TW201431872A - 高純度可溶性凝血酶調節素之製造方法 - Google Patents

高純度可溶性凝血酶調節素之製造方法 Download PDF

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Abstract

本發明之目的係獲得一種實質上不含於酸性條件下可生成的可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素。本發明係關於一種可溶性凝血酶調節素之製造方法，其係由含有或者疑為含有於酸性條件下可生成的可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素含有物，製造實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素者；此製造方法包括以下步驟：將該可溶性凝血酶調節素含有物供給於陰離子交換體或羥磷灰石；以及以可將該可溶性凝血酶調節素的變性體分離的分離條件進行線性方式或逐步方式、或者將線性方式與逐步方式加以組合之鹽濃度梯度之溶出，藉由預先確認而取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份，或者藉由一面確認溶出部份，一面取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份。

Description

高純度可溶性凝血酶調節素之製造方法
本發明係關於一種實質上不含於酸性條件下可生成的可溶性凝血酶調節素的變性體之高純度可溶性凝血酶調節素(thrombomodulin)之製造方法。
凝血酶調節素，係作為具有與凝血酶特異性結合且抑制凝血酶的血液凝固活性同時顯著地促進凝血酶的蛋白質C活化能的作用之物質而為業界所知，已知悉其具有強力的血液凝固抑制作用。已知悉凝血酶調節素可延長凝血酶的凝固時間、或者抑制由於凝血酶所引起的血小板凝集。蛋白質C係於血液凝固纖溶系統中發揮重要作用之維生素K依賴性蛋白質，蛋白質C經由凝血酶的作用而被活化，成為活化蛋白質C。已知悉，該活化蛋白質C在生物體內可使血液凝固系因子之活性型第V因子、及活性型第VIII因子失去活性，又參與具有血栓溶解作用之纖維蛋白溶酶原活化物的產生(非專利文獻1)。因此，凝血酶調節素促進由於該凝血酶所引起的蛋白質C之活化而認為可作為抗血液凝固劑或血栓溶解劑使用，亦有關於凝血酶調節素可有效治療、預防伴有凝固亢進的疾病之動物實驗方面的報告(非專利文獻2)。
先前，凝血酶調節素係作為在以人為代表的各種動物的血管內皮細胞上表現之糖蛋白質而發現並取得，其後業者成功地進行了選殖。亦即，利用基因工程學方法自人體肺cDNA基因庫中選殖出含訊息肽之人體凝血酶調節素前驅物的基因，繼而對凝血酶調節素的全基因序列 進行分析，而獲知含訊息肽(通常可例示18個胺基酸殘基)的575個殘基之胺基酸序列(專利文獻1)。已知悉，將訊息肽切斷之成熟的凝血酶調節素，係自其成熟肽的N末端側開始，由N末端區域(第1~226號：認定訊息肽為18個胺基酸殘基之情形時之位置表示，以下相同)、具有6個類EGF構造之區域(第227~462號)、O型糖鏈附加區域(第463~498號)、膜貫通區域(第499~521號)、以及細胞質內區域(第522~557號)之五個區域所構成，而且，作為具有與全長的凝血酶調節素相同活性之部分(亦即最小活性單位)，在具有6個類EGF結構之區域中，主要係自N末端側開始由第4、5、6號類EGF結構所構成之部分(非專利文獻3)。
全長之凝血酶調節素若沒有界面活性劑存在則難以溶解，作為製劑則必須添加界面活性劑，相反卻存在即使沒有界面活性劑存在下亦可充分溶解之可溶性凝血酶調節素。可溶性凝血酶調節素，若以至少不含有膜貫通區域的一部分或全部之方式進行製備即可，例如，僅由N末端區域與具有6個類EGF結構之區域與O型糖鏈附加區域三個區域所構成之(亦即，由序列編號1之第19~516位胺基酸序列所構成)可溶性凝血酶調節素，可藉由應用重組技術而取得，而且可確認，該重組體可溶性凝血酶調節素具有天然凝血酶調節素之活性(專利文獻1)。此外，作為可溶性凝血酶調節素之例，有若干報告(專利文獻2~9)。或者，作為天然型可溶性凝血酶調節素，亦可例示源自人尿之可溶性凝血酶調節素等(專利文獻10、11)。
附帶說明，由於基因中之自然突變或取得時之突變，如多數情況下所見，於人體中亦可見多型性之突變，已確認有上述由575個殘基的胺基酸序列所構成之人體凝血酶調節素前驅物的第473位胺基酸為Val者、以及為Ala者。於編碼該胺基酸之鹼基序列中，於第1418位，相當於T與C之突變(非專利文獻4)。然而，於活性及物性方面卻完全相同，可判斷兩者實質上係相同。
報告有，凝血酶調節素在DIC(Disseminated Intravascular Coagulation，瀰漫性血管內凝血)治療方面有效(非專利文獻5)。作為凝血酶調節素之用途，除上述以外，例如，可期待用於急性冠狀動脈綜合症(ACS，Acute Coronary Syndrome)、血栓症、末梢血管閉塞症、閉塞性動脈硬化症、血管炎、心臟手術後續發之功能性障礙、器官移植之併發症、心絞痛、一過性腦缺血發作、妊娠中毒症、糖尿病、肝VOD(Liver veno-occlusive disease，猛爆性肝炎或骨髓移植後之肝靜脈閉塞症)、深部靜脈血栓症(DVT，Deep venous thrombosis)等、以及進而用於成人呼吸窘迫症(ARDS，Adult respiratory distress syndrome)疾病之治療及預防。
作為凝血酶調節素之變性體，已知有於冷凍乾燥步驟中生成之凝集體及於冷凍乾燥狀態下長期保存中所生成之凝集體(專利文獻12~16)。
考慮到於醫藥品方面之利用，作為以工業規模製造可溶性凝血酶調節素之方法，例如已知有：採用承載有針對凝血酶調節素的抗體之親和層析作為純化步驟之方法；實質上不含血清來源物及抗體來源物之高純度可溶性凝血酶調節素之製造方法，其特徵在於：於進一步使利用親和層析所獲得之該可溶性凝血酶調節素在比電導為25~34ms/cm、pH值為3~4之條件下與陽離子交換體接觸之步驟中，取得作為連續通過之部份之該可溶性凝血酶調節素(專利文獻17)；以及凝血酶調節素之純化方法，其特徵在於：藉由凝血酶結合親和層析法將含有人尿凝血酶調節素之試料進行預純化，繼而藉由以羥磷灰石為吸附劑之吸附層析法進行純化(專利文獻18)。
[專利文獻1]日本專利特開昭64-6219號公報
[專利文獻2]日本專利特開平2-255699號公報
[專利文獻3]日本專利特開平3-133380號公報
[專利文獻4]日本專利特開平3-259084號公報
[專利文獻5]日本專利特開平4-210700號公報
[專利文獻6]日本專利特開平5-213998號公報
[專利文獻7]WO 92/00325號公報
[專利文獻8]WO 92/03149號公報
[專利文獻9]WO 93/15755號公報
[專利文獻10]日本專利特開平3-86900號公報
[專利文獻11]日本專利特開平3-218399號公報
[專利文獻12]日本專利特開平6-321085號公報
[專利文獻13]日本專利第3007785號公報
[專利文獻14]日本專利特開平11-171790號公報
[專利文獻15]WO 95/16460號公報
[專利文獻16]日本專利第3822383號公報
[專利文獻17]日本專利特開平11-341990號公報
[專利文獻18]日本專利第3745805號公報
[非專利文獻1]鈴木宏治，醫學進展，第125卷，901頁(1983年)
[非專利文獻2]K. Gomi等人Blood 75. 1396~1399(1990)
[非專利文獻3]M. Zushi等人，J. Biol. Chem.，246，10351~10353(1989)
[非專利文獻4]D. Z. Wen等人，Biochemistry，26，4350~4357(1987)
[非專利文獻5]S. M. Bates等人，Br. J. Pharmacol.，144，1017~1028(2005)
本發明之課題在於提供以高生產性製造實質上不含可溶性凝血酶調節素的變性體之凝血酶調節素之方法。
本發明者們發現以下新穎的課題：於以工業級製造可溶性凝血酶調節素之過程中，又於藉由包括於酸性條件下使病毒不活性化的步驟之製造方法來製造可溶性凝血酶調節素之過程中，將可溶性凝血酶調節素置於酸性條件下時會生成該可溶性凝血酶調節素的變性體，必須將其高效率地去除。本發明者們為了去除該可溶性凝血酶調節素的變性體，對凝膠過濾層析法(GFC，Gel Filtration Chromatography)、尺寸排除層析儀(SEC，Size exclusion chromatography)等之使用進行了研究。然而，發現凝膠過濾層析儀(GFC)、尺寸排除層析儀(SEC)之處理容量較少，一般為管柱容積的5%以下，因而必須加大管柱容積或者進行複數次循環。又，作為提高效率之方法，會考慮加快層析線速，但加快線速會使分離能力下降，因此認為並不合適。進而，作為其他方法，會考慮提高處理蛋白質濃度，但若增加提高蛋白質濃度之濃縮步驟，則存在以由於高蛋白濃度所造成的高黏性為要因之分離能力下降等問題。
因此，本發明者基於上述新穎的課題，為了以工業級製造可溶性凝血酶調節素，則認為重要的是，以解決上述問題的生產性高之方法分離出該可溶性凝血酶調節素的變性體。本發明者為了解決上述新穎的課題，而以各種層析載體對各種條件進行了努力研究，結果成功發現了以下方法：藉由使用陰離子交換體或羥磷石灰作為載體，並就各載體找出其適當的條件，而高效率且穩定地分離出該可溶性凝血酶調節素的變性體。
亦即，作為本發明，可舉出以下者。
[A1]一種可溶性凝血酶調節素之製造方法，其係製造實質上不含由可溶性凝血酶調節素於酸性條件下可生成的該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素者，此製造方法包括以下步驟：(1)將含有或者疑為含有該可溶性凝血酶調節素的變性體之該可 溶性凝血酶調節素含有物供給於陰離子交換體或羥磷灰石；及(2)以可將該可溶性凝血酶調節素與該可溶性凝血酶調節素的變性體加以分離之分離條件，取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素之部份。
[A2]如上述[A1]所述之製造方法，其係製造實質上不含由可溶性凝血酶調節素於酸性條件下可生成的該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素者，此製造方法包括以下步驟：(0)將該可溶性凝血酶調節素置於pH值為5以下之酸性條件下；(1)將經由上述(0)步驟所獲得之含有或者疑為含有該可溶性凝血酶調節素的變性體之該可溶性凝血酶調節素含有物供給於陰離子交換體或羥磷灰石；及(2)以可將該可溶性凝血酶調節素與該可溶性凝血酶調節素的變性體加以分離之分離條件，取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素之部份。
[A2-2]如上述[A1]所述之製造方法，其係製造實質上不含由可溶性凝血酶調節素於酸性條件下可生成的該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素者，此製造方法包括如下步驟：(＊)將可溶性凝血酶調節素加以純化；(0)將該可溶性凝血酶調節素置於pH值為5以下之酸性條件下；(1)將經由上述(0)步驟所獲得之含有或者疑為含有該可溶性凝血酶調節素的變性體之該可溶性凝血酶調節素含有物供給於陰離子交換體或羥磷灰石；及(2)以可將該可溶性凝血酶調節素與該可溶性凝血酶調節素的變性體加以分離之分離條件，取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素之部份。
[A2-3]如上述[A1]、[A2]、或[A2-2]中任一項所述之製造方法，其 中將該可溶性凝血酶調節素含有物供給於陰離子交換體或羥磷灰石之步驟係將該可溶性凝血酶調節素含有物供給於陰離子交換體。
[A2-4]如上述[A1]、[A2]或[A2-2]中任一項所述之製造方法，其中將該可溶性凝血酶調節素含有物供給於陰離子交換體或羥磷灰石之步驟係將該可溶性凝血酶調節素含有物供給於羥磷灰石。
[A3]如上述[A1]至[A2-4]中任一項所述之製造方法，其中可溶性凝血酶調節素係相對於可溶性凝血酶調節素含有物中的全蛋白之含有率為80%以上者。
再者，如上述[A1]至[A2-4]般所引用之項編號表示範圍，於該範圍內配置有[A2-2]等具有次編號之項之情形時，意指亦引用[A2-2]等具有次編號之項。以下亦相同。
[A3-2]如上述[A1]至[A2-4]中任一項所述之製造方法，其中可溶性凝血酶調節素係相對於可溶性凝血酶調節素含有物中的全蛋白之含有率為90%以上者。
[A3-3]如上述[A1]至[A2-4]中任一項所述之製造方法，其中可溶性凝血酶調節素係相對於可溶性凝血酶調節素含有物中的全蛋白之含有率為95%以上者。
[A3-4]如上述[A1]至[A2-4]中任一項所述之製造方法，其中可溶性凝血酶調節素係相對於可溶性凝血酶調節素含有物中的全蛋白之含有率為99%以上者。
[A4]如上述[A1]至[A3-4]中任一項所述之製造方法，其中(2)步驟係進行線性或逐步、或者將線性與逐步組合之梯度溶出，而取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份。
再者，如上述[A1]至[A3-4]般所引用之項編號表示範圍，於該範圍內配置有[A3-2]等具有次編號之項之情形時，意指亦引用[A3-2]等具 有次編號之項。以下亦相同。
[A5]如上述[A1]至[A3-4]中任一項所述之製造方法，其中(2)步驟係取得連續通過之部份者，且該步驟係取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素之部份者。
[A6]如上述[A1]至[A3-4]中任一項所述之製造方法，其中(2)步驟係進行等位溶出而取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份。
[A7]如上述[A1]至[A3-4]中任一項所述之製造方法，其中(1)步驟係使用pH值為4~9的緩衝液將該可溶性凝血酶調節素含有物供給於陰離子交換體；(2)步驟係以下步驟：使用pH值為5~9且鹽濃度為0~1M的緩衝液進、行線性或逐步、或者將線性與逐步組合之梯度溶出，(a)預先確認可溶性凝血酶調節素溶出之部份的位置，而取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份，或者(b)一面確認溶出部份中存在有可溶性凝血酶調節素，一面取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份。
[A7-2]如上述[A7]所述之製造方法，其中(a)或(b)步驟為(a)步驟。
[A7-3]如上述[A7]所述之製造方法，其中(a)或(b)步驟為(b)步驟。
[A8]如上述[A1]至[A3-4]中任一項所述之製造方法，其中(1)步驟係使用pH值為5~8且鹽濃度為0.1~0.2M的緩衝液，將該可溶性凝血酶調節素含有物供給於陰離子交換體；(2)步驟係使用pH值為5~8且鹽濃度為0.1~0.2M的緩衝液取得連續通過之部份，藉此取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的部份。
[A9]如上述[A1]至[A3-4]中任一項所述之製造方法，其中(1)步驟係使用pH值為6~9且磷酸鹽濃度為8mM以下的緩衝液，將可溶性凝血酶調節素含有物供給於羥磷灰石；(2)步驟係使用pH值為6~9且磷酸鹽 濃度為0~0.5M的緩衝液進行線性或逐步、或者將線性與逐步組合之梯度溶出，(a)預先確認可溶性凝血酶調節素溶出之部份的位置，而取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份，或者(b)一面確認溶出部份中存在有可溶性凝血酶調節素，一面取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份。
[A9-2]如上述[A9]所述之製造方法，其中(a)或(b)步驟為(a)步驟。
[A9-3]如上述[A9]所述之製造方法，其中(a)或(b)步驟為(b)步驟。
[A10]如上述[A1]至[A3-4]中任一項所述之製造方法，其中(1)步驟係使用pH值為6~9且磷酸鹽濃度為5~20mM的緩衝液，將該可溶性凝血酶調節素含有物供給於羥磷灰石之步驟；(2)步驟係使用pH值為6~9且磷酸鹽濃度為5~20mM的緩衝液取得連續通過之部份，藉此取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的部份。
[A11]如上述[A1]至[A10]中任一項所述之製造方法，其中不包括以下步驟：於取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份後，將該部份之pH值設為4以下。
[A12]如上述[A1]至[A11]中任一項所述之製造方法，其中係包括在取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份後，不將該部份的pH值設為4以下之濃縮步驟及/或脫鹽步驟者，該方法係用以將該可溶性凝血酶調節素作為醫藥原料者。
[A13]如上述[A1]至[A12]中任一項所述之製造方法，其中實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素中，可溶性凝血酶調節素的變性體之含有率為3%以下。
[A14]如上述[A1]至[A13]中任一項所述之製造方法，其中該可溶 性凝血酶調節素係由將編碼序列編號9或序列編號11中所記載之胺基酸序列之DNA轉染至宿主細胞的製備之轉形細胞中所取得者。
[A15]一種可溶性凝血酶調節素之純化方法，其係以實質上不含有由可溶性凝血酶調節素於酸性條件下可生成的該可溶性凝血酶調節素的變性體之方式，將可溶性凝血酶調節素加以純化之方法，其包括以下步驟：(1)將含有或者疑為含有該可溶性凝血酶調節素的變性體之該可溶性凝血酶調節素含有物供給於陰離子交換體或羥磷灰石；(2)以可將該可溶性凝血酶調節素與該可溶性凝血酶調節素的變性體加以分離之分離條件，取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份，或者，該純化方法中，在將該可溶性凝血酶調節素含有物供給於陰離子交換體或羥磷灰石之步驟中，製備該可溶性凝血酶調節素含有物的緩衝液，取得作為連續通過之部份之實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素。
[A15-2]如上述[A15]所述之純化方法，其具有上述[A1]至[A14]中任一項所述之特徵。
[A16]如上述[A1]至[A15]中任一項所述之製造方法，其中實質上不含可溶性凝血酶調節素的變性體之凝血酶調節素中的可溶性凝血酶調節素的變性體之含有率為3.0%以下。
[B1]一種凝血酶調節素之製造方法，其係由含有或者疑為含有由可溶性凝血酶調節素於酸性條件下可生成的該可溶性凝血酶調節素的變性體之該可溶性凝血酶調節素含有物，製造實質上不含有該可溶性凝血酶調節素的變性體之凝血酶調節素者，其包括以下步驟：(1)將該凝血酶調節素含有物供給於陰離子交換體或羥磷灰石；(2)以可將該可溶性凝血酶調節素與該可溶性凝血酶調節素的變性體加以分離之分離條件，取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性 凝血酶調節素的溶出部份。
[B2]一種凝血酶調節素之製造方法，其係由含有或者疑為含有由可溶性凝血酶調節素於酸性條件下可生成的該可溶性凝血酶調節素的變性體之該可溶性凝血酶調節素含有物，製造實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之凝血酶調節素者；於將該凝血酶調節素含有物供給於陰離子交換體或羥磷灰石之步驟中，製備該凝血酶調節素含有物的緩衝液，取得作為連續通過之部份之實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素。
[B3]如[B1]所述之製造方法，其中(1)步驟係將可溶性凝血酶調節素含有物供給於陰離子交換體，且所使用之緩衝液的pH值為4~9；(2)步驟係使用pH值為5~9、且鹽濃度為0~1M之緩衝液進行線性或逐步、或者將線性與逐步加以組合之梯度溶出，預先確認而取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份，或者一面確認溶出部份，一面取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份。
[B4]如[B1]所述之製造方法，其中(1)步驟，係將可溶性凝血酶調節素含有物供給於陰離子交換體，所使用之緩衝液的pH值為4~5之步驟；(2)步驟，係使用pH值為5~9、且鹽濃度為0~1M之緩衝液進行線性或逐步、或者將線性與逐步組合之梯度溶出，預先確認而取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份，或者一面確認溶出部份，一面取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份。
[B5]如[B2]所述之製造方法，其中緩衝液之pH值為5~8、鹽濃度為0.1~0.2M，將可溶性凝血酶調節素含有物供給於陰離子交換體，取得作為連續通過之部份之實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素。
[B6]如[B1]所述之製造方法，其中(1)步驟係將可溶性凝血酶調節素含有物供給於羥磷灰石，所使用之緩衝液的pH值為6~9、磷酸濃度為8mM以下；上述(2)步驟係所使用pH值為6~9、且磷酸鹽濃度為0~0.5M之緩衝液進行線性或逐步、或者將線性與逐步加以組合之梯度溶出，預先確認再取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份，或者一面確認溶出部份，一面取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份。
[B7]如[B1]所述之製造方法，其中(1)步驟係將可溶性凝血酶調節素含有物供給於羥磷灰石，所使用之緩衝液的pH值為6~9、磷酸濃度為1~4mM；上述(2)步驟係使用pH值為6~9、且磷酸鹽濃度為1~40mM之緩衝液進行線性或逐步、或者將線性與逐步加以組合之梯度溶出，預先確認而取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份，或者一面確認溶出部份，一面取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份。
[B8]如[B2]所述之製造方法，其中緩衝液之pH值為6~9，磷酸鹽濃度為5~20mM，將可溶性凝血酶調節素含有物供給於羥磷灰石，取得作為連續通過之部份之實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素。
[B9]如[B1]至[B8]中任一項所述之製造方法，其中於取得含有實質上不含可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份後，不將該部份之pH值設為4以下。
[B10]如[B1]至[B8]中任一項所述之製造方法，其中於取得含有實質上不含可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份後，藉由不將該部份之pH值設為4以下之濃縮步驟或脫鹽步驟而 製成醫藥原料。
[B11]如[B1]至[B10]中任一項所述之製造方法，其中實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素中的可溶性凝血酶調節素的變性體之含有率為3%以下。
[B12]如[B1]至[B11]中任一項所述之製造方法，其中實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素中的可溶性凝血酶調節素的變性體之含有率為1%以下。
[B13]如[B1]至[B12]中任一項所述之製造方法，其中該凝血酶調節素係由將編碼序列編號9或序列編號11中所記載之胺基酸序列之DNA轉染至宿主細胞而製備之轉形細胞所取得之肽。
藉由使用本發明之製造方法，能夠進行無需提高處理蛋白質濃度之濃縮步驟、處理容積不受限制、生產性高的該可溶性凝血酶調節素的變性體之分離，從而可取得實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之高純度可溶性凝血酶調節素。
圖1表示實施例4中之利用陰離子交換體線性梯度溶出將可溶性凝血酶調節素的變性體進行分離之層析圖。
圖2表示實施例5中利用陰離子交換體線性梯度溶出將可溶性凝血酶調節素的變性體進行分離之層析圖。
圖3表示實施例6中利用陰離子交換體線性梯度溶出將可溶性凝血酶調節素的變性體進行分離之層析圖。
圖4表示對於實施例3中所取得之高純度純化品測定可溶性凝血酶調節素的變性體之含量的結果。
圖5表示實施例8中利用陰離子交換體階段梯度溶出將可溶性凝血酶調節素的變性體去除之層析圖。
圖6表示實施例11中利用羥磷灰石階段梯度溶出將可溶性凝血酶調節素的變性體去除之層析圖。
圖7表示實施例14中使用強陰離子交換體之高純度化以及將可溶性凝血酶調節素的變性體去除之層析圖。
已知悉，本發明之凝血酶調節素具有以下作用：(1)與凝血酶選擇性結合，(2)促進由於凝血酶所導致的蛋白質C之活化。又，較好的是，通常可認定凝血酶調節素具有以下作用：(3)延長使用凝血酶之凝固時間，及/或(4)抑制由於凝血酶所導致之血小板凝集。有時將該等凝血酶調節素所具有之作用稱為凝血酶調節素活性。
作為凝血酶調節素活性，較好的是具有上述(1)及(2)之作用，更好的是具有上述(1)~(4)之所有作用。
促進由於凝血酶所導致蛋白質C活化之作用，例如，藉由以日本專利特開昭64-6219號公報為代表的各種公知文獻中所明確記載之試驗方法，可容易地確認促進蛋白質C活化之作用的活性量及其有無。又，低於延長使用凝血酶的凝固時間之作用、及/或抑制由於凝血酶而引起血小板凝集之作用，亦能夠以同樣之方式容易地確認。
本發明所記載之可溶性凝血酶調節素，作為示例，可舉出於界面活性劑不存在下可溶於水之可溶性凝血酶調節素。作為可溶性凝血酶調節素之溶解性的較佳例示，可舉出：對於水例如注射用蒸餾水(於Triton X-100或聚醚醇(polidocanol)等界面活性劑不存在下，通常於中性附近)之溶解度為1mg/ml以上、或10mg/ml以上，較好地舉出15mg/ml以上、或17mg/ml以上，更好地例示20mg/ml以上、25mg/ml以上、或30mg/ml以上，尤其好地舉出60mg/ml以上，根據情況，可分別舉出80mg/ml以上、或100mg/ml以上。當判斷可溶性凝血酶調節素是否可溶解時，一般理解為，於溶解後例如在白色光源的正下方、亮 度約1000勒克司之位置用肉眼進行觀察之情形時，將清澈、不含有明確可見程度之不溶性物質的狀況作為明確的指標。又，亦可進行過濾再確認有無殘渣。
作為本發明之可溶性凝血酶調節素，較好的是包含人類型凝血酶調節素中作為凝血酶調節素活性的中心部位而已知的序列編號1之第19~132位之胺基酸序列，若包含序列編號1之第19~132位之胺基酸序列，則無特別限定。該序列編號1之第19~132位之胺基酸序列，只要具有促進由於凝血酶所導致的蛋白質C活化之作用亦即具有凝血酶調節素活性，即可發生自然或人工突變，亦即序列編號1之第19~132位胺基酸序列的一個或複數個胺基酸產生置換、缺失、附加。對於所容許之突變程度，若具有凝血酶調節素活性則無特別限定，例如可例示，作為胺基酸序列有50%以上之同源性，較好的是70%以上之相同性，更好的是80%以上之相同性，進而更好的是90%以上之相同性，尤其好的是95%以上之相同性，最好的是98%以上之相同性。將如該等之胺基酸序列稱為相同突變序列。該等突變，如後述若使用通常之基因操作技術則可容易地取得。
序列編號3之序列，係序列編號1之序列之第125位胺基酸即Val突變成Ala者，作為本發明之可溶性凝血酶調節素，亦較好的是包含序列編號3之第19~132位之胺基酸序列。
如此般，本發明之可溶性凝血酶調節素，至少具有序列編號1或序列編號3之第19~132位序列或者其等之相同突變序列，若包含至少具有凝血酶調節素活性之肽序列則無特別限定，但作為較佳例，可舉出：由序列編號1或序列編號3的各自中的第19~132位或第17~132位序列所構成之肽、或者由上述序列之相同突變序列所構成且至少具有凝血酶調節素活性之肽；更好的是由序列編號1或序列編號3的第19~132位序列所構成之肽。又，由序列編號1或序列編號3各自中的第19~132位或 第17~132位之相同突變序列所構成且至少具有凝血酶調節素活性之肽，亦有更好的其他態樣。
又，作為本發明之可溶性凝血酶調節素之其他態樣，較好的是包含序列編號5之第19~480位之胺基酸序列，若包含序列編號5之第19~480位之胺基酸序列則無特別限定。該序列編號5之第19~480位之胺基酸序列，只要具有促進由於凝血酶所導致的蛋白質C活化之作用亦即凝血酶調節素活性，則亦可為其相同突變序列。
序列編號7之序列，係序列編號5之序列之第473位胺基酸即Val突變成Ala者，作為本發明之可溶性凝血酶調節素，亦較好的是，包含序列編號7之第19~480位之胺基酸序列。
如此般，本發明之可溶性凝血酶調節素，至少具有序列編號5或序列編號7之第19~480位之序列、或其等之相同突變序列，若包含至少具有凝血酶調節素活性之肽序列則無特別限定，但作為較佳例，可舉出：由序列編號5或序列編號7各自中的第19~480位或第17~480位序列所構成之肽、或者由上述序列的相同突變序列構成且至少具有凝血酶調節素活性之肽，更好的是由序列編號5或序列編號7之第19~480位序列所構成之肽。又，由序列編號5或序列編號7各自中的第19~480位或第17~480位之相同突變序列構成且至少具有凝血酶調節素活性之肽，亦有更好的其他態樣。
又，作為本發明之可溶性凝血酶調節素之其他態樣，較好的是包含序列編號9之第19~515位之胺基酸序列，若包含序列編號9之第19~515位之胺基酸序列則無特別限定。該序列編號9之第19~515位之胺基酸序列，只要具有促進由於凝血酶而導致的蛋白質C活化之作用亦即凝血酶調節素活性，則亦可為其相同突變序列。
序列編號11之序列，係序列編號9之序列之第473位胺基酸即Val突變成Ala者，但作為本發明之凝血酶調節素，亦較好的是，包含序列 編號11之第19~515位之胺基酸序列。
如此般，本發明之可溶性凝血酶調節素，至少具有序列編號9或序列編號11之第19~515位之序列、或其等之相同突變序列，若包含至少具有凝血酶調節素活性之肽序列則無特別限定，作為更好之例，可舉出：由序列編號9或序列編號11各自中的第19~516位、第19~515位、第17~516位、或第17~515位之序列所構成之肽，或者由上述序列之相同突變序列所構成且至少具有凝血酶調節素活性之肽；尤其好的是由序列編號9中的第19~516位、第19~515位、第17~516位、或第17~515位之序列所構成之肽。亦可舉出其等之混合物，作為較好之例。又，由序列編號11的第19~516位、第19~515位、第17~516位、或第17~515位之序列構成之肽，亦有其尤其好的其他態樣。亦可舉出該等之混合物，作為較好之例。進而，作為較好之例，亦可舉出：由其等之相同突變序列所構成且至少具有凝血酶調節素活性之肽。
所謂具有相同突變序列之肽，係如上所述，但亦係指對象肽之胺基酸序列中有1個以上、亦即1個或複數個胺基酸、更好的是數個(例如1~20個，較好的是1~10個，更好的是1~5個，尤其好的是1~3個)胺基酸可產生置換、缺失、附加之肽。所容許之突變程度，若具有凝血酶調節素活性則無特別限定，例如可例示，作為胺基酸序列有50%以上之相同性，較好的是70%以上之相同性，更好的是80%以上之相同性，進而更好的是90%以上之相同性，尤其好的是95%以上之相同性，最好的是98%以上之相同性。
進而，本發明之可溶性凝血酶調節素，作為較好之例，亦可舉出：日本專利特開昭64-6219中之由序列編號14之序列(462個胺基酸殘基)所構成之肽、由序列編號8之序列(272個胺基酸殘基)所構成之肽、或由序列編號6之序列(236個胺基酸殘基)所構成之肽。
作為本發明之可溶性凝血酶調節素，只要為至少具有序列編號1 或序列編號3之第19~132位的胺基酸序列之肽則無特別限定，其中，較好的是至少具有序列編號5或序列編號7之第19~480位的胺基酸序列之肽，更好的是至少具有序列編號9或序列編號11之第19~515位的胺基酸序列之肽。具有序列編號9或序列編號11之第19~515位的胺基酸序列之肽，作為其更好之例，可舉出：由序列編號9或序列編號11各自中的第19~516位、第19~515位、第17~516位、或第17~515位的序列所構成之肽。又，作為更好之例，亦可舉出：由序列編號9或序列編號11各自中之第19~516位、第19~515位、第17~516位、或第17~515位的序列所構成之肽的序列編號9或序列編號11各自之混合物。
於上述混合物之情形時，作為序列編號9或序列編號11各自中的自第17位開始之肽與自第19位開始之肽的混合比例，可例示(30：70)~(50：50)，作為較好之例，可舉出(35：65)~(45：55)。
又，作為序列編號9或序列編號11各自中的於第515位終止之肽與於第516位終止之肽的混合比例，可例示(0：100)~(90：10)，根據情況可例示(70：30)~(90：10)、(0：100)~(30：70)。
該等肽之混合比例，可藉由通常之方法而求出。
再者，序列編號1之第19~132位之序列相當於序列編號9之第367~480位之序列，序列編號5之第19~480位之序列相當於序列編號9之第19~480位之序列。
又，序列編號3之第19~132位之序列相當於序列編號11之第367~480位之序列，序列編號7之第19~480位之序列相當於序列編號11之第19~480位之序列。
進而，序列編號1、3、5、7、9及11各自中的第1~18位之序列，均為相同序列。
該等本發明之凝血酶調節素，如後述，可由利用載體將編碼該等序列編號1、3、5、7、9或11等肽之DNA(具體而言，分別為序列編號2、 序列編號4、序列編號6、序列編號8、序列編號10或序列編號12等之鹼基序列)轉染至宿主細胞所製備之轉形細胞而取得。作為凝血酶調節素，較好的是，由利用載體將編碼序列編號9或序列編號11的胺基酸序列之DNA(具體而言分別為序列編號10或序列編號12)轉染至宿主細胞中所製備之轉形細胞而取得之凝血酶調節素。
進而，該等肽若具有上述胺基酸序列即可，可附加糖鏈，亦可不附加糖鏈，對於該點並無特別限定。又，於基因操作中，糖鏈之種類、及附加位置及附加程度，根據所使用宿主細胞之種類而不同，可使用任意者。關於糖鏈之結合位置及種類，已知有日本專利特開平11-341990所記載之事實，本發明之凝血酶調節素，亦有時在相同的位置附加相同的糖鏈。如後述，對於藉由基因操作而取得，並無規定，於藉由基因操作而取得之情形時，作為可於表現時使用之訊息序列，可利用編碼上述序列編號9之第1~18位的胺基酸序列之鹼基序列、編碼序列編號9之第1~16位的胺基酸序列之鹼基序列、其他公知之訊息序列例如人體組織型纖維蛋白溶酶原活化物之訊息序列(國際公開88/9811號公報)。
於將編碼凝血酶調節素之DNA序列導入宿主細胞之情形時，較好地舉出：藉由將編碼凝血酶調節素之DNA序列重組至載體、尤其好的是動物細胞中能夠表現之表現載體，而進行導入之方法。所謂表現載體，係指由啟動子序列、向mRNA賦予核糖體結合部位之序列、編碼欲表現的蛋白之DNA序列、剪接訊息、轉錄終止之終止子序列、複製起源序列等所構成之DNA分子，作為較好的動物細胞表現載體之例，可舉出R.C.Mulligan等人[Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78.2072(1981)]所報告之pSV2-X、及P.M.Howley等人[Method in Emzymology,101,387,Academic Press(1983)]所報告之pBP69T(69-6)等。
至於在製造該等肽時可使用之宿主細胞，可舉出：中國倉鼠卵巢 (CHO)細胞、COS-1細胞、COS-7細胞、VERO(ATCC CCL-81)細胞、BHK細胞、源自狗腎之MDCK細胞、倉鼠AV-12-664細胞等，又，至於源自人體之細胞，可舉出：HeLa細胞、WI38細胞、人體293細胞；因CHO細胞極為普通故較好，於CHO細胞中，更好的是DHFR-CHO細胞。
又，於基因操作過程或肽製造過程中，亦經常使用大腸桿菌等微生物，較好的是使用適於各過程之宿主-載體系統，於上述宿主細胞中亦可選擇適宜的載體系統。對於基因重組技術所使用之凝血酶調節素之基因，已揭示有預先經選殖繼而利用凝血酶調節素之基因重組技術之製造例，進而亦已知用以獲得其純化品之純化方法[日本專利特開昭64-6219號公報、日本專利特開平2-255699號公報、日本專利特開平5-213998號公報、日本專利特開平5-310787號公報、日本專利特開平7-155176號公報、J.Biol.Chem.,264：10351-10353(1989)]。因此，本發明中所使用之可溶性凝血酶調節素，可藉由利用上述報告所記載之方法，或者藉由以其等報告中所記載之方法為基準而製造。例如，日本專利特開昭64-6219號公報中，揭示有含有質體pSV2凝血酶調節素J2之Escherichia coli K-12 strain DH5(ATCC寄存編號67283號)，其中質體pSV2凝血酶調節素J2含有編碼全長的凝血酶調節素之DNA。又，亦可使用將該菌株再寄存於生命研(現獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心)之菌株(Escherichia coli DH5/pSV2TM J2)(FERMBP-5570)。可將編碼該全長的凝血酶調節素之DNA作為原料，且藉由公知之基因操作技術，而製備本發明之凝血酶調節素。
本發明所使用之可溶性凝血酶調節素，若利用先前公知之方法或者利用以其為基準之方法進行製備即可，例如，可參考上述山本等人之方法[日本專利特開昭64-6219號公報]、或日本專利特開平5-213998號公報。亦即，藉由基因操作技術，將源自人體之凝血酶調節素基因製成例如編碼序列編號9的胺基酸序列之DNA，進而根據需要亦可進行 改變。作為此改變，例如，為了形成編碼序列編號11的胺基酸序列之DNA(具體而言，由序列編號12之鹼基序列所構成)，而對於編碼序列編號9的胺基酸序列的第473位胺基酸之密碼子(尤其是第1418位的鹼基)，依照[Methods in Enzymology,100：468(1983年)，Academic Press]所記載之方法，進行部位特異性突變。例如，可形成使用具有序列編號13中所示鹼基序列之突變用合成DNA將序列編號10的第1418位的鹼基T變換成鹼基C之DNA。
將如此製備之DNA重組入例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中而成為轉形細胞，再進行適當選擇，培養該細胞，由所獲得的培養液，藉由公知方法可製造經純化之凝血酶調節素。如上所述，較好的是將編碼序列編號9的胺基酸序列之DNA(序列編號10)轉染入上述宿主細胞中。本發明所採用之凝血酶調節素之生產方法，並不限定於上述方法，例如，亦可自生產凝血酶調節素的組織或該等組織的培養液等中進行萃取純化，又亦可根據需要進一步利用蛋白分解酶進行切斷處理。
於藉由上述細胞培養方法製造本發明之凝血酶調節素之情形時，由於蛋白質之轉譯後修飾，有時會發現N末端胺基酸具有多樣性。例如，有時序列編號9的第17位、18位、19位、或22位胺基酸成為N末端。又，例如，有時以將第22位的麩胺酸變換成焦谷胺酸(pyroglutamic acid)之方式，對N末端胺基酸加以修飾。較好的是第17位或19位的胺基酸成為N末端，更好的是第19位的胺基酸成為N末端。又，第17位的胺基酸成為N末端，亦係較好的其他態樣。關於以上修飾及多樣性等，就序列編號11而言亦可舉出同樣之例。
進而，於使用具有序列編號10的鹼基序列之DNA來製造凝血酶調節素之情形時，會發現C末端胺基酸之多樣性，有時會製造具有1個胺基酸殘基之短肽。亦即，有時第515位的胺基酸成為C末端，進而以將該第515位醯胺化之方式，對C末端胺基酸加以修飾。因此，有時製造 N末端胺基酸及C末端胺基酸具有豐富多樣性之肽、或者其等之混合物。較好的是第515位的胺基酸成為C末端。又，第516位的胺基酸成為C末端，亦為較好的其他態樣。關於以上修飾及多樣性等，就具有序列編號12的鹼基序列之DNA而言亦同樣。
以上述方法獲得之凝血酶調節素，有時係發現於N末端及C末端具有多樣性之肽的混合物。具體可舉出：由序列編號9中的第19~516位、第19~515位、第17~516位、或第17~515位的序列所構成之肽的混合物。
根據本發明，可提供一種可溶性凝血酶調節素之製造方法，其中該可溶性凝血酶調節素實質上不含有由可溶性凝血酶調節素於酸性條件下可生成的該可溶性凝血酶調節素的變性體。該製造方法若包括以下步驟則無特別限定：(1)將含有或者疑為含有該可溶性凝血酶調節素的變性體之該可溶性凝血酶調節素含有物供給於陰離子交換體或羥磷灰石；及(2)以可將該可溶性凝血酶調節素與該可溶性凝血酶調節素的變性體加以分離之分離條件，取得含有實質上不含有該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素之部份；此製造方法，較好的是，於(1)步驟之前包括(0)將該可溶性凝血酶調節素置於pH值為5以下的酸性條件下之步驟，更好的是，於(1)步驟之前包括(0)將該可溶性凝血酶調節素置於pH值為5以下的酸性條件下之步驟、且包括(＊)將可溶性凝血酶調節素加以純化之步驟。於本發明之製造方法中，對於(＊)步驟之位置並無特別限定，但較好的是位於(1)步驟之前。
作為由本發明之可溶性凝血酶調節素於酸性條件下可生成該可溶性凝血酶調節素的變性體之酸性條件，例如可例示：pH值為5以下，較好的是pH值為4以下，更好的是pH值為3以下；作為該pH值之下限，例如可例示：pH值為1以上，較好的是pH值為2以上，更好的是pH值為3以上。又，作為於酸性條件下之時間，例如可例示：0.5小時以上，較好的是1小時以上，更好的是2小時以上。又，作為於酸性條件下之 溫度，例如可例示：室溫，較好的是15℃以下，更好的是8℃以下；作為該溫度之下限，可例示：通常為0℃以上，較好的是2℃以上，更好的是5℃以上。於上述酸性之條件下，則成為可溶性凝血酶調節素與該可溶性凝血酶調節素的變性體之混合物。
作為以本發明之方法而製造之「實質上不含有可溶性凝血酶調節素的變性體之凝血酶調節素」中可溶性凝血酶調節素的變性體之含有率的上限，較好的是3.0%以下，更好的是2.0%以下，進而更好的是1.0%以下，尤其好的是0.5%以下；作為其下限，可例示0.01%以上，較好的是檢測界限以下。可溶性凝血酶調節素的變性體之含有率，可利用層析法進行分析，例如，可使用TSKgel G3000SWXL(7.8mmI.D.×30cm；TOSOH公司)分析用尺寸排除層析儀，以含有硫酸鈉之磷酸緩衝液移動相，供給150μl之分析樣品，於0.9ml/min之流速下，測定於280nm處之吸光度，藉此進行分析，且由可溶性凝血酶調節素及可溶性凝血酶調節素之波峰面積而求出。
於酸性條件下可由本發明之可溶性凝血酶調節素而生成之該可溶性凝血酶調節素的變性體，若使用TSKgel G3000SWXL(7.8mmI.D.×30cm；TOSOH公司)分析用尺寸排除層析儀，以含有硫酸鈉之磷酸緩衝液移動相供給150μl之分析樣品，以0.9ml/min之流速進行分析，則於可溶性凝血酶調節素之保持時間的約90%之保持時間(例如，於可溶性凝血酶調節素之保持時間約為9分鐘之情形時，可溶性凝血酶調節素的變性體之保持時間約為8分鐘)而檢出。又，於酸性條件下可由本發明之可溶性凝血酶調節素而生成之該可溶性凝血酶調節素的變性體，於電泳之Native-PAGE(Native-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis，非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳)下移動而在凝血酶調節素之高分子側被發現，於SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯 醯胺凝膠電泳)下則未被檢出。
作為本發明所使用之含有或者疑為含有於酸性條件下可生成的可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素含有物(以下，簡稱為變性體含有物)，若含有可溶性凝血酶調節素及可溶性凝血酶調節素變性體，則無特別限定，可例示：由使用含有血清成分的培養基或無血清培養基培養可生產可溶性凝血酶調節素之細胞所製備之培養上清液中所獲得之可溶性凝血酶調節素液體，較好地例示：利用使用含有血清成分的培養基或無血清培養基培養可生產可溶性凝血酶調節素之細胞所製備之培養上清液，經由純化步驟而獲得之該可溶性凝血酶調節素液體，或者置於酸性條件下之該可溶性凝血酶調節素液體，更好地例示：利用使用含有血清成分的培養基或無血清培養基培養可生產可溶性凝血酶調節素之細胞所製備之培養上清液，經由純化步驟而獲得之該可溶性凝血酶調節素液體。又，置於酸性條件下之該可溶性凝血酶調節素液體，亦有較好的其他態樣。
作為上述純化步驟，若為可至少去除可溶性凝血酶調節素以外的蛋白質之步驟則無特別限定，但可舉出以下步驟：利用承載有針對凝血酶調節素的抗體之親和層析法，於酸性條件下將該可溶性凝血酶調節素進行溶出回收；或者於比電導度為25~34ms/cm、pH值為3~4之條件下，於利用上述親和層析法所獲得之該可溶性凝血酶調節素進一步與陽離子交換體接觸之步驟中，將作為連續通過之部份之該可溶性凝血酶調節素加以回收。
作為上述可溶性凝血酶調節素含有物(變性體含有物)，若係含有可溶性凝血酶調節素及可溶性凝血酶調節素變性體者則無特別限定，但可例示：實質上不含有除可溶性凝血酶調節素及可溶性凝血酶調節素變性體以外之蛋白者。具體而言，可溶性凝血酶調節素相對於可溶性凝血酶調節素含有物中的全蛋白之含有率，作為下限，可例示50% 以上，較好的是60%以上，更好的是70%以上，進而更好的是80%以上，尤其好的是90%以上，最好的是95%以上，更好的是99%以上。又，有時亦較好的是99.9%以上。作為上述可溶性凝血酶調節素之含有率，可舉出可溶性凝血酶調節素自身之含有率，但有時亦意指將可溶性凝血酶調節素與可溶性凝血酶調節素變性體兩者加以合計之含有率。於可溶性凝血酶調節素之含有率意指將可溶性凝血酶調節素與可溶性凝血酶調節素變性體兩者加以合計之含有率之情形時，可溶性凝血酶調節素相對於可溶性凝血酶調節素含有物中的全蛋白之含有率，作為下限，可例示50%以上，較好的是60%以上，更好的是70%以上，進而更好的是80%以上，尤其好的是90%以上，最好的是95%以上，更好的是99%以上。又，有時亦較好的是99.9%以上。
上述可溶性凝血酶調節素之含有率，可利用層析法進行測定，例如，使用Asahipak C4P-50(4.6mmI.D.×15cm；昭和電工股份有限公司)分析用逆相層析儀，以含有0.1%三氟醋酸之蒸餾水(A液)及含有0.1%三氟醋酸之乙腈(B液)之移動相，提供150μl之分析樣品，以0.8ml/min之流速，使A液與B液之混合比以自96：4開始至48分鐘後變為0：100之方式使使A液與B液之混合比產生直線性變化，測定溶出液於280nm處之吸光度，藉此進行分析，且由可溶性凝血酶調節素及其他蛋白質之波峰面積而求出。又，採用日本專利特開平11-341990號公報所記載之ELISA方法，測定除可溶性凝血酶調節素以外之蛋白質，藉此可求出可溶性凝血酶調節素之含有率。
於本發明中，較好的是，經由將該凝血酶調節素置於pH值為5以下的酸性條件下之步驟後，將含有或者疑為含有該可溶性凝血酶調節素的變性體之該凝血酶調節素含有物供給於陰離子交換體或羥磷灰石。作為酸性之上限，較好的是pH值為5以下，更好的是pH值為4以下，進而更好的是pH值為3以下；作為下限，較好的是pH值為1以上，更好 的是pH值為2以上，進而更好的是pH值為3以上。
又，作為酸性條件下之時間，例如可例示0.5小時以上，較好的是1小時，更好的是2小時以上。又，作為酸性條件下之溫度，例如可例示室溫，較好的是15℃以下，更好的是8℃以下；作為該溫度之下限，可例示通常為0℃以上，較好的是2℃以上，更好的是5℃以上。
作為本發明所使用之鹽，合適的鹽為氯化物，最合適的鹽為氯化鈉。又，於羥磷灰石中之合適的磷酸鹽為磷酸鈉、磷酸鉀。
作為可將可溶性凝血酶調節素與可溶性凝血酶調節素的變性體加以分離之分離條件，可舉出：線性或逐步或者將線性與逐步加以組合之梯度溶出條件，於連續通過之部份中具有可溶性凝血酶調節素溶出之條件，或者等位溶出條件；較好是線性或逐步或者將線性與逐步加以組合之梯度溶出條件、或者於連續通過之部份中具有可溶性凝血酶調節素溶出之條件，更好的是線性或逐步或者將線性與逐步加以組合之梯度溶出條件。又，於連續通過之部份中具有可溶性凝血酶調節素溶出之條件，亦有較好的其他態樣。進而，等梯度條件亦有較好的其他態樣。
至於連續通過之部份，可舉出：將可溶性凝血酶調節素含有物供給於陰離子交換體或羥磷灰石，可溶性凝血酶調節素不吸附於陰離子交換體或羥磷灰石之部份。至於連續通過之部份，若實質上不含凝血酶調節素變性體則無特別限定，例如可舉出：1~20倍管柱容積、1~50倍管柱容積、或1~100倍管柱容積。
作為梯度溶出條件，若根據所使用管柱而作適當設定即可。至於具體條件可舉出後述條件。又，作為連續通過之部份中具有可溶性凝血酶調節素溶出之條件，對於所使用之緩衝液，亦若根據所使用管柱作適當設定即可。至於具體條件，可舉出後述條件。進而，作為等位溶出條件，若根據所使用管柱作適當設定即可。
陰離子交換體，較好的是，於使用作為強陰離子交換體之具有四級銨基之陰離子交換體例如SOURCEQ(GE Healthcare Bio-Sciences公司)，供給變性體含有物之前，使用數倍管柱容積的pH值為4~9之緩衝液(緩衝液之種類並無限定，例如，可為pH值為4之0.1M醋酸、或pH值為7.3之0.02M磷酸、或pH值為8之0.02M Tris)使之平衡化。平衡後，供給變性體含有物，繼而於可溶性凝血酶調節素溶出之前，可使用pH值為4~9之緩衝液(緩衝液之種類並無限定，例如pH值為4之0.1M醋酸、pH值為7.3之0.02M磷酸、或pH值為8之0.02M Tris)加以清洗。對於所吸附之變性體含有物，使用pH值為5~9、較好的是pH值為7~8之緩衝液(緩衝液之種類並無限定，例如pH值為4之0.1M醋酸、pH值為7.3之0.02M磷酸、或pH值為8之0.02M Tris)，藉由0~1M鹽濃度之梯度溶出，將可溶性凝血酶調節素與可溶性凝血酶調節素的變性體分離溶出。分離條件，若係可將可溶性凝血酶調節素與可溶性凝血酶調節素的變性體加以分離之分離條件則無特別限定，作為梯度溶出條件，可舉出：線性或逐步、或者將線性與逐步加以組合之條件。較好的是，該梯度溶出採用0~0.3M之鹽濃度，更好的是0.03~0.26M之鹽濃度。溶出緩衝液之量，為2~40倍管柱容積，較好的是5~20倍管柱容積之範圍。
於使用梯度溶出條件之情形時，作為取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份之步驟，例如可舉出：(a)預先確認可溶性凝血酶調節素溶出之部份之位置而取得之步驟，或(b)一面確認溶出部份中存在有可溶性凝血酶調節素，一面取得之步驟。
若具體說明(a)步驟，則可舉出以下步驟：以可確認可溶性凝血酶調節素及可溶性凝血酶調節素變性體之存在的分析方法(例如，以下實施例7中記載之尺寸排除層析法)，預先確認實質上不含該可溶性凝血 酶調節素的變性體之溶出部份的位置，再將該位置之溶出部份回收。又，若具體說明(b)步驟，則可舉出以下步驟：一面以可確認可溶性凝血酶調節素及可溶性凝血酶調節素變性體之存在的分析方法(例如，以下實施例7中記載之尺寸排除層析法)確認溶出部份含有該可溶性凝血酶調節素且實質上不含有該可溶性凝血酶調節素的變性體，一面取得含有實質上不含有該可溶性凝血酶調節素的變性體之該可溶性凝血酶調節素的溶出部份。較好的是(b)步驟。又，根據情況，有時較好的是(a)步驟。
又，亦可於提供變性體含有物之前，將變性體含有物置換為適當的緩衝液，藉此取得作為連續通過之部份之實質上不含有凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素。至於連續通過之部份，可舉出：將可溶性凝血酶調節素含有物供給於陰離子交換體，可溶性凝血酶調節素並不吸附於陰離子交換體之部份。於利用可溶性凝血酶調節素與可溶性凝血酶調節素的變性體之間對管柱之吸附力差之情形時，陰離子交換體，較好的是使用作為強陰離子交換體之具有四級銨基的陰離子交換體，例如SOURCEQ、QsepharoseFF(GE Healthcare Bio-Sciences公司)、Sartobind(Sartorius公司)、Mustang(PALL公司)。進行置換之適當的緩衝液，較好的是pH值為5~8、0.1~0.2M鹽濃度之緩衝液，對於緩衝液之種類並無限定，例如可使用0.02M磷酸、0.18M氯化鈉、pH值為7.3之緩衝液。作為取得連續通過之部份之方法，只要一面以後述實施例7中記載之尺寸排除層析法等分析方法確認部份中含有該可溶性凝血酶調節素且實質上不含有該可溶性凝血酶調節素的變性體，一面適當取得該部份即可。
進而，亦可使用等位溶出條件。此時，亦可參考梯度溶出條件及連續通過之部份中具有可溶性凝血酶調節素溶出之條件，來設定適當條件。
羥磷灰石，例如可使用Macro-Prep(R)Ceramic Hydroxyapatite TYPE1(BIO-RAD公司)，於供給變性體含有物之前，使用數倍管柱容積的pH值為6~9的磷酸濃度為8mM以下、較好的是5mM以下、更好的是2mM以下之緩衝液(對於緩衝液之種類並無限定，例如：5mM磷酸、0.2M氯化鈉、pH值為7之緩衝液，或者1mM磷酸、25mM TRIS、0.2M氯化鈉、pH值為7.7之緩衝液，或者2mM磷酸、20mM HEPES、0.17M氯化鈉、pH值為7之緩衝液)使之平衡化。將進行供給之變性體含有物之緩衝液，使用pH值為6~9之磷酸濃度為8mM以下、較好的是5mM以下、更好的是2mM以下之緩衝液使之平衡後，供給變性體含有物，繼而於可溶性凝血酶調節素溶出之前，可使用pH值為6~9的磷酸濃度為8mM以下、較好的是5mM以下、更好的是2mM以下之緩衝液(對於緩衝液之種類並無限定，例如：5mM磷酸、0.2M氯化鈉、pH值為7之緩衝液，或1mM磷酸、25mM TRIS、0.2M氯化鈉、pH值為7.7之緩衝液，或2mM磷酸、20mM HEPES、0.17M氯化鈉、pH值為7之緩衝液)加以清洗。對於所吸附之變性體含有物，係使用pH值為6~9、較好的是pH值為7~8之緩衝液，藉由0~0.5M磷酸鹽濃度之梯度，將可溶性凝血酶調節素及可溶性凝血酶調節素的變性體分離溶出。分離條件，若係可將可溶性凝血酶調節素與可溶性凝血酶調節素的變性體加以分離之分離條件則無特別限定，作為梯度溶出條件，可舉出線性溶出或逐步溶出。較好的是，該梯度為1~40mM之磷酸鹽濃度，更好的是，以逐步方式進行溶出，以8~10mM磷酸鹽濃度獲得含有實質上不含可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份。藉由進一步提高磷酸鹽之濃度，而將可溶性凝血酶調節素的變性體溶出。
於使用梯度溶出條件之情形時，作為取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份之方法，可舉出：與以陰離子交換體將可溶性凝血酶調節素與可溶性凝血酶調 節素變性體加以分離之方法同樣之方法。
又，亦可藉由於提供變性體含有物之前，將變性體含有物置換成適當的緩衝液，而取得作為連續通過之部份之實質上不含凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素。作為連續通過之部份，可舉出：將可溶性凝血酶調節素含有物供給於羥磷灰石，可溶性凝血酶調節素並不吸附於羥磷灰石之部份。利用可溶性凝血酶調節素與可溶性凝血酶調節素的變性體之間對管柱的吸附力之差。此時，羥磷灰石，例如可使用Macro-Prep(R)Ceramic Hydroxyapatite TYPE1(BIO-RAD公司)。進行置換之適當的緩衝液，係pH值為6~9、磷酸鹽濃度為5~20mM之緩衝液，較好的是pH值為6~7、磷酸鹽濃度為5~10mM之緩衝液，對於緩衝液之種類並無限定，例如可使用10mM磷酸、10mM氯化鈉、pH值為7之緩衝液。作為取得連續通過之部份之方法，若一面以後述實施例7所記載之尺寸排除層析法等分析方法確認部份中含有該可溶性凝血酶調節素且實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體，一面適當取得該部份即可。
進而，亦可使用等位溶出條件。此時，亦可參考梯度溶出條件及通過份中具有可溶性凝血酶調節素溶出之條件，來設定適當的條件。
於本發明之製造方法中，較好的是不包括以下步驟：將可溶性凝血酶調節素含有物供給於陰離子交換體或羥磷灰石，且取得實質上不含可溶性凝血酶調節素變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份，然後將該部份之pH值設為4以下。又，於用以將該可溶性凝血酶調節素製成醫藥原料之後的濃縮步驟及/或脫鹽步驟中，亦較好的是不將pH值設為4以下。
若例示自使用含有血清成分的培養基或無血清培養基來培養可生產可溶性凝血酶調節素之細胞而製備之培養上清液中，將可溶性凝血酶調節素加以純化之較佳方法，則可舉出：將凝血酶調節素活性例 如對由於凝血酶所導致的蛋白質C活化之促進活性作為指標進行純化之方法，例如可舉出以下純化方法：以離子交換管柱之Q-Sepharose FF將培養上清液進行粗純化且回收具有凝血酶調節素活性之部份，繼而以親和管柱之小白鼠抗凝血酶調節素單株抗體加以純化，且回收凝血酶調節素活性較強之部份，再以陽離子交換管柱之SP-Sepharose FF將回收部份加以純化，將連續通過之部份濃縮，實行凝膠過濾而取得凝血酶調節素活性部份。於該使用SP-Sepharose FF進行純化後，於最適條件下使用本發明之陰離子交換體、較好的是作為強陰離子交換體之具有四級銨基的陰離子交換體例如SOURCEQ(GE Healthcare Bio-Sciences公司)、或者本發明之羥磷灰石例如Macro-Prep(R)Ceramic Hydroxyapatite TYPE1(BIO-RAD公司)，藉此能夠簡便地取得實質上不含可溶性凝血酶調節素的變性體之高純度凝血酶調節素。
又，於以小白鼠抗凝血酶調節素單株抗體進行純化後，於最適條件下使用本發明之陰離子交換體、較好的是作為強陰離子交換體之具有四級銨基的陰離子交換體例如SOURCEQ(GE Healthcare Bio-Sciences公司)，藉此可同時去除可溶性凝血酶調節素的變性體、小白鼠抗體來源物、及使用含血清的培養基時之血清來源物，能夠簡便地取得實質上不含可溶性凝血酶調節素的變性體之高純度的凝血酶調節素。
進而，藉由不將pH值設為4以下之濃縮步驟及/或脫鹽步驟，對以上述所例示方法而獲得之高純度的凝血酶調節素進行處理，藉此可取得經緩衝液交換之高純度純化品。以上述方法取得之可溶性凝血酶調節素，可作為醫藥原料使用。
又，根據本發明，可提供一種純化可溶性凝血酶調節素之方法，其係以實質上不含有由可溶性凝血酶調節素於酸性條件下可生成的該可溶性凝血酶調節素的變性體之方式，將可溶性凝血酶調節素純化之 方法。該純化方法若包括以下步驟則無限定：(1)將含有或者疑為含有該可溶性凝血酶調節素的變性體之該可溶性凝血酶調節素含有物供給於陰離子交換體或羥磷灰石；及(2)以可將該可溶性凝血酶調節素與該可溶性凝血酶調節素的變性體加以分離之分離條件，取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的部份。又，作為該純化方法，可舉出：具有上述本發明之可溶性凝血酶調節素之製造方法所具備特徵之純化方法。
[實施例]
利用以下實施例更具體地說明本發明，但本發明並不受該等實施例之任何限定。
(實施例1)使用強陰離子交換體管柱之粗純化
依照日本專利特開平11-341990號公報，將利用基因操作技術來調製改變並重組編碼序列編號9中所記載胺基酸序列之DNA的中國倉鼠卵巢細胞加以培養，取得培養液上清液。以0.2μm薄膜過濾器(Millipore公司，Millipak 20)將所取得之培養液41l上清液進行過濾。將經過濾之培養上清液供給至以含有150mM氯化鈉之20mM Tris鹽緩衝液(pH值為7.4)進行平衡化之Q-Sepharose(GE Healthcare Bio-Sciences公司)管柱(直徑為44cm，高度為26.3cm)中。其次以6倍管柱容積之含有180mM氯化鈉之20mM醋酸緩衝液進行清洗，進而以8倍管柱容積之含有180mM氯化鈉之20mM Tris鹽緩衝液(pH值為7.4)進行清洗，再以含有300mM氯化鈉之20mM Tris鹽緩衝液(pH值為7.4)開始溶出，取得溶出液之吸光度280nm處的波峰上升開始的0.5倍管柱容積容量之溶出液，作為粗純化品。再者，以760mL/min之流速實施溶出。
(實施例2)使用單株抗體之純化
依照日本專利特開平11-341990號公報，製作將源自人體肺的凝血酶調節素作為抗原之抗凝血酶調節素單株抗體，使其與CNBr-activated Sepharose 4FastFlow(GE Healthcare Bio-Sciences公司)進行接觸反應而將抗凝血酶調節素單株連接上，製作出抗凝血酶調節素單株結合Sepharose 4FastFlow。將實施例1所得溶出部份中之16.5l供給於以含有0.3M氯化鈉之20mM磷酸緩衝液(pH值為7.3)進行平衡化之單株抗體管柱(直徑為44cm，高度為10.5cm)。流過6倍管柱容積之含有1.0M氯化鈉之20mM磷酸緩衝液(pH值為7.3)，進而流過3倍管柱容積之0.1M醋酸緩衝液(pH值為5.0)進行清洗，以含有0.3M氯化鈉之0.1M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值為3.0)開始溶出，取得於溶出液的吸光度280nm處的波峰上升開始至波峰下降為止之溶出液，向溶出液中添加1/10倍溶出液容積容量之0.5M磷酸緩衝液(pH值為7.3)，作為純化液而取得。再者，以760mL/min之流速實施溶出。
(實施例3)使用強陽離子交換體管柱之純化
以1.0M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值為2.0)將實施例2所得純化液中193ml之純化液製備成pH 3.5的溶液，將此溶液供給至以含有0.3M NaCl之0.1M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值為3.5)進行平衡化的SP-Sepharose FF(GE Healthcare Bio-Sciences公司)管柱(直徑16mm，高度12cm)中。以含有300mM NaCl之100mM甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值為3.5)開始清洗，獲得於吸光度280nm處的波峰上升開始至下降為止之連續通過之部份，立即以0.5M磷酸緩衝液(pH值為7.3)將pH值中和至7，作為高純度純化品而取得。再者，以3.3mL/min之流速實施溶出。藉由上述使用Asahipak C4P-50之層析法或者日本專利特開平11-341990號公報所記載之ELISA法等，獲知該高純度純化品中可溶性凝血酶調節素之含有率為99%以上。
(實施例4)利用陰離子交換體線性梯度溶出對可溶性凝血酶調節素的變性體之分離(1)
以30ml純化水將實施例3中所得高純度純化品中之10ml高純度 純化品加以稀釋。將40ml稀釋溶液供給於以含有0.1M氯化鈉之20mM磷酸緩衝液(pH值為6)進行平衡化之source Q30(GE Healthcare Bio-Sciences公司)管柱(直徑0.5cm，高度9.8cm)。以3倍管柱容積之20mM磷酸緩衝液(pH值為6)加以清洗，以20mM磷酸緩衝液(pH值為6)之0.1M~0.3M氯化鈉之線性梯度、20倍管柱容積之溶出容積開始溶出，自溶出液於吸光度280nm處之波峰上升開始，以1倍管柱容積為單位進行截斷。再者，樣品之載入及清洗時之流速為2.2mL/min，溶出時之流速為0.3mL/min。將層析圖示於圖1。
(實施例5)利用陰離子交換體線性梯度溶出對可溶性凝血酶調節素的變性體之分離(2)
以30ml純化水將實施例3中所得高純度純化品中之10ml高純度純化品加以稀釋。將40ml稀釋溶液供給至以含有0.1M氯化鈉之20mM磷酸緩衝液(pH值為7)進行平衡化之source Q30(GE Healthcare Bio-Sciences公司)管柱中(直徑0.5cm，高度9.8cm)。以3倍管柱容積之20mM磷酸緩衝液(pH值為7)進行清洗，以20mM磷酸緩衝液(pH值為7)之0.1M~0.3M氯化鈉之線性梯度、20倍管柱容積之溶出容積開始溶出，自溶出液之吸光度280nm處之波峰上升開始，以1倍管柱容積為單位進行截斷。再者，樣品之裝入及清洗時之流速為2.2mL/min，溶出時之流速為0.3mL/min。將層析圖示於圖2。
(實施例6)利用陰離子交換體線性梯度溶出對可溶性凝血酶調節素的變性體之分離(3)
以30ml純化水將實施例3中所得高純度純化品中之10ml高純度純化品加以稀釋。將40ml稀釋溶液供給至以含有0.1M氯化鈉之20mM Tris緩衝液(pH值為8)進行平衡化之source Q30(GE Healthcare Bio-Sciences公司)管柱(直徑0.5cm，高度9.8cm)中。以3倍管柱容積之20mM Tris緩衝液(pH值為8)進行清洗，以20mM Tris緩衝液(pH值為8) 之0.1M~0.3M氯化鈉之線性梯度、20倍管柱容積之溶出容積開始溶出，自溶出液之吸光度280nm處的波峰上升開始，以1倍管柱容積為單位進行截斷。再者，樣品之裝入及清洗時之流速為2.2mL/min，溶出時之流速為0.3mL/min。將層析圖示於圖3。
(實施例7)實施例4~6之可溶性凝血酶調節素的變性體之含量評價
使用TSK gel G3000SWXL(7.8mm I.D.×30cm；TOSOH公司)分析用尺寸排除層析儀，評價各部份中可溶性凝血酶調節素的變性體之含量。以移動相將管柱平衡化，移動相係使用pH 7.3之含有0.1M硫酸鈉之50mM磷酸鹽緩衝液，以0.9ml/min之流速供給150μl各部份，進行分析。又，各部份之回收，係藉由測定於280nm處之吸光度而算出。將實施例4至實施例6之結果示於下述表1。又，對於實施例3中所取得之高純度純化品，亦以上述方法測定可溶性凝血酶調節素的變性體之含量，含量為7.0%(圖4)。於實施例4至實施例6中的任一條件下，均能夠以76%~81%之回收率取得實質上不含有可溶性凝血酶調節素的變性體之高純度可溶性凝血酶調節素。
(實施例8)利用陰離子交換體階段梯度溶出對可溶性凝血酶調節素的變性體之分離
以210ml純化水將實施例3中所得高純度純化品中之70ml高純度 純化品加以稀釋。將稀釋溶液供給於以含有30mM氯化鈉之20mM磷酸緩衝液(pH值為7.3)進行平衡化之source Q30(GE Healthcare Bio-Sciences公司)管柱(直徑0.5cm，高度20.5cm)中。以3倍管柱容積之含有30mM氯化鈉之20mM磷酸緩衝液(pH值為7.3)進行清洗，以含有0.18M氯化鈉之20mM磷酸緩衝液(pH值為7.3)開始溶出，獲得溶出液之吸光度280nm處的波峰上升開始至6倍管柱容積容量為止之溶出液。使用TSK gel G3000SWXL(TOSOH公司)分析用尺寸排除層析儀，以實施例7之條件評價溶出液中可溶性凝血酶調節素的變性體之含量，結果可溶性凝血酶調節素的變性體之含量比率為0.0%，係作為實質上不含可溶性凝血酶調節素的變性體之高純度可溶性凝血酶調節素而取得。溶出液之回收率為89%。再者，樣品之裝入及清洗時之流速為0.8mL/min，溶出時之流速為0.4mL/min。將層析圖示於圖5。
(實施例9)使用利用基因操作技術而調製改變並重組源自人體之凝血酶調節素基因的中國倉鼠卵巢細胞之無血清培養所得之含有可溶性凝血酶調節素之培養上清液的取得
用以取得含有可溶性凝血酶調節素之培養上清液的培養中所使用的不含動物成分之無血清培養基，係製備成種子用培養基與灌流培養用培養基兩種。
種子用培養基，係於每1L之IS CHO-CD(液體培養基，目錄編號91119-1L，生產廠商：Irvine Scientific)中，在無菌條件下混合入5mL之HT supplement(液體，目錄編號11067-030，生產廠商：Invitrogen)及40mL之L-Glutamine 200mM(液體，目錄編號25030-081，生產廠商：Invitrogen)而進行製備。種子用培養基，於保存時係採用冷藏保存(2~8度)，使用時於即將使用之前以36℃恆溫水浴槽加溫而使用。
灌流培養用培養基，係於每1L脫離子超過濾水中添加20.8g之IS CHO-CD-A3(粉末培養基，目錄編號98688，生產廠商：Irvine Scientific)、2.6g食鹽(特級，生產廠商：和光純藥)及4.4g碳酸氫鈉食鹽(特級，生產廠商：和光純藥)將其溶解後，以0.2μm過濾器(PVDF製，生產廠商：Millipore)進行無菌過濾而製備。灌流培養用培養基，於保存時、使用時均採用冷藏保存(2~8度)。
種子培養開始時，以37度恆溫水浴槽將經冷凍保存之可生產可溶性凝血酶調節素之細胞(日本專利特開平11-341990號公報)迅速融解，將細胞懸浮於種子用培養基中，進行離心分離(2000rpm，2分鐘，國產化學)，去除離心上清液後，使細胞團懸浮於100mL種子用培養基中，再分注於225cm2之T燒瓶培養容器(生產廠商：BD Biosciences)中，開始第1階段之種子培養。第1階段種子培養，係以於36度5%二氧化碳培養箱內的靜置培養之方式來實施。於第1階段種子培養之浮游活細胞密度達到約8×105cells/mL時，進行繼代培養至第2階段種子培養。
第2階段種子培養以後之培養係以攪拌培養之方式實施。攪拌培養下之種子培養之規模及攪拌培養容器為，第2階段種子培養：400mL(玻璃製旋轉瓶，生產廠商：柴田科學)，第3階段種子培養：1.6L(玻璃製旋轉瓶，生產廠商：柴田科學)，第4階段種子培養：6L(玻璃製球旋轉瓶，生產廠商：柴田科學)，如此依序進行繼代培養且擴大培養液量。於種子培養之浮游活細胞密度達到約8×105cells/mL時，進行繼代培養至下一階段之種子培養。繼代時，添加與自繼代後的培養規模減去繼代前的培養規模所得之值相同量的種子培養用培養基而擴大培養液量。攪拌培養，係於36度5%二氧化碳培養箱內，利用電磁攪拌器(生產廠商：柴田科學)於攪拌速度為60~100rpm之條件下實施培養。
於第4階段種子培養之浮游活細胞密度達到約8×105cells/mL時，將種子培養液分別移送至3台灌流培養槽(2L灌流培養裝置，生產廠商：Marubishi Bio Eng)中，每個灌流培養槽中各移送2L，開始灌流培養。
灌流培養中向灌流培養槽供給之灌流培養用培養基之定量移送，係使用蠕動泵(生產廠商：Masterflex)以2L/天之流量進行。
灌流培養下之細胞分離，係以設置於灌流培養槽內之旋轉過濾器進行。3台灌流培養槽中之旋轉過濾器各不相同。第1台係使用不鏽鋼製篩網(FP-10，孔徑為10μm，生產廠商：富士過濾器工業)之旋轉過濾器，第2台目係使用不鏽鋼製篩網(FP-30，孔徑為30μm，生產廠商：富士過濾器工業)之旋轉過濾器，第3台係使用polyester PETP製篩網(孔徑為10μm，目錄編號BB-8808571，生產廠商：Sartorius)之旋轉過濾器。
以設置於灌流培養槽內之旋轉過濾器進行細胞分離之培養上清液，於藉由顯示灌流培養槽內的2L液面之液位感測器的運作得知培養液量達到2L以上之情形時，則利用培養槽內壓力將其間歇地排出。經間歇排出之培養上清液，被移送至冷藏保存之容器中，於2~8度下進行冷藏保存。
將灌流培養條件控制於槽內溫度為35~37℃、溶存氧濃度為10%~90%、pH值為6.8~7.6，進行培養。
進行30天灌流培養，此時之平均活細胞密度，第1台為17×106cells/mL，第2台為10×106cells/mL，第3台為18×106cells/mL。
將3台灌流培養槽中自灌流培養第3天開始至第30天為止所取得之培養上清液加以混合，以0.2μm過濾器(PVDF製，生產廠商：Millipore)進行過濾，冷藏保存所過濾之培養上清液(2~8度)。
(實施例10)使用強陰離子交換體管柱之純化
將藉由實施例9所取得的培養液上清液中之850ml培養液上清液，供給至以含有30mM氯化鈉之20mM醋酸鈉、120mM醋酸緩衝液進行平衡化之Q-Sepharose FF(GE Healthcare Bio-Sciences公司)管柱(直徑1.6cm，高度29cm)中。其次以12倍管柱容積之含有30mM氯化 鈉之20mM醋酸鈉、120mM醋酸緩衝液(pH值為3.8)進行清洗，以含有140mM氯化鈉之20mM醋酸鈉、40mM醋酸緩衝液(pH值為4.2)開始溶出，向溶出液之吸光度280nm處的主波峰上升開始的2倍管柱容積容量之溶出液中，添加1/5管柱容積容量之含有10mM磷酸鉀之1M HEPES緩衝液(pH值為8)，取得純化品。再者，以2mL/min之流速實施溶出。
(實施例11)利用羥磷灰石階段梯度溶出對可溶性凝血酶調節素的變性體之分離
將實施例10中所取得之純化品中之20ml純化品，供給至以含有0.17M氯化鈉、2mM磷酸鈉之20mM HEPES緩衝液(pH值為7)進行平衡化之Macro-Prep(R)Ceramic Hydroxyapatite TYPE1(BIO-RAD公司)管柱中(直徑為0.5cm，高度為9.7cm)。以6倍管柱容積之含有0.17M氯化鈉、2mM磷酸鈉之20mM HEPES緩衝液(pH值為7)進行清洗，以含有10mM氯化鈉之8mM磷酸緩衝液(pH值為7)、且以4倍管柱容積之溶出容積進行溶出，獲得溶出液之吸光度280nm處的波峰上升開始至下降為止之溶出液。再者，以0.4mL/min之流速實施溶出。使用TSK gel G3000SWXL(TOSOH公司)分析用尺寸排除層析儀，以實施例7之條件評價溶出液之可溶性凝血酶調節素的變性體之含量，結果可溶性凝血酶調節素的變性體之含量比率為0.8%以下。以0.5M磷酸緩衝液(pH值為7)對管柱進行再生。將層析圖示於圖6。
(實施例12)使用強陰離子交換體管柱之粗純化(2)
將5.21之實施例9中所取得之培養液上清液，供給至以含有150mM氯化鈉之20mM Tris鹽緩衝液(pH值為7.7)進行平衡化之CaptoQ(GE Healthcare Bio-Sciences公司)管柱中(直徑為1.6cm，高度為26cm)。其次，以15倍管柱容積之含有0.18M氯化鈉之20mM Tris鹽緩衝液(pH值為7.7)進行清洗，以含有0.3M氯化鈉之20mM Tris鹽緩衝液(pH值為7.7)開始溶出，取得溶出液之吸光度280nm處的波峰上升開始 的2倍管柱容積容量之溶出液，作為粗純化品。再者，以10mL/min之流速實施溶出。
(實施例13)使用單株抗體之純化(2)
依照(專利文獻2)製作單株抗體。將實施例12中所獲得之溶出部份中之72mL，供給至以含有0.3M氯化鈉之20mM磷酸緩衝液(pH值為7.3)進行平衡化之單株抗體管柱中(直徑為5cm，高度為11cm)。流過6倍管柱容積之含有1.0M氯化鈉之20mM磷酸緩衝液(pH值為7.3)，進而流過3倍管柱容積之0.1M醋酸緩衝液(pH值為5.0)進行清洗，以含有20mM氯化鈉之0.1M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值為3.0)開始溶出，獲得溶出液之於吸光度280nm處的波峰上升開始至下降為止之溶出液，向溶出液中添加15%溶出液容積容量之0.3M磷酸緩衝液(pH值為7.3)而取得純化液。再者，以9.8mL/min之流速實施溶出。藉由上述使用Asahipak C4P-50之層析儀或者日本專利特開平11-341990號公報所揭示之ELISA法等獲知，該純化液中可溶性凝血酶調節素之含有率為99%以上。
(實施例14)使用強陰離子交換體之高純度化及可溶性凝血酶調節素的變性體之去除
將實施例13中獲得之純化液中之75mL純化液，供給至以含有40mM氯化鈉之0.1M醋酸緩衝液(pH值為4)進行平衡化之source Q30(GE Healthcare Bio-Sciences公司)管柱中(直徑0.5cm，高度20.5cm)。流過2倍管柱容積之含有40mM氯化鈉之0.1M醋酸緩衝液(pH值為4)，進而流過4倍管柱容積之含有50mM氯化鈉之0.1M醋酸緩衝液(pH值為4)，繼而進一步以3倍管柱容積之含有30mM氯化鈉之20mM磷酸緩衝液(pH值為7.3)加以清洗，以含有0.18M氯化鈉之20mM磷酸緩衝液(pH值為7.3)開始溶出，獲得溶出液之吸光度280nm處的波峰上升開始至6倍管柱容積為止之溶出液。再者，樣品載入時之流速為1mL/min，清 洗及溶出時之流速為0.3mL/min。使用TSK gel G3000SWXL(TOSOH公司)分析用尺寸排除層析儀，以實施例7之條件評價溶出液中可溶性凝血酶調節素的變性體之含量，結果可溶性凝血酶調節素的變性體之含量比率為0.1%，從而取得實質上不含可溶性凝血酶調節素的變性體之高純度可溶性凝血酶調節素。溶出液之回收率為71%。將層析圖示於圖7。
(實施例15)混入異種蛋白質(小白鼠抗體來源物及中國倉鼠卵巢細胞細胞來源物)量之評價
利用日本專利特開平11-341990號公報所記載之ELISA方法，就實施例13~14之溶出部份進行評價。測定各溶出部份於280nm處之吸光度，將以每1吸光度的混入量進行評價之結果示於下述表2。可同時減去各成分之混入量。
<110> 日商旭化成製藥股份有限公司
<120> 高純度可溶性凝血酶調節素之製造方法
<130> F107165
<140> 097110165
<141> 2008-03-21
<150> 2007-077389
<151> 2007-03-23
<160> 13
<210> 1
<211> 132
<212> PRT
<213> 人類
<400> 1
<210> 2
<211> 396
<212> DNA
<213> 人類
<400> 2
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<212> DNA
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<400> 12
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列說明：合成DNA
<400> 13

Claims (21)

  1. 一種可溶性凝血酶調節素之製造方法，其係製造實質上不含由可溶性凝血酶調節素於酸性條件下可生成之該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素者，該方法包括以下步驟：(1)將含有或者疑為含有該可溶性凝血酶調節素的變性體之該可溶性凝血酶調節素含有物供給至陰離子交換體或羥磷灰石；及(2)以可將該可溶性凝血酶調節素與該可溶性凝血酶調節素的變性體分離之分離條件，取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素之部份。
  2. 如請求項1之製造方法，其係製造實質上不含由可溶性凝血酶調節素於酸性條件下可生成的該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素者，其包括以下步驟：(0)將該可溶性凝血酶調節素置於pH值為5以下之酸性條件下；(1)將經由上述(0)步驟所獲得之含有或者疑為含有該可溶性凝血酶調節素的變性體之該可溶性凝血酶調節素含有物供給至陰離子交換體或羥磷灰石；及(2)以可將該可溶性凝血酶調節素與該可溶性凝血酶調節素的變性體分離之分離條件，取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素之部份。
  3. 如請求項2之製造方法，其中可溶性凝血酶調節素係相對於可溶性凝血酶調節素含有物中之全蛋白之含有率為80%以上者。
  4. 如請求項2之製造方法，其中(2)步驟係進行線性或逐步、或者將線性與逐步加以組合之梯度溶出，取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份。
  5. 如請求項2之製造方法，其中(2)步驟係取得連續通過之部份者，且該步驟係取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性 體之可溶性凝血酶調節素的部份者。
  6. 如請求項2之製造方法，其中(2)步驟，係進行等位溶出，取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份者。
  7. 如請求項2之製造方法，其中(1)步驟係使用pH值為4~9的緩衝液將該可溶性凝血酶調節素含有物供給至陰離子交換體；(2)步驟係以下步驟：使用PH值為5~9、且鹽濃度為0~1M的緩衝液進行線性或逐步、或者將線性與逐步加以組合之梯度溶出，(a)預先確認可溶性凝血酶調節素所溶出之部份之位置，取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份，或者(b)一面確認溶出部份中存在可溶性凝血酶調節素，一面取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份。
  8. 如請求項2之製造方法，其中(1)步驟係使用pH值為5~8、且鹽濃度為0.1~0.2M的緩衝液，將該可溶性凝血酶調節素含有物供給至陰離子交換體；(2)步驟係使用pH值為5~8、且鹽濃度為0.1~0.2M之緩衝液取得連續通過之部份，藉此取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的部份。
  9. 如請求項2之製造方法，其中(1)步驟係使用pH值為6~9、且磷酸鹽濃度為8mM以下的緩衝液，將可溶性凝血酶調節素含有物供給至羥磷灰石；(2)步驟係以下步驟：使用pH值為6~9、且磷酸鹽濃度為0~0.5M的緩衝液進行線性或逐步、或者將線性與逐步加以組合之梯度溶出，(a)預先確認可溶性凝血酶調節素所溶出之部份之位置，再取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份，或者(b)一面確認溶出部份中存在可溶性凝血酶調節素，一面取得含有實質上不含該可溶性凝血酶 調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份。
  10. 如請求項2之製造方法，其中(1)步驟係使用pH值為6~9、且磷酸鹽濃度為5~20mM的緩衝液，將該可溶性凝血酶調節素含有物供給至羥磷灰石之步驟；(2)步驟係使用pH值為6~9、且磷酸鹽濃度為5~20mM之緩衝液取得連續通過之部份，藉此取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的部份。
  11. 如請求項1至10中任一項之製造方法，其中不包括以下步驟：於取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份後，將該部份之pH值設為4以下。
  12. 如請求項1至10中任一項之製造方法，其中包括於取得含有實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素的溶出部份後，不將該部份的pH值設為4以下之濃縮步驟及/或脫鹽步驟者，該方法係用於將該可溶性凝血酶調節素製成醫藥原料。
  13. 如請求項1至10中任一項之製造方法，其中於實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素中，可溶性凝血酶調節素的變性體之含有率為3%以下。
  14. 如請求項1至10中任一項之製造方法，其中於實質上不含該可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素中，可溶性凝血酶調節素的變性體之含有率為1%以下。
  15. 如請求項1至10中任一項之製造方法，其中該可溶性凝血酶調節素係自將編碼序列編號9或序列編號11中所記載之胺基酸序列的DNA轉染至宿主細胞中而製備之轉形細胞中所取得者。
  16. 如請求項1至10中任一項之製造方法，其中該可溶性凝血酶調節素為：具有序列編號9或序列編號11各自中的第19~516位之序列 之肽；或者前述肽之胺基酸序列中具有1個或複數個胺基酸產生置換、缺失、附加之胺基酸序列，且具有可溶性凝血酶調節素之活性之肽。
  17. 如請求項1及4至10中任一項之製造方法，其中可溶性凝血酶調節素係相對於可溶性凝血酶調節素含有物中之全蛋白之含有率為80%以上者。
  18. 如請求項2至10中任一項之製造方法，其中將該可溶性凝血酶調節素置於pH值為5以下之酸性條件下之步驟為將該可溶性凝血酶調節素置於pH值為4以下之酸性條件下之步驟。
  19. 如請求項1至10中任一項之製造方法，其中將該可溶性凝血酶調節素含有物供給至陰離子交換體或羥磷灰石之步驟為將該可溶性凝血酶調節素含有物供給至陰離子交換體之步驟。
  20. 如請求項1至10中任一項之製造方法，其中將該可溶性凝血酶調節素含有物供給至陰離子交換體或羥磷灰石之步驟為將該可溶性凝血酶調節素含有物供給至羥磷灰石之步驟。
  21. 一種實質上不含可溶性凝血酶調節素的變性體之可溶性凝血酶調節素，其係藉由如請求項1至10中任一項之製造方法所獲得者。
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