CN110331201B

CN110331201B - 宫颈鳞癌相关生物标志物及其应用

Info

Publication number: CN110331201B
Application number: CN201910684296.6A
Authority: CN
Inventors: 李文梅; 张永生
Original assignee: Sishui People's Hospital
Current assignee: Sishui People's Hospital
Priority date: 2019-07-26
Filing date: 2019-07-26
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2039-07-26
Also published as: CN110331201A

Abstract

本发明公开了宫颈鳞癌相关生物标志物及其应用，所述生物标志物为WDR5B与TRIOBP。本发明首次发现了WDR5B与TRIOBP在宫颈鳞癌中呈现差异表达，鉴于此，本发明公开了WDR5B与TRIOBP在制备诊断宫颈鳞癌的产品中的应用以及包含检测WDR5B与TRIOBP的表达水平的试剂的诊断宫颈鳞癌的产品。

Description

宫颈鳞癌相关生物标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及宫颈鳞癌相关生物标志物及其应用。

背景技术

宫颈癌的发病率和死亡率位居全球恶性肿瘤的第四位(Bray F,Ferlay J,Soerjomataram I,et al.Global cancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates ofincidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].CACancer J Clin,2018,68(6):394-424.)。每年有超过50万妇女被诊断为宫颈癌，该疾病导致全球超过30万人死亡(Cohen PA,Jhingran A,Oaknin A,et al.Cervical cancer[J].Lancet,2019,393(10167):169-182.)，且约有85％的患者来自于发展中国家或欠发达地区(Small W,Bacon MA,Bajaj A,et al.Cervical cancer:A global health crisis[J].Cancer,2017,123(13):2404-2412.)。宫颈癌发病的主要原因是HPV高危型的持续性感染，在约70％的宫颈癌患者中可检测到HPV 16型和18型(Hu Z,Ma D.The precisionprevention and therapy of HPV-related cervical cancer:new concepts andclinical implications[J].Cancer Med,2018,7(10):5217-5236.)。随着HPV疫苗的推广，宫颈癌的预防取得了一定的成果，但在人口众多的发展中国家HPV疫苗还有很多难以普及的问题，此外，HPV疫苗对宫颈癌只具有预防作用而没有治疗作用。早期宫颈癌的治疗目前还是主要以手术为主，晚期和复发的患者主要以放疗和化疗为主，但目前，在欠发达国家宫颈癌的3～5年生存率仍小于50％。所以，针对宫颈鳞癌的预防和治疗还需进一步的研究和探讨。目前对临床治疗最有意义的标记物为鳞状细胞癌抗原，但其特异性和敏感性仅为60％，对判断是否有淋巴结转移诊断价值较低。因此，寻找其他更具有临床诊断意义的肿瘤标记物仍然十分重要。

肿瘤的发生和发展的过程中涉及基因组的突变(Hanahan D,Weinberg RA.Thehallmarks of cancer[J].Cell,2000,100(1):57-70.)和表观遗传学的变化，是一个十分复杂涉及多个通路调控的过程，表观遗传的变化是指不改变基因组的DNA序列而影响基因表达的结构修饰，包括DNA甲基化，染色质修饰，核小体定位和RNA表达谱的改变的关键过程。随着生物技术的发展以及精准化医疗的提出，与疾病相关的基因表达谱的研究成为目前的焦点，寻找可用于表征疾病的分子标志物对于疾病的早期诊断和治疗具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与宫颈鳞癌相关的生物标志物，通过检测生物标志物的表达水平，进而实现宫颈鳞癌的早期诊断。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测生物标志物的试剂在制备诊断宫颈鳞癌产品中的应用，所述生物标志物选自WDR5B、TRIOBP的一种或两种。

进一步，WDR5B在宫颈鳞癌患者中表达上调，TRIOBP在宫颈鳞癌患者中表达下调。

进一步，所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术、蛋白免疫技术检测生物标志物水平的试剂。

进一步，所述试剂选自：

特异性识别WDR5B或TRIOBP的探针；或

特异性扩增WDR5B或TRIOBP的引物；或

特异性结合WDR5B或TRIOBP编码的蛋白的抗体。

进一步，特异性扩增WDR5B的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示，特异性扩增TRIOBP的引物序列如SEQ ID NO.3～4所示。

本发明提供了一种检测样本中生物标志物WDR5B或TRIOBP表达水平的产品，所述产品包括制剂、核酸膜条、芯片或试剂盒。其中，“样本”是包含细胞或细胞物质的可从中获取核酸、多肽、或其它分析物的物质。

进一步，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片，基因芯片包括针对生物标志物的特异性引物或寡核苷酸探针，蛋白质芯片包括特异性结合生物标志物编码的蛋白的抗体或配体。

进一步，所述试剂盒包括：

检测生物标志物表达水平的一种或多种试剂；和

选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

进一步，所述试剂盒包括通过RT-PCR法、qRT-PCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法、免疫印迹法检测生物标志物表达水平的试剂。

试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

进一步，所述样本为组织。

本发明提供了检测样本中生物标志物WDR5B或TRIOBP表达水平的产品在制备诊断宫颈鳞癌的工具中的应用。

在本发明中，“标志物”指与一个或多个生物分子相关的参数(即“生物标志物”)，例如天然或人工合成产生的核酸(即个体基因，以及编码和非编码DNA和RNA)和蛋白(例如肽、多肽)。本发明中的“生物标志物”还包括指可通过考虑来自两个或多个不同标志物的表达数据计算或以其他方式获得的单个参数。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。WDR5B和TRIOBP在目前国际公共核酸数据库GeneBank中的ID分别为54554和11078。本领域技术人员知道，在进行测序分析时，会将原始测序结果比对到人的参考基因组上，因此筛选结果中的基因可能会包含不同的转录本，只要可以比对到参考基因组上即可。

人WDR5B基因位于3号染色体上，一种代表性的WDR5B基因序列如NM_019069.4所示，相对应的氨基酸序列如NP_061942.2所示。

人TRIOBP基因位于22号染色体上，目前国际公共核酸数据库GeneBank中TRIOBP基因存在3个转录本。作为非限制性的实例，TRIOBP基因的序列如NM_001039141.3、NM_007032.5或NM_138632.2任一转录本所示。其相应的氨基酸序列如NP_001034230.1、NP_008963.3、NP_619538.2所示。在本发明中，一种代表性的TRIOBP基因序列如NM_001039141.3所示，氨基酸序列如NP_001034230.1所示。

本发明所述的生物标志物包括基因和蛋白。此类标志物包括含有编码生物标志物的核酸序列或此序列的互补序列的完整或部分序列的DNA。生物标志物核酸还包括含有所关注的任何核酸序列的完整或部分序列的RNA。生物标志物蛋白是由本发明的DNA生物标志物编码的或对应于本发明的DNA生物标志物的蛋白。生物标志物蛋白包含任何生物标志物蛋白或多肽的完整或部分氨基酸序列。生物标志物基因和蛋白的片段和变体也包括在本发明的范围内。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录或翻译(即蛋白)水平上检测生物标志物的表达水平。

本发明的生物标志物使用本领域普通技术人员已知的多种核酸以及蛋白技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交、核酸扩增技术、蛋白免疫技术。

本发明所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。

蛋白免疫技术包括夹心免疫测定，例如夹心ELISA，其中使用识别生物标志物上不同表位的两种抗体进行该生物标志物的检测；放射免疫测定(RIA)、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、荧光免疫测定(FIA)、蛋白质印迹法、免疫沉淀法和基于任何颗粒的免疫测定(如使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)。可例如在微量滴定板或条的形式中实施免疫法。

在一些实施方案中，在转录水平上检测生物标志物的表达水平。利用核酸杂交技术进行具体DNA和RNA测量的多种方法是本领域技术人员已知的。一些方法涉及电泳分离(例如，用于检测DNA的Southern印迹和用于检测RNA的Northern印迹)，但是也可以在不利用电泳分离的情况下进行DNA和RNA的测量(例如，通过斑点印迹)。基因组DNA(例如，来自人)的Southern印迹可用于筛选限制性片段长度多态性(RFLP)，以检测影响本发明多肽的遗传病症的存在。可以检测所有形式的RNA，包括但不限于信使RNA(mRNA)、微RNA(miRNA)、核糖体RNA(rRNA)和转运RNA(tRNA)。

核酸杂交形式的选择不是关键的。多种核酸杂交形式包括但不限于夹心测定和竞争或替代测定。杂交复合物的检测可需要产信号复合物与靶标和探针多核苷酸或核酸的双螺旋的结合。通常，这种结合通过配体和抗配体相互作用而发生，例如配体偶联的探针和偶联有信号的抗配体之间的相互作用。通过暴露于超声能，信号生成复合物的结合也易于得到加速。

术语“芯片”也称为“阵列”，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。

“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。

本发明中使用的针对上述基因编码的蛋白质的抗体以最广义使用，而且具体涵盖例如单克隆抗体、多克隆抗体、具有多表位特异性的抗体，多特异性抗体和抗体片段。此类抗体可以是嵌合的，人源化的，人的和合成的。

在本发明中，核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了与宫颈鳞癌相关的生物标志物，所述生物标志物为WDR5B和TRIOBP，WDR5B和TRIOBP在宫颈鳞癌患者中呈现差异表达，通过检测分子标志物的表达水平，可以判断受试者是否患有宫颈鳞癌，以实现宫颈鳞癌的早期诊断。

附图说明

图1是生物标志物宫颈鳞癌中的表达情况图，其中，图A是WDR5B的表达情况图，图B是TRIOBP的表达情况图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例QPCR检测WDR5B和TRIOBP在宫颈鳞癌中的表达情况

1、样品收集

收集35例宫颈鳞癌组织和相应的癌旁组织，所有病例术前未做任何免疫抑制剂治疗、放疗以及化疗。

2、RNA样品的制备及质量分析

使用TRIZOL法提取组织总RNA

1)用剪刀组织剪碎，加入1ml Trizol,振荡器上震荡1min；常温放置10min，使核蛋白体完全分解。

2)加入200μl三氯甲烷(氯仿)，盖紧管盖，剧烈震荡15s，常温静置10min。

3)4℃，11000rpm离心15min。

4)将水样层转移到一个新的离心管中，加入500μl异丙醇；颠倒混匀后，常温静置10min。

5)4℃，11000rpm离心15min。

6)用枪小心吸走液体，留沉淀在管底，加入1ml 75％的乙醇，在振荡器上震荡5s，洗涤沉淀一次。

7)4℃，8000rpm离心5min。

8)将上清小心去掉，干燥沉淀10min，加入适量的水溶解沉淀10min。

9)检测RNA浓度，鉴定RNA的产量和纯度。

3、逆转录：

使用TAKARA公司的反转录试剂盒(Takara code：DRR047A)进行操作。

1)去除基因组DNA

在试管中加入5×gDNA Eraser Bμffer 2.0μl，gDNA Eraser 1.0μl，总RNA 1μg，加Rnase Free ddH₂O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热2min。

2)反转录反应

将

Buffer 2 4.0μl，

RT Enzyme Mix I 1.0μl，RTPrimer Mix 1.0μl，RNase Free ddH₂O 4.0μl加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中37℃15min，85℃5s。

4、QPCR扩增

1)引物设计

根据WDR5B、TRIOBP和GADPH的基因序列设计引物，引物序列如下所示。

WDR5B基因：

SEQ ID NO.1(F)：5’-ACGGAAGCAGTGTCATCA-3’

SEQ ID NO.2(R)：5’-GATTAGCCTATCAGCAGAAGAAC-3’；

TRIOBP基因：

SEQ ID NO.3(F)：5’-TAACAGAACCATCCAACAAG-3’

SEQ ID NO.4(R)：5’-TCTCGTGTGGCTCTATTG-3’；

GAPDH基因：

SEQ ID NO.5(F)：5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’

SEQ ID NO.6(R)：5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’

2)QPCR扩增检验

用

Premix Ex Taq^TMII(Takara Code:DRR081)试剂盒配置PCR反应体系，在Thermal Cycler

Real Time System扩增仪上进行PCR扩增，反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和溶解曲线，ΔΔCT法进行相对定量。

配置25μl反应体系：

Premix Ex TaqTM II(2×)12.5μl，正(反)向引物各1μl，DNA模板2μl，灭菌蒸馏水8.5μl。

反应条件：95℃30s，(95℃5s，60℃30s)×40

5、结果

结果如图1所示，与正常组织相比，WDR5B在宫颈鳞癌患者中表达上调，上调约7.83倍，TRIOBP在宫颈鳞癌患者中表达下调，下调约4.56倍，差异具有统计学意义(P<0.05)，其中WDR5B在30例样本中表达上调，TRIOBP在33例宫颈鳞癌样本中表达下调，提示WDR5B和TRIOBP可作为分子标志物应用于宫颈鳞癌的诊断。

根据WDR5B和TRIOBP与宫颈鳞癌之间的关系，可以设计靶向WDR5B和TRIOBP的siRNA或shRNA，治疗宫颈鳞癌。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 泗水县人民医院

<120> 宫颈鳞癌相关生物标志物及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acggaagcag tgtcatca 18

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gattagccta tcagcagaag aac 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

taacagaacc atccaacaag 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tctcgtgtgg ctctattg 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aatcccatca ccatcttcca g 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gagccccagc cttctccat 19

Claims

1.检测生物标志物的试剂在制备诊断宫颈鳞癌产品中的应用，其特征在于，所述生物标志物选自WDR5B、TRIOBP的一种或两种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于， WDR5B在宫颈鳞癌患者中表达上调，TRIOBP在宫颈鳞癌患者中表达下调。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术、蛋白免疫技术检测基因标志物水平的试剂。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂选自：

特异性识别WDR5B或TRIOBP的探针；或

特异性扩增WDR5B或TRIOBP的引物；或

特异性结合WDR5B或TRIOBP编码的蛋白的抗体。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，特异性扩增WDR5B的引物序列如SEQ IDNO.1~2所示，特异性扩增TRIOBP的引物序列如SEQ ID NO.3~4所示。

6.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括制剂、核酸膜条、芯片或试剂盒。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片，基因芯片包括针对基因标志物的特异性引物或寡核苷酸探针，蛋白质芯片包括特异性结合基因标志物编码的蛋白的抗体或配体。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括：

检测基因标志物表达水平的一种或多种试剂；和

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括通过RT-PCR法、qRT-PCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法、免疫印迹法检测基因标志物表达水平的试剂。