JP5117486B2

JP5117486B2 - 高純度可溶性トロンボモジュリンの製造方法

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Description

本発明は、酸性下において生成し得る可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含有しない高純度可溶性トロンボモジュリンの製造方法に関する。

技術背景

トロンボモジュリンは、トロンビンと特異的に結合しトロンビンの血液凝固活性を阻害すると同時にトロンビンのプロテインＣ活性化能を著しく促進する作用を有する物質として知られ、強力な血液凝固阻害作用を有することが知られている。トロンビンによる凝固時間を延長することや、トロンビンによる血小板凝集を抑制することが知られている。プロテインＣは、血液凝固線溶系において重要な役割を演じているビタミンＫ依存性の蛋白質であり、トロンビンの作用により活性化され、活性化プロテインＣとなる。この活性化プロテインＣは、生体内で血液凝固系因子の活性型第Ｖ因子、及び活性型第ＶＩＩＩ因子を失活させ、また血栓溶解作用を有するプラスミノゲンアクチベーターの産生に関与していることが知られている（非特許文献１）。したがって、トロンボモジュリンは、このトロンビンによるプロテインＣの活性化を促進して抗血液凝固剤又は血栓溶解剤として有用であるとされており、凝固亢進を伴う疾患の治療、予防に有効であるという動物実験についての報告もある（非特許文献２）。

従来、トロンボモジュリンは、ヒトをはじめとする種々の動物種の血管内皮細胞上に発現している糖蛋白質として発見取得され、その後、クローニングに成功した。即ち、遺伝子工学的手法を用いてヒト肺ｃＤＮＡライブラリーからシグナルペプチドを含むヒトトロンボモジュリン前駆体の遺伝子をクローニングし、そしてトロンボモジュリンの全遺伝子配列を解析し、シグナルペプチド（通常は、１８アミノ酸残基が例示される）を含む５７５残基のアミノ酸配列が明らかにされている（特許文献１）。シグナルペプチドが切断されたマチュアなトロンボモジュリンは、そのマチュアなペプチドのＮ末端側よりＮ末端領域（１−２２６番目：シグナルペプチドが１８アミノ酸残基であると考えた場合の位置表示、以下同じ）、６つのＥＧＦ様構造をもつ領域（２２７−４６２番目）、Ｏ型糖鎖付加領域（４６３−４９８番目）、膜貫通領域（４９９−５２１番目）、そして細胞質内領域（５２２−５５７番目）の５つの領域から構成されており、そして全長のトロンボモジュリンと同じ活性を有する部分（すなわち、最小活性単位）としては、６つのＥＧＦ様構造を持つ領域のうち、主にはＮ末端側から４，５，６番目のＥＧＦ様構造からなる部分であることが知られている（非特許文献３）。

全長のトロンボモジュリンは界面活性剤の存在下でないと溶解し難く、製剤としては界面活性剤の添加が必須であるのに対して、界面活性剤の非存在下でもきれいに溶解することができる可溶性トロンボモジュリンが存在する。可溶性トロンボモジュリンは、少なくとも、膜貫通領域の一部又は全部を含有せしめないように調製すればよく、例えば、Ｎ末端領域と６つのＥＧＦ様構造をもつ領域とＯ型糖鎖付加領域の３つの領域のみからなる（即ち、配列番号１の第１９〜５１６位のアミノ酸配列からなる）可溶性トロンボモジュリンは、組換え技術の応用により取得できること、そしてその組換え体可溶性トロンボモジュリンは、天然のトロンボモジュリンの活性を有していることが確認されている（特許文献１）。他に可溶性トロンボモジュリンの例としていくつかの報告がある（特許文献２〜９）。あるいは天然型としてヒト尿由来の可溶性トロンボモジュリン等も例示される（特許文献１０、１１）。

因みに、遺伝子においては、自然の変異又は取得時の変異により、多くのケースで認められる通り、ヒトにおいても多型性の変異が見つけられており、上述の５７５残基のアミノ酸配列からなるヒトトロンボモジュリン前駆体の第４７３位のアミノ酸においてＶａｌであるものと、Ａｌａであるものが現在確認されている。このアミノ酸をコードする塩基配列においては、第１４１８位において、それぞれＴとＣとの変異に相当する（非特許文献４）。しかし、活性及び物性においては、全く相違なく、両者は実質的に同一と判断できる。

トロンボモジュリンはＤＩＣの治療において効果があることが報告されている（非特許文献５）。トロンボモジュリンの用途としては上述の他に、例えば、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）、血栓症、末梢血管閉塞症、閉塞性動脈硬化症、血管炎、心臓手術に続発する機能性障害、臓器移植の合併症、狭心症、一過性脳虚血発作、妊娠中毒症、糖尿病、肝ＶＯＤ（Ｌｉｖｅｒｖｅｎｏ−ｏｃｃｌｕｓｉｖｅｄｉｓｅａｓｅ；劇症肝炎や骨髄移植後の肝静脈閉塞症）、深部静脈血栓症（ＤＶＴ；Ｄｅｅｐｖｅｎｏｕｓｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）等や、さらには成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ；Ａｄｕｌｔｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｄｉｓｔｒｅｓｓｓｙｎｄｒｏｍｅ）の疾患の治療及び予防に用いられることが期待されている。

トロンボモジュリンの変性体としては、凍結乾燥工程において生成される凝集体及び凍結乾燥状態において長期保存中に生成される凝集体が知られている（特許文献１２〜１６）。

医薬品への利用を考え、工業的レベルとして可溶性トロンボモジュリンを製造する方法としては、例えば精製工程としてトロンボモジュリンに対する抗体を担持させたアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法、更にアフィニティークロマトグラフィーにより得られた該可溶性トロンボモジュリンを、比伝導度２５〜３４ｍｓ／ｃｍ、ｐＨ３〜４の条件下にて、陽イオン交換体と接触させる工程において、素通り画分として該可溶性トロンボモジュリンを取得することを特徴とする血清由来物及び抗体由来物を実質的に含有しない高純度可溶性トロンボモジュリンの製造方法（特許文献１７）、人尿トロンボモジュリン含有試料をトロンビン結合アフィニティークロマトグラフィーで予備精製し、次いでヒドロキシアパタイトを吸着剤とする吸着クロマトグラフィーで精製することを特徴とするトロンボモジュリンの精製方法（特許文献１８）が知られている。

特開昭６４−６２１９号公報特開平２−２５５６９９号公報特開平３−１３３３８０号公報特開平３−２５９０８４号公報特開平４−２１０７００号公報特開平５−２１３９９８号公報ＷＯ９２／００３２５号公報ＷＯ９２／０３１４９号公報ＷＯ９３／１５７５５号公報特開平３−８６９００号公報特開平３−２１８３９９号公報特開平６−３２１０８５号公報特許第３００７７８５号公報特開平１１−１７１７９０号公報Ｗ０９５／１６４６０号公報特許第３８２２３８３号公報特開平１１−３４１９９０号公報特許第３７４５８０５号公報鈴木宏治、医学のあゆみ、第１２５巻、９０１頁（１９８３年）Ｋ．ＧｏｍｉらＢｌｏｏｄ７５．１３９６−１３９９（１９９０）Ｍ．Ｚｕｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４６，１０３５１−１０３５３（１９８９）Ｄ．Ｚ．Ｗｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６，４３５０−４３５７（１９８７）Ｓ．Ｍ．Ｂａｔｅｓら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１４４，１０１７−１０２８（２００５）

本発明の課題は、可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まないトロンボモジュリンを生産性高く製造する方法を提供することにある。

本発明者らは、工業的レベルとして可溶性トロンボモジュリンを製造する過程において、また、酸性下においてウイルス不活化する工程を含む製造方法により可溶性トロンボモジュリンを製造する過程において、可溶性トロンボモジュリンを酸性下においた場合に該可溶性トロンボモジュリンの変性体が生成され、これを効率良く除去する必要があるという新規な課題を見出した。本発明者らは、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を除去するために、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＦＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）等の使用を検討した。しかし、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＦＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、処理容量が少なく、一般的にはカラム容積の５％以下のため、カラム容積が大きくなるか、複数のサイクルを必要とすることを見出した。また、効率を上げる方法としては、クロマト線速を速くすることが考えられるが、線速を速くすることは分離能力を低下させるので適当でないと考えられる。さらに、他の方法として処理タンパク質濃度を高くすることが考えられるが、タンパク質濃度を高くする濃縮工程の増加と、高いタンパク濃度による高い粘性を要因とする分離能力の低減等の問題がある。

そこで本発明者は、上記新規な課題に基づき、工業的レベルとして可溶性トロンボモジュリンを製造するためには、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を上記問題を解決した生産性の高い方法で分離することが重要であると考えた。本発明者は、上記新規な課題を解決するため、種々のクロマトグラフィー担体にて種々の条件を鋭意検討した結果、担体としてアニオン交換体又はハイドロキシアパタイトを用い、それぞれの担体において適切な条件を見出すことで、効率的かつ安定的に該可溶性トロンボモジュリンの変性体を分離する方法を見出すことに成功した。

すなわち本発明としては以下のものが挙げられる。
〔Ａ１〕可溶性トロンボモジュリンから酸性下において生成し得る該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを製造する方法であって、（１）該可溶性トロンボモジュリンの変性体を含むか、含むことが疑われる該可溶性トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体又はヒドロキシアパタイトに供する工程、及び（２）該可溶性トロンボモジュリンと該可溶性トロンボモジュリンの変性体とが分離し得る分離条件にて該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する画分を取得する工程を含む、該製造方法。

〔Ａ２〕可溶性トロンボモジュリンから酸性下において生成し得る該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを製造する方法であって、（０）該可溶性トロンボモジュリンをｐＨ５以下の酸性下におく工程、（１）前記（０）の工程を経て得られた、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を含むか、含むことが疑われる該可溶性トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体又はヒドロキシアパタイトに供する工程、及び（２）該可溶性トロンボモジュリンと該可溶性トロンボモジュリンの変性体とが分離し得る分離条件にて該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する画分を取得する工程を含む、前記〔Ａ１〕に記載の製造方法。
〔Ａ２−２〕可溶性トロンボモジュリンから酸性下において生成し得る該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを製造する方法であって、（＊）可溶性トロンボモジュリンを精製する工程、（０）該可溶性トロンボモジュリンをｐＨ５以下の酸性下におく工程、（１）前記（０）の工程を経て得られた、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を含むか、含むことが疑われる該可溶性トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体又はヒドロキシアパタイトに供する工程、及び（２）該可溶性トロンボモジュリンと該可溶性トロンボモジュリンの変性体とが分離し得る分離条件にて該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する画分を取得する工程を含む、前記〔Ａ１〕に記載の製造方法。
〔Ａ２−３〕該可溶性トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体又はヒドロキシアパタイトに供する工程が、該可溶性トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体に供する工程である前記〔Ａ１〕、〔Ａ２〕、又は〔Ａ２−２〕のいずれかに記載の製造方法。
〔Ａ２−４〕該可溶性トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体又はヒドロキシアパタイトに供する工程が、該可溶性トロンボモジュリン含有物をヒドロキシアパタイトに供する工程である前記〔Ａ１〕、〔Ａ２〕、又は〔Ａ２−２〕のいずれかに記載の製造方法。

〔Ａ３〕可溶性トロンボモジュリンが、可溶性トロンボモジュリン含有物中の全蛋白に対する含有率が８０％以上の可溶性トロンボモジュリンである、前記〔Ａ１〕〜〔Ａ２−４〕のいずれかに記載の製造方法。
なお、上記〔Ａ１〕〜〔Ａ２−４〕のように引用する項番号が範囲で示され、その範囲内に〔Ａ２−２〕等の枝番号を有する項が配置されている場合には、〔Ａ２−２〕等の枝番号を有する項も引用されることを意味する。以下においても同様である。
〔Ａ３−２〕可溶性トロンボモジュリンが、可溶性トロンボモジュリン含有物中の全蛋白に対する含有率が９０％以上の可溶性トロンボモジュリンである、前記〔Ａ１〕〜〔Ａ２−４〕のいずれかに記載の製造方法。
〔Ａ３−３〕可溶性トロンボモジュリンが、可溶性トロンボモジュリン含有物中の全蛋白に対する含有率が９５％以上の可溶性トロンボモジュリンである、前記〔Ａ１〕〜〔Ａ２−４〕のいずれかに記載の製造方法。
〔Ａ３−４〕可溶性トロンボモジュリンが、可溶性トロンボモジュリン含有物中の全蛋白に対する含有率が９９％以上の可溶性トロンボモジュリンである、前記〔Ａ１〕〜〔Ａ２−４〕のいずれかに記載の製造方法。

〔Ａ４〕（２）の工程が、リニア若しくはステップワイズ、又はリニアとステップワイズを組み合わせたグラジエント溶出を行い、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を取得する工程である前記〔Ａ１〕〜〔Ａ３−４〕のいずれかに記載の製造方法。
なお、上記〔Ａ１〕〜〔Ａ３−４〕のように引用する項番号が範囲で示され、その範囲内に〔Ａ３−２〕等の枝番号を有する項が配置されている場合には、〔Ａ３−２〕等の枝番号を有する項も引用されることを意味する。以下においても同様である。
〔Ａ５〕（２）の工程が、素通り画分を取得する工程であって、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する画分を取得する工程である前記〔Ａ１〕〜〔Ａ３−４〕のいずれかに記載の製造方法。
〔Ａ６〕（２）の工程が、アイソクラティック溶出を行い、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を取得する工程である前記〔Ａ１〕〜〔Ａ３−４〕のいずれかに記載の製造方法。

〔Ａ７〕（１）の工程が、ｐＨが４〜９の緩衝液を使用して該可溶性トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体に供する工程であって、（２）の工程が、ｐＨが５〜９かつ塩濃度が０〜１Ｍの緩衝液を使用してリニア若しくはステップワイズ、又はリニアとステップワイズを組み合わせたグラジエント溶出を行い、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を、（ａ）可溶性トロンボモジュリンが溶出する画分の位置を予め確認しておき取得する工程、又は（ｂ）溶出画分に可溶性トロンボモジュリンが存在することを確認しながら取得する工程である前記〔Ａ１〕〜〔Ａ３−４〕のいずれかに記載の製造方法。
〔Ａ７−２〕（ａ）又は（ｂ）の工程が、（ａ）の工程である前記〔Ａ７〕に記載の製造方法。
〔Ａ７−３〕（ａ）又は（ｂ）の工程が、（ｂ）の工程である前記〔Ａ７〕に記載の製造方法。

〔Ａ８〕（１）の工程が、ｐＨが５〜８かつ塩濃度が０．１〜０．２Ｍの緩衝液を使用して該可溶性トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体に供する工程であって、（２）の工程が、ｐＨが５〜８かつ塩濃度が０．１〜０．２Ｍの緩衝液を使用して素通り画分を取得することにより該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する画分を取得する工程である前記〔Ａ１〕〜〔Ａ３−４〕のいずれかに記載の製造方法。

〔Ａ９〕（１）の工程が、ｐＨが６〜９かつリン酸塩濃度が８ｍＭ以下である緩衝液を使用して可溶性トロンボモジュリン含有物をヒドロキシアパタイトに供する工程であって、（２）の工程が、ｐＨが６〜９かつリン酸塩濃度が０〜０．５Ｍの緩衝液を使用してリニア若しくはステップワイズ、又はリニアとステップワイズを組み合わせたグラジエント溶出を行い、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を、（ａ）可溶性トロンボモジュリンが溶出する画分の位置を予め確認しておき取得する工程、又は（ｂ）溶出画分に可溶性トロンボモジュリンが存在することを確認しながら取得する工程である前記〔Ａ１〕〜〔Ａ３−４〕のいずれかに記載の製造方法。
〔Ａ９−２〕（ａ）又は（ｂ）の工程が、（ａ）の工程である前記〔Ａ９〕に記載の製造方法。
〔Ａ９−３〕（ａ）又は（ｂ）の工程が、（ｂ）の工程である前記〔Ａ９〕に記載の製造方法。

〔Ａ１０〕（１）の工程が、ｐＨが６〜９かつリン酸塩濃度が５〜２０ｍＭの緩衝液を使用して該可溶性トロンボモジュリン含有物をヒドロキシアパタイトに供する工程であって、（２）の工程が、ｐＨが６〜９かつリン酸塩濃度が５〜２０ｍＭの緩衝液を使用して素通り画分を取得することにより該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する画分を取得する工程である前記〔Ａ１〕〜〔Ａ３−４〕のいずれかに記載の製造方法。
〔Ａ１１〕該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を取得した後に該画分のｐＨを４以下にする工程を含まない、前記〔Ａ１〕〜〔Ａ１０〕のいずれかに記載の製造方法。

〔Ａ１２〕該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を取得した後に該画分のｐＨを４以下にしない濃縮工程及び／又は脱塩工程を含む製造方法であって、該可溶性トロンボモジュリンを医薬原料とするための、前記〔Ａ１〕〜〔Ａ１１〕のいずれかに記載の製造方法。
〔Ａ１３〕該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンにおける可溶性トロンボモジュリンの変性体の含有率が３％以下である、前記〔Ａ１〕〜〔Ａ１２〕のいずれかに記載の製造方法。
〔Ａ１４〕該可溶性トロンボモジュリンが、配列番号９又は配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして調製された形質転換細胞より取得されるトロンボモジュリンである、前記〔Ａ１〕〜〔Ａ１３〕のいずれかに記載の製造方法。

〔Ａ１５〕可溶性トロンボモジュリンから酸性下において生成し得る該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まないよう可溶性トロンボモジュリンを精製する方法であって、（１）該可溶性トロンボモジュリンの変性体を含むか、含むことが疑われる該可溶性トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体又はヒドロキシアパタイトに供する工程、（２）該可溶性トロンボモジュリンと該可溶性トロンボモジュリンの変性体とが分離し得る分離条件にて該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を取得する工程を含む、該精製方法、又は該可溶性トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体又はヒドロキシアパタイトに供する工程において、該可溶性トロンボモジュリン含有物の緩衝液を調製し、素通り画分として該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを取得する、該精製方法。
〔Ａ１５−２〕前記〔Ａ１〕〜〔Ａ１４〕のいずれかに記載の特徴を有する前記〔Ａ１５〕に記載の精製方法。
〔Ａ１６〕可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まないトロンボモジュリンにおける可溶性トロンボモジュリンの変性体の含有率が３．０％以下である、前記〔Ａ１〕〜〔Ａ１５〕のいずれかに記載の製造方法。

〔Ｂ１〕可溶性トロンボモジュリンから酸性下において生成し得る該可溶性トロンボモジュリンの変性体を含むか、含むことが疑われる該可溶性トロンボモジュリン含有物から、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まないトロンボモジュリンを製造する方法であって、（１）該トロンボモジュリン含有物を、アニオン交換体または、ヒドロキシアパタイトに供する工程、（２）該可溶性トロンボモジュリンと該可溶性トロンボモジュリンの変性体とが分離し得る分離条件にて該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を取得する工程を含む該製造方法。
〔Ｂ２〕可溶性トロンボモジュリンから酸性下において生成し得る該可溶性トロンボモジュリンの変性体を含むか、含むことが疑われる該可溶性トロンボモジュリン含有物から、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まないトロンボモジュリンを製造する方法であって、該トロンボモジュリン含有物を、アニオン交換体または、ヒドロキシアパタイトに供する工程において、該トロンボモジュリン含有物の緩衝液を調製し、素通り画分として該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを取得する該製造方法。

〔Ｂ３〕（１）の工程が可溶性トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体に供し、使用する緩衝液のｐＨが４〜９である工程であって、（２）の工程が、使用する緩衝液のｐＨが５〜９で、０〜１Ｍの塩濃度によるリニア又はステップワイズ、又はリニアとステップワイズを組み合わせたグラジエント溶出を行い、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を、予め確認するか、又は溶出画分を確認しながらかにより、取得する工程である〔Ｂ１〕に記載の製造方法。
〔Ｂ４〕（１）の工程が可溶性トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体に供し、使用する緩衝液のｐＨが４〜５である工程であって、（２）の工程が、使用する緩衝液のｐＨが５〜９で、０〜１Ｍの塩濃度によるリニア又はステップワイズ、又はリニアとステップワイズを組み合わせたグラジエント溶出を行い、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を、予め確認するか、又は溶出画分を確認しながらかにより、取得する工程である〔Ｂ１〕に記載の製造方法。
〔Ｂ５〕緩衝液がｐＨ５〜８で、０．１〜０．２Ｍの塩濃度であり、可溶性トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体に供し、素通り画分として該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを取得する〔Ｂ２〕に記載の製造方法。

〔Ｂ６〕（１）の工程が可溶性トロンボモジュリン含有物をヒドロキシアパタイトに供し、使用する緩衝液のｐＨが６〜９で、該緩衝液のリン酸濃度が８ｍＭ以下の工程であって、上記の（２）の工程が、使用する緩衝液のｐＨが６〜９で、０〜０．５Ｍのリン酸塩濃度によるリニア又はステップワイズ、又はリニアとステップワイズを組み合わせたグラジエント溶出を行い、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を、予め確認するか、又は溶出画分を確認しながらかにより、取得する工程である〔Ｂ１〕に記載の製造方法。
〔Ｂ７〕（１）の工程が可溶性トロンボモジュリン含有物をヒドロキシアパタイトに供し、使用する緩衝液のｐＨが６〜９で、該緩衝液のリン酸濃度が１〜４ｍＭの工程であって、上記の（２）の工程が、使用する緩衝液のｐＨが６〜９で、１〜４０ｍＭのリン酸塩濃度によるリニア又はステップワイズ、又はリニアとステップワイズを組み合わせたグラジエント溶出を行い、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を、予め確認するか、又は溶出画分を確認しながらかにより、取得する工程である〔Ｂ１〕に記載の製造方法。
〔Ｂ８〕緩衝液がｐＨ６〜９で、５〜２０ｍＭのリン酸塩濃度であり、可溶性トロンボモジュリン含有物をヒドロキシアパタイトに供し、素通り画分として該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを取得する〔Ｂ２〕に記載の製造方法。

〔Ｂ９〕可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を取得した後に、該画分のｐＨを４以下にしない、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ８〕の何れかに記載の製造方法。
〔Ｂ１０〕可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を取得した後に、該画分のｐＨを４以下にしない濃縮工程又は脱塩工程により医薬原料とする、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ８〕の何れかに記載の製造方法。
〔Ｂ１１〕該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンにおける可溶性トロンボモジュリンの変性体の含有率が３％以下である〔Ｂ１〕〜〔Ｂ１０〕のいずれかに記載の製造方法。
〔Ｂ１２〕該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンにおける可溶性トロンボモジュリンの変性体の含有率が１％以下である〔Ｂ１〕〜〔Ｂ１１〕のいずれかに記載の製造方法。
〔Ｂ１３〕該トロンボモジュリンが、配列番号９又は配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして調製された形質転換細胞より取得されるペプチドである、〔Ｂ１〕〜〔Ｂ１２〕のいずれかに記載の製造方法。

本発明の製造方法を用いることにより、処理タンパク質濃度を高くする濃縮工程を必要としない、処理容積に制限されない、生産性の高い、該可溶性トロンボモジュリンの変性体の分離を可能とし、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含有しない高純度可溶性トロンボモジュリンを取得できる。

本発明におけるトロンボモジュリンは、（１）トロンビンと選択的に結合して（２）トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用を有することが知られている。また、（３）トロンビンによる凝固時間を延長する作用、及び／又は（４）トロンビンによる血小板凝集を抑制する作用が通常認められることが好ましい。これらトロンボモジュリンの持つ作用をトロンボモジュリン活性と呼ぶことがある。

トロンボモジュリン活性としては、上記（１）及び（２）の作用を有し、さらに上記（１）〜（４）の作用を全て備えていることが好ましい。

トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用は、例えば、特開昭６４−６２１９号公報を初めとする各種の公知文献に明確に記載された試験方法によりプロテインＣの活性化を促進する作用の活性量やその有無を容易に確認できるものである。また、トロンビンによる凝固時間を延長する作用、及び／又はトロンビンによる血小板凝集を抑制する作用についても同様に容易に確認できる。

本発明に記載された可溶性トロンボモジュリンとしては、界面活性剤の非存在下で水に可溶な可溶性トロンボモジュリンが例として挙げられる。可溶性トロンボモジュリンの溶解性の好ましい例示としては、水、例えば注射用蒸留水に対して（トリトンＸ−１００やポリドカノール等の界面活性剤の非存在下、通常は中性付近にて）、１ｍｇ／ｍｌ以上、又は１０ｍｇ／ｍｌ以上が挙げられ、好ましくは１５ｍｇ／ｍｌ以上、又は１７ｍｇ／ｍｌ以上が挙げられ、さらに好ましくは２０ｍｇ／ｍｌ以上、２５ｍｇ／ｍｌ以上、又は３０ｍｇ／ｍｌ以上が例示され、特に好ましくは６０ｍｇ／ｍｌ以上が挙げられ、場合によっては、８０ｍｇ／ｍｌ以上、又は１００ｍｇ／ｍｌ以上がそれぞれ挙げられる。可溶性トロンボモジュリンが溶解し得たか否かを判断するに当たっては、溶解した後に、例えば白色光源の直下、約１０００ルクスの明るさの位置で、肉眼で観察した場合に、澄明であって、明らかに認められるような程度の不溶性物質を含まないことが端的な指標となるものと理解される。また、濾過して残渣の有無を確認することもできる。

本発明における可溶性トロンボモジュリンとしては、ヒト型のトロンボモジュリンにおいてトロンボモジュリン活性の中心部位として知られている配列番号１の第１９〜１３２位のアミノ酸配列を包含していることが好ましく、配列番号１の第１９〜１３２位のアミノ酸配列を包含していれば特に限定されない。該配列番号１の第１９〜１３２位のアミノ酸配列は、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用、すなわちトロンボモジュリン活性を有する限り自然又は人工的に変異していてもよく、すなわち配列番号１の第１９〜１３２位のアミノ酸配列の１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加していても良い。許容される変異の程度は、トロンボモジュリン活性を有すれば特に限定されないが、例えばアミノ酸配列として５０％以上の相同性が例示され、７０％以上の相同性が好ましく、８０％以上の相同性がより好ましく、９０％以上の相同性がさらに好ましく、９５％以上の相同性が特に好ましく、９８％以上の相同性が最も好ましい。これらのようなアミノ酸配列を相同変異配列という。これらの変異については後述の通り、通常の遺伝子操作技術を用いれば容易に取得可能である。

配列番号３の配列は、配列番号１の配列の第１２５位のアミノ酸であるＶａｌがＡｌａに変異したものであるが、本発明における可溶性トロンボモジュリンとして、配列番号３の第１９〜１３２位のアミノ酸配列を包含していることも好ましい。

このように本発明における可溶性トロンボモジュリンとしては、配列番号１もしくは配列番号３の第１９〜１３２位の配列、又はそれらの相同変異配列を少なくとも有し、少なくともトロンボモジュリン活性を有するペプチド配列を包含していれば特に限定されないが、配列番号１もしくは配列番号３のそれぞれにおける第１９〜１３２位もしくは第１７〜１３２位の配列からなるペプチド、又は上記配列の相同変異配列からなり少なくともトロンボモジュリン活性を有するペプチドが好ましい例として挙げられ、配列番号１もしくは配列番号３の第１９〜１３２位の配列からなるペプチドがより好ましい。また、配列番号１もしくは配列番号３のそれぞれにおける第１９〜１３２位もしくは第１７〜１３２位の相同変異配列からなり少なくともトロンボモジュリン活性を有するペプチドがより好ましい別の態様もある。

また本発明における可溶性トロンボモジュリンの別の態様として、配列番号５の第１９〜４８０位のアミノ酸配列を包含していることが好ましく、配列番号５の第１９〜４８０位のアミノ酸配列を包含していれば特に限定されない。該配列番号５の第１９〜４８０位のアミノ酸配列は、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用、すなわちトロンボモジュリン活性を有する限りその相同変異配列であってもよい。

配列番号７の配列は、配列番号５の配列の第４７３位のアミノ酸であるＶａｌがＡｌａに変異したものであるが、本発明における可溶性トロンボモジュリンとして、配列番号７の第１９〜４８０位のアミノ酸配列を包含していることも好ましい。

このように本発明における可溶性トロンボモジュリンとしては、配列番号５もしくは配列番号７の第１９〜４８０位の配列、又はそれらの相同変異配列を少なくとも有し、少なくともトロンボモジュリン活性を有するペプチド配列を包含していれば特に限定されないが、配列番号５もしくは配列番号７のそれぞれにおける第１９〜４８０位もしくは第１７〜４８０位の配列からなるペプチド、又は上記配列の相同変異配列からなり少なくともトロンボモジュリン活性を有するペプチドが好ましい例として挙げられ、配列番号５もしくは配列番号７の第１９〜４８０位の配列からなるペプチドがより好ましい。また、配列番号５もしくは配列番号７のそれぞれにおける第１９〜４８０位もしくは第１７〜４８０位の相同変異配列からなり少なくともトロンボモジュリン活性を有するペプチドがより好ましい別の態様もある。

また本発明における可溶性トロンボモジュリンの別の態様として、配列番号９の第１９〜５１５位のアミノ酸配列を包含していることが好ましく、配列番号９の第１９〜５１５位のアミノ酸配列を包含していれば特に限定されない。該配列番号９の第１９〜５１５位のアミノ酸配列は、トロンビンによるプロテインＣの活性化を促進する作用、すなわちトロンボモジュリン活性を有する限りその相同変異配列であってもよい。

配列番号１１の配列は、配列番号９の配列の第４７３位のアミノ酸であるＶａｌがＡｌａに変異したものであるが、本発明におけるトロンボモジュリンとして、配列番号１１の第１９〜５１５位のアミノ酸配列を包含していることも好ましい。

このように本発明における可溶性トロンボモジュリンとしては、配列番号９もしくは配列番号１１の第１９〜５１５位の配列、又はそれらの相同変異配列を少なくとも有し、少なくともトロンボモジュリン活性を有するペプチド配列を包含していれば特に限定されないが、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチド、又は上記配列の相同変異配列からなり少なくともトロンボモジュリン活性を有するペプチドがより好ましい例として挙げられ、配列番号９における第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチドが特に好ましい。これらの混合物も好ましい例として挙げられる。また、配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチドが特に好ましい別の態様もある。これらの混合物も好ましい例として挙げられる。さらにそれらの相同変異配列からなり、少なくともトロンボモジュリン活性を有するぺプチドも好ましい例として挙げられる。

相同変異配列を有するペプチドとは、上述した通りであるが、対象とするペプチドのアミノ酸配列中１つ以上、すなわち１つ又は複数のアミノ酸、さらに好ましくは数個（例えば１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個）のアミノ酸が置換、欠失、付加していてもよいペプチドをも意味する。許容される変異の程度は、トロンボモジュリン活性を有すれば特に限定されないが、例えばアミノ酸配列として５０％以上の相同性が例示され、７０％以上の相同性が好ましく、８０％以上の相同性がより好ましく、９０％以上の相同性がさらに好ましく、９５％以上の相同性が特に好ましく、９８％以上の相同性が最も好ましい。

さらに、本発明における可溶性トロンボモジュリンとしては、特開昭６４−６２１９における配列番号１４の配列（４６２アミノ酸残基）からなるペプチド、配列番号８の配列（２７２アミノ酸残基）からなるペプチド、又は配列番号６の配列（２３６アミノ酸残基）からなるペプチドも好ましい例として挙げられる。

本発明における可溶性トロンボモジュリンとしては配列番号１又は配列番号３の第１９〜１３２位のアミノ酸配列を少なくとも有しているペプチドであれば特に限定されないが、その中でも配列番号５又は配列番号７の第１９〜４８０位のアミノ酸配列を少なくとも有しているペプチドであることが好ましく、配列番号９もしくは配列番号１１の第１９〜５１５位のアミノ酸配列を少なくとも有しているペプチドであることがより好ましい。配列番号９もしくは配列番号１１の第１９〜５１５位のアミノ酸配列を少なくとも有しているペプチドとしては、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチドがより好ましい例として挙げられる。また、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチドの、配列番号９もしくは配列番号１１それぞれについての混合物もより好ましい例として挙げられる。

上記混合物の場合、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１７位から始まるペプチドと第１９位から始まるペプチドの混合割合としては、（３０：７０）〜（５０：５０）が例示され、（３５：６５）〜（４５：５５）が好ましい例として挙げられる。
また、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第５１５位で終わるペプチドと第５１６位で終わるペプチドの混合割合としては、（０：１００）〜（９０：１０）が例示され、場合によっては、（７０：３０）〜（９０：１０）、（０：１００）〜（３０：７０）が例示される。
これらペプチドの混合割合は、通常の方法により求めることができる。

なお、配列番号１の第１９〜１３２位の配列は、配列番号９の第３６７〜４８０位の配列の相当し、配列番号５の第１９〜４８０位の配列は、配列番号９の第１９〜４８０位の配列に相当する。

また、配列番号３の第１９〜１３２位の配列は、配列番号１１の第３６７〜４８０位の配列に相当し、配列番号７の第１９〜４８０位の配列は、配列番号１１の第１９〜４８０位の配列に相当する。
さらに、配列番号１、３、５、７、９、及び１１のそれぞれにおける第１〜１８位の配列は、全て同一の配列である。

これら本発明におけるトロンボモジュリンは後述の通り、これら配列番号１、３、５、７、９、又は１１等のペプチドをコードするＤＮＡ（具体的には、それぞれ配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１２等の塩基配列）をベクターにより宿主細胞にトランスフェクトして調製された形質転換細胞より取得することができる。トロンボモジュリンとしては、配列番号９又は配列番号１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（具体的にはそれぞれ配列番号１０又は配列番号１２）をベクターにより宿主細胞にトランスフェクトして調製された形質転換細胞より取得されるトロンボモジュリンが好ましい。

さらに、これらのペプチドは、前記のアミノ酸配列を有すればよいのであって、糖鎖が付いていても、又付いていなくともよく、この点は特に限定されるものではない。また遺伝子操作においては、使用する宿主細胞の種類により、糖鎖の種類や、付加位置や付加の程度は相違するものであり、いずれも用いることができる。糖鎖の結合位置及び種類については、特開平１１−３４１９９０に記載の事実が知られており、本発明におけるトロンボモジュリンについても同様の位置に同様の糖鎖が付加する場合がある。後述の通り、遺伝子操作により取得することに特定されるものではないが、遺伝子操作により取得する場合には、発現に際して用いることができるシグナル配列としては、上述の配列番号９の第１〜１８位のアミノ酸配列をコードする塩基配列、配列番号９の第１〜１６位のアミノ酸配列をコードする塩基配列、その他公知のシグナル配列、例えば、ヒト組織型プラスミノゲンアクチベーターのシグナル配列を利用することができる（国際公開８８／９８１１号公報）。

トロンボモジュリンをコードするＤＮＡ配列を宿主細胞へ導入する場合には、好ましくはトロンボモジュリンをコードするＤＮＡ配列を、ベクター、特に好ましくは、動物細胞において発現可能な発現ベクターに組み込んで導入する方法が挙げられる。発現ベクターとは、プロモーター配列、ｍＲＮＡにリボソーム結合部位を付与する配列、発現したい蛋白をコードするＤＮＡ配列、スプライシングシグナル、転写終結のターミネーター配列、複製起源配列などで構成されるＤＮＡ分子であり、好ましい動物細胞発現ベクターの例としては、Ｒ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８．２０７２（１９８１）］が報告しているｐＳＶ２−Ｘや、Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙら［ＭｅｔｈｏｄｉｎＥｍｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１，３８７，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９８３）］が報告しているｐＢＰ６９Ｔ（６９−６）などが挙げられる。

これらのペプチドを製造するに際して用いることのできる宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＶＥＲＯ（ＡＴＣＣＣＣＬ−８１）細胞、ＢＨＫ細胞、イヌ腎由来ＭＤＣＫ細胞、ハムスターＡＶ−１２−６６４細胞等が、またヒト由来細胞としてＨｅＬａ細胞、ＷＩ３８細胞、ヒト２９３細胞が挙げられる。ＣＨＯ細胞が極めて一般的であり好ましく、ＣＨＯ細胞においては、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞がさらに好ましい。

また、遺伝子操作の過程やペプチドの製造過程において、大腸菌等の微生物も多く使われ、それぞれに適した宿主−ベクター系を使用することが好ましく、上述の宿主細胞においても、適宜のベクター系を選択することができる。遺伝子組換え技術に用いるトロンボモジュリンの遺伝子は、クローニングされており、そしてトロンボモジュリンの遺伝子組換え技術を用いた製造例が開示されており、さらにはその精製品を得るための精製方法も知られている［特開昭６４−６２１９号公報、特開平２−２５５６９９号公報、特開平５−２１３９９８号公報、特開平５−３１０７８７号公報、特開平７−１５５１７６号公報、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１０３５１−１０３５３（１９８９）］。したがって本発明で用いる可溶性トロンボモジュリンは、上記の報告に記載されている方法を用いることにより、あるいはそれらに記載の方法に準じることにより製造することができる。例えば特開昭６４−６２１９号公報では、全長のトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＳＶ２トロンボモジュリンＪ２を含む、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ−１２ｓｔｒａｉｎＤＨ５（ＡＴＣＣ寄託番号６７２８３号）が開示されている。また、この菌株を生命研（現独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）（日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５））に、１９９６年６月１９日に再寄託した菌株（ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＨ５／ｐＳＶ２ＴＭＪ２）（ＦＥＲＭＢＰ−５５７０）を用いることもできる。この全長のトロンボモジュリンをコードするＤＮＡを原料として、公知の遺伝子操作技術によって、本発明のトロンボモジュリンを調製することができる。

本発明に用いられる可溶性トロンボモジュリンは、従来公知の方法又はそれに準じて調製すればよいが、例えば、前記山本らの方法［特開昭６４−６２１９号公報］、又は特開平５−２１３９９８号公報を参考にすることができる。すなわちヒト由来のトロンボモジュリン遺伝子を遺伝子操作技術により、例えば、配列番号９のアミノ酸配列をコードするＤＮＡとなし、さらに必要に応じた改変を行うことも可能である。この改変としては、例えば、配列番号１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（具体的には、配列番号１２の塩基配列よりなる）となすために、配列番号９のアミノ酸配列の第４７３位のアミノ酸をコードするコドン（特に、第１４１８位の塩基）に、メソッドインエンザイモロジー［ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００：４６８（１９８３年），アカデミックプレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）］に記載の方法に従って、部位特異的変異を行う。例えば、配列番号１０の第１４１８位の塩基Ｔは、配列番号１３に示された塩基配列を有する変異用合成ＤＮＡを用いて塩基Ｃに変換したＤＮＡとなすことができる。

このようにして調製したＤＮＡを、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に組み込んで、形質転換細胞とし、適宜選択し、この細胞を培養して得た培養液から、公知の方法により精製されたトロンボモジュリンが製造できる。前述の通り配列番号９のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（配列番号１０）を前記宿主細胞にトランスフェクトすることが好ましい。本発明に用いられるトロンボモジュリンの生産方法は、上記の方法に限定されるものではなく、例えば、トロンボモジュリンを生産する組織又はこれら組織培養液等から抽出精製することも、また必要によりさらに蛋白分解酵素により切断処理することも可能である。

上記細胞培養方法により本発明におけるトロンボモジュリンを製造する場合、タンパク質の翻訳後修飾により、Ｎ末端アミノ酸に多様性が認められる場合がある。例えば、配列番号９における第１７位、１８位、１９位、もしくは２２位のアミノ酸がＮ末端となる場合がある。また、例えば第２２位のグルタミン酸がピログルタミン酸に変換されるように、Ｎ末端アミノ酸が修飾される場合もある。第１７位又は１９位のアミノ酸がＮ末端となることが好ましく、第１９位のアミノ酸がＮ末端となることがより好ましい。また、第１７位のアミノ酸がＮ末端となることが好ましい別の態様もある。以上の修飾や多様性等については配列番号１１についても同様な例が挙げられる。

さらに、配列番号１０の塩基配列を有するＤＮＡを用いてトロンボモジュリンを製造する場合、Ｃ末端アミノ酸の多様性が認められることがあり、１アミノ酸残基短いペプチドが製造される場合がある。すなわち、第５１５位のアミノ酸がＣ末端となり、さらに該第５１５位がアミド化されるといったように、Ｃ末端アミノ酸が修飾される場合がある。したがって、Ｎ末端アミノ酸とＣ末端アミノ酸が多様性に富んだペプチド、又はそれらの混合物が製造されることがある。第５１５位のアミノ酸がＣ末端となることが好ましい。また、第５１６位のアミノ酸がＣ末端になることが好ましい別の態様もある。以上の修飾や多様性等については配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡについても同様である。

上記方法で得られるトロンボモジュリンは、Ｎ末端及びＣ末端に多様性が認められるペプチドの混合物である場合がある。具体的は、配列番号９における第１９〜５１６位、第１９〜５１５位、第１７〜５１６位、もしくは第１７〜５１５位の配列からなるペプチドの混合物が挙げられる。

本発明により、可溶性トロンボモジュリンから酸性下において生成し得る該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを製造する方法が提供される。当該製造方法は、（１）該可溶性トロンボモジュリンの変性体を含むか、含むことが疑われる該可溶性トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体又はヒドロキシアパタイトに供する工程、及び（２）該可溶性トロンボモジュリンと該可溶性トロンボモジュリンの変性体とが分離し得る分離条件にて該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する画分を取得する工程を含んでいれば特に限定されないが、（１）の工程以前に（０）該可溶性トロンボモジュリンをｐＨ５以下の酸性下におく工程を含むことが好ましく、（１）の工程以前に（０）該可溶性トロンボモジュリンをｐＨ５以下の酸性下におく工程を含みかつ（＊）可溶性トロンボモジュリンを精製する工程を含むことがより好ましい。本発明の製造方法において（＊）の工程の位置は特に限定されないが、（１）の工程以前に位置することが好ましい。

本発明の可溶性トロンボモジュリンから酸性下において該可溶性トロンボモジュリンの変性体が生成し得る酸性下の条件としては、例えばｐＨ５以下、好ましくはｐＨ４以下、より好ましくはｐＨ３以下が例示され、このｐＨの下限としては、例えばｐＨ１以上、好ましくはｐＨ２以上、より好ましくはｐＨ３以上が例示される。また、酸性下における時間としては、例えば０．５時間以上、好ましくは１時間以上、より好ましくは２時間以上が例示される。また、酸性下における温度としては、例えば、室温、好ましくは１５℃以下、より好ましくは８℃以下が例示され、この温度の下限としては、通常０℃以上、好ましくは２℃以上、より好ましくは５℃以上が例示される。上記の酸性下の条件において、可溶性トロンボモジュリンと該可溶性トロンボモジュリンの変性体との混合物となる。

本発明の方法で製造される「可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まないトロンボモジュリン」における可溶性トロンボモジュリンの変性体の含有率の上限としては、３．０％以下であることが好ましく、２．０％以下であることがより好ましく、１．０％以下であることがさらに好ましく、０．５％以下であることが特に好ましく、下限としては０．０１％以上が例示されるが、検出限界以下であることが好ましい。可溶性トロンボモジュリンの変性体の含有率は、クロマトグラフィーを用いて分析することができ、例えば、ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬ（７．８ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ；ＴＯＳＯＨ社）分析用サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、硫酸ナトリウムを含むリン酸緩衝液の移動相にて、分析サンプル１５０μｌを供し、流速０．９ｍｌ／分で、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより分析し、可溶性トロンボモジュリン及び可溶性トロンボモジュリンのピーク面積から求めることができる。

本発明の可溶性トロンボモジュリンから酸性下において生成し得る該可溶性トロンボモジュリンの変性体は、ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬ（７．８ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ；ＴＯＳＯＨ社）分析用サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、硫酸ナトリウムを含むリン酸緩衝液の移動相にて、分析サンプル１５０μｌを供し、流速０．９ｍｌ／分で分析すると、可溶性トロンボモジュリンの保持時間の約９割の保持時間（例えば、可溶性トロンボモジュリンの保持時間が約９分の場合、可溶性トロンボモジュリンの変性体の保持時間は約８分）で検出された。また、本発明の可溶性トロンボモジュリンから酸性下において生成し得る該可溶性トロンボモジュリンの変性体は、電気泳動のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥでは、移動してトロンボモジュリンの高分子側に認められ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、検出されなかった。

本発明に用いる酸性下において生成し得る可溶性トロンボモジュリンの変性体を含むか、含むことが疑われる可溶性トロンボモジュリン含有物（以下、変性体含有物と略することがある）としては、可溶性トロンボモジュリン及び可溶性トロンボモジュリン変性体を含有するものであれば特に限定されないが、可溶性トロンボモジュリンを生産し得る細胞を、血清成分を含有する培地や無血清培地を用いて培養して調製された培養上清から得られた可溶性トロンボモジュリン液体が例示され、好ましくは、可溶性トロンボモジュリンを生産し得る細胞を、血清成分を含有する培地や無血清培地を用いて培養して調製された培養上清を用い、精製工程を経て得られた該可溶性トロンボモジュリン液体、又は酸性下におかれた該可溶性トロンボモジュリン液体が例示され、より好ましくは、可溶性トロンボモジュリンを生産し得る細胞を、血清成分を含有する培地や無血清培地を用いて培養して調製された培養上清を用い、精製工程を経て得られた該可溶性トロンボモジュリン液体が例示される。また、酸性下におかれた該可溶性トロンボモジュリン液体が好ましい別の態様もある。

上記精製工程としては、少なくとも可溶性トロンボモジュリン以外の蛋白質を除去することができる工程であれば特に限定されないが、トロンボモジュリンに対する抗体を担持させたアフィニティークロマトグラフィーを用い、酸性下で該可溶性トロンボモジュリンを溶出回収する工程、又は上記アフィニティークロマトグラフィーにより得られた該可溶性トロンボモジュリンを更に、比伝導度２５〜３４ｍｓ／ｃｍ、ｐＨ３〜４の条件下にて、陽イオン交換体と接触させる工程において、素通り画分として該可溶性トロンボモジュリンを回収する工程が挙げられる。

上記可溶性トロンボモジュリン含有物（変性体含有物）としては可溶性トロンボモジュリン及び可溶性トロンボモジュリン変性体を含有するものであれば特に限定されないが、可溶性トロンボモジュリン及び可溶性トロンボモジュリン変性体以外の蛋白を実質的に含まないものが例示される。具体的には、可溶性トロンボモジュリン含有物中の全蛋白に対する可溶性トロンボモジュリンの含有率が、下限として５０％以上であることが例示され、６０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく９０％以上であることが特に好ましく、９５％以上であることが最も好ましく、９９％以上であることがこの上なく好ましい。また、９９．９％以上が好ましい場合もある。前記可溶性トロンボモジュリンの含有率としては、可溶性トロンボモジュリン自体の含有率が挙げられるが、可溶性トロンボモジュリン及び可溶性トロンボモジュリン変性体の両者を合わせた含有率を意味する場合もある。可溶性トロンボモジュリンの含有率が、可溶性トロンボモジュリン及び可溶性トロンボモジュリン変性体の両者を合わせた含有率を意味する場合でも、可溶性トロンボモジュリン含有物中の全蛋白に対する可溶性トロンボモジュリンの含有率が、下限として５０％以上であることが例示され、６０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましく９０％以上であることが特に好ましく、９５％以上であることが最も好ましく、９９％以上であることがこの上なく好ましい。また、９９．９％以上が好ましい場合もある。

上記可溶性トロンボモジュリンの含有率はクロマトグラフィーを用いて測定することができ、例えば、ＡｓａｈｉｐａｋＣ４Ｐ−５０（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×１５ｃｍ；昭和電工株式会社）分析用逆相クロマトグラフィーを用いて、０．１％トリフルオロ酢酸を含む蒸留水（Ａ液）と０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル（Ｂ液）の移動相にて、分析サンプル１５０μｌを供し、流速０．８ｍｌ／分で、Ａ液とＢ液の混合比を９６：４から４８分後に０：１００になるように直線的に変化させて、溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより分析し、可溶性トロンボモジュリンと他の蛋白質のピーク面積から求めることができる。また特開平１１−３４１９９０号公報に記載のELISA方法を用いて、可溶性トロンボモジュリン以外の蛋白質を測定することにより、可溶性トロンボモジュリンの含有率を求めることができる。

本発明においては、該トロンボモジュリンをｐＨ５以下の酸性下におく工程を経た後に、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を含むか、含むことが疑われる該トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体又はヒドロキシアパタイトに供することが好ましい。酸性下としては、上限としてｐＨ５以下が好ましく、ｐＨ４以下がより好ましく、ｐＨ３以下がさらに好ましく、下限としてｐＨ１以上が好ましく、ｐＨ２以上がより好ましく、ｐＨ３以上がさらに好ましい。

また、酸性下における時間としては、例えば０．５時間以上、好ましくは１時間以上、より好ましくは２時間以上が例示される。また、酸性下における温度としては、例えば、室温、好ましくは１５℃以下、より好ましくは８℃以下が例示され、この温度の下限としては、通常０℃以上、好ましくは２℃以上、より好ましくは５℃以上が例示される。

本発明で用いられる塩として好適な塩は、塩化物であり、最も好適な塩は塩化ナトリウムである。また、ヒドロキシアパタイトにおいて好適なリン酸塩は、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムである。

可溶性トロンボモジュリンと可溶性トロンボモジュリンの変性体とを分離し得る分離条件としては、リニア若しくはステップワイズ、又はリニアとステップワイズを組み合わせたグラジエント溶出条件、素通り画分に可溶性トロンボモジュリンが溶出する条件、或いはアイソクラティック溶出条件が挙げられ、リニア若しくはステップワイズ、又はリニアとステップワイズを組み合わせたグラジエント溶出条件、或いは素通り画分に可溶性トロンボモジュリンが溶出する条件が好ましく、リニア若しくはステップワイズ、又はリニアとステップワイズを組み合わせたグラジエント溶出条件がより好ましい。また、素通り画分に可溶性トロンボモジュリンが溶出する条件が好ましい別の態様もある。さらに、アイソクラティック条件が好ましい場合もある。

素通り画分としては、可溶性トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体又はヒドロキシアパタイトに供し、可溶性トロンボモジュリンがアニオン交換体又はヒドロキシアパタイトに吸着しない画分が挙げられる。素通り画分としてはトロンボモジュリン変性体を実質的に含まなければ特に限定されないが、例えば１〜２０カラム容積、１〜５０カラム容積、又は１〜１００カラム容積が挙げられる。

グラジエント溶出条件としては、使用するカラムに応じて適宜設定すればよい。具体的な条件としては後述する条件が挙げられる。また、素通り画分に可溶性トロンボモジュリンが溶出する条件としては、使用する緩衝液も使用するカラムに応じて適宜設定すればよい。具体的な条件としては後述する条件が挙げられる。さらに、アイソクラティック溶出条件としては、使用するカラムに応じて適宜設定すればよい。

アニオン交換体は、好ましくは強陰イオン交換体である、第４級アンモニウム基を有する陰イオン交換体、例えばＳＯＵＲＣＥＱ（GEヘルスケアバイオサイエンス社）を用い、変性体含有物を供する前に、数カラム容積のｐＨ４〜９の緩衝液（緩衝液の種類は限定されないが、例えば、０．１Ｍ酢酸、ｐＨ４または、０．０２Ｍリン酸、ｐＨ７．３、または、０．０２Ｍトリス、ｐＨ８）を用いて平衡化され得る。平衡の後、変性体含有物を供し、そして可溶性トロンボモジュリン溶出の前に、ｐＨ４〜９の緩衝液（緩衝液の種類は限定されないが、例えば、０．１Ｍ酢酸、ｐＨ４または、０．０２Ｍリン酸、ｐＨ７．３、または、０．０２Ｍトリス、ｐＨ８）を用いて洗浄され得る。吸着させた変性体含有物はｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ７〜８の緩衝液（緩衝液の種類は限定されないが、例えば、０．０２Ｍリン酸、ｐＨ７．３、または、０．０２Ｍトリス、ｐＨ８）を用い、０〜１Ｍの塩濃度によるグラジエント溶出により、可溶性トロンボモジュリンと可溶性トロンボモジュリンの変性体が分離溶出される。分離条件は可溶性トロンボモジュリンと可溶性トロンボモジュリンの変性体とを分離し得る分離条件であれば特に限定されないが、グラジエント溶出条件としてリニア若しくはステップワイズ、又はリニアとステップワイズを組み合わせた条件が挙げられる。好ましくはこのグラジエント溶出は、０〜０．３Ｍの塩濃度、より好ましくは０．０３〜０．２６Ｍの塩濃度である。溶出緩衝液の量は、２〜４０カラム容積、好ましくは５〜２０カラム容積の範囲である。

グラジエント溶出条件を使用する場合、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を取得する工程としては、例えば（ａ）可溶性トロンボモジュリンが溶出する画分の位置を予め確認しておき取得する工程、又は（ｂ）溶出画分に可溶性トロンボモジュリンが存在することを確認しながら取得する工程が挙げられる。

（ａ）の工程を具体的に述べれば、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない溶出画分の位置を、可溶性トロンボモジュリン及び可溶性トロンボモジュリン変性体の存在を確認できる分析方法（例えば、以下の実施例７に記載のサイズ排除クロマトグラフィー）にて予め確認しておき、その位置の溶出画分を回収する工程が挙げられる。また、（ｂ）の工程を具体的に述べれば、溶出画分が該可溶性トロンボモジュリンを含有しかつ該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まないことを、可溶性トロンボモジュリン及び可溶性トロンボモジュリン変性体の存在を確認できる分析方法（例えば、以下の実施例７に記載のサイズ排除クロマトグラフィー）にて確認しながら、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない該可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を取得する工程が挙げられる。（ｂ）の工程が好ましい。また、場合によっては（ａ）の工程が好ましい場合もある。

また、変性体含有物を供する前に、変性体含有物を適切な緩衝液に置換することにより、素通り画分として、トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを取得することもできる。素通り画分としては、可溶性トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体に供し、可溶性トロンボモジュリンがアニオン交換体に吸着しない画分が挙げられる。可溶性トロンボモジュリン及び可溶性トロンボモジュリンの変性体との間のカラムへの吸着力の差を利用するこの場合、アニオン交換体は、好ましくは強陰イオン交換体である、第４級アンモニウム基を有する陰イオン交換体、例えばＳＯＵＲＣＥＱ、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（GEヘルスケアバイオサイエンス社）、ザルトバインド（ザルトリウス社）、ムスタング（ＰＡＬＬ社）を用いることができる。置換する適切な緩衝液は、好ましくは、ｐＨ５〜８、０．１〜０．２Ｍの塩濃度の緩衝液で、緩衝液の種類に限定されないが、例えば、０．０２Ｍリン酸、０．１８Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．３を用いることができる。素通り画分を取得する方法としては、画分が該可溶性トロンボモジュリンを含有しかつ該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まないことを、後述する実施例７に記載のサイズ排除クロマトグラフィー等の分析方法にて確認しながら当該画分を適宜取得すればよい。

さらに、アイソクラティック溶出条件を用いることもできる。この場合も、グラジエント溶出条件及び素通り画分に可溶性トロンボモジュリンが溶出する条件を参考に適宜条件を設定することができる。

ヒドロキシアパタイトは、例えばＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（Ｒ）ＣｅｒａｍｉｃＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅＴＹＰＥ１（BIO-RAD社）を用い、変性体含有物を供する前に、数カラム容積のｐＨ６〜９のリン酸濃度が８ｍＭ以下、好ましくは５ｍＭ以下、より好ましくは２ｍＭ以下の緩衝液（緩衝液の種類は限定されないが、例えば、５ｍＭリン酸、０．２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７、または、１ｍＭリン酸、２５ｍＭＴＲＩＳ、０．２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．７、または、２ｍＭリン酸、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、０．１７Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７）を用いて平衡化され得る。供する変性体含有物の緩衝液は、ｐＨ６〜９のリン酸濃度が８ｍM以下、好ましくは５ｍＭ以下、より好ましくは２ｍＭ以下の緩衝液を用い、平衡の後、変性体含有物を供し、そして可溶性トロンボモジュリン溶出の前に、ｐＨ６〜９のリン酸濃度が８ｍM以下、好ましくは５ｍＭ以下、より好ましくは２ｍＭ以下の緩衝液（緩衝液の種類は限定されないが、例えば、５ｍＭリン酸、０．２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７、または、１ｍＭリン酸、２５ｍＭＴＲＩＳ、０．２Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．７、または、２ｍＭリン酸、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、０．１７Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７）を用いて洗浄され得る。吸着させた変性体含有物はｐＨ６〜９、好ましくはｐＨ７〜８の緩衝液を用い、０〜０．５Ｍのリン酸塩濃度のグラジエントにより、可溶性トロンボモジュリンと可溶性トロンボモジュリンの変性体が分離溶出される。分離条件は可溶性トロンボモジュリンと可溶性トロンボモジュリンの変性体とを分離し得る分離条件であれば特に限定されないが、グラジエント溶出条件としてリニアまたはステップワイズが挙げられる。好ましくはこのグラジエントは、１〜４０ｍＭのリン酸塩濃度で、より好ましくは、ステップワイズで行い、８〜１０ｍＭリン酸塩濃度で可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を得ることができる。リン酸塩の濃度を更に上げることによって可溶性トロンボモジュリンの変性体が溶出される。

グラジエント溶出条件を使用する場合、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を取得する方法としては、可溶性トロンボモジュリン及び可溶性トロンボモジュリン変性体をアニオン交換体で分離する場合の方法と同様の方法が挙げられる。

また、変性体含有物を供する前に、変性体含有物を適切な緩衝液に置換することにより、素通り画分として、トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを取得することもできる。素通り画分としては、可溶性トロンボモジュリン含有物をヒドロキシアパタイトに供し、可溶性トロンボモジュリンがヒドロキシアパタイトに吸着しない画分が挙げられる。可溶性トロンボモジュリン及び可溶性トロンボモジュリンの変性体との間のカラムへの吸着力の差を利用する。この場合、ヒドロキシアパタイトは、例えばＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（Ｒ）ＣｅｒａｍｉｃＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅＴＹＰＥ１（BIO-RAD社）を用いることができる。置換する適切な緩衝液は、ｐＨ６〜９、５〜２０ｍＭのリン酸塩濃度、好ましくは、ｐＨ６〜７、５〜１０ｍＭのリン酸塩濃度の緩衝液で、緩衝液の種類に限定されないが、例えば、１０ｍＭリン酸、１０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７を用いることができる。素通り画分を取得する方法としては、画分が該可溶性トロンボモジュリンを含有しかつ該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まないことを、後述する実施例７に記載のサイズ排除クロマトグラフィー等の分析方法にて確認しながら当該画分を適宜取得すればよい。

本発明の製造方法においては、可溶性トロンボモジュリン含有物を陰イオン交換体又はヒドロキシアパタイトに供し、可溶性トロンボモジュリン変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンの溶出画分を取得した後に該画分をｐＨ４以下にする工程を含まないことが好ましい。また該可溶性トロンボモジュリンを医薬原料とするためのその後の濃縮工程及び／又は脱塩工程においてもｐＨ４以下にしないことが好ましい。

可溶性トロンボモジュリンを生産し得る細胞を、血清成分を含有する培地や無血清培地を用いて培養して調製された培養上清から可溶性トロンボモジュリンを精製する好ましい方法を例示すれば、トロンボモジュリン活性、例えばトロンビンによるプロテインＣ活性化の促進活性を指標に精製する方法が挙げられ、例えばイオン交換カラムのＱ−セファロースＦＦで培養上清を粗精製しトロンボモジュリン活性を有する画分を回収し、ついでアフィニティーカラムのマウス抗トロンボモジュリンモノクローナル抗体で精製し、トロンボモジュリン活性が強い画分を回収し、回収画分を陽イオン交換カラムのＳＰ−セファロースＦＦにて精製し、素通り画分を濃縮し、ゲルろ過にかけトロンボモジュリン活性画分を取得する精製方法が挙げられる。このＳＰ−セファロースＦＦによる精製の後、本発明によるアニオン交換体、好ましくは強陰イオン交換体である、第４級アンモニウム基を有する陰イオン交換体、例えばＳＯＵＲＣＥＱ（GEヘルスケアバイオサイエンス社）、または、本発明によるヒドロキシアパアタイト、例えばＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（Ｒ）ＣｅｒａｍｉｃＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅＴＹＰＥ１（BIO-RAD社）を最適な条件下で用いることにより、簡便に可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含有しない高純度なトロンボモジュリンを取得することが可能である。

また、マウス抗トロンボモジュリンモノクローナル抗体で精製した後、本発明によるアニオン交換体、好ましくは強陰イオン交換体である、第４級アンモニウム基を有する陰イオン交換体、例えばＳＯＵＲＣＥＱ（GEヘルスケアバイオサイエンス社）を最適な条件下で用いることにより、可溶性トロンボモジュリンの変性体とマウス抗体由来物、血清含有培地を使用した場合は血清由来物を同時に除去し得、簡便に可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含有しない高純度なトロンボモジュリンを取得することが可能である。

上記、例示した方法で得られた高純度なトロンボモジュリンをさらに、ｐＨが４以下とせしめない、濃縮工程及び／又は脱塩工程により緩衝液交換した高純度精製品を取得することができる。上記方法で取得した可溶性トロンボモジュリンは医薬原料として用いることができる。

また、本発明により可溶性トロンボモジュリンから酸性下において生成し得る該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まないよう可溶性トロンボモジュリンを精製する方法が提供される。当該精製方法は、（１）該可溶性トロンボモジュリンの変性体を含むか、含むことが疑われる該可溶性トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体又はヒドロキシアパタイトに供する工程、及び（２）該可溶性トロンボモジュリンと該可溶性トロンボモジュリンの変性体とが分離し得る分離条件にて該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する画分を取得する工程を含んでいれば特に限定されない。また、当該精製方法としては、上記本発明の可溶性トロンボモジュリンの製造方法が有する特徴を有している精製方法が挙げられる。

以下の実施例によって、本発明をより具体的に説明するが、本発明は何らこれらによって限定されるものではない。

（実施例１）強陰イオン交換体カラムによる粗精製
特開平１１−３４１９９０号公報に従って、配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを遺伝子操作技術により、調製改変して組み込んだチャイニーズハムスター卵巣細胞を培養し、培養液上清を取得した。取得した培養液上清４１ｌを、０．２μｍのメンブレンフィルター（ミリポア社、ミリパック２０）で濾過した。濾過した培養上清を、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（GEヘルスケアバイオサイエンス社）カラム（直径４４ｃｍ、高さ２６．３ｃｍ）に供した。次に６カラム容積の１８０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液で洗浄し、更に８カラム容積の１８０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄を行ない、３００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩緩衝液（ｐＨ７．４）で溶出を開始し、溶出液の吸光度２８０ｎｍのピーク立ち上がりからの０．５カラムボリューム容量の溶出液を粗精製品として取得した。なお、流速は７６０ｍL／分で実施した。

（実施例２）モノクローナル抗体による精製
特開平１１−３４１９９０号公報に従って、ヒト肺由来トロンボモジュリンを抗原とした抗トロンボモジュリンモノクローナル抗体を作製し、ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦａｓｔＦｌｏｗ（GEヘルスケアバイオサイエンス社）と接触反応させ、抗トロンボモジュリンモノクローナルをカップリングし、抗トロンボモジュリンモノクローナル結合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦａｓｔＦｌｏｗを作製した。実施例１で得られた溶出画分の内１６．５ｌを、０．３Ｍ塩化ナトリウム含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化したモノクローナル抗体カラム（直径４４ｃｍ、高さ１０．５ｃｍ）に供した。６カラム容積の１．０Ｍ塩化ナトリウム含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）を流し、更に３カラム容積の０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を流し洗浄し、０．３Ｍ塩化ナトリウム含む０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出を開始し、溶出液の吸光度２８０ｎｍのピーク立ち上がりから立ち下がりまでの溶出液を得、溶出液に１／１０溶出液容積容量の０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）を添加して精製液として取得した。なお、流速は７６０ｍL／分で実施した。

（実施例３）強陽イオン交換体カラムによる精製
実施例２で得られた精製液の内１９３ｍｌを１．０Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）にてｐＨ３．５に調製した液を、０．３ＭＮａＣｌを含む０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）で平衡化したＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（GEヘルスケアバイオサイエンス社）カラム（直径１６ｍｍ、高さ１２ｃｍ）に供した。３００ｍＭＮａＣｌを含む１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．５）で洗浄を開始し、吸光度２８０ｎｍのピーク立ち上がりから立ち下がりまでの素通り画分を得、直ちに０．５Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７．３）でｐＨ７に中和し、高純度精製品として取得した。なお、流速は３．３ｍL／分で実施した。当該高純度精製品の可溶性トロンボモジュリンの含有率は、上記ＡｓａｈｉｐａｋＣ４Ｐ−５０を用いたクロマトグラフィー又は特開平１１−３４１９９０号公報に記載のELISA法等により、９９％以上であることがわかる。

（実施例４）アニオン交換体リニアグラジエント溶出による可溶性トロンボモジュリンの変性体の分離（１）
実施例３で得られた高純度精製品の内１０ｍｌを、精製水３０ｍｌで希釈した。希釈した溶液４０ｍｌを、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）で平衡化したｓｏｕｒｒｃｅＱ３０（GEヘルスケアバイオサイエンス社）カラム（直径０．５ｃｍ、高さ９．８ｃｍ）に供した。３カラム容積の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）で洗浄し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）の０．１Ｍ〜０．３Ｍ塩化ナトリウムのリニアグラジエント、溶出容積２０カラム容積にて溶出を開始し、溶出液の吸光度２８０ｎｍのピーク立ち上がりから、１カラム容積を単位で分画した。なお、サンプルのロード及び洗浄の際の流速は２．２ｍL／分、溶出の際の流速は０．３ｍL／分で実施した。クロマトグラムを図１に示した。

（実施例５）アニオン交換体リニアグラジエント溶出による可溶性トロンボモジュリンの変性体の分離（２）
実施例３で得られた高純度精製品の内１０ｍｌを、精製水３０ｍｌで希釈した。希釈した溶液４０ｍｌを、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したｓｏｕｒｒｃｅＱ３０（GEヘルスケアバイオサイエンス社）カラム（直径０．５ｃｍ、高さ９．８ｃｍ）に供した。３カラム容積の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で洗浄し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）の０．１Ｍ〜０．３Ｍ塩化ナトリウムのリニアグラジエント、溶出容積２０カラム容積にて溶出を開始し、溶出液の吸光度２８０ｎｍのピーク立ち上がりから、１カラム容積を単位で分画した。なお、サンプルのロード及び洗浄の際の流速は２．２ｍL／分、溶出の際の流速は０．３ｍL／分で実施した。クロマトグラムを図２に示した。

（実施例６）アニオン交換体リニアグラジエント溶出による可溶性トロンボモジュリンの変性体の分離（３）
実施例３で得られた高純度精製品の内１０ｍｌを、精製水３０ｍｌで希釈した。希釈した溶液４０ｍｌを、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８）で平衡化したｓｏｕｒｒｃｅＱ３０（GEヘルスケアバイオサイエンス社）カラム（直径０．５ｃｍ、高さ９．８ｃｍ）に供した。３カラム容積の２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８）で洗浄し、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８）の０．１Ｍ〜０．３Ｍ塩化ナトリウムのリニアグラジエント、溶出容積２０カラム容積にて溶出を開始し、溶出液の吸光度２８０ｎｍのピーク立ち上がりから、１カラム容積を単位で分画した。なお、サンプルのロード及び洗浄の際の流速は２．２ｍL／分、溶出の際の流速は０．３ｍL／分で実施した。クロマトグラムを図３に示した。

（実施例７）実施例４〜６の可溶性トロンボモジュリンの変性体含量評価
ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬ（７．８ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ；ＴＯＳＯＨ社）分析用サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、各画分の可溶性トロンボモジュリンの変性体含量を評価した。カラムは移動相で平衡化し、移動相は、０．１Ｍ硫酸ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７．３を用い、流速０．９ｍｌ／分、各画分１５０μｌを供し、分析した。また、各画分の回収は、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより算出した。実施例４から実施例６までの結果を下記表１に示した。また、実施例３で取得した高純度精製品についても、上記方法で可溶性トロンボモジュリンの変性体含量を測定し、７．０％であった（図４）。実施例４から実施例６の何れの条件においても、可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含有しない高純度可溶性トロンボモジュリンを回収率７６％〜８１％で取得することができた。

（実施例８）アニオン交換体ステップワイズグラジエント溶出による可溶性トロンボモジュリンの変性体の分離
実施例３で得られた高純度精製品の内７０ｍｌを、精製水２１０ｍｌで希釈した。希釈した溶液を、３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化したｓｏｕｒｃｅＱ３０（GEヘルスケアバイオサイエンス社）カラム（直径０．５ｃｍ、高さ２０．５ｃｍ）に供した。３カラム容積の３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．３）で洗浄し、０．１８Ｍ塩化ナトリウム含む２０ｍMリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で溶出を開始し、溶出液の吸光度２８０ｎｍのピーク立ち上がりから６カラムボリューム容量までの溶出液を得た。ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬ（ＴＯＳＯＨ社）分析用サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、実施例７の条件にて溶出液の可溶性トロンボモジュリンの変性体含量を評価した結果、可溶性トロンボモジュリンの変性体含量比率は０．０％となり、可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない高純度可溶性トロンボモジュリンとして取得した。溶出液の回収率は８９％であった。なお、サンプルのロード及び洗浄の際の流速は０．８ｍL／分、溶出の際の流速は０．４ｍL／分で実施した。クロマトグラムを図５に示した。

（実施例９）ヒト由来のトロンボモジュリン遺伝子を遺伝子操作技術により、調製改変して組み込んだチャイニーズハムスター卵巣細胞の無血清培養による可溶性トロンボモジュリン含有培養上清の取得
可溶性トロンボモジュリン含有培養上清を取得するための培養で使用した動物成分不含無血清培地は、シード用培地と灌流培養用培地の２種類を調製した。

シード用培地はＩＳＣＨＯ−ＣＤ（液体培地、カタログ番号９１１１９−１Ｌ，メーカーＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）１Ｌ当たりに、ＨＴｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ (液体、カタログ番号１１０６７−０３０，メーカーＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を５ｍＬ、Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ２００ｍＭ (液体，カタログ番号２５０３０−０８１，メーカーＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ) を４０ｍＬの割合で無菌的に混合し調製した。シード用培地は、保存時は冷蔵保存（２〜８度）し、使用時は使用直前に３６℃恒温水浴槽で加温し使用した。

灌流培養用培地は、脱イオン限外濾過水１Ｌ当たりに、ＩＳＣＨＯ−ＣＤ−Ａ３（粉末培地、カタログ番号９８６８８，メーカーＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を２０．８ｇ、食塩（特級グレード、メーカー和光純薬）を２．６ｇ、重曹食塩（特級グレード、メーカー和光純薬）を４．４ｇの割合で添加し溶解後、０．２μｍフィルター（ＰＶＤＦ製、メーカーミリポア）で無菌濾過し調製した。灌流培養用培地は、保存時、使用時ともに冷蔵保存（２〜８度）とした。

シード培養の開始では、凍結保存された可溶性トロンボモジュリンを生産し得る細胞（特開平１１−３４１９９０号公報）を、３７度恒温水浴槽で素早く融解し、シード用培地に懸濁し遠心分離（２０００ｒｐｍ、２分、国産化学）し、遠心上清除去後、細胞ペレットをシード用培地１００ｍＬで懸濁し、２２５ｃｍ²Ｔフラスコ培養容器（メーカーＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に分注し、１段目のシード培養を開始した。１段目シード培養は、３６度５％炭酸ガスインキュベーター内での静置培養で実施した。１段目シード培養の浮遊生細胞密度が約８×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに達したところで２段目シード培養に継代した。

２段目シード培養以降は攪拌培養で実施した。攪拌培養でのシード培養のスケール及び攪拌培養容器は、２段目シード培養：４００ｍＬ（ガラス製スピナーフラスコ、メーカー柴田科学）、３段目シード培養：１．６Ｌ（ガラス製スピナーフラスコ、メーカー柴田科学）、４段目シード培養：６Ｌ（ガラス製球スピナーフラスコ、メーカー柴田科学）、と順次継代し培養液量を拡大した。シード培養の浮遊生細胞密度が約８×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに達したところで次段のシード培養に継代した。継代では、継代後の培養スケールから継代前の培養スケールを差し引いた値と同じ量のシード培養用培地を加え拡大した。攪拌培養は、３６度５％炭酸ガスインキュベーター内で、マグネティックスターラー（メーカー柴田科学）により攪拌数６０〜１００ｒｐｍの条件で実施した。

４段目シード培養の浮遊生細胞密度が約８×１０⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍＬに達したところで、シード培養液を３台の灌流培養槽（２Ｌ灌流培養装置、メーカー丸菱バイオ）それぞれに２Ｌずつ移送し、灌流培養を開始した。

灌流培養において灌流培養槽に供給する灌流培養用培地の定量移送は、ペリスターポンプ（メーカー：マスターフレックス）を用い２Ｌ／日の流量で行った。

灌流培養での細胞分離は、灌流培養槽内に設置されたスピンフィルターで行った。３台の灌流培養槽のスピンフィルターはそれぞれ異なるものを使用した。１台目はステンレス製メッシュ（ＦＰ−１０、孔径１０μｍ、メーカー富士フィルター工業）、２台目はステンレス製メッシュ（ＦＰ−３０、孔径３０μｍ、メーカー富士フィルター工業）、３台目はｐｏｌｙｅｓｔｅｒＰＥＴＰ製メッシュ（孔径１０μｍ、カタログ番号ＢＢ−８８０８５７１、メーカーザルトリウス）のスピンフィルターを使用した。

灌流培養槽内に設置されたスピンフィルターで細胞分離された培養上清は、灌流培養槽内の２Ｌ液面を示すレベルセンサーの動作により、培養液量が２Ｌ以上になった場合、培養槽内圧力により、間欠的に抜きだした。間欠的に抜き出された培養上清は、冷蔵保存された容器中へ移送され、２〜８度で冷蔵保存した。

灌流培養条件は、槽内温度３５〜３７℃、溶存酸素濃度１０％〜９０％、ｐＨ６．８〜７．６で制御し培養した。

灌流培養は３０日間行い、その間の平均生細胞密度は、１台目１７×１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、２台目１０×１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、３台目１８×１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍＬであった。

３台の灌流培養槽で、灌流培養３日目から３０日目までに取得した培養上清は、混合し、０．２μｍフィルター（ＰＶＤＦ製、メーカーミリポア）で濾過し、濾過した培養上清として冷蔵保存（２〜８度）した。

（実施例１０）強陰イオン交換体カラムによる精製
実施例９により取得した培養液上清の内８５０ｍｌを、３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１２０ｍＭ酢酸緩衝液で平衡化したＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（GEヘルスケアバイオサイエンス社）カラム（直径１．６ｃｍ、高さ２９ｃｍ）に供した。次に１２カラム容積の３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．８）で洗浄し、１４０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム、４０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．２）で溶出を開始し、溶出液の吸光度２８０ｎｍのメインピーク立ち上がりから２カラムボリューム容量の溶出液に１／５カラムボリューム容量の１０ｍＭリン酸カリウムを含む１ＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８）を添加して精製品を取得した。なお、流速は２ｍL／分で実施した。

（実施例１１）ヒドロキシアパタイトステップワイズグラジエント溶出による可溶性トロンボモジュリンの変性体の分離
実施例１０で取得した精製品の内２０ｍｌを、０．１７Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭリン酸ナトリウムを含む２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）で平衡化したＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（Ｒ）ＣｅｒａｍｉｃＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅＴＹＰＥ１（BIO-RAD社）カラム（直径０．５ｃｍ、高さ９．７ｃｍ）に供した。６カラム容積の０．１７Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭリン酸ナトリウムを含む２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）で洗浄し、１０ｍＭ塩化ナトリウムを含む８ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）、溶出容積４カラム容積にて溶出し、溶出液の吸光度２８０ｎｍのピーク立ち上がりから立ち下がりまでの溶出液をを得た。なお、流速は０．４ｍL／分で実施した。ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬ（ＴＯＳＯＨ社）分析用サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、実施例７の条件にて溶出液の可溶性トロンボモジュリンの変性体含量を評価した結果、可溶性トロンボモジュリンの変性体含量比率は０．８％以下となった。カラムは、０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）で再生した。クロマトグラムを図６に示した。

（実施例１２）強陰イオン交換体カラムによる粗精製（２）
実施例９で取得した培養液上清５．２ｌを、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩緩衝液（ｐＨ７．７）で平衡化したＣａｐｔｏＱ（GEヘルスケアバイオサイエンス社）カラム（直径１．６ｃｍ、高さ２６ｃｍ）に供した。次に１５カラム容積の０．１８Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩緩衝液（ｐＨ７．７）で洗浄を行ない、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩緩衝液（ｐＨ７．７）で溶出を開始し、溶出液の吸光度２８０ｎｍのピーク立ち上がりからの２カラムボリューム容量の溶出液を粗精製品として取得した。なお、流速は１０ｍL／分で実施した。

（実施例１３）モノクローナル抗体による精製（２）
モノクローナル抗体を（特許文献２）に順じて作製した。実施例１２で得られた溶出画分の内７２ｍLを、０．３Ｍ塩化ナトリウム含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化したモノクローナル抗体カラム（直径５ｃｍ、高さ１１ｃｍ）に供した。６カラム容積の１．０Ｍ塩化ナトリウム含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）を流し、更に３カラム容積の０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）を流し洗浄し、２０ｍＭ塩化ナトリウム含む０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出を開始し、溶出液の吸光度２８０ｎｍのピーク立ち上がりから立ち下がりまでの溶出液を得、溶出液に１５％溶出液容積容量の０．３Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）を添加して精製液として取得した。なお、流速は９．８ｍL／分で実施した。当該精製液の可溶性トロンボモジュリンの含有率は、上記ＡｓａｈｉｐａｋＣ４Ｐ−５０を用いたクロマトグラフィー又は特開平１１−３４１９９０号公報に記載のELISA法等により、９９％以上であることがわかる。

（実施例１４）強陰イオン交換体による高純度化と可溶性トロンボモジュリンの変性体の除去
実施例１３で得られた精製液の内７５ｍLを、４０ｍＭ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）で平衡化したｓｏｕｒｃｅＱ３０（GEヘルスケアバイオサイエンス社）カラム（直径０．５ｃｍ、高さ２０．５ｃｍ）に供した。２カラム容積の４０ｍＭ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）を流し、更に４カラム容積の５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）を流し、そして更に３カラム容積の３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で洗浄し、０．１８Ｍ塩化ナトリウム含む２０ｍMリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）で溶出を開始し、溶出液の吸光度２８０ｎｍのピーク立ち上がりから６カラム容積までの溶出液を得た。なお、サンプルのロード際の流速は１ｍL／分、洗浄及び溶出の際の流速は０．３ｍL／分で実施した。ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷＸＬ（ＴＯＳＯＨ社）分析用サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、実施例７の条件にて溶出液の可溶性トロンボモジュリンの変性体含量を評価した結果、可溶性トロンボモジュリンの変性体含量比率は０．１％となり、可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない高純度可溶性トロンボモジュリンとして取得した。溶出液の回収率は７１％であった。クロマトグラムを図７に示した。

（実施例１５）混入異種蛋白質（マウス抗体由来物及びチャイニーズハムスター卵巣細胞細胞由来物）量の評価
特開平１１−３４１９９０号公報に記載のELISA方法を用いて、実施例１３〜１４までの溶出画分について評価した。各溶出画分の２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光度１あたりの混入量で評価した結果を下記表２に示した。各成分の混入量を同時に減じることができた。

図１は、実施例４でのアニオン交換体リニアグラジエント溶出による可溶性トロンボモジュリンの変性体の分離におけるクロマトグラムを示す。図２は、実施例５でのアニオン交換体リニアグラジエント溶出による可溶性トロンボモジュリンの変性体の分離におけるクロマトグラムを示す。図３は、実施例６でのアニオン交換体リニアグラジエント溶出による可溶性トロンボモジュリンの変性体の分離におけるクロマトグラムを示す。図４は、実施例３で取得した高純度精製品について可溶性トロンボモジュリンの変性体含量を測定した結果を示す。図５は、実施例８でのアニオン交換体ステップワイズグラジエント溶出による可溶性トロンボモジュリンの変性体の除去におけるクロマトグラムを示す。図６は、実施例１１でのヒドロキシアパタイトステップワイズグラジエント溶出による可溶性トロンボモジュリンの変性体の除去におけるクロマトグラムを示す。図７は、実施例１４での強陰イオン交換体による高純度化と可溶性トロンボモジュリンの変性体の除去におけるクロマトグラムを示す。

Claims

可溶性トロンボモジュリンから酸性下において生成し得る該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを製造する方法であって、（０）該可溶性トロンボモジュリンをｐＨ５以下の酸性下におく工程、（１）前記（０）の工程を経て得られた、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を含むか、含むことが疑われる該可溶性トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体又はヒドロキシアパタイトに供する工程、及び（２）該可溶性トロンボモジュリンと該可溶性トロンボモジュリンの変性体とが分離し得る分離条件にて該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する画分を取得する工程を含む、該製造方法。
該可溶性トロンボモジュリンをｐＨ５以下の酸性下におく工程が、該可溶性トロンボモジュリンをｐＨ４以下の酸性下におく工程である請求項１に記載の製造方法。
該可溶性トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体又はヒドロキシアパタイトに供する工程が、該可溶性トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体に供する工程である請求項１又は２に記載の製造方法。
該可溶性トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体又はヒドロキシアパタイトに供する工程が、該可溶性トロンボモジュリン含有物をヒドロキシアパタイトに供する工程である請求項１又は２に記載の製造方法。
可溶性トロンボモジュリンが、可溶性トロンボモジュリン含有物中の全蛋白に対する含有率が８０％以上の可溶性トロンボモジュリンである、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
（２）の工程が、リニア若しくはステップワイズ、又はリニアとステップワイズを組み合わせたグラジエント溶出を行い、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を取得する工程である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
（２）の工程が、素通り画分を取得する工程であって、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する画分を取得する工程である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
（２）の工程が、アイソクラティック溶出を行い、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を取得する工程である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
（１）の工程が、ｐＨが４〜９の緩衝液を使用して該可溶性トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体に供する工程であって、（２）の工程が、ｐＨが５〜９かつ塩濃度が０〜１Ｍの緩衝液を使用してリニア若しくはステップワイズ、又はリニアとステップワイズを組み合わせたグラジエント溶出を行い、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を取得する工程である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
（１）の工程が、ｐＨが４〜９の緩衝液を使用して該可溶性トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体に供する工程であって、（２）の工程が、ｐＨが５〜９かつ塩濃度が０〜１Ｍの緩衝液を使用してリニア若しくはステップワイズ、又はリニアとステップワイズを組み合わせたグラジエント溶出を行い、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を、（ａ）可溶性トロンボモジュリンが溶出する画分の位置を予め確認しておき取得する工程、又は（ｂ）溶出画分に可溶性トロンボモジュリンが存在することを確認しながら取得する工程である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
（１）の工程が、ｐＨが５〜８かつ塩濃度が０．１〜０．２Ｍの緩衝液を使用して該可溶性トロンボモジュリン含有物をアニオン交換体に供する工程であって、（２）の工程が、ｐＨが５〜８かつ塩濃度が０．１〜０．２Ｍの緩衝液を使用して素通り画分を取得することにより該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する画分を取得する工程である、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
（１）の工程が、ｐＨが６〜９かつリン酸塩濃度が８ｍＭ以下である緩衝液を使用して可溶性トロンボモジュリン含有物をヒドロキシアパタイトに供する工程であって、（２）の工程が、ｐＨが６〜９かつリン酸塩濃度が０〜０．５Ｍの緩衝液を使用してリニア若しくはステップワイズ、又はリニアとステップワイズを組み合わせたグラジエント溶出を行い、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を取得する工程である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
（１）の工程が、ｐＨが６〜９かつリン酸塩濃度が８ｍＭ以下である緩衝液を使用して可溶性トロンボモジュリン含有物をヒドロキシアパタイトに供する工程であって、（２）の工程が、ｐＨが６〜９かつリン酸塩濃度が０〜０．５Ｍの緩衝液を使用してリニア若しくはステップワイズ、又はリニアとステップワイズを組み合わせたグラジエント溶出を行い、該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を、（ａ）可溶性トロンボモジュリンが溶出する画分の位置を予め確認しておき取得する工程、又は（ｂ）溶出画分に可溶性トロンボモジュリンが存在することを確認しながら取得する工程である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
（１）の工程が、ｐＨが６〜９かつリン酸塩濃度が５〜２０ｍＭの緩衝液を使用して該可溶性トロンボモジュリン含有物をヒドロキシアパタイトに供する工程であって、（２）の工程が、ｐＨが６〜９かつリン酸塩濃度が５〜２０ｍＭの緩衝液を使用して素通り画分を取得することにより該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する画分を取得する工程である請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を取得した後に該画分のｐＨを４以下にする工程を含まない、請求項１〜１４のいずれかに記載の製造方法。
該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンを含有する溶出画分を取得した後に該画分のｐＨを４以下にしない濃縮工程及び／又は脱塩工程を含む製造方法であって、該可溶性トロンボモジュリンを医薬原料とするための、請求項１〜１５のいずれかに記載の製造方法。
該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンにおける可溶性トロンボモジュリンの変性体の含有率が３％以下である、請求項１〜１６のいずれかに記載の製造方法。
該可溶性トロンボモジュリンの変性体を実質的に含まない可溶性トロンボモジュリンにおける可溶性トロンボモジュリンの変性体の含有率が１％以下である、請求項１〜１６のいずれかに記載の製造方法。
該可溶性トロンボモジュリンが、配列番号９又は配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトして調製された形質転換細胞より取得されるトロンボモジュリンである、請求項１〜１８のいずれかに記載の製造方法。
該可溶性トロンボモジュリンが、配列番号９もしくは配列番号１１のそれぞれにおける第１９〜５１６位の配列を有するペプチド、又は前記ペプチドのアミノ酸配列の１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列を有しトロンボモジュリン活性を有するペプチドである、請求項１〜１９のいずれかに記載の製造方法。