CN105209488A - 变体因子viii多肽及其产生和使用方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及变体因子VIII多肽，其在凝血酶切割位点和活化环之一或两者中的一个或多个位置处包含氨基酸取代。在某些实施方案中，该变体因子VIII多肽包含在凝血酶切割位点和活化环两者中的一个或多个氨基酸取代。在进一步的实施方案中，所述变体因子VIII多肽还包含在A1-A2域界面和A2-A3域界面内的一个或多个氨基酸取代。本公开还涉及产生和/或使用这类变体因子VIII多肽的方法：编码该多肽的核酸；含有这类核酸的载体和/或重组细胞、组织或生物体；和含有这类多肽和/或核酸的试剂盒和药物组合物。

Description

变体因子VIII多肽及其产生和使用方法

对相关申请的交叉引用

本申请要求2013年3月15号提交的美国临时申请No.61/789,112的权益，其通过提述完整并入本文。

发明领域

本文中提供了人凝固因子VIII变体和编码这类变体的多核苷酸，包含和表达这类变体的载体和宿主细胞，获得这类变体的方法，使用这类变体的方法，变体的组合物，和与其相关的另外的发明特征。

发明背景

血液凝固是由多种血液组分(或因子)之间复杂的相互作用组成的逐渐导致纤维蛋白凝块形成的过程。通常参与被常称为凝固“级联反应”的血液组分是不具有酶活性的蛋白(原酶或酶原)，通过激活剂的作用使其转化为蛋白水解酶，所述激活剂本身常常是激活的凝固因子。对凝固级联反应关键性的一种肽是因子VIII或FVIII。事实上，最常见的遗传性凝血病症血友病A是由因子VIII中的缺陷或结构性缺陷导致的。因子VIII的生物化学允许针对凝固的快速打开/关闭转换。它作为无活性的辅因子循环，通过凝血酶(凝固级联反应的倒数第二个酶)被活化为FVIIIa。FVIIIa与FIXa、膜或磷脂(PL)表面和Ca⁺²一起参与一种短寿命的酶复合物(FXase)以将FX转化成FXa。FVIIIa作为FXase复合物中的参与者的主要功能是突出地增多FXa，由此允许凝血酶生成。因子VIII由～186kb基因编码，该基因由26个外显子组成(Thompson,SeminarsinThrombosisandHemostasis,29:11-22(2003)(参考文献11和16-18))。该基因的mRNA的翻译继之以19个氨基酸的信号序列的除去，产生2332个氨基酸的成熟蛋白质。该蛋白由6个主要域组成，其从氨基末端为：A1、A2、B、A3、C1和C2。涉及活化的另外的短酸性区域a1、a2和a3分别散布在A1和A2、A2和B、和B和A3域之间。这一2332个氨基酸的主要翻译产物被加工成异二聚体，其由异质性重链(含有完整的A1,a1A2,a2域和多种长度的B域)和同质性80kD轻链(含有a3、A3、C1和C2域)组成。B域的异质性来自分泌期间的蛋白水解。

因子VIII到因子VIIIa的活化一般经由通过凝血酶对原辅因子(procofactor)的蛋白水解而发生。凝血酶识别限定沿因子VIII肽链的凝血酶切割位点的特定氨基酸区域。因子VIII具有3个凝血酶切割位点。对其他凝血酶底物的检查揭示了可被凝血酶容纳的多个残基。尽管在这些凝血酶切割位点内的氨基酸可在一定程度上变化，但某些氨基酸比之其他氨基酸在这些切割位点内要更常见得多，且某些氨基酸残基引起凝血酶对该肽的更有效的切割。(参见例如Newell-Caito等,“P3-P3’ResiduesflankingScissileBondsinFactorVIIIModulateRatesofSubstrateCleavageandProfactorActivationbyThrombin,”Biochemistry51:3451-59(2012)；Gallwitz等,“TheExtendedCleavageSpecificityofHumanThrombin,”PLoSONE7:e31756(2012))。因子VIII中的3个凝血酶切割位点之一位于或接近a1-A2接合处，其位于或接近成熟野生型人因子VIII肽的氨基酸位置370-375处。

在切割后，活性因子VIIIa是包含A1亚基、A2亚基和A3C1C2亚基的异三聚体。该异三聚体由在亚基彼此相互作用所在区域处的亚基之间的静电和疏水性相互作用两者支持，所述区域称为“域界面”。已知该异三聚体包含至少A1-A2和A2-A3域界面。(参见例如美国专利No.8,338,571(2008年7月25日提交)(2012年12月25日授权))。

人因子VIII被重组生产为约300kD的单链分子。该前体产物在高尔基体(GolgiApparatus)中被加工成200kD(重链)和80kD(轻链)的两条多肽链，这两条链通过金属离子被保持在一起(Kaufman等,J.Biol.Chem.263:6352(1988)；Andersson等,Proc.Natl.Acad.Sci.83:2979(1986))。FVIII的B域似乎是可有可无的，因为B域缺失的FVIII(FVIII-BDD；90kDA1-A2重链加80kD轻链)已显示为是血友病A的有效替换疗法。称为“BDD-SQ”或简称为“BDD”的一种公知的B域缺失的因子VIII序列含有除14个氨基酸以外的B域全部缺失。

对血友病A的治疗目前涉及按需要或作为防护疗法静脉内(iv)施用因子VIII。尽管对于全长蛋白其有超过300kD的较大大小，但因子VIII在人中的半衰期仅为约11小时。(Ewenstein等,Semin.Hematol.41:1-16(2004))。因此，必须相对频繁地施用因子VIII以用于对凝血病症的防护性治疗。因子VIII通常每周施用两至三次，给药基于因子VIII活性。这种对频繁iv注射的需要给患者依从性创造了巨大的障碍。如果能开发出不需要那么频繁施用的因子VIII产品，对于患者将是更方便的。此外，降低需要的剂量数目也会降低治疗的成本。另外，即使使用这些频繁施用，由于其短半衰期，进行因子VIII替换疗法的患者也经常在血浆因子VIII活性水平中产生较大的摆动，从而给其带来潜在的血栓症(在峰值水平)和出血(在低谷水平)的风险。

另外，备选的非iv施用路径如皮下(sc)施用可以通过将血浆因子VIII水平维持在更恒定的水平既增加治疗的容易性又降低血栓症和出血的潜在风险。Sc投递的一项挑战是增加施用的因子VIII的生物利用度。具有增强的活性的因子VIII肽可能对于增强生物利用度有用，因此可能可用于因子VIII的sc投递。由于其较高的比活性(specificactivity)，这类因子VIII肽可能允许施用所需体积的减少，因为药物的活性浓度更高。降低的注射体积能减少患者不适。此外，体积降低还将转化成货品成本的降低。最后，增强的活性因子VIII分子还能赋予在野生型因子VIII之上的额外保护，其通过延长辅因子活性的持续时间(如果给药是通过质量(mass)而非通过活性的话)。例如，在等质量给药时，具有2倍比活性增强的增强活性的FVIII变体在0.5％水平将提供与野生型FVIII在1％水平所提供的相同的保护，由此延长因子VIII剂量之间的时间间期。

已生成大量因子VIII变体以试图解决当前医学疗法的一个或多个缺点。例如，美国专利No.8,338,571(2008年7月25日提交；2012年12月25日授权)描述了一种重组因子VIII，其包含一个或多个导致因子VIII和因子VIIIa两者的增强的稳定性的突变。类似地，美国专利公开No.2012/0190623(2011年1月27日提交)描述了对失活抗性的因子VIII突变体，包括“其中APC切割位点Arg336和Ile562被突变”的突变体。美国专利公开No.2011/0124565(2006年4月10日)涉及经修饰的核酸序列，其编码具有改进的稳定性的凝固因子特别是人因子VIII及其衍生物，包括具有以下修饰的因子VIII肽，该修饰据报道阻止FVIII的A1和A2域之间的凝血酶切割。其他努力产生了例如由于引入了允许肽PEG化的突变而报告具有增加的循环半衰期的经修饰的因子VIII多肽(Mei等,Blood116:270-279(2010))和由于对构成活性FVIIIa异三聚体的域界面的突变而报告具有增加的稳定性的经修饰的因子VIII多肽(Wakabayashi等,J.Thromb.Haemost.7:438-444(2009))。

出于如上文所述的原因，存在对改进的因子VIII变体，例如具有增加活性的变体和/或不需要那么频繁和/或高剂量施用的变体的需要。此外，期望这类蛋白质作为同质性产物以一致性方式生产。

发明概述

在一个实施方案中，本公开涉及作为功能性因子VIII的因子VIII多肽变体，该因子VIII多肽包含氨基酸位置370-375处的凝血酶切割位点和氨基酸位置558-565处的活化环，其中所述这些酸位置编号依照SEQIDNO:1中列出的氨基酸序列；且其中所述变体包含在所述凝血酶切割位点内一个或多个残基处的氨基酸取代和在活化环内一个或多个残基处的氨基酸取代。

在某些例子中，变体因子VIII多肽的凝血酶切割位点内的所述取代不包括在氨基酸位置372处的取代。在其他例子中，凝血酶切割位点内的取代包含在位置370、371和374的一个或多个位置处的取代，而在其他例子中，凝血酶切割位点内的取代包含在位置370、371和374的两个或更多个位置处的取代。

在别的例子中，活化环内的所述取代包含在位置559、562和565的一个或多个位置处的取代，而在其他例子中，活化环内的所述取代包含在位置559、562和565的两个或更多个位置处的取代取代。

在其他例子中，变体因子VIII多肽还包含包括氨基酸残基E272和D519的A1-A2域界面和包括氨基酸残基E665和E1984的A2-A3域界面，其中所述这些氨基酸位置编号依照SEQIDNO:1中列出的氨基酸序列；且其中所述变体还包含在所述A1-A2域界面的一个或多个氨基酸残基处的取代和在所述A2-A3域界面的一个或多个氨基酸残基处的取代。在另外的例子中，A1-A2域界面的所述取代包含选自下组的一个或多个取代：E272A、E272V、D519A和D519V。在其他例子中，A2-A3域界面的所述取代包含选自下组的一个或多个取代：E665A,E665V,E1984A和E1984V。在仍进一步的例子中，A1-A2域界面的所述取代包含D519V且A2-A3域界面的所述取代包含E665V。

在具体的例子中，变体因子VIII多肽包含在位置370、371和374的一个或多个位置处的氨基酸取代，和在位置559、562和565的一个或多个位置处的氨基酸取代。在其他例子中，该变体包含在位置370、371和374的两个或更多个位置处的氨基酸取代，和在位置559、562和565的两个或更多个位置处的氨基酸取代。在仍进一步的例子中，该变体包含选自下组的氨基酸取代：Q370M,I371P,V374F,V559L,R562W,R562F,R562K和Q565E。在另外的例子中，该变体包含在所述凝血酶切割位点内的氨基酸取代，其选自下组：(i)Q370M和I371P，和(ii)I371P和V374F。在仍进一步的例子中，该变体包含在所述活化环内的氨基酸取代，其选自下组：(i)V559L和R562F,(ii)V559L和R562W,(iii)V559L和Q565E,(iv)V559L,R562W和Q565E，以及(v)V559L,R562F和Q565E。

在某些具体的例子中，该变体包含氨基酸取代I371P,V374F,V559L,R562W和Q565E。在其他具体的例子中，该变体包含氨基酸取代I371P,V374F,V559L,R562W,Q565E,D519V和E665V。在仍进一步的例子中，该变体还在氨基酸位置336处包含氨基酸取代。在某些例子中，在氨基酸位置336处的氨基酸取代包括R336I取代。

在某些例子中，所述变体因子VIII多肽包含与SEQIDNO:1,2或3的序列至少90％相同的氨基酸序列。在其他例子中，所述变体因子VIII多肽包含SEQIDNO:53的氨基酸序列。

在某些例子中，所述变体因子VIII多肽相比于未经修饰的因子VIII多肽具有增加的比活性。

在一个另外的实施方案中，本公开涉及一种药物组合物，其包含如本文中描述的变体因子VIII多肽和药学可接受的赋形剂。

在另一个实施方案中，本公开涉及分离的核酸，其编码如本文中描述的变体因子VIII多肽。

在又一个实施方案中，本公开涉及包含编码如本文中描述的变体因子VIII多肽的核酸序列的载体。在某些例子中，所述载体是表达载体。

在再一个实施方案中，本公开涉及包含本文中描述的分离的核酸或载体的重组宿主细胞。

在又一个实施方案中，本公开涉及产生变体因子VIII多肽的方法，所述方法包括在适宜所述变体因子VIII多肽表达的条件下培养如本文中描述的重组宿主细胞，和分离所述变体。

在再一个实施方案中，本公开涉及用于预防或治疗出血病症的方法，包括对受试者施用有效量的如本文中描述的变体因子VIII多肽或药物组合物。在某些例子中，所述出血病症是慢性出血病症。在其他例子中，所述出血病症是急性出血事件(episode)。

附图简述

图1显示多种因子VIII多肽和变体的aPTT比活性，呈现为相对于野生型因子VIII的倍数活性。命名具有以下含义：“A”指示多肽在凝血酶切割位点中拥有I371P和V374F氨基酸取代；“B”指示多肽在活化位点中拥有V559L,R562W和Q565E氨基酸取代；而“C”指示多肽拥有D519V和E665V氨基酸取代。所有氨基酸位置命名均给予wt-FVIII(SEQIDNO:1)中的位置编号。

图2显示多种因子VIII多肽和变体的比活性，呈现为相对于野生型因子VIII的倍数活性，如通过生色测定法测定的。命名具有与图1相同的含义。

图3显示FVIII-BDD(SEQIDNO:3),D519VE665V-FVIII(SEQIDNO:5)和Var97的凝血酶生成概况(profile)，Var97是D519VE665V-FVIII的变体，其具有以下氨基酸取代：I371P,V374F,V559L,R562W和Q565E(SEQIDNO:53)。

图4呈现的数据显示引发限定量的峰值凝血酶所需的多种因子VIII多肽和变体的浓度。研究的因子VIII多肽是FVIII-BDD(SEQIDNO:3)，D519VE665V-FVIII(SEQIDNO:5)，具有D519V和E665V氨基酸取代的经修饰的FVIII-BDD，和D519VE665V-FVIII的变体Var97，其具有以下氨基酸取代：I371P,V374F,V559L,R562W和Q565E(SEQIDNO:53)。

图5显示FVIII-BDD(SEQIDNO:3),D519VE665V-FVIII(SEQIDNO:5)和Var97的凝块形成速率的动力学概况，Var97是D519VE665V-FVIII的变体，其具有以下另外的氨基酸取代：I371P,V374F,V559L,R562W和Q565E(SEQIDNO:53)。Var97相对于BDD和D519VE665V的约高10倍的活性从实现凝块形成的最大速率所需的时间是明显的。

图6显示FVIII-BDD(SEQIDNO:3),D519VE665V-FVIII(SEQIDNO:5)和Var97的结合亲和力结果，Var97是D519VE665V-FVIII的变体，其具有以下另外的氨基酸取代：I371P,V374F,V559L,R562W和Q565E(SEQIDNO:53)。

图7显示凝块形成的浊度概况(吸光度单位对时间)，其使用正常血浆、FVIII缺陷性血浆或含有50mU/mL(5％)的以下FVIII变体之一的FVIII缺陷性血浆：FVIII-BDD,D519VE665V-FVIII,Var97或Var97-R336I。

图8显示在血管损伤后施用多剂量FVIII-BDD(灰色原性)或Var97(黑色三角形)后HemA小鼠的24小时存活(％)的图，其通过质量(左图)或单位(右图)测量。

图9显示在存在(+)或缺乏(-)过量FIXa的情况下，来自FXase反应的变体因子VIII多肽的SDS-PAGE凝胶图像。研究的FVIII多肽是FVIII-BDD(第2和3道)，D519VE665V-FVIII(第4和5道)，Var97(第6和7道)和Var97-R336I(第8和9道)，质量标志在第1道。

图10显示FVIII-BDD(SEQIDNO:3),D519VE665V-FVIII(SEQIDNO:5),Var97(SEQIDNO:53)和Var97-R336I(SEQIDNO:55)的凝血酶生成概况。

图11呈现的数据显示引发限定量的峰值凝血酶所需的多种因子VIII多肽和变体的浓度。研究的因子VIII多肽是FVIII-BDD(SEQIDNO:3),D519VE665V-FVIII(SEQIDNO:5),Var97(SEQIDNO:53)和Var97-R336I(SEQIDNO:55)。

序列表简述

SEQIDNO:1包含野生型人因子VIII多肽序列。该多肽在本文中一般称为“野生型因子VIII”、“wt-FVIII”或简称为“因子VIII”或“FVIII”。

SEQIDNO:2包含编码SEQIDNO:1的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:3包含SEQIDNO:1的wt-FVIII多肽序列的经修饰形式，其在B域中有缺失。这是几乎完全的B域缺失，仅B域的14个氨基酸保留。该多肽在本文中一般称为“B域缺失的因子VIII”、“因子VIIIBDD”或“FVIII-BDD”。

SEQIDNO:4包含编码SEQIDNO:3的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:5包含SEQIDNO:3的FVIII-BDD的经修饰形式，其含有两个氨基酸取代：D519V和E665V。该多肽在本文中一般称为“D519VE665V因子VIII”或“D519VE665V-FVIII”。

SEQIDNO:6包含编码SEQIDNO:5的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:7是SEQIDNO:1的wt-FVIII的变体，其含有以下氨基酸取代：Q370M和I371P。

SEQIDNO:8包含编码SEQIDNO:7的多肽的核苷酸序列。。

SEQIDNO:9是SEQIDNO:3的FVIII-BDD的变体，其含有以下氨基酸取代：Q370M和I371P。

SEQIDNO:10包含编码SEQIDNO:9的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:11是SEQIDNO:5的D519VE665V-FVIII的变体，其含有以下另外的氨基酸取代：Q370M和I371P。

SEQIDNO:12包含编码SEQIDNO:11的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:13是SEQIDNO:1的wt-FVIII的变体，其含有以下氨基酸取代：I371P和V374F。

SEQIDNO:14包含编码SEQIDNO:13的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:15是SEQIDNO:3的FVIII-BDD的变体，其含有以下氨基酸取代：I371P和V374F。

SEQIDNO:16包含编码SEQIDNO:15的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:17是SEQIDNO:5的D519VE665V-FVIII的变体，其含有以下另外的氨基酸取代：I371P和V374F。

SEQIDNO:18包含编码SEQIDNO:17的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:19是SEQIDNO:1的wt-FVIII的变体，其含有以下氨基酸取代：V559L和R562F。

SEQIDNO:20包含编码SEQIDNO:19的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:21是SEQIDNO:3的FVIII-BDD的变体，其含有以下氨基酸取代：V559L和R562F。

SEQIDNO:22包含编码SEQIDNO:21的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:23是SEQIDNO:5的D519VE665V-FVIII的变体，其含有以下另外的氨基酸取代：V559L和R562F。

SEQIDNO:24包含编码SEQIDNO:23的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:25是SEQIDNO:1的wt-FVIII的变体，其含有以下氨基酸取代：V559L和R562W。

SEQIDNO:26包含编码SEQIDNO:25的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:27是SEQIDNO:3的FVIII-BDD的变体，其含有以下氨基酸取代：V559L和R562W。

SEQIDNO:28包含编码SEQIDNO:27的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:29是SEQIDNO:5的D519VE665V-FVIII的变体，其含有以下另外的氨基酸取代：V559L和R562W。

SEQIDNO:30包含编码SEQIDNO:29的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:31是SEQIDNO:1的wt-FVIII的变体，其含有以下氨基酸取代：V559L和Q565E。

SEQIDNO:32包含编码SEQIDNO:31的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:33是SEQIDNO:3的FVIII-BDD的变体，其含有以下氨基酸取代：V559L和Q565E。

SEQIDNO:34包含编码SEQIDNO:33的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:35是SEQIDNO:5的D519VE665V-FVIII的变体，其含有以下另外的氨基酸取代：V559L和Q565E。

SEQIDNO:36包含编码SEQIDNO:35的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:37是SEQIDNO:1的wt-FVIII的变体，其含有以下氨基酸取代：V559L,R562W和Q565E。

SEQIDNO:38包含编码SEQIDNO:37的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:39是SEQIDNO:3的FVIII-BDD的变体，其含有以下氨基酸取代：V559L,R562W和Q565E。

SEQIDNO:40包含编码SEQIDNO:39的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:41是SEQIDNO:5的D519VE665V-FVIII的变体，其含有以下另外的氨基酸取代：V559L,R562W和Q565E。

SEQIDNO:42包含编码SEQIDNO:41的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:43是SEQIDNO:1的wt-FVIII的变体，其含有以下氨基酸取代：V559L,R562F和Q565E。

SEQIDNO:44包含编码SEQIDNO:43的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:45是SEQIDNO:3的FVIII-BDD的变体，其含有以下氨基酸取代：V559L,R562F和Q565E。

SEQIDNO:46包含编码SEQIDNO:45的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:47是SEQIDNO:5的D519VE665V-FVIII的变体，其含有以下另外的氨基酸取代：V559L,R562F和Q565E。

SEQIDNO:48包含编码SEQIDNO:47的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:49是SEQIDNO:1的wt-FVIII的变体，其含有以下氨基酸取代：I371P,V374F,V559L,R562W和Q565E。

SEQIDNO:50包含编码SEQIDNO:49的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:51是SEQIDNO:3的FVIII-BDD的变体，其含有以下氨基酸取代：I371P,V374F,V559L,R562W和Q565E。

SEQIDNO:52包含编码SEQIDNO:51的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:53是SEQIDNO:5的D519VE665V-FVIII的变体，其含有以下另外的氨基酸取代：I371P,V374F,V559L,R562W和Q565E。

SEQIDNO:54包含编码SEQIDNO:53的多肽的核苷酸序列。

SEQIDNO:55是SEQIDNO:5的D519VE665V-FVIII的变体，其含有以下另外的氨基酸取代：I371P,V374F,V559L,R562W,Q565E和R336I。

SEQIDNO:56包含编码SEQIDNO:55的多肽的核苷酸序列。

发明详述

在详细描述本发明之前，应理解本公开不限于具体的实施方案，其当然可以变化。还应理解本文中使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，且不意图为限制性的。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语一般具有与本公开所属领域的普通技术人员普遍理解的相同的含义。一般地，本文中使用的命名法和细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化合和杂交中的实验室规程是本领域公知和普遍采用的那些。将标准技术用于核酸和多肽合成。本文中使用的命名法和下文描述的实验室规程是本领域公知和普遍采用的那些。用于遗传工程化的规程是公知的且可见于例如Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,N.Y.)。

如本说明书和所附权利要求中使用的，单数术语和例如单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非内容另外清楚地指示。如此，例如对“多肽”、“该多肽”或“一个/一种多肽”的提述还包括多个/多种多肽。另外，如本文中使用的，术语“包括”意图指组分或步骤的非穷举性列表，如此表明给定的组合物或方法包括所列的组分或步骤，且还可以包括未具体列出的另外的组分或步骤。例如，“包含/包括一个/一种多肽”的组合物还可以包括另外的组分或多肽。术语“包含/包括”还意图涵盖“基本由”和“由”所列组分或步骤“组成”的实施方案。类似地，术语“基本…由”还意图涵盖“由”所列组分或步骤“组成”的实施方案。

本说明书中记载的数值范围包含限定范围的数值(端点数值)且还意图包括在限定范围内的每个整数或任意非整数分数。

在描述和主张具体的实施方案时，将依照下文所述的定义使用下列术语。

如本文中使用的，“B域缺失的因子VIII”或“FVIII-BDD”指含有至少一些部分B域的缺失的因子VIII多肽。在本文所述的例子中，FVIII-BDD具体指除14个氨基酸以外B域全部缺失的因子VIII。(Lind等,Eur.J.Biochem.232:19-27(1995))，其多肽序列列在SEQIDNO:3中，该序列由SEQIDNO:4的核苷酸序列编码。然而，尽管在本文的例子中采用了这一具体的FVIII-BDD序列，应理解还可以使用相比于SEQIDNO:3具有修饰的因子VIII多肽，包括在B域缺失中具有差异。例如，具有多于或少于14个B域氨基酸保留的因子VIII多肽也可用于一些实施方案，如果因子VIII促凝血活性保留的话。

如本文中使用的，“因子VIII”或“FVIII”指血液凝固因子，其为由肝合成并释放到血流中的糖蛋白。在其未成熟形式中，FVIII含有信号序列，该序列在翻译过程期间被蛋白水解性切割。在除去该19氨基酸的信号序列后，因子VIII多肽处于其成熟形式，其中分泌的FVIII产物的第一氨基酸是丙氨酸。因子VIII的这种成熟形式在本文中将称为“成熟因子VIII”。成熟的野生型人FVIII具有SEQIDNO:1中所列的氨基酸序列，尽管可能有等位变体和经修饰的型式，如SEQIDNO:3和5中所列的那些。

如本文中使用的，“功能性因子VIII多肽”指能够在体内或体外改正人因子VIII缺陷(由例如血友病A表征)的多肽或多肽组合。因子VIII在天然状态有多种降解或经加工形式。这些蛋白水解性衍生自前体一链蛋白，如本文中显示的。功能性因子VIII多肽包括这类单链蛋白且还提供具有改正人因子VIII缺陷的生物学活性的这些多种降解产物。等位变异可能存在。功能性因子VIII多肽包括所有这类等位变异，糖基化型式，修饰，和片段(产生因子VIII衍生物)，只要它们含有因子VIII的功能性区段且基本的、特征性的因子VIII功能性活性在种类上保持未受影响。拥有必要的功能性活性的那些因子VIII衍生物可通过本文中描述的直接体外测试鉴定。此外，功能性因子VIII多肽能催化在存在因子IXa、钙和磷脂的情况下因子X到Xa的转化，以及改正源自患有血友病A的个体的血浆中的凝血缺陷。从本文中人因子VIII氨基酸序列和功能性区域的序列的公开内容，可经由对DNA的限制酶切割或人因子VIII蛋白的蛋白水解性或其他降解衍生的片段对于本领域技术人员将是明显的。

如本文中使用的，“凝血酶切割位点”指因子VIII肽链的一部分，其为凝血酶的靶切割位点。在某些实施方案中，凝血酶切割位点位于或接近因子VIII多肽的a1-A2接合处。在其他实施方案中，凝血酶切割位点位于成熟野生型人因子VIII肽(SEQIDNO:1)的氨基酸残基370-375处。在进一步的实施方案中，凝血酶切割位点可以是同源因子VIII多肽如等位变体或经修饰多肽中的同源位点。

如本文中使用的，“活化环”指因子VIII肽链的A2亚基的一部分，其能够与因子IXa界面连接。在某些实施方案中，所述活化环位于成熟野生型人因子VIII肽(SEQIDNO:1)的氨基酸残基558-565处。在进一步的实施方案中，所述活化环可以是同源因子VIII多肽如等位变体或经修饰多肽中的同源位点。

如本文中使用的，“域界面”指因子VIIIa异三聚体的相应亚基上的区域或残基，其与该异三聚体的其他亚基相互作用。如此，“A1-A2域界面”指A1和A2亚基各自上的区域或残基，其与其他亚基上的相应区域或残基相互作用。类似地，“A2-A3域界面”指A2和A3亚基各自上的区域或残基，其与其他亚基上的相应区域或残基相互作用。在某些例子中，A1-A2域界面包含残基E272和D519(基于SEQIDNO:1的野生型因子VIII序列)。在其他例子中，A2-A3域界面包含残基E665和E1984(基于SEQIDNO:1的野生型因子VIII序列)。

如本文中使用的，“因子IX”或“FIX”意指凝固因子IX，其也称为人凝固因子IX或血浆促凝血酶原激酶成分。

如本文中使用的，“因子X”或“FX”意指凝固因子X，其也称为人凝固因子X和名为Stuart-Prower因子。

“药动学”或“PK”用于本文指药物在体内的吸收、分布、代谢和消除的特性。药物的药动学的改进意指使得药物在体内作为治疗剂更有效的那些特征中的改进，尤其是它在体内的有用持续时间。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中一般可交换使用且其指单体为氨基酸通过酰胺键连接在一起的聚合物。另外，非天然氨基酸例如β-丙氨酸、苯基甘氨酸、和高精氨酸也包括在内。非基因编码的氨基酸也可以用于本文中描述的技术。此外，经过修饰以包括反应基团、糖基化位点、聚合物、治疗模块、生物分子等的氨基酸也可以使用。本文中使用的所有氨基酸可以是D-或L-异构体。一般优选L-异构体。如本文中使用的，“多肽”、“肽”和“蛋白质”指糖基化和非糖基化形式两者。

术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物，其以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥功能。天然存在的氨基酸是由遗传密码子编码的那些，以及后来修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。“氨基酸类似物”指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构即结合氢的α碳、羧基基团、氨基基团和R基团的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍(sulfonium)。这类类似物具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥功能的化学化合物。

“变体”和“突变体”在本文中可交换使用且它们各自指经遗传工程化的多肽或编码多肽的核苷酸序列，其产生是对核苷酸或多肽序列进行实验室诱导的改变的结果。在描述氨基酸时，本领域公知的标准一字母或三字母氨基酸编码可代填氨基酸的完整名称使用。另外，一字母氨基酸编码继之以数字可用于指示开始序列中在具体位置处的具体氨基酸。例如“V374”将指示在wt-FVIII序列(SEQIDNO:1)的氨基酸位置374处的缬氨酸。进一步地，在位置编号后可以纳入取代氨基酸的一字母编码以指示进行的具体氨基酸取代。例如，“V374F”将指示在位置374处取代缬氨酸的苯丙氨酸残基。“取代”如用于本文指将一种氨基酸用另一种氨基酸替换且不包括缺失或添加，除非另外明确说明。

应注意的是，除非具体的例子的语言另外具体地指示，本文中公开的氨基酸位置均基于成熟野生型因子VIII肽的氨基酸序列中的相应位置，如SEQIDNO:1中提供的，如本领域中常规所做的。

本公开的变体多肽包含在凝血酶切割位点和活化环之一或两者中的一个或多个氨基酸取代。在某些例子中，变体多肽包含在以下之一或两者中的一个或多个氨基酸取代：1)凝血酶切割位点，由SEQIDNO:1的氨基酸位置370-375代表，和2)活化环，由SEQIDNO:1的氨基酸位置558-565代表。对于残基370-375处的凝血酶切割位点，切割通常在R372残基之后立即发生，使得该残基对于在该位点处的适宜切割是重要的。如此，在某些实施方案中，变体多肽将包含由SEQIDNO:1的氨基酸位置370-375代表的凝血酶切割位点内的一个或多个氨基酸取代，其中所述取代不在位置372处。在某些实施方案中，氨基酸取代可以是在起始序列中下列一个或多个位置处的取代(位置编号基于SEQIDNO:1的wt-FVIII序列)：Q370,I371,S373,V374,A375,S558,V559,D560,Q561,R562,G563,N564和Q565。在某些其他实施方案中，在那些位置的2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12或13个处可能有取代。在另外的实施方案中，变体可以在凝血酶切割位点(370-375)和活化环(558-565)各自中包含至少一个取代。在某些例子中，变体可以包含Q370,I371,S373,V374和A375的至少一个的取代，和S558,V559,D560,Q561,R562,G563,N564和Q565的至少一个的取代。在进一步的实施方案中，变体可以在凝血酶切割位点(370-375)或活化环(558-565)的任一中包含超过一个取代，例如2,3,4,5,6,7或8个取代。在具体的例子中，变体包含在凝血酶切割位点(370-375)内的两个取代和在活化环(558-565)内的两个取代。在其他例子中，变体包含在凝血酶切割位点(370-375)内的两个取代和在活化环(558-565)内的三个取代。在具体的例子中，凝血酶切割位点内的取代是Q370M,I371P,V374F,Q370M/I371P或I371P/V374F。在其他例子中，活化环内的取代是V559L,R562W,R562F,R562K,Q565E,V559L/R562F,V559L/R562W,V559L/Q565E,V559L/R562W/Q565E或V559L/R562F/Q565E。

在别的例子中，变体因子VIII多肽还包含对A1-A2和A2-A3域界面的每个内的氨基酸残基的一个或多个取代。在具体的例子中，A1-A2域界面内的取代包含对残基E272和D519之一或两者的取代(基于SEQIDNO:1的野生型因子VIII序列)。在某些实施方案中，这些取代将在E272和D519处的带电荷的天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)残基之一或两者用疏水性残基，特别是疏水性残基如丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或色氨酸替换。在某些例子中，A1-A2域界面内的一个或多个取代选自下组：E272A、E272V、D519A和D519V。在另外的例子中，A2-A3域界面内的取代包含对残基E665和E1984之一或两者的取代(基于SEQIDNO:1的野生型因子VIII序列)。在某些实施方案中，这些取代将在E665和E1984处的带电荷的谷氨酸(E)残基之一或两者用疏水性残基，特别是疏水性残基如丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或色氨酸替换。在进一步的例子中，A2-A3域界面内的一个或多个取代选自下组：E665A,E665V,E1984A和E1984V。在某些例子中，所述变体因子VIII多肽包含D519A/E665A取代、D519A/E665V取代、D519V/E665A取代或D519V/E665V取代。

在某些例子中，变体因子VIII多肽的制备牵涉对编码因子VIII多肽的核酸序列的定点诱变。核苷酸序列的这类定点突变可通过本领域已知的任意方法进行且本领域技术人员将能容易地确定用于手头上具体应用的适宜的诱变技术。在某些例子中，使用商品化的定点诱变试剂盒如StratageneQuickChange^TMII定点诱变试剂盒、ClontechTransformer定点诱变试剂盒no.K1600-1、InvitrogenGenTaylor定点诱变系统no.12397014、PromegaAlteredSitesII体外诱变系统试剂盒no.Q6210、或TakaraMirusBioLAPCR诱变试剂盒no.TAKRR016完成诱变。

在某些实施方案中，当与起始因子VIII多肽相比时，变体因子VIII多肽将在至少一种活性测定中具有增加的活性。任何适用于测试因子VIII活性的测定法可用于本公开的变体多肽，且这类测定法是本领域中公知的。这类活性测定法包括但不限于：aPTT；用于FVIII的生色或生荧光(fluorogenic)底物测定法，从FXase复合物的个体组分组装或作为试剂盒；凝血酶生成测定法或测试(TGA或TGT)或校准的自动化凝血酶成像术(thrombography)(CAT)；和旋转性凝血酶弹性测定法(thromboelastometry)(ROTEM)或旋转型凝血酶弹性成像术(thromboelastography)(ROTEG)。

aPTT可以指一阶段或不太常见的两阶段测定，其中凝固检测为实现预限定的样品浊度或粘度所需要的时间(凝固时间或CT)。由于aPTT是基于血浆的测定法，其用于评估血浆中的潜在因子VIII活性和功能。在典型的一阶段aPTT中，将含有FVIII的血浆样品与带负电荷的表面或颗粒和Ca⁺²温育以启动凝血。在一阶段测定中，FXIa、FVIIIa、FXa、凝血酶和血纤蛋白生成在一个反应中发生。在两阶段测定中，FXIa、FVIIIa和FXa生成在第一阶段发生而凝血酶和血纤蛋白生成在第二阶段中发生。可以对一阶段和两阶段aPTT修改以使得测定法特异于FVIII定量，如在FVIII特异性因子测定法中的。

生色底物测定法(色测定)是设计为评估FXase复合物(FIXa,PL,Ca+2和FX)背景中的FVIII功能的两阶段测定法。在该测定法中，FVIIIa被完全激活，且FIXa和PL过量，这是生理上不通常遇到的情况。在该测定法中，在第一阶段将FVIIIa与FXase复合物的纯化的或相对纯化的组分组合以生成FXa。在第二阶段中，生成的FXa的水平通过在由FXa切割时产生颜色的底物来定量。生色测定法的变型包括将生色底物用生荧光底物替换，并检测荧光发射(生荧光测定法)。

TGA，FVIII促凝血功能的另一种测定法，通过用生理引发剂(initiator)如组织因子(TF)或FXIa在存在磷脂(PL)(40:40:20,v/v/v磷酯酰丝氨酸:磷脂酰胆碱:磷脂酰乙醇胺)的情况下激活含有FVIII的血浆以刺激激活的血小板的膜表面来实施。凝血酶生成(和凝固)起始于对样品添加Ca⁺²和凝血酶的生荧光底物。在CAT中，荧光随时间的变化随后与凝血酶浓度相关，其通过监测含有限定水平的凝血酶的并行样品中荧光变化的速率。描述凝血酶生成概况中的动力学变化的参数可包括应答开始前的时间(延迟(lag))和实现的峰值凝血酶(峰值)。

ROTEM/ROTEG类似于TGA，只不过监测随凝固的粘度的进展而不是凝血酶生成。同样，凝固在含有FVIII的血浆中通过Ca⁺²或TF-PL混合物启动。描述粘度中的动力学变化的参数可包括凝固启动时间(CT)和粘度变化速率(α角)。

在某些例子中，变体因子VIII多肽的活性将通过一种或多种测定法测试。注意由于这些FVIII变体的作用机制中的变化和测定法检测FVIII功能的特定方面的能力，仅某些测定法将检测因子VIII活性中的显著增强。因此，在某些例子中，变体因子VIII多肽在一个测定法中可能具有与wt-FVIII可比的活性而在另一测定法中拥有增加的活性。例如，变体在生色测定法中可能具有与wt-FVIII可比的活性而当使用aPTT测定法或凝血酶生成测定法测试时拥有增加的活性。这可以发生在例如变体具有增强的催化活性但也更易感于蛋白水解性降解时发生。对于一些变体，对增强的活性最敏感的测定法可能是一阶段aPTT和TGA，而非生色测定法。凝固蛋白的测定表现中的这类差异并非不常见的，特别是当突变处于影响特定功能而非其他的域中时(Leong等,Biochemistry31:2567(1992)；Stone等,Biochemistry30:6392(1991)；Henriksen和Mann,Biochemistry28:2078(1989))。这些结果可能表明这些变体可能具有更易于被激活的优势，即加速从FVIII至FVIIIa的转化，其然后能转换成增强的凝血酶生成。

在某些例子中，变体因子VIII多肽将拥有大于起始因子VIII多肽、wt-FVIII、FVIII-BDD或D519VE665E-FVIII的活性。这些活性将使用在可比条件下产生的多肽测量，所述条件如变体和起始多肽在同一类型的细胞系中在可比条件下的重组表达。在某些实施方案中，在至少一种测定法中相对于起始因子VIII多肽、wt-FVIII、FVIII-BDD、或D519VE665E-FVIII活性将增加至少1.1倍。在其他实施方案中，在至少一种测定法中相对于起始因子VIII多肽、wt-FVIII、FVIII-BDD、或D519VE665E-FVIII活性将增加至少约1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4.0倍、4.5倍、5.0倍、5.5倍、6.0倍、6.5倍、7.0倍、7.5倍、8.0倍、8.5倍、9.0倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、21倍、22倍、23倍、24倍、25倍、26倍、27倍、28倍、29倍、30倍、31倍、32倍、33倍、34倍、35倍、36倍、37倍、38倍、39倍、40倍、41倍、42倍、43倍、44倍、45倍、46倍、47倍、48倍、49倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、160倍、170倍、180倍、190倍、200倍、210倍、220倍、230倍、240倍、250倍、260倍、270倍、280倍、290倍、300倍、310倍、320倍、330倍、340倍、350倍、360倍、370倍、380倍、390倍、400倍、450倍、500倍，或更高。

仍在别的实施方案，在至少一种测定法中相对于起始因子VIII多肽、wt-FVIII、FVIII-BDD、或D519VE665E-FVIII活性将增加约1.2至10倍、1.2至12倍、1.2至14倍、1.2至16倍、1.2至18倍、1.2至20倍、1.2至30倍、1.2至40倍、1.2至50倍、1.2至60倍、1.2至70倍、1.2至80倍、1.2至90倍、1.2至100倍、1.3至10倍、1.3至12倍、1.3至14倍、1.3至16倍、1.3至18倍、1.3至20倍、1.3至30倍、1.3至40倍、1.3至50倍、1.3至60倍、1.3至70倍、1.3至80倍、1.3至90倍、1.3至100倍、1.4至10倍、1.4至12倍、1.4至14倍、1.4至16倍、1.4至18倍、1.4至20倍、1.4至30倍、1.4至40倍、1.4至50倍、1.4至60倍、1.4至70倍、1.4至80倍、1.4至90倍、1.4至100倍、1.5至10倍、1.5至12倍、1.5至14倍、1.5至16倍、1.5至18倍、1.5至20倍、1.5至30倍、1.5至40倍、1.5至50倍、1.5至60倍、1.5至70倍、1.5至80倍、1.5至90倍、1.5至100倍、1.6至10倍、1.6至12倍、1.6至14倍、1.6至16倍、1.6至18倍、1.6至20倍、1.6至30倍、1.6至40倍、1.6至50倍、1.6至60倍、1.6至70倍、1.6至80倍、1.6至90倍、1.6至100倍、1.8至10倍、1.8至12倍、1.8至14倍、1.8至16倍、1.8至18倍、1.8至20倍、1.8至30倍、1.8至40倍、1.8至50倍、1.8至60倍、1.8至70倍、1.8至80倍、1.8至90倍、1.8至100倍、2至10倍、2至12倍、2至14倍、2至16倍、2至18倍、2至20倍、2至30倍、2至40倍、2至50倍、2至60倍、2至70倍、22至80倍、2至90倍、2至100倍、4至10倍、4至12倍、4至14倍、4至16倍、4至18倍、4至20倍、4至30倍、4至40倍、4至50倍、4至60倍、4至70倍、4至80倍、4至90倍、4至100倍、5至10倍、5至12倍、5至14倍、5至16倍、5至18倍、5至20倍、5至30倍、5至40倍、5至50倍、5至60倍、5至70倍、5至80倍、5至90倍、5至100倍、6至12倍、6至14倍、6至16倍、6至18倍、6至20倍、6至30倍、6至40倍、6至50倍、6至60倍、6至70倍、6至80倍、6至90倍、6至100倍、8至16倍、8至18倍、8至20倍、8至30倍、8至40倍、8至50倍、8至60倍、8至70倍、8至80倍、8至90倍、8至100倍、10至20倍、10至30倍、10至40倍、10至50倍、10至60倍、10至70倍、10至80倍、10至90倍、10至100倍、12至20倍、12至30倍、12至40倍、12至50倍、12至60倍、12至70倍、12至80倍、12至90倍、12至100倍、15至30倍、15至40倍、15至50倍、15至60倍、5至70倍、15至80倍、15至90倍、15至100倍、20至40倍、20至50倍、20至60倍、20至70倍、20至80倍、20至90倍、20至100倍、30至40倍、30至50倍、30至60倍、30至70倍、30至80倍、30至90倍、30至100倍、40至60倍、40至70倍、40至80倍、40至90倍、40至100倍、50至80倍、50至90倍、50至100倍、60至80倍、60至90倍、60至100倍、70至100倍、70至200倍、90至100倍、90至120倍、90至140倍、100至150倍、100至160倍、100至180倍、100至200倍、100至250倍、100至300倍、100至350倍、100至400倍、100至500倍、120至150倍、120至160倍、120至180倍、120至200倍、120至250倍、120至300倍、120至350倍、120至400倍、120至500倍、150至200倍、150至250倍、150至300倍、150至350倍、150至400倍、150至500倍、200至300倍、200至400倍、200至500倍、00至400倍、300至500倍、或400至500倍。

本文中描述的因子VIII变体可使用任何功能性因子VIII多肽作为起始多肽来设计。在某些实施方案中，因子VIII多肽是人因子VIII多肽。在进一步的实施方案中，因子VIII多肽是人wt-FVIII(SEQIDNO:1),FVIII-BDD(SEQIDNO:3)或D519VE665E-FVIII(SEQIDNO:5)。相比于野生型因子VIII的氨基酸序列，起始多肽可以具有缺失、插入和/或添加。作为非限制性例子，起始多肽可包括具有进一步稳定化A2域的突变的因子VIII突变体(参见例如WO97/40145)、产生增加的表达的因子VIII突变体(参见例如Swaroop等,JBC272:24121-24124(1997))，相对于野生型降低免疫原性的因子VIII突变体(参见例如Lollar,Thromb.Haemost.82:505-508(1999))，从不同表达的重链和轻链重建的因子VIII(参见例如Oh等,Exp.Mol.Med.31:95-100(1999)，或具有降低的对受体的结合导致因子VIII的分解代谢如HSPG(硫酸类肝素蛋白多糖)和/或LRP(l低密度脂蛋白受体相关的蛋白)的因子VIII突变体(参见例如Ananyeva等,TCM11:251-257(2001))。在某些例子中，因子VIII多肽还可以含有另外的氨基酸取代，如例如在R336残基或接近该残基处的取代，例如R336I取代。另外，可用的起始多肽可以是仍拥有因子VIII功能性的这些的经修饰形式，包括包含与wt-FVIII(SEQIDNO:1)、FVIII-BDD(SEQIDNO:3)或D519VE665E-FVIII(SEQIDNO:5)的序列至少约99％,98％,97％,96％,95％,94％,93％,92％,91％,90％,89％,88％,87％,86％,85％,84％,83％,82％,81％,80％,79％,78％,77％,76％,75％,74％,73％,72％,71％,70％,69％,68％,67％或66％相同的氨基酸序列的多肽。进一步地，本公开的变体因子VIII多肽包括任何变体多肽，其与wt-FVIII(SEQIDNO:1)、FVIII-BDD(SEQIDNO:3)或D519VE665E-FVIII(SEQIDNO:5)的序列具有至少约99％,98％,97％,96％,95％,94％,93％,92％,91％,90％,89％,88％,87％,86％,85％,84％,83％,82％,81％,80％,79％,78％,77％,76％,75％,74％,73％,72％,71％,70％,69％,68％,67％或66％同一性且其也含有本文中论述的一个或多个氨基酸取代，或在一个进一步的实施方案中在凝血酶切割位点和活化环两者中含有一个或多个氨基酸取代。在另一个实施方案中，本公开的变体因子VIII多肽包括任意变体多肽，其与wt-FVIII(SEQIDNO:1)、FVIII-BDD(SEQIDNO:3)或D519VE665E-FVIII(SEQIDNO:5)的序列具有超过99％,98％,97％,96％,95％,94％,93％,92％,91％,90％,89％,88％,87％,86％,85％,84％,83％,82％,81％,80％,79％,78％,77％,76％,75％,74％,73％,72％,71％,70％,69％,68％,67％或66％同一性且其也含有本文中论述的一个或多个氨基酸取代，或在一个进一步的实施方案中在凝血酶切割位点和活化环两者中含有一个或多个氨基酸取代。

在另一个实施方案中，本公开涉及编码所述变体因子VIII多肽的核酸序列。在一个实施方案中，因子VIII变体由以下核苷酸序列编码，该核苷酸序列与wt-FVIII(SEQIDNO:2)、FVIII-BDD(SEQIDNO:4)或D519VE665E-FVIII(SEQIDNO:6)的核苷酸序列在全长中具有至少约99％,98％,97％,96％,95％,94％,93％,92％,91％,90％,89％,88％,87％,86％,85％,84％,83％,82％,81％,80％,79％,78％,77％,76％,75％,74％,73％,72％,71％,70％,69％,68％,67％或66％同一性且其编码含有本文中论述的一个或多个氨基酸改变，或在一个进一步的实施方案中在凝血酶切割位点和活化环两者中含有一个或多个氨基酸取代的多肽。在另一个实施方案中，因子VIII变体由以下核苷酸序列编码，该核苷酸序列与wt-FVIII(SEQIDNO:2)、FVIII-BDD(SEQIDNO:4)或D519VE665E-FVIII(SEQIDNO:6)的核苷酸序列在全长中具有超过99％,98％,97％,96％,95％,94％,93％,92％,91％,90％,89％,88％,87％,86％,85％,84％,83％,82％,81％,80％,79％,78％,77％,76％,75％,74％,73％,72％,71％,70％,69％,68％,67％或66％同一性且其编码含有本文中论述的一个或多个氨基酸改变，或在一个进一步的实施方案中在凝血酶切割位点和活化环两者中含有一个或多个氨基酸取代的多肽。

百分比同一性值在整个氨基酸或核酸序列区域中计算。熟练技术人员可获得基于多种算法的一系列程序来比较不同的序列。在至少一个实施方案中，使用Needleman和Wunsch算法测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性(NeedlemanJ.Mol.Biol.48:444-453(1970))，该算法已被纳入EMBOSS软件包的needle程序中(Rice等,“EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,”TrendsinGenetics16:276-277(2000))，对于远相关蛋白使用BLOSUM45或PAM250打分矩阵，或对于更近相关的蛋白使用BLOSUM62或PAM160打分矩阵，以及为16,14,12,10,8,6或4的缺口打开罚分和为0.5,1,2,3,4,5或6的缺口延伸罚分。本地安装EMBOSS软件包的指导以及到WEB-Services的链接可见于emboss.sourceforge.net。要用于使用needle程序比对两个氨基酸序列的参数的非限制性例子是缺省参数，包括EBLOSUM62打分矩阵、缺口打开罚分为10和缺口延伸罚分为0.5。在又一个实施方案中，使用EMBOSS软件包中的needle程序测定两条核苷酸序列之间的百分比同一性(Rice等,“EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,”TrendsinGenetics16:276-277(2000))，其使用EDNAFULL打分矩阵和为16,14,12,10,8,6或4的缺口打开罚分和为0.5,1,2,3,4,5或6的缺口延伸罚分。关于使用needle程序比对两个氨基酸序列的参数的非限制性例子是缺省参数，包括EDNAFULL打分矩阵、缺口打开罚分为10和缺口延伸罚分为0.5。核酸和蛋白质序列可进一步被用作"查询序列"对公共数据库进行检索，例如以鉴定其他家族成员或相关序列。这类检索可使用Altschul的(Altschul等,J.Mol.Biol.215:403-10(1990))BLAST系列程序实施(版本2.2)。使用本公开的核酸序列作为查询序列的BLAST可用BLASTn、BLASTx或tBLASTx程序实施，其使用缺省参数以获得核苷酸序列(BLASTn、tBLASTx)或与本公开的核酸序列编码的序列同源的氨基酸序列(BLASTx)。使用本公开的核酸序列编码的蛋白质序列作为查询序列的BLAST可用BLASTp或tBLASTn程序实施，使用缺省参数以获得与本公开的序列同源的氨基酸序列(BLASTp)或核酸序列(tBLASTn)。为了获得用于比较目的的有缺口比对，可利用如Altschul等,NucleicAcidsRes.25:3389-3402(1997)中描述的使用缺省参数的GappedBLAST。

在某些实施方案中，本公开的多核苷酸基本由前述核苷酸序列组成或包含前述核苷酸序列。如此，它们还可含有别的核苷酸序列。在某些实施方案中，所述多核苷酸除了开发阅读框之外，还可进一步在编码基因区的3'和5'末端处包含不翻译序列，例如在编码区5'末端的上游序列的至少10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,200,300,400,500或更多个核苷酸和/或在编码基因区3'末端的下游序列的至少10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,200,300,400,500或更多个核苷酸。此外，多核苷酸可编码包含所谓的“标签”的蛋白质，该标签可充当可检测标志物或用于纯化目的的辅助手段。用于不同目的的标签是本领域中公知的且包括例如FLAG标签、6-组氨酸标签、MYC标签等。在一个实施方案中，所述多核苷酸还包含可操作地连接于核苷酸序列的表达调控序列。

在某些实施方案中，将编码变体因子VIII多肽的核酸序列插入适宜的载体中。可用于多种目的的大量载体是本领域中公知的且本领域技术人员将能容易地选择适宜的载体用于其期望的应用。在某些例子中，所述载体可以是克隆载体或表达载体。在其他例子中，载体可以是质粒、病毒载体、粘粒或人工染色体。适宜载体的例子包括Tat/Tar-oriP表达载体，如pSS185(Cho等,Biotechnol.Prog.19:229-232(2003))和pSS207(Mei等,Mol.Biotech.34:165-178(2006))，以及pcDNA3.1、pCINeo、pEAK、pCEP4和pUCOE载体。在某些例子中，可将编码变体因子VIII多肽的核酸置于适宜的启动子附近和/或处于适宜启动子的调控下。可用于多种目的的大量启动子是本领域公知的且本领域技术人员将能容易地选择适宜的启动子用于其期望的应用。在某些例子中，启动子可以是构成性启动子、可诱导启动子或组织特异性启动子。适宜启动子的例子包括人或鼠CMV启动子/增强子、SV40启动子/增强子、EIf1alpha启动子、MPSV启动子、和SRalpha启动子。

在某些实施方案中，变体因子VIII多肽在细胞、组织或生物体中重组产生。在某些实施方案中，这类重组产生通过用编码变体多肽的核酸分子或含有这类核酸的载体转化或转染宿主细胞来完成。大量转化和转染方法是本领域公知的且本领域技术人员将能容易地选择适宜的方法用于其期望的应用。适宜的转化方法的例子包括脂质体介导的转染(例如293Fectin^TMfromInvitrogen)、磷酸钙转染、电穿孔和DEAE-葡聚糖转染。

这类重组产生还可以使用任何适宜的宿主细胞、组织或生物体完成。适宜的宿主细胞、组织和生物体是本领域公知的且本领域技术人员将能容易地选择适宜的宿主用于其期望的应用。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物的。适宜的哺乳动物细胞系的例子是COS-1(ATCCCRL1650)、幼仓鼠肾(BHK)细胞系，如BHK21,HKB11(Cho等,J.Biomed.Sci.9:631(2002)),HEK293(ATCCCRL-1573；Graham等,J.Gen.Virol.36:59-72(1977)),HEK293T(ATCCCRL11268；DSMACC2494)和HEK293F(InvitrogenR79007)细胞。可用的BHK细胞系是tk³¹ts13BHK细胞系(Waechter和Baserga,Proc.Natl.Acad.Sci.USA79:1106-1110(1982)，通过提述并入本文)，下文中称为BHK570细胞。BHK570细胞系已保藏于美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)，12301ParklawnDr.,Rockville,Md.20852，在ATCC登录号CRL10314下。tk^-ts13BHK细胞系也可从ATCC登录号CRL1632下获得。另外，本公开中可使用许多其他细胞系，包括大鼠HepI(大鼠肝细胞瘤；ATCCCRL1600)、大鼠HepII(大鼠肝细胞瘤；ATCCCRL1548)、TCMK(ATCCCCL139)、人肺(ATCCHB8065)、NCTC1469(ATCCCCL9.1)、CHO(ATCCCCL61)、CHOK1(ATCCCCI61)、DUKX细胞(Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220(1980))和CHO-DG44细胞(Urlaub等,Cell33:405-412(1983))。

在另一个实施方案中，本公开设计因子VIII变体的药物制剂，以及药物组合物，其包含治疗有效量的因子VIII变体和药学可接受的赋形剂或载体。药学可接受的赋形剂或载体一般包括可添加到活性成分以帮助配制或稳定化制备物，且对患者不产生显著的不良毒物性作用的物质。大量适宜的赋形剂和载体是本领域公知的且本领域技术人员将能容易地鉴定适宜的赋形剂或载体用于具体的制剂或组合物。适宜的赋形剂或载体的例子包括水、糖如麦芽糖或蔗糖；清蛋白；和盐。适宜制剂的具体例子包括美国专利No.5,763,401(1996年7月12日提交；1998年6月9日授权)中描述的制剂，其通过提述完整并入本文。

在一个实施方案中，所述药物制剂/组合物用于胃肠外施用，如通过iv、sc或肌内(im)施用，且给药可以是单次推注给药、间歇给药或连续iv输注。也可用局部制剂。在一个实施方案中，所述药物制剂包含如本文中描述的分离的因子VIII变体，或包含如本文中描述的因子VIII变体的组合物，其处于冻干制备物中，在使用时重建。或者，所述药物制剂可以是稳定的液体即用型制剂，不需要重建。药物制剂可以以冻干粉末的一次性管形瓶或即用型溶液的管形瓶(含有约25IU,50IU,75IU,100IU,125IU,150IU,175IU,200IU,250IU,300IU,350IU,400IU,450IU,500IU,550IU,600IU,650IU,700IU,750IU,800IU,850IU,900IU,950IU,1000IU,1050IU,1100IU,1150IU,1200IU,1250IU,1300IU,1350IU,1400IU,1450IU,1500IU,1550IU,1600IU,1650IU,1700IU,1750IU,1800IU,1850IU,1900IU,1950IU,2000IU,2050IU,2100IU,2150IU,2200IU,2250IU,2300IU,2350IU,2400IU,2450IU,2500IU,2550IU,2600IU,2650IU,2700IU,2750IU,2800IU,2850IU,2900IU,2950IU,3000IU,3050IU,3100IU,3150IU,3200IU,3250IU,3300IU,3350IU,3400IU,3450IU,3500IU,3550IU,3600IU,3650IU,3700IU,3750IU,3800IU,3850IU,3900IU,3950IU,4000IU,4050IU,4100IU,4150IU,4200IU,4250IU,4300IU,4350IU,4400IU,4450IU,4500IU,4550IU,4600IU,4650IU,4700IU,4750IU,4800IU,4850IU,4900IU,4950IU,5000IU,5500IU,6000IU,6500IU,7000IU,7500IU,8000IU,8500IU,9000IU,9500IU,10000IU,10500IU,11000IU,11500IU,12000IU,12500IU,13000IU,13500IU,14000IU,14500IU或15000IU)提供，且含有由两个上述数值鉴别的上述量的任意范围的管形瓶也包括在本文中(例如25-75IU,100-200IU等的范围)。“IU”在本领域中理解为国际单位(InternationalUnit)且由WHO国际标准鉴定。用于制备胃肠外可施用组合物的实际方法将是本领域技术人员已知或显然的，且更多详情记载于例如Remington'sPharmaceuticalSciences,21sted.,publishedbyLippincottWilliams&Wilkins(2005)。局部施用，如在外伤或手术情况中可取的，可通过喷雾、灌注、导管、支架(stent)、血管移植物或支架、软膏剂、或其他本领域已知的制备物的手段实施。在某些例子中，局部施用可通过固体或半固体基质，如外科海绵或胶原基质，其已用包含变体因子VIII多肽的组合物处理、输注、包被或浸泡。制备这类基质的方法是本领域中公知的(参见例如Thrombosis/Hemostasis12:445(2006))。然后将使用已知的技术将本公开的组合物应用到基质，如将水性制剂喷洒到基质上。

在一个实施方案中，本公开涉及包含变体因子VIII多肽的试剂盒。在某些例子中，试剂盒含有管形瓶，其含有冻干的变体因子VIII多肽，或包含该多肽的冻干制剂，还含有用于重建的稀释物。在其他例子中，试剂盒含有因子VIII多肽的局部制剂，例如软膏剂、喷雾、液体和基质如海绵或其他在施用给患者前可对其应用局部制剂的医学基质。

对患有血友病A或由特定凝血因子中的缺陷导致的其他凝血病症的患者施用的适宜剂量可由本领域技术人员基于例如患者的重量、出血事件的严重性、因子缺陷性、和采用的具体变体的比活性容易地确定。在某些例子中，当胃肠外施用时，给药可以是约5IU/kg,10IU/kg,15IU/kg,20IU/kg,25IU/kg,30IU/kg,35IU/kg,40IU/kg,45IU/kg,50IU/kg,55IU/kg,60IU/kg,65IU/kg,70IU/kg,75IU/kg,80IU/kg,85IU/kg,90IU/kg,95IU/kg,100IU/kg或更多。剂量还可以在某剂量范围内，其中该范围的各端点选自上述剂量，如即5-15IU/kg、10-20IU/kg等。在某些实施方案中，对于患有血友病A的患者，iv施用的剂量为约40IU每千克用于术前适应证，15至20IU每千克用于小出血，和20至40IU每千克在8小时时段内施用用于维持剂量。基于所施用的变体因子VIII制备物的药动学概况，这些剂量可以按照需要频繁施用。例如，这类制备物可以每日两次、每日、每隔一日、每三日、每周三次、每周两次或每周一次静脉内施用用于防护用途。给药的频率将基于血友病A状况的严重性、所施用的变体的药动学和由于增强的活性实现的作用延长来确定。

本文中的因子VIII变体和组合物可用于治疗血液凝固病症和受益于血液凝固的那些病症，且尤其可用于其中需要具有增加的凝血活性的因子VIII的情况。因此，本文中的因子VIII变体和组合物可用于在患有凝血病症的患者中的防护治疗，以及用于治疗有或无潜在凝血缺陷的患者中的急性出血事件。在某些实施方案中，可以采用所述变体因子VIII多肽来治疗由穿透性创伤损伤导致或与其有关的出血；钝性创伤损伤；选择性手术中的出血；心脏手术中的出血；脊椎手术中的出血；整形外科手术；神经外科；肿瘤手术；产后手术；月经过多；干细胞移植中的出血；肝移植中的出血；胃肠出血；硬化中的活性静脉曲张出血；硬化中的非静脉曲张出血；弥漫性肺泡出血；大动脉动脉瘤；大脑内出血；外伤性脑损伤；脑挫伤；逆转华法林；逆转肝素；逆转抗凝血剂；逆转抗血栓药；因子VIII缺陷；vonWillebrand病的特定类型；遗传性出血性毛细血管扩张；多种动静脉血管畸形；烧伤；使用抑制剂的血友病患者中的防护；非硬化和硬化患者的部分肝切除术；获得性血友病；特发性血小板减少性紫癜；血小板介导的止血中的缺陷(例如血小板数目或应答中的缺陷)；格兰茨曼血小板机能不全(Glanzmann’sThrombasthenia)；对血小板输注难治性的格兰茨曼血小板机能不全；巨血小板综合征(Bernard-SoulierSyndrome)；和登革出血热。

提供以下实施例以例示但不限制所要求保护的实施方案。应理解本文中描述的例子和实施方案仅用于例示性目的，且本领域技术人员将认可可以改变多种参数而不背离本公开的精神或所附权利要求的范围。

实施例

实施例1：凝血酶切割位点和活化环的诱变

凝血酶切割位点诱变

通过标准定点诱变生成携带在凝血酶切割位点内位置处的氨基酸取代的多种FVIII变体的表达构建体，其使用QuickChange定点诱变试剂盒(AgilentTechnologiescat.#200251)和使用FVIII-BDD作为起始多肽。构建体初始在pcDNA3.1载体中创建。在诱变后，使用适宜的限制酶将编码变体因子VIII的核酸序列从pcDNA3.1切出并连接到pSS207表达载体中。将所得质粒瞬时转染到在基于96孔形式中的HEK293细胞中。通过标准夹心ELISA对FVIII表达水平定量。

活化环诱变

使用FVIII-BDD作为起始多肽和上文描述的标准诱变技术，生成分别随机化氨基酸位置558-65的基因文库。将8个文库的克隆DNA制备物瞬时转染到HEK293细胞中。通过标准夹心ELISA对FVIII表达水平定量，如上文描述的。

纳入另外突变

除了产生在凝血酶切割位点和活化环内的取代外，还进行沿因子VIII多肽链的其他位置处的特定取代以研究这类另外突变的影响。在一种情况中，对含有编码具有I371P,V374F,V559L,R562W和Q565E取代的D519VE665V-FVIII多肽的核酸的pcDNA3.1载体进一步进行定点诱变，如上文描述的，以产生R336I取代。然后将所得核酸转移到表达载体pSS207。

感兴趣突变的组合

在创建不同的变体集后，组合感兴趣的突变且使用基本相同的方案以多种排列(permutation)表征。总体生成大约2000种FVIII变体并表征。

因子VIII活性测定

通过生色和aPTT测定法两者测量FVIII活性。对于纯化的蛋白质，通过CoatestFVIII:C(InstrumentationLaboratory；Bedford,MA)测定生色活性，使用02-122作为校准物(NIBSC；PottersBar,Hertfordshire,UK)。生色测定法原理的详情在上文描述。在ACLTOP上测定纯化的蛋白质的aPTT活性，使用FVIII-BDD作为校准物和APTT-SP试剂盒(InstrumentationLaboratory；Bedford,MA)。一阶段aPTT测定法原理的进一步的细节在上文描述。使用A280计算纯化蛋白质的比活性以测定蛋白浓度。

结果

产生和研究了大量FVIII-BDD的变体，其在凝血酶切割位点内氨基酸370-375的位置处具有氨基酸取代(见表1)。优选的凝血酶切割序列基于使用动力学生荧光底物测定法，凝血酶相比于其他切割特异性线性肽序列的能力(Bianchini等,J.Biol.Chem.277:20527(2002))。令人惊讶地，先前预测为含有“最佳”凝血酶切割位点的一个变体(Bianchini等,J.Biol.Chem.277:20527(2002))显示出较差的aPTT活性(表1中的变体“a”)。部分对应于预测的“最佳”共有序列的其他变体(表1中的变体b和c)展现增强的aPTT活性。不希望以任意方式受理论束缚地，从预测的“最佳”凝血酶切割位点的差异可能部分由于从与较小线性肽序列的凝血酶相互作用外推至与较大三维蛋白质的凝血酶的相互作用的有限能力。但是，“b”和“c”的增强的aPTT活性指示这些FVIII突变体在aPTT条件下，例如有限的激活的凝固因子启动下更有效地激活。

表1

产生和表征了具有在位置558-565处的活化环内氨基酸取代的大约1600种因子VIII变体。使用生色测定法完成了初步筛选，aPTT测定法鉴定出具有增强的促凝血活性的变体。表2列出了产生和表征的某些变体的aPTT活性。

表2

变体	比活性(aPTT，相对于FVIII-BDD的倍数)
		FVIII-BDD	1
R562W	1.7
		R562F	2.0
Q565E	2.0
		R562K	2.8
V559L	3.6

随后，研究了组合活化环内的多个氨基酸取代的影响。表3列出了选择的组合的变体的活性。

表3

变体	比活性(aPTT，相对于FVIII-BDD的倍数)
		FVIII-BDD	1
V559L,R562F	3.2
		V559L,R562W	3.1
V559L,Q565E	4.8
		V559L,R562W,Q565E	7.9
V559L,R562F,Q565E	9.5

最后，表征了在凝血酶切割位点和活化环两者处的变体的组合。许多所得变体显示仅适度的活性增加，如通过生色测定法评估的(图2)，但当通过aPTT测定表征时显示大量活性增加(图1)。生色测定法活性中的适度改变相对于显著增强的aPTT活性可能与这些FVIII变体的激活优势一致，因为FVIII在生色测定法而非aPTT测定法中完全被预激活。

实施例2：Var97的进一步表征

进一步表征了另一种特定变体称为Var97，其使用D519VE665V-FVIII作为起始多肽且拥有I371P,V374F,V559L,R562W和Q565E氨基酸取代。将该选择的变体首先克隆到pSS207表达载体中并转染到HKB11细胞中以获得细胞的稳定表达池(pool)以用于接种10Lwave发酵罐。获得纯化的Var97对比并如下文描述的在体外和体内两者中表征。

在初始研究中，发现纯化的Var97蛋白与其相对于起始因子VIII多肽的生色测定活性相比，具有显著增强的aPTT活性。这两种测定法的比活性的比率指示变体Var97蛋白的aPTT活性对生色测定活性的程度为FVIII-BDD活性的约30倍(表4)。

表4

通过TGA使用组织因子(TF)作为引发剂进一步评估Var97在凝固中的效力。TGA按照制造商推荐的实施(DiagnosticaStago；AsnièressurSeine,France)。简言之，将FVIII(BDD、D519VE665V或变体)添加到具有终浓度1pMTF4μMPL混合物的人血友病A血浆中，如上文所述。反应通过添加凝血酶底物和CaCl₂(Flu-Ca)的混合物启动，并监测60min。本文中报告的TGA结果代表一式三份实验的均值。由于使用低水平的TF，TGA可能更密切地反映生理凝固。通过TGA，Var97清楚地比FVIII-BDD或D519VE665V-FVIII蛋白更有效力，相对于那些亲本分子引发凝血酶生成中的非常快速的增加(图3)。Var97与其亲本D519VE665V-FVIII之间的凝血酶概况的比较清楚显示了另外的突变通过增加凝血酶激活的容易性(更短的延迟)和增强的FXa生成(凝血酶生成的更快的发生速率和更大范围)的贡献。

尽管其对于引发凝血酶应答的增强的能力，总体Var97凝血酶概况从定性而言非常类似于FVIII-BDD和D519VE665V-FVIII，其中返回基线凝血酶水平的速率与峰值凝血酶水平相关(图3)。这表明Var97未改变调节血浆中凝血酶水平的机制。这些结果预测Var97可能不引起高于FVIII-BDD或D519VE665V-FVIII蛋白的额外的血栓形成风险或系统性凝血风险。

相对于测试的其他FVIII分子的Var97效力的定量比较指示促凝血测定(TGA和aPTT)结果之间的一致性。引发限定量的峰值凝血酶所需的Var97的浓度的比较指示Var97比其亲本D519VE665V-FVIII的效力大～10倍，且比FVIII-BDD的效力大～100倍(图4)。通过aPTT的类似评估指示需要少～10倍的Var97来引发与D519VE665V-FVIII相同的凝固时间(图5)。

使用FXase动力学测定法检查Var97变体在其生理学酶复合物中的功能。这些FXase动力学测定法在10mMHEPESpH7.4,150mMNaCl,5mMCaCl2,0.01％Tween20,0.01％BSA和10μMPL(40:40:20,v/v/vPS:PC:PE)中实施。在这些FXase动力学测定法中，通过与20nM凝血酶温育生成纯化的FVIIIa蛋白。将FVIII水平保持固定于10pM并与各种浓度的FIXa(0-10nM)反应，或将FIXa水平保持固定于(100pM)并改变凝血酶激活的FVIIIa的水平(0-10nM)。将FX(150nM)添加到任一类型的反应，且在1min后通过添加EDTA停止FXase反应。使用S-2765生色底物测量这些反应中生成的FXa的量。然后将FXa生成从标准曲线外推，该标准曲线将FXa水平与生色底物切割的速率关联。将数据拟合于标准Michaelis-Menten等式以推导动力学常数。绘出该数据以显示FXa活性生成如何随FIXa浓度而变化。该分析的结果显示于表5和图6。如表5显示的，Var97变体相比于wt-FVIII或FVIII-BDD多肽具有增强的FX激活速率。另外，图6例示了Var97变体显示对FIXa的增加的结合亲和力。实际上，Var97显示比FVIII-BDD多肽大至少4倍的对于FIXa的结合亲和力。

表5：

可以分析凝固溶液随时间过程的浊度以研究凝固动力学和所得凝块的结构。之前已显示凝固期间的浊度变化相对于时间概况可通过降低相比于生理水平的凝固因子的浓度来诱导，且进一步地浊度概况中的这类变化与凝块的血纤蛋白结构中的变化相关。参见例如Weisel和Nagsawami,Biophys.J.,63:111-28(1992)。如Weisel和Nagsawami描述的实施浊度分析，其使用正常血浆、FVIII缺陷性血浆或含有50mU/mL的多种因子VIII变体的FVIII缺陷性血浆。如图7中显示的，向FVIII缺陷性血浆引入50mU/mLBDD或D519VE665V产生的浊度概况(吸光度单位[AU]对时间[sec])不同于正常血清的；这两种变体中浊度的升高远不及在正常血清样品中观察到的那么快速。除了指示BDD和D519VE665V的凝固动力学没有正常血清中那么快以外，这还表明50mU/mL的BDD或D519VE665V变体的存在可能产生与正常凝固期间产生的不同的凝块结构和体系。相比之下，引入50mU/mLVar97因子VIII变体产生的浊度概况与正常血清样品的相当类似，表明与正常凝固的密切类似的凝固动力学和凝块结构。

作为对Var97变体的进一步表征，实施研究以比较BDD和Var97在HemA小鼠中保护免于血管损伤的死亡的能力。对HemA小鼠施用不同浓度的多种FVIII且在24小时后，如描述的横切HemA小鼠的尾静脉(Mei等,Blood(2010)116:270-279.)。监测HemA小鼠存活24小时并将FVIII变体功效评估为24小时存活。然后，将施用的多种剂量的存活率绘图(以μg/kg和IU/kg两者)并从图中确定产生50％存活(ED50)需要的BDD和Var97的剂量(图8和表6)。如其显示的，使用Var97在比用BDD低～2-3倍的剂量实现了50％存活率。这与本文中论述的其他测试的结果较好地关联，表明Var97的增强的效力和通过Var97产生的改进的凝块结构。

表6：

	ED50(μg/kg)	ED50(IU/kg)
			Var97	0.33	2.47
BDD	0.96	4.93
			差异	～3倍	～2倍

使用变化的FIXa和固定的FVIIIa的动力学FXase结果(未显示)表明蛋白水解可能引起Var97的不同的aPTT对生色测定活性。为了研究变体因子VIII多肽的切割，使在存在过量FIXa的情况下FXase反应中的FVIII物理变化可视化。为了检测存在于FXase的通过FIXa的FVIIIa切割，将检查的因子VIII多肽在标准Xase反应缓冲液中调整为0.1μg/ml终浓度，其中不存在牛血清清蛋白。将FVIII溶液(25μL)添加到5μl的120nMIXa或缓冲液。允许反应物在37℃温育1hr，并添加4Xnupage缓冲液以停止反应。然后对样品进行SDS-PAGE继之以考马斯蓝染色(图9)。该分析证明相对于BDD和D519VE665V变体FVIII之一或两者，Var97因子VIII变体显示由FIXa的增强的蛋白水解切割。

实施例3：Var97-R336I的表征

在示图降低Var97的增强的蛋白水解切割的努力中，在Var97肽链内进行一个额外的取代R336I(Var97-R336I；SEQIDNO:55)。这是在对激活的蛋白C(aPC)的已知切割位点内的取代。如可在图9的SDS-PAGE凝胶图像中看到的，在FIXa消化测定法中，Var97-R336I的蛋白水解切割相比于Var97显著降低。

还通过TGA评估凝固变体中Var97-R336I变体的效力，其使用组织因子(TF)作为引发剂，如上文描述的。通过TGA，Var97-R336I比BDD效力更高，尽管比Var97和D519VE665V效力稍低(图10)。另外，总体Var97-R336I凝血酶概况再次定性上非常类似于BDD,D519VE665V和Var97，其中返回基线凝血酶水平的速率与峰值凝血酶水平关联(图10)。引发限定量的峰值凝血酶所需的BDD,D519VE665V,Var97和Var97-R336I因子VIII变体的浓度的定量比较表明，Var97-R336I与D519VE665V-FVIII具有类似的效力(图11)。

为了进一步表征Var97-R336I变体，将该变体的浊度概况与其他变体，以及正常血清对照比较，如上文描述的。如图7中显示的，Var97-R336I变体的浊度概况密切类似于BDD和D519VE665V变体的浊度概况，表明相似的凝固动力学和凝块结构。

本文中描述的变体多肽，包括Var97在内，具有针对多种临床适应证的应用。对于血友病A，这类具有快速和增强的凝血酶应答概况的分子可极性或防护性使用，通过iv或sc路径施用。这些变体还可以用于治疗其他出血病症，不管是来自血小板或凝固缺陷的。在血小板介导的出血中缺陷的情况中(由于血小板数目或应答不足)，这些变体生成凝血酶的增强的能力可进行潜在地弥补，其通过增强血小板活性或通过提供更多的血纤蛋白“胶”来支持有效出血所需的血小板栓。

除了血友病和其他出血病症外，这些变体引发这类快速凝血酶应答的能力指示了在更急性情况中的可能效用，如创伤和手术。在这些背景中，这些变体能支持凝血酶应答的快速性和稳健性，对于调节凝血酶水平的机制的最小影响，可能是优势所在。在那些背景中，这些变体可以以多种方式施用，包括iv,sc和局部，以喷雾或浸泡在基质中的形式，如外科海绵或胶原。这些变体可能具有效用的其他适应证包括治疗出血综合征，如登革出血热，其中大量血管通透性、受损的血小板功能、和增强的血纤蛋白溶解可能导致致命的内出血。

Claims (30)

1.一种因子VIII多肽的变体，其中所述因子VIII多肽是包含氨基酸位置370-375处的凝血酶切割位点和氨基酸位置558-565处的活化环的功能性因子VIII，其中所述氨基酸位置编号依照SEQIDNO:1中列出的氨基酸序列；且其中所述变体包含在所述凝血酶切割位点内一个或多个残基处的氨基酸取代和在所述活化环内一个或多个残基处的氨基酸取代。

2.权利要求1的变体，其中所述凝血酶切割位点内的所述取代不包括在氨基酸位置372处的取代。

3.权利要求1或2的变体，其中所述因子VIII多肽还包含包括氨基酸残基E272和D519的A1-A2域界面和包括氨基酸残基E665和E1984的A2-A3域界面，其中所述氨基酸位置编号依照SEQIDNO:1中列出的氨基酸序列；且其中所述变体还包含在所述A1-A2域界面的一个或多个氨基酸残基处的取代和在所述A2-A3域界面的一个或多个氨基酸残基处的取代。

4.权利要求1-3中任一项的变体，其中所述凝血酶切割位点内的所述取代包含在选自下组的一个或多个位置处的取代：370、371和374。

5.权利要求1-3中任一项的变体，其中所述凝血酶切割位点内的所述取代包含在选自下组的两个或更多个位置处的取代：370、371和374。

6.权利要求1-5中任一项的变体，其中所述活化环内的所述取代包含在选自下组的一个或多个位置处的取代：559、562和565。

7.权利要求1-5中任一项的变体，其中所述活化环内的所述取代包含在选自下组的两个或多个位置处的取代：559、562和565。

8.权利要求3-7中任一项的变体，其中对所述A1-A2域界面的所述取代包含选自下组的一个或多个取代：E272A、E272V、D519A和D519V。

9.权利要求3-8中任一项的变体，其中对所述A2-A3域界面的所述取代包含选自下组的一个或多个取代：E665A、E665V、E1984A和E1984V。

10.权利要求3-7中任一项的变体，其中对所述A1-A2域界面的所述取代包含D519V且其中对所述A2-A3域界面的所述取代包含E665V。

11.权利要求1-10中任一项的变体，其中所述变体包含在选自由370、371和374组成的组的一个或多个位置处的氨基酸取代和在选自由559、562和565组成的组的一个或多个位置处的氨基酸取代。

12.权利要求1-10中任一项的变体，其中所述变体包含在选自由370、371和374组成的组的两个或更多个位置处的氨基酸取代和在选自由559、562和565组成的组的两个或更多个位置处的氨基酸取代。

13.权利要求1-12中任一项的变体，其中所述氨基酸取代选自下组：Q370M，I371P，V374F，V559L，R562W，R562F，R562K和Q565E。

14.权利要求1-12中任一项的变体，其中所述变体包含在所述凝血酶切割位点内的氨基酸取代，其选自下组：

(i)Q370M和I371P，和

(ii)I371P和V374F；

且包含在所述活化环内的氨基酸取代，其选自下组：

(i)V559L和R562F，

(ii)V559L和R562W，

(iii)V559L和Q565E，

(iv)V559L，R562W和Q565E，和

(v)V559L，R562F和Q565E。

15.权利要求1-10中任一项的变体，其中所述变体包含氨基酸取代I371P，V374F，V559L，R562W和Q565E。

16.权利要求1-10中任一项的变体，其中所述变体包含氨基酸取代I371P，V374F，V559L，R562W，Q565E，D519V和E665V。

17.权利要求1-16中任一项的变体，其中所述变体还包含在氨基酸位置336处的氨基酸取代。

18.权利要求17的变体，其中所述在氨基酸位置336处的氨基酸取代包括R336I取代。

19.权利要求1-18中任一项的变体，其中所述因子VIII多肽包含与SEQIDNO:1，2，或3的序列至少90％相同的氨基酸序列。

20.权利要求1的变体，其中所述因子VIII多肽包含SEQIDNO:53的氨基酸序列。

21.权利要求1-20中任一项的变体，其中所述变体相比于未经修饰的因子VIII多肽具有增加的比活性。

22.一种药物组合物，其包含权利要求1-21中任一项的变体因子VIII多肽和药学可接受的赋形剂。

23.一种分离的核酸，其编码权利要求1-21中任一项的变体因子VIII多肽。

24.包含权利要求23的核酸序列的载体。

25.权利要求24的载体，其中所述载体是表达载体。

26.一种重组宿主细胞，其包含权利要求23的分离的核酸或权利要求24或25的载体。

27.一种产生变体因子VIII多肽的方法，所述方法包括(a)在适宜所述变体因子VIII多肽表达的条件下培养权利要求26的重组宿主细胞，和(b)分离所述变体。

28.一种用于预防或治疗出血病症的方法，包括对受试者施用有效量的权利要求1-21中任一项的变体因子VIII多肽或权利要求22的药物组合物。

29.权利要求28的方法，其中所述出血病症是慢性出血病症。

30.权利要求29的方法，其中所述出血病症是急性出血事件。