CN1710079A - 一种可同时表达多种shRNA的载体pCSH1－n及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可同时表达多种shRNA的载体pCSH1－n，可在一个载体上同时实现对多个基因的干扰，所说载体pCSH1包含有基本质粒序列、shRNA转录单位和两组多克隆位点，插入针对靶基因的shRNA模板后，转染细胞或动物就可以特异并有效地抑制两个或多个靶基因的表达，因而可将本发明方便地用于基因功能的研究和用于抗肿瘤药物的研究与开发。

Description

一种可同时表达多种shRNA的载体pCSH1-n及其构建方法

技术领域：

本发明涉及医药分子生物学技术领域中可用于同时表达多种shRNA的载体pCSH1-n及其构建方法。

背景技术：

RNA干扰(RNAi)是指双链RNA(dsRNA)特异性地诱发与其同源序列的mRNA分子被降解，导致相应基因表达被抑制的现象，是一种特殊的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silence，PTGS)现象。shRNA是指在构建表达短RNA片段时的发卡式结构。自1998年发现以来，在机理研究及应用开发方面均取得了令人鼓舞的成果。它的具体过程是由外源或转基因、病毒感染等方式引入的dsRNA，在细胞内被RNA酶Dicer以ATP依赖的方式，切割为21-23核苷酸长的3’-端有2个核苷酸突出的双链RNA，即小分子干扰RNA(smallinterfering RNA，siRNA)。siRNA同核酸酶等蛋白结合而形成RNA诱导基因沉默复合物(RNAs inducedsilencing complex，RISC)。RISC在ATP的作用下将双链siRNA打开成单链，与靶基因表达的mRNA的互补位置特异性结合，诱发mRNA降解，使靶基因的mRNA的数量减少，从而在RNA水平上抑制靶基因表达。

目前RNA干扰的应用主要集中于抗病毒、抗肿瘤和对基因功能的研究等方面。在哺乳动物细胞中，由于干扰素效应的存在，只能采用小于29bp的双链RNA。实验过程中获得siRNA的方法主要有化学合成siRNA法、体外转录合成siRNA法、shRNA表达载体法、用RNaseIII(Dicer)切割长的dsRNA的方法、PCR表达盒法(由PCR得到的siRNA转录模板，为DNA片段，仅含启动子、siRNA模板和终止位点)等五种。

在抗病毒、抗肿瘤的研究中，化学合成法以其方便快捷的优点而进展迅速，但它相对高昂的成本限制了它的进一步推广。而shRNA表达载体法则成本低廉，也能有效地在体内、体外实现RNA干扰，近来的发展也十分迅速。

shRNA表达载体法的基本思路如下：细胞内的RNA聚合酶III可以识别特定启动子从而起始转录，当遇到连续的4～6个T时，转录就会终止。科学家们由此设计了能表达特定短RNA的质粒，转染进入细胞后经RNA聚合酶III转录就可得到短RNA。这种RNA两端的21个左右的核苷酸反向互补，可以形成发卡结构。这种发卡结构的RNA(short hairpin RNA，shRNA)会很快被剪切成为siRNA，从而起到RNA干扰的作用。这种方法操作简便，成本低，与化学合成siRNA相比，DNA质粒在体内更稳定，对靶基因的表达抑制效率高，便于进行较长时间的基因功能研究，因而日渐成为热门研究课题。

shRNA表达载体法分为病毒载体法和非病毒载体法两种。尽管相对于非病毒载体而言，病毒载体用量少，转染效率高，但它的安全性一直倍受关注。非病毒载体相对安全，它的缺点是转染效率低，载体用量大等。

Alan J Bridge等发现，足够量的shRNA表达载体也可以促发干扰素效应，并且普通的质粒如Bluscript转染哺乳动物细胞时，只要达到一定的用量，也可以引起细胞的干扰素效应，尤其是在体外实验中。这一现象限制了转染时载体的用量，在某些试验尤其是需要同时抑制两个或多个基因时往往受到很大的限制。

本发明的目的，是要提供一种可用于同时表达多种shRNA的载体pCSH1-n，具体地讲，是为了克服非病毒载体已知的上述缺陷，使一个载体上能同时存在多个shRNA转录单位，提高shRNA干扰效果，在产生有效的特异RNA干扰的同时，尽量降低载体的用量，以减少转染过程产生的非特异性作用。

发明内容：

本发明提供一种可用于同时表达多种shRNA的载体pCSH1-n(n表示shRNA转录单位的个数，n＝1，2，…，n)。所说载体pCSH1-n，其组成包括多个shRNA转录单位、质粒基本序列及多克隆位点的表达载体(图1)。本发明利用目前普遍使用的、也是分子量最小的shRNA表达载体之一pSilencer H1 3.0载体的H1启动子，将H1启动子用合适的酶切位点串联起来，并在H1启动子转录单位的前后各连接一个多克隆位点，然后将连接产物连接到含有质粒基本序列如pUC19上，命名为pCSH1-n。构建完成后的载体pCSH1-n包含有基本质粒序列、两个或多个shRNA转录单位及两组多克隆位点。两组多克隆位点分别位于shRNA转录单位的前后，利用转录单位前后合适的两个酶切位点如同尾酶酶切位点和多克隆位点的一个酶切位点进行的组合即可实现多个shRNA转录单位串联在一个载体上。该多个shRNA转录单位可以设计成针对一个靶基因的同一位点，也可以设计成针对一个靶基因的不同位点，还可以设计成针对不同靶基因，从而实现对一个或多个靶基因有效而且特异的抑制。因此，本发明所说载体可用于制备研究基因功能的siRNA试剂或用于siRNA抗肿瘤药物的研究与开发。本发明shRNA表达载体pCSH1-n的构建步骤如下：

1、设计酶切位点组合

为了利用同尾酶的特性，实现将多个shRNA转录单位串联在一个载体上的目的，需要在shRNA转录单位两侧选择一对同尾酶和设计两组多克隆位点，使这两组多克隆位点与shRNA表达转录单位、基本的质粒序列有序组合，构建成质粒载体。

2、合成两对引物

根据以上设计思路，需人工合成两对引物，每对引物对应一个多克隆位点。

3、引物进行退火成为双链DNA

这两对引物退火形成双链后，-20℃保存备用。

4、将各个片断进行连接

用基因工程的手段将载体基本质粒序列如pUC19和利用转录单位如pSilencer H1 3.0(购自Ambion公司)中的H1启动子前后合适的两个酶切位点如同尾酶酶切位点，加上含两个多克隆位点的引物连接起来。利用转录单位前后合适的两个酶切位点如同尾酶酶切位点和多克隆位点的一个酶切位点进行的组合可实现两个或多个shRNA转录单位的串联。然后测序验证插入片断的正误，构建形成pCSH1-n表达载体。本发明所述的载体pCSH1-n由基本质粒序列、两个或多个shRNA转录单位和两组多克隆位点构建而成，可以实现在一个载体上同时表达多种shRNA。

5、pCSH1-n载体同时表达多种shRNA在肿瘤细胞中进行RNAi效应检测

载体pCSH1-1构建完成后，合成了两个肿瘤相关基因如N-Ras和c-Myc的shRNA模板，分别构建含单一N-Ras或c-Myc shRNA的pCSH1-1载体，即pCSH1-shN2和pCSH1-shMyc。然后利用本发明的思路，或将shN2和shMyc串联成两个转录单位的pCSH1-shNM载体，或将两个shN2转录单位串联，构成pCSH1-2shN2表达载体，进行RNAi效应检测。结果表明，本发明所说载体可以同时表达两种或多种shRNA。串联后的载体pCSH1-2shN2对细胞的干扰效应呈现增强。表明本载体应用于串联相同的shRNA转录单位可增强RNA干扰的效果。

发明效果：

本发明以质粒表达干扰RNA为技术平台，提供了一种新的可以在一个载体上表达多种干扰RNA的载体pCSH1-n及其构建方法，经siRNA体外生长抑制作用检测、mRNA和蛋白水平沉默效果检测等表明，所构建的载体能实现两个不同靶点的抑制效果明显，应用于串联相同靶点转录单位可增强RNA干扰的效果。与单shRNA表达载体如pSilencer H1 3.0相比，本发明载体降低了质粒的使用量，降低了载体导入细胞过程中产生的非特异毒性。因此，载体pCSH1-n在以RNA干扰为基础的肿瘤基因治疗中有着较好的应用前景。

附图说明：

图1.pCSH1-n质粒结构示意图，

其中：n表示shRNA转录单位的个数，n＝1，2，…，n。

图2.两个shRNA转录单位串联的流程图，

其中：Sal I、Xho I和Pst I三个酶切位点的相对位置维持不变。

图3.pCSH1-1质粒构建流程图，

其中：Sal I、Xho I和Pst I三个酶切位点是进行shRNA转录单位串联的关键酶。

图4.pCSH1-shN2降低靶mRNA水平，

其中：Marker：DNA分子量标准；

Control：未转染任何质粒组；

psiMock：转染pCSH1-shMock组；

psiN2：转染pCSH1-shN2组。

图5.pCSH1-shN2降低靶蛋白水平，

其中：Control：未转染任何质粒组；

psiMock：转染pCSH1-shMock组；

psiN2：转染pCSH1-shN2组。

图6.pCSH1-shMyc降低靶mRNA水平，

其中：Marker：DNA分子量标准；

Control：未转染任何质粒组；

psiMock：转染pCSH1-shMock组；

psiMyc：转染pCSH1-shMyc组。

图7.pCSH1-shMyc降低靶蛋白水平，

其中：Control：未转染任何质粒组；

psiMock：转染pCSH1-shMock组；

psiMyc：转染pCSH1-shMyc组。

图8.pCSH1-2shN2、pCSH1-shN2对HepG2细胞生长的影响，

其中：Control：未转染任何质粒组；

shMock：转染pCSH1-shMock组；

2shMock：转染pCSH1-2shMock组；

shN2：转染pCSH1-shN2组；

2shN2：转染pCSH1-2shN2组。

图9.pCSH1-shN2、pCSH1-shMyc和pCSH1-shNM降低靶蛋白水平，

其中：Control：未转染任何质粒组；

psiMock：转染pCSH1-shMock组；

psiN2：转染pCSH1-shN2组；

psiMyc：转染pCSH1-shMyc组；

psiNM：转染pCSH1-shNM组。

具体实施方式：

本发明说明书实施例中在强调所构建的发卡式短干扰RNA结构时使用shRNA来表示，在强调短干扰RNA的效应时用siRNA来表示。

以下所举实施例是为帮助进一步理解本发明，而不具有任何限制作用。

实施例1：能同时表达多种shRNA的载体pCSH1-n的构建

要在一个载体上实现多个shRNA转录单位的串联，需要利用原始载体的shRNA转录单位中没有的酶切位点，即在保证转录单位完整的情况下，利用合适的酶切位点，以使串联成为可能。本发明利用内切酶中同尾酶能产生相同的粘末端可进行连接但连接后不再被切开的原理，来实现串联的目标，但不限于所选用的内切酶包括同尾酶。Sal I和Xho I是一对同尾酶，Sal I识别的位点是G TCGAC，Xho I识别的位点是C TCGAG，二者的酶切产物均含相同的粘末端TCGA，可以用连接酶进行连接，连接完成后序列为G TCGAG，这一对同尾酶均不能被识别。根据这一特点，本发明设计了一个方案，在转录单位之前加入Sal I位点，在转录单位之后加入Xho I位点和Pst I位点。将改造好的载体用SalI+Pst I酶切回收小片断，再用Xho I+Pst I酶切回收大片断，将两个回收的片断连接即可实现两个shRNA转录单位的串联，而这三个酶切位点的相对位置维持不变，可以继续用来串联别的shRNA转录单位(图2)。

本发明所说的载体pCSH1-n由基本质粒序列、n个shRNA转录单位和两个多克隆位点构建而成，可以实现在一个载体上同时表达多种shRNA。

一、多克隆位点的设计与合成

两个多克隆位点，按照同尾酶的特性进行多个shRNA转录单位串联的思路设计，委托赛百盛公司合成，退火后冻存，分别命名为KSEE和HXEP，合成的

引物序列分别为：

KSEEa：5′-AATT GGTACCGTCGAC GATATCG-3′

KSEEas：3′- CCATGGCAGCTG CTATAGCTTAA-5′

HXEPa：5′-AGCTT CTCGAGATAT CTGC-3′

HXEPas：3′-A GAGCTCTATA GACGTCGA-5′

KSEEa和KSEEas可以退火形成双链，双链上含有Kpn I、Sal I、EcoR V、EcoR I四个酶切位点；HXEPa和HXEPas可以形成双链，双链上含有Hind III、Xho I、EcoR V、Pst I四个酶切位点。

二、引物进行退火成为双链DNA

引物加无RNase水溶解至1μg/μL。将成对的引物各2μL加入46μLDNA退火缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5，100mM NaCl，1mM EDTA pH8.0)至总体积50μL，95℃ 5分钟、37℃ 1小时孵育，使引物退火成为双链DNA，分别命名为KSEE和HXEP，KSEE上含有Kpn I、Sal I、EcoR V、EcoR I四个酶切位点，HXEP上含有Hind III、Xho I、EcoR V、Pst I四个酶切位点。其中Sal I和Xho I是一对同尾酶。引物退火后的DNA-20℃保存备用。

三、将各个片断进行连接

用基因工程的手段将载体pUC19、KSEE、pSilencer H1 3.0(购自Ambion公司)的H1启动子和HXEP连接起来(图3)，命名为pCSH1-1。

四、本发明shRNA表达载体pCSH1-1的检测

构建好的载体委托宝生物公司测序，引物为M13±，双向测序结果均正确，证明改造完成。

五、本发明shRNA表达载体pCSH1-n的构建(n＞1时)

如果需要构建含一个以上shRNA转录单位的pCSH1-n载体，则按照实施例6的方法完成构建。

实施例2：应用pCSH1-n实现针对肿瘤相关基因N-Ras的RNA干扰

为了验证pCSH1-n是否可以实现针对单个基因的RNA干扰，需要设计针对特定基因的siRNA靶序列，联入pCSH1-1并在RNA水平和蛋白水平检测靶基因的变化。同时设计不针对任何特定基因的siRNA序列，即mock序列，联入pCSH1-1载体来作为阴性对照。

一、siRNA靶序列的选择

N-Ras是Ras蛋白家族中的一种，在许多肿瘤中发生突变，且突变后会导致Raf-MAPK途径的组成型激活。在肿瘤细胞中抑制突变的N-Ras的表达，可以有效地抑制肿瘤细胞的增殖，是肿瘤治疗中的一个热门靶点。

shRNA靶序列的选择，目前主要是遵循较为公认的Tushl原则并参考其它一些标准。选定靶序列后进行Blast检索，使该靶序列与其它基因不具有较高的同源性。

确定靶序列后需要按照现有规则合成靶序列的shRNA模板DNA(见Thijn R.Brummelkamp等，Science 296，550-553<2002>)。shRNA模板DNA包括正义、反义两条互补的短DNA单链，其基本单位为：BamH I位点、靶序列正义链、9bp的环序列、靶序列反义链、6个T、HindIII位点，总长约60bp。

N-Ras-siRNA的靶mRNA序列及寡DNA引物序列如下：

mRNA Target(N19)

5’-GUGUGAUUUGCCAACAAGG-3’(SEQ ID No1)

引物序列为：

Sense：

5′-GATCC GTGTGATTTGCCAACAAGGTTCAAGAGA CCTTGTTGGCAAATCA

CACTTTTTTGGAAA-3′(SEQ ID No2)

Antisense：

5′-AGCTTTTCCAAAAAA GTGTGATTTGCCAACAAGGTCTCTTGAA CCTTGTT

GGCAAATCACACG-3′(SEQ ID No3)

实验中采用的mock-siRNA序列为：

mRNA Target(N19)

5’-GGAUAGUACGAGAUUACAC-3’

引物序列为：

Sense：

5′-GATCCC GGATAGTACGAGATTACACTTCAAGAGA GTGTAATCTCGTACTA

TCCTTTTTTGGAAA-3′

Antisense：

5′-AGCTTTTCCAAAAAA GGATAGTACGAGATTACACTCTCTTGAA GTGTAA

TCTCGTACTATCCGG-3′

引物中划线部分为相应靶mRNA序列的DNA序列或其互补序列，转录成RNA后会在此处形成发夹结构RNA的双链部分。引物送到赛百盛公司合成。

二、以N-Ras为靶点的干扰序列表达质粒pCSH1-shN2的构建

引物加无RNase水溶解至1μg/μL。将成对的引物各2μL加入46μL DNA退火缓冲液，95℃，5分钟，37℃，1小时孵育，-20℃保存备用。引物退火后形成的双链RNA的5’端有BamH I酶切位点的粘末端，3’端有Hind III酶切位点的粘术端，可以直接用于连接。

将质粒pCSH1-1用内切酶BamH I和Hind III双酶切，回收大片断，-20℃保存备用。

将回收的质粒大片断和引物退火后形成的短双链DNA连接，筛选，测序鉴定。以N-Ras为靶点的干扰序列表达质粒命名为pCSH1-shN2，对照干扰序列表达质粒命名为pCSH1-shMock，对照干扰序列经Blast分析不针对任何基因的mRNA。

三、干扰序列表达质粒的转染

本发明使用LipofectAMINE^TM2000脂质体(Life Technologies，产品货号：11668-027)进行转染，转染后24-48小时进行沉默效果测定。

四、RT-PCR检测干扰序列表达质粒的基因沉默效果

细胞转染24小时后，用TRIzol(Ivitrogen，产品货号：15596-026)提取总RNA，并用紫外分光光度计(BECKMAN DU800)测定RNA的浓度和质量。采用RT-PCR试剂盒(Invitrogen，Cat.No.10928-34)对mRNA水平进行检测。以GAPDH为内标进行RT-PCR，反应完成后将产物进行琼脂糖电泳，用凝胶成像仪照相并分析结果。结果表明，pCSH1-shN2能够有效降低N-Ras基因mRNA的水平，而pCSH1-shMock对N-Ras基因mRNA的水平没有影响(图4)。

五、Western Blotting检测干扰序列表达质粒对靶蛋白水平的影响

细胞转染36小时后，10％的SDS-PAGE，伯乐小型垂直电泳槽(Bio-RadMini-PROTEAN 3)凝胶电泳分离各蛋白，半干转膜仪(Amersham Biosciences，Hoefer TE 70)将蛋白转到PVDF膜上。转完的膜浸于含5％(w/v)脱脂奶粉TBS(10mM Tris HCl，pH 7.5，150mM NaCl)溶液中室温振摇封闭过夜，TBS室温润洗5次，每次5分钟，装入杂交袋，用含1％BSA的TBS溶液稀释第一抗体，室温振摇孵育3小时，TBS室温润洗5次，每次5分钟。装入新的杂交袋内，用二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗)室温孵育3小时，TBS室温润洗5次，每次5分钟。膜上滴加化学发光增强剂(Santa Cruz Biotechnology sc-2048)，按照试剂说明进行操作，通过化学发光成像系统ChemiImager5500(Alpha Innotech.)捕获图像。抗体的稀释比例如下，小鼠单克隆N-RAS抗体(Santa Cruz产品，sc-31)1/150稀释，小鼠单克隆PCNA抗体(Oncogene Product，NA-03)1/500稀释，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠抗体(ZB-2305)1/3000稀释。结果表明pCSH1-shN2能抑制HepG2细胞中相应蛋白的表达，而经pCSH1-shMock对N-RAS蛋白水平没有影响(图5)。同时以PCNA(Proliferating cell nuclear antigen)蛋白作为上样对照。

实施例3：应用pCSH1-n实现针对肿瘤相关基因c-Myc的RNA干扰

为了验证pCSH1-n是否可以实现对两个基因的同时干扰，本发明又设计了针对肿瘤相关基因c-Myc的siRNA模板。c-Myc是Myc蛋白家族中的一种，是一个转录因子，参与了细胞的生长、分化与凋亡。c-myc与多种肿瘤发生发展有关。c-Myc有助于癌细胞的发展，在恶性肿瘤的病态发展中扮演着关键性的角色。c-Myc目前是肿瘤治疗的一个重要靶标。

确定靶序列后需要按照同实施例2的方法合成靶序列的shRNA模板DNA。

c-Myc-siRNA的靶mRNA序列及寡DNA序列如下：

mRNA Target(N19)

5’-GGAAGAAAUUCGAGCUGCU-3’(SEQ ID No4)

引物序列为：

Sense：

5′-GATCCC GGAAGAAATTCGAGCTGCTTTCAAGAGA AGCAGCTCGAATTTC

TTCCTTTTTTGGAAA-3′(SEQ ID No5)

Antisense：

5′-AGCTTTTCCAAAAAA GGAAGAAATTCGAGCTGCTTCTCTTGAA AGCAGC

TCGAATTTCTTCCGG-3′(SEQ ID No6)

引物中划线部分为相应靶mRNA序列的DNA序列或其互补序列，转录成RNA后会在此处形成发夹结构RNA的双链部分。引物送到赛百盛公司合成。实验中采用的mock-siRNA序列同实施例2。

按照同实施例2的方法完成以c-Myc为靶点的干扰序列表达质粒pCSH1-shMyc的构建后，把质粒转染HepG2细胞，并对其进行RT-PCR和WesternBlotting检测，结果表明，pCSH1-shN2能够有效降低c-Myc基因mRNA的水平，而pCSH1-shMock对c-Myc基因mRNA的水平没有影响(图6)。Western Blotting检测中小鼠单克隆c-Myc抗体(Santa Cruz产品，sc-31)1/150稀释，pCSH1-shMyc能抑制HepG2细胞中相应蛋白的表达，而经pCSH1-shMock对c-Myc蛋白水平没有影响(图7)。同时以actin(Santa Cruz产品，sc-1616)作为上样对照。

实施例4：应用pCSH1-n实现针对肿瘤相关基因N-Ras同一位点的shRNA转录单位串联

为了验证pCSH1-n对同一shRNA转录单位进行串联是否有意义，本发明构建了针对肿瘤相关基因N-Ras同一位点的shRNA转录单位串联的载体pCSH1-2shN2，并用生长曲线法检验它对细胞生长的影响。

一、pCSH1-2shN2的构建

将pCSH1-shN2用Sal I+Pst I酶切回收小片断，再用Xho I+Pst I酶切回收大片断，两个回收的片断连接，转化，筛选，就可以得到含两个相同的shRNA转录单位串联的载体，命名为pCSH1-2shN2。同时构建Mock的两个相同的shRNA转录单位串联的载体，命名为pCSH1-2shMock。

二、pCSH1-2shN2对细胞生长的影响

将pCSH1-shN2、pCSH1-2shN2、pCSH1-shMock和pCSH1-2shMock转染HepG2细胞24小时后，将细胞以每孔3000个细胞铺到24孔板中，连续计数6天。相同质量的pCSH1-2shN2对细胞生长的抑制明显强于pCSH1-shN2，而相同质量的pCSH1-2shMock对细胞生长的抑制略微强于pCSH1-shMock(图8)。说明pCSH1-n针对同一位点的shRNA转录单位串联可以增加RNA干扰效果或在保证相同的干扰效果的同时降低质粒的使用量。

实施例5：应用pCSH1-n实现针对肿瘤相关基因N-Ras和c-Myc不同靶基因的shRNA转录单位的串联

为了验证pCSH1-n是否可以实现针对不同靶基因的shRNA转录单位的串联，本发明构建了将针对肿瘤相关基因N-Ras和c-Myc不同靶基因的shRNA转录单位串联的载体pCSH1-shNM，并且在RNA水平和蛋白水平同时检测这两个基因的变化，看它们是否会同时降低。

一、pCSH1-shNM的构建

将pCSH1-shN2用Sal I+Pst I酶切回收小片断，再用Xho I+Pst I酶切pCSH1-shMyc回收大片断，两个回收的片断连接，转化，筛选，就可以得到含两个shRNA转录单位串联的载体，命名为pCSH1-shNM。

二、pCSH1-shNM的效果检测

将pCSH1-shMock、pCSH1-shN2、和pCSH1-shNM转染HepG2细胞48小时后，Western Blotting检测质粒对靶蛋白水平的影响，pCSH1-shNM既能有效抑制N-Ras又能有效抑制c-Myc的蛋白表达水平(图9)。说明pCSH1-n可以实现对两个基因同时干扰，两个shRNA转录单位之间没有明显抑制作用。

实施例6：应用pCSH1-n实现多个的shRNA转录单位的串联

为了验证pCSH1-n是否可以实现针对多个shRNA转录单位的串联，我们构建了含3个shRNA转录单位串联的载体，4个shRNA转录单位串联的载体，5个shRNA转录单位串联的载体，6个shRNA转录单位串联的载体。这些串联在-个载体内的shRNA转录单位可以相同也可以不同。

一、pCSH1-3shN2的构建

将pCSH1-shN2用Sal I+Pst I酶切回收小片断，再用Xho I+Pst I酶切pCSH1-2shN2回收大片断，两个回收的片断连接，转化，筛选，就可以得到含3个shRNA转录单位串联的载体，命名为pCSH1-3shN2。

二、pCSH1-4shN2的构建

将pCSH1-2shN2用Sal I+Pst I酶切回收小片断，再用Xho I+Pst I酶切pCSH1-2shN2回收大片断，两个回收的片断连接，转化，筛选，就可以得到含4个shRNA转录单位串联的载体，命名为pCSH1-4shN2。

三、pCSH1-5shN2的构建

将pCSH1-2shN2用Sal I+Pst I酶切回收小片断，再用Xho I+Pst I酶切pCSH1-3shN2回收大片断，两个回收的片断连接，转化，筛选，就可以得到含5个shRNA转录单位串联的载体，命名为pCSH1-5shN2。

四、pCSH1-6shN2的构建

将pCSH1-3shN2用Sal I+Pst I酶切回收小片断，再用Xho I+Pst I酶切pCSH1-3shN2回收大片断，两个回收的片断连接，转化，筛选，就可以得到含6个shRNA转录单位串联的载体，命名为pCSH1-6shN2。

Claims (7)

1、一种可同时表达多种shRNA的质粒载体pCSH1-n，其特征是所说载体pCSH1-n由基本质粒序列、多个shRNA转录单位和两组多克隆位点组成。多个shRNA转录单位可以用于多次表达一个靶基因，或表达一个靶基因的多个不同位点，还可以表达不同靶基因，从而实现对一个或多个靶基因有效而且特异的抑制。

2.如权利要求1所述的表达多种shRNA的质粒载体pCSH1-n，其特征是shRNA表达载体中可被串联构建入两段针对肿瘤基因治疗靶点N-Ras和/或c-Myc的RNA干扰序列。

3、如权利要求1或2所述的载体pCSH1-n，其特征是肿瘤基因治疗靶点N-Ras的RNA干扰序列为：

5′-GATCC TTCAAGAGA

TTTTTTGGAAA-3′(SEQ ID No2)

5′-AGCTTTTCCAAAAAA

TCTCTTGAA

G-3′(SEQ ID No3)

其中N-Ras-siRNA的靶mRNA序列为：

5’-GUGUGAUUUGCCAACAAGG-3’(SEQ ID No 1)。

4、如权利要求1或2所述的载体pCSH1-n，其特征是肿瘤基因治疗靶点c-Myc的干扰序列为：

5′-GATCCC

TTCAAGAGA TTTTTTGGAAA-3′(SEQ ID No5)

5′-AGCTTTTCCAAAAAA TCTCTTGAA

GG-3′(SEQ ID No6)

其中c-Myc-siRNA的靶mRNA序列为：

5’-GGAAGAAAUUCGAGCUGCU-3’(SEQ ID No4)。

5、一种构建如权利要求1所述载体pCSH1-n的方法，其特征是在shRNA转录单位两侧选择一对同尾酶酶切位点，通过引物设计合成及退火获得含有两组多克隆位点的序列，使含两组多克隆位点序列与shRNA转录单位、基本的质粒序列有序组合；利用转录单位前后的同尾酶酶切位点和多克隆位点的一个酶切位点进行多个shRNA转录单位组合，即可构建表达多个shRNA质粒载体pCSH1-n。

6、如权利要求1所述shRNA表达载体pCSH1-n在制备肿瘤基因治疗药物中的应用。

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