATCCCAGTTCAG 3’
PCR-2引物：
5’LG：5’GACTCTGATGGATCGTCTGCAGAG 3’
3’BH1：5’ACACATCCA ACGGATCCCAGTTCAG 3’
(C)质检PCR：
5’U6：5’AAGGTCGGGCAGGAAGAGGGC 3’
3’H1：5’TATTTGCATGTCGCTATGTGTTCT 3’
(4)试剂盒：凝胶抽提试剂盒：QIAEX II Gel Extration Kit(QIAGEN)；质粒纯化试剂盒：TIANprep Mini Plasmid Kit(TIANGEN)等。
(5)主要仪器：PCR仪(PE9600)；电转仪(BIO-RAD，MicroPulser)；长波长紫外灯等。
2.1 DNase I不完全酶切
DNA在Mn2+的缓冲体系中，用DNase I进行不完全酶切，得到的DNA片段均为平端。
先将10U的DNaseI用NEB Buffer-2和80％甘油稀释到0.01U，-20℃保存。SARS全长cDNA，在Mn2+的缓冲体系中，用0.01～003U的DNaseI在冰上反应1分钟，然后70℃灭活20分钟，Agarose电泳检测，如图2所示，DNA不完全酶切后呈雾状分布，在100～300bp处呈亮区。
2.2磷酸接头-1连接和PCR-1反应
DNase I酶切过的DNA通过用平端连接的方法接上磷酸接头1。
磷酸接头1为19LP1、20LP1、21LP1、22LP1、23LP1。退火处理(95℃1分钟，自然降至室温)。
上述各磷酸接头-1连接反应：取2.5μl经过DNase I酶切过的DNA，在10×连接反应Buffer(500mM Tris-HCl(pH7.5，25℃)，100mM MgCl2，100mM DTT，25μg/μlBSA)的体系中，加入1μl(10mM)磷酸接头-1，1μl 10mM ATP，0.5μl T4DNA Ligase和0.5μl10×Buffer，在PCR仪上16℃过夜反应。
PCR-1：在各连接反应体系中取出0.5μl作为模板进行50μl PCR反应：0.5μl模板DNA，2μl单一引物BH1(20μM)，1μl dNTP(10mM)，0.5μl Tag酶，用D-H2O补足到50μl，反应条件为：95℃1分钟预变性，95℃15秒变性，68℃1min退火和延伸，28个循环。1％Agarose胶电泳检测，如图3所示，5种PCR产物：19LP1、20LP1、21LP1、22LP1、23LP1都显示阳性结果，说明5种接头-1连接成功。
将各PCR-1产物进行酚提，乙醇沉淀(-20℃，2小时)离心后，沉淀物加20μl D-H2O溶解，-20℃保存。为了跟踪沉淀物，在下一步反应前再进行1％Agarose胶电泳检测，如图4所示，5种PCR产物：19LP1、20LP1、21LP1、22LP1、23LP1酚提后回收正常。
2.3EcoP15I酶切
为了合理使用EcoP15I酶，将纯化后的19LP1、20LP1、21LP1、22LP1、23LP1PCR-1产物以各5μl混合，加入10μl ATP(10mM)，10μl10XNEB Buffer-3，1μl BSA(100×)(10mg/ml)，10U EcoP15I酶，用D-H2O补足到100μl，37℃水浴，酶切过夜。将EcoP15I酶切产物进行酚提，乙醇沉淀(-20℃，4小时)后，离心后加入11μl D-H2O溶解沉淀物，-20℃保存。
2.4T4DNA聚合酶补平DNA
EcoP15I酶切后的DNA 11μl，加1.5μl(4.5U)T4DNA聚合酶；1.5μlNEB Buffer-2，2μl dNTP(1mM)，总反应体积为15μl，混合均匀，置于PCR仪37℃孵化15分钟。
2.5PAGE分离DNA目的条带
在修补成平端的15μl DNA中加入1.5μl的DNA上样Buffer(30mMEDTA；36％(V/V)丙三醇；0.05％(W/V)溴酚蓝；pH＝7.0)，6.5μl X3点样到20％TBE聚丙烯胺凝胶。电泳：200V，90分钟，分离DNA片段。电泳结束后，取出凝胶置于含10％EB(溴化乙锭)的TBE染液中行DNA染色20分钟。如图5所示，66bp的EcoP15I酶切片段清晰可见。
在紫外灯下，胶切66bp的DNA片段，置于1.5ml离心管中。加入150μl溶胶Buffer(0.5M NH4Ac，10mM Mg(Ac)2，1mM EDTA(pH8.0))，55℃烘箱过夜，溶出DNA。用QIAEX II Gel Extration Kit抽提DNA，加D-H2O洗脱。
2.6磷酸接头-2连接
取2.5μl PAGE分离的DNA，加入1μl(20mM)磷酸接头-2，0.5μl 10×连接Buffer，0.5μl ATP(10mM)，0.5μl T4DNA Ligase，用D-H2O补到5μl，混合均匀，PCR仪16℃过夜反应。
2.7PCR-2反应
在反应体系中用灭菌的D-H2O补足到50μl，从中取出5μl作为模板，1μl 5’LG(10μM)；1μl 3’BH1(10μM)，lμl dNTP(10mM)，0.5μl Tag
DNA聚合酶，用D-H2O补到50μl进行PCR反应。反应条件为：95℃1分钟预变性，95℃15秒变性，68℃2min退火和延伸，28个循环。PAGE检测。10μl PCR-2产物PAGE检测结果如图6所示，连接产物DNA片段大小为109bp片段，显示磷酸接头-2连接成功。
PCR-2产物进行酚提，乙醇沉淀(-20℃，2小时)后，离心加入20μl D-H2O，-20℃保存。
2.8 FokI酶切
FokI酶消化PCR-2产物，切成粘端DNA片段。
取20μl PCR-2DNA，加入2μl FokI酶，5μl NEBuffer-3，用D-H2O补到50μl，混匀后加100μl，37℃反应100分钟。10μl酶切产物PAGE检测，如图7所示，目的片段为29～33bp，如箭头所示。其它3条带至上而下为：未消化条带；不完全消化条带；消化的两边接头条带(因重叠，故信号较强)。
PAGE分离目的片段，胶切和回收和上述2.5。
2.9与siRNA表达载体连接
将FokI酶切后的DNA片段连接到带有U6和H1双启动子的siRNA表达载体pU6H1-GEP，如图10所示。
反应体系为：1μl载体，2μl Fok1酶切的DNA，10μl 1.5X P Buffer(90mM Tris((PH8.5～9.0)；12mM DTT；6mM MgCl2；40％PEG8000)，0.5μl ATP(10mM)，0.25μl T4DNA Ligase，用D-H2O补足到15μl，16℃反应30分钟。连接后用D-H2O补到100μl，进行连接产物纯化：加1.5μl glycogen，253μl的预冷无水乙醇，-70℃放置30分钟沉淀后，离心加5μlD-H2O溶解DNA沉淀。
1.10电转化
融化-80℃保存的感受态细胞。将40μl的细胞和5μl纯化后的连接产物在冰上混匀，放置1分钟，然后加入到预冷的电击杯中，进行电击。加入150μl SOC培养基(2％(W/V)Tryptone，0.5％(W/V)Yeast，0.05％(W/V)NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，20mM葡萄糖，pH＝7.0)，37℃摇床，220rpm振摇40～60分钟。将菌液均匀涂布到含50μg/ml Kan的LB琼脂平板(1％(W/V)Tryptone，0.5％(W/V)Yeast，1％(W/V)NaCl，1.5％(W/V)Agar，pH＝7.0)上，37℃恒温培养箱过夜培养。
1.11 PCR菌检
随机挑取菌斑至400μl LB(1％(W/V)，Tryptone0.5％(W/V)，Yeast1％(W/V)，NaCl，pH＝7.0)1.5ml EP管(或48深孔板)中37℃摇床，220rpm振摇2h。
PCR检测：取2μl培养菌液为模板，进行PCR反应。PCR体系为：2μl菌液，0.5μl 3’H1(10pM)，0.5μl 5’U6(10pM)，0.5μl dNTP(10mM)，3μl 10×PCR Buffer，0.3μl Tag DNA polymerase，用D-H2O补到30μl。反应体系为95℃5分钟预变性，94℃30秒变性，62℃30秒退火，72℃40秒延伸，72℃7终末延伸，25个循环。5μl PCR产物Agarose胶检测，如图8所示，出现400bp左右条带的为阳性；没有PCR产物的为没挑到菌斑或接菌培养失败。在随机挑取的48个克隆中，44例阳性，阳性率为91.6％。
SfiI酶切证实真阳性：400bp左右条带的阳性条带中，siRNA只有19-13bp，siRNA重组体(真阳性克隆)和非重组体(假阳性空载体克隆)的PCR产物长度鉴定极为困难。为了进一步鉴定真阳克隆，本发明利用空载体多克隆位点含有SfiI酶切位点的特点，将菌液PCR产物进行SfiI酶切，PCR产物不能被消化者为真阳性克隆。
取4μl菌液PCR产物，加入0.25μl SfiI酶，0.75μl NEBuffer-2，混匀后PCR仪，50℃，反应1.5小时。5μl酶切产物Agarose胶检测，如图9所示，43例检测中，只有1例被SfiI消化，重组率为97.6％。
1.12接菌扩大培养，质粒抽提
100μl 2小时培养的菌液接种到4ml Ka+LB液体培养基试管中，37℃摇床，220rpm过夜摇菌。次日取800μl菌液保种为20％的甘油菌，-20℃保存；用TIANprep Mini Plasmid Kit抽提质粒，50μl D-H2O洗脱DNA，-20℃保存。1μl质粒Agarose胶电泳检测，如图10所示，质粒大小为5.5kb，与。
1.13测序鉴定
从抽提的质粒中取出20μl，送测序(上海英骏生物技术有限公司)。所得序列用alignment program软件和SARS全长基因进行序列比对。
2.结果分析
从SARS siRNA分子库中，随机抽样30例进行测序，所得结果统计见下表：
  编号 克隆号 siRNA分子序列 siRNA长度 位点所在
  1   S061218-1   TACAATTTGCCTATTCTAATC  21   101～121
  2   S061218-11   GGCTCTTGTGGCCAGTAACA  20   161～181
  3   S061220-10   GGAAAACAAGCTTTATTATG  20   529～510
  4   S061220-19   TACGGTAGCGGTTGTATGC  19   87～69
  5   S070115-21   TATTCTAATCGGAACAGGTT  20   112～131
  6   S070115-26   GAGCAAACAGCCTGAAGGAAGC  22   378～357
  7   S070115-46   GTACCCGCTCAATGTGGTCA  20   311～330
  8   S070119-27   GTACATAATAAAGCTTGTTTTC C  23   135～157
  9   S070119-28   AGAATGTTTGTTTCTGGGT  19   332～312
  10   S070119-30   CATTGGTGCTGTGATCATTC  20   414～433
  11   S070119-31   GAGAATGTTTGTTTCTGGGT  20   332～314
  12   S070119-32   CTTTATTATGTACAAAAACC  20   539～520*
  13   S070119-34   GATTAGAATAGGCAAATTGT  20   565～546
  14   S070122-7   GGAAGCAACGAAGTAGCTAAGCC  23   395～373
  15   S070122-12   GAGCGGGTACGAGCAAACAGCC  22   368～347
  16   S070122-14   TCTCCGGGGGACAATTGTGAC  21   366～386*
  17   S070122-19   TGTTACTACAATTTGCCTATTC  22   95～116
  18   S070122-22   GCTTTATTATGTACAAAAACC  21   539～519*
  19   S070122-30   GAATGACCACATTGAGCGGGT  21   354～334
  20   S070122-32   GTGATGTAGCCACAGTGATC  20   169～150
  21   S070122-48   TCAACCCAGAAACAAACATTC  21   332～352
  22   S070307-4   GTATTGTAGGCTTGATGTGGCT  22   254～275*
  23   S070307-45   CTACAATTTGCCTATTCTAATC  22   100～121
  24   S070307-48   TACAATACAAGCCATTGCAATC  22   427～406
  25   S070316-11   CATCAAGCCTACAATACAAGCC  22   418～397*
30例中，5例为序列重复克隆(*)，25例为不同位点随机分布。长度可控性分布在19～23bp之间，显示出位点及长度的多样性。

Claims (2)

1.一种PCR高通量构建siRNA全位点分子库的制备方法，其特征是：为依次包括下列步骤和结构：
(1)将起始DNA在Mn2+的缓冲体系中用DNAse I行不完全消化，消化后的DNA和产生16-23bp的siRNA环状磷酸接头-1进行平端连接；
结构上，各环状磷酸接头-1都包含一个III型限制性酶切位点，该位点的近端即近接头平端，与多聚A/T序列相接续，远端即近发夹环部，与一个II型限制性酶切位点相接续，通过加减多聚A/T碱基对的数目，可以控制各环状磷酸接头-1中的III型限制性酶切长度，使siRNA长度呈可控性分布，远端II型限制性酶切位点能介导多聚A/T的克隆方式，一旦克隆能产生U6和H1启动子多聚A和多聚T的转录起始和终止信号，去除启动子和siRNA之间多余的克隆位点序列；
所述的环状磷酸接头-1的通式为：
5’pC(n)TTTTN(n)III型内切酶N(n)II型内切酶-PCR锚序列-环
3’G(n)AAAAN(n)III型内切酶N(n)II型内切酶-PCR锚序列-环
上述P：磷酸键；N：G，C，T，A任意碱基；n：碱基数(0-20)，可计算
上述两种限制性内切酶的距离相应调整；
(2)以上述平端连接反应后的产物为模板，用环状磷酸接头-1的反义链序列为引物进行“单引物”PCR扩增，选择性扩增两个对立而置的III型限制性酶切位点分子，使之能被III型限制性酶消化；
(3)PCR产物用III型限制性内切酶消化，酶切后的DNA呈粘性末端；
(4)上述DNA酶切后的粘端用DNA聚合酶在dNTPs存在下补平，然后与磷酸接头-2进行平端连接。该接头包含一个II型限制性内切酶消化位点(与磷酸接头-1产生相同的粘端)，为进行克隆所用；
(5)将经步骤(4)平端连接后的产物用5’(磷酸接头-1)和3’磷酸接头-2)引物进行PCR扩增；
(6)纯化PCR产物后进行II型限制性内切酶消化，两侧产生AAAA粘端；
(7)分离目的片段后，克隆到带有T5/A1粘端的表达载体构建siRNA分子库或miRNA(microRNA)分子库；前者带有U6和H1双启动子，表达双链的siRNA；后者为U6或H1单一启动子，表达单链的miRNA。一经克隆能产生U6或/和H1启动子多聚A和多聚T的转录起始和终止信号。
2.根据权利要求1所述的PCR高通量构建siRNA全位点分子库的制备方法，其特征是：在环状磷酸接头-1的转录起始信号多聚A后加一个增强转录效率的“G”碱基。
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