JPH11341990A - 高純度可溶性トロンボモジュリンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 血清由来物および抗体由来を実質的に含有し
ない高純度可溶性トロンボモジュリンを得るものであ
る。 【解決手段】 可溶性トロンボモジュリンを生産し得る
動物細胞を、血清成分を含有する培地を用いて培養し、
得られた該培養上清を、該可溶性トロンボモジュリンに
対する抗体と接触させた後、溶出させる工程により、精
製された該可溶性トロンボモジュリン溶液を、比伝導度
２５〜３４ｍｓ／ｃｍ、ｐＨ３〜４の条件下にて、陽イ
オン交換体と接触させ、素通り画分として該可溶性トロ
ンボモジュリンを取得する、血清由来物及び抗体由来物
を実質的に含有しない高純度可溶性トロンボモジュリン
の製造方法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、血清由来物及び抗体由
来物を実質的に含有しない高純度可溶性トロンボモジュ
リンの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】トロンボモジュリンはトロンビンによる
プロテインＣ活性化を促進する作用を有する物質として
従来より知られている。プロテインＣは血液凝固線溶系
において重要な役割を演じているビタミンＫ依存性の蛋
白質であり、トロンビンの作用により活性化され、活性
型プロテインＣとなる。活性型プロテインＣは、生体内
で血液凝固系因子の活性型第Ｖ因子、および活性型第Ｖ
ＩＩＩ因子を失活させ、また血栓溶解作用を有するプラ
スミノーゲンアクチベーターの産生に関与していること
が知られている〔鈴木宏治、医学のあゆみ、第１２５
巻、９０１頁（１９８３年）〕。トロンボモジュリン
は、このトロンビンによるプロテインＣの活性化を促進
して抗血液凝固作用と血栓溶解作用を示す活性型プロテ
インＣを大量に産生せしめるものである。従ってトロン
ボモジュリンは生体における抗血液凝固および血栓溶解
に大きく寄与するものである。

【０００３】従来トロンボモジュリンの用途として、例
えば、心筋梗塞、血栓症（例えば、急性期又は慢性期の
脳血栓症、動脈又は静脈の急性又は慢性の末梢血栓症な
ど）、塞栓症（例えば、急性期又は慢性期の脳塞栓症、
動脈又は静脈の急性又は慢性の末梢塞栓症など）、末梢
血管閉塞症（例えば、バージャー病、レイノー病な
ど）、閉塞性動脈硬化症、心臓手術に続発する機能性障
害、移植臓器の合併症、血管内血液凝固症候群（ＤＩ
Ｃ）、狭心症、一過性脳虚血発作、妊娠中毒症、糖尿
病、肝ＶＯＤ（Ｌｉｖｅｒ ｖｅｎｏ−ｏｃｃｌｕｓｉ
ｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ；劇症肝炎や骨髄移植後の肝静脈
閉塞症）、深部静脈血栓症（ＤＶＴ；Ｄｅｅｐｖｅｎｏ
ｕｓ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）等の疾患の治療および予
防に用いられることが期待されている。

【０００４】ヒト由来のトロンボモジュリンは、血管内
皮細胞の細胞表面に存在する膜蛋白として見いだされて
いた［Ｗ．Ｇ．Ｏｗｅｎら；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２５６、５５３２−５５３５（１９８１）］が、山本ら
はヒトトロンボモジュリン遺伝子のクローニングに成功
し（特開昭６４−６２１９号公報）、遺伝子操作技術に
より、各種の組み換え型トロンボモジュリンを得ること
が可能となった。特に、膜結合部位のアミノ酸配列を除
去することにより調製されるトロンボモジュリンは、界
面活性剤の非存在下でも水に可溶性であり、医薬品への
利用において極めて好適なものと考えられている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】医薬品への利用を考え
る前提として、トロンボモジュリンを、大量に、そして
より安価に取得する必要があることは言うまでもない
が、特に最近においては製造工程に由来する、異種の蛋
白質、特にウシ等の血清由来物やマウス等の抗体由来物
の安全性に及ぼす影響が指摘されている。（ＩＣＨ Ｑ
６Ｂ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ６，１９９８ ｐ７及びｐ２
５） したがって、工業的レベルとして充分に効率的な、安全
性の高いトロンボモジュリンの製造方法の確立が望まれ
ていた。トロンボモジュリンをより増産せしめるため
に、細胞を高密度で培養する方法が一般的に採られる
が、通常の培地を用いて培養を行うと、細胞を高密度に
することが悪い影響を与えるためか、細胞当たり時間当
たりの生産速度（以下、比生産速度）が低下し、密度の
上昇による期待された生産性の向上が得られない問題点
があった。

【０００６】また可溶性トロンボモジュリンを生産し得
る動物細胞、ことに遺伝子組換えによる形質転換体を用
いた動物細胞を用いて培養して増殖させ、トロンボモジ
ュリンを効率的に製造しようとする場合に、一般にウシ
血清成分等の添加が効果的であるが、そのため最終精製
品には通常微量の血清由来物が混入する。また血清由来
物等の不純物を効率的に除去し、純度を大幅に向上させ
る手段としてトロンボモジュリンに対する抗体をリガン
ドとするアフィニティークロマトグラフィーを用いるこ
ともできるが、この場合には更にクロマト担体から遊離
する抗体成分の混入のチェックが十分になされる必要が
あった。

【０００７】これらの異種蛋白は基本的にヒトに対して
抗原性を有し、その混入は、医薬として投与した際に、
アナフィラキシー等の予期せぬ事態を引き起こす可能性
が指摘されるに至っている。また最近では特にウシ血清
成分中に含まれる、プリオンに由来するクロイツフェル
ト・ヤコブ病等の危険性も指摘されている（”Ｒｅｖｉ
ｓｅｄ Ｐｒｅｃａｕｔｉｏｎａｒｙ Ｍｅａｓｕｒｅ
ｓ ｔｏ Ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ Ｐｏｓｓｉｂｌｅ
Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｏｆ Ｃｒ
ｅｕｔｚｆｅｌｄ−Ｊａｃｏｂ Ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ
Ｂｌｏｏｄａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔ”Ｃ
ＢＥＲ Ｍｅｍｏｒａｎｄｕｍ １２／１１／９６，Ｇ
ｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｍｉｎｉｍｉｚｉｎｇ
ｔｈｅ Ｒｉｓｋ ｏｆ Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｉｎｇ
Ａｇｅｎｔｓ Ｃａｕｓｉｎｇ Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ
Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｔｈｙ ｖｉａ Ｍｅｄｉｃｉｎ
ａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ”−ＣＰＭＰ Ｎｏｔｅｓ ｆ
ｏｒ Ｇｕｉｄａｎｃｅ １９９２）。これら混入異種
蛋白は元々多成分の混合物であることから、工業的なト
ロンボモジュリン製造プロセスの中で、簡便な手法によ
り、それぞれを実質的に含有しないレベルまで除去する
ことは非常な困難を招いている。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため、先ず効率的な可溶性トロンボモジュリ
ンの製造を達成するために、種々の条件を鋭意検討した
結果、効率的かつ安定的な製造が可能である製造用培地
を見出すことに成功した。しかしながら、この効率的生
産条件においては、好ましくは血清成分の添加が必要で
あり、例えば主精製工程としてトロンボモジュリンに対
する抗体を担持させたアフィニティークロマトグラフィ
ーを用いても、最終的に得られるトロンボモジュリン精
製品中に混入する、微量の血清由来物を再現性良く除去
することが必ずしも容易ではなかった。また逆に抗体ア
フィニティークロマトグラフィーを用いると、担体から
遊離する抗体由来物の微量混入も容易に避けられる状況
にはなかった。

【０００９】本発明者らは、これらの問題点を解決する
ために、先ず、通常の精製方法の単なる組み合わせによ
る解決を検討したが、非常に多段階の精製工程が必要と
なり、トロンボモジュリン活性の回収率が激減してしま
うという、相矛盾した課題に直面した。本発明者らは、
こうした課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、本発
明者らが見出した製造用培地によりトロンボモジュリン
の効率的かつ安定的な製造を行い、次いで該可溶性トロ
ンボモジュリンの精製工程において、最終的に混入する
血清由来物及び抗体由来物を、効率的にかつ再現性よ
く、非常に簡便に除去する方法を考案し、高純度可溶性
トロンボモジュリンを得ることを確認し、本発明を完成
するに至った。

【００１０】即ち本発明は、高純度可溶性トロンボモジ
ュリンの製造方法において、（１）可溶性トロンボモジ
ュリンおよび血清成分を含有する未精製上清を得、
（２）得られた該上清を、該可溶性トロンボモジュリン
に対する抗体と接触させた後、溶出させる工程により、
精製された該可溶性トロンボモジュリン溶液を得、更
に、（３）得られた該可溶性トロンボモジュリンを、比
伝導度２５〜３４ｍｓ／ｃｍ、ｐＨ３〜４の条件下に
て、陽イオン交換体と接触させる工程において、素通り
画分として該可溶性トロンボモジュリンを取得する、こ
とを特徴とする血清由来物及び抗体由来物を実質的に含
有しない高純度可溶性トロンボモジュリンの製造方法を
提供するものである。

【００１１】更にまた本発明は、下記の成分表１に記載
された成分から実質的になるトロンボモジュリンを効率
的に製造しうる培地に関する。

【００１２】

【化４】

【００１３】本発明でトロンボモジュリン（以下、トロ
ンボモジュリンをＴＭと略することがある）とは、トロ
ンビンによるプロテインＣ活性化を促進する作用を有す
る物質として定義される。ヒトＴＭについては、Ｓ．Ｙ
ａｍａｍｏｔｏら［国際公開番号ＷＯ８８／０５０５
３］によりそのｃＤＮＡが取得され、そのｃＤＮＡによ
りコードされるシグナル配列を有する全長のアミノ酸配
列としては、５７５アミノ酸であり、このうちシグナル
配列は通常１８アミノ酸と考えられており、したがっ
て、主たるマチュアーなペプチドとしては、５５７アミ
ノ酸が開示されている。また、このシグナル配列として
は、ヒトｔＰＡ（組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー）のシグナルを始めとする多くの、ヒト由来、酵母由
来、大腸菌由来等の公知のシグナル配列を用いることも
できる。

【００１４】本発明に記載された可溶性ＴＭとしては、
界面活性剤の非存在下で水に可溶な可溶性ＴＭが例とし
て挙げられる。可溶性の程度としては、界面活性剤の非
存在下の通常の蒸留水（中性）に簡単に溶解するもので
あればよく、例えば、１ｍｇ／ｍｌ以上、好ましくは３
ｍｇ／ｍｌ以上、特に好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ以上の
可溶性ＴＭが例示される。本発明に記載された可溶性Ｔ
Ｍとしては、ヒトＴＭのアミノ酸配列を有する、または
その部分配列を有する可溶性ペプチドが好ましいが、ヒ
トＴＭとホモロジーの高い構造を有する可溶性ペプチド
も好ましい例として挙げられる。例えばヒトＴＭとアミ
ノ酸配列において６０％以上のホモロジーを有するペプ
チドが好ましい例として挙げられ、さらに好ましくは７
０％以上または８０％以上、特に好ましくは９０％以上
のペプチドが例示される。本発明で記載された可溶性で
あるＴＭとしては、例えば上記全長アミノ酸配列から、
膜通過ドメイン及び細胞内ドメインを除去したＴＭが考
えられるが、好ましい配列として、４９８アミノ酸の構
造も本出願には記載されている。更にまた、ＴＭの活性
を完全に表すことができ、かつ可溶性である好ましい配
列として、１１４アミノ酸（即ち、配列番号１の１７−
１３０位のアミノ酸配列）の構造も指摘されており
［Ｍ．Ｚｕｓｈｉら；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
６、１９８８６−１９８８９（１９９１）］、ＴＭの元
々の活性を保持している分子種としての１１４アミノ酸
の高ホモロジー変異物、またはこれら活性中心を含みか
つ可溶性であるペプチドもまた好ましい。しかしなが
ら、上記の１１４アミノ酸を完全に包含することなく若
干のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加があってもトロ
ンボモジュリン本来の活性を程度の差はあれ保持するこ
とも大いに期待される。

【００１５】またヒトＴＭの遺伝子には、多型性変異が
存在することが知られており、開始コドンから４７３番
目のアミノ酸残基に関してバリン（具体的には、配列番
号１の１７−１３０位のアミノ酸配列を包含するペプチ
ド）［山本ら；特開昭６４−６２１９号公報］とアラニ
ン（具体的には、配列番号２の１７−１３０位のアミノ
酸配列を包含するペプチド）［Ｄ．Ｗｅｎら；Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６、４３５０−４３５７（１９８
７）］の変異が存在するが、これらの変異はＴＭ活性に
は無関係であり、また血栓症等の疾患とも無関係な変異
であることが明らかになっている［Ｖ．Ｄ．Ｖａｒｄｅ
ｎら；Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄＨａｅｍｏｓｔａ
ｓｉｓ、６５、５１１−５１３（１９９１）］ので、本
発明においては同等に扱うことができる。

【００１６】したがって、例えば、配列番号１の１７−
１３０位のアミノ酸配列、配列番号２の１７−１３０位
のアミノ酸配列、及びそれらアミノ酸配列の１又は数個
のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配
列からなる群より選ばれたいずれかのアミノ酸配列を含
有するアミノ酸配列、およびそれをコードする遺伝子が
例示される。また、配列番号１の１−１３０位のアミノ
酸配列、配列番号２の１−１３０位のアミノ酸配列、配
列番号３の１−５１６位のアミノ酸配列、配列番号４の
１−５１６位のアミノ酸配列、及びそれらアミノ酸配列
の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され
たアミノ酸配列からなる群より選ばれたいずれかのアミ
ノ酸配列、およびそれをコードする遺伝子が好ましい例
として挙げられる。これらの種々のペプチドの製法の詳
細は、国際公開番号ＷＯ９８／０１１５３号に説明され
ている。

【００１７】勿論本発明のＴＭは、上記の性質を有すれ
ば特に限定されず、例えば、糖鎖を含んでいても含まな
くてもよい。本発明に用いる可溶性トロンボモジュリン
および血清成分を含有する未精製上清としては、可溶性
トロンボモジュリンを生産し得る動物細胞を、血清成分
を含有する培地を用いて培養して調製された培養上清を
用いることが好ましい。

【００１８】本発明に用いる可溶性ＴＭを生産し得る細
胞としては、可溶性ＴＭを生産し得る細胞であれば特に
限定されず、通常、動物細胞を意味し、ヒト由来の種々
の細胞やその他の動物由来の種々の細胞を用いることが
できる。上記のヒト由来の細胞としては、例えばヒト血
管内皮細胞、胎盤組織由来の合胞体細胞、ヒト肺ガン細
胞株であるＡ５４９細胞、巨核球系の細胞株であるＭｅ
ｇ−Ｏ１細胞等が例示される。また、その他の動物由来
の細胞としては、公知の細胞が知られており、後記する
各種の細胞が利用できる。

【００１９】このような可溶性ＴＭを生産し得る細胞を
本発明の製造方法に用いることのできるか否かは、例え
ば、ヒト由来の種々の細胞やその他の動物由来の種々の
細胞のＴＭ活性やＴＭと反応する抗体との反応性を調べ
ることで、簡単に識別することが可能である。具体的に
は、スクリーニングしようとする細胞の培養上清や細胞
自体を、実施例１−（４）−ａ記載のトロンビンによる
プロテインＣ活性化を促進する活性の測定方法に準じて
スクリーニングし、ＴＭ活性の検出できた細胞を本発明
のＴＭを生産し得る細胞として選択する方法が例示され
る。また例えば細胞の培養上清や細胞の抽出物を実施例
１−（４）−ｃに記載のＥＬＩＳＡに準じて、ＴＭを検
出し、求める細胞を選択することや、また、細胞自体を
免疫染色することにより検出する事も可能である。

【００２０】また、本発明の未精製上清としては、細胞
の膜上に発現された全長ＴＭを抽出し、例えばエラスタ
ーゼのようなプロテアーゼ処理により容易に可溶性ＴＭ
となった培養液、抽出液を利用することができる。本発
明で、可溶性ＴＭを生産し得る細胞として特に好ましい
細胞は、可溶性ＴＭをコードする遺伝子（ＤＮＡ配列）
を導入して調製された形質転換体である。本発明で可溶
性ＴＭをコードする遺伝子としては、上記で説明した可
溶性ＴＭをコードすることができる遺伝子であれば特に
限定されず、種々のＤＮＡ配列が含まれるが、これらは
公知の方法に準じて調製することができる。例えば、こ
のような可溶性ＴＭをコードする遺伝子、およびその調
製法は、国際公開番号ＷＯ８８／０５０５３号等の公知
文献に詳しく記載されている。最も簡便には、国際公開
番号ＷＯ８８／０５０５３号の実施例１−（１）に記載
されたｐＳＶ２ＴＭＪ２〔ＡＴＣＣ寄託番号第６７２８
３号、またＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＤＨ５／
ｐＳＶ２ＴＭＪ２として再度寄託（ＦＥＲＭ ＢＰ−５
５７０）を利用することにより、簡単に調製することが
でき、遺伝子操作の常法にしたがって、種々の欠落、変
異、付加、置換等の変異物の可溶性ＴＭをコードする遺
伝子が調製しえる。また、特開平５−２１３９９８号公
報の実施例１記載の方法を参考に調製することもでき
る。これらの可溶性ＴＭをコードするＤＮＡ配列は、少
なくとも実質的に可溶性ＴＭをコードするＤＮＡ配列を
用いればよいが、通常は、シグナル配列をコードする塩
基配列を含めて用いることが好ましい。シグナル配列と
しては、配列番号３の１−１８または１−１６のアミノ
酸配列をコードする塩基配列が例示される。即ち、実質
的にＴＭをコードするＤＮＡ配列として、具体的には、
例えば、配列番号１ないし４のＤＮＡ配列を導入するこ
とが好ましい例として挙げられる。

【００２１】可溶性ＴＭをコードするＤＮＡ配列を宿主
細胞へ導入する場合には、好ましくは前記可溶性ＴＭを
コードするＤＮＡ配列を、ベクター、特に好ましくは、
動物細胞において発現可能な発現ベクターに組み込んで
導入する方法が挙げられる。発現ベクターとは、プロモ
ーター配列、ｍＲＮＡにリボソーム結合部位を付与する
配列、発現したい蛋白をコードするＤＮＡ配列、スプラ
イシングシグナル、転写終結のターミネーター配列、複
製起源配列などで構成されるＤＮＡ分子であり、好まし
い動物細胞発現ベクターの例としては、Ｒ．Ｃ．Ｍｕｌ
ｌｉｇａｎら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８，２０７２（１９８１）］が報告
しているｐＳＶ２−Ｘや、Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙら［Ｍ
ｅｔｈｏｄｉｎ Ｅｍｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１，３８
７，Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ（１９８３）］が報
告しているｐＢＰ６９Ｔ（６９−６）などが挙げられ
る。

【００２２】また、本発明の製造方法に使用できる、可
溶性ＴＭを生産し得る細胞を、より高生産な細胞とする
ための処理を行なうことも可能であって、例えば、メト
トレキセイト（ＭＴＸ）耐性を与えるジヒドロ葉酸還元
酵素（ＤＨＦＲ）をコードするＤＮＡ配列を細胞に導入
してＭＴＸ耐性株を取得する方法や、又はＤＨＦＲをコ
ードするＤＮＡ配列とＴＭをコードするＤＮＡ配列とを
共に宿主細胞に導入した形質転換体より、ＭＴＸ耐性株
を取得する方法が例示される。ＤＨＦＲとは、２経路あ
るＤＮＡ合成系のうち、プリン、チミジル酸、グリシン
のｄｅ ｎｏｖｏ合成に必要なテトラヒドロ葉酸を生成
する酵素である。ＣＨＯ細胞ＤＨＦＲ欠損株ではＤＮＡ
合成はｄｅ ｎｏｖｏ経路に欠陥があるため、残存する
サルベージ経路を通してのみ成される。従って、その生
育にプリン、チミジル酸、グリシンを必要とする。プリ
ン等が含まれない培地を用いれば、ＤＨＦＲ欠損株は死
滅し、ＤＨＦＲを保有する細胞のみが選択され選択マー
カーとなりうる。また、ＭＴＸはＤＨＦＲの阻害剤であ
り、細胞ＤＮＡ合成を阻害し細胞を死滅させる。細胞の
ＭＴＸ耐性獲得の機構としては、Ｇ．Ａ．Ｆｉｓｃｈｅ
ｒら［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍｃｏｌ．１１，１２
３３−１２３７（１９６２）］の報告しているＭＴＸの
細胞内移送の低下、Ｗ．Ｆ．Ｆｌｉｎｔｏｆｆら［Ｃｅ
ｌｌ，２，２４５−２６２，（１９７６）］の報告して
いるＭＴＸに対する親和性の低下したＤＨＦＲ変異体、
Ｒ．Ｔ．Ｓｃｈｉｍｋｅら［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０２、
１０５１（１９７８）］の報告しているＤＨＦＲ遺伝子
の増幅によるものであるが、本発明において好ましいの
は、遺伝子増幅を起こすＤＨＦＲ遺伝子であり、そのよ
うなＤＨＦＲ遺伝子であれば、ヒト、サル、ウシ、ウサ
ギ、ハムスター、ラット、マウス等いずれの種由来のＤ
ＨＦＲでも良いが、好ましくは、Ａ．Ｃ．Ｙ．Ｃｈａｎ
ｇら［Ｎａｔｕｒｅ，２７５、６１７−６２４（１９７
８）］やＪ．Ｈ．Ｎｕｎｂｅｒｇら［Ｃｅｌｌ，１９，
３５５−３６４（１９８０）］によりその配列が明らか
にされたマウスのＤＨＦＲ遺伝子である。ＤＨＦＲをコ
ードするＤＮＡ配列を用いる場合には、実質的にＤＨＦ
ＲをコードするＤＮＡ配列のみを含むＤＮＡを用いても
よいが、好ましくは、動物細胞において発現可能な発現
ベクターに組み込んで用いる方法が挙げられ、例えば、
ｐＳＶ２ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ３７１４６）等の動物細胞
においてマウスＤＨＦＲを発現する発現ベクターが挙げ
られる。

【００２３】可溶性ＴＭをコードするＤＮＡ配列を宿主
細胞へ導入するに際して、可溶性ＴＭをコードする発現
ベクターと、ＤＨＦＲをコードする発現ベクターとによ
り共形質転換した動物細胞を得る。形質転換とは、ＤＮ
Ａを細胞の貪食能や強制的方法により細胞に取りこま
せ、プラスミド状態あるいは、染色体に組み込まれた状
態でＤＮＡの形質を発現させることである。リン酸カル
シウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、プリッキング
法、プロトプラスト融合法、電気窄孔法などのいずれの
方法でも導入することできが、特に好ましくは、Ｍ．Ｗ
ｉｇｌｅｒら［Ｃｅｌｌ，１４，７２５（１９７８）］
によるリン酸カルシウムとＤＮＡの複合体を細胞に導入
する方法である。この際のＤＮＡの形状は前述の通り、
環状ＤＮＡであってもよいし、線状ＤＮＡであってもよ
い。

【００２４】宿主として用いられる動物細胞としては、
ＶＥＲＯ細胞、Ｈｅｌａ細胞、チャイニーズハムスター
（ＣＨＯ）細胞、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ハムスターＡＶ−
１２−６６４細胞などや、ヒト２９３細胞などが挙げら
れる。好ましくは、ＣＨＯ細胞、更に好ましくは、Ｌ．
Ｈ．Ｇｒａｆら［Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
２，９３ー９６（１９８２）］の報告しているＣＨＯ−
ＤＸＢ１１株等のＤＨＦＲ欠損株が例示される。

【００２５】このようにして得られた共形質転換された
細胞は、ＭＴＸ濃度の漸増する濃度条件下で選択され
る。ＭＴＸの漸増を行うに際しては、連続的にまたは、
段階的に行なえばよいが、通常は、段階的が好ましい。
ＭＴＸの濃度の範囲は、通常２０ｎＭ〜１００ｍＭ、好
ましくは、２０ｎＭ〜１０ｍＭである。ＭＴＸによる選
択に先立ち、ＭＴＸ非添加培地による予備選択と、後記
の比生産速度を指標にしてＴＭ生産性の確認を行っても
よいし、最初からＭＴＸ添加培地により選択した後に、
ＴＭ生産性の確認を行ってもよい。高生産細胞を得るた
めには、ＭＴＸの濃度は、初期濃度の３〜５倍づつ増加
させ、段階はできるだけ多く行なうのが好ましいが、少
なくとも、５段階以上行うことが好ましい。さらに、各
段階でＴＭの比生産速度を調べながら行なうのが好まし
い。

【００２６】かくして、本発明の製造方法に使用でき
る、可溶性ＴＭを生産し得る細胞を取得することができ
る。本発明の可溶性ＴＭ製造用培地において、血清と
は、特に限定されないが、通常、動物の血清、好ましく
は牛の胎児、新生児、仔牛、成牛の血清が挙げられる。
また血清に代わる増殖因子としては、アルブミン、イン
シュリン、トランスフェリン、エタノールアミン、亜セ
レン酸ナトリウムのいずれか、もしくはそれらの混合物
が挙げられる。血清と増殖因子のいずれを用いるかにつ
いては、用いるＴＭを生産し得る細胞の性質に応じて適
宜選択することができる。すなわち、血清非存在下でＴ
Ｍ生産細胞が増殖性を示す場合は、血清のみ、増殖因子
のみ、または、血清と増殖因子の両者を用いる各方法を
選択することができる。また、血清非存在下でＴＭ生産
細胞が増殖性を示さない場合は、血清のみ、または、血
清と増殖因子の両者を用いる各方法を選択することがで
きる。血清か増殖因子のいずれか一方か、または混合物
を用いるかにより、これらの添加量は適宜決定できる
が、通常は、血清の場合には、２〜１０％（ｖ／ｖ）が
例示され、増殖因子の場合には、例えば、アルブミンは
約３ｍｇ、インシュリンは約５ｍｇ、トランスフェリン
は約５ｍｇ、エタノールアミンは約２μＭ、亜セレン酸
ナトリウムは約２０ｎＭが例示される。

【００２７】本発明の可溶性ＴＭ製造用培地は、上記成
分表１に記載の各成分から実質的になればよいが、成分
表１に記載されたもののほか、通常、タイロシン、ゲン
タマイシン、カナマイシン等の抗生物質を追加すること
も特に妨げられない。本発明の可溶性ＴＭ製造用培地の
ｐＨは、細胞の培養を妨げない程度であれば特に限定さ
れないが、通常はｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ７付近が
例示される。

【００２８】本発明の可溶性ＴＭ製造用培地である前述
の成分表１に記載された成分から実質的になる培地は、
該培地の成分の組成比率が下記の成分表２に記載の組成
比率であることがさらに好ましい例として挙げられる。

【００２９】

【化５】

【００３０】成分表２の組成比率として記載された数値
の誤差範囲として、通常１０％、好ましくは５％程度が
挙げられる。なお、水分は適宜調整してもよい。本発明
の可溶性ＴＭ製造用培地として、上記の成分表２に記載
の組成比率の以外の該培地の成分の組成比率も選択する
ことができ、その場合には、下記のスクリーニング方法
により、他の適宜の組成比率を検討することができ、可
溶性ＴＭを生産し得る細胞や培養条件等によって、好ま
しい培地組成比率を選択することができる。

【００３１】〔培地成分の組成比率に関するスクリーニ
ング方法〕様々に成分比率を変えたスクリーニングすべ
き培地へ、遠心分離した、可溶性ＴＭの製造を予定して
いる細胞を必要数懸濁し、細胞培養用ディッシュへ分注
し、炭酸ガスインキュベーターで１日〜３日間培養をす
る。比生産速度を測定する場合には、前述の測定法によ
るＴＭ活性の測定と、生細胞密度の測定を、培養１、
２、３日目の培地上清に関して行い、比生産速度（細胞
当たり時間当たりの生産速度）を算出する。ＴＭの最終
濃度を指標とする場合には、３日間培養後のＴＭ濃度
と、生細胞密度を測定する。

【００３２】本発明において、上述の可溶性ＴＭ製造用
培地を用いて、ＴＭを生産し得る細胞の製造のための培
養を行なうに際しては、公知の方法にて行なえばよく、
選択したＴＭを生産し得る細胞の性質に応じて適宜の条
件を選択できる。例えば、細胞の接着依存の性質、即
ち、付着細胞または浮遊細胞によって、付着細胞であれ
ば、付着担体としてセファロース、セルロース、ガラ
ス、ゼラチン、ポリスチロールそしてポリエチレンなど
からできたマイクロキャリアーや、マルチトレイ、ロー
ラーボトル、中空糸などを用いることができる。培養環
境条件は細胞の性質に応じて選択でき、例えば、温度３
０℃〜４０℃、好ましくは３７℃付近、撹拌が必要な場
合では２０〜２００ｒｐｍ、好ましくは８０ｒｐｍ付
近、溶存酸素濃度（ＤＯ）は水の空気飽和に対し約３％
〜９０％、好ましくは５０％付近、ｐＨは６〜８、好ま
しくは７付近に調節される例が挙げられる。また培養環
境条件を一定に保つため必要な培養液の混合方法とし
て、自然対流の静置型、撹拌羽根による撹拌型、通気に
よるエアリフト型または循環ポンプや撹拌機による流動
床型などが挙げられる。

【００３３】本発明においては、可溶性ＴＭを製造する
ための培養において、本発明の可溶性ＴＭ製造用培地を
用いるが、細胞を増殖させる工程においては、他の培地
を使用してもよいが、本発明の可溶性ＴＭ製造用培地を
細胞の増殖からＴＭの製造のための培養に一貫して使用
することも好ましい。細胞の増殖のために他の培地を用
いる場合には、他の培地としては公知の各種培地が使用
でき、例えば、血清そしてまたは増殖因子を添加したＤ
ＭＥＭなどが例示される。増殖せしめる細胞は、凍結保
存されていることも多く、このような細胞においては、
３７℃の恒温槽で素早く融解し、適宜の培地に懸濁し遠
心分離し、遠心後、上清は吸引除去し新鮮培地で懸濁
し、スピンナーフラスコや細胞培養用ディッシュなどの
培養容器に移し培養を行なうとよい。

【００３４】細胞の増殖中の培地交換頻度は、１日〜６
日たびに１培養量相当の上清を連続的もしくは間欠的に
除き、除去した上清と等量の新鮮培地を連続的もしくは
間欠的に添加し培地交換を行なうことができる。そして
可溶性ＴＭを製造するための培養に必要な細胞密度に達
した後、好ましくは飽和密度に達した後、１日〜３日た
びに好ましくは毎日１培養量相当の上清を連続的もしく
は間欠的に除き、上清除去と等量の新鮮培地を連続的も
しくは間欠的に添加し培地交換を行なうことができる。

【００３５】また培地交換を実施せずに可溶性ＴＭを製
造するための培養においては、適当な期間培養し、好ま
しくは最大の累積生産性になるまで培養し、その培養液
全てを目的産物を含む培養物として収穫することができ
る。培養上清の回収方法としてはバッチ式、繰り返しバ
ッチ式または連続式などが挙げられ、細胞と培養上清の
分離として、重力沈降、遠心分離、膜分離が挙げられ
る。可溶性ＴＭを含有する培養上清を以後の精製工程に
用いる。これらの培養上清を保存する場合には、例え
ば、１０℃から−８０℃にて保存することが例示され
る。

【００３６】次いで上記により取得された培養上清から
の可溶性ＴＭの精製方法は、通常用いられる手法〔堀尾
武一編集；蛋白質・酵素の基礎実験法〕に準じて行なう
ことができる。例えば、可溶性ＴＭと逆の電荷を持つ官
能基を固定化したクロマトグラフィー担体と、可溶性Ｔ
Ｍの間の相互作用を利用したイオン交換クロマトグラフ
ィーの使用も好ましい。また、可溶性ＴＭの分子量サイ
ズを利用した、ゲル濾過クロマトグラフィーや限外濾過
が挙げられる。そしてまた、疎水性基を固定化したクロ
マトグラフィー担体と、可溶性ＴＭのもつ疎水性部位と
の間の疎水結合を利用した疎水性クロマトグラフィーが
挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせることがで
きる。また更に、主精製工程としては、可溶性ＴＭとの
特異的親和性を利用したアフィニティークロマトグラフ
ィーが好ましい例として挙げられる。吸着体の好ましい
例として、ＴＭのリガンドであるトロンビンや可溶性Ｔ
Ｍの抗体を利用する例が挙げられる。これらの抗体とし
ては、適宜の性質、或いは適宜のエピトープを認識する
可溶性ＴＭの抗体を利用することができ、例えば、特公
平５−４２９２０号公報、特開昭６４−４５３９８号公
報、特開平６−２０５６９２号公報などに記載された例
が挙げられる。精製の程度は、使用目的等により選択で
きるが、例えば電気泳動、好ましくはＳＤＳ−ＰＡＧＥ
の結果が単一バンドとして得られるか、もしくは単離精
製品のゲル濾過ＨＰＬＣまたは逆相ＨＰＬＣの結果が単
一のピークになるまで純粋化することが望ましい。

【００３７】しかしながら可溶性ＴＭを医薬用途として
用いるためには、上記の通常用いられる精製手法を単に
組み合わせただけの精製工程では、安全性の面で問題を
有する可能性のある夾雑蛋白質を実質的に含有しないレ
ベルまで除去することは困難である。こうした問題を有
する混入蛋白質としては、細胞培養による増殖、可溶性
ＴＭ産生のために用いられる培地成分中に含まれる例え
ばウシの血清成分、生産基材である細胞として例えばＣ
ＨＯ細胞を用いた場合にはチャイニーズハムスター由来
の成分、更には主精製に抗体アフィニティーカラムを用
いた場合には、例えばマウス抗ＴＭ抗体成分といった異
種蛋白があげられる。これらの異種蛋白は基本的にヒト
に対して抗原性を有し、その混入は、医薬として投与し
た際に、アナフィラキシー等の予期せぬ事態を引き起こ
しかねない。また最近では特にウシ血清由来物中に含ま
れる、プリオンに由来するクロイツフェルト・ヤコブ病
の危険性も指摘されている。これら混入異種蛋白は元々
多成分の混合物であることから、工業的な可溶性ＴＭ製
造プロセスの中で、簡便な手法によりそれぞれを実質的
に含有しないレベルまで除去することは非常な困難を招
いている。

【００３８】精製法を具体的に例示すれば、ＴＭ活性、
例えばトロンビンによるプロテインＣ活性化の促進活性
を指標に精製する方法が挙げられ、例えばイオン交換カ
ラムのＱ−セファロースＦＦで培養上清を粗精製しＴＭ
活性を有する画分を回収し、ついでアフィニティーカラ
ムのマウス抗ＴＭモノクローナル抗体で精製し、ＴＭ活
性が強い画分を回収し、回収画分を濃縮し、ゲルろ過に
かけＴＭ活性画分を取得する精製方法［五味ら；Ｂｌｏ
ｏｄ、７５、１３９６−１３９９、１９９０］が挙げら
れる。この際抗ＴＭ抗体カラムによる精製の後、本発明
による陽イオン交換体、好ましくは強陽イオン交換体で
ある、スルホプロピル基を有する陽イオン交換体、例え
ばＳＰ−セファロースＦＦ（ファルマシア社）を最適な
条件下で用いることにより、培地由来のウシ血清由来物
及びマウス抗体由来物を１工程で同時に除去し、簡便に
高純度なＴＭを取得することが可能である。

【００３９】好ましい精製法を例示すると以下の通りで
ある。可溶性ＴＭと良好な吸着条件を有する適当なイオ
ン交換樹脂を選定し、イオン交換クロマト精製を行な
う。特に好ましい例としては、０．１８Ｍ ＮａＣｌを
含む０．０２Ｍトリス塩緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化
したＱ−セファロースＦＦを用いる方法である。適宜洗
浄後、例えば０．３Ｍ ＮａＣｌを含む０．０２Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出し粗精製品の可溶性
ＴＭを得ることができる。

【００４０】次に、例えば可溶性ＴＭと特異的親和性を
持つ物質を樹脂に固定化しアフィニティークロマト精製
を行なうことができる。好ましい例としてＤＩＰ−トロ
ンビン−アガロースカラムの例と、抗ＴＭモノクローナ
ル抗体カラムの例が挙げられる。ＤＩＰ−トロンビン−
アガロースカラムは、予め、例えば、１００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ及び０．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリ
ス緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化せしめ、上記の粗精製
品をチャージして、適宜の洗浄を行い、例えば、１．０
Ｍ ＮａＣｌ及び０．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０
ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出し精製品のＴＭ
を取得することができる。また抗ＴＭモノクローナル抗
体カラムにおいては、予めＣＮＢｒにより活性化したセ
ファロース４Ｂ（ファルマシア社）に、抗ＴＭモノクロ
ーナル抗体を溶解した０．５ＭＮａＣｌ含有０．１Ｍ
ＮａＨＣＯ3 緩衝液（ｐＨ８．３）に接触させ、セファ
ロース４Ｂに抗ＴＭモノクローナル抗体をカップリング
させた樹脂を充填したカラムを、予め例えば１．０Ｍ
ＮａＣｌ含む２０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．３）で平
衡化し、適宜の洗浄の後、例えば、０．３Ｍ ＮａＣｌ
含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）にて
溶出せしめる方法が例示される。

【００４１】次に得られた上記精製可溶性トロンボモジ
ュリン溶液を、塩濃度、ｐＨの測定精度及びＴＭの分子
種にもよるが、通常例えば比伝導度２５〜３４ｍｓ／ｃ
ｍ、ｐＨ３〜４の条件下にて平衡化せしめた、陽イオン
交換体、好ましくは強陽イオン交換体であるＳＰ−セフ
ァロースＦＦ（ファルマシア社）にチャージする。上記
の比伝導度としては、３０±３ｍｓ／ｃｍが、より好ま
しく、またｐＨはｐＨ３．０〜３．７が好ましく、さら
に好ましくはｐＨ３．５±０．１の条件が例示される。
これらの条件は、適当な濃度の塩を添加した緩衝液を使
用することが好ましく、種々の態様が考えられるが、例
えば０．２５〜０．３２Ｍ、好ましくは０．３±０．０
１Ｍの食塩を含む５０〜１５０ｍＭのｐＨ３〜４の緩衝
液が例示される。緩衝液の種類としては特に限定されな
いが、例えば、グリシン−塩酸、クエン酸−リン酸２ナ
トリウム、クエン酸−クエン酸ナトリウム、酢酸−酢酸
ナトリウムが例示される。上記の条件をさらに具体的に
示せば、３００ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ｍＭグリシ
ン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）が例示される。比伝導度
は、例えば、ポータブル伝導度計（東亜電波工業社製、
ＰシリーズＣＭ−１１Ｐ、換算基準温度２５度）により
簡単に測定することができる。

【００４２】上記のカラムを例えば３００ｍＭ ＮａＣ
ｌを含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５、
比伝導度３１ｍｓ／ｃｍ）で洗浄を開始し、素通り画分
の吸光度２８０ｎｍのピーク立ち上がりから立ち下がり
までの素通り画分を得、適当な緩衝液で中和し、血清由
来物及び抗体由来物を実質的に含有しない程度まで精製
された可溶性ＴＭを高純度精製品として取得することが
できる。後記する通り、このカラムを使用すると血清由
来物や抗体由来物を効率および再現性よく除去できるこ
とが確認される。勿論、これらは、適宜限外濾過により
濃縮することができる。

【００４３】さらに、ゲル濾過による緩衝液交換を行な
うことも好ましい。例えば、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む
２０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化せしめた
Ｓｅｐａｈｃｒｙｌ Ｓ−３００カラムもしくはＳ−２
００カラムに、限外濾過により濃縮した高純度精製品を
チャージし、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭりん酸
緩衝液（ｐＨ７．３）で展開分画し、トロンビンによる
プロテインＣの活性化の促進活性の確認を行ない活性画
分を回収し緩衝液交換した高純度精製品を取得すること
ができる。

【００４４】目標とする純度が得られ、さらに緩衝液交
換された可溶性ＴＭ高純度精製品は、凍結乾燥を行い製
剤化することができる。例えば、配列番号３に記載のア
ミノ酸配列をコードする遺伝子を導入して得られる形質
転換体より取得される可溶性トロンボモジュリンの凍結
乾燥方法は、特開平６−３２１８０５号公報に記載の方
法に従い実施できる。製剤化した可溶性ＴＭは遮光条
件、例えば暗室、箱、褐色ビンのなかで保存することが
できる。

【００４５】公知の通常の培地、例えば、大量培養に好
んで用いられるダルベッコ改変イーグル培地（以下ＤＭ
ＥＭ）では、細胞の高密度化にともない、時間当たり細
胞当たりのＴＭの生産速度（以下、比生産速度）が著し
く低下するのに対して、本発明の可溶性ＴＭ製造用培地
によれば、効率的に可溶性ＴＭの生産が行われ、極めて
好ましい結果を与えた。

【００４６】

【発明の実施の態様】以下実施例によって、本発明をよ
り具体的に説明するが、本発明は何らこれらによって限
定されるものではない。

【００４７】実施例１ 細胞の作製 （１）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１２３の構築 国際特許出願（国際公開番号ＷＯ８８／０５０５３）の
実施例１−（１）に記載されたｐＳＶ２ＴＭＪ２〔ＡＴ
ＣＣ寄託番号第６７２８３号、またＥｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５／ｐＳＶ２ＴＭＪ２として再度
寄託している（ＦＥＲＭ ＢＰ−５５７０）〕をＮｃｏ
Ｉで完全消化した後、切断末端をＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポ
リメラーゼを用いて平滑末端にした。次いでＨｉｎｄII
I で完全消化して約１９００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
得られたＤＮＡ断片をＴＭＪ３と称した。一方、ファー
ジＭ１３ｍｐ１９（宝酒造製、日本、カタログ番号３１
１９）をＨｉｎｄIII 及びＨｉｎｃIIで消化してベクタ
ーを調製した。このベクターにＤＮＡ断片ＴＭＤ３を挿
入して組換え体プラスミドＭ１３ｍｐ１９ＴＭＪ３を得
た。

【００４８】また別途、下記に示す削除用ＤＮＡプロー
ブ〔以下“ディリーター（ｄｅｌｅｔｅｒ）”と称す
る〕を有機合成した：５’−ＧＧＡＧＧＣＣＧＣＴＣＡ
ＧＣＣＣＧＡＡＴＧＣＡＣＧ−３’（２５ｍｅｒ、（配
列表５）。この合成ディリーターをＴＭＤと称した。こ
のようにして作成したディリーターＴＭＤを用い、メソ
ッド イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１００巻、４６８頁、（１
９８３年）、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法に従って部位特異的変異の手
法で前記の如く得られた組換え体プラスミドＭ１３ｍｐ
１９ＴＭＪ１３の１７７塩基からなる部分の削除を行っ
た。即ち、２５ｐｍｏｌのディリーターＴＭＤおよび１
０ｐｍｏｌのＭ１３プライマーＭ３（ユニバーサルプラ
イマー、宝酒造製、カタログ番号３８３１）の５′末端
をＴ4 キナーゼを用いてリン酸化した後、０．５ｐｍｏ
ｌの組換え体プラスミドＭ１３ｍｐ１９ＴＭＪ３のシン
グルストランドＤＮＡを加え、９５℃で５分間加熱後、
室温にまで冷却した。

【００４９】次いで５単位のＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリ
メラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ）、及び
１０単位のＴ4 ＤＮＡリガーゼを混合物に加えて３７℃
で３０分間インキュベートして混合物中に組換え体プラ
スミドを生成させた。得られた混合物を大腸菌（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）ＪＭ１０５（ファルマシア社製、スウェーデ
ン、カタログ番号２７−１５５０）に加えた。それによ
って、この大腸菌を組換え体プラスミドでトランスフェ
クションした。３７℃で一夜培養して生じた寒天培地上
のプラークをニトロセルロースフィルターに移しとり、
８０℃で２時間加熱後、プレハイブリダイゼーションを
行った。プレハイブリダイゼーションは６×ＳＥＴ
〔０．９Ｍ ＮａＣｌ、１８０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
８．０）、６ｍＭ ＥＤＴＡ〕、５×Ｄｅｎｈａｒｔ
ｓ’〔０．１％（ｗ／ｖ）フィコール（Ｆｉｃｏｌ
ｌ）、０．１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン、０．
１％（ｗ／ｖ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）〕、
０．１％ＳＤＳ，１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ
を含む溶液中で５５℃、２時間加温することにより実施
した。

【００５０】次いで、上記の溶液中の変性サケ精子ＤＮ
Ａのかわりに³²ＰでラベルしたＴＭＤを加えた溶液を用
いてハイブリダイゼーション反応を５５℃、２時間実施
した。次いで６×ＳＳＣ（０．９Ｍ食塩、０．０９Ｍク
エン酸三ナトリウムの水溶液）を用いてニトロセルロー
スフィルターを洗浄した。洗浄は室温で、５分間、２回
洗った後、５５℃、６５℃、７５℃、と段階的に温度を
上げていって、それぞれ５分間２回ずつ洗った。Ｘ線フ
ィルムＸＡＲ−５（イーストマン コダック社製、米
国）を得られたニトロセルロースフィルターに密着させ
て−８０℃、一夜露出させたところ、Ｘ線フイルム上に
強く露光した黒いスポットが数１０個検出された。各ス
ポットは組換え体プラスミドで感染したクローンに対応
するものである。そのうち、６クローンを選択し、各ク
ローンの組換え体プラスミドを単離して制限酵素解析、
及び塩基配列の解析を行ったところ、これらのクローン
の保有する組換え体プラスミドは制限部位と塩基配列が
それぞれ同一であることがわかった。得られた組換え体
プラスミドをＭ１３ＴＭＤ１２３と称した。さらにこの
組換え体プラスミドＭ１３ＴＭＤ１２３は、配列表５に
示した開始コドン（ＡＴＧ）から始まる５１６個のアミ
ノ酸からなるヒトトロンボモジュリンをコードする塩基
配列を含む塩基配列を含有するＤＮＡ断片を有すること
がわかった。この組換え体プラスミドＭ１３ＴＭＤ１２
３に含まれるＤＮＡ断片をＴＭＤ１２３と称した。

【００５１】この組換え体プラスミドＭ１３ＴＭＤ１２
３をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで完全消化してＴ
ＭＤ１２３の約１９００ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。
一方、プラスミドｐＳＶ２ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ ３７１
４６）をＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌIIで完全消化してベ
クター断片を得た。このベクター断片と、先のＤＮＡ断
片ＴＭＤ１２３とをＴ4 ＤＮＡリガーゼを用いて継ぎあ
わせ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１２３を得た。

【００５２】（２）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１２３と
プラスミドｐＳＶ２−ＤＨＦＲによるＣＨＯ細胞の形質
転換 上記の実施例１−１で得られたプラスミドｐＳＶ２ＴＭ
Ｄ１２３、約４０μｇとプラスミドｐＳＶ２ＤＨＦＲ、
約３．５μｇを混合し、エタノール沈殿した。沈殿物を
風乾後、４５０μｌのＴＥ（ｐＨ７．９、１ｍＭトリス
塩酸緩衝液、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、５０μ
ｌの２．５Ｍ ＣａＣｌ2 を滴下し、５００μｌの２×
ＨＢＳ（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１．５ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 、ｐＨ７．１２）を加
えて混合した。次いで氷上で１０分間放置した後、１ｍ
ｌの１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（以下”ＦＣＳ”と
略する）及び１ｖ／ｖ％ペニシリン−ストレプトマイシ
ン（米国、フローラボラトリー社製、カタログ番号１６
−７００−４９）を含有するＨａｍ’ｓＦ−１２培地
（米国、フローラボラトリー社製、カタログ番号１０−
４２１−２０）に懸濁した。一方、１０％（ｖ／ｖ）Ｆ
ＣＳ及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン−ストレプトマイシ
ンを含有するＨａｍ’ｓＦ−１２培地に直径６ｃｍの組
織培養用プレートにプレート１枚当たり細胞数約５×１
０⁵ 程度播種したＣＨＯ−ＤＸＢ１１株（米国コロンビ
ア大、Ｄｒ．Ｌ．Ａ．Ｃｈａｓｉｎより分与）を１夜培
養し、培地を新鮮な培地に交換し、更に４時間培養し
た。このＣＨＯ−ＤＸＢ１１株に前述のＣａＣｌ2 を滴
下したプラスミドＤＮＡ溶液を重層し、３７℃で約８時
間培養した。５ｍｌのＰＢＳ（−）（米国、フローラボ
ラトリー社製、カタログ番号２８−１０３−０５）を用
いて３回洗浄し、さらに、５ｍｌの前述の培地で洗浄
後、新鮮な培地を５ｍｌ加えて３日間さらに培養した。

【００５３】（３）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１２３と
プラスミドｐＳＶ２−ＤＨＦＲにより形質転換したＣＨ
Ｏ細胞からＤＨＦＲ産生株の選択 上記実施例１−（２）で形質転換した細胞を０．２５％
トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ溶液を用いてはがし、
直径１０ｃｍの組織培養プレート４枚に広げて培養し
た。２４時間後、培地を選択培地に交換した。選択培地
の組成は１０％（ｖ／ｖ）透析ＦＣＳ、１５０μｇ／ｍ
ｌプロリン、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン−ストレプトマ
イシンを含むＤＭＥＭ（米国、フローラボラトリー社
製、カタログ番号１７−１０１−２２）である。３〜４
日おきに培地交換を行いながら約２週間培養して、トラ
ンスフォームした細胞をクローニングし、５９株のＤＨ
ＦＲ産生株を得た。

【００５４】（４）ＤＨＦＲ産生株からのＴＭ生産株の
選択 前述の実施例３で得られたＤＨＦＲ産生株の各クローン
を９６穴組織培養用プレートで培養し、コンフルエント
になった時点で培地を１５０μｇ／ｍｌプロリンを含む
ＤＭＥＭ １００μｌに交換した。その後２４時間培養
し、その培養上清を回収した。このうち５０μｌを９６
穴の平底ＥＬＩＳＡ用プレート（米国、ＤＹＮＡＴＥＣ
Ｈ社製）で４℃で一晩インキュベートした。この培養液
中のＴＭ量は、抗ヒトトロンボモジュリンポリクローナ
ル抗体を用いたエンザイムインムノアッセイ（以下”Ｅ
ＬＩＳＡ”と略す）により定量した。詳しくは以下に述
べる。

【００５５】（４）−ａ 免疫源の精製 抗ヒトトロンボモジュリンポリクローナル抗体の免疫源
は、以下のようにしてヒト肺より抽出して得た。公立病
院より提供されたヒト肺標本約８００ｇを挟みで約１ｃ
ｍ四方程度の大きさに細切りした後、得られた組織片に
１ｍＭのＤＦＰ（Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｆｌｕｏｒ
ｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含む４℃に冷却した５００ｍ
ｌの生理食塩水を加え、ワーリングブレンダーとしてＡ
ｃｅ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ ＡＭ−１型（日本精器
会社製、日本）を用いて４℃で５分間、ホモジナイズし
た。ホモジナイズ後、混合物を氷中で５分間冷却した。
次に混合物を更に４℃で５分間、ホモジナイズし氷中で
５分間冷却した。上記のホモジナイズ及び冷却操作を更
に３回くり返した。得られたホモジェネートを１２００
０ｇで４℃において３０分間遠心分離にかけて上澄液と
ペレットに分け、ペレットを集める。これに０．５％
（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、０．２５Ｍ庶糖、１ｍ
Ｍベンズアミジン塩酸、０．５ｍＭ ＣａＣｌ2 を含む
０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１００ｍｌ
に懸濁し、ワーリングブレンダーを用いて４℃で５分
間、５回ホモジナイズして細胞抽出物を得た。

【００５６】得られた抽出物を３５，０００ｇ、１０℃
で６０分間遠心分離にかけて上澄液を集めた。Ｎ．Ｌ．
Ｅｓｍｏｎら〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７巻、８
５９頁（１９８２年）〕の方法に従って作成したＤＩＰ
−トロンビン〔ジイソプロピルホスフォロトロンビン
（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏ−ｔｈｒ
ｏｍｂｉｎ）を、Ｐ．Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓの方法
〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４５巻、３０５９頁（１
９７０年）〕に従ってブロムシアン化したアガロースに
結合させて、ＤＩＰ−トロンビン−アガロースを作成し
た。

【００５７】次にＤＩＰ−トロンビン−アガロースを
２．５ｃｍφ×１０ｃｍの大きさのカラムに充填してＤ
ＩＰ−トロンビン−アガロースカラムを作成し、室温で
０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ2 、１ｍＭ
ベンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ
ＰＸ（半井科学薬品製、日本）を含む０．０２Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）でカラムを平衡化した。次
いで、上記の抽出上澄液をカラムに供した。カラムを
０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ2 、１ｍＭ
ベンズアミジン塩酸、０．５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ
ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で洗浄した後、１Ｍ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、１ｍＭベンズアミジン塩酸０．５％（ｖ／ｖ）Ｌ
ｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で溶出して２．０ｍｌずつフラクシヨン
を集めた。溶出によって得られる各フラクションについ
てトロンビンによるプロテインＣ活性化を促進する活性
を測定した。即ち、それぞれのフラクションを定量用希
釈液（２０ｍＭトリス塩酸、１００ｍＭ ＮａＣｌ、
０．１％ ルブロールＰＸ、０．１％アジ化ナトリウ
ム、０．００１％ＢＳＡ、ｐＨ７．５）で希釈した。こ
の液を５μｌ、トロンビン（米国、シグマ社、カタログ
番号Ｔ−６７５９、２０ｎｇ／μｌ）３μｌ、１０×ア
ッセイ緩衝液（１Ｍ ＮａＣｌ、３０ｍＭ ＣａＣｌ2
、１％牛血清アルブミン含有、０．５Ｍ トリス塩酸
緩衝液、ｐＨ８．５）５μｌ、及び蒸留水２９．５μｌ
を混合し、３７℃５分間放置後、プロテインＣ（牛由
来、０．２μｇ／μｌ）７．５μｌを加え、３７℃で３
０分間反応させた。

【００５８】反応は、ストップ液（１００ｍＭ ＮａＣ
ｌ、０．３Ａ２８０アンチトロンビンＩＩＩ、１００μ
ｇ／ｍｌヘパリン含有２０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ
７．５）を６．２５μｌ加えることにより止めた。活性
化プロテインＣの活性は、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔ
ｈｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（日本、ペプチド研究所、５ｍｇ
／ｍｌ）１０μｌ、５Ｍ ＣｓＣｌ ５μｌ、基質反応
緩衝液（１００ｍＭＮａＣｌ含有５０ｍＭトリス塩酸緩
衝液、ｐＨ８．５）４９５μｌを加え、３７℃、２０分
間反応させ、酢酸５５μｌを加え反応を止めた後、遊離
したＡＭＣ（７−アミノ−７−メチル−クマリン）濃度
を励起波長３８０ｎｍ，発光波長４４０ｎｍで蛍光分光
光度計（島津製作所 ＲＦ−５４０）により測定した。
得られた蛍光強度を既知濃度のＡＭＣの蛍光強度と比較
して、遊離したＡＭＣ量を求めた。このＡＭＣ量から精
製品を含まない水溶液を加えたときのＡＭＣ量を差し引
いた値がサンプルのトロンビンによるプロテインＣ活性
化を促進する活性の強さを表す。１分間に反応液１ｍｌ
あたり１ｎＭの活性化プロテインＣを生成する活性を１
ｕとした。また、同時に島津製作所（日本）製スペクト
ロフォトメーターＵＶ−２４０を用いて各フラクション
の波長２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）を測定し
た。

【００５９】プロテインＣ活性化を促進する活性のある
画分を回収し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ2 、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含
む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析し
た。得られた透析液を２回目のＤＩＰ−トロンビン−ア
ガロースカラムクロマトグラフィーに供した。即ち、透
析液を１．５ｃｍφ×１０ｃｍの大きさのＤＩＰ−トロ
ンビン−アガロースカラムに供し、０．４Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ2 、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕ
ｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）で洗浄後、さらに０．４Ｍ ＮａＣｌ、０．
１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ
ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
で洗浄し、次いで１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．
０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した。

【００６０】プロテインＣ活性化を促進する活性のある
画分を回収し、さらに０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％
（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析した。得られた透析液
を３回目のＤＩＰ−トロンビン−アガロースカラムクロ
マトグラフィーに供した。カラムの大きさ、洗浄条件お
よび溶出条件は２回目のＤＩＰ−トロンビン−アガロー
スカラムクロマトグラフィーの条件と全く同じ条件で行
なった。なお、溶出して得られるフラクションは２ｍｌ
ずつ集めた。プロテインＣ活性化を促進する活性のある
画分を回収し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／
ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．５）で透析した後、０．９ｃｍφ×８ｃ
ｍの大きさの４回目のＤＩＰ−トロンビン−アガロース
カラムクロマトグラフィーに供した。０．３５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ2 、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌ
ｕｂｒｏｌ ＰＸを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で洗浄後、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｌｕｂｒｏｌ ＰＸを
含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出
した。溶出して得られたフラクションは１．９ｍｌずつ
集めた。この第４回目のＤＩＰ−トロンビン−アガロー
スカラムクロマトグラフィーのプロテインＣ活性化を促
進する活性のある画分を回収し、免疫源とした。

【００６１】このようにして精製されたフラクションの
吸光度から、得られた精製品の分子吸光係数を一般的な
蛋白質の分子吸光係数にならない１０．０（Ｅ１％１ｃ
ｍ・２８０ｎｍ＝１０．０）と規定してそれに基づき本
精製品の量を計算したところ約５００μｇであった。な
お、得られた精製画分をポリアクリルアミドゲル濃度５
〜１０％のグラジェントを用いるＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を５０Ｖの電圧で２時間行ない、銀
染色によってバンドを観察したところ単一バンドのみ確
認された。さらにこの精製画分には、トロンビンによる
プロテインＣ活性化を促進する効果が認められた。

【００６２】（４）−ｂ 抗ヒトトロンボモジュリンポ
リクローナル抗体の作製 抗ヒトトロンボモジュリンポリクローナル抗体（ウサギ
抗体）は、前述の免疫源を用いて、成書〔Ｌ．ｈｕｄｓ
ｏｎｅｔ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ、９頁（１９７６年）、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ〕に従って作
製した。

【００６３】この抗体が、上記免疫源と反応することを
以下の様にして確認した。すなわち、実施例１−（４）
−ａで得た免疫源（精製ヒトトロンボモジュリン蛋白）
の約１０ｎｇをニトロセルロースのフィルターにスポッ
トする。よく風乾した後、この抗体を一次抗体としてニ
トロセルロースフィルター上のタンパクと反応させ、次
いでヤギで調製したビオチン化抗ウサギＩｇＧ（ザイメ
ットラボラトリー社製、米国、カタログ番号６２−１８
４０）を二次抗体として反応させた後、アビジン・ビオ
チン化した西洋ワサビ由来パーオキシダーゼ（アマシャ
ムジャパン社製、日本、カタログ番号ＲＰＮ．１０５
１）を作用させる方法で発色させると黒褐色のスポット
を与えた。

【００６４】（４）−ｃ ＥＬＩＳＡ 培養液の入った９６穴の平底ＥＬＩＳＡ用プレートの穴
を２００μｌのＰＢＳ（日本、日水製）で５回洗浄す
る。その後、０．５％ＢＳＡ含有ＰＢＳを１００μｌ／
穴となるように加え、室温で２時間静置する。プレート
の各穴を０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０含有ＰＢＳで５回洗
浄後、上記実施例１−４−（ｂ）で作製した抗ヒトＴＭ
ポリクローナル抗体を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１０００
倍希釈し、１００μｌ／穴で各穴に加え、一次抗体とし
て反応させる。その後、プレートの各穴を０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ８０含有ＰＢＳで５回洗浄後、酵素標識された
抗ラビットＩｇＧ抗体（カッペル社、カタログ番号５０
−７４１５−１６）を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１０００
倍希釈し、１００μｌ／穴で各穴に加え、室温で１時間
反応させた。プレートの各穴を０．０５％Ｔｗｅｅｎ８
０含有ＰＢＳで５回洗浄後、発色液（３０ｍｇオルトフ
ェニレンジアミンを２０ｍｌクエン酸燐酸緩衝液に３０
％過酸化水素液を７０μｌ添加した液）１００μｌ添加
し、適度な発色が得られた時点で５０μｌの４．１Ｍ硫
酸液を添加し反応を止め、４９２ｎｍの測定波長で測定
し、ヒトトロンボモジュリン生産株を選択した。

【００６５】（５）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＤ１２３及
びプラスミドｐＳＶ２ＤＨＦＲにより形質転換されたＣ
ＨＯ細胞株のＭＴＸによるＴＭ生産性の増幅 上述の実施例１−（４）の結果より得られたＴＭの高生
産株を選別し、６穴の組織培養用プレートでコンフルエ
ントになるまで培養し、７／１０、３／１０の割合で直
径１０ｃｍの組織培養用プレートに継代した。７／１０
で継代したプレートは、１５０μｇ／ｍｌプロリンと１
０％透析ＦＣＳを含むＤＭＥＭでコンフルエントになる
まで培養した後、生産性測定培地（１５０μｇ／ｍｌプ
ロリン含有ＤＭＥＭ）１０ｍｌに交換し、２４時間後に
培養液を回収し、ＭＴＸ無添加細胞生産液とした。

【００６６】また、３／１０で継代したプレートは、翌
日２０ｎＭのＭＴＸ含有選択培地に交換し培養を続け
た。コンフルエントになった後、生産性測定培地１０ｍ
ｌに交換し、２４時間後に培養液を回収し、２０ｎＭ
ＭＴＸ選択細胞生産液とした。この回収された生産液
は、以下に述べるサンドイッチ法ＥＬＩＳＡで生産液中
のＴＭの定量を行い、細胞１×１０⁶ 個が２４時間当た
りに生産するＴＭの生産量を評価した。

【００６７】抗ヒトトロンボモジュリンモノクローナル
抗体の作製は、Ｍａｒｕｙａｍａらの方法［Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６０，１５４３２（１９８５）］に従
った。即ち、実施例１−（４）−ａで精製したヒト肺由
来トロンボモジュリンを抗原とし、Ｂａｌｂ／Ｃマウス
に数回免疫後、マウスの脾臓細胞液を調製し、適当なラ
インからのマウス骨髄細胞種とポリエチレングリコール
等の融合促進剤の使用により、細胞融合させる。

【００６８】細胞融合に用いるマウス骨髄細胞は、例え
ば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１細胞（Ｐ３−Ｕ１）
［Ｙｅｌｔｏｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉ
ｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ，８１，１（１９７８）］等が用いられる。融
合した細胞を適当な選択培地、例えば、ＨＡＴ（ヒポキ
サンチン・アミノプテリン・チミジン）培地を用いて選
択する。このようにしてハイブリドーマ細胞が検出され
た後、その培養上清を採取し、トロンボモジュリンに対
する抗体についてトロンボモジュリンを固相抗原とした
ＥＬＩＳＡ（酵素免疫定量法）によりスクリーニングす
る。トロンボモジュリンに対する抗体を産生するハイブ
リドーマ細胞を適当な方法、例えば限外希釈法によりク
ローン化する。その結果、２種の抗ヒトトロンボモジュ
リンモノクローナル抗体が得られ、それぞれ抗ＴＭモノ
クローナル抗体Ａ及び、Ｂと命名した。

【００６９】上述の抗ＴＭモノクローナル抗体Ａの精製
品を２００μｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ重炭酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ９．２）で希釈し、５０μｌ／穴と
なるように９６穴の平底ＥＬＩＳＡ用プレートに分注す
る。室温で２時間静置後、プレートの穴を２００μｌの
ＰＢＳ（日本、日水製）で５回洗浄する。その後、０．
５％ＢＳＡ含有ＰＢＳを１００μｌ／穴となるように加
え、室温で２時間静置する。プレートの各穴を０．０５
％Ｔｗｅｅｎ８０含有ＰＢＳで５回洗浄後、回収した培
養液を段階的に希釈して５０μｌ／穴となるように添加
し、室温で２時間静置する。プレートの各穴を０．０５
％Ｔｗｅｅｎ８０含有ＰＢＳで５回洗浄後、ビオチン標
識した抗ＴＭモノクローナル抗体Ｂを２０μｇ／ｍｌと
なるように、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１０００倍希釈
し、１００μｌ／穴で加え、室温で１時間反応させた。
プレートの各穴を０．０５％Ｔｗｅｅｎ８０含有ＰＢＳ
で５回洗浄後、アビジンＤ（米国、Ｖｅｃｔｏｒ社製，
カタログ番号Ａ−２００４）を１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで
５０００倍希釈し、１００μｌ／穴で各穴に加え、室温
で３０分反応させた。プレートの各穴を０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ８０含有ＰＢＳで５回洗浄後、発色液（３０ｍｇ
オルトフェニレンジアミンを２０ｍｌクエン酸燐酸緩衝
液に３０％過酸化水素液を７０μｌ添加した液）１００
μｌ添加し、適度な発色が得られた時点で５０μｌの
４．１Ｍ硫酸液を添加し反応を止め、４９２ｎｍの測定
波長で測定した。なお、標準品には、上記実施例１−
（４）−ａで精製したヒト肺トロンボモジュリンを用い
た。

【００７０】ＭＴＸ無添加細胞生産液と２０ｎＭ ＭＴ
Ｘ選択細胞生産液のサンドイッチ法ＥＬＩＳＡの結果を
比較して、２０ｎＭ ＭＴＸ選択細胞生産液の方が高生
産であった株を選択した。これらの株は、さらに、１×
１０⁴ 、５×１０⁴ 細胞／プレートの細胞密度で直径１
０ｃｍの組織培養用プレートに継代し、翌日２００ｎＭ
ＭＴＸ含有選択培地に交換し培養を続けた。出現して
きた２００ｎＭ ＭＴＸ耐性株をクローニングし、９６
穴の組織培養用プレートに継代しコンフルエントになる
まで培養した後、１５０μｇ／ｍｌプロリン含有ＤＭＥ
Ｍ１０ｍｌに交換し、２４時間後に培養液を回収した。
回収した培養液は、上記のサンドイッチＥＬＩＳＡでＴ
Ｍの生産性を評価した。高生産株は上記で述べたように
６穴の組織培養用プレートに継代しさらに直径１０ｃｍ
の組織培養用プレートに継代し、２４時間後培養上清を
回収し、ヒトトロンボモジュリン生産性ををサンドイッ
チ法ＥＬＩＳＡで定量した。

【００７１】高生産株を選択し、上記と同様の操作を繰
り返して、ＭＴＸの濃度を、２００ｎＭから、２μＭ、
２０μＭ、４０μＭ、１００μＭ、５００μＭと上げて
いった。こうしてＭＴＸによる遺伝子増幅によりＴＭの
生産性が上昇した株を取得した。ＭＴＸ濃度の上昇によ
り効率的にヒトトロンボモジュリンの生産性が増幅さ
れ、４０μＭ ＭＴＸ濃度で、約１７ｐｇ／細胞・日、
１００μＭ ＭＴＸ濃度で、約２０ｐｇ／細胞・日、５
００μＭで４７ｐｇ／細胞・日という高生産の細胞株が
樹立された。

【００７２】（６）ＴＭ生産安定性の検討 実施例１−（５）で得られた１００μＭ ＭＴＸ耐性株
について、各耐性濃度のＭＴＸ含有非選択培地とＭＴＸ
を含有しない非選択培地（１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１
５０μｇ／ｍｌプロリン含有ＤＭＥＭ）で長期間継代培
養を行い、サンドイッチ法ＥＬＩＳＡで培養終了後細胞
当りのＴＭ生産量を評価した。２０μＭＭＴＸ耐性株に
ついては、１カ月間の継代培養と２カ月間の継代培養を
行った。１００μＭ ＭＴＸ耐性株は、ＭＴＸ無しの培
養を２カ月行っても、生産性は維持され、安定なＴＭ生
産株が得られた。

【００７３】（７）浮遊培養馴化株の取得 実施例１−（６）で得られた１００μＭ ＭＴＸ耐性株
について、１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１５０μｇ／ｍｌ
プロリン含有ＤＭＥＭを用い５０ｍｌスケールの浮遊攪
拌培養を行なった。１×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍｌで培養
を開始し、１×１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度に達
するまで培養した。比生産速度の維持を確認しつつ同様
の培養を５回繰り返した結果、浮遊培養に馴化したＴＭ
生産株が得られた。

【００７４】実施例２ 浮遊培養繰り返しバッチ培養でのＤＭＥＭと本発明のＴ
Ｍ製造用培地の比較本発明のＴＭ製造用培地の調製方法
は、前述の成分表２の各成分（但し、水、血清そして増
殖因子は除く）を混合し、所定量の脱イオン限外濾過水
へ加え、更に硫酸カナマイシン（明治製菓製）、タイロ
シン（三樂製）を加え溶解後、さらに牛血清（ハイクロ
ン）を４％（ｖ／ｖ）添加し、濃塩酸（和光純薬）でｐ
Ｈを７．１に調製した後、０．２２μｍのフィルター
（ミリポア製）で濾過し、４℃保存した（以下、本発明
のＴＭ製造用培地の名称をＨＭ−０４培地と略すること
がある）。また血清を添加したＤＭＥＭの調製方法は、
粉末培地のＤＭＥＭ（ライフテック社）を所定量の脱イ
オン限外濾過水へ加え、更に重曹（和光純薬）、硫酸カ
ナマイシン（明治製菓製）、タイロシン（三樂製）を加
え溶解後、牛血清（ハイクロン）を４％（ｖ／ｖ）添加
し濃塩酸（和光純薬）でｐＨを７．１に調製した後、
０．２２μｍのフィルター（ミリポア製）で濾過し、４
℃保存した。何れの培地も、使用直前に３７℃水浴恒温
槽で３７℃に加温し使用した。

【００７５】培養の開始では２×１０⁷ ｃｅｌｌｓ／ア
ンプルで凍結保存した細胞を、３７℃恒温槽で素早く融
解し、それぞれの培地に懸濁し遠心分離（２０００ｒｐ
ｍ、２分、国産化学）した。遠心後、上清は吸引除去し
それぞれの新鮮培地５０ｍｌで懸濁し、培養容器（カル
スター１００、柴田ハリオ社製）に入れ培養を開始し
た。

【００７６】培養条件は、３７℃恒温室内、撹拌８０ｒ
ｐｍ（マグネティックスターラー、柴田ハリオ社製）、
溶存酸素濃度（ＤＯ）５０％制御（ＤＯ電極（エイブル
社）、ＤＯコントローラー（東亜化学））、通気流量：
空気１００ｍｌ／分、二酸化炭素ガス１０ｍｌ／分、Ｄ
Ｏ制御用酸素ガス３００ｍｌ／分 で培養を実施した。
培養は浮遊生細胞密度が平衡に達するまで行なった。

【００７７】培養中の培地交換は５日目、９日目に行な
った。また、９日目以降は毎日行なった。培地交換は、
培養液全量を５０ｍｌ遠心チューブ（ファルコン社）に
入れ遠心分離（２０００ｒｐｍ、２分）し、上清除去
後、予め３７℃に加温したそれぞれの５０ｍｌ新鮮培地
で懸濁し培養容器に移し培養を再開した。遠心除去した
培養上清は−２０℃保存した。この培養上清から一定量
をサンプリングした。また別に６日目〜８日目の培養液
より、毎日一定量をサンプリングし、遠心除去して得た
培養上清からも一定量をサンプリングした。これらのサ
ンプリングした培養上清に含まれるＴＭ濃度は、実施例
１−（４）−ａ記載の方法（トロンビンによるプロテイ
ンＣ活性化を促進する活性の測定方法）により測定し
た。なお、ＴＭの比活性を８万Ｕ／ｍｇとして換算し
た。

【００７８】浮遊生細胞密度の測定は、サンプリングし
た培養液と等量のトリパンブルー染色液（フロ−）を混
合し、血球計算盤を用い顕微鏡で非染色細胞を生細胞と
して測定し、浮遊生細胞密度を測定した。浮遊生細胞密
度（×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を縦軸に、培養日数
（日）を横軸にプロットしたものが、図１である。この
結果によれば、浮遊生細胞密度の推移は、培養初期の低
密度での増殖速度はＤＭＥＭ、ＨＭ−０４培地ともに同
程度であったが、約７×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍｌから増
殖速度に差が現れ、ＤＭＥＭは最終到達密度が約４５×
１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍｌであったが、ＨＭ−０４培地は
約１００×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍｌまで増殖した。

【００７９】交換した培地の容量とＴＭ濃度を考慮し
て、各培養日数におけるＴＭの累積生産量（ｍｇ）を算
出し、縦軸に、各培養日数（日）を横軸にプロットし、
図２を得た。図２によれば、培養開始後６日目から２６
日目までの２０日間の累積生産性は、ＨＭ−０４培地を
用いた培養法がＤＭＥＭを用いた培養法に比べ約３倍高
い値を得た。したがって、本発明の培地によれば、ＴＭ
の大量生産が容易であり、好ましいものであることが確
認された。

【００８０】各培養日数におけるＴＭの１日当りの生産
量を、浮遊生細胞密度で割って算出された比生産速度
（ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ）を、縦軸に、各培養日数
（日）を横軸にプロットし、図３を得た。図３によれ
ば、比生産速度の経時変化は、ＨＭ−０４培地を用いた
培養方法では比較的安定していたが、ＤＭＥＭを用いた
培養方法では経時的に低下した。したがって、本発明の
培地によれば、長期生産が可能であり、好ましいもので
あることが確認された。

【００８１】各培養日数における比生産速度（ｐｇ／ｃ
ｅｌｌ／ｄａｙ）を、縦軸に、各培養日数（日）におけ
る浮遊生細胞密度（×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を横軸
にプロットし、図４を得た。図４によれば、浮遊生細胞
密度に対する比生産速度の変化は、ＨＭ−０４培地を用
いた培養ではなかったが、ＤＭＥＭを用いた培養では浮
遊生細胞密度の増加により低下した。したがって、本発
明の培地によれば高密度培養においても生産性が変化し
ない好ましいものであることが確認された。

【００８２】実施例３ 浮遊培養での繰り返しバッチ培養 培地作製は、実施例２と同様に行なった。但し血清添加
濃度は、ＴＭ生産細胞を増殖せしめる培養（以下、増殖
培養）に用いる培地では１０％（ｖ／ｖ）添加、ＴＭを
製造するための培養（以下、生産培養とも略す）に用い
る培地では２％（ｖ／ｖ）添加し、作製した。

【００８３】増殖培養の開始では、２×１０⁷ ｃｅｌｌ
ｓ／アンプルで凍結保存した細胞を、３７℃恒温槽で素
早く融解し、それぞれの培地に懸濁し遠心分離（２００
０ｒｐｍ、２分、国産化学）した。遠心後、上清は吸引
除去しそれぞれの新鮮培地１００ｍｌで懸濁し、培養容
器（カルスター１００、柴田ハリオ社製）に入れ培養を
開始した。増殖培養は、３７℃１０％炭酸ガス恒温室
内、撹拌８０ｒｐｍ（マグネティックスターラー、柴田
ハリオ社製）で実施した。増殖培養は浮遊生細胞密度が
５×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達したところで継代し
た。継代の培養スケールは１００ｍｌ、５００ｍｌ、２
Ｌ、８Ｌと順次拡大した。継代では継代後の培養スケー
ルから継代前の培養スケールを差し引いた値と同じ量の
新鮮培地を加え拡大した。

【００８４】培養スケール８Ｌでの増殖培養で浮遊生細
胞密度が５×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達したところで
ＤＯ制御を開始した。制御条件はＤＯ５０％制御（ＤＯ
電極（エイブル社）、ＤＯコントローラー（東亜化
学））、通気流量：空気３００ｍｌ／分、二酸化炭素ガ
ス３０ｍｌ／分、ＤＯ制御用酸素ガス９００ｍｌ／分で
行った。

【００８５】培養スケール８Ｌでの増殖培養での培地交
換は、５、９、１１日目に、連続遠心分離機（アルファ
−ラバル社、製品名ＣＣ−１００）を用い培養液の遠心
分離を行ない予め３７℃に加温した新鮮培地へ交換し
た。培養スケール８Ｌでの増殖培養の１２日目から生産
培養を開始した。培地交換は毎日、連続遠心分離機（ア
ルファ−ラバル社、製品名ＣＣ−１００）を用い培養液
の遠心分離を行ない上清を取得し、細胞は予め３７℃に
加温した新鮮培地と懸濁し生産培養を開始した。遠心分
離した上清のうち８００ｍｌをサンプリングし−２０℃
で凍結保存した。生産培養の条件は、３７℃恒温室内、
撹拌１００ｒｐｍ（マグネティックスターラー、柴田ハ
リオ社製）、溶存酸素濃度（ＤＯ）５０％制御（ＤＯ電
極（エイブル社）、ＤＯコントローラー（東亜化
学））、通気流量：空気１００ｍｌ／分、二酸化炭素ガ
ス１０ｍｌ／分、ＤＯ制御用酸素ガス１０００ｍｌ／分
で培養を２０日間行なった。浮遊生細胞密度は実施例２
と同様に測定した。また、生産培養の上清中のＴＭ濃度
は実施例１−（４）−ａ記載のトロンビンによるプロテ
インＣ活性化を促進する活性の測定方法により比活性を
８万Ｕ／ｍｇとして算出した。

【００８６】生産培養結果は、平均生細胞密度３．１×
１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌで、平均生産性は２７ｍｇ／Ｌ
／ｄａｙであった。

【００８７】実施例４ 浮遊培養でのバッチ培養 培地作製は実施例２と同様に行なった。但し血清添加濃
度は１０％（ｖ／ｖ）で作製した。細胞は実施例３の８
Ｌスケールの増殖培養５日目から培養液２０ｍｌをサン
プリングし、新鮮培地８０ｍｌに懸濁し、培養容器（カ
ルスター１００、柴田ハリオ社製）に入れ培養を開始し
た。培養は、３７℃１０％炭酸ガス恒温室内、撹拌８０
ｒｐｍ（マグネティックスターラー、柴田ハリオ社製）
で実施した。５×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達したとこ
ろで、培養液全量を遠心分離（２０００ｒｐｍ、２分、
国産化学）し、５００ｍｌの新鮮培地に懸濁し、スピナ
ーフラスコ（カルスター５００、柴田ハリオ社製）に移
し、３７℃１０％炭酸ガス恒温室内、撹拌１２０ｒｐｍ
（マグネティックスターラー、柴田ハリオ社製）でバッ
チ培養を開始し生産培養とした。浮遊生細胞密度は実施
例２と同様に測定した。また、生産培養の上清中のＴＭ
濃度は実施例１−（４）−ａ記載のトロンビンによるプ
ロテインＣ活性化を促進する活性の測定方法により比活
性を８万Ｕ／ｍｇとして算出した。

【００８８】生産培養は８日間培養し、到達生細胞密度
１．８×１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌで、累積生産性は３５
ｍｇ／Ｌであった。

【００８９】実施例５ 浮遊培養での連続培養 培地作製は、実施例２と同様に行なった。但し血清添加
濃度は増殖培養用培地では８％（ｖ／ｖ）、生産培養用
培地では４％（ｖ／ｖ）で調製した。増殖培養の開始で
は、２×１０⁷ ｃｅｌｌｓ／アンプルで凍結保存した細
胞を、３７℃恒温槽で素早く融解し、それぞれの培地に
懸濁し遠心分離（２０００ｒｐｍ、２分、国産化学）し
た。遠心後、上清は吸引除去しそれぞれの新鮮培地１０
０ｍｌで懸濁し、培養容器（カルスター１００、柴田ハ
リオ社製）に入れ培養を開始した。増殖培養は、３７℃
１０％炭酸ガス恒温室内、撹拌８０ｒｐｍ（マグネティ
ックスターラー、柴田ハリオ社製）で実施した。増殖培
養は浮遊生細胞密度が５×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達
したところで継代した。継代の培養スケールは１００ｍ
ｌ、５００ｍｌ、１．５Ｌと順次拡大した。継代では継
代後の培養スケールから継代前の培養スケールを差し引
いた値と同じ量の新鮮培地を加え拡大した。

【００９０】培養スケール１．５Ｌでの増殖培養で浮遊
生細胞密度が５×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達したとこ
ろでＤＯ制御を開始した。制御条件はＤＯ５０％制御
（ＤＯ電極（エイブル社）、ＤＯコントローラー（東亜
化学））、通気流量：空気３００ｍｌ／分、二酸化炭素
ガス３０ｍｌ／分、ＤＯ制御用酸素ガス９００ｍｌ／分
で行なった。

【００９１】培養スケール１．５Ｌでの増殖培養での連
続培地交換は、分離モジュールを用いた連続濾過で実施
した。培養槽外に設置した循環ポンプ（ハワード社）で
培養液を循環させ、その循環ライン中に培養上清分離モ
ジュール（旭化成工業）を設置し、ペリスターポンプ
（ギルソン社）でモジュール２次側を陰圧にし定量濾過
（濾過速度は１．５Ｌ／日に設定）を行ない、細胞を分
離した培養上清を抜きだした。抜きだした培養上清は４
℃に冷却保存し、その中から毎日５０ｍｌずつサンプリ
ングし−２０℃凍結保存した。新鮮培地の添加は抜きだ
した培養上清と等量を培養槽内へペリスターポンプによ
り定量移送した。

【００９２】２０×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達したと
ころで、増殖培地を生産培地に切り換え、培養スケール
１．５Ｌでの増殖培養での連続培地交換と同様な方法で
生産培養を開始し、２０日間生産培養を行なった。但
し、通気流量：空気１００ｍｌ／分、二酸化炭素ガス１
０ｍｌ／分、ＤＯ制御用酸素ガス１０００ｍｌ／分、撹
拌１２０ｒｐｍ（マグネティックスターラー、柴田ハリ
オ社製）。浮遊生細胞密度は実施例２と同様に測定し
た。また、生産培養の上清中のＴＭ濃度はトロンビンに
よる実施例１−（４）−ａ記載のプロテインＣ活性化を
促進する活性の測定方法により比活性を８万Ｕ／ｍｇと
して算出した。

【００９３】生産培養結果は、平均生細胞密度１２．５
×１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌで、平均生産性は７６ｍｇ／
Ｌ／ｄａｙであった。

【００９４】実施例６ 浮遊培養での連続培養 培地作製は、実施例２と同様に行なった。但し血清添加
濃度は増殖培養用培地では８％（ｖ／ｖ）、生産培養用
培地では４％（ｖ／ｖ）で作製した。増殖培養の開始で
は、２×１０⁷ ｃｅｌｌｓ／アンプルで凍結保存した細
胞を、３７℃恒温槽で素早く融解し、それぞれの培地に
懸濁し遠心分離（２０００ｒｐｍ、２分、国産化学）し
た。遠心後、上清は吸引除去しそれぞれの新鮮培地１０
０ｍｌで懸濁し、培養容器（カルスター１００、柴田ハ
リオ社製）に入れ培養を開始した。増殖培養は、３７℃
１０％炭酸ガス恒温室内、撹拌８０ｒｐｍ（マグネティ
ックスターラー、柴田ハリオ社製）で実施した。増殖培
養は浮遊生細胞密度が５×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達
したところで継代した。継代の培養スケールは１００ｍ
ｌ、５００ｍｌ、１．５Ｌと順次拡大した。継代では継
代後の培養スケールから継代前の培養スケールを差し引
いた値と同じ量の新鮮培地を加え拡大した。

【００９５】培養スケール１．５Ｌでの増殖培養で浮遊
生細胞密度が５×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達したとこ
ろで、培養液全量をＢＩＯＳＴＡＴ−Ｍ（ビーブラウン
社製培養装置）に移送した。培養スケール１．５Ｌでの
増殖培養での連続培地交換は、槽内に設置された分離チ
ューブ（親水性多孔質テフロン、ビーブラウン社）を用
いた連続濾過で実施した。槽内分離チューブをペリスタ
ーポンプ（ギルソン社）で陰圧にし定量濾過（濾過速度
は１．５Ｌ／日に設定）を行ない、分離チューブにより
培養上清を抜きだした。培養上清は４℃に冷却保存し、
その中から毎日５０ｍｌずつサンプリングし−２０℃凍
結保存した。新鮮培地の添加は抜きだした培養上清と等
量を培養槽内へペリスターポンプにより定量移送した。

【００９６】増殖培養条件は、槽内温度３７℃、ＤＯ＝
５０％、ｐＨ＝７．１に制御した。２０×１０⁵ ｃｅｌ
ｌｓ／ｍｌに達したところで、増殖培地を生産培地に切
り換え、培養スケール１．５Ｌでの増殖培養での連続培
地交換と同様な方法で生産培養を開始し、２０日間培養
を行なった。浮遊生細胞密度は実施例２と同様に測定し
た。

【００９７】また、生産培養の上清中のＴＭ濃度は実施
例１−（４）−ａ記載のトロンビンによるプロテインＣ
活性化を促進する活性の測定方法により比活性を８万Ｕ
／ｍｇとして算出した。生産培養結果は、平均生細胞密
度１２．０×１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌで、平均生産性は
７８ｍｇ／Ｌ／ｄａｙであった。

【００９８】実施例７ 浮遊培養での連続培養培養 （１）血清培地 培地作製は、実施例２と同様に行なった。但し血清添加
濃度は増殖培養用培地では８％（ｖ／ｖ）、生産培養用
培地では４％（ｖ／ｖ）で作製した。

【００９９】増殖培養の開始では、２×１０⁷ ｃｅｌｌ
ｓ／アンプルで凍結保存した細胞を、３７℃恒温槽で素
早く融解し、それぞれの培地に懸濁し遠心分離（２００
０ｒｐｍ、２分、国産化学）した。遠心後、上清は吸引
除去しそれぞれの新鮮培地１００ｍｌで懸濁し、培養容
器（カルスター１００、柴田ハリオ社製）に入れ培養を
開始した。

【０１００】増殖培養条件は、３７℃１０％炭酸ガス恒
温室内、撹拌８０ｒｐｍ（マグネティックスターラー、
柴田ハリオ社製）で実施した。増殖培養は浮遊生細胞密
度が５×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達したところで継代
した。継代の培養スケールは１００ｍｌ、５００ｍｌ、
１．５Ｌと順次拡大した。継代では継代後の培養スケー
ルから継代前の培養スケールを差し引いた値と同じ量の
新鮮培地を加え拡大した。

【０１０１】培養スケール１．５Ｌでの増殖培養で浮遊
生細胞密度が５×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達したとこ
ろで、培養液全量をＢＩＯＳＴＡＴ−Ｍ（ビーブラウン
社製培養装置）に移送した。培養スケール１．５Ｌでの
増殖培養での連続培地交換は、槽内に設置された分離ス
テンレスメッシュフィルター（孔径２０μｍ、ビーブラ
ウン社）を用いた連続濾過で実施した。

【０１０２】槽内分離ステンレスメッシュフィルター内
に差し込んだ抜きだしパイプをペリスターポンプ（ギル
ソン社）で陰圧にし定量濾過（濾過速度は１．５Ｌ／日
に設定）を行ない、ステンレスメッシュフィルターによ
り分離した培養上清を抜きだした。培養上清は４℃に冷
却保存し、その中から毎日５０ｍｌずつサンプリングし
−２０℃凍結保存した。新鮮培地の添加は抜きだした培
養上清と等量を培養槽内へペリスターポンプにより定量
移送した。

【０１０３】増殖培養条件は、槽内温度３７℃、ＤＯ＝
５０％、ｐＨ＝７．１に制御した。２０×１０⁵ ｃｅｌ
ｌｓ／ｍｌに達したところで、増殖培地を生産培地に切
り換え、培養スケール１．５Ｌでの増殖培養での連続培
地交換と同様な方法で生産培養を開始し、２０日間培養
した。浮遊生細胞密度は実施例２と同様に測定した。

【０１０４】また、生産培養の上清中のＴＭ濃度は実施
例１−（４）−ａ記載のトロンビンによるプロテインＣ
活性化を促進する活性の測定方法により比活性を８万Ｕ
／ｍｇとして算出した。生産培養結果は、平均生細胞密
度１１．２×１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌで、平均生産性は
７６ｍｇ／Ｌ／ｄａｙであった。

【０１０５】（２）増殖因子培地 実施例７−（１）の方法に従い培養を行った。但し生産
培養用培地には血清を添加せず、増殖因子としてアルブ
ミン３ｍｇ、インシュリン５ｍｇ、トランスフェリン５
ｍｇ、エタノールアミン２μＭ、亜セレン酸ナトリウム
２０ｎＭを添加し生産培養用培地を調製した。

【０１０６】本細胞は完全に血清非依存性で無いため
か、飽和細胞密度は実施例７−（１）の約半分の５×１
０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ程度であった。生産培養結果は、
平均生細胞密度４．８×１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌで、平
均生産性は４２ｍｇ／Ｌ／ｄａｙであった。

【０１０７】実施例８ 付着培養での繰り返しバッチ培養 培地作製は、実施例２と同様に行った。但し血清添加濃
度は増殖培養用培地では１０％（ｖ／ｖ）、生産培養用
培地では２％（ｖ／ｖ）で作製した。増殖培養の開始で
は、２×１０⁷ ｃｅｌｌｓ／アンプルで凍結保存した細
胞を、３７℃恒温槽で素早く融解し、それぞれの培地に
懸濁し遠心分離（２０００ｒｐｍ、２分、国産化学）し
た。遠心後、上清は吸引除去しそれぞれの新鮮培地１０
０ｍｌで懸濁し、培養容器（カルスター１００、柴田ハ
リオ社製）に入れ培養を開始した。

【０１０８】増殖培養条件は、３７℃１０％炭酸ガス恒
温室内、撹拌８０ｒｐｍ（マグネティックスターラー、
柴田ハリオ社製）で実施した。浮遊生細胞密度が２×１
０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達したところで、培養液を遠心
分離（２０００ｒｐｍ、２分、国産化学）した。遠心
後、上清は吸引除去しそれぞれの新鮮培地２００ｍｌで
懸濁し、培養容器（カルスター１００、柴田ハリオ社
製）２基にそれぞれ１０ｍｌづつ入れた。そして直ちに
それぞれの培養器に９０ｍｌの新鮮培地に懸濁した３ｇ
／Ｌの表面付着型のサイトデクス１（ファルマシア製）
と多孔質性の内部付着型の旭化成マイクロキャリア（旭
化成工業製）を添加した（サイトデクス１はファルマシ
アバイオテクの添付マニュアル、旭化成マイクロキャリ
アは旭化成工業の添付マニュアルに従い準備した）。

【０１０９】付着担体を用いた１００ｍｌ撹拌増殖培養
は、３７℃１０％炭酸ガス恒温室内、撹拌８０ｒｐｍ
（マグネティックスターラー、柴田ハリオ社製）で実施
した。培地交換は、培養の撹拌を停止し付着担体が沈降
後、上清をピペットで吸引除去し等量の新鮮培地を加え
培養を再開した。培地交換は、５、８、１０日目実施し
た。

【０１１０】２０×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達したと
ころで、増殖培地を生産培地に切り換え、培地交換は同
様な方法で毎日行ない、生産培養は２５日間行なった。
培地交換で得た培養上清１００ｍｌは−２０℃で冷凍保
存した。浮遊生細胞密度は実施例２と同様に測定した。
担体付着細胞密度は、サンプリングした培養液の担体沈
澱上清を除去し、除去した上清と等量の脱核染色液（ク
リスタルバイオレット、ＴＷＥＥＮ８０、クエン酸）を
加え、脱核後、血球計算盤で核数を測定し、核密度を付
着細胞密度とした。

【０１１１】また、生産培養の上清中のＴＭ濃度は実施
例１−（４）−ａ記載のトロンビンによるプロテインＣ
活性化を促進する活性の測定方法により比活性を８万Ｕ
／ｍｇとして算出した。生産培養結果は、平均細胞密度
はサイトデクス１使用の培養で２．５×１０⁶ｃｅｌｌ
ｓ／ｍｌで、平均生産性は２６ｍｇ／Ｌ／ｄａｙであ
り、また平均細胞密度は旭化成マイクロキャリア使用の
培養で５．５×１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌで、平均生産性
は４６ｍｇ／Ｌ／ｄａｙであった。

【０１１２】実施例９ 強陰イオン交換樹脂カラムによる粗精製 実施例３で取得した−２０℃凍結培養上清１１Ｌを溶解
し、０．２μｍのメンブレンフィルター（ミリポア社、
ミリパック２０）で濾過した。濾過した培養上清につい
ては、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩緩
衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ（ファルマシア社）カラム（直径９０ｍｍ、高さ６．
５ｃｍ）に供した。次に１８０ｍＭ ＮａＣｌを含む２
０ｍＭ酢酸緩衝液で洗浄し、更に１８０ｍＭ ＮａＣｌ
を含む２０ｍＭトリス塩緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄を
行ない、３００ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩
緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出を開始し、溶出液の吸光度
２８０ｎｍのピーク立ち上がりからの０．５カラムボリ
ューム容量の溶出液を粗精製品として取得した。

【０１１３】実施例１０ アフィニティーカラム（抗体Ｂ）による主精製 アフィニティーカラムは以下のように作製した。即ち、
上記実施例１−（５）で得られた抗ＴＭモノクローナル
抗体Ｂは、その抗体を産生するハイブリドーマを培養す
ることにより得た培養上清、あるいは、ハイブリドーマ
を組織適合性動物、ヌードマウス等の腹腔内にて増殖さ
せて得た腹水より、塩析、イオン交換クロマトグラフィ
ー、プロテインＡカラム等の分離精製操作により精製し
た。次に、ファルマシア社のマニュアル（Ａｆｆｉｎｉ
ｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｐｒｉｎｃｉｐ
ｌｅｓ ＆ ｍｅｔｈｏｄｓ）に従い、精製抗ＴＭモノ
クローナル抗体Ｂを０．５Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍ
ＮａＨＣＯ3 緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解し、ＣＮＢｒ
−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（フ
ァルマシア社、５２−１１５３−００−ＡＩ）と接触反
応させ、セファロース４Ｂに抗ＴＭモノクローナル（抗
体Ｂ）をカップリングし、抗ＴＭモノクローナル（抗体
Ｂ）結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂを作製した。次いで
この抗ＴＭモノクローナル（抗体Ｂ）結合Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ ４Ｂをカラムに充填しモノクローナル（抗体
Ｂ）カラムを作製した。

【０１１４】実施例９で得られた溶出画分４００ｍｌ
を、１．０Ｍ ＮａＣｌ含む２０ｍＭりん酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．３）で平衡化したモノクローナル抗体（抗体Ｂ）
カラム（直径５０ｍｍ、高さ６ｃｍ）に供した。１．０
Ｍ ＮａＣｌ含む２０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．３）
を流し、更に１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を流
し洗浄し、０．３Ｍ ＮａＣｌ含む１００ｍＭグリシン
塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出を開始し、溶出液の吸
光度２８０ｎｍのピーク立ち上がりから立ち下がりまで
の溶出液を主精製品として取得した。

【０１１５】実施例１１ 強陽イオン交換樹脂カラムによる高純度精製 実施例１０で得られた溶出液１８０ｍｌを１．０Ｍグリ
シン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）にてｐＨ３．５に調製し
た液を、３００ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ｍＭグリシ
ン塩酸緩衝液（比伝導度３１ｍｓ／ｃｍ、ｐＨ３．５）
で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア
社）カラム（直径２６ｍｍ、高さ３ｃｍ）に供した。３
００ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝
液（比伝導度３１ｍｓ／ｃｍ、ｐＨ３．５）で洗浄を開
始し、吸光度２８０ｎｍのピーク立ち上がりから立ち下
がりまでの素通り画分を得、直ちに５００ｍＭりん酸緩
衝液（ｐＨ７．３）でｐＨ７に中和し、高純度精製品と
して取得した。

【０１１６】実施例１２ ポリスルフォン中空糸による高純度精製品の濃縮 実施例１１で得られた高純度精製品をそれぞれ、５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．
３）で湿潤化した１ｍのポリスルフォン中空糸（旭化成
工業製）を用い濃縮し、それぞれ５ｍｌの濃縮液を取得
した。

【０１１７】実施例１３ ゲル濾過カラムによる高純度精製品の緩衝液交換 実施例１２で得られたそれぞれの濃縮液５ｍｌを、５０
ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．
３）で平衡化したそれぞれのＳｅｐａｈｃｒｙｌ Ｓ−
３００カラム（ファルマシア社、直径１６ｍｍ、高さ９
０ｃｍ）に供した。５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ
りん酸緩衝液（ｐＨ７．３）で展開し分画した。各画分
は実施例１−（４）−ａ記載のトロンビンによるプロテ
インＣ活性化を促進する活性の測定法方により活性の確
認を行ない活性画分を回収し緩衝液交換した高純度精製
品を取得した。

【０１１８】実施例１４ アフィニティーカラム（トロンビンカラム）を用いた精
製 実施例９で得られた溶出画分４００ｍｌを１００ｍＭ
ＮａＣｌ及び０．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭ
トリス緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析した。透析
後、１００ｍＭ ＮａＣｌ及び０．５ｍＭ塩化カルシウ
ムを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化
したＤＩＰ−トロンビン−アガロース（ＰＡＥＳＥ Ｌ
ＯＲＥＩ社、０６−１４８−１０３５、直径５０ｍｍ、
高さ６ｃｍ）に供した。２００ｍＭ ＮａＣｌ及び０．
５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）で洗浄後、１．０Ｍ ＮａＣｌ及び０．５ｍ
Ｍ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７．４）で溶出を開始し、溶出液の吸光度２８０ｎｍの
ピーク立ち上がりから立ち下がりまでの溶出液を主精製
品として取得した。

【０１１９】得られた溶出液２００ｍｌに１００ｍＭグ
リシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）を加え希釈した液を、
次に１．０Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）でｐＨ
３．５に調製した。この希釈ｐＨ調製した溶出液を３０
０ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液
（比伝導度３１ｍｓ／ｃｍ、ｐＨ３．５）で平衡化した
ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社）カラム
（直径２６ｍｍ、高さ３ｃｍ）に供した。３００ｍＭ
ＮａＣｌを含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（比伝導
度３１ｍｓ／ｃｍ、ｐＨ３．５）で洗浄を開始し、吸光
度２８０ｎｍのピーク立ち上がりから立ち下がりまでの
素通り画分を得、直ちに５００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ
７．３）でｐＨ７に中和し、高純度精製品として取得し
た。

【０１２０】この高純度精製品を、５０ｍＭ ＮａＣｌ
を含む２０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．３）で湿潤化し
た１ｍのポリスルフォン中空糸（旭化成工業製）を用い
濃縮し、５ｍｌの濃縮液を取得した。次にゲル濾過カラ
ムによる高純度精製品の緩衝液交換を行った。即ち、得
られた濃縮液５ｍｌを、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０
ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化したそれぞれ
のＳｅｐａｈｃｒｙｌ Ｓ−３００カラム（ファルマシ
ア社、直径１６ｍｍ、高さ９０ｃｍ）に供した。５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．
３）で展開し分画した。各画分は実施例１−（４）−ａ
記載のトロンビンによるプロテインＣ活性化を促進する
活性の測定方法により活性の確認を行ない、活性画分を
回収し緩衝液交換した高純度精製品を取得した。

【０１２１】実施例１５ 凍結した生産培養上清、すなわち実施例４の培養上清、
実施例５の培養上清、実施例６の培養上清、実施例７−
（１）の培養上清、実施例８の培養付着担体としてサイ
トデクスを用いた培養の培養上清、そして実施例８の培
養付着担体として旭化成マイクロキャリアを用いた培養
の培養上清それぞれを、精製の出発材料にした。

【０１２２】精製は、実施例９のイオン交換クロマトに
よる粗精製を行ない、次に粗精製品を実施例１０のアフ
ィニティークロマトで精製した。そしてこの精製品を実
施例１１のイオン交換クロマトで高純度精製し、実施例
１２の濃縮方法で高純度精製品を濃縮し、実施例１４の
ゲル濾過を行ない緩衝液置換された高純度精製品を得
た。

【０１２３】実施例１６ 高純度精製品の物性 実施例１３、１４、１５で得られた緩衝液置換された高
純度精製品について、以下の検討をした。高純度精製品
は、界面活性剤の非存在下でｐＨ中性の注射用蒸留水に
少なくとも１０ｍｇ／ｍｌは溶解せしめることができ
た。

【０１２４】また、高純度精製品を、還元、非還元の両
条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行ない、クマシー染
色で検出した結果、還元で約９４ｋＤａ、非還元で約７
３ｋＤａの１本のバンドが検出された。また、パーキン
エルマー社製のプロテインシーケンサーＰｒｏｃｉｓｅ
４９２型を用いて、パルスリキッド法で、高純度精製品
のＮ末端アミノ酸解析を行なった。その結果、Ｎ末端の
アミノ酸はアラニンから始まるものとフェニルアラニン
から始まる２種類の蛋白からなり、これはそれぞれ配列
番号３の１９−５１６及び配列番号３の１７−５１６に
相当するアミノ酸配列と考えられた。そしてアラニンか
ら始まるもの含量比率は、それぞれの実施例の生産培養
上清由来について、実施例３：６２％、実施例４：６８
％、実施例５：６９％，実施例６：５９％、実施例７：
６３％、実施例８の培養付着担体としてサイトデクス１
（ファルマシアバイオテク社製）を用いた培養：６５
％、そして実施例８の培養付着担体として旭化成マイク
ロキャリア（旭化成工業製）を用いた培養：５９％であ
った。

【０１２５】高純度精製品の翻訳後修飾解析 以下の実施例において表記されているアミノ酸の配列位
置は、配列番号３及び配列番号４に記載されたアミノ酸
配列の配列位置に相当する。 （１）Ｎ結合型糖鎖結合位置の解析 実施例１３、１４、１５で得られた緩衝液置換された高
純度精製品について、Ｎ結合型糖鎖の結合位置を解析し
た。高純度精製品０．５ｍｇを遠心濃縮機を用いて乾固
させ、トリス・尿素緩衝液・（８Ｍ尿素を含む２００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）０．５ｍＬに溶解
した。この溶液に２−メルカプトエタノール溶液（２−
メルカプトエタノール／トリス・尿素緩衝液Ｉ＝５０μ
Ｌ／４５０μＬ）３２μＬを添加し、３７℃で１時間イ
ンキュベートした。ヨード酢酸溶液（ヨード酢酸０．３
ｇを１ｍＬの２Ｍ ＮａＯＨに溶かしたもの）２７μＬ
を添加し、遮光して、室温で１５分間静置した。この溶
液を１ｍＭ塩酸に透析した後、遠心濃縮機で乾固させた
ものをＲＣＭ−ＴＭとした。ＲＣＭ−ＴＭを、トリス・
尿素緩衝液II（２Ｍ尿素を含む２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ、ｐＨ８．０）１８０μＬに溶解し、０．１ｍｇ
／ｍＬトリプシン溶液（溶媒はトリス・尿素緩衝液II）
４５μＬおよび０．１M塩化カルシウム溶液２５μＬを
添加し、３７℃で１６時間酵素消化した。

【０１２６】この酵素消化液を０．１％ＴＦＡ／５％ア
セトニトリルで平衡化したＣｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−
ＡＲカラム (４．６Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ、日本国、ナ
カライテスク社製）に添加後、０．１％ＴＦＡ／５０％
アセトニトリルへの直線濃度勾配により、ペプチド断片
を分画した。なお、流速は０．７ｍＬ／分、カラム温度
は３５℃、検出は２１０ｎｍの吸収で行った。Ｎ結合型
糖鎖の付加が予想されるコンセンサスシーケンス（Ａｓ
ｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）は、Ａｓｎ４７、Ａｓｎ１１
５、Ａｓｎ１１６、Ａｓｎ３８２、Ａｓｎ４０９の５ケ
所あるので、これらのアスパラギン残基を含むペプチド
断片をＰＳＱ−２３、ＰＳＱ−１ (日本国、島津製作所
製）または、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
Ｐｒｏｃｉｓｅ４９２（米国、パーキンエルマー社製）
を用いて、メーカーの推奨する方法に従ってアミノ酸配
列分析した。

【０１２７】Ａｓｎ４７を含むペプチド断片（Ａｌａ１
９−Ａｒｇ５６）のアミノ酸配列分析で、Ａｓｎ４７の
位置はブランク（ＰＴＨ−Ａｓｎのピークが検出されな
い）であったことから、Ａｓｎ４７にはＮ結合型糖鎖が
結合していることが確認された。同様に、Ａｓｎ３８２
を含むペプチド断片（Ａｌａ３７２−Ａｒｇ４０３）、
Ａｓｎ４０９を含むペプチド断片（Ｃｙｓ４０４−Ａｒ
ｇ４７４）をアミノ酸配列解析した結果、Ａｓｎ３８２
およびＡｓｎ４０９の位置はともにブランクであったこ
とから、Ａｓｎ３８２およびＡｓｎ４０９にもＮ結合型
糖鎖が結合していることが確認された。また、Ａｓｎ１
１５およびＡｓｎ１１６を含むペプチド断片（Ｇｌｙ１
０７−Ａｒｇ１２１）のアミノ酸配列を解析すると、Ａ
ｓｎ１１５、Ａｓｎ１１６の位置はブランクではない
が、検出されるＰＴＨ−Ａｓｎ量が予想される量よりそ
れぞれ低いことから、Ａｓｎ１１５に糖鎖が結合したも
の（Ａｓｎ１１６には糖鎖が結合していない）とＡｓｎ
１１６に糖鎖が結合したもの（Ａｓｎ１１５には糖鎖が
結合していない）の混合物と考えられた。このことは、
この断片の質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）の結果
で、このペプチド断片には、Ｎ結合型糖鎖が１本結合し
た分子量しか認められないことからも支持された。

【０１２８】（２）Ｎ結合糖鎖構造の解析 実施例１３、１４、１５で得られた緩衝液置換された高
純度精製品について、Ｎ結合型糖鎖構造を解析した。高
純度精製品０．５ｍｇを脱塩後、遠心濃縮機を用いて乾
固させた。これをＨｙｄｒａｃｌｕｂＳ−２０４（日本
国、ホーネン社製）を用いて、１１０℃で１時間無水ヒ
ドラジンで処理し、糖鎖を切りだした。これを、２５０
μＬの０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムに溶解し、２５μＬ
の無水酢酸を加え、室温で３０分間静置した。この操作
を２回繰り返し、再アセチル化した。この糖鎖を宝酒造
社製のＰＡＬＳＴＡＴＩＯＮ Ｍｏｄｅｌ １０００
（日本国、宝酒造社製）および糖鎖分析用試薬キットを
用い、そのプロトコールに従ってピリジルアミノ（Ｐ
Ａ）化した。脱塩して遠心濃縮機で乾固させた後、２０
μＬの０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０に溶
解した。この溶液にシアリダーゼ０．０５Ｕを添加し、
３７℃で終夜インキュベートして、アシアロＰＡ化糖鎖
を調製した。このアシアロＰＡ化糖鎖をＴｏｍｉｙａら
の方法（Ｔｏｍｉｙａ、Ｎ．，ｅｔ．ａｌ，１９８８，
Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７１，７３−９０）に
従って２次元マッピングし、構造を推定した。

【０１２９】その結果、主成分はフコシルバイアンテナ
型であることが推定された（８５〜９０％）。その次に
多い成分はフコシルトリアンテナ型であり（１０〜１５
％）、この２成分が大部分を占めていた。さらに、この
主要２成分の構造は、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭ
Ｓ、ＦＡＢ−ＭＳ）、エキソグリコシダーゼ処理（ガラ
クトシダーゼ、ＧｌｃＮＡｃ−ａｓｅ、フコシダーゼ）
による解析においても正しいことが確認できた。また、
前述の（１）で調製した各Ｎ型糖鎖結合部位を含む糖ペ
プチド断片についてもそれぞれ同様に解析したが、すべ
ての結合位置の糖鎖主成分の構造はフコシルバイアンテ
ナ型であり、結合部位による糖鎖構造の顕著な違いは認
められなかった。

【０１３０】（３）Ｏ結合型糖鎖結合位置の解析 実施例１３、１４、１５で得られた緩衝液置換された高
純度精製品について、Ｏ結合型糖鎖の結合位置を解析し
た。高純度精製品１ｍｇを脱塩した後、遠心濃縮機を用
いて乾固させ、水３０μＬに溶解した。この溶液に１０
μＬの０．２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．
０）とＡｓｐ−Ｎ（日本国、和光純薬工業製）１μｇを
添加し、室温で３日間酵素消化した。この酵素消化液を
０．１％ＴＦＡ／水で平衡化したＣｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ
１８−３００カラム (４．６Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ、日
本国、ナカライテスク社製）に添加後、０．１％ＴＦＡ
／９０％アセトニトリルへの直線濃度勾配により、ペプ
チド断片を分画した。なお、流速は０．８ｍＬ／分、検
出は２２０ｎｍの吸収で行った。Ｏ結合型糖鎖は、プロ
リンリッチな配列付近に結合している場合が多いことか
ら、可溶化ＴＭのＣ末端近傍に結合していることが予想
された。そこでＣ末端を含むペプチド断片（Ａｓｐ４８
９−Ｇｌｙ５１６）をシアリダーゼ及びガラクトシダー
ゼ処理した後、ＰＳＱ−２３、ＰＳＱ−１ (日本国、島
津製作所製）または、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ Ｐｒｏｃｉｓｅ４９２（米国、パーキンエルマー
社製）を用いて、メーカーの推奨する方法に従ってアミ
ノ酸配列分析した。なおＳｅｒ／Ｔｈｒの分析サイクル
で、ＰＴＨ−Ｓｅｒ／ＰＴＨ−Ｔｈｒの収量が低く、か
つＰＴＨ−Ｓｅｒ（ＧａｌＮＡｃ）／ＰＴＨ−Ｔｈｒ
（ＧａｌＮＡｃ）のピークが認められる位置を糖鎖結合
位置とした。

【０１３１】その結果、Ｏ糖鎖結合位置としてＳｅｒ４
９８、Ｔｈｒ５００、Ｓｅｒ５０３、Ｔｈｒ５０４、Ｔ
ｈｒ５０６の５カ所が確認された。だだし、この中でＳ
ｅｒ５０３だけは部分修飾であった。Ｓｅｒ４９２につ
いてもＰＴＨ−Ｓｅｒが検出されないことから糖鎖の修
飾が予想されたが、ＰＴＨ−Ｓｅｒ（ＧａｌＮＡｃ）の
ピークが認められず、糖鎖構造に違いがあることが推測
された。

【０１３２】（４）Ｏ結合型糖鎖構造の解析 実施例１３、１４、１５で得られた緩衝液置換された高
純度精製品について、Ｏ結合型糖鎖構造を解析した。高
純度精製品１．０ｍｇを脱塩後、遠心濃縮機を用いて乾
固させた。これをＨｙｄｒａｃｌｕｂＳ−２０４（日本
国、ホーネン社製）を用いて、６５℃で６時間無水ヒド
ラジンで処理し、糖鎖を切りだした。これを、２５０μ
Ｌの０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムに溶解し、２５μＬの
無水酢酸を加え、室温で３０分間静置した。この操作を
２回繰り返し、再アセチル化した。この糖鎖を宝酒造社
製のＰＡＬＳＴＡＴＩＯＮ Ｍｏｄｅｌ １０００（日
本国、宝酒造社製）および単糖分析用試薬キットを用
い、そのプロトコールに従ってピリジルアミノ（ＰＡ）
化した。遠心濃縮機で乾固させた後、０．０２５Ｍ塩酸
中８０℃で１時間加熱して、アシアロＰＡ化糖鎖を調製
した。このアシアロＰＡ化糖鎖をＩｗａｓｅらの方法
（Ｉｗａｓｅ，ｅｔ．ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１
９９６，１２０，９２−９７）に従ってＨＰＬＣ分析を
行った結果、以下に示す４種類の糖鎖構造が存在するこ
とが推測された。 １）Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ ２）ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ ３）Ｇａｌβ１，３（ＮｕｅＡｃα２，６）ＧａｌＮＡ
ｃ ４）ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，３（ＮｕｅＡｃα
２，６）ＧａｌＮＡｃ

【０１３３】（５）グリコサミノグリカン鎖結合位置お
よび構造の解析 Ｏ結合型糖鎖結合位置の解析結果から、Ｓｅｒ４９２に
はＧａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃ以外の構造の糖鎖が結合
していることが推測されたので、それを含むアシアロ、
アガラクト−ペプチド断片について糖組成分析を行っ
た。すなわちＡｓｐ−Ｎ消化ペプチド断片（Ａｓｐ４８
９−Ｇｌｙ５１６）を蒸留水１００μＬで溶解し、加水
分解試験管に入れ１００μＬの８Ｍ ＴＦＡと混合し１
００℃、３時間加水分解を行った。これを遠心濃縮乾固
した後にＮ−アセチル化を行い、ピリジルアミノ化装置
（パルスステーションＭｏｄｅｌ ４０００、日本国宝
酒造社製）及びＰＡＬＳＴＡＴＩＯＮ Ｐｙｒｉｄｙｌ
ａｍｉｎａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてピ
リジルアミノ化を行った。これをＰＡＬＰＡＫ Ｔｙｐ
ｅＡカラム（宝酒造社製）に供し、ＰＡ−単糖を定量し
た。なお、流速は０．３ｍｌ／分で、カラム温度は６５
℃、検出は蛍光Ｅｘ：３１０ｎｍ、Ｅｍ：３８０ｎｍで
行った。

【０１３４】その結果、Ｓｅｒ４９８、Ｔｈｒ５００、
Ｓｅｒ５０３、Ｔｈｒ５０４、Ｔｈｒ５０６、Ｓｅｒ４
９２に結合するＧａｌＮＡｃ以外に、キシロースとガラ
クトースが約１：２の割合で検出された。したがって、
Ｓｅｒ４９２には、グリコサミノグリカン鎖の橋渡し４
糖の構造（Ｘｙｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃＡ）を含む
ような糖鎖が結合していることが示唆された。

【０１３５】（６）Ａｓｎ３４２のβ−ヒドロキシ化 ＳｔｅｎｆｌｏらはＥＧＦ様構造の−Ｃｙｓ−Ｘ−Ａｓ
ｐ／Ａｓｎ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｔｙｒ／Ｐｈｅ−Ｘ−Ｃ
ｙｓ−Ｘ−Ｃｙｓ−配列中のＡｓｐ／Ａｓｎがβ−ヒド
ロキシ化を受けることを報告している（Ｓｔｅｎｆｌ
ｏ，Ｊ．Ｏｈｌｉｎ，ｅｔ．ａｌ，１９８７，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，３６
８−３７２、Ｓｔｅｎｆｌｏ，Ｊ．Ｏｈｌｉｎ，ｅｔ．
ａｌ，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，
２１−２４）Ｓｔｅｎｆｌｏらのコンセンサスシーケン
スに従えば、可溶化ＴＭには２ケ所修飾が予想される位
置がある（Ａｓｎ３４２、Ａｓｎ４５７）。そこで、Ａ
ｓｎ３４２とＡｓｎ４５７を含む各ペプチド断辺のアミ
ノ酸配列解析と質量分析を行ったところ、Ａｓｎ３４２
を含むペプチド断片は、修飾されない場合の質量より１
６質量数大きく、Ａｓｎがヒドロキシ化された場合の質
量数とほぼ一致した（Ｍ＋Ｈ：Ａｖ．ｍａｓｓ＝３９１
７．２、ヒドロキシされていない場合は３９０１．
２）。この結果から、Ａｓｎ３４２はβ−ヒドロキシ化
を受けていると考えられた。またその修飾率はＭＳのイ
オン強度比から９０％以上と予想された。

【０１３６】（７）Ｓｅｒ３０５のグルコシル化 ＲＣＭ−ＴＭのトリプシン消化液中から、Ｓｅｒ３０５
を含むペプチド断片（Ｓｅｒ２７９−Ａｒｇ３１５）を
分離し、アミノ酸配列を解析した結果、Ｓｅｒ３０５の
位置にはＰＴＨ−Ｓｅｒのピークは認められず、ＰＴＨ
−Ａｓｐの溶出位置の近くにピークが移動していること
がわかった。また、このペプチド断片を質量分析（ＭＡ
ＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ）した結果ｍ／ｚ４５１６にピーク
が認められ、ペプチド断片の予想質量より約１６２質量
数だけ大きかった。この結果から、Ｓｅｒ３０５は修飾
を受けており、ヘキソース（質量数＝１６２）の付加が
予想された。そこで、このペプチド断片の糖組成分析を
行ったところ、グルコースが検出された。

【０１３７】ＥＧＦ様構造中のＳｅｒ残基のグルコシル
化については、いくつかの血清タンパク質について報告
されている（ｆａｃｔｏｒＶＩＩ、ｆａｃｔｏｒＩＸ、
ｐｒｏｔｅｉｎＺ、ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）
（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｈ．，ｅｔ．ａｌ，１９８９，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，２０３２０−２０
３２５）。しかし、これまでに報告されている糖鎖構造
は、２糖（Ｘｙｌ−Ｇｌｃ）もしくは３糖（Ｘｙｌ−Ｘ
ｙｌ−Ｇｌｃ）であったが、可溶化ＴＭのＳｅｒ３０５
に結合する糖鎖はグルコース１糖でキシロースの付加は
認められず、これまでに報告されている糖鎖構造とは異
なることがわかった。また、グルコース付加のコンセン
サスシーケンスはＣｙｓ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｃ
ｙｓであるが、Ｓｅｒ３０５周辺のアミノ酸配列はＰｒ
ｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ３０５−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−
であり、一致しない。したがって、Ｓｅｒ３０５のグル
コシル化は新しいタイプの修飾と考えられた。

【０１３８】実施例１７ トロンボモジュリン精製工程のスケールアップとマスバ
ランス 実施例７−（１）の培養上清１２Ｌを用い、カラムスケ
ールを容量に合わせて増大させた他は、実質的に実施例
９〜１３に記載したのと同様の方法で、高純度ＴＭを得
た。このときの精製マスバランスを下記表１に示した。
最終的に高純度ＴＭとして約２８５ｍｇが得られ、活性
回収率は３８％であった。

【０１３９】

【表１】

【０１４０】更に実施例７−（１）の培養上清１２Ｌを
用い、カラムスケールを容量に合わせて増大させた他
は、実質的に実施例９〜１３に記載したのと同様の方法
で、但し実施例１１に記載したＳＰイオン交換工程を実
施せず精製ＴＭを得た。このときの精製マスバランスを
下記表２に示した。最終的に精製ＴＭとして約２８０ｍ
ｇが得られ、活性回収率は４０％とＳＰ−セファロース
を導入した場合とほぼ同様の回収率であった。

【０１４１】

【表２】

【０１４２】実施例１８ 混入異種蛋白質量の評価 ＴＭウシ血清由来物、マウス抗体由来物及びＣＨＯ細胞
由来物それぞれについて、それぞれＥＬＩＳＡによる測
定系を確立した。 （１）血清由来物の評価方法 ウシ血清とフロイント完全アジュバントとの等量乳濁液
１ｍｌをウサギの背皮下感作した。２週間後及び３週間
後にそれぞれ背皮下に同乳濁液１ｍｌずつを投与し、最
終感作１週間後に採血した。血液を約４℃で１晩静置し
た後、血餅を除き遠心分離した上清をとり、得られたウ
サギ抗ウシ血清成分抗血清より、硫安塩析法及びウシ血
清成分をリガンドとしたカラムクロマトグラフ法によっ
て、ウサギ抗ウシ血清成分抗体を得た。

【０１４３】ウサギ抗ウシ血清成分抗体をペプシンで消
化し、２Ｆ（ａｂ’）２断片を得た。２−メルカプトエ
チルアミン塩酸塩で還元後、Ｎ−（４−カルボキシシク
ロヘキシルメチル）マレイミドのＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステルでマレイミド基を導入した西洋ワサビ
ペルオキシダーゼと反応させ、酵素標識抗ウシ血清成分
抗体を調製した。予想されるウシ血清成分含量が０〜２
５ｎｇ／ｍｌとなるように、各工程の溶出液をポリソル
ベート・リン酸塩緩衝食塩液で薄め、試料溶液とした。
別にウシ血清成分標準品にポリソルベート・リン酸塩緩
衝食塩液を加えて、その１ｍｌ中に２５〜１．２５及び
０ｎｇを含む液を調製し、標準溶液とした。

【０１４４】ポリスチレン製９６穴プレートに、１穴当
たりウサギ抗ウシ血清成分抗体溶液を５０μｌずつ加え
た後，２５℃で約２時間静置した。次いでリン酸塩緩衝
食塩液で各穴を洗浄し，ブロッキング溶液を加え，２５
℃で約１時間静置した。ポリソルベート・リン酸塩緩衝
食塩液で洗った後、試料溶液及び標準溶液を１００μｌ
ずつそれぞれの穴に加え、２５℃で約１６時間静置し
た。次いでポリソルベート・リン酸塩緩衝食塩液で洗浄
後，酵素標識抗ウシ血清成分抗体溶液を５０μｌずつ加
え、２５℃で約２時間静置した。ポリソルベート・リン
酸塩緩衝食塩液で洗浄した後，酵素基質溶液を１００μ
ｌずつ加え、２５℃で約４０分反応させた。薄めた硫酸
（１→４）５０μｌずつ加えて反応を停止させた後、９
６穴プレート用吸光度計で４９０ｎｍの吸光度を測定し
た。標準溶液による検量線から、本品１ｍｌ中のウシ血
清成分の含量を求めた。標準溶液の最低濃度の１．２５
ｎｇ／ｍＬを検出限界とした。

【０１４５】（２）マウス抗体由来物の評価方法 マウス抗体とフロイント完全アジュバントとの等量乳濁
液1 mlをウサギの背皮下感作した。2 週間後及び3 週間
後にそれぞれ背皮下に同乳濁液1 mlずつを投与し，最終
感作1 週間後に採血した。血液を約４℃で１晩静置した
後，血餅を除き遠心分離した上清をとり、得られたウサ
ギ抗マウス抗体成分抗血清より，硫安塩析法及びマウス
抗体成分をリガンドとしたカラムクロマトグラフ法によ
って、ウサギ抗マウス抗体成分抗体を得た。

【０１４６】ウサギ抗マウス抗体成分抗体をペプシンで
消化し、Ｆ（ａｂ’）２断片を得た。２−メルカプトエ
チルアミン塩酸塩で還元後、Ｎ−（４−カルボキシシク
ロヘキシルメチル）マレイミドのＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステルでマレイミド基を導入した西洋ワサビ
ペルオキシダーゼと反応させ、酵素標識抗マウス抗体成
分抗体を調製した。

【０１４７】予想されるマウス抗体成分含量が０〜２５
ｎｇ／ｍｌとなるように、各工程の溶出液をポリソルベ
ート・リン酸塩緩衝食塩液で薄め、試料溶液とした。別
にマウス抗体成分標準品にポリソルベート・リン酸塩緩
衝食塩液を加えて、その1 ｍｌ中に２５〜１．２５及び
０ｎｇを含む液を調製し、標準溶液とした。ポリスチレ
ン製９６穴プレートに、１穴当たりウサギ抗マウス抗体
成分抗体溶液を５０μｌずつ加えた後、２５℃で約２時
間静置した。次いでリン酸塩緩衝食塩液で各穴を洗浄
し、ブロッキング溶液を加え、２５℃で約１時間静置し
た。ポリソルベート・リン酸塩緩衝食塩液で洗った後、
試料溶液及び標準溶液を１００μｌずつそれぞれの穴に
加え、２５℃で約１６時間静置した。次いでポリソルベ
ート・リン酸塩緩衝食塩液で洗浄後、酵素標識抗マウス
抗体成分抗体溶液を５０μｌずつ加え、２５℃で約２時
間静置した。ポリソルベート・リン酸塩緩衝食塩液で洗
浄した後、酵素基質溶液を１００μｌずつ加え、２５℃
で約４０分反応させた。薄めた硫酸（１→４）５０μｌ
ずつ加えて反応を停止させた後、９６穴プレート用吸光
度計で４９０ｎｍの吸光度を測定した。標準溶液による
検量線から、本品１ｍｌ中のマウス抗体成分の含量を求
めた。標準溶液の最低濃度の１．２５ｎｇ／ｍＬを検出
限界とした。

【０１４８】（３）ＣＨＯ細胞由来物の評価方法 ＣＨＯ細胞を無血清培地で培養した上清を濃縮し、ＣＨ
Ｏ細胞由来物を得た。ＣＨＯ細胞由来物とフロイント完
全アジュバントとの等量乳濁液１ｍｌをウサギの背皮下
感作した。２週間後及び３週間後にそれぞれ背皮下に同
乳濁液１ｍｌずつを投与し、最終感作１週間後に採血し
た。血液を約４℃で１晩静置した後、血餅を除き遠心分
離した上清をとり、得られたウサギ抗ＣＨＯ細胞由来物
成分抗血清より、硫安塩析法及びカラムクロマトグラフ
法によって、ウサギ抗ＣＨＯ細胞由来物成分抗体を得
た。

【０１４９】ウサギ抗ＣＨＯ細胞由来物成分抗体をペプ
シンで消化し、Ｆ（ａｂ’）２断片を得た。２−メルカ
プトエチルアミン塩酸塩で還元後、Ｎ− (４−カルボキ
シシクロヘキシルメチル）マレイミドのＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステルでマレイミド基を導入した西洋
ワサビペルオキシダーゼと反応させ、酵素標識抗ＣＨＯ
細胞由来物成分抗体を調製した。

【０１５０】予想されるＣＨＯ細胞由来物成分含量が０
〜５００ｎｇ／ｍｌとなるように、各工程の溶出液をポ
リソルベート・リン酸塩緩衝食塩液で薄め、試料溶液と
した。別にＣＨＯ細胞由来物成分標準品にポリソルベー
ト・リン酸塩緩衝食塩液を加えて、その１ｍｌ中に５０
０〜２５及び０ｎｇを含む液を調製し、標準溶液とし
た。

【０１５１】ポリスチレン製９６穴プレートに、１穴当
たりウサギ抗ＣＨＯ細胞由来物成分抗体溶液を１００μ
ｌずつ加えた後、２５℃で約２時間静置した。次いでリ
ン酸塩緩衝食塩液で各穴を洗浄し、ブロッキング溶液を
加え、２５℃で約１時間静置した。ポリソルベート・リ
ン酸塩緩衝食塩液で洗った後、試料溶液及び標準溶液を
１００μｌずつそれぞれの穴に加え、２５℃で約１６時
間静置した。次いでポリソルベート・リン酸塩緩衝食塩
液で洗浄後、酵素標識抗ＣＨＯ細胞由来物成分抗体溶液
を５０μｌずつ加え、２５℃で約２時間静置した。ポリ
ソルベート・リン酸塩緩衝食塩液で洗浄した後、酵素基
質溶液を１００μｌずつ加え、２５℃で約４０分反応さ
せた。薄めた硫酸（１→４）５０μｌずつ加えて反応を
停止させた後、９６穴プレート用吸光度計で４９０ｎｍ
の吸光度を測定した。標準溶液による検量線から、本品
１ｍｌ中のＣＨＯ細胞由来物成分の含量を求めた。標準
溶液の最低濃度の２５ｎｇ／ｍＬを検出限界とした。

【０１５２】（４）各混入成分量の評価 これらの評価方法を用いて、実施例１７の表１、表２に
示した高純度及び精製可溶性ＴＭの精製各段における混
入量をそれぞれ評価した。結果を表３、表４に示した。
ＳＰイオン交換工程の導入によって、各成分の混入量を
同時に劇的に減じることができた。同様の実験を計５回
実施したが、ウシ血清由来物とマウス抗体由来物に関し
てはいずれも検出されなかった。これに対してＳＰを用
いない場合は、それぞれの含量は一定せず、５回の実験
で血清由来物が１５〜１３６μｇ、血清由来物が８〜３
６μｇであった。

【０１５３】

【表３】

【０１５４】

【表４】

【０１５５】実施例１９ 実施例１７でＳＰセファロース工程を用いずに精製され
た、精製ＴＭ溶液を用い、同イオン交換工程の溶出挙動
に影響を与える因子として、食塩濃度及びｐＨを変化さ
せ、混入異種蛋白除去効率に与える影響を調べた。用い
た溶媒条件は下記の通りであった。 １、食塩濃度０．１Ｍ、ｐＨ２．５、比伝導度１６ｍｓ
／ｃｍ ２、食塩濃度０．１Ｍ、ｐＨ３．０、比伝導度１３ｍｓ
／ｃｍ ３、食塩濃度０．１Ｍ、ｐＨ３．５、比伝導度１２ｍｓ
／ｃｍ ４、食塩濃度０．１Ｍ、ｐＨ４．０、比伝導度１１ｍｓ
／ｃｍ ５、食塩濃度０．１Ｍ、ｐＨ４．８、比伝導度１１ｍｓ
／ｃｍ ６、食塩濃度０．２５Ｍ、ｐＨ２．５、比伝導度３０ｍ
ｓ／ｃｍ ７、食塩濃度０．２５Ｍ、ｐＨ３．０、比伝導度２７ｍ
ｓ／ｃｍ ８、食塩濃度０．２５Ｍ、ｐＨ３．５、比伝導度２６ｍ
ｓ／ｃｍ ９、食塩濃度０．２５Ｍ、ｐＨ４．０、比伝導度２６ｍ
ｓ／ｃｍ １０、食塩濃度０．２５Ｍ、ｐＨ４．８、比伝導度２５
ｍｓ／ｃｍ １１、食塩濃度０．３Ｍ、ｐＨ２．５、比伝導度３４ｍ
ｓ／ｃｍ １２、食塩濃度０．３Ｍ、ｐＨ３．０、比伝導度３２ｍ
ｓ／ｃｍ １３、食塩濃度０．３Ｍ、ｐＨ３．５、比伝導度３１ｍ
ｓ／ｃｍ １４、食塩濃度０．３Ｍ、ｐＨ４．０、比伝導度３０ｍ
ｓ／ｃｍ １５、食塩濃度０．３Ｍ、ｐＨ４．８、比伝導度３０ｍ
ｓ／ｃｍ １６、食塩濃度０．３２Ｍ、ｐＨ２．５、比伝導度３６
ｍｓ／ｃｍ １７、食塩濃度０．３２Ｍ、ｐＨ３．０、比伝導度３４
ｍｓ／ｃｍ １８、食塩濃度０．３２Ｍ、ｐＨ３．５、比伝導度３２
ｍｓ／ｃｍ １９、食塩濃度０．３２Ｍ、ｐＨ４．０、比伝導度３１
ｍｓ／ｃｍ ２０、食塩濃度０．３２Ｍ、ｐＨ４．８、比伝導度３２
ｍｓ／ｃｍ

【０１５６】精製ＴＭ溶液各３２ｍｌを上記各条件に調
整した１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液に透析し、溶媒を
交換した。また同じ組成の各緩衝液で平衡化したＳＰ−
ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦカラム（直径１６ｍｍ、高さ５
ｍｍ）に供した。更に同緩衝液で洗浄を開始し、吸光度
２８０ｎｍのピーク立ち上がりから立ち下がりまでの素
通り画分を得、直ちに５００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ
７．３）でｐＨ７に中和し、中和した洗浄液を精製品と
して取得した。

【０１５７】得られた精製品に関して実施例１８と同様
にウシ血清成分及びマウス抗体成分の混入量を評価する
と共に、ＴＭの活性回収率を評価し、実質的に精製操作
が可能な条件範囲を決定した。その結果を表５に示し
た。

【０１５８】

【表５】

【０１５９】ウシ血清由来物およびマウス抗体由来物を
同時に除去でき、かつ良好なＴＭ活性回収率を達成でき
る条件は、０．２５〜０．３２Ｍ、好ましくは約０．３
Ｍ食塩濃度、即ち、２５〜３４ｍｓ／ｃｍ、好ましくは
約３１ｍｓ／ｃｍ前後の比伝導度の条件であり、ｐＨは
ｐＨ３．０〜４．０、好ましくはｐＨ約３．５の条件で
あった。

【０１６０】実施例２０ Ｅ４５６生産用細胞の作製 （１）プラスミドｐＳＶ２ＴＭＥ４５６の構築 実施例１記載の方法に従い、配列番号６に示すディリー
ターＴＭＤ２：５’−ＧＡＡＧＣＡＣＧＧＧＴＣＣＣＣ
ＣＡＧＧＣＣＧＧＣＣ−３’（２５ｍｅｒ）を用い、実
施例１−（１）で作製した組換え体プラスミドＭ１３Ｔ
ＭＤ１２３の１０５０塩基からなる部分の削除を行っ
た。得られた組換え体プラスミドをＭ１３ＴＭＥ４５６
Ｄ３と称した。更にこの組換え体プラスミドＭ１３ＴＭ
Ｅ４５６Ｄ３は、配列番号３のアミノ酸残基番号１の開
始コドン（ＡＴＧ）から１６のＧｌｙ及び、３６７から
５１６のアミノ酸からなるヒトトロンボモジュリンの部
分配列をコードする塩基配列を含有するＤＮＡ断片を有
することがわかった。さらに、配列番号７に示すディリ
ーターＴＭＤ２：５’−ＧＧＡＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＣ
ＡＧＴＣＧＧＴＧＣＣＡ−３’（２５ｍｅｒ）を用い、
Ｍ１３ＴＭＥ４５６Ｄ３の１０８塩基からなる部分の削
除を行った。得られた組換え体プラスミドをＭ１３ＴＭ
Ｅ４５６と称した。更にこの組換え体プラスミドＭ１３
ＴＭＥ４５６は、配列番号１に示す開始コドン（ＡＴ
Ｇ）とその下流に１３０個のアミノ酸からなるヒトトロ
ンボモジュリンの部分配列をコードする塩基配列を含有
するＤＮＡ断片を有することがわかった。この組換え体
プラスミドをＭ１３ＴＭＥ４５６に含まれるＤＮＡ断片
をＴＭＥ４５６と称した。

【０１６１】この組換え体プラスミドＭ１３ＴＭＥ４５
６をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで完全消化してＴ
ＭＤ１２３の約６００ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。一
方、プラスミドｐＳＶ２ＤＨＦＲ（ＡＴＣＣ ３７１４
６）をＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌIIで完全消化してベク
ター断片を得た。このベクター断片と、先のＤＮＡ断片
ＴＭＥ４５６とをＴ4 ＤＮＡリガーゼを用いて継ぎあわ
せ、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＥ４５６を得た。

【０１６２】（２）ＴＭＥ４５６製造用高生産細胞の樹
立 実施例１−（２）、（３）、（４）、（５）の方法に従
い、プラスミドｐＳＶ２ＴＭＥ４５６とプラスミドｐＳ
Ｖ２−ＤＨＦＲによるＣＨＯ細胞の形質転換、形質転換
したＣＨＯ細胞からＤＨＦＲ産生株の選択、Ｅ４５６生
産株の選択、ＭＴＸによるＥ４５６生産性の増幅を行
い、ＭＴＸ濃度の上昇により効率的にＥ４５６の生産性
が増幅され、２μＭＭＴＸ濃度で、約８ｐｇ／細胞・
日、２０μＭＭＴＸ濃度で、約１４ｐｇ／細胞・日、１
００μＭで４０ｐｇ／細胞・日という高生産の細胞株が
樹立された。また、実施例１−（６）の方法に従い、Ｅ
４５６生産が安定であることを確認し、更に実施例１−
（７）記載の方法に従い、浮遊培養馴化株を取得した。

【０１６３】実施例２１ ＴＭＥ４５６高生産細胞によるＴＭを製造する培養 実施例２に記載の方法に従い、ＴＭ製造用培地を調製し
た。また、ＴＭ生産細胞を増殖させる培養は、実施例３
に記載の方法に従い、後述するＴＭを製造する培養に必
要なスケール、細胞数を満たすような継代を行った。

【０１６４】（１）浮遊培養での繰り返しバッチ培養 実施例３記載の方法に従いＴＭを製造する培養を行っ
た。生産培養結果は、平均生細胞密度２．９×１０⁶ ｃ
ｅｌｌｓ／ｍｌで、平均生産性は５８ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ
であった。

【０１６５】（２）浮遊培養でのバッチ培養 実施例４記載の方法に従いＴＭを製造する培養を行っ
た。生産培養は１０日間培養し、到達生細胞密度２．０
×１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌで、累積生産性は３８ｍｇ／
Ｌであった。

【０１６６】（３）浮遊培養での連続培養 実施例５記載の方法に従いＴＭを製造する培養を行っ
た。生産培養結果は、平均生細胞密度１１．４×１０⁶
ｃｅｌｌｓ／ｍｌで、平均生産性は１３７ｍｇ／Ｌ／ｄ
ａｙであった。

【０１６７】（４）浮遊培養での連続培養 実施例６記載の方法に従いＴＭを製造する培養を行っ
た。生産培養結果は、平均生細胞密度１１．９×１０⁶
ｃｅｌｌｓ／ｍｌで、平均生産性は１２８ｍｇ／Ｌ／ｄ
ａｙであった。

【０１６８】（５）浮遊培養での連続培養 実施例７−（１）記載の方法に従いＴＭを製造する培養
を行った。生産培養結果は、平均生細胞密度１２．３×
１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌで、平均生産性は１３５ｍｇ／
Ｌ／ｄａｙであった。

【０１６９】（６）付着培養での繰り返しバッチ培養 実施例８記載の方法に従いＴＭを製造する培養を行っ
た。生産培養結果は、平均細胞密度はサイトデクス１使
用の培養で２．８×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍｌで、平均生
産性は４８ｍｇ／Ｌ／ｄａｙであり、また平均細胞密度
は旭化成マイクロキャリア使用の培養で６．２×１０⁶
ｃｅｌｌｓ／ｍｌで、平均生産性は８９ｍｇ／Ｌ／ｄａ
ｙであった。

【０１７０】実施例２２ ＴＭＥ４５６高生産細胞による培養上清の精製 （１）強陰イオン交換樹脂カラムによる粗精製 実施例２１−（１）で取得した−２０℃凍結培養上清５
Ｌを溶解し、０．２μｍのメンブレンフィルター（ミリ
ポア社、ミリパック２０）で濾過した。濾過した培養上
清については、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭト
リス塩緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ（ファルマシア社）カラム（直径９０ｍｍ、
高さ１１ｃｍ）に供した。次に１５０ｍＭ ＮａＣｌを
含む２０ｍＭトリス塩緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄を行
ない、３００ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩緩
衝液（ｐＨ７．４）で溶出を開始し、溶出液の吸光度２
８０ｎｍのピーク立ち上がりからの１．０カラムボリュ
ーム容量の溶出液を粗精製品として取得した。

【０１７１】（２）アフィニティーカラム（トロンビン
カラム）による主精製 実施例２２−（１）で得られた溶出画分４００ｍｌを１
００ｍＭ ＮａＣｌ及び０．５ｍＭ塩化カルシウムを含
む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析し
た。透析後、１００ｍＭ ＮａＣｌ及び０．５ｍＭ塩化
カルシウムを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．４）
で平衡化したＤＩＰ−トロンビン−アガロース（ＰＡＥ
ＳＥ ＬＯＲＥＩ社、０６−１４８−１０３５、直径５
０ｍｍ、高さ６ｃｍ）に供した。３００ｍＭ ＮａＣｌ
及び０．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス緩
衝液（ｐＨ７．４）で洗浄後、１．０Ｍ ＮａＣｌ及び
０．５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７．４）で溶出を開始し、溶出液の吸光度２８０
ｎｍのピーク立ち上がりから立ち下がりまでの溶出液を
主精製品として取得した。

【０１７２】（３）アフィニティーカラム（抗体Ａ）に
よる主精製 実施例１−（５）で作製した抗ＴＭモノクローナル（抗
体Ａ）を実施例１１に従いカラム化し、抗ＴＭモノクロ
ーナル（抗体Ａ）カラムを作製した。次いで、実施例２
２−（１）で得られた溶出画分４００ｍｌを、１．０Ｍ
ＮａＣｌ含む２０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．３）で
平衡化したモノクローナル抗体（抗体Ａ）カラム（直径
５０ｍｍ、高さ６ｃｍ）に供した。１．０Ｍ ＮａＣｌ
を含む２０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．３）を流し、更
に１００ｍＭ酢酸緩衝液を流し洗浄し、０．３Ｍ Ｎａ
Ｃｌ含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）
で溶出を開始し、溶出液の吸光度２８０ｎｍのピーク立
ち上がりから立ち下がりまでの溶出液を主精製品として
取得した。

【０１７３】（４）強陽イオン交換樹脂カラムによる高
純度精製 （４）−１ トロンビンカラム溶出液の精製 実施例２２−（２）で得られた溶出液２００ｍｌに１０
０ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）を加え希釈し
た液を、次に１．０Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．
０）でｐＨ３．５に調製した。この希釈ｐＨ調製した溶
出液を３００ｍＭＮａＣｌを含む１００ｍＭグリシン塩
酸緩衝液（比伝導度３１ｍｓ／ｃｍ、ｐＨ３．５）で平
衡化したＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（ファルマシア
社）カラム（直径２６ｍｍ、高さ３ｃｍ）に供した。３
００ｍＭ ＮａＣｌを含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝
液（比伝導度３１ｍｓ／ｃｍ、ｐＨ３．５）で洗浄を開
始し、吸光度２８０ｎｍのピーク立ち上がりから立ち下
がりまでの素通り画分を得、直ちに５００ｍＭりん酸緩
衝液（ｐＨ７．３）でｐＨ７に中和し、高純度精製品と
して取得した。

【０１７４】（４）−２ 抗体カラム溶出液の精製 実施例２２−（３）で得られた溶出液１８０ｍｌに１０
０ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）を加え希釈し
た液を、次に１．０Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．
０）でｐＨ３．５に調製した。この希釈、ｐＨ調製した
液を、３００ｍＭＮａＣｌを含む１００ｍＭグリシン塩
酸緩衝液（ｐＨ３．５）で平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅＦＦ（ファルマシア社）カラム（直径２６ｍ
ｍ、高さ３ｃｍ）に供した。３００ｍＭ ＮａＣｌを含
む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）で洗浄
を開始し、溶出液の吸光度２８０ｎｍのピーク立ち上が
りから立ち下がりまでの溶出液を得、直ちに５００ｍＭ
りん酸緩衝液（ｐＨ７．３）でｐＨ７に中和し、中和し
た溶出液を高純度精製品として取得した。

【０１７５】（５）ポリスルフォン中空糸による高純度
精製品の濃縮 実施例２２−（４）で得られた高純度精製品をそれぞ
れ、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭりん酸緩衝液
（ｐＨ７．３）で湿潤化した１ｍのポリスルフォン中空
糸（旭化成工業製）を用い濃縮し、それぞれ５ｍｌの濃
縮液を取得した。

【０１７６】（６）ゲル濾過カラムによる高純度精製品
の緩衝液交換 実施例２２−（５）で得られたそれぞれの濃縮液５ｍｌ
を、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭりん酸緩衝液
（ｐＨ７．３）で平衡化したそれぞれのＳｅｐａｈｃｒ
ｙｌ Ｓ−２００カラム（ファルマシア社、直径１６ｍ
ｍ、高さ９０ｃｍ）に供した。５０ｍＭ ＮａＣｌを含
む２０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．３）で展開し分画し
た。各画分は実施例１−（４）−ａ記載のトロンビンに
よるプロテインＣ活性化を促進する活性の測定法方によ
り活性の確認を行ない活性画分を回収し緩衝液交換した
高純度精製品を取得した。

【０１７７】実施例２３ 凍結した生産培養上清、すなわち実施例２１−（２）の
培養上清、実施例２２−（３）の培養上清，実施例２２
−（４）の培養上清、実施例２２−（５）の培養上清、
実施例２２−（６）の培養付着担体としてサイトデクス
を用いた培養の培養上清、そして実施例８の培養付着担
体として旭化成マイクロキャリアを用いた培養の培養上
清それぞれを、精製の出発材料にした。精製は、実施例
２２−（１）のイオン交換クロマトによる粗精製を行な
い、次に粗精製品を実施例２２−（３）のアフィニティ
ークロマトで主精製した。そして主精製品を実施例２２
−（４）−２のイオン交換クロマトで高純度精製し、実
施例２２−（５）の濃縮方法で高純度精製品を濃縮し、
実施例２２−（６）のゲル濾過を行ない緩衝液置換され
た高純度精製品を得た。

【０１７８】実施例２４ 高純度精製品の物性 実施例２３で得られた緩衝液置換された高純度精製品に
ついて、以下の検討をした。高純度精製品は、界面活性
剤の非存在下でｐＨ中性の注射用蒸留水に少なくとも１
０ｍｇ／ｍｌは溶解せしめることができた。

【０１７９】また、高純度精製品を、還元、非還元の両
条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行ない、クマシー染
色でにより検出した結果、還元で約２６ｋＤａ、非還元
で約２１−２４ｋＤａの１本のバンドが検出された。ま
た、パーキンエルマー社製のプロテインシーケンサーＰ
ｒｏｃｉｓｅ４９２型を用いて、パルスリキッド法で、
高純度精製品のＮ末端アミノ酸解析を行なった。その結
果、Ｎ末端のアミノ酸は全ての高純度精製品サンプルで
アスパラギンから始まる１種類の蛋白からなり、これは
配列番号１の１７−１３０に相当するアミノ酸配列と考
えられた。またいずれの高純度精製品についても、ウシ
血清由来物、マウス抗体由来物の混入量は検出限界以下
であった。

【０１８０】実施例２５ 高純度精製品の凍結乾燥 注射用蒸留水２ｍｌあたり１ｍｇの実施例１７で得られ
た高純度ＴＭを含む溶液を調製した。このＴＭ溶液にマ
ンニトール１０ｍｇを添加した。また別にこのＴＭ溶液
にアルギニン−塩酸塩０．１ｍｍｏｌを添加した。これ
らの溶液を２ｍｌずつガラスバイアル瓶に分注し、凍結
乾燥を行った。凍結乾燥は−４０℃で１８時間予備凍結
し、−４０〜＋２０℃、真空度０．０５〜０．０１ｍｍ
Ｈｇで４０時間一次乾燥し、ついで２０℃、真空度０．
０５〜０．０１ｍｍＨｇで６時間二次乾燥した。得られ
た凍結乾燥品は、紙箱内で遮光保存した。場合によって
は、褐色ガラスバイアルを用いる。

【０１８１】

【発明の効果】本発明は、抗血液凝固剤あるいは血栓溶
解剤等として有効な医薬品となりうる可溶性トロンボモ
ジュリンの製造において、血清由来物および抗体由来を
実質的に含まない、高純度トロンボモジュリンの製造方
法を提供できる。そして、その培地を用いるトロンボモ
ジュリンの製造方法を提供できる。

【０１８２】

【配列表】 <110> 旭化成工業株式会社 <120> 高純度可溶性トロンボモジュリンの製造方法 <150> 日本 平成１０年特許願第８４３８９号 <151> 平成１０年３月３０日 <160> 7 <210> 1 <211> 390 <212> RNA <213> ヒト(human) <220> <221> CDS <222> (1)...(390) <400> 1 atg ctt ggg gtc ctg gtc ctt ggc gcg ctg gcc ctg gcc ggc ctg ggg 48 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15 gac ccg tgc ttc aga gcc aac tgc gag tac cag tgc cag ccc ctg aac 96 Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn 20 25 30 caa act agc tac ctc tgc gtc tgc gcc gag ggc ttc gcg ccc att ccc 144 Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro 35 40 45 cac gag ccg cac agg tgc cag atg ttt tgc aac cag act gcc tgt cca 192 His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro 50 55 60 gcc gac tgc gac ccc aac acc cag gct agc tgt gag tgc cct gaa ggc 240 Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly 65 70 75 80 tac atc ctg gac gac ggt ttc atc tgc acg gac atc gac gag tgc gaa 288 Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu 85 90 95 aac ggc ggc ttc tgc tcc ggg gtg tgc cac aac ctc ccc ggt acc ttc 336 Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe 100 105 110 gag tgc atc tgc ggg ccc gac tcg gcc ctt gtc cgc cac att ggc acc 384 Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr 115 120 125 gac tgt 390 Asp Cys <210> 2 <211> 390 <212> RNA <213> ヒト(human) <220> <221> CDS <222> (1)...(390) <400> 2 atg ctt ggg gtc ctg gtc ctt ggc gcg ctg gcc ctg gcc ggc ctg ggg 48 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15・ gac ccg tgc ttc aga gcc aac tgc gag tac cag tgc cag ccc ctg aac 96 Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn 20 25 30・ caa act agc tac ctc tgc gtc tgc gcc gag ggc ttc gcg ccc att ccc 144 Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro 35 40 45・ cac gag ccg cac agg tgc cag atg ttt tgc aac cag act gcc tgt cca 192 His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro 50 55 60・ gcc gac tgc gac ccc aac acc cag gct agc tgt gag tgc cct gaa ggc 240 Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly 65 70 75 80 tac atc ctg gac gac ggt ttc atc tgc acg gac atc gac gag tgc gaa 288 Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu 85 90 95 aac ggc ggc ttc tgc tcc ggg gtg tgc cac aac ctc ccc ggt acc ttc 336 Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe 100 105 110 gag tgc atc tgc ggg ccc gac tcg gcc ctt gcc cgc cac att ggc acc 384 Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Ala Arg His Ile Gly Thr 115 120 125・ gac tgt 390 Asp Cys <210> 3 <211> 1548 <212> RNA <213> ヒト(human) <220) <221> CDS <222> (1)...(1548) <400> 3 atg ctt ggg gtc ctg gtc ctt ggc gcg ctg gcc ctg gcc ggc ctg ggg 48 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15 ttc ccc gca ccc gca gag ccg cag ccg ggt ggc agc cag tgc gtc gag 96 Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu 20 25 30 cac gac tgc ttc gcg ctc tac ccg ggc ccc gcg acc ttc ctc aat gcc 144 His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala 35 40 45・ agt cag atc tgc gac gga ctg cgg ggc cac cta atg aca gtg cgc tcc 192 Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser 50 55 60・ tcg gtg gct gcc gat gtc att tcc ttg cta ctg aac ggc gac ggc ggc 240 Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly 65 70 75 80 gtt ggc cgc cgg cgc ctc tgg atc ggc ctg cag ctg cca ccc ggc tgc 288 Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys 85 90 95 ggc gac ccc aag cgc ctc ggg ccc ctg cgc ggc ttc cag tgg gtt acg 336 Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr 100 105 110 gga gac aac aac acc agc tat agc agg tgg gca cgg ctc gac ctc aat 384 Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn 115 120 125 ggg gct ccc ctc tgc ggc ccg ttg tgc gtc gct gtc tcc gct gct gag 432 Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu 130 135 140 gcc act gtg ccc agc gag ccg atc tgg gag gag cag cag tgc gaa gtg 480 Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val 145 150 155 160 aag gcc gat ggc ttc ctc tgc gag ttc cac ttc cca gcc acc tgc agg 528 Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg 165 170 175 cca ctg gct gtg gag ccc ggc gcc gcg gct gcc gcc gtc tcg atc acc 576 Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr 180 185 190 tac ggc acc ccg ttc gcg gcc cgc gga gcg gac ttc cag gcg ctg ccg 624 Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro 195 200 205 gtg ggc agc tcc gcc gcg gtg gct ccc ctc ggc tta cag cta atg tgc 672 Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys 210 215 220 acc gcg ccg ccc gga gcg gtc cag ggg cac tgg gcc agg gag gcg ccg 720 Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro 225 230 235 240 ggc gct tgg gac tgc agc gtg gag aac ggc ggc tgc gag cac gcg tgc 768 Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys 245 250 255 aat gcg atc cct ggg gct ccc cgc tgc cag tgc cca gcc ggc gcc gcc 816 Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala 260 265 270 ctg cag gca gac ggg cgc tcc tgc acc gca tcc gcg acg cag tcc tgc 864 Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys 275 280 285 aac gac ctc tgc gag cac ttc tgc gtt ccc aac ccc gac cag ccg ggc 912 Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly 290 295 300 tcc tac tcg tgc atg tgc gag acc ggc tac cgg ctg gcg gcc gac caa 960 Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln 305 310 315 320 cac cgg tgc gag gac gtg gat gac tgc ata ctg gag ccc agt ccg tgt 1008 His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys 325 330 335 ccg cag cgc tgt gtc aac aca cag ggt ggc ttc gag tgc cac tgc tac 1056 Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr 340 345 350 cct aac tac gac ctg gtg gac ggc gag tgt gtg gag ccc gtg gac ccg 1104 Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro 355 360 365 tgc ttc aga gcc aac tgc gag tac cag tgc cag ccc ctg aac caa act 1152 Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr 370 375 380 agc tac ctc tgc gtc tgc gcc gag ggc ttc gcg ccc att ccc cac gag 1200 Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu 385 390 395 400 ccg cac agg tgc cag atg ttt tgc aac cag act gcc tgt cca gcc gac 1248 Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp 405 410 415 tgc gac ccc aac acc cag gct agc tgt gag tgc cct gaa ggc tac atc 1296 Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile 420 425 430 ctg gac gac ggt ttc atc tgc acg gac atc gac gag tgc gaa aac ggc 1344 Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly 435 440 445 ggc ttc tgc tcc ggg gtg tgc cac aac ctc ccc ggt acc ttc gag tgc 1392 Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys 450 455 460・ atc tgc ggg ccc gac tcg gcc ctt gtc cgc cac att ggc acc gac tgt 1440 Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 465 470 475 480 gac tcc ggc aag gtg gac ggt ggc gac agc ggc tct ggc gag ccc ccg 1488 Asp Ser Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro 485 490 495 ccc agc ccg acg ccc ggc tcc acc ttg act cct ccg gcc gtg ggg ctc 1536 Pro Ser Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu 500 505 510 gtg cat tcg ggc 1548 Val His Ser Gly <210> 4 <211> 1548 <212> RNA <213> ヒト(human) <220> <221> CDS <222> (1)...(1548) <400> 4 atg ctt ggg gtc ctg gtc ctt ggc gcg ctg gcc ctg gcc ggc ctg ggg 48 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15 <222> (1)...(1548) <400> 3 cac gac tgc ttc gcg ctc tac ccg ggc ccc gcg acc ttc ctc aat gcc 144 His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala 35 40 45 agt cag atc tgc gac gga ctg cgg ggc cac cta atg aca gtg cgc tcc 192 Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser 50 55 60 tcg gtg gct gcc gat gtc att tcc ttg cta ctg aac ggc gac ggc ggc 240 Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly 65 70 75 80 gtt ggc cgc cgg cgc ctc tgg atc ggc ctg cag ctg cca ccc ggc tgc 288 Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys 85 90 95 ggc gac ccc aag cgc ctc ggg ccc ctg cgc ggc ttc cag tgg gtt acg 336 Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr 100 105 110 gga gac aac aac acc agc tat agc agg tgg gca cgg ctc gac ctc aat 384 Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn 115 120 125 ggg gct ccc ctc tgc ggc ccg ttg tgc gtc gct gtc tcc gct gct gag 432 Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu 130 135 140 gcc act gtg ccc agc gag ccg atc tgg gag gag cag cag tgc gaa gtg 480 Ala Thr Val Pro Ser Glu Pro Ile Trp Glu Glu Gln Gln Cys Glu Val 145 150 155 160 aag gcc gat ggc ttc ctc tgc gag ttc cac ttc cca gcc acc tgc agg 528 Lys Ala Asp Gly Phe Leu Cys Glu Phe His Phe Pro Ala Thr Cys Arg 165 170 175 cca ctg gct gtg gag ccc ggc gcc gcg gct gcc gcc gtc tcg atc acc 576 Pro Leu Ala Val Glu Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser Ile Thr 180 185 190 tac ggc acc ccg ttc gcg gcc cgc gga gcg gac ttc cag gcg ctg ccg 624 Tyr Gly Thr Pro Phe Ala Ala Arg Gly Ala Asp Phe Gln Ala Leu Pro 195 200 205 gtg ggc agc tcc gcc gcg gtg gct ccc ctc ggc tta cag cta atg tgc 672 Val Gly Ser Ser Ala Ala Val Ala Pro Leu Gly Leu Gln Leu Met Cys 210 215 220 acc gcg ccg ccc gga gcg gtc cag ggg cac tgg gcc agg gag gcg ccg 720 Thr Ala Pro Pro Gly Ala Val Gln Gly His Trp Ala Arg Glu Ala Pro 225 230 235 240 ggc gct tgg gac tgc agc gtg gag aac ggc ggc tgc gag cac gcg tgc 768 Gly Ala Trp Asp Cys Ser Val Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Ala Cys 245 250 255 aat gcg atc cct ggg gct ccc cgc tgc cag tgc cca gcc ggc gcc gcc 816 Asn Ala Ile Pro Gly Ala Pro Arg Cys Gln Cys Pro Ala Gly Ala Ala 260 265 270 ctg cag gca gac ggg cgc tcc tgc acc gca tcc gcg acg cag tcc tgc 864 Leu Gln Ala Asp Gly Arg Ser Cys Thr Ala Ser Ala Thr Gln Ser Cys 275 280 285 aac gac ctc tgc gag cac ttc tgc gtt ccc aac ccc gac cag ccg ggc 912 Asn Asp Leu Cys Glu His Phe Cys Val Pro Asn Pro Asp Gln Pro Gly 290 295 300 tcc tac tcg tgc atg tgc gag acc ggc tac cgg ctg gcg gcc gac caa 960 Ser Tyr Ser Cys Met Cys Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Ala Ala Asp Gln 305 310 315 320 cac cgg tgc gag gac gtg gat gac tgc ata ctg gag ccc agt ccg tgt 1008 His Arg Cys Glu Asp Val Asp Asp Cys Ile Leu Glu Pro Ser Pro Cys 325 330 335 ccg cag cgc tgt gtc aac aca cag ggt ggc ttc gag tgc cac tgc tac 1056 Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Gly Phe Glu Cys His Cys Tyr 340 345 350 cct aac tac gac ctg gtg gac ggc gag tgt gtg gag ccc gtg gac ccg 1104 Pro Asn Tyr Asp Leu Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro 355 360 365 tgc ttc aga gcc aac tgc gag tac cag tgc cag ccc ctg aac caa act 1152 Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr 370 375 380 agc tac ctc tgc gtc tgc gcc gag ggc ttc gcg ccc att ccc cac gag 1200 Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu 385 390 395 400 ccg cac agg tgc cag atg ttt tgc aac cag act gcc tgt cca gcc gac 1248 Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp 405 410 415 tgc gac ccc aac acc cag gct agc tgt gag tgc cct gaa ggc tac atc 1296 Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile 420 425 430 ctg gac gac ggt ttc atc tgc acg gac atc gac gag tgc gaa aac ggc 1344 Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly 435 440 445 ggc ttc tgc tcc ggg gtg tgc cac aac ctc ccc ggt acc ttc gag tgc 1392 Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys 450 455 460 atc tgc ggg ccc gac tcg gcc ctt gcc cgc cac att ggc acc gac tgt 1440 Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Ala Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 465 470 475 480 gac tcc ggc aag gtg gac ggt ggc gac agc ggc tct ggc gag ccc ccg 1488 Asp Ser Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro 485 490 495 ccc agc ccg acg ccc ggc tcc acc ttg act cct ccg gcc gtg ggg ctc 1536 Pro Ser Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu 500 505 510 gtg cat tcg ggc 1548 Val His Ser Gly <210> 5 <211> 25 <212> RNA <400> 5 ggaggccgct cagcccgaat gcacg 25 <210> 6 <211> 25 <212> RNA <400> 6 gaagcacggg tcccccaggc cggcc 25 <210> 7 <211> 25 <212> RNA <400> 7 ggaggccgct caacagtcgg tgcca 25

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例２における浮遊生細胞密度（×
１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）の経時変化を示すグラフであ
る。

【図２】本発明の実施例２におけるＴＭの累積生産量
（ｍｇ）の経時変化を示すグラフである。

【図３】本発明の実施例２におけるＴＭの比生産速度
（ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ）の経時変化を示すグラフで
ある。

【図４】本発明の実施例２におけるＴＭの浮遊生細胞密
度（×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に対する比生産速度
（ｐｇ／ｃｅｌｌ／ｄａｙ）の変化を示すグラフであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 高純度可溶性トロンボモジュリンの製造
   方法において、（１）可溶性トロンボモジュリンおよび
   血清成分を含有する未精製上清を得、（２）得られた該
   上清を、該可溶性トロンボモジュリンに対する抗体と接
   触させた後、溶出させる工程により、精製された該可溶
   性トロンボモジュリン溶液を得、更に、（３）得られた
   該可溶性トロンボモジュリンを、比伝導度２５〜３４ｍ
   ｓ／ｃｍ、ｐＨ３〜４の条件下にて、陽イオン交換体と
   接触させる工程において、素通り画分として該可溶性ト
   ロンボモジュリンを取得する、ことを特徴とする血清由
   来物及び抗体由来物を実質的に含有しない高純度可溶性
   トロンボモジュリンの製造方法。
2. 【請求項２】 該未精製上清が、可溶性トロンボモジュ
   リンを生産し得る動物細胞を、血清成分を含有する培地
   を用いて培養して調製された培養上清である請求項１に
   記載の製造方法。
3. 【請求項３】 該血清成分が、ウシ血清成分である請求
   項１または２に記載の製造方法。
4. 【請求項４】 該可溶性トロンボモジュリンに対する抗
   体が、マウス抗ヒトトロンボモジュリンモノクローナル
   抗体である請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
5. 【請求項５】 該陽イオン交換体が、スルホプロピル基
   を有するカラムクロマトグラフィー用担体である請求項
   １〜４のいずれかに記載の製造方法。
6. 【請求項６】 該血清成分を含有する培地が、下記の成
   分表１に記載された成分から実質的になる培地である請
   求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。 【化１】
7. 【請求項７】 該血清成分を含有する培地の成分の組成
   比率が下記の成分表２に記載の組成比率の培地である請
   求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。 【化２】
8. 【請求項８】 該可溶性トロンボモジュリンを生産し得
   る動物細胞が、配列番号１の１７−１３０位のアミノ酸
   配列、配列番号２の１７−１３０位のアミノ酸配列、及
   びそれらアミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が欠失、
   置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる群より選
   ばれたいずれかのアミノ酸配列を含有するアミノ酸配列
   をコードする遺伝子を導入して得られた形質転換体であ
   る請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
9. 【請求項９】 該可溶性トロンボモジュリンを生産し得
   る動物細胞が、配列番号１の１−１３０位のアミノ酸配
   列、配列番号２の１−１３０位のアミノ酸配列、配列番
   号３の１−５１６位のアミノ酸配列、配列番号４の１−
   ５１６位のアミノ酸配列、及びそれらアミノ酸配列の１
   又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
   ミノ酸配列からなる群より選ばれたいずれかのアミノ酸
   配列をコードする遺伝子を導入して得られた形質転換体
   である請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
10. 【請求項１０】 下記の成分表１に記載された成分から
    実質的になるトロンボモジュリン製造用培地。 【化３】