ES2680942T3 - Variante de polipéptidos del factor VIII y procedimientos para su producción y utilización - Google Patents

Abstract

Una variante de un polipéptido del factor VIII, en la que dicha variante es un factor VIII funcional que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53.

Description

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DESCRIPCION

Variante de polipéptidos del factor VIII y procedimientos para su producción y utilización Campo de la divulgación

En el presente documento se proporcionan variantes del factor VIII de coagulación humano y los polinucleótidos que codifican dichas variantes, vectores y células hospedadoras que comprenden y expresan dichas variantes, procedimientos para obtener dichas variantes, procedimientos para utilizar dichas variantes, composiciones de las variantes y características inventivas adicionales relacionadas con las mismas.

Antecedentes

La coagulación sanguínea es un proceso que consiste en complejas interacciones entre diversos componentes sanguíneos (o factores) que, en última instancia, dan lugar a un coágulo de fibrina. Generalmente, los componentes sanguíneos que participan en lo que frecuentemente se denomina la "cascada" de coagulación son proteínas enzimáticamente inactivas (proenzimas o zimógenos) que se convierten en enzimas proteolíticas mediante la acción de un activador, que, a menudo, es un factor de coagulación activado. Un péptido que es crítico en la cascada de coagulación es el factor VIII o FVIII. De hecho, la hemofilia A, que es el trastorno de coagulación hereditario más común, es causada por deficiencia o defectos estructurales en el factor VIII. La bioquímica del factor VIII permite una activación o desactivación rápida de la coagulación. Circula como un cofactor inactivo que se activa a FVIIIa mediante trombina, la penúltima enzima de la cascada de coagulación. El FVIIIa participa en un complejo enzimático de vida corta (FXasa) con el FIXa, una membrana o superficie fosfolipídica (PL) y Ca+2 para convertir el FX en el FXa. La principal función del FVIIIa como participante en el complejo FXasa es amplificar notablemente FXa, que, luego, permite la generación de trombina. El factor VIII se codifica mediante un gen de ~186 kb que consiste en 26 exones (Thompson, Seminars in Trombosis and Hemostasia, 29:11-22 (2003) (referencias 11 y 16-18)). La traducción del ARNm de este gen, seguida de la eliminación de una secuencia señal de 19 aminoácidos, da lugar a una proteína madura de 2332 aminoácidos. La proteína consiste en 6 dominios principales, que, desde el extremo amino, son: A1, A2, B, A3, C1 y C2. Las regiones ácidas cortas adicionales a1, a2 y a3, que están involucradas en la activación, están intercaladas entre los dominios A1 y A2, A2 y B y B y A3, respectivamente. El producto de la traducción primaria de los 2332 aminoácidos se procesa en un heterodímero que consiste en una cadena pesada heterogénea, que contiene los dominios A1,a1 A2,a2 intactos y diversas longitudes del dominio B y un cadena ligera homogénea de 80 kD, que contiene los dominios a3, A3, C1 y C2. La heterogeneidad del dominio B resulta de la proteólisis durante la secreción.

La activación del factor VIII al factor VIIIa se produce, normalmente, a través de proteólisis del procofactor mediante trombina. La trombina reconoce diversas regiones de aminoácidos que definen sitios de escisión de trombina a lo largo de la cadena peptídica del factor VIII. El factor VIII tiene tres sitios de escisión de trombina. El examen de otros sustratos de trombina revela una diversidad de restos que se pueden acomodar mediante trombina. Aunque los aminoácidos dentro de estos sitios de escisión de trombina pueden variar hasta cierto punto, ciertos aminoácidos son mucho más comunes dentro de estos sitios de escisión que otros y ciertos restos de aminoácido dan como resultado una escisión más eficaz del péptido mediante trombina. (Véase, por ejemplo, Newell-Caito y col., "P3-P3' Residues flanking Scissile Bonds in Factor VIII Modulate Rates of Substrate Cleavage and Profactor Activation by Thrombin," Biochemistry 51: 3451-59 (2012); Gallwitz y col., "The Extended Cleavage Specificity of Human Thrombin," PLoS ONE 7:e31756 (2012)). Uno de los tres sitios de escisión de la trombina en el factor VIII se encuentra en o cerca de la unión a1-A2, que está en o cerca de las posiciones de aminoácido 370-375 del péptido maduro del factor VIII humano de tipo silvestre.

Después de la escisión, el factor VIIIa activo es un heterotrímero compuesto por la subunidad A1, la subunidad A2 y la subunidad A3C1C2. Este heterotrímero se mantiene por interacciones electrostáticas e hidrófobas entre las subunidades en las regiones en las que interactúan entre sí, denominadas "interfaces de dominio". Se sabe que el heterotrímero incluye al menos las interfaces de dominio A1-A2 y A2-A3. (Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 8.338.571 (presentada el 25 de julio de 2008) (concedida el 25 de diciembre de 2012)).

El factor VIII humano se ha producido de manera recombinante como una molécula de cadena sencilla de aproximadamente 300 kD. El producto precursor se procesa en dos cadenas polipeptídicas de 200 kD (pesada) y 80 kD (sencilla) en el aparato de Golgi, con las dos cadenas unidas mediante iones metálicos (Kaufman y col., J. Biol. Chem. 263:6352 (1988); Andersson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 83:2979 (1986)). El dominio B del FVIII parece ser prescindible, ya que el FVIII con dominio B delecionado (FVIII-BDD; cadena pesada A1-A2 de 90 kD más cadena sencilla de 80 kD) también ha demostrado ser eficaz como terapia de reemplazo para la hemofilia A. Una secuencia bien conocida del factor VIII con dominio B delecionado denominada "BDD-SQ" o simplemente "BDD" contiene una deleción de todos menos 14 aminoácidos del dominio B.

El tratamiento de la hemofilia A implica actualmente administración intravenosa (iv) del factor VIII a demanda o como terapia profiláctica. A pesar de su gran tamaño de más de 300 kD para la proteína de longitud completa, el factor VIII tiene una semivida en humanos de solo aproximadamente 11 horas. (Ewenstein y col., Semin. Hematol. 41:1-16 (2004)). Como tal, el factor VIII debe administrarse con relativa frecuencia para el tratamiento profiláctico de trastornos de coagulación. El factor VIII se administra, normalmente, dos o tres veces a la semana con dosificación

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basada en la actividad del factor VIII. Esta necesidad de inyecciones iv frecuentes crea enormes barreras al cumplimiento del paciente. Sería más conveniente para los pacientes si se pudiera desarrollar un producto del factor VIII que requiriera una administración menos frecuente. Además, la reducción del número de dosificaciones requeridas también reduciría el coste del tratamiento. Además, incluso con estas administraciones frecuentes, debido a su corta semivida, los pacientes sometidos a terapia de reemplazo del factor VIII a menudo logran grandes oscilaciones en los niveles plasmáticos de la actividad del factor VIII, potencialmente poniéndolos en riesgo de trombosis (en niveles máximos) y hemorragia (en niveles mínimos).

Además, una vía alternativa de administración no iv, tal como administración subcutánea (sc), podría aumentar la facilidad de tratamiento y disminuir los riegos potenciales de trombosis y hemorragia manteniendo los niveles plasmáticos del factor VIII en un nivel más constante. Un desafío del suministro sc es aumentar la biodisponibilidad del factor VIII administrado. Un péptido del factor VIII con actividad mejorada podría ser útil para mejorar la biodisponibilidad y, por lo tanto, podría ser útil en el suministro sc del factor VIII. Debido a su mayor actividad específica, dicho péptido del factor VIII podría permitir una disminución en el volumen necesario para la administración, ya que la concentración de actividad del fármaco es mayor. Un volumen de inyección reducido podría disminuir la incomodidad del paciente. Además, la reducción en el volumen también se traduciría en una reducción del coste de los bienes. Finalmente, una molécula del factor VIII con actividad mejorada también podría conferir protección adicional por encima de la del factor VIII de tipo silvestre, mediante la prolongación de la duración de la actividad del cofactor si la dosificación es por masa en lugar de por actividad. Como ejemplo, con igual dosificación de masa, las variantes del FVIII con actividad mejorada con mejora de la actividad específica de 2 veces ofrecerían la misma protección en el nivel de 0,5 % que la protección proporcionada en el nivel de 1 % para el FVIII de tipo silvestre, ampliando así el intervalo entre las dosis del factor VIII.

Se han producido numerosas variantes del factor VIII en un intento de abordar uno o más inconvenientes de la terapia médica actual o su suministro. Por ejemplo, el documento WO1990005530 describe proteínas del FVIII activadoras de coagulante o procoagulante híbrido, en las que se reemplazan partes de uno o más dominios del FVIII por el dominio correspondiente del FV (véase también Kane y col., Blood, 1988; 71(3):539-555) y que permiten la expresión a niveles mayores que los obtenidos normalmente con el FVIII de tipo silvestre. La patente de Estados Unidos n.° 8.338.571 describe un factor VIII recombinante que incluye una o más mutaciones que dan como resultado una estabilidad mejorada del factor VIII y del factor VIIIa. De forma similar, la publicación de patente de Estados Unidos n.° 2012/0190623 describe muteínas del factor VIII que son resistentes a inactivación, incluyendo muteínas "en las que los sitios de escisión de APC, Arg336 y Ile562, están mutados". La publicación de patente de Estados Unidos n.° 2011/0124565 se refiere a secuencias de ácidos nucleicos modificadas que codifican para factores de coagulación, en particular el factor VIII humano y sus derivados con estabilidad mejorada, incluyendo un péptido del factor VIII con una modificación que, según se informa, previene la escisión de trombina entre el dominio A1 y A2 del FVIII. Otros esfuerzos han producido, por ejemplo, polipéptidos del factor VIII modificados que, según se informa, han aumentado las semividas circulantes debido a la introducción de mutaciones que permiten PEGilación del péptido (Mei y col., Blood 116:270-279 (2010)) y polipéptidos del factor VIII modificados que, según se informa, poseen estabilidad aumentada debido a mutaciones en los aminoácidos que forman las interfaces de dominio del heterotrímero del FVIIIa activo (Wakabayashi y col., J. Thromb. Haemost. 7:438-444 (2009)).

Debido a los motivos indicados anteriormente, existe una necesidad de variantes del factor VIII mejoradas, por ejemplo, una variante que posea actividad aumentada y/o una variante que no necesite administrarse frecuentemente y/o a una dosis tan alta. Además, es deseable que dicha proteína se produzca como un producto homogéneo de una forma coherente.

Breve sumario

La presente divulgación se refiere a una variante de un polipéptido del factor VIII que es un factor VIII funcional, comprendiendo el polipéptido del factor VIII un sitio de escisión de trombina en las posiciones de aminoácido 370375 y un bucle de activación en las posiciones de aminoácido 558-565, en la que estos números de posiciones de aminoácido se refieren a la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 1; y en la que la variante comprende una sustitución de aminoácido en uno o más restos dentro del sitio de escisión de trombina y una sustitución de aminoácido en uno o más restos dentro del bucle de activación. En una realización, la variante es un factor VIII funcional que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53 como se desvela en las reivindicaciones.

En ciertos ejemplos, la sustitución dentro del sitio de escisión de trombina de la variante de polipéptido del factor VIII no incluye una sustitución en la posición de aminoácido 372. En otros ejemplos, la sustitución dentro del sitio de escisión de trombina comprende un sustitución en uno o más de las posiciones 370, 371 o 374, mientras que en otros ejemplos la sustitución dentro del sitio de escisión de trombina comprende una sustitución en dos o más de las posiciones 370, 371 o 374.

En ejemplos adicionales, la sustitución dentro del bucle de activación comprende una sustitución en una o más de las posiciones 559, 562 y 565, mientras que en otros ejemplos, la sustitución dentro del bucle de activación comprende una sustitución en dos o más de las posiciones 559, 562 y 565.

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En otros ejemplos, la variante de polipéptido del factor VIII además comprende una interfaz de dominio A1-A2 que comprende restos de aminoácido E272 y D519 y una interfaz de dominio A2-A3 que comprende restos de aminoácido E665 y E1984, en la que estos números de posiciones de aminoácido se refieren a la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 1; y la variante además comprende una sustitución en uno o más restos de aminoácido de la interfaz de dominio A1-A2 y una sustitución en uno o más restos de aminoácido de la interfaz de dominio A2-A3. En ejemplos adicionales, la sustitución de la interfaz de dominio A1-A2 comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en E272A, E272V, D519A y D519V. En otros ejemplos, la sustitución de la interfaz de dominio A2-A3 comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en E665A, E665V, E1984A y E1984V. En otros ejemplos adicionales, la sustitución de la interfaz de dominio A1-A2 comprende D519V y la sustitución de la interfaz de dominio A2-A3 comprende E665V.

En ejemplos particulares, la variante de polipéptido del factor VIII comprende una sustitución de aminoácido en una o más de las posiciones 370, 371 y 374 y una sustitución de aminoácido en una o más de las posiciones 559, 562 y 565. En otros ejemplos, la variante comprende una sustitución de aminoácido en dos o más de las posiciones 370, 371 y 374 y una sustitución de aminoácido en dos o más de las posiciones 559, 562 y 565. En otros ejemplos adicionales, la variante comprende sustituciones de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste en: Q370M, I371P, V374F, V559L, R562W, R562F, R562K y Q565E. En ejemplos adicionales, la variante comprende sustituciones de aminoácido dentro del sitio de escisión de trombina seleccionadas del grupo que consiste en: (i) Q370M y I371P, y (ii) I371P y V374F. En ejemplos adicionales, la variante comprende sustituciones de aminoácido dentro del bucle de activación seleccionadas del grupo que consiste en: (i) V559L y R562F, (ii) V559L y R562W, (iii) V559L y Q565E, (iv) V559L, R562W y Q565E, y (v) V559L, R562F y Q565E.

En ciertos ejemplos particulares, la variante comprende las sustituciones de aminoácido I371P, V374F, V559L, R562W y Q565E. En otros ejemplos particulares, la variante comprende las sustituciones de aminoácido I371P, V374F, V559L, R562W, Q565E, D519V y E665V. En otros ejemplos adicionales, la variante comprende además una sustitución de aminoácido en la posición de aminoácido 336. En ciertos ejemplos, la sustitución de aminoácido en la posición de aminoácido 336 comprende una sustitución R336I.

En ciertos ejemplos, la variante de polipéptido del factor VIII comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 1, 2 o 3. En otros ejemplos, la variante de polipéptido del factor VIII comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53.

En ciertos ejemplos, la variante de polipéptido del factor VIII ha aumentado la actividad específica en comparación con el polipéptido del factor VIII no modificado.

En una realización adicional, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende una variante de polipéptido del factor VIII como se describe en el presente documento y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En otra realización, la presente divulgación se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica una variante de polipéptido del factor VIII como se describe en el presente documento.

En una realización adicional, la presente divulgación se refiere a un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una variante de polipéptido del factor VIII como se desvela en las reivindicaciones. En ciertos ejemplos, el vector es un vector de expresión.

En otra realización más, la presente divulgación se refiere a una célula hospedadora recombinante que comprende un vector o ácido nucleico aislado como se desvela en las reivindicaciones.

En todavía otra realización, la presente divulgación se refiere a un procedimiento para prevenir o tratar un trastorno hemorrágico que comprende administrar a un sujeto una cantidad eficaz de una variante de polipéptido del factor VIII o la composición farmacéutica como se desvela en las reivindicaciones. En ciertos ejemplos, el trastorno hemorrágico es un trastorno hemorrágico crónico. En otros ejemplos, el trastorno hemorrágico es un episodio hemorrágico agudo.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 presenta las actividades específicas de aPTT de diversos polipéptidos y variantes del factor VIII, presentados como factor de actividad sobre el factor VIII de tipo silvestre. Las designaciones tienen los siguientes significados: "A" indica que el polipéptido poseía sustituciones de aminoácidos I371P y V374F en el sitio de escisión de trombina; "B" indica que el polipéptido poseía sustituciones de aminoácidos V559L, R562W y Q565E en el sitio de activación; y "C" indica que el polipéptido poseía sustituciones de aminoácidos D519V y E665V. Todas las designaciones de posición de aminoácidos se basan en números de posición en wt-FVIII (SEQ ID NO: 1).

La FIG. 2 presenta actividades específicas de diversos polipéptidos y variantes del factor VIII, presentadas como factor de actividad sobre el factor VIII de tipo silvestre, según se determina mediante un ensayo cromogénico. Las designaciones tienen los mismos significados que para la FIG. 1.

La FIG. 3 presenta perfiles de generación de trombina para FVIII-BDD (SEQ ID NO: 3), D519VE665V-FVIII (SEQ

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La FIG. 4 presenta datos que demuestran la concentración de diversos polipéptidos y variantes del factor VIII necesaria para obtener una cantidad definida de trombina máxima. Los polipéptidos del factor VIII investigados son FVIII-BDD (SEQ ID NO: 3), D519VE665V-FVIII (SEQ ID NO: 5), una modificación FVIII-BDD con sustituciones de aminoácidos D519V y E665V y Var97, una variante de D519VE665V-FVIII que poseía las siguientes sustituciones de aminoácidos: I371P, V374F, V559L, R562W y Q565E (SEQ ID NO: 53).

La FIG. 5 presenta perfiles cinéticos de las tasas de formación de coágulos para FVIII-BDD (SEQ ID NO: 3), D519VE665V-FVIII (SEQ ID NO: 5) y Var97, una variante de D519VE665V-FVIII que poseía las siguientes sustituciones de aminoácidos adicionales: I371P, V374F, V559L, R562W y Q565E (SeQ ID NO: 53). La actividad aproximadamente 10 veces mayor de Var97 relacionada con BDD y D519VE665V es evidente en el tiempo necesario para lograr la tasa máxima de formación de coágulos.

La FIG. 6 presenta resultados de afinidad de unión para FVIII-BDD (SEQ ID NO: 3), D519VE665V-FVIII (SEQ ID NO: 5) y Var97, una variante de D519VE665V-FVIII que poseía las siguientes sustituciones de aminoácidos adicionales: I371P, V374F, V559L, R562W y Q565E (SEQ ID NO: 53).

La FIG. 7 presenta perfiles de turbidez (unidades de absorbancia frente a tiempo) para la formación de coágulos utilizando plasma normal, plasma deficiente en FVIII o plasma deficiente en FVIII que contiene 50 mU/ml (5 %) de una de las siguientes variantes del FVIII: FVIII-BDD, D519VE665V-FVIII, Var97 o Var97-R336I.

La FIG. 8 presenta gráficos de supervivencia de 24 horas (%) de ratones HemA después de una lesión vascular después de la administración de diversas dosificaciones, medidas mediante masa (panel izquierdo) o unidades (panel derecho), de FVIII-BDD (círculos grises) o Var97 (triángulos negros).

La FIG. 9 presenta una imagen de un gel SDS-PAGE de variantes de polipéptido del factor VIII a partir de una reacción FXasa en presencia (+) o ausencia (-) de exceso de FIXa. Los polipéptidos del FVIII investigado son FVIII-BDD (carriles 2 y 3), D519VE665V-FVIII (carriles 4 y 5), Var97 (carriles 6 y 7) y Var97-R336I (carriles 8 y 9), con un marcador de masa en el carril 1.

La FIG. 10 presenta perfiles de generación de trombina para FVIII-BDD (SEQ ID NO: 3), D519VE665V-FVIII (SEQ ID NO: 5), Var97 (SEQ ID NO: 53) y Var97-R336I (SEQ ID NO: 55).

La FIG. 11 presenta datos que demuestran la concentración de diversos polipéptidos y variantes del factor VIII necesaria para obtener una cantidad definida de trombina máxima. Los polipéptidos del factor VIII investigados son FVIII-BDD (SEQ ID NO: 3), D519VE665V-FVIII (SEQ ID NO: 5), Var97 (SEQ ID NO: 53) y Var97-R336I (SEQ ID NO: 55).

Breve descripción de las secuencias

La SEQ ID NO: 1 comprende una secuencia polipeptídica del factor VIII humano de tipo silvestre. Este polipéptido se denomina, normalmente, en el presente documento "factor VIII de tipo silvestre", "wt-FVIII," o simplemente "factor VIII" o "FVIII".

La SEQ ID NO: 2 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 1.

La SEQ ID NO: 3 comprende una forma modificada de la secuencia polipeptídica del wt-FVIII de SEQ ID NO: 1 que tiene una deleción en el dominio B. Esta es una deleción casi completa del dominio B con solo 14 aminoácidos del dominio B restante. Este polipéptido se denomina, normalmente, en el presente documento "factor VIII con dominio B delecionado", "factor ViII BDD", o "FVIII-BDD".

La SEQ ID NO: 4 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 3.

La SEQ ID NO: 5 comprende una forma modificada del FVIII-BDD de SEQ ID NO: 3 que contiene dos sustituciones de aminoácidos: D519V y E665V. Este polipéptido se denomina, normalmente, en el presente documento "D519VE665V factor VIII" o "D519VE665V-FVIII".

La SEQ ID NO: 6 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 5.

La SEQ ID NO: 7 es una variante del wt-FVIII de SEQ ID NO: 1 que contiene las siguientes sustituciones de aminoácidos: Q370M y I371P.

La SEQ ID NO: 8 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 7.

La SEQ ID NO: 9 es una variante del FVIII-BDD de SEQ ID NO: 3 que contiene las siguientes sustituciones de aminoácidos: Q370M y I371P.

La SEQ ID NO: 10 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 9.

La SEQ ID NO: 11 es una variante del D519VE665V-FVIII de SEQ ID NO: 5 que contiene las siguientes sustituciones de aminoácidos adicionales: Q370M y I371P.

La SEQ ID NO: 12 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 11. La SEQ ID NO: 13 es una variante del wt-FVIII de SEQ ID NO: 1 que contiene las siguientes sustituciones de aminoácidos: l371P y V374F.

La SEQ ID NO: 14 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 13. La SEQ ID NO: 15 es una variante del FVIII-BDD de SEQ ID NO: 3 que contiene las siguientes sustituciones de aminoácidos: I371P y V374F.

La SEQ ID NO: 16 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 15. La SEQ ID NO: 17 es una variante del D519VE665V-FVIII de SEQ ID NO: 5 que contiene las siguientes sustituciones de aminoácidos adicionales: l371P y V374F.

La SEQ ID NO: 18 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 17. La SEQ ID NO: 19 es una variante del wt-FVIII de SEQ ID NO: 1 que contiene las siguientes sustituciones de

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aminoácidos: V559L y R562F.

La SEQ ID NO: 20 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 19. La SEQ ID NO: 21 es una variante del FVIII-BDD de SEQ ID NO: 3 que contiene las siguientes sustituciones de aminoácidos: V559L y R562F.

La SEQ ID NO: 22 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 21. La SEQ ID NO: 23 es una variante del D519VE665V-FVIII de SEQ ID NO: 5 que contiene las siguientes sustituciones de aminoácidos adicionales: V559L y R562F.

La SEQ ID NO: 24 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 23. La SEQ ID NO: 25 es una variante del wt-FVIII de SEQ ID NO: 1 que contiene las siguientes sustituciones de aminoácidos: V559L y R562W.

La SEQ ID NO: 26 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 25. La SEQ ID NO: 27 es una variante del FVIII-BDD de SEQ ID NO: 3 que contiene las siguientes sustituciones de aminoácidos: V559L y R562W.

La SEQ ID NO: 28 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 27. La SEQ ID NO: 29 es una variante del D519VE665V-FVIII de SEQ ID NO: 5 que contiene las siguientes sustituciones de aminoácidos adicionales: V559L y R562W.

La SEQ ID NO: 30 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 29. La SEQ ID NO: 31 es una variante del wt-FVIII de SEQ ID NO: 1 que contiene las siguientes sustituciones de aminoácidos: V559L y Q565E.

La SEQ ID NO: 32 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 31. La SEQ ID NO: 33 es una variante del FVIII-BDD de SEQ ID NO: 3 que contiene las siguientes sustituciones de aminoácidos: V559L y Q565E.

La SEQ ID NO: 34 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 33. La SEQ ID NO: 35 es una variante del D519VE665V-FVIII de SEQ ID NO: 5 que contiene las siguientes sustituciones de aminoácidos adicionales: V559L y Q565E.

La SEQ ID NO: 36 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 35. La SEQ ID NO: 37 es una variante del wt-FVIII de SEQ ID NO: 1 que contiene las siguientes sustituciones de aminoácidos: V559L, R562W y Q565E.

La SEQ ID NO: 38 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 37. La SEQ ID NO: 39 es una variante del FVIII-BDD de SEQ ID NO: 3 que contiene las siguientes sustituciones de aminoácidos: V559L, R562W y Q565E.

La SEQ ID NO: 40 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 39. La SEQ ID NO: 41 es una variante del D519VE665V-FVIII de SEQ ID NO: 5 que contiene las siguientes sustituciones de aminoácidos adicionales: V559L, R562W y Q565E.

La SEQ ID NO: 42 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 41. La SEQ ID NO: 43 es una variante del wt-FVIII de SEQ ID NO: 1 que contiene las siguientes sustituciones de aminoácidos: V559L, R562F y Q565E.

La SEQ ID NO: 44 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 43. La SEQ ID NO: 45 es una variante del FVIII-BDD de SEQ ID NO: 3 que contiene las siguientes sustituciones de aminoácidos: V559L, R562F y Q565E.

La SEQ ID NO: 46 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 45. La SEQ ID NO: 47 es una variante del D519VE665V-FVIII de SEQ ID NO: 5 que contiene las siguientes sustituciones de aminoácidos adicionales: V559L, R562F y Q565E.

La SEQ ID NO: 48 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 47. La SEQ ID NO: 49 es una variante del wt-FVIII de SEQ ID NO: 1 que contiene las siguientes sustituciones de aminoácidos: I371P, V374F, V559L, R562W y Q565E.

La SEQ ID NO: 50 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 49. La SEQ ID NO: 51 es una variante del FVIII-BDD de SEQ ID NO: 3 que contiene las siguientes sustituciones de aminoácidos: I371P, V374F, V559L, R562W y Q565E.

La SEQ ID NO: 52 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 51. La SEQ ID NO: 53 es una variante del D519VE665V-FVIII de SEQ ID NO: 5 que contiene las siguientes sustituciones de aminoácidos adicionales: I371P, V374F, V559L, R562W y Q565E.

La SEQ ID NO: 54 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 53. La SEQ ID NO: 55 es una variante del D519VE665V-FVIII de SEQ ID NO: 5 que contiene las siguientes sustituciones de aminoácidos adicionales: I371P, V374F, V559L, R562W, Q565E y r336I.

La SEQ ID NO: 56 comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido de SEQ ID NO: 55.

Descripción detallada

A menos que defina lo contrario, todos las expresiones técnicas y científicas utilizadas en el presente documento tienen, normalmente, el mismo significado que entiende comúnmente una persona normalmente experta en la materia a la que pertenece la presente divulgación. Generalmente, la nomenclatura utilizada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio en cultivo celular, genética molecular, química orgánica y química de ácidos nucleicos y de hibridación son aquellos bien conocidos y habitualmente utilizados en la materia. Se utilizan técnicas estándar para la síntesis de ácidos nucleicos y polipéptidos. La nomenclatura utilizada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio descritos a continuación son aquellos bien conocidos y comúnmente

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empleados en la materia. Los procedimientos utilizados para ingeniería genética son bien conocidos y se pueden encontrar, por ejemplo, en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Tal como se usa en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, expresiones en singular o la forma singular "a", "una", y "la", por ejemplo, incluyen referencias plurales salvo que el contexto indique claramente otra cosa. De ese modo, por ejemplo, referencia a "polipéptido", "el polipéptido", o "un polipéptido" también incluye a una pluralidad de polipéptidos. Además, tal como se usa en el presente documento, el término "comprende" pretende indicar una lista no exhaustiva de componentes o fases, que indica, así, que la composición o procedimiento dado incluye los componentes o fases enumeradas y puede incluir también componentes o fases adicionales no enumerados específicamente. Como ejemplo, una composición "que comprende un polipéptido" puede incluir también componentes o polipéptidos adicionales. El término "que comprende" también pretende abarcar realizaciones "que consisten esencialmente en" o "que consisten en" los componentes o fases enumeradas. De forma similar, la expresión "que consiste esencialmente en" pretende también abarcar realizaciones "que consisten en" los componentes o fases enumeradas.

Los intervalos numéricos recitados dentro de la presente memoria descriptiva incluyen los números que definen el intervalo (los números del punto final) y también pretenden incluir cada fracción íntegra o no íntegra dentro del intervalo definido.

Se utilizará la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones expuestas a continuación.

Como se usa en el presente documento, "factor VIII con dominio B delecionado" o "FVIII-BDD" se refiere a un polipéptido del factor VIII que contiene una deleción de al menos alguna porción del dominio B. En los ejemplo expuestos en el presente documento, FVIII-BDD se refiere, específicamente, a un deleción de todos menos 14 aminoácidos del dominio B del factor VIII. (Lind y col., Eur. J. Biochem. 232:19-27 (1995)), cuya secuencia polipeptídica se expone en la SEQ ID NO: 3, que se codifica por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4. Sin embargo, aunque esta secuencia de FVIII-BDd particular se empleó en los ejemplos en el presente documento, debe entenderse que también podrían emplearse polipéptidos del factor VIII con modificaciones en comparación con la SEQ ID NO: 3, que incluyen diferencias en la deleción del dominio B. Por ejemplo, un polipéptido del factor VIII con más o menos de 14 aminoácidos del dominio B restante podría también ser útil en algunas realizaciones si se conserva la actividad procoagulante del factor VIII.

Como se usa en el presente documento, el "factor VIII" o "FVIII" se refiere a un factor de coagulación sanguínea que es una glucoproteína sintetizada y liberada en el torrente sanguíneo mediante el hígado. En su forma inmadura, el FVIII contiene una secuencia señal, que se escinde proteolíticamente durante el procedimiento de traducción. Después de la eliminación de esa secuencia señal de 19 aminoácidos, el polipéptido del factor VIII está en su forma madura, en la que el primer aminoácido del producto del FVIII secretado es una alanina. Esta forma madura del factor VIII se denominará en el presente documento "factor VIII maduro". El FVIII humano de tipo silvestre maduro tiene la secuencia de aminoácidos expresada en la SEQ ID NO: 1, aunque son posibles variantes alélicas, como son versiones modificadas, tales como las expresadas en las SEQ ID NOS: 3 y 5.

Como se usa en el presente documento, un "polipéptido del factor VIII funcional" denota un polipéptido o combinación de polipéptidos que es/son capaces, in vivo o in vitro, de corregir deficiencias del factor VIII humano, caracterizado, por ejemplo, mediante hemofilia A. El factor VIII tiene múltiples formas degradadas o procesadas en el estado natural. Estas proceden proteolíticamente de una proteína precursora de una cadena, como se demuestra en el presente documento. Un polipéptido del factor VIII funcional incluye dicha proteína de cadena sencilla y proporciona también estos diversos productos de degradación que tienen la actividad biológica de corregir deficiencias del factor VIII humano. Existen, probablemente, variaciones alélicas. Los polipéptidos del factor VIII funcionales incluyen todas esas variaciones alélicas, versiones glucosiladas, modificaciones y fragmentos que dan como resultado derivados del factor VIII siempre que contengan el segmento funcional del factor VIII y permanezca intacta en su tipo la característica esencial de la actividad funcional del factor VIII. Estos derivados del factor VIII que poseen la actividad funcional requerida pueden identificarse, fácilmente, mediante sencillas pruebas in vitro descritas en el presente documento. Además, un polipéptido del factor VIII funcional es capaz de catalizar la conversión del factor X a Xa en presencia del factor IXa, calcio y fosfolípidos, así como corregir el defecto de coagulación en plasma procedente de individuos afectados de hemofilia A. A partir de la divulgación de la secuencia de las secuencias de aminoácidos del factor VIII humano y las regiones funcionales en el presente documento, los fragmentos que pueden proceder a través del corte con enzimas de restricción del ADN o degradación proteolítica u otra degradación de la proteína del factor VIII humano serán evidentes para aquellas personas expertas en la materia.

Como se usa en el presente documento, "sitio de escisión de trombina" se refiere a una porción de la cadena del péptido del factor VIII que es un sitio de escisión diana para trombina. En determinadas realizaciones, el sitio de escisión de trombina se localiza en o cerca de la unión a1-A2 del polipéptido del factor VIII. En otras realizaciones, el sitio de escisión de trombina se localiza en los restos de aminoácido 370-375 del péptido del factor VIII humano de tipo silvestre maduro (SEQ ID NO: 1). En realizaciones adicionales, el sitio de escisión de trombina puede ser un sitio homólogo en un polipéptido del factor VIII homólogo, tal como una variante alélica o un polipéptido modificado.

Como se usa en el presente documento, "bucle de activación" se refiere a una porción de la subunidad A2 de la

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cadena del péptido del factor VIII que es capaz de interactuar con el factor IXa. En determinadas realizaciones, el bucle de activación se localiza en los restos de aminoácido 558-565 del péptido del factor VIII humano de tipo silvestre maduro (SEQ ID NO: 1). En realizaciones adicionales, el bucle de activación puede ser un sitio homólogo en un polipéptido del factor VIII homólogo, tal como una variante alélica o un polipéptido modificado.

Como se usa en el presente documento, "interfaz de dominio" se refiere a las regiones o restos en las subunidades respectivas del heterotrímero del factor VIIIa que interactúan con las otras subunidades del heterotrímero. Como tal, "interfaz de dominio A1-A2" se refiere a las regiones o restos en cada una de las subunidades A1 y A2 que interactúan con las regiones o restos correspondientes en la otra subunidad. De forma similar, "interfaz de dominio A2-A3" se refiere a las regiones o restos en cada una de las subunidades A2 y A3 que interactúan con las regiones o restos correspondientes en la otra subunidad. En ciertos ejemplos, el interfaz de dominio A1-A2 incluye restos E272 y D519 (basados en la secuencia del factor VIII de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1). En otros ejemplos, el interfaz de dominio A2-A3 incluye restos E665 y E1984 (basados en la secuencia del factor VIII de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1).

Como se usa en el presente documento, "factor IX" o "FIX" significa factor IX de coagulación, que también se conoce como factor IX de coagulación humano o componente de la tromboplastina plasmática.

Como se usa en el presente documento, "factor X" o "FX" significa factor X de coagulación, que también se conoce por el nombre de factor X de coagulación humano y por el epónimo factor Stuart Prower.

"Farmacocinética" o "PK" se usa en el presente documento para describir las propiedades de absorción, distribución, metabolismo y eliminación de un fármaco en un cuerpo. Una mejora en la farmacocinética de un fármaco significa una mejora en aquellas características que hacen el fármaco más eficaz in vivo como un agente terapéutico, especialmente su duración útil en el cuerpo.

Los términos "polipéptido", "péptido", y "proteína" generalmente se usan en el presente documento de forma indistinta y se refieren a un polímero en el que los monómeros son aminoácidos que se unen a través de enlaces amida. Además, también se incluyen aminoácidos no naturales, por ejemplo, p-alanina, fenilglicina y homoarginina. Los aminoácidos que no están codificados genéticamente también pueden utilizarse con la tecnología desvelada en el presente documento. Además, también se pueden utilizar aminoácidos que se han modificado para incluir grupos reactivos, sitios de glucosilación, polímeros, restos terapéuticos, biomoléculas y similares. Todos los aminoácidos utilizados en el presente documento pueden ser isómeros D o L. Generalmente se prefiere el isómero L. Como se usa en el presente documento, "polipéptido", "péptido", y "proteína" se refieren a formas glucosiladas y no glucosiladas.

El término “aminoácido” se refiere a aminoácidos naturales y sintéticos, así como análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de un modo similar a los aminoácidos que se producen naturalmente. Son aminoácidos que se producen naturalmente aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican más tarde, por ejemplo, hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato y O-fosfoserina. "Análogos de aminoácidos" se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido que se produce naturalmente, es decir, un carbono a que está unido a hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metilsulfonio de metionina. Dichos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o las estructuras principales de los péptidos modificadas, pero retienen la misma estructura química básica que un aminóacido que se produce naturalmente. Miméticos de aminoácidos se refiera a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de un modo similar a un aminoácido que se produce naturalmente.

"Variante" y "muteína" se usan en el presente documento de forma indistinta y se refieren a un polipéptido modificado genéticamente o a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que surge como resultado de un cambio inducido en el laboratorio en la secuencia de nucleótidos o polipéptidos. Al describir los aminoácidos, pueden utilizarse los códigos de aminoácidos estándar de una letra o de tres letras que son bien conocidos en la materia en lugar del nombre completo del aminoácido. Además, puede utilizarse un código de aminoácidos de una letra seguido de un número para indicar un aminoácido particular en una posición particular en la secuencia de inicio. Por ejemplo "V374" indicaría la valina en la posición de aminoácido 374 de la secuencia del wt-FVIII (SEQ ID NO: 1). Además, puede incluirse el código de una letra del aminoácido sustituido después del número de posición para indicar una sustitución de aminoácido particular que se realizó. Por ejemplo, "V374F" indicaría que un resto de fenilalanina se ha sustituido por la valina en la posición 374. "Sustitución" como se usa en el presente documento se refiere al reemplazo de un aminoácido por otro aminoácido y no incluye deleciones ni adiciones salvo que se indique expresamente lo contrario.

También se debe tener en cuenta que, salvo que el lenguaje de un ejemplo particular indique específicamente lo contrario, las posiciones de aminoácido desveladas en el presente documento están todas basadas en la posición correspondiente en la secuencia de aminoácidos del péptido del factor VIII de tipo silvestre maduro, como se proporciona en la SEQ ID NO: 1, como se hace convencionalmente en la materia.

Las variantes de polipéptido de la presente divulgación incluyen una o más sustituciones de aminoácidos en uno o ambos de los sitios de escisión de trombina y el bucle de activación. En ciertos ejemplos, las variantes de polipéptido

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incluyen una o más sustituciones de aminoácidos en uno o ambos de 1) el sitio de escisión de trombina, representado por las posiciones de aminoácido 370-375 de la SEQ ID NO: 1 y 2) el bucle de activación, representado por las posiciones de aminoácido 558-565 de la SEQ ID NO: 1. Con respecto al sitio de escisión de trombina en los restos 370-375, la escisión se produce, normalmente, inmediatamente después del resto R372, lo que hace a este resto importante para la escisión apropiada en este sitio. Como tal, en determinadas realizaciones, la variante de polipéptido incluirá una o más sustituciones de aminoácidos dentro del sitio de escisión de trombina representadas por las posiciones de aminoácido 370-375 de la SEQ ID NO: 1, en el que la sustitución no está en la posición 372. En determinadas realizaciones, la sustitución de aminoácidos puede ser una sustitución en una o más de las siguientes posiciones en la secuencia de inicio (con los números de posición basados en la secuencia del wt- FVIII de la SEQ ID NO: 1): Q370, I371, S373, V374, A375, S558, V559, D560, Q561, R562, G563, N564 y Q565. En otras realizaciones concretas, pueden existir sustituciones en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o 13 de esas posiciones. En realizaciones adicionales, la variante puede comprender al menos una sustitución en cada uno del sitio de escisión de trombina (370-375) y el bucle de activación (558-565). En ciertos ejemplos, la variante puede comprender una sustitución de al menos una de Q370, 1371, S373, V374 y A375 y una sustitución de al menos una de S558, V559, D560, Q561, R562, G563, N564 y Q565. En realizaciones adicionales, la variante puede comprender más de una sustitución dentro del sitio de escisión de trombina (370-375) o del bucle de activación (558-565), por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 sustituciones. En otros ejemplos, la variante comprende dos sustituciones dentro del sitio de escisión de trombina (370-375) y tres sustituciones dentro del bucle de activación (558-565). En ejemplos particulares, las sustituciones dentro del sitio de escisión de trombina son Q370M, 1371P, V374F, Q370M/I371P o I371P/V374F. En otros ejemplos, las sustituciones dentro del bucle de activación son V559L, R562W, R562F, R562K, Q565E, V559L/R562F, V559L/R562W, V559L/Q565E, V559L/R562W/Q565E o V559L/R562F/Q565E.

En ejemplos adicionales, la variante de polipéptido del factor VIII incluye además una o más sustituciones en restos de aminoácido dentro de cada una de las interfaces de dominio A1-A2 y A2-A3. En ejemplos particulares, la sustitución dentro de la interfaz de dominio A1-A2 comprende una sustitución de uno o ambos de los restos E272 y D519 (basada en la secuencia del factor VIII de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1). En determinadas realizaciones, estas sustituciones reemplazan uno o ambos de los restos de ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) cargados en E272 y D519 con un resto hidrófobo y, particularmente, una resto hidrófobo tal como alanina, leucina, prolina, metionina, glicina, valina, isoleucina, fenilalanina o triptófano. En ciertos ejemplos, se seleccionan una o más sustituciones dentro de la interfaz de dominio A1-A2 a partir del grupo que consiste en E272A, E272V, D519A y D519V. En ejemplos adicionales, la sustitución dentro de la interfaz de dominio A2-A3 comprende una sustitución de uno o ambos de los restos E665 y E1984 (basada en la secuencia de factor VIII de tipo silvestre de SEQ ID NO: 1). En determinadas realizaciones, estas sustituciones reemplazan uno o ambos de los restos de ácido glutámico (E) cargados en E665 y E1984 con un resto hidrófobo y, particularmente, un resto hidrófobo tal como alanina, leucina, prolina, metionina, glicina, valina, isoleucina, fenilalanina o triptófano. En ejemplos adicionales, se seleccionan una o más sustituciones dentro de la interfaz de dominio A2-A3 a partir del grupo que consiste en E665A, E665V, E1984A y E1984V. En ciertos ejemplos, la variante de polipéptido del factor VIII comprende sustituciones D519A/E665A, sustituciones D519A/E665V, sustituciones D519V/E665A o sustituciones D519V/E665V.

En ciertos ejemplos, la preparación de las variantes de polipéptido del factor VIII implica mutagénesis dirigida al sitio de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido del factor VIII. Dicha mutación dirigida al sitio de una secuencia de nucleótidos puede producirse mediante cualquier procedimiento conocido en la materia y los expertos en la materia serían capaces de determinar fácilmente una técnica de mutagénesis apropiada a emplear para la aplicación específica en cuestión. En ciertos ejemplos, la mutagénesis se lleva a cabo utilizando un kit de mutagénesis dirigida al sitio comercialmente disponible tal como el kit de mutagénesis dirigida al sitio Stratagene QuickChange™ II, el kit de mutagénesis dirigida al sitio Clontech Transformer n.° K1600-1, el sistema de mutagénesis dirigida al sitio Invitrogen GenTaylor n.° 12397014, el sistema de mutagénesis in vitro Promega Altered Sites II n.° Q6210 o el kit de mutagénesis Takara Mirus Bio LA PCR n.° TAK RR016.

En ciertos ejemplos, las variantes de polipéptido del factor VIII tendrán una actividad aumentada en al menos un ensayo de actividad cuando se compara con el polipéptido de inicio del factor VIII. Se puede emplear cualquier ensayo adecuado para probar la actividad del factor VIII con las variantes de polipéptido de la presente divulgación y, tales ensayos son bien conocidos en la materia. Dichos ensayos de actividad incluyen, pero sin limitación: aPTT; ensayo de sustrato cromogénico o fluorogénico para FVIII, ya sea ensamblado a partir de componentes individuales del complejo FXasa o como un kit; ensayo o prueba de generación de trombina (TGA o TGT) o trombografía automatizada calibrada (CAT); y tromboelastometría rotacional (ROTEM) o tromboelastografía rotacional (ROTEG).

El aPTT puede referirse al ensayo de una fase o, menos común, de dos fases, en el que se detecta la coagulación como el tiempo necesario para lograr una turbidez o viscosidad de muestra predefinida (tiempo de coagulación o CT). Como el aPTT es un ensayo basado en plasma, se ha utilizado para evaluar la actividad y función potencial del factor VIII en plasma. En el típico aPTT de una fase, se incuba una muestra de plasma que contiene FVIII con una superficie o partículas cargadas negativamente y Ca+2 para iniciar la coagulación. En el ensayo de una fase, la generación del FXIa, FVIIIa, FXa, trombina y fibrina se produce en una reacción. En el ensayo de dos fases la generación del FXIa, FVIIIa y FXa se produce en la primera fase y la formación de trombina y fibrina se produce en la segunda fase. Pueden ser posibles modificaciones en el aPTT de una fase y de dos fases para hacer los ensayos específicos para la cuantificación del FVIII, como en un ensayo de factor específico del FVIII.

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El ensayo de sustrato cromogénico (ensayo cromático) es un ensayo de dos fases diseñado para evaluar la función del FVIII en el contexto del complejo FXasa (FIXa, PL, Ca+2 y FX). En este ensayo, FVIIIa está totalmente activado y FIXa y PL están en exceso, una situación que, normalmente, no se encuentra fisiológicamente. En este ensayo, FVIIIa se combina con componentes purificados o relativamente purificados del complejo FXasa para generar FXa en la primera fase. En la segunda fase, se cuantifica el nivel de FXa generado mediante un sustrato que produce color cuando se escinde mediante FXa. La variación del ensayo cromogénico incluye reemplazo del sustrato cromogénico con un sustrato fluorogénico y se detecta emisión de fluorescencia (ensayo fluorogénico).

TGA, otro ensayo de la función procoagulante del FVIII, se realiza mediante la activación del plasma que contiene FVIII con un iniciador fisiológico tal como factor tisular (TF) o FXIa en presencia de fosfolípidos (PL) (40:40:20, v/v/v fosfatidilserina:fosfatidilcolina:fosfatidiletanolamina) para simular la superficie de membrana de las plaquetas activadas. La generación de trombina (y la coagulación) comienza con la adición de Ca+2 y un sustrato fluorogénico para trombina en la muestra. In CAT, el cambio de fluorescencia a lo largo del tiempo se relaciona de nuevo con la concentración de trombina mediante el control de la tasa de cambio de fluorescencia en muestras paralelas que contienen niveles definidos de trombina. Los parámetros que describen el cambio cinético en los perfiles de generación de trombina pueden incluir el tiempo anterior al inicio de la respuesta (desfase) y la trombina máxima alcanzada (pico).

ROTEM/ROTEG es análogo a TGA, excepto que se controla el desarrollo de la viscosidad con la coagulación en lugar de la generación de trombina. De nuevo, la coagulación se inicia en plasma que contiene el FVIII mediante Ca+2 o mezcla de TF-PL. Los parámetros que describen los cambios cinéticos en viscosidad pueden incluir tiempo de iniciación del coágulo (CT) y la tasa de cambio de viscosidad (ángulo a).

En ciertos ejemplos, la actividad de la variante de polipéptido del factor VIII se probará mediante uno o más ensayos. Obsérvese que debido a los cambios en el mecanismo de acción para estas variantes del FVIII y a las diferencias en la capacidad de los ensayos para detectar aspectos específicos de la función del FVIII, solo determinados ensayos detectarán mejoras marcadas en la actividad del factor VIII. Como tal, en ciertos ejemplos, la variante de polipéptido del factor VIII puede tener actividad comparable al wt-FVIII en un ensayo mientras que posee actividad aumentada en otro ensayo. Por ejemplo, la variante puede tener actividad que es comparable a la del wt-FVIII en un ensayo cromogénico mientras que posee actividad aumentada cuando se prueba utilizando un ensayo aPTT o un ensayo de generación de trombina. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando una variante tiene actividad catalítica mejorada pero también es más susceptible a degradación proteolítica. Para algunas variantes, los ensayos más sensibles a la actividad mejorada pueden ser el aPTT de una fase y el TGA, pero no el ensayo cromogénico. Dicha discrepancia en el rendimiento de los ensayos de las proteínas de coagulación no es infrecuente, particularmente cuando las mutaciones están en dominios que afectan a unas funciones específicas pero no a otras (Leong y col., Biochemistry 31:2567 (1992); Stone y col., Biochemistry 30:6392 (1991); Henriksen y Mann, Biochemistry 28:2078 (1989)). Estos resultados pueden sugerir que estas variantes pueden tener la ventaja de ser más fáciles de activar, es decir, la conversión del FVIII al FVIIIa se acelera, lo que luego podría traducirse en una generación de trombina mejorada.

En ciertos ejemplos, la variante de polipéptido del factor VIII poseerá una actividad mayor que la del polipéptido de inicio del factor VIII, wt-FVIII, FVIII-BdD o D519VE665E-FVIII. Estas actividades se medirán utilizando polipéptidos producidos en condiciones comparables, tales como expresión recombinante de la variante y del polipéptido de inicio en el mismo tipo de línea celular en condiciones comparables. En determinadas realizaciones, la actividad aumentará al menos 1,1 veces sobre la del polipéptido de inicio del factor VIII, wt-FVIII, FVIII-BDD o D519VE665E- FVIII en al menos un ensayo. En otras realizaciones, la actividad aumentará al menos aproximadamente 1,2 veces, 1,3 veces, 1,4 veces, 1,5 veces, 1,6 veces, 1,7 veces, 1,8 veces, 1,9 veces, 2,0 veces, 2,5 veces, 3,0 veces, 3,5 veces, 4,0 veces, 4,5 veces, 5,0 veces, 5,5 veces, 6,0 veces, 6,5 veces, 7,0 veces, 7,5 veces, 8,0 veces, 8,5 veces, 9,0 veces, 9,5 veces, 10 veces, 11 veces, 12 veces, 13 veces, 14 veces, 15 veces, 16 veces, 17 veces, 18 veces, 19 veces, 20 veces, 21 veces, 22 veces, 23 veces, 24 veces, 25 veces, 26 veces, 27 veces, 28 veces, 29 veces, 30

veces, 31 veces, 32 veces, 33 veces, 34 veces, 35 veces, 36 veces, 37 veces, 38 veces, 39 veces, 40 veces, 41

veces, 42 veces, 43 veces, 44 veces, 45 veces, 46 veces, 47 veces, 48 veces, 49 veces, 50 veces, 55 veces, 60

veces, 65 veces, 70 veces, 75 veces, 80 veces, 85 veces, 90 veces, 100 veces, 110 veces, 120 veces, 130 veces,

140 veces, 150 veces, 160 veces, 170 veces, 180 veces, 190 veces, 200 veces, 210 veces, 220 veces, 230 veces, 240 veces, 250 veces, 260 veces, 270 veces, 280 veces, 290 veces, 300 veces, 310 veces, 320 veces, 330 veces, 340 veces, 350 veces, 360 veces, 370 veces, 380 veces, 390 veces, 400 veces, 450 veces, 500 veces o más sobre la del polipéptido de inicio del factor VIII, wt-FVIII, FVIII-BDD o D519VE665E-FVIII en al menos un ensayo.

En otros ejemplos adicionales, la actividad aumentará en aproximadamente 1,2 a 10 veces, 1,2 a 12 veces, 1,2 a 14 veces, 1,2 a 16 veces, 1,2 a 18 veces, 1,2 a 20 veces, 1,2 a 30 veces, 1,2 a 40 veces, 1,2 a 50 veces, 1,2 a 60

veces, 1,2 a 70 veces, 1,2 a 80 veces, 1,2 a 90 veces, 1,2 a 100 veces, 1,3 a 10 veces, 1,3 a 12 veces, 1,3 a 14

veces, 1,3 a 16 veces, 1,3 a 18 veces, 1,3 a 20 veces, 1,3 a 30 veces, 1,3 a 40 veces, 1,3 a 50 veces, 1,3 a 60

veces, 1,3 a 70 veces, 1,3 a 80 veces, 1,3 a 90 veces, 1,3 a 100 veces, 1,4 a 10 veces, 1,4 a 12 veces, 1,4 a 14

veces, 1,4 a 16 veces, 1,4 a 18 veces, 1,4 a 20 veces, 1,4 a 30 veces, 1,4 a 40 veces, 1,4 a 50 veces, 1,4 a 60

veces, 1,4 a 70 veces, 1,4 a 80 veces, 1,4 a 90 veces, 1,4 a 100 veces, 1,5 a 10 veces, 1,5 a 12 veces, 1,5 a 14

veces, 1,5 a 16 veces, 1,5 a 18 veces, 1,5 a 20 veces, 1,5 a 30 veces, 1,5 a 40 veces, 1,5 a 50 veces, 1,5 a 60

veces, 1,5 a 70 veces, 1,5 a 80 veces, 1,5 a 90 veces, 1,5 a 100 veces, 1,6 a 10 veces, 1,6 a 12 veces, 1,6 a 14

veces, 1,6 a 16 veces, 1,6 a 18 veces, 1,6 a 20 veces, 1,6 a 30 veces, 1,6 a 40 veces, 1,6 a 50 veces, 1,6 a 60

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veces, 1,6 a 70 veces, 1,6 a 80 veces, 1,6 a 90 veces, 1,6 a 100 veces, 1,8 a 10 veces, 1,8 a 12 veces, 1,8 a 14

veces, 1,8 a 16 veces, 1,8 a 18 veces, 1,8 a 20 veces, 1,8 a 30 veces, 1,8 a 40 veces, 1,8 a 50 veces, 1,8 a 60

veces, 1,8 a 70 veces, 1,8 a 80 veces, 1,8 a 90 veces, 1,8 a 100 veces, 2 a 10 veces, 2 a 12 veces, 2 a 14 veces, 2 a 16 veces, 2 a 18 veces, 2 a 20 veces, 2 a 30 veces, 2 a 40 veces, 2 a 50 veces, 2 a 60 veces, 2 a 70 veces, 2 a 80

veces, 2 a 90 veces, 2 a 100 veces, 4 a 10 veces, 4 a 12 veces, 4 a 14 veces, 4 a 16 veces, 4 a 18 veces, 4 a 20

veces, 4 a 30 veces, 4 a 40 veces, 4 a 50 veces, 4 a 60 veces, 4 a 70 veces, 4 a 80 veces, 4 a 90 veces, 4 a 100 veces, 5 a 10 veces, 5 a 12 veces, 5 a 14 veces, 5 a 16 veces, 5 a 18 veces, 5 a 20 veces, 5 a 30 veces, 5 a 40

veces, 5 a 50 veces, 5 a 60 veces, 5 a 70 veces, 5 a 80 veces, 5 a 90 veces, 5 a 100 veces, 6 a 12 veces, 6 a 14

veces, 6 a 16 veces, 6 a 18 veces, 6 a 20 veces, 6 a 30 veces, 6 a 40 veces, 6 a 50 veces, 6 a 60 veces, 6 a 70

veces, 6 a 80 veces, 6 a 90 veces, 6 a 100 veces, 8 a 16 veces, 8 a 18 veces, 8 a 20 veces, 8 a 30 veces, 8 a 40

veces, 8 a 50 veces, 8 a 60 veces, 8 a 70 veces, 8 a 80 veces, 8 a 90 veces, 8 a 100 veces, 10 a 20 veces, 10 a 30 veces, 10 a 40 veces, 10 a 50 veces, 10 a 60 veces, 10 a 70 veces, 10 a 80 veces, 10 a 90 veces, 10 a 100 veces, 12 a 20 veces, 12 a 30 veces, 12 a 40 veces, 12 a 50 veces, 12 a 60 veces, 12 a 70 veces, 12 a 80 veces, 12 a 90 veces, 12 a 100 veces, 15 a 30 veces, 15 a 40 veces, 15 a 50 veces, 15 a 60 veces, 5 a 70 veces, 15 a 80 veces, 15 a 90 veces, 15 a 100 veces, 20 a 40 veces, 20 a 50 veces, 20 a 60 veces, 20 a 70 veces, 20 a 80 veces, 20 a 90 veces, 20 a 100 veces, 30 a 40 veces, 30 a 50 veces, 30 a 60 veces, 30 a 70 veces, 30 a 80 veces, 30 a 90 veces, 30 a 100 veces, 40 a 60 veces, 40 a 70 veces, 40 a 80 veces, 40 a 90 veces, 40 a 100 veces, 50 a 80 veces, 50 a 90 veces, 50 a 100 veces, 60 a 80 veces, 60 a 90 veces, 60 a 100 veces, 70 a 100 veces, 70 a 200 veces, 90 a 100 veces, 90 a 120 veces, 90 a 140 veces, 100 a 150 veces, 100 a 160 veces, 100 a 180 veces, 100 a 200 veces, 100 a 250 veces, 100 a 300 veces, 100 a 350 veces, 100 a 400 veces, 100 a 500 veces, 120 a 150 veces, 120 a 160 veces, 120 a 180 veces, 120 a 200 veces, 120 a 250 veces, 120 a 300 veces, 120 a 350 veces, 120 a 400 veces, 120 a 500 veces, 150 a 200 veces, 150 a 250 veces, 150 a 300 veces, 150 a 350 veces, 150 a 400 veces, 150 a 500 veces, 200 a 300 veces, 200 a 400 veces, 200 a 500 veces, 300 a 400 veces, 300 a 500 veces o 400 a 500 veces sobre la del polipéptido de inicio del factor VIII, wt-FVIII, FVIII-BDD o D519VE665E-FVIII en al menos un ensayo.

Las variantes del factor VIII descritas en el presente documento pueden diseñarse utilizando cualquier polipéptido del factor VIII funcional como un polipéptido de inicio. En determinadas realizaciones, el polipéptido del factor VIII es un polipéptido del factor VIII humano. En realizaciones adicionales, el polipéptido del factor VIII es un wt-FVIII humano (SEQ ID NO: 1), FVIII-BDD (SEQ ID NO: 3) o D519VE665E-FVIII (SEQ ID NO: 5). El polipéptido de inicio puede tener deleciones, inserciones y/o adiciones comparadas con la secuencia de aminoácidos del factor VIII de tipo silvestre. Como ejemplos no limitativos, el polipéptido de inicio puede incluir mutantes del factor VIII con mutaciones que estabilizan aún más el dominio a2 (véase, por ejemplo, el documento WO 97/40145), mutantes del factor VIII que dan como resultado expresión aumentada (véase, por ejemplo, Swaroop y col., JBC 272:24121-24124 (1997)), mutantes del factor VIII que reducen la inmunogenicidad relativa al tipo silvestre (véase, por ejemplo, Lollar, Thromb. Haemost. 82:505-508 (1999)), factor VIII reconstituido a partir de cadenas ligeras y pesadas expresadas de forma diferente (véase, por ejemplo, Oh y col., Exp. Mol. Med. 31:95-100 (1999) o mutantes del factor VIII que tienen uniones reducidas a receptores que conducen al catabolismo del factor VIII como HSPG (proteoglicanos de sulfato de heparano) y/o LRP (proteína relativa al receptor de lipoproteínas de baja densidad) (véase, por ejemplo, Ananyeva y col., TCM 11:251-257 (2001)). En ciertos ejemplos, el polipéptido del factor VIII también puede contener sustituciones de aminoácidos adicionales, tal como, por ejemplo, una sustitución en o cerca del resto R336, por ejemplo, una sustitución R336I. Además, los polipéptidos de inicio útiles pueden ser formas modificadas de éstos que todavía poseen funcionalidad del factor VIII, incluyendo polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 %, 93 %, 92 %, 91 %, 90 %, 89 %, 88

%, 87 %, 86 %, 85 %, 84 %, 83 %, 82 %, 81 %, 80 %, 79 %, 78 %, 77 %, 76 %, 75 %, 74 %, 73 %, 72 %, 71 %, 70

%, 69 %, 68 %, 67 % o 66 % idéntica a la secuencia del wt-FVIII( SEQ ID NO: 1), FVIII-BDD (SEQ ID NO: 3) o D519VE665E-FVIII (SEQ ID NO: 5). Además, las variantes de polipéptido del factor VIII de la presente divulgación incluyen cualquier variante de polipéptido con al menos aproximadamente 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 %, 93 %, 92 %, 91 %, 90 %, 89 %, 88 %, 87 %, 86 %, 85 %, 84 %, 83 %, 82 %, 81 %, 80 %, 79 %, 78 %, 77 %, 76 %, 75

%, 74 %, 73 %, 72 %, 71 %, 70 %, 69 %, 68 %, 67 % o 66 % de identidad con la secuencia de wt-FVIII (SEQ ID NO:

1), FVIII-BDD (SEQ ID NO: 3) o D519VE665E-FVIII (SEQ ID NO: 5) y que también contiene una o más sustituciones de aminoácido descritas en el presente documento o en una realización adicional contiene una o más sustituciones de aminoácidos tanto en el sitio de escisión de trombina como en el bucle de activación. En otra realización, las variantes de polipéptido del factor VIII de la presente divulgación incluyen cualquier variante de polipéptido con más del 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 %, 93 %, 92 %, 91 %, 90 %, 89 %, 88 %, 87 %, 86 %, 85 %, 84 %, 83 %, 82 %, 81 %, 80 %, 79 %, 78 %, 77 %, 76 %, 75 %, 74 %, 73 %, 72 %, 71 %, 70 %, 69 %, 68 %, 67 % o 66 % de identidad con la secuencia de wt-FVIII (SEQ ID NO: 1), FVIII-BDD (SEQ ID NO: 3) o D519VE665E-FVIII (SEQ ID NO: 5) y que también contiene una o más sustituciones de aminoácido descritas en el presente documento o en una realización adicional contiene una o más sustituciones de aminoácidos tanto en el sitio de escisión de trombina como en el bucle de activación.

En otro ejemplo, la presente divulgación se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que codifican las variantes de polipéptido del factor VIII. En una realización, las variantes del factor VIII se codifican mediante una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 %, 93 %, 92 %, 91 %, 90 %, 89 %, 88 %, 87 %, 86 %, 85 %, 84 %, 83 %, 82 %, 81 %, 80 %, 79 %, 78 %, 77 %, 76 %, 75 %, 74 %, 73 %, 72 %, 71 %, 70 %, 69 %, 68 %, 67 % o 66 % de identidad a lo largo de la longitud completa de la secuencia de nucleótidos del wt-FVIII (SEQ ID NO: 2), FVIII-BDD (SEQ ID NO: 4) o D519VE665E-FVIII (SEQ ID NO: 6) y que codifica un

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polipéptido que contiene una o más de las alteraciones de aminoácidos descritas en el presente documento o en una realización adicional contiene una o más sustituciones de aminoácidos en tanto el sitio de escisión de trombina como el bucle de activación. En otra realización, la variante del factor VIII se codifica mediante una secuencia de nucleótidos que tiene más del 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 94 %, 93 %, 92 %, 91 %, 90 %, 89 %, 88 %, 87 %, 86 %, 85 %, 84 %, 83 %, 82 %, 81 %, 80 %, 79 %, 78 %, 77 %, 76 %, 75 %, 74 %, 73 %, 72 %, 71 %, 70 %, 69 %, 68 %, 67 % o 66 % de identidad a lo largo de la longitud completa de la secuencia de nucleótidos del wt-FVIII (SEQ ID NO: 2), FVIII-BDD (SEQ ID NO: 4) o D519VE665E FVIII (SEQ ID NO: 6) y que codifica un polipéptido que contiene una o más de las alteraciones de aminoácidos descritas en el presente documento o en una realización adicional contiene una o más sustituciones de aminoácidos en tanto el sitio de escisión de trombina como el bucle de activación.

Los valores de porcentaje de identidad se calculan en toda la región de la secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos. Una serie de programas basados en una diversidad de algoritmos está disponible para los trabajadores expertos para comparar diferentes secuencias. En al menos una realización, se determina el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos utilizando el algoritmo Needleman y Wunsch (Needleman J. Mol. Biol. 48:444- 453 (1970)) que se ha incorporado en el programa needle en el paquete del software EMBOSS (Rice y col., "EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite," Trends in Genetics 16:276-277 (2000)), que utiliza una matriz de puntuación BLOSUM 45 o PAM250 para proteínas relacionadas lejanamente o una matriz de puntuación BLOSUM 62 o PAM160 para proteínas relacionadas más cercanas y una penalización por abertura de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y una penalización por extensión de hueco de 0,5, 1,2, 3, 4, 5 o 6. Se pueden encontrar guías para la instalación local del paquete EMBOSS así como enlaces a los servicios WEB en emboss.sourceforge.net. Un ejemplo no limitante de parámetros a utilizar para alinear dos secuencias de aminoácidos que utilizan el programa needle son los parámetros por defecto, incluyendo la matriz de puntuación EBLOSUM62, una penalización por abertura de hueco de 10 y una penalización por extensión de hueco de 0,5. En otra realización más, se determina el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos utilizando el programa needle en el paquete del software EMBOSS (Rice y col., "EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite," Trends in Genetics 16:276-277 (2000)), utilizando la matriz de puntuación EDNAFULL y una penalización por abertura de hueco en 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y una penalización por extensión de hueco de 0,5, 1,2, 3, 4, 5 o 6. Un ejemplo no limitante de parámetros a utilizar de forma conjunta para alinear dos secuencias de aminoácidos que utilizan el programa needle son los parámetros por defecto, incluyendo la matriz de puntuación EDNAFULL, una penalización por abertura de hueco de 10 y una penalización por extensión de hueco de 0,5. Las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas pueden además utilizarse como "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda basada en datos públicos para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Se pueden realizar dichas búsquedas utilizando la serie de programas BLAST (versión 2.2) de Altschul (Altschul y col., J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990)). Se puede realizar BLAST utilizando secuencias de ácidos nucleicos de la presente divulgación como secuencia de consulta con el programa BLASTn, BLASTx o tBLASTx que utiliza parámetros por defecto para obtener secuencias de nucleótidos (BLASTn, tBLASTx) o secuencias de aminoácidos (BLASTx) homólogas a secuencias codificadas mediante las secuencias de ácidos nucleicos de la presente divulgación. Se puede realizar BLAST utilizando secuencias de proteínas codificadas mediante las secuencias de ácidos nucleicos de la presente divulgación como secuencia de consulta con el programa BLASTp o tBLASTn que utiliza parámetros por defecto para obtener secuencias de aminoácidos (BLASTp) o secuencias de ácidos nucleicos (tBLASTn) homólogas a secuencias de la presente divulgación. Para obtener alineamientos con huecos con fines comparativos, puede utilizarse el Gapped BLAST que utiliza parámetros por defecto como se describe en Altschul y col., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997).

En ciertos ejemplos, los polinucleótidos de la presente divulgación consisten esencialmente en las secuencias de nucleótidos anteriormente mencionadas o comprenden las secuencias de nucleótidos anteriormente mencionadas. De ese modo, también pueden contener secuencias de nucleótidos adicionales. En determinadas realizaciones, el polinucleótido puede comprender, además de un marco de lectura abierto, una secuencia no traducida adicional en el extremo 3' y en el 5' de la región del gen codificante, por ejemplo, al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 o más nucleótidos de la secuencia cadena arriba del extremo 5' de la región codificante y/o al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 o más nucleótidos de la secuencia cadena abajo del extremo 3' de la región del gen codificante. Además, los polinucleótidos pueden codificar proteínas que comprenden las llamadas "etiquetas" que pueden servir como marcador detectable o como medida auxiliar para fines de purificación. Las etiquetas para diferentes fines son bien conocidas en la materia e incluyen, por ejemplo, etiquetas FLAG, etiquetas de 6 histidinas, etiquetas MYC y similares. En una realización, el polinucleótido comprende además una secuencia de control de la expresión unida operativamente a la secuencia de nucleótidos.

En ciertos ejemplos, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la variante de polipéptido del factor VIII se inserta en un vector adecuado. Numerosos vectores útiles para diversos fines son bien conocidos en la materia y los expertos en la materia podrían seleccionar fácilmente un vector apropiado para su aplicación deseada. En ciertos ejemplos, el vector puede ser un vector de clonación o un vector de expresión. En otros ejemplos, el vector puede ser un plásmido, un vector vírico, un cósmido o un cromosoma artificial. Los ejemplos de vectores adecuados incluyen vectores de expresión Tat/Tar-oriP, tales como pSS185 (Cho y col., Biotechnol. Prog. 19:229-232 (2003)) y pSS207 (Mei y col., Mol. Biotech. 34:165-178 (2006)), así como vectores pcDNA3.1, pCINeo, pEAK, pCEP4 y pUCOE. En ciertos ejemplos, el ácido nucleico que codifica la variante de polipéptido del factor VIII puede colocarse

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adyacente a y/o bajo el control de un promotor apropiado. Numerosos promotores útiles para diversos fines son bien conocidos en la materia y los expertos podrían seleccionar fácilmente un promotor apropiado para su aplicación deseada. En ciertos ejemplos, el promotor puede ser un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor específico de tejido. Los ejemplos de promotores adecuados incluyen el promotor/potenciador de CMV humano o murino, promotor/potenciador de SV40, promotor alfa EIf1, promotor MPSV y promotor SRalfa.

En ciertos ejemplos, las variantes de polipéptido del factor VIII se producen de forma recombinante en una célula, tejido u organismo. En determinadas realizaciones, dicha producción recombinante se lleva a cabo mediante la transformación o transfección de una célula hospedadora con una molécula de ácido nucleico que codifica la variante de polipéptido o un vector que contiene dicho ácido nucleico. Numerosos procedimientos de transformación y transfección son bien conocidos en la materia y los expertos en la materia podrían seleccionar fácilmente un procedimiento apropiado para su aplicación deseada. Los ejemplos de procedimientos de transformación adecuados incluyen transfección mediada por liposomas (por ejemplo, 293Fectin™ de Invitrogen), transfección con fosfato de calcio, electroporación y transfección por DEAE-dextrano.

También se puede llevar a cabo dicha producción recombinante utilizando cualquier célula hospedadora, tejido u organismo adecuado. Células, tejidos y organismos adecuados son bien conocidos en la materia y los expertos podrían seleccionar fácilmente un hospedador apropiado para su aplicación deseable. En algunos ejemplos, la célula hospedadora es de mamífero. Los ejemplos de líneas celulares de mamífero adecuadas son las cOS-1 (ATCC CRL 1650), líneas celulares de riñón de cría de hámster (BHK), tales como BHK21, células HKB11 (Cho y col., J. Biomed. Sci. 9:631 (2002)), HEK293 (ATCC CRL-1573; Graham y col., J. Gen. Virol. 36:59-72 (1977)), HEK293T (ATCC CRL 11268; DSM ACC 2494) y HEK293F (Invitrogen R79007). Una línea celular BHK útil es la línea celular BHK tk31ts13 (Waechter and Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110 (1982)), en lo sucesivo denominada células BHK 570. La línea celular BHK 570 se ha depositado en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Dr., Rockville, Md. 20852, bajo en número de referencia de ATCC CRL 10314. Una línea celular BHK tk- ts13 está también disponible en la ATCC con el número de referencia CRL 1632. Además, se puede utilizar un número de otras líneas celulares en la presente divulgación, incluyendo Rat Hep I (hepatoma de rata; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (hepatoma de rata; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), pulmón humano (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), CHO (ATCC CCL 61), CHO K1 (ATCC CCI61), células DUKX (Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 (1980)) y células CHO-DG44 (Urlaub y col., Cell 33:405-412 (1983)).

En otro ejemplo, la presente divulgación se refiere a formulaciones farmacéuticas de las variantes del factor VIII, así como a composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de la variante del factor VIII y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Los excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, normalmente, sustancias que pueden añadirse al principio activo para ayudar a formular o estabilizar la preparación y que no causan efectos toxicológicos adversos significativos en el paciente. Son bien conocidos en la materia numerosos excipientes y vehículos adecuados y los expertos en la materia podrían identificar fácilmente un excipiente o vehículo adecuado para emplear para una formulación o composición particular. Los ejemplos de excipientes o vehículos adecuados incluyen agua, azúcares tales como maltosa o sacarosa; albúmina; y sales. Los ejemplos específicos de formulaciones adecuadas incluyen las formulaciones descritas en la patente de Estados Unidos n.° 5.763.401 (presentada el 12 de julio de 1996; concedida el 9 de junio de 1998).

En un ejemplo, las formulaciones/composiciones farmacéuticas son para administración parenteral, tal como por administración iv, sc o intramuscular (im) y la dosificación puede ser como única dosis en bolo, dosificación intermitente o como infusión iv continua. También son útiles formulaciones tópicas. En una realización, la formulación farmacéutica comprende una variante del factor VIII aislada como se describe en el presente documento o comprende una composición de variantes del factor VIII como se describe en el presente documento, en una preparación liofilizada que se reconstituye en el momento que se utiliza. Como alternativa, la formulación farmacéutica puede ser una formulación líquida estable lista para utilizar que no requiere reconstitución. La formulación farmacéutica se puede proporcionar en viales de uso único de polvo liofilizado o viales de solución lista para usar de aproximadamente 25 UI, 50 UI, 75 UI, 100 UI, 125 UI, 150 UI, 175 UI, 200 UI, 250 UI, 300 UI, 350 UI, 400 UI, 450 UI, 500 UI, 550 UI, 600 UI, 650 UI, 700 UI, 750 UI, 800 UI, 850 UI, 900 UI, 950 UI, 1000 UI, 1050 UI, 1100 UI, 1150 UI, 1200 UI, 1250 UI, 1300 UI, 1350 UI, 1400 UI, 1450 UI, 1500 UI, 1550 UI, 1600 UI, 1650 UI, 1700 UI, 1750 UI, 1800 UI, 1850 UI, 1900 UI, 1950 UI, 2000 UI, 2050 UI, 2100 UI, 2150 UI, 2200 UI, 2250 UI, 2300 UI, 2350 UI, 2400 UI, 2450 UI, 2500 UI, 2550 UI, 2600 UI, 2650 UI, 2700 UI, 2750 UI, 2800 UI, 2850 UI, 2900 UI, 2950 UI, 3000 UI, 3050 UI, 3100 UI, 3150 UI, 3200 UI, 3250 UI, 3300 UI, 3350 UI, 3400 UI, 3450 UI, 3500 UI, 3550 UI, 3600 UI, 3650 UI, 3700 UI, 3750 UI, 3800 UI, 3850 UI, 3900 UI, 3950 UI, 4000 UI, 4050 UI, 4100 UI, 4150 UI, 4200 UI, 4250 UI, 4300 UI, 4350 UI, 4400 UI, 4450 UI, 4500 UI, 4550 UI, 4600 UI, 4650 UI, 4700 UI, 4750 UI, 4800 UI, 4850 UI, 4900 UI, 4950 UI, 5000 UI, 5500 UI, 6000 UI, 6500 UI, 7000 UI, 7500 UI, 8000 UI, 8500 UI, 9000 UI, 9500 UI, 10000 UI, 10500 UI, 11000 UI, 11500 UI, 12000 UI, 12500 UI, 13000 UI, 13500 UI, 14000 UI, 14500 UI o 15000 UI y se incluyen en el presente documento viales que contienen cualquier intervalo de las cantidades anteriores identificadas mediante dos de los números anteriores (por ejemplo, un intervalo de 25-75 UI, 100-200 UI, etc.). "UI" se entiende en el campo como Unidad Internacional y se define por el estándar internacional de la OMS. Los procedimientos reales para la preparación de composiciones administrables vía parenteral serán conocidos o evidentes para los expertos en la materia y se describen en más detalle en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 21a ed., publicada por Lippincott Williams & Wilkins (2005). La aplicación tópica, como puede ser aconsejable en caso de traumatismo o cirugía, puede llevarse a cabo mediante un pulverizador, perfusión,

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catéteres, endoprótesis, injertos o endoprótesis vasculares, pomada u otras preparaciones conocidas en la materia. En ciertos ejemplos, la administración tópica puede ser a través de una matriz sólida o semisólida, tal como una esponja quirúrgica o matriz de colágeno, que se han tratado con, infundidas con, revestidas con o empapadas en una composición que comprende la variante de polipéptido del factor VIII. Los procedimientos de preparación de dichas matrices son bien conocidos en la materia (véase, por ejemplo, Trombosis/Hemostasia 12:445 (2006)). La composición de la divulgación se aplicaría luego a la matriz utilizando tecnología conocida, tal como pulverización de una formulación acuosa sobre la matriz.

En una realización, la presente divulgación se refiere a kits que comprenden la variante de polipéptido del factor VIII. En ciertos ejemplos, el kit contiene un vial que contiene la variante de polipéptido del factor VIII liofilizada o una formulación liofilizada que comprende el polipéptido y, también, un disolvente para la reconstitución. En otros ejemplos, el kit contiene una formulación tópica del polipéptido del factor VIII, por ejemplo, una pomada, pulverizador o líquido y una matriz tal como una esponja u otra matriz médica en la que la formulación tópica se puede aplicar antes de la administración al paciente.

Se puede determinar fácilmente la dosificación apropiada para la administración al paciente que padece hemofilia A u otro trastorno de coagulación causado por una deficiencia en un factor de coagulación particular por expertos en la materia basándose en, por ejemplo, el peso del paciente, la gravedad del episodio hemorrágico, la deficiencia del factor y la actividad específica de la variante particular que se está empleando. En ciertos ejemplos, la dosificación puede ser de aproximadamente 5 UI/kg, 10 UI/kg, 15 UI/kg, 20 UI/kg, 25 UI/kg, 30 UI/kg, 35 UI/kg, 40 UI/kg, 45 UI/kg, 50 UI/kg, 55 UI/kg, 60 UI/kg, 65 UI/kg, 70 UI/kg, 75 UI/kg, 80 UI/kg, 85 UI/kg, 90 UI/kg, 95 UI/kg, 100 UI/kg o más cuando se administra por vía parenteral. La dosificación puede estar también dentro de un intervalo de dosificaciones en las que se selecciona cada punto final del intervalo a partir de las dosificaciones anteriores, tal como, es decir, 5-15 UI/kg, 10-20 UI/kg, etc. En determinadas realizaciones, para un paciente que tiene hemofilia A, las dosificaciones administradas de forma iv son aproximadamente 40 UI por kilogramo para indicaciones preoperatorias, 15 a 20 UI por kilogramo para hemorragias menores y 20 a 40 UI por kilogramo administrado durante un periodo de 8 horas para una dosis de mantenimiento. Estas dosificaciones pueden administrarse con la frecuencia necesaria basándose en el perfil farmacocinético de la preparación de la variante del factor VIII que se administra. Por ejemplo, dichas preparaciones pueden administrarse vía intravenosa dos veces al día, diariamente, cada dos días, cada tres días, tres veces por semana, dos veces por semana o una vez por semana para uso profiláctico. La frecuencia de dosificación se determinaría basándose en la gravedad de la condición de hemofilia A, la farmacocinética de la variante que se administra y la prolongación de la acción lograda debido a la actividad mejorada.

Las variantes y composiciones del factor VIII en el presente documento son útiles para el tratamiento de trastornos de coagulación sanguínea y aquellos trastornos que se benefician de la coagulación sanguínea y son, particularmente, útiles en situaciones en las que se necesita un factor VIII con actividad de coagulación mejorada. Por consiguiente, las variantes y composiciones del factor VIII en el presente documento son útiles para el tratamiento profiláctico en pacientes con trastornos de coagulación, así como para el tratamiento de episodios hemorrágicos agudos en pacientes con o sin una deficiencia de coagulación subyacente. En determinadas realizaciones, las variantes de polipéptido del factor VIII se pueden emplear para tratar hemorragias causadas por o relacionadas con una lesión traumática penetrante; lesión traumática contundente; hemorragia en cirugía electiva; hemorragia en cirugía cardiaca; hemorragia en cirugía de columna; cirugía ortopédica; neurocirugía; cirugía oncológica; cirugía post-pasto; menorragia; hemorragia en trasplante de células madre; hemorragia en trasplante de hígado; hemorragia gastrointestinal; hemorragia por varices activas en cirrosis; hemorragia no por varices en cirrosis; hemorragia alveolar difusa; aneurisma aórtica; hemorragia intracerebral; lesión cerebral traumática; contusión cerebral; inversión de warfarina; inversión de heparina; inversión de anticoagulantes; inversión de antitrombóticos; deficiencia del factor VIII; tipos específicos de trastornos de von Willebrand; telangiectasia hemorrágica hereditaria; diversas alteraciones arterovenosas; quemaduras; profilaxis en pacientes con hemofilia con inhibidores; hepactetomía parcial para pacientes no cirróticos y cirróticos; hemofilia adquirida; púrpura idiopática trombocitopénica; defectos en hemostasia mediada por plaquetas (por ejemplo, defectos en el número o respuesta de plaquetas); trombastenia de Glanzmann; trombastenia de Glanzmann refractaria a la transfusión de plaquetas; síndrome de Bernard-Soulier; y fiebre hemorrágica del dengue.

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero sin limitar, las realizaciones reivindicadas. Debe entenderse que los ejemplos y realizaciones descritas en el presente documento son solo para fines ilustrativos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Mutagénesis del sitio de escisión de trombina y bucle de activación

Mutagénesis del sitio de escisión de trombina

Se generaron construcciones de expresión para una variedad de variantes del factor FVIII que llevan sustituciones de aminoácidos en posiciones dentro del sitio de escisión de trombina mediante mutagénesis dirigida al sitio estándar utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio Quick Change (Agilent Technologies cat. # 200251) y utilizando FVIII-BDD como un polipéptido de inicio. Las construcciones son creadas, inicialmente, en un vector

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pcDNA3.1. Después de la mutagénesis, se cortó la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la variante del factor VIII del pcDNA3.1 utilizando enzimas de restricción apropiadas y se ligó en un vector de expresión pSS207. Se introdujeron de forma transitoria por transfección los plásmidos resultantes en células HEK293 en un formato basado en 96 pocillos. Se cuantificaron los niveles de expresión del FVIII mediante ELISA de sándwich estándar.

Mutagénesis del bucle de activación

Se generaron bibliotecas de genes aleatorizando individualmente las posiciones de aminoácido 558-65 utilizando FVIII-BDD como polipéptido de inicio y la técnica de mutagénesis estándar descrita anteriormente. Se introdujeron de forma transitoria por transfección preparaciones de ADN clonal de las ocho bibliotecas en células HEK293. Se cuantificaron los niveles de expresión de FVIII mediante ELISA de sándwich estándar, como se ha descrito anteriormente.

Inclusión de mutaciones adicionales

Además de producir sustituciones dentro del sitio de escisión de trombina y del bucle de activación, también se realizaron diversas sustituciones en otras posiciones a lo largo de la cadena del polipéptido del factor VIII para investigar los efectos de dichas mutaciones adicionales. En un ejemplo, se sometió adicionalmente un vector pcDNA3.1 que contiene un ácido nucleico que codifica un polipéptido D519VE665V-FVIII con sustituciones I371P, V374F, V559L, R562W y Q565E a mutagénesis dirigida al sitio, como se ha descrito anteriormente, para producir una sustitución R336I. Luego se introdujo por transfección el ácido nucleico resultante al vector de expresión pSS207.

Combinación de mutaciones de interés

Después de la creación de distintos conjuntos de variantes, se combinaron y caracterizaron mutaciones de interés en una variedad de permutaciones utilizando protocolos esencialmente idénticos. En general, se generaron y caracterizaron aproximadamente 2000 variantes del FVIII.

Ensayos de actividad del factor VIII

Se midió la actividad del FVIII mediante ensayos cromogénicos y aPTT. Para proteínas purificadas, se determinó la actividad cromogénica mediante Coatest FVIII:C (Instrumentation Laboratory; Bedford, MA), utilizando como calibrador 02-122 (NIBSC; Potters Bar, Hertfordshire, UK). Se describen anteriormente los detalles de los principios de ensayo cromogénico. Se determinó la actividad por aPTT de proteínas purificadas en el ACL TOP, utilizando como calibrador FVIII-BDD y el kit APTT-SP (Instrumentation Laboratory; Bedford, MA). Se describe anteriormente detalles adicionales de los principios de ensayo aPTT de una fase. Se calculó la actividad específica de proteínas purificadas utilizando A280 para determinar las concentraciones de proteínas.

Resultados

Se produjeron e investigaron numerosas variantes del FVIII-BDD con sustituciones de aminoácidos en posiciones dentro del sitio de escisión de trombina en los aminoácidos 370-375 (véase tabla 1). Las secuencias de escisión de trombina preferidas se basaron en la capacidad de la trombina para escindir secuencias de péptidos lineales específicas sobre otras utilizando ensayo de sustrato fluorogénico cinético (Bianchini y col., J. Biol. Chem. 277:20527 (2002)). Sorprendentemente, una variante que se predijo previamente que contenía sitio de escisión de trombina "óptimo" (Bianchini y col., J. Biol. Chem. 277:20527 (2002)) mostró actividad aPTT pobre (variante "a" en la tabla 1). Otras variantes con correspondencia parcial con la secuencia consenso "óptima" predicha (variantes b y c en la tabla 1) mostraron actividad aPTT mejorada. Sin querer ser limitado en ninguna manera por la teoría, la discrepancia del sitio de escisión de trombina "óptimo" predicho puede deberse parcialmente a la capacidad limitada de extrapolar a partir de la interacción de trombina con secuencias de péptidos lineales pequeñas a la interacción de trombina con proteínas tridimensionales grandes. No obstante, la actividad aPTT mejorada de "b" y "c" indicó que estos mutantes del FVIII se activaron más eficazmente en condiciones aPTT, por ejemplo, iniciación del factor de coagulación activado limitado.

Tabla 1

Nombre de la variante

Secuencia de aminoácidos dentro el sitio de escisión de trombina (370-375) Actividad específica (aPTT, factor sobre FVIII-BDD)

FVIII-BDD

QIRSVA 1

a

MPRFSR 0,27

b

MPRSVA 2,0

c

QPRSFA 2,5

Se produjeron y caracterizaron aproximadamente 1600 variantes del factor VIII con sustituciones de aminoácidos en el bucle de activación en las posiciones 558-565. Mientras que se hizo la prueba principal utilizando un ensayo

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cromogénico, los ensayos aPTT identificaron variantes con actividad procoagulante mejorada. La tabla 2 enumera las actividades aPTT de diversas variantes producidas y caracterizadas.

Tabla 2

Variante

Actividad específica (aPTT, factor sobre FVIII-BDD)

FVIII-BDD

1

R562W

1,7

R562F

2,0

Q565E

2,0

R562K

2,8

V559L

3,6

Posteriormente, se investigaron los efectos de la combinación múltiple de sustituciones de aminoácidos en el bucle de activación. La tabla 3 enumera las actividades de combinaciones seleccionadas de variantes.

Tabla 3

Variante

Actividad específica (aPTT, factor sobre FVIII-BDD)

FVIII-BDD

1

V559L, R562F

3,2

V559L, R562W

3,1

V559L, Q565E

4,8

V559L, R562W, Q565E

7,9

V559L, R562F, Q565E

9,5

Finalmente, se caracterizaron combinaciones de variantes del sitio de escisión de trombina y del bucle de activación. Muchas de las variantes resultantes mostraron solo aumentos de actividad modestos cuando se evaluaron mediante ensayo cromogénico (FIG. 2), pero mostraron aumentos de actividad sustanciales cuando se caracterizaron mediante el ensayo aPTT (FIG. 1). El cambio modesto en la actividad de ensayo cromogénico frente a la actividad aPTT marcadamente mejorada podría ser consistente con la ventaja de activación de estas variantes del FVIII, ya que el FVIII se preactiva completamente en el ensayo cromogénico pero no en el ensayo aPTT.

Ejemplo 2: Caracterización adicional de Var97

Se caracterizó adicionalmente otra variante particular, denominada Var97, que utilizó D519VE665V-FVIII como el polipéptido de inicio y que poseía las sustituciones de aminoácidos I371P, V374F, V559L, R562W y Q565E. Se clonó primero la variante seleccionada en el vector de expresión pSS207 y se introdujo por transfección en células HKB11 para obtener una combinación de células que expresan de forma estable utilizadas para inocular un fermentador de onda de 10 L. Se obtuvo y caracterizó proteína Var97 purificada in vitro e in vivo como de describe a continuación.

En los estudios iniciales, se encontró que la proteína Var97 purificada tiene actividad aPTT significativamente mejorada en comparación con su actividad de ensayo cromogénico en relación con el polipéptido de inicio del factor VIII. La relación de actividad específica para estos ensayos indicó que el grado de actividad aPTT sobre la actividad de ensayo cromogénico para la proteína Var97 variante fue aproximadamente 30 veces que la actividad FVIII-BDD (Tabla 4).

Tabla 4

Proteína

Relación de la actividad aPTT con la actividad de ensayo cromogénico Desviación estándar de la relación

FVIII-BDD

0,76 0,40

D519VE665V- FVIII

2,01 0,18

Var97

33,1 2,69

Se realizó una evaluación adicional de la potencia de Var97 en la coagulación mediante TGA utilizando el factor tisular (TF) como iniciador. Se realizó TGA según lo recomendado por el fabricante (Diagnostica Stago; Asniéres sur Seine, Francia). En resumen, se agregó FVIII (BDD, D519VE665V o variantes) en plasma de hemofilia A humano con una mezcla de TF 1 pM PL 4 jM, concentración final, como se ha descrito anteriormente. Se iniciaron

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reacciones mediante la adición de una mezcla de sustrato de trombina y CaCl2 (Flu-Ca) y se controló durante 60 minutos. Los resultados de TGA informados en el presente documento representan la media de experimentos por triplicado. Debido a la utilización de niveles bajos de TF, es probable que la TGA refleje más de cerca coagulación fisiológica. Mediante TGA, Var97 fue claramente más potente que las proteínas FVIII-BDD o D519VE665V-FVIII, desencadenando un aumento muy rápido en la generación de trombina en relación con aquellas moléculas originales (FIG. 3). La comparación de los perfiles de trombina entre Var97 y su origen, D519VE665V-FVIII, demostró claramente la contribución de las mutaciones adicionales mediante el aumento de la facilidad de activación de trombina (desfase más corto) y la generación del FXa mejorada (tasa de aumento más rápida y la mayor extensión de generación de trombina).

A pesar de su capacidad mejorada para desencadenar una respuesta de trombina, el perfil de trombina Var97 global fue cualitativamente muy similar al del FVIII-BDD y D519VE665V-FVIII, en el que se relacionó la tasa de retorno hacia los niveles de trombina basales con los niveles máximos de trombina (FIG. 3). Esto sugiere que Var97 no altera los mecanismos que regulan los niveles de trombina en plasma. Estos resultados predicen que es probable que Var97 no presente riesgo trombogénico adicional o riesgo de coagulación sistémica por encima de las proteínas FVIII-BDD o D519VE665V-FVIII.

Las comparaciones cuantitativas de la potencia de Var97 en relación con otras moléculas del FVIII probadas indican concordancia entre los resultados del ensayo procaogulante (TGA y aPTT). La comparación de la concentración de Var97 necesaria para obtener una cantidad definida de trombina máxima indicó que Var97 fue ~ 10 x más potente que su origen D519VE665V-FVIII y ~ 100 x más potente que FVIII-BDD (FIG. 4). Una evaluación similar mediante aPTT indicó que se requirió ~ 10 x menos de Var97 para obtener el mismo tiempo de coagulación que D519VE665V-FVIII (FIG. 5).

Se examinó la función de la variante Var97 en su complejo de enzimas fisiológicas utilizando ensayos cinéticos FXasa. Se realizaron estos ensayos cinéticos FXasa en HePeS 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, Tween 20 al 0,01 %, BSA al 0,01 % y PL 10 pM (40:40:20, v/v/v PS:PC:PE). En estos ensayos cinéticos FXasa, se generaron proteínas FVIIIa purificadas mediante incubación con trombina 20 nM. Se mantuvo fijo el nivel del FVIII a 10 pM y reaccionó con concentraciones variables del FIXa (0-10 nM) o se mantuvo fijo el nivel del FIXa a (100 pM) y varió el nivel del FVIIIa activado con trombina (0-10 nM). Se añadió FX (150 nM) a cualquiera de los tipos de reacciones y, después de 1 minuto, se pararon las reacciones del FXasa mediante la adición de EDTA. Se midió la cantidad del FXa generado en estas reacciones utilizando el sustrato cromogénico S-2765. Luego se extrapoló la generación del FXa a partir de una curva estándar que relaciona el nivel del FXa con las tasas de escisión de sustrato cromogénico. Se ajustó el dato a una ecuación Michaelis-Menten estándar para derivar constantes cinéticas. Se representó este dato para mostrar como la generación de actividad del FXa varió con la concentración del FIXa. Los resultados de este análisis se muestran en la tabla 5, y la FIG. 6. Como demuestra la tabla 5, la variante Var97 tiene una tasa mejorada de activación del FX a diferencia de los polipéptidos wt-FVIII o FVIII-BDD. Además, la FIG. 6 ilustra que la variante Var97 muestra una afinidad de unión aumentada para FIXa. De hecho, Var97 muestra afinidad de unión al menos 4 veces mayor para FIXa que el polipéptido FVIII-BDD.

Tabla 5:

Vmax (nM/segundo) eem Km (nM) eem Kcat (s-1) eem

Var97

0,325 0,007 16,770 1,554 3,25 0,067

D519VE665V-FVIII

0,186 0,003 10,990 0,894 1,859 0,031

FVIII-BDD

0,147 0,002 9,493 0,779 1,472 0,023

Se puede analizar la turbidez de una solución de coagulación en un curso de tiempo para investigar la cinética de coagulación y la estructura de un coágulo resultante. Previamente se ha demostrado que se pueden inducir los cambios en la turbidez frente al perfil de tiempo durante la coagulación mediante la bajada de la concentración de factores de coagulación en comparación con los niveles fisiológicos y, además, que dichos cambios en el perfil de turbidez correlaciona con cambios en la estructura de fibrina del coágulo. Véase, por ejemplo, Weisel y Nagsawami, Biophys. J., 63:111-28 (1992). Se realizaron análisis de turbidez como se describe por Weisel y Nagsawami utilizando plasma normal, plasma deficiente en FVIII o plasma deficiente en FVIII que contiene 50 mU/ml de diversas variantes del factor VIII. Tal como se muestra en la FIG. 7, la introducción de 50 mU/ml de BDD o D519VE665V en plasma deficiente en FVIII produjo un perfil de turbidez (unidades de absorbancia [UA] frente a tiempo [segundos]) que difiere del suero normal; el aumento de la turbidez en estas dos variantes no fue tan rápido como se observó en la muestra de suero normal. Además de indicar que la cinética de coagulación de BDD y D519VE665V no es tan rápida como en suero normal, se sugiere que la presencia de 50 mU/ml de la variante bDd o D519VE665V puede producir una estructura y arquitectura de coágulo diferente a la que se produce durante la coagulación normal. Por el contrario, la introducción de 50 mU/ml de la variante del factor VIII Var97 produjo un perfil de turbidez que es bastante similar al de la muestra de suero normal, indicando que se parecen mucho la cinética de coagulación y la estructura del coágulo a la de un coágulo normal.

Como una caracterización adicional de la variante Var97, se realizó un estudio para comparar la capacidad de BDD

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y Var97 para proteger frente a la muerte por lesión vascular en ratones HemA. Se dosificaron ratones HemA con diferentes concentraciones de los diversos FVIII y 24 horas más tarde, se cortaron transversalmente las venas de la cola de los ratones HemA como se describe (Mei y col., Blood (2010) 116: 270-279.). Se controló la supervivencia de los ratones HemA durante 24 horas y se evaluó la eficacia de la variante del FVIII como supervivencia a las 24 horas. Luego se presentó la tasa de supervivencia en las diversas dosificaciones administradas (tanto en pg/kg como en Ul/kg) y se determinó la dosificación de BDD y Var97 requeridas para dar como resultado una supervivencia del 50 % (ED50) a partir del gráfico (FIG. 8 y tabla 6). Como se muestra, se logra una tasa de supervivencia del 50 % con una dosis ~ 2-3 veces menor con Var97 que con BDD. Esta se correlaciona bien con los resultados de las otras pruebas descritas en el presente documento, que indicó potencia mejorada de Var97 y estructura de coágulo mejorada producida por Var97.

Tabla 6:

ED50 (pg/kg) ED50 (UI/kg)

Var97

0,33 2,47

BDD

0,96 4,93

Diferencia

~ 3 veces ~ 2 veces

Los resultados cinéticos del FXasa (no mostrados) con FlXa variable y FVIIIa fijo sugirieron que la proteólisis podría explicar la actividad discrepante de ensayo aPTT frente al cromogénico de Var97. Para investigar la escisión de la variante de polipéptido del factor VIII, se visualizaron los cambios físicos en el FVIII en presencia de exceso del FlXa en una reacción de FXasa. Para la detección de la escisión del FVIIIa mediante FIXa presente en FXasa, se ajustaron polipéptidos del factor VIII que se están examinando a una concentración final de 0,1 pg/ml en el tampón de reacción Xasa estándar sin presencia de albúmina de suero bovino. Se añadió la solución FVIII (25 pL) a 5 pl de tampón o IXa 120 nM. Se dejaron incubar los reactivos a 37 °C durante 1 hora y se añadió tampón nupage 4X para detener la reacción. Luego se sometieron las muestras a SDS-PAGE, seguido de tinción con azul Coomassie (FIG. 9). Este análisis demostró que la variante del factor VIII Var97 muestra escisión proteolítica mejorada por el FIXa en relación con una o ambas de las variantes del FVIII BDD y D519VE665V.

Ejemplo 3: Caracterización de Var97-R336I

En un intento para reducir la escisión proteolítica mejorada de Var97, se hizo una sustitución adicional, R336I, en la cadena peptídica de Var97 (Var97-R336I; SEQ ID NO: 55). Esta es una sustitución en un sitio de escisión conocido por la proteína C activada (aPC). Como puede verse en la imagen del gel SDS-PAGE de la FIG. 9, en el ensayo de digestión del FIXa, se redujo marcadamente la escisión proteolítica de Var97-R336I en comparación con Var97.

También se evaluó la potencia de la variante Var97-R336I en la variante de coagulación mediante TGA utilizando factor tisular (TF) como iniciador, como se ha descrito anteriormente. Mediante TGA, Var97-R336I fue más potente que BDD, aunque algo menos potente que Var97 y D519VE665V (FIG. 10). Además, el perfil de trombina de Var97- R336I global fue, de nuevo, cualitativamente muy similar a BDD, D519VE665V y Var97, en el que se relacionó la tasa de retorno hacia los niveles de trombina basales con los niveles de trombina máxima (FIG. 10). Las comparaciones cuantitativas de la concentración de las variantes del factor VIII BDD, D519VE665V, Var97 y Var97- R336i necesarias para obtener una cantidad definida de trombina máxima indicaron que Var97-R336I fue de potencia similar a D519VE665V-FVIII (FIG. 11).

Para caracterizar de forma adicional la variante Var97-R336l, se comparó el perfil de turbidez de esta variante con las otras variantes, así como con el control de suero normal, como se ha descrito anteriormente. Tal como se muestra en la FIG. 7, el perfil de turbidez de la variante Var97-R336I se asemeja mucho al de las variantes BDD y D519VE665V, indicando una cinética de coagulación y una estructura de coágulo similares.

Las variantes de polipéptido descritos en el presente documento, incluyendo Var97, tienen aplicación para una diversidad de indicaciones clínicas. Para hemofilia A, se podría utilizar dicha molécula con un perfil de respuesta de trombina rápido y mejorado de forma aguda o profiláctica, con rutas de administración iv o sc. También podrían utilizarse estas variantes para tratar otros trastornos hemorrágicos, ya sea que surja de un defecto de plaquetas o de coagulación. En los casos de defectos en hemostasia mediada por plaquetas, ya sea debido a insuficiencia en el número o respuesta de plaquetas, podría compensarse potencialmente la capacidad mejorada de estas variantes para generar trombina mediante la mejora de la actividad plaquetaria y mediante la proporción de más "pegamento" de fibrina para contener el tapón plaquetario necesario para la hemostasia efectiva.

Además de la hemofilia y otros trastornos hemostáticos, la capacidad de estas variantes para obtener dicha respuesta rápida de trombina sugiere una posible utilidad en más situaciones agudas, tales como traumatismo y cirugía. En estas configuraciones, podría ser una ventaja la rapidez y "firmeza" con que estas variantes pueden soportar una respuesta de trombina, con un impacto mínimo en los mecanismos que regulan los niveles de trombina. En estas configuraciones, podrían administrarse estas variantes en una variedad de maneras, incluyendo iv, sc y tópica, ya sea en forma de pulverizador o empapadas en matrices, tales como colágeno o esponjas quirúrgicas. Otras indicaciones en las que estas variantes podrían tener utilidad incluyen el tratamiento de síndromes

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hemorrágicos, tales como fiebre hemorrágica del dengue, en la que la permeabilidad vascular masiva, la función plaquetaria alterada y la fibrinólisis mejorada pueden dar como resultado hemorragias internas que ponen en peligro la vida.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Bayer HealthCare Gritzan, Uwe Leong, Lilley Patel, Chandra Kretschmer, Peter

<120> variantes de polipéptido DEL FACTOR VIII Y PROCEDIMIENTOS PARA SU PRODUCCIÓN Y UTILIZACIÓN

<130> BHC125004

<160> 56

<170> Versión 3.5 de PatentIn

<210> 1 <211> 2332 <212> PRT <213>Homo sapiens

<400> 1

imagen1

Claims (4)

1. Una variante de un polipéptido del factor VIII, en la que dicha variante es un factor VIII funcional que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53.

2. La variante de la reivindicación 1, en la que dicha variante tiene además la sustitución de aminoácido R336I.

5 3. Una composición farmacéutica que comprende la variante de polipéptido del factor Vlll de una cualquiera de las

reivindicaciones 1 o 2 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

4. Un ácido nucleico aislado que codifica la variante de polipéptido del factor VIII de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

5. Una célula hospedadorarecombinante que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 4.

10 6. Una variante de un polipéptido del factor VIII de cualquiera de la reivindicaciones 1 o 2 o la composición

farmacéutica de la reivindicación 3 para su uso en la prevención o tratamiento de un trastorno hemorrágico.

Factor sobre el tipo salvaje

Actividad específica de variantes del FVIII mediante aPTT

imagen1

imagen2

imagen3

Var97

Perfiles de trombina para BDD, D519VE665V y Var97:

1.3 U m derive de FV

Cinética

300

de inactivación

•100

-100

Tiempo (min.)

BDD

D519VE66SV

FIG. 3

imagen4

Comparación de D519VE665V o Var97 con BDD mediante masa:

Trombina maxima; con TF 1 pM - fosfohpidos de iniciación 4 pM

400

@

Var97

05

m

*

BDD

nM

D519VE565V

/<&

nM

1

1e-6 1e-6 1e-4 1e-3 le.-2 1e-1 1e+0 1e+1 1e+2

FVIII (nM

•------ BDD

■------D519VE66SV

A,.— Var97

FIG. 4

Tasa máxima de cambio de turbidez (UA)

FIG. 5

Formación de coágulos con unidades ¡guales de moléculas del FVIII: APTT-SP; Tasa máxima de cambio de turbidez

imagen5

imagen6

Tiempo (min.)

-------------- 500 rnll/ml BDD

-------------- 500 mU/ml D519VE665V

-------------- 500 mU/ml Var97

--------------50 mU/ml Var97

imagen7

Turbidez (UA)

FIG. 7

Máximo de turbidez reducido con Var97 consistente con alta respuesta de generación de trombina

350 t-------------------------------------------------------------------------------

300-

250-

200-

150-

100-

50 H-----------1-----------1-----------1-----------1------------1------------1-----------

0 20 40 60 80 100 120 140

Tiempo (s)

................ normal

.................... Plasma deficiente en FVIII, sin FVIII

----------------- + 5 % de BDD

-----------------+5%deD519VE665V

-----------------+ 5 % de Var97

-----------------+ 5 % de Var97R336l

imagen8

imagen9

imagen10

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BD D519VE66 Var9 Var97Ft33

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188 kDa*

98 kDa

62 kDa

49 kDa

38 kDa':

FIG. 9

imagen11

sobre la generación de trombina:

Comparación 0,1 nM

zou

200

Actividad para 100 pM (U/ml)

Proteina

0,10

BDD

D619VE66SV

[HKB)

0,26

Var97

Var97-R336l

0,14

Tiempo (min.)

D519VE665V

Var97

Var97R336l

FIG. 10

imagen12

300

ED60:

CUSO

0,3

0,03 nPíT

<5 200

ED50:

ZA MM

0,0001

0,001

FVIII (nM)

O HDD • D519VÉ60SV ■ Vsi97 A Var97F¡336l

FIG. 11