EA045357B1 - Прогемостатические белки для лечения кровотечений - Google Patents
Прогемостатические белки для лечения кровотечений Download PDFInfo
- Publication number
- EA045357B1 EA045357B1 EA202190813 EA045357B1 EA 045357 B1 EA045357 B1 EA 045357B1 EA 202190813 EA202190813 EA 202190813 EA 045357 B1 EA045357 B1 EA 045357B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- amino acid
- acid residues
- seq
- factor
- fxa
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 94
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 94
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 title claims description 16
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 194
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 claims description 141
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 51
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 51
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 49
- QNZCBYKSOIHPEH-UHFFFAOYSA-N Apixaban Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1N1C(C(=O)N(CC2)C=3C=CC(=CC=3)N3C(CCCC3)=O)=C2C(C(N)=O)=N1 QNZCBYKSOIHPEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 47
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 45
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 45
- 229960003886 apixaban Drugs 0.000 claims description 44
- KGFYHTZWPPHNLQ-AWEZNQCLSA-N rivaroxaban Chemical compound S1C(Cl)=CC=C1C(=O)NC[C@@H]1OC(=O)N(C=2C=CC(=CC=2)N2C(COCC2)=O)C1 KGFYHTZWPPHNLQ-AWEZNQCLSA-N 0.000 claims description 28
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 25
- 229960001148 rivaroxaban Drugs 0.000 claims description 25
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 24
- HGVDHZBSSITLCT-JLJPHGGASA-N Edoxaban Chemical compound N([C@H]1CC[C@@H](C[C@H]1NC(=O)C=1SC=2CN(C)CCC=2N=1)C(=O)N(C)C)C(=O)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C=N1 HGVDHZBSSITLCT-JLJPHGGASA-N 0.000 claims description 21
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 20
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 20
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 18
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 18
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 16
- 229960000622 edoxaban Drugs 0.000 claims description 16
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 claims description 15
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 15
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 claims description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 15
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 14
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 13
- 229940123688 Direct Factor Xa inhibitor Drugs 0.000 claims description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 11
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 11
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 10
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 10
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 10
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 claims description 9
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 7
- XHOLNRLADUSQLD-UHFFFAOYSA-N betrixaban Chemical compound C=1C=C(Cl)C=NC=1NC(=O)C1=CC(OC)=CC=C1NC(=O)C1=CC=C(C(=N)N(C)C)C=C1 XHOLNRLADUSQLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229950011103 betrixaban Drugs 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 claims description 5
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 5
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 5
- JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N toluene-4-sulfonic acid Chemical compound CC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 JOXIMZWYDAKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- YIKSCQDJHCMVMK-UHFFFAOYSA-N Oxamide Chemical compound NC(=O)C(N)=O YIKSCQDJHCMVMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- DENPQNAWGQXKCU-UHFFFAOYSA-N thiophene-2-carboxamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CS1 DENPQNAWGQXKCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- -1 5 -methyl-6,7-dihydro-4H-[1,3]thiazolo[5,4-c]pyridin-2carbonyl Chemical group 0.000 claims 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 claims 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 94
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 84
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 description 59
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 46
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 45
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 45
- 229940019332 direct factor xa inhibitors Drugs 0.000 description 40
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 39
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 30
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 24
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 23
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 21
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 21
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 20
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 20
- 102100029117 Coagulation factor X Human genes 0.000 description 19
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 17
- 229940105756 coagulation factor x Drugs 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 229940127066 new oral anticoagluant drug Drugs 0.000 description 16
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 108010074105 Factor Va Proteins 0.000 description 13
- 241000272132 Pseudonaja textilis Species 0.000 description 13
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 241000894007 species Species 0.000 description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 12
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 10
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 10
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 10
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 10
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 9
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 9
- 101000918470 Homo sapiens Coagulation factor X Proteins 0.000 description 9
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 9
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 8
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 8
- 101001052793 Homo sapiens GDP-L-fucose synthase Proteins 0.000 description 8
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 8
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 8
- 102000050085 human TSTA3 Human genes 0.000 description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 7
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 7
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 7
- 239000000729 antidote Substances 0.000 description 7
- 239000003130 blood coagulation factor inhibitor Substances 0.000 description 7
- 229940099813 human coagulation factor x Drugs 0.000 description 7
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 7
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 6
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 6
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 6
- 108090000040 Russellysin Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 5
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 5
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 5
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 229940024790 prothrombin complex concentrate Drugs 0.000 description 5
- 108010014806 prothrombinase complex Proteins 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101800001401 Activation peptide Proteins 0.000 description 4
- 102400000069 Activation peptide Human genes 0.000 description 4
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 4
- 229940075522 antidotes Drugs 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N coumarin Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 4
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 4
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 4
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 241000271032 Daboia russelii Species 0.000 description 3
- 101001030665 Dictyostelium discoideum GDP-L-fucose synthase Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100008681 Glycine max DHPS1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108010054964 H-hexahydrotyrosyl-alanyl-arginine-4-nitroanilide Proteins 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000272115 Notechis scutatus Species 0.000 description 3
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 3
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 3
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 3
- 108010059382 Zea mays trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 3
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002821 viper venom Substances 0.000 description 3
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 3
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 229940019333 vitamin k antagonists Drugs 0.000 description 3
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 3
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003462 zymogenic effect Effects 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 2
- 102100035233 Furin Human genes 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 2
- 208000022120 Jeavons syndrome Diseases 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010018682 PRT064445 Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 229960002054 acenocoumarol Drugs 0.000 description 2
- VABCILAOYCMVPS-UHFFFAOYSA-N acenocoumarol Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 VABCILAOYCMVPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 229950002054 andexanet alfa Drugs 0.000 description 2
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229960000956 coumarin Drugs 0.000 description 2
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 2
- 229960003850 dabigatran Drugs 0.000 description 2
- YBSJFWOBGCMAKL-UHFFFAOYSA-N dabigatran Chemical compound N=1C2=CC(C(=O)N(CCC(O)=O)C=3N=CC=CC=3)=CC=C2N(C)C=1CNC1=CC=C(C(N)=N)C=C1 YBSJFWOBGCMAKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJNIQYINMSGIPS-UHFFFAOYSA-N darexaban Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(=O)NC1=CC=CC(O)=C1NC(=O)C1=CC=C(N2CCN(C)CCC2)C=C1 IJNIQYINMSGIPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- QQBKAVAGLMGMHI-WIYYLYMNSA-N eribaxaban Chemical compound N1([C@H](C[C@H](C1)OC)C(=O)NC=1C(=CC(=CC=1)N1C(C=CC=C1)=O)F)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C=C1 QQBKAVAGLMGMHI-WIYYLYMNSA-N 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000000111 isothermal titration calorimetry Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000003055 low molecular weight heparin Substances 0.000 description 2
- 229940127215 low-molecular weight heparin Drugs 0.000 description 2
- 238000001768 microscale thermophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940127216 oral anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 229960004923 phenprocoumon Drugs 0.000 description 2
- DQDAYGNAKTZFIW-UHFFFAOYSA-N phenprocoumon Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC)C1=CC=CC=C1 DQDAYGNAKTZFIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 108010071286 prethrombins Proteins 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 108010013773 recombinant FVIIa Proteins 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N serine Chemical compound OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012032 thrombin generation assay Methods 0.000 description 2
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-UPWJBAEMSA-N (1s,3r,4e,6e,8e,10e,12e,14e,16e,18s,19r,20r,21s,25r,27r,30r,31r,33s,35r,37s,38r)-3-(4-amino-3,5-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxy-19,25,27,30,31,33,35,37-octahydroxy-18,20,21-trimethyl-23-oxo-22,39-dioxabicyclo[33.3.1]nonatriaconta-4,6,8,10,12,14,16-heptaen Chemical compound OC1C(N)C(O)C(C)OC1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-UPWJBAEMSA-N 0.000 description 1
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- GEHAEMCVKDPMKO-HXUWFJFHSA-N 1-[1-[(2s)-3-(6-chloronaphthalen-2-yl)sulfonyl-2-hydroxypropanoyl]piperidin-4-yl]-1,3-diazinan-2-one Chemical compound O=C([C@@H](CS(=O)(=O)C=1C=C2C=CC(Cl)=CC2=CC=1)O)N(CC1)CCC1N1CCCNC1=O GEHAEMCVKDPMKO-HXUWFJFHSA-N 0.000 description 1
- GNENVASJJIUNER-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-tricyclohexyloxy-1,3,5,2,4,6-trioxatriborinane Chemical compound C1CCCCC1OB1OB(OC2CCCCC2)OB(OC2CCCCC2)O1 GNENVASJJIUNER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940127062 3-factor PCC Drugs 0.000 description 1
- ZFJJCZXQIIVEKF-UHFFFAOYSA-N 4,5,6,7-tetrahydro-1h-pyrazolo[3,4-c]pyridine-3-carboxamide Chemical compound C1NCCC2=C1NN=C2C(=O)N ZFJJCZXQIIVEKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940127063 4-factor PCC Drugs 0.000 description 1
- 101150054177 Acot8 gene Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N Alanine Chemical compound CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003658 Atrial Fibrillation Diseases 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010038061 Chymotrypsinogen Proteins 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 101710164762 Coagulation factor X isoform 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710164765 Coagulation factor X isoform 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 229940122564 Factor X inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 229940123583 Factor Xa inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 206010016948 Food interaction Diseases 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 1
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000651439 Homo sapiens Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101100107938 Mus musculus Acot3 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004353 Polyethylene glycol 8000 Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241001522306 Serinus serinus Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 241000201656 Trichalophus rubripes Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710181904 Venom factor Proteins 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 229940127508 Vitamin K Inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000000468 autoproteolytic effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N carboxyglutamic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000007820 coagulation assay Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950004553 darexaban Drugs 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000000612 dual polarization interferometry Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229950007830 eribaxaban Drugs 0.000 description 1
- 208000005376 factor X deficiency Diseases 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000004023 fresh frozen plasma Substances 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 1
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940039715 human prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 229950001775 letaxaban Drugs 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- OVYUVJUNBVSPBC-IBGZPJMESA-N methyl n-cyclohexyl-n-[2-[[2-[[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-2-oxoethyl]carbamate Chemical compound O=C([C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)CNC(=O)CN(C(=O)OC)C1CCCCC1)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 OVYUVJUNBVSPBC-IBGZPJMESA-N 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- VYNKVNDKAOGAAQ-UHFFFAOYSA-N n-[2-[4-(1-methylpiperidin-4-yl)piperazin-1-yl]-2-oxo-1-phenylethyl]-1h-indole-6-carboxamide Chemical compound C1CN(C)CCC1N1CCN(C(=O)C(NC(=O)C=2C=C3NC=CC3=CC=2)C=2C=CC=CC=2)CC1 VYNKVNDKAOGAAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- PFGVNLZDWRZPJW-OPAMFIHVSA-N otamixaban Chemical compound C([C@@H](C(=O)OC)[C@@H](C)NC(=O)C=1C=CC(=CC=1)C=1C=C[N+]([O-])=CC=1)C1=CC=CC(C(N)=N)=C1 PFGVNLZDWRZPJW-OPAMFIHVSA-N 0.000 description 1
- 229950009478 otamixaban Drugs 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 125000004482 piperidin-4-yl group Chemical group N1CCC(CC1)* 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229940085678 polyethylene glycol 8000 Drugs 0.000 description 1
- 235000019446 polyethylene glycol 8000 Nutrition 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 108010012557 prothrombin complex concentrates Proteins 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000012313 reversal agent Substances 0.000 description 1
- 229940011622 savaysa Drugs 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940055725 xarelto Drugs 0.000 description 1
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к области медицинского лечения. В частности, настоящее изобретение относится к области лечения, предотвращения или облегчения осложнений в виде кровотечений, возникающих в результате измененного гемостатического ответа.
Уровень техники
Миллионы пациентов по всему миру нуждаются в противосвертывающих лекарственных средствах (антикоагулянтах) для профилактики инсульта при фибрилляции предсердий или предотвращения и лечения тромбоза вен. Основным средством профилактики традиционно являются пероральные антикоагулянты на основе кумарина, являющиеся антагонистами витамина K (VKA, АВК), такие как варфарин, аценокумарол и фенпрокумон, которые блокируют синтез факторов свертывания крови, зависимых от витамина K. Другие антикоагулянты включают мишень-специфичные антикоагулянты, такие как дабигатран, которые ингибируют фермент тромбин, являющийся сериновой протеазой, превращающей растворимый фибриноген в нерастворимые нити фибрина. Эффективное обращение антикоагулянтного эффекта с использованием так называемого антидота является необходимым условием для безопасного применения лекарственного средства. Это особенно важно с учетом того, что, только в Нидерландах, ежегодно более 10 000 пациентов, получающих лечение антикоагулянтами, страдают от тяжелых эпизодов кровотечения, включающих до 2 000 смертельных исходов (Adriaansen H., с соавт.: Samenvatting Medische Jaarverslagen van de Federatie van Nederlandse Trombosediensten, 2011; 1-44).
Доступными на данный момент парами антикоагулянт-антидот для предотвращения чрезмерного антикоагулянтного эффекта являются гепарин-протамин и варфарин-витамин K. Концентраты протромбинового комплекса (КПК, РСС), содержащие зависимые от витамина K факторы свертывания II, IX, X (трехфакторный КПК) или II, VII, IX, X (четырехфакторный КПК), и различные количества белков С и S назначают для обращения связанных с варфарином эффектов (см., например, Frumkin, Ann Emerg Med, 2013, 62: 616-626). Свежезамороженную плазму и рекомбинантный фактор VIIa (rfVIIa) также применяют в качестве неспецифических антидотов у пациентов с обширной травмой или тяжелым кровотечением, получающих лечение низкомолекулярным гепарином (Lauritzen ссоавт., 2005. Blood 106: Abstract 2149, 607А-608А). Также описаны фрагменты протамина (патент США № 6,624,141) и небольшие синтетические пептиды (патент США № 6,200,955) в качестве антидотов к гепарину или низкомолекулярному гепарину, а также мутеины тромбина (патент США № 6,060,300) в качестве антидотов к ингибиторам тромбина. Сообщалось о промежуточных соединениях и производных протромбина в качестве антидотов к гирудину и другим ингибиторам тромбина (патенты США №№ 5,817,309 и 6,086,871). Несмотря на отсутствие надежных клинических данных, связанные с дабигатраном тяжелые кровотечения обычно лечат неспецифичным препаратом обратного действия - концентратом активированного протромбинового комплекса (АРСС) (Siegal с соавт., 2014. Blood 123: 1152-1158).
Разработанные недавно прямые ингибиторы фактора Ха (FXa) (DFXI), такие как ривароксабан, апиксабан и эдоксабан, являются антикоагулянтами и могут в недалеком будущем в значительной степени заменить классические ингибиторы витамина К благодаря своему быстрому терапевтическому действию, простоте введения и отсутствию необходимости в мониторинге, обусловленному более слабому взаимодействию между лекарственным средством и пищей и предсказуемой фармакокинетике. Прямые ингибиторы фактора Ха представляют собой низкомолекулярные ингибиторы, которые были специально разработаны для сильного связывания с фактором свертывания крови Ха и блокировки его активности. Фактор свертывания крови Ха является важнейшей сериновой протеазой, которая в норме присутствует в циркулирующей крови в виде неактивного предшественника массой ~60 КДа (зимогена) фактора свертывания X (FX), но после повреждения сосуда переходит в форму активной протеазы в результате сложной последовательности этапов активации белка, которая носит общее названия каскада свертывания крови. Основным для этой системы является образование комплекса кофактор-протеаза, известного как протромбиназный комплекс, который состоит из фактора свертывания крови Ха, связанного с кофакторным фактором Va (FVa), который собирается только на отрицательно заряженной фосфолипидной мембране и преобразует неактивный протромбин в активную сериновую протеазу тромбин.
Основным недостатком применения прямых ингибиторов фактора Ха (DFXI) является отсутствие стратегии специфичного и адекватного обращения их эффекта для предотвращения и остановки потенциальных жизнеугрожающих осложнений в виде кровотечений, связанных с их применением в антикоагулянтной терапии.
Поскольку прямые ингибиторы фактора Ха связывают как свободный фактор свертывания крови Ха, так и связанный с протромбиназой фактор свертывания крови Ха (Европейское агентство по лекарственным средствам, 2008, отчет по оценке препарате Ксарелто (Xarelto) Комитета по лекарственным препаратам для медицинского применения (СНМР), процедура № ЕМЕА/Н/С/000944. Номер документа: ЕМЕА/543519/2008), для эффективного восстановления гемостаза необходима либо полная замена циркулирующего фактора свертывания крови FXa, либо эффективное удаление ингибиторных соединений из крови.
В настоящее время не существует стратегий специфичного обращения для предотвращения и остановки потенциальных жизнеугрожающих осложнений в виде кровотечений, связанных с доступной те- 1 045357 рапией с применением DFXI. Наряду с жизнесохраняющими и хирургическими терапевтическими средствами на основании ограниченных свидетельств может рассматриваться неспецифическая обращающая терапия с применением 3-факторного и 4-факторного КПК (Siegal с соавт., 2014. Blood 123: 1152-1158; Levi с соавт., 2014. J Thrombosis Haemostatis, опубликовано онлайн 8 мая 2014 г.; doi: 10.1111/jth. 12599). Разрабатывается обращающая стратегия, специфичная для кровотечений, связанных с прямыми ингибиторами фактора Ха, которая основана на каталитически неактивной форме рекомбинантного FXa (андексанет альфа), которая служит приманкой для прямых ингибиторов фактора Ха, связывая и удерживая циркулирующие прямые ингибиторы фактора Ха, обеспечивая, таким образом возможность эндогенному фактору свертывания крови Ха нормально участвовать в свертывании крови (Lu с соавт., 2013. Nature Medicine 19: 446). Недостатком этого подхода является необходимость вводить высокие дозы андексанета альфа, обусловленная тем, что для достижения ингибирования необходимы стехиометрические концентрации (IV болюс 400 мг в испытаниях III фазы; новостной релиз компании Portola, 19 марта 2014 г.). Кроме того, поскольку время полужизни прямых ингибиторов фактора Ха частично зависит от почечного клиренса, количество фактора FXa-приманки, необходимое для захвата всех циркулирующих ингибиторных молекул, при почечной недостаточности может быть еще более высоким. Эта стратегия обращения не обеспечивает быстрого и прямого прокоагулянтного ответа, поскольку ответ зависит от образования свободного эндогенного фактора свертывания крови Ха.
В настоящее время не существует доступной адекватной стратегии прямого обращения для предотвращения и остановки потенциальных жизнеугрожающих осложнений в виде кровотечений, связанных с антикоагулянтной терапией с применением DFXI.
Настоящее изобретение решает эту задачу за счет применения в качестве адекватной стратегии обращения для предотвращения и остановки потенциальных жизнеугрожающих осложнений в виде кровотечений, связанных с антикоагулянтной терапией с применением DFXI, рекомбинантного белка, содержащего или состоящего из полипептида фактора свертывания крови Ха млекопитающего, предпочтительно примата, более предпочтительно, человека, причем указанный полипептид содержит изменение в области аминокислотных остатков, соответствующей области аминокислотных остатков между Gly-289 и sp-320 последовательности SEQ ID NO: 1, предпочтительно между Glu-297 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO:1, более предпочтительно между Val-305 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO:1, и наиболее предпочтительно между His-311 и Asp-320 или между His-311 и Tyr-319 последовательности SEQ ID NO: 1, при этом указанное изменение представляет собой вставку и/или замену и/или делецию по меньшей мере одного аминокислотного остатка, предпочтительно вставку по меньшей мере одного аминокислотного остатка. В целях ясности, нумерация аминокислотных остатков основана на аминокислотной последовательности человеческого фактора свертывания крови X, представленной в SEQ ID NO: 1.
Было обнаружено, что каталитически активный человеческий фактор свертывания крови Ха с измененным аминокислотным составом в области между Gly и Asp, соответствующими Gly-289 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1, участвует в каскаде свертывания в качестве прокоагулянта и благодаря этому указанный фактор обладает более низкой чувствительностью к ингибиторам фактора свертывания Ха, чем фактор свертывания крови Ха без указанного изменения аминокислотного состава. Согласно настоящему изобретению предложен прокоагулянтный антидот, который не зависит от образования свободного, эндогенного фактора свертывания крови Ха и обеспечивает стратегию прямого обращения для предотвращения и остановки потенциальных жизнеугрожающих осложнений, связанных с антикоагулянтной терапией с применением DFXI.
Аминокислотная последовательность человеческого фактора свертывания крови X приведена как SEQ ID NO: 1 и ее можно найти в базе данных GENBANK® под номером ААН46125.1 по адресу <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/AAH46125.1>. Нумерация аминокислотных остатков в этой последовательности основана на последовательности человеческого фактора свертывания крови X (FX). Фактор свертывания крови X с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1, представляет собой предшественник, содержащий препролидерную последовательность (аминокислотные остатки с 1 по 40 последовательности SEQ ID NO: 1), за которой следуют последовательности, соответствующие легкой цепи фактора свертывания крови X (аминокислотные остатки с 41 по 179 последовательности SEQ ID NO: 1), триплет RKR (аминокислотные остатки с 180 по 182 последовательности SEQ ID NO: 1), который удаляется в ходе секреции фактора свертывания крови X, и тяжелой цепи фактора свертывания крови X (аминокислотные остатки с 183 по 488 последовательности SEQ ID NO: 1), содержащей пептид активации (АР) (аминокислотные остатки с 183 по 234 последовательности SEQ ID NO: 1) и каталитический домен с активностью сериновой протеазы (аминокислотные остатки с 235 по 488 последовательности SEQ ID NO: 1).
Созревание человеческого фактора свертывания крови X включает, среди прочего, протеолитическое расщепление и посттрансляционную модификацию в аппарате Гольджи. Зрелый белок FX представляет собой молекулу из двух цепей, состоящую из тяжелой и легкой цепей, которые связаны дисульфидной связью (Uprichard с соавт., 2002. Blood Reviews 16: 97-110). Зрелый человеческий фактор свертывания крови X активируется в результате расщепления пептидной связи на тяжелой цепи между Arg234 и IIe-235 последовательности SEQ ID NO: 1, в результате чего из тяжелой цепи фактора свертывания
- 2 045357 крови X высвобождается пептид активации из 52 остатков. Образовавшиеся связанные дисульфидной связью легкая цепь и укороченная тяжелая цепь составляют активированный полипептид FXa.
Аминокислотная последовательность легкой цепи человеческого фактора свертывания крови Ха представлена в SEQ ID NO: 2. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи человеческого фактора свертывания крови Ха представлена в SEQ ID NO: 3.
Термин рекомбинантный в настоящем документе относится к белку, который получают с использованием технологий рекомбинантной ДНК, известных специалистам в данной области. Рекомбинантный фактор свертывания крови X или полипептид FXa также обозначается как rFX (pFX) или rFXa (pFXa). В предпочтительном варианте рекомбинантный белок не идентичен нативному белку, например, вследствие различий аминокислотного состава и/или вследствие различий в посттрантрансляционной модификации, такой как гликозилирование.
Термин изменение в настоящем документе относится к вставке и/или замене и/или делеции по меньшей мере одного аминокислотного остатка. В предпочтительном варианте указанное изменение представляет собой вставку по меньшей мере одной аминокислоты.
Выражение рекомбинантный белок, содержащий полипептид фактора свертывания крови Ха в настоящем документе охватывает белок, который содержит рекомбинантный полипептид фактора свертывания крови Ха, предпочтительно происходящий из организма млекопитающего, более предпочтительно примата, и наиболее предпочтительно человека. Это выражение включает, например, рекомбинантный белок-предшественник млекопитающего, такой как человеческий фактор свертывания крови X, который в результате процессинга и/или активации превращается в полипептид рекомбинантного фактора свертывания млекопитающего rFXa. Соответственно, в предпочтительном варианте белок согласно настоящему изобретению представляет собой рекомбинантный фактор свертывания крови X млекопитающего, предпочтительно примата, более предпочтительно человека, содержащий вставку и/или замену и/или делецию, предпочтительно вставку, по меньшей мере одного аминокислотного остатка в области аминокислотных остатков, соответствующей области аминокислотных остатков между Gly-289 и Asp320 последовательности SEQ ID NO: 1, предпочтительно между Glu-297 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO:1, более предпочтительно между Val-305 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO:1 и наиболее предпочтительно между His-311 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1. Дополнительно указанное выражение охватывает белок, который содержит одну или больше дополнительных аминокислотных последовательностей, помимо полипептида фактора свертывания rFXa, например аминокислотные последовательности, которые образуют метку, например метку FLAG, описанную в ЕР0150126, и/или один или больше идентифицирующих пептидов.
Соответственно, в одном варианте реализации рекомбинантный белок, содержащий полипептид фактора свертывания крови Ха согласно настоящему изобретению представляет собой полипептид фактора свертывания X, причем указанный полипептид содержит изменение в области аминокислотных остатков, соответствующей области аминокислотных остатков между Gly-289 и Asp-320, предпочтительно между His-311 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1; где указанное изменение представляет собой вставку по меньшей мере одного аминокислотного остатка.
Термин фактор свертывания крови X (FX) в настоящем документе относится к неактивному белку-предшественнику фактора свертывания крови X. Специалисту известно, что фактор свертывания крови X называется также препробелком FX. В настоящем документе фактор свертывания крови X содержит полипептид фактора свертывания крови Ха.
Термин зрелый фактор свертывания крови X в настоящем документе относится к неактивному белку фактора свертывания крови X, который состоит из легкой и тяжелой цепи, которые связаны с дисульфидной связью. Этот белок FX также называется препробелком фактора X (препробелком FX) или зимогеном фактора X (зимогеном FX). В настоящем документе зрелый фактор свертывания крови X содержит полипептид фактора свертывания крови Ха.
В предпочтительном варианте белок согласно настоящему изобретению содержит или представляет собой полипептид фактора свертывания крови Ха млекопитающего, предпочтительно примета, более предпочтительно человеческий или гуманизированный полипептид фактора свертывания крови Ха, содержащий вставку и/или замену и/или делецию, предпочтительно вставку, по меньшей мере одного аминокислотного остатка в области аминокислотных остатков, соответствующей области аминокислотных остатков между Gly-289 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1.
Термин гуманизированнный в настоящем документе относится к замене или гуманизации предпочтительно внешних аминокислотных остатков белка одного вида на аминокислотные остатки, которые присутствуют в человеческом гомологе этого белка, благодаря чему белки первого вида будут неиммуногенными или менее иммуногенными при введении человеку. Замена внешних остатков в предпочтительном варианте незначительно влияет или не влияет на внутренние домены, или на междоменные контакты между легкой и тяжелой цепями. Белок согласно настоящему изобретению нечеловеческого происхождения, предпочтительно происходящий из организма млекопитающего, более предпочтительно, происходящий из организма примета, в предпочтительном варианте гуманизируют для снижения иммуногенности указанного белка в организме человека.
- 3 045357
В предпочтительном варианте не являющийся человеческим белок согласно настоящему изобретению содержит гуманизированный полипептид фактора свертывания крови Ха млекопитающего, более предпочтительно примата, поскольку ожидается, что риск антигенного ответа после введения в организм человека будет ниже, чем в случае белка согласно настоящему изобретению, содержащего негуманизированный полипептид фактора свертывания крови Ха.
В контексте гуманизированных белков, следует обратить внимание на способ гуманизации, применяемый для антител. В этом способе используют доступную информацию о последовательностях вариабельных доменов человеческих антител, содержащуюся в Kabat с соавт. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed., Bethesda, Md., National Institutes of Health, обновлениях этой базы данных и других доступных базах данных (как нуклеиновых кислот, так и белков) США и других стран. Неограничивающие примеры способов, применяемых для получения гуманизированных антител, включают ЕР 519596, патент США № 6,797,492 и описанные в работе Padlan с соавт., 1991. Mol Immunol 28: 489-498. Дополнительные примеры способов гуманизации белков, не являющихся белками человека, приведены в статье Sarkar с соавт., 2012, Journal of Lipids, Article ID 610937, стр. 1-13, где описано, что параоксаназу 1 успешно гуманизировали путем изменения поверхности фермента для имитации последовательности человека.
Термин полипептид фактора свертывания крови Ха относится к каталитически активной форме фактора свертывания крови X. Указанный полипептид фактора свертывания крови Ха образуется в результате отщепления пептида активации от тяжелой цепи зрелого фактора свертывания крови X. Полипептид фактора свертывания крови Ха активирует протромбин, и, за счет этого, стимулирует свертывание крови. В контексте настоящего изобретения белок является полипептидом фактора свертывания крови Ха, если он является прокоагулянтной сериновой протеазой, и если полная аминокислотная последовательность указанного белка содержит участки последовательных аминокислотных остатков или отдельные аминокислотные остатки, которые соответствуют участкам последовательных аминокислотных остатков или отдельным аминокислотным остаткам, консервативным для факторов свертывания крови X у различных видов, как показано на фиг. 8. Например, предполагается, что прокоагулянтная сериновая протеаза, которая содержит отрезки последовательных аминокислотных остатков, которые соответствуют аминокислотным остаткам от Cys-246 до Ala-250, от Phe-260 до Leu-266 и/или от Asp413 до His-423 последовательности SEQ ID NO: 1, является полипептидом фактора свертывания крови Ха. Указанный полипептид фактора свертывания крови Ха в предпочтительном варианте получают путем местного и/или топического применения рекомбинантного белка согласно настоящему изобретению. Способы определения, является ли белок сериновой протеазой, известны в данной области, и включают сравнение последовательностей и применение наборов для детектирования протеаз, например, производства SigmaAldrich.
Термин полипептид фактора свертывания крови Ха млекопитающего в настоящем документе относится к полипептиду фактора свертывания крови Ха, который присутствует в качестве эндогенного в организме млекопитающего, предпочтительно, примата, более предпочтительно, человека.
Термин ингибитор свертывания крови в настоящем документе относится к противосвертывающему средству - антикоагулянту. Термин ингибитор свертывания включает (i) агенты, такие как гепарин, которые стимулируют активность антитромбина, (ii) пероральные антикоагулянты на основе кумарина, являющиеся антагонистами витамина K, такие как варфарин, аценокумарол и фенпрокумон и (iii) прямые ингибиторы фактора X (DFXI), но не ограничивается перечисленным.
Термин DFXI в настоящем документе относится к прямым ингибиторам фактора Ха, например, пероральным прямым ингибиторам FXa. DFXI представляют собой низкомолекулярные ингибиторы, которые связываются с фактором свертывания крови Ха и блокируют его активность. Группа DFXI включает следующие соединения, но не ограничивается ими: ривароксабан (5-хлор-N-[[(5S)-2-оксо-3-[4(3-оксо-4-морфолинил)фенил]-5-оксазолидинил]метил]-2-тиофенкарбоксамид), апиксабан (1-(4метоксифенил)-7-оксо-6-[4-(2-оксопиперидин-1-ил)фенил]-4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пиразоло[3,4с]пиридин-3-карбоксамид), эдоксабан (N'-(5-хлоропиридин-2-ил)-N-[(1S,2R,4S)-4-(диметилкарбамоил)-2[(5-метил-6,7-дигидро-4Н-[1,3]тиазоло[5,4-с]пиридин-2-карбонил)амино]циклогексил]оксамид; 4метилбензолсульфоновая кислота), бетриксабан (N-(5-хлоропиридин-2-ил)-2-[[4-(N,Nдиметилкарбамимидоил)бензоил]амино]-5-метоксибензамид), дарексабан Щ-[2-[[4-(гексагидро-4-метил1Н-1,4-диазепин-1-ил)бензоил]амино]-3-гидроксифенил]-4-метоксибензамид), отамиксабан(метил (2R,3R)-2-[(3-карбамимидоилфенил)метил]-3-[[4-(1-оксидопиридин-1-иум-4ил)бензоил]амино]бутаноат), эрибаксабан (2R,4R)-1-N-(4-хлорфенил)-2-N-[2-фтор-4-(2-оксопиридин-1 ил)фенил] -4-метоксипирролидин-1,2-дикарбоксамид), летаксабан (1-[ 1-[(2S)-3-(6-хлорнафталин-2ил)сульфонил-2-гидроксипропаноил]пиперидин-4-ил]-1,3-диазинан-2-он, LY517717 (N-[2-[4-(1метилпиперидин-4-ил)пиперазин-1-ил]-2-оксо-1-фенилэтил]-1Н-индол-6-карбоксамид) и 813893 (Nциклогексил-N-[2-[(4-метил-1,3-тиазол-2-ил)амино]-2-оксоэтил]фуран-2-карбоксамид). Термины
DOAC (прямой пероральный антикоагулянт) и DFXI в настоящем тексте используются взаимозаменяемо.
Термин гомологичный в настоящем документе относится к идентичности аминокислотной после- 4 045357 довательности между двумя аминокислотными последовательностями, выраженной как процентная доля от полной длины этих двух аминокислотных последовательностей. Идентичность последовательностей определяют путем сравнения идентичности отдельных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности с соответствующими аминокислотными остатками в другой аминокислотной последовательности.
Термин область в настоящем документе относится к отрезку из последовательных аминокислотных остатков, ограниченному двумя аминокислотными остатками. Нумерация аминокислотных остатков, применяемая в настоящем тексте, основана на аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.
Термин вставка или встроенный в настоящем документе относится к добавлению аминокислотных остатков в определенной области нативного полипептида фактора свертывания крови Ха, которое приводит к увеличению числа аминокислотных остатков в указанной области, по сравнению с числом аминокислотных остатков в этой области в нативном полипептиде фактора свертывания FXa.
Термин замена или замененная в настоящем документе относится к замене одного или более аминокислотных остатков в определенной области или в определенном сайте полипептида фактора свертывания Ха, что приводит к изменению аминокислотной последовательности, но не числа аминокислотных остатков в указанной области. Замена является результатом удаления какого-либо аминокислотного остатка с последующей вставкой другого аминокислотного остатка в том же положении.
Термин делеция или делетированный в настоящем документе относится к делеции одного или больше аминокислотных остатков в конкретной области или в конкретном сайте полипептида фактора свертывания Ха, в результате которой число аминокислотных остатков в указанной области указанного полипептида уменьшается.
Термин нативный полипептид фактора свертывания крови Ха в настоящем документе относится к эндогенному полипептиду фактора свертывания крови Ха, который присутствует в природных условиях в организме животного, предпочтительно в организме млекопитающего, более предпочтительно в организме примата, более предпочтительно в организме человека.
Термин аминокислотный состав в настоящем документе относится к аминокислотной последовательности и длине отрезка из последовательных аминокислотных остатков, где длина определяется числом аминокислотных остатков в этом отрезке.
Вставку, замену и/или делецию, предпочтительно вставку одного или больше аминокислотных остатков можно осуществить с использованием технологий рекомбинантной ДНК, которые хорошо известны специалистам в данной области. Например, специалист может применять технологии синтетической ДНК, ПЦР и молекулярного клонирования для получения рекомбинантных ДНК-конструктов, имеющих последовательность ДНК, которая кодирует белок согласно настоящему изобретению. Подходящие средства и методы описаны в источнике Green, Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL Press, 2012 г.
Выражение соответствующий области аминокислотных остатков между, например применительно к области аминокислотных остатков, соответствующей области аминокислотных остатков между His311 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1 в настоящем документе обозначает, что номер остатка консервативных (сохраняющихся) остатков His и Asp другого фактора свертывания крови Ха, соответствующих His-311 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1, может отличаться от номера остатка, присвоенному указанному остатку His и Asp в последовательности SEQ ID NO: 1 (см. фиг. 8 ). Различия в номерах аминокислотных остатков могут быть обусловлены, например, различиями в методе нумерации аминокислотных остатков. Также различия в номерах аминокислотных остатков могут быть обусловлены различиями между длиной полипептида фактора свертывания крови Ха и длиной человеческого полипептида фактора свертывания крови Ха, как показано на фиг. 8. Также аминокислотные остатки Gly289, Glu-297, Val-305 и Tyr-319, последовательности SEQ ID NO: 1 являются консервативными у полипептидов фактора свертывания крови Ха различных видов (см. фиг. 1 и 8). Соответственно, можно идентифицировать аминокислотные остатки, которые соответствуют указанным аминокислотным остаткам в другом полипептиде фактора свертывания крови Ха. Соответственно, для специалиста в данной области понятно, что нумерация аминокислотных остатков, применяемая в данном документе, не ограничивает настоящее изобретение, и применяется лишь в целях ясности.
Специалисту известно, как идентифицировать область аминокислотных остатков, которая соответствует области аминокислотных остатков между указанными консервативными аминокислотными остатками последовательности SEQ ID NO: 1, которые ограничивают область, описанную в настоящем документе. Если аминокислотные остатки 289-322 последовательности SEQ ID NO: 1 выровнять с соответствующими аминокислотными остатками в полипептидах фактора свертывания крови Ха различных видов, будет видно, что аминокислотные остатки в положениях 289, 297, 305, 311, 313, 314, 318, 319, 320 и 322 последовательности SEQ ID NO:1 консервативны, хотя и не идентичны в полипептидах фактора свертывания крови Ха различных видов, особенно у млекопитающих, причем Asp-322 последовательности SEQ ID NO: 1 представляет собой высококонсервативный каталитический остаток (Asp-102 в нумерации для химотрипсиногена; Bode с соавт., 1989. EMBO Journal 8: 3467-3475; Messier с соавт., 1996. Blood Coagulation and Fibrinolysis 7: 5-14 and figures 1 and 8).
- 5 045357
Благодаря высококонсервативной природе аминокислотных остатков в положениях Gly-289 и Asp320 последовательности SEQ ID NO: 1 и вокруг них, или в положениях соответствующих остатков Gly и Asp нечеловеческих факторов свертывания крови Ха, и вокруг них, специалист в данной области может идентифицировать область аминокислотных остатков, соответствующую области аминокислотных остатков между Gly-289 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1. Этот же общий принцип справедлив для других аминокислотных остатков, которые ограничивают область, описанную в настоящем документе. Другими словами, консервативная природа конкретных аминокислотных остатков является для специалиста однозначным признаком того, какие аминокислотные остатки образуют эту область.
Для специалиста в данной области понятно, что настоящее изобретение относится к аминокислотному составу области аминокислотных остатков, соответствующей области аминокислотных остатков между Gly-289 и Asp-320, наиболее предпочтительно между His-311 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1. Соответственно, специалист в данной области поймет, что аминокислотная последовательность остального белка согласно настоящему изобретению может варьировать, при условии, что указанный белок остается прокоагулянтным полипептидом FXa с пониженной чувствительностью к прямым ингибиторам фактора Ха или преобразуется такой полипептид в результате активации. Таким образом, указанная остальная часть белка согласно настоящему изобретению может варьировать, как она, например, варьирует у полипептидов фактора свертывания крови X или фактора свертывания крови Ха у различных видов.
Количество аминокислотных остатков в области, соответствующей области между Gly-289 и Asp320, предпочтительно между His-311 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1 консервативно среди белков фактора свертывания крови X различных видов, в частности, среди видов, принадлежащих к группе млекопитающих или к группе приматов. Эта область также присутствует в белке-зимогене FX и полипептиде FXa. Следовательно, число аминокислотных остатков также консервативно у белказимогена FX и полипептида FXa и в соответствующих областях белка-зимогена FX и полипептида FXa. Указанное консервативное число аминокислотных остатков в области аминокислотных остатков, соответствующей области между Gly-289 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1, равно тридцати, не включая Gly-289 и Asp-320. Указанное консервативное число аминокислотных остатков в области аминокислотных остатков, соответствующей области между His-311 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1, равно восьми, не включая His-311 и Asp-320.
Было обнаружено, что вставка и/или замена и/или делеция, предпочтительно вставка, по меньшей мере одного аминокислотного остатка в области аминокислотных остатков, соответствующей области аминокислотных остатков между Gly-289 и Asp-320, предпочтительно между His-311 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1 в белке согласно настоящему изобретению дает каталитически активный фактор свертывания крови Ха с пониженной чувствительностью к ингибированию прямыми ингибиторами фактора Ха.
Было показано, что Tyr-319 человеческого FXa является остатком, координирующим DFXI (Roehrig с соавт., 2005. J Med Chem 48: 5900-5908; Pinto с соавт., 2007. J Med Chem 50: 5339-5356), a Asp-322 последовательности SEQ ID NO: 1 присутствует в каталитическом сайте с активностью сериновой протеазы (Messier с соавт., 1996. Blood Coagulation and Fibrinolysis 7: 5-14). Без ограничения теоретическим объяснением, возможно, что близость измененного аминокислотного остатка, такого как вставка по меньшей мере одного аминокислотного остатка в области между Gly-289 и Asp-320, к координирующему DFXI остатку Tyr-319 последовательности SEQ ID NO: 1, или соответствующему тирозину, и/или близость к каталитическому домену отвечает за сниженную чувствительность к DFXI. Оказывается, в области аминокислотных остатков, соответствующей области аминокислотных остатков между Gly-289 и Asp320 последовательности SEQ ID NO: 1, в белке согласно настоящему изобретению число аминокислотных остатков и аминокислотная последовательность могут быть изменены таким образом, что это приведет к образованию каталитически активного фактора свертывания крови Ха с пониженной чувствительностью к прямым ингибиторам фактора Ха.
Указанное изменение выбирают из вставки, замены и/или делеции, и в предпочтительном варианте оно представляет собой вставку, более предпочтительно, вставку в комбинации с изменением по меньшей мере одной аминокислоты в области между Gly-289 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1.
Особенно предпочтительным является белок согласно настоящему изобретению, в котором вставка содержит 1-50, предпочтительно 1-20 аминокислотных остатков. Вставка в области аминокислотных остатков, соответствующей области аминокислотных остатков между Gly-289 и Asp-320, предпочтительно между His-311 и Asp-320, последовательности SEQ ID NO: 1 в белке согласно настоящему изобретению содержит или состоит из от 1 до 50, предпочтительно от 1 до 20, аминокислотных остатков. В предпочтительном варианте вставка содержит, или состоит из по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислотных остатков, что дает в целом 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28, соответственно, аминокислот между His-311 и Asp-320. Особенно предпочтительной является вставка по меньшей мере 5 аминокислотных остатков, такая как вставка 9, 12 или 13 аминокислотных остатков. Специалист в данной области поймет, что аминокислотные остатки могут быть встроены в любом положении в области аминокислотных остатков, соответст
- 6 045357 вующей области аминокислотных остатков между Gly-289 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1. Аминокислотный остаток, подходящий для вставки, выбирают из группы из двадцати аминокислотных остатков, перечисленных в табл. 1. Специалисту в данной области понятно, что указанные встроенные аминокислотные остатки могут подвергаться посттрансляционным химическим изменениям in vivo или in vitro. Как указано выше в настоящем документе, специалист в данной области сможет использовать технологии синтеза ДНК, ПЦР и молекулярного клонирования для получения рекомбинантных ДНКконструкций, последовательность ДНК которых кодирует белок согласно настоящему изобретению, содержащий вставку от 1 до 50 аминокислотных остатков в области аминокислотных остатков, соответствующей области между Gly-289 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1.
Вставка в области аминокислотных остатков, соответствующей области аминокислотных остатков между Gly-289 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1 в белке согласно настоящему изобретению в предпочтительном варианте расположена между Thr-315 и Lys-316, между Lys-316 и Glu-317, между Glu-317 и Thr-318 и/или между Thr-318 и Tyr-319 последовательности SEQ ID NO: 1 или между двумя аминокислотными остатками, соответствующими этим аминокислотным остаткам в полипептиде фактора свертывания крови Ха, не являющемся человеческим.
Особенно предпочтительным является белок согласно настоящему изобретению, в котором замена содержит 1-30, предпочтительно 1-8, более предпочтительно 6 или 7 аминокислотных остатков. Замена аминокислотных остатков в области аминокислотных остатков, соответствующей области аминокислотных остатков между Gly-289 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1, в белке согласно настоящему изобретению в предпочтительном варианте содержит, или состоит из, от 1 до 30 аминокислотных остатков в области, соответствующей области аминокислотных остатков между Gly-289 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1. В предпочтительном варианте указанная замена содержит, или состоит из, 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 аминокислотных остатков. В предпочтительном варианте консервативные аминокислотные остатки, такие как, например, Glu-297, Val-305 и/или His-311, показанные SEQ ID No: 1, не подвергаются замене. Особенно предпочтительной является замена 6 или 7 аминокислотных остатков.
В предпочтительном варианте аминокислотный остаток, присутствующий в области, соответствующей области аминокислотных остатков между Gly-289 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1, белка согласно настоящему изобретению заменяют любым из аминокислотных остатков, перечисленных в табл. 1, предпочтительно аминокислотой из той же группы в соответствии с колонками полярность боковой цепи и заряд боковой цепи в табл. 1. В предпочтительном варианте один или больше из Asn312, Arg-313, Phe-314, Thr-315, Lys-316, Glu-317, Thr-318 и Tyr-319 последовательности SEQ ID NO: 1 или соответствующих и аминокислотных остатков в не являющемся человеческим белке согласно настоящему изобретению, заменяют на любой из аминокислотных остатков, приведенных в табл. 1. Asn312 последовательности SEQ ID NO: 1 в предпочтительном варианте заменен на остаток Thr или Lys. Arg-313 в предпочтительном варианте заменен на аминокислотный остаток с основной полярностью и положительно заряженной боковой цепью (см. табл. 1), более предпочтительно на остаток Lys. Аминокислотный остаток Thr-315 в предпочтительном варианте заменен на полярный аминокислотный остаток с нейтральной боковой цепью, более предпочтительно на остаток Val. Lys-316 последовательности SEQ ID NO: 1 в предпочтительном варианте заменен на остаток Pro. Glu-317 последовательности SEQ ID NO: 1 в предпочтительном варианте заменен на остаток Val. Thr-318 в предпочтительном варианте заменен на полярный аминокислотный остаток с нейтральной боковой цепью, более предпочтительно на остаток Ser или Ala.
Замена аминокислотных остатков в области аминокислотных остатков, соответствующей области аминокислотных остатков между Gly-289 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1 в белке согласно настоящему изобретению в предпочтительном варианте содержит, или состоит из по меньшей мере двух аминокислотных остатков. Настоящее изобретение предусматривает любую комбинацию по меньшей мере двух аминокислотных остатков, например, замену Asn-312 последовательности SEQ ID NO: 1 и Lys-316 последовательности SEQ ID NO: 1 остатком Pro и остатком Ala, соответственно, или замену Asn312, Arg-313, Thr-315, Lys-316, Glu-317, Thr-318 и Tyr-319 последовательности SEQ ID NO: 1 одним из аминокислотных остатков, перечисленных в табл. 1. Особенно предпочтительным является белок согласно настоящему изобретению, содержащий замену (i) Asn-312, (ii) Arg-313, (iii) Thr-315, (iv) Lys-316, (v) Glu-317 и (vi) Thr-318 последовательности SEQ ID NO: 1 на (i) остаток Thr или Pro, (ii) остаток Lys, (iii) остаток Val, (iv) остаток Pro, (v) остаток Val и (vi) остаток Ser или Ala, соответственно.
Специалисту в данной области понятно, что в случае замены аминокислотных остатков в области аминокислотных остатков, соответствующей области между Gly-289 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1 не являющегося человеческим белка согласно настоящему изобретению, заменяют только те аминокислотные остатки, которые до этого еще не присутствовали в предпочтительном белке согласно настоящему изобретению. Специалисту в данной области будет понятно, что вышеупомянутая отсылка к SEQ ID NO: 1 сделана исключительно в качестве примера замены аминокислотных остатков в указанной области аминокислотных остатков. Благодаря этому он будет знать, каким или какими аминокислотными остатками он может заменить другой аминокислотный остаток или остатки в не являющемся человече
- 7 045357 ским факторе свертывания крови Ха.
Белок согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать делецию по меньшей мере одного аминокислотного остатка в области аминокислотных остатков, соответствующей области аминокислотных остатков между Gly-289 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO:1. Особенно предпочтительным является белок согласно настоящему изобретению, содержащий делецию по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20 или 30 аминокислотных остатков.
Предпочтительный белок согласно настоящему изобретению содержит комбинацию вставки и замены или комбинацию вставки, замены и/или делеции. Вставки и делеции могут присутствовать независимо друг от друга и возможны варианты, когда, например, вставка 5 аминокислотных остатков и делеция 5 аминокислот присутствуют в различных положениях аминокислот в области аминокислотных остатков, соответствующей области аминокислотных остатков между Gly-289 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO:1, и при этом общее число аминокислотных остатков в факторе свертывания крови X не изменяется. Специалисту понятно, что вставка или делеция изменяют нумерацию аминокислотных остатков в белке. С точки зрения удобства оценки того, где расположено изменение и в чем заключается это изменение, специалист может осуществить несколько выравниваний аминокислотных последовательностей различных белков фактора свертывания крови X, как показано на фиг. 8. На основании этих выравниваний специалист сможет определить, какие аминокислотные остатки изменены. Специалист может использовать консервативные аминокислотные остатки, например, Glu-297, Val-305 и/или His-311 в качестве маркеров для оценки номера аминокислотного остатка, который был изменен.
Особенно предпочтительным является белок согласно настоящему изобретению, в котором вставка содержит 1-50, предпочтительно 1-20, аминокислотных остатков, и в котором замена содержит 1-7, предпочтительно 6 аминокислотных остатков. Указанный предпочтительный белок содержит вставку от 1 до 50, предпочтительно от 1 до 20 аминокислотных остатков в комбинации с заменой от 1 до 8, предпочтительно 6 или 7 аминокислотных остатков в области аминокислотных остатков, соответствующей области аминокислотных остатков между Gly-289 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1
Более предпочтительный белок согласно настоящему изобретению содержит вставку по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 аминокислотных остатков и замену по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислотных остатков в области аминокислотных остатков, соответствующей области аминокислотных остатков между Gly-289 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1, что означает, что вставку по меньшей мере 1-20 аминокислотных остатков комбинируют с заменой по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислотных остатков. Настоящее изобретение относится ко всем возможным комбинациям вышеупомянутых вставок и замен. Особенно предпочтительным является белок, содержащий вставку 12-13 аминокислотных остатков и замену 6 аминокислотных остатков в области аминокислотных остатков, соответствующей области аминокислотных остатков между Gly-289 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1.
В наиболее предпочтительном варианте белок согласно настоящему изобретению содержит область аминокислотных остатков, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11 между аминокислотными остатками, соответствующими аминокислотным остаткам His-311 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1.
Кроме того, изменение Arg-366, Glu-369, Phe-396, Asp-413, Ala-414, Cys-415, Gln-416, Ser-419, Val437, Ser-438, Trp-439, Gly-440, Glu-441, Gly-442, Cys-443, Gly-450, lle-451 и Tyr-452 последовательности SEQ ID NO:1 вероятно ведет к образованию белка, нечувствительного к DFXI. Без ограничения теоретическим обоснованием, Arg-366, Glu-369, Phe-396, Asp-413, Ala-414, Cys-415, Gln-416, Ser-419, Val-437, Ser-438, Trp-439, Gly-440, Glu-441, Gly-442, Cys-443, Gly-450, lle-451 и Tyr-452 последовательности SEQ ID NO: 1 вероятно являются остатками, координирующими прямые ингибиторы фактора Ха. Литературные данные косвенно подтверждают эту точку зрения, поскольку они демонстрируют, что по меньшей мере некоторые из этих остатков участвуют в связывании DFXI (Roehrig с соавт., 2005. J Med Chem 48: 5900-5908; Pinto с соавт., 2007. J Med Chem 50: 5339-5356). Белок согласно настоящему изобретению в предпочтительном варианте содержит замену или делецию аминокислотного остатка, соответствующего Arg-366, Glu-369, Phe-396, Asp-413, Ala-414, Cys-415, Gln-416, Ser-419, Val-437, Ser-438, Trp-439, Gly440, Glu-441, Gly-442, Cys-443, Gly-450, lle-451 или Tyr-452 последовательности SEQ ID NO:1. Аминокислотные остатки Arg-366, Glu-369, Phe-396, Asp-413, Ala-414, Cys-415, Gln-416, Ser-419, Val-437, Ser438, Trp-439, Gly-440, Glu-441, Gly-442, Cys-443, Gly-450, lle-451 и/или Tyr-452 последовательности SEQ ID NO:1 последовательности SEQ ID NO:1, или соответствующие аминокислотные остатки в родственном белке в предпочтительном варианте заменены на любой один аминокислотный остаток, приведенный в табл. 1. Также белок согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит вставку по меньшей мере одного аминокислотного остатка, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 аминокислотных остатков в области аминокислотных остатков, соответствующей области между аминокислотными остатками, расположенными на расстоянии 15 аминокислотных остатков в направлении N-конца и 15 аминокислотных остатков в направлении С-конца от Arg-366, Glu-369, Phe-396, Asp-413, Ala-414, Cys-415, Gln-416, Ser-419, Val-437, Ser-438, Trp-439, Gly-440, Glu-441, Gly-442, Cys443, Gly-450, IIe-451 и/или Tyr-452. Указанное изменение Phe-396, Arg-366, Glu-369, Asp-413, Ala-414,
- 8 045357
Cys-415, Gln-416, Ser-419, Val-437, Ser-438, Trp-439, Gly-440, Glu-441, Gly-442, Cys-443, Gly-450, IIe-451 и/или Tyr-452 последовательности SEQ ID NO:1. В предпочтительном варианте указанную вставку в области, указанной в этом абзаце, комбинируют с изменением в области между Gly-289 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1, определенным выше.
Настоящее изобретение также охватывает белки, которые по существу гомологичны белку согласно настоящему изобретению и биологически эквивалентны ему. В предпочтительном варианте белок согласно настоящему изобретению имеет аминокислотную последовательность, которая более чем на 60%, предпочтительно более чем на 70%, более предпочтительно более чем на 80% и наиболее предпочтительно более чем на 90% гомологична последовательности SEQ ID NO: 1, или его каталитически активированную форму, где указанный белок является каталитически активным (прокоагулянт) или становится каталитически активным после процессинга/активации, и обладает пониженной чувствительностью к прямым ингибиторам фактора свертывания Ха (DFXI), предпочтительно к DFXI, выбранному из группы, состоящей из ривароксабана, апиксабана, эдоксабана и бетриксабана. Специалисту в данной области известно, каким образом препробелок или пробелок фактора свертывания крови X преобразуется в его каталитически активную форму. В базе данных UniProt под номером доступа Р00742 приведен обзор процессинга человеческого фактора свертывания крови X с образованием активированного человеческого фактора свертывания крови Ха. Соответственно, специалист сможет определить, какие аминокислотные остатки присутствуют или отсутствуют в факторе свертывания крови Ха.
Термин сниженная чувствительность к прямым ингибиторам фактора свертывания Ха (DFXI) в контексте настоящего изобретения относится к концентрации DFXI, необходимой для обеспечения 50% максимального ингибирования (Ki), которая выше для полипептида согласно настоящему изобретению, чем для нативного фактора свертывания крови Ха, причем в предпочтительном варианте указанный нативный фактор свертывания крови Ха выделен из плазмы крови или получен рекомбинантным путем. В предпочтительном варианте Ki прямого ингибитора фактора свертывания Ха (DFXI) измеряют путем предварительной инкубации белка согласно настоящему изобретению с 0,001 до 100 мкМ DFXI с последующим приведением эксперимента, в котором измеряют каталитическую активность в отношении Spectrozyme Xa (Sekisui Diagnostics; Stamford, CT, США) по превращению пептидил-субстрата. В предпочтительном варианте Ki белка согласно настоящему изобретению повышена более чем в 2 раза, более предпочтительно повышена в от 50 до 100 раз, и наиболее предпочтительно повышена в более чем 100 раз по сравнению с Ki указанного нативного фактора свертывания крови Ха без изменения по меньшей мере одного аминокислотного остатка в области аминокислотных остатков, соответствующей области аминокислотных остатков между Gly-298 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1.
Неожиданно было обнаружено, что белок согласно настоящему изобретению обладает повышенной аффинностью связывания в отношении фактора свертывания FVa -партнера фактора свертывания крови Ха по связыванию в протромбиназном комплексе, по сравнению с аффинностью связывания нативного фактора свертывания крови Ха в отношении фактора свертывания FVa. Аффинность связывания человеческого или гуманизированного белка согласно настоящему изобретению в отношении FVa по меньшей мере в два раза выше, чем аффинность связывания нативного человеческого FXa в отношении FVa.
Методы анализа для определения аффинности связывания известны в данной области, например, основанные на применении партнера по связыванию (такого как FVa или FXa) с радиоактивной меткой. Количество радиации, испускаемое после связывания, можно применять для расчета аффинности связывания. Также можно применять нерадиоактивные методы, такие как поверхностный плазмонный резонанс и двойная поляризационная интерферометрия, для измерения аффинности связывания по анализам, основанным на концентрации, а также по кинетике ассоциации и диссоциации и, в последнем случае, конформационным изменениям после связывания. Недавно был разработан метод микромасштабного термофореза (Microscale Thermophoresis, MST) без иммобилизации, который обеспечивает возможность определения аффинности связывания между двумя белками (Wienken с соавт., 2010. Nature Communications 1: 100). В предпочтительном варианте аффинность комплекса факторов свертывания FVa-FXa определяют по кинетике протромбина или преобразованию производных протромбина (претромбина-1, претромбина-2) (Bos с соавт., 2009. Blood 114: 686-692), измеряемых по интенсивности флуоресценции/анизотропии (Bos et al, 2012. J Biol Chem 287: 26342-51) или методом изометрической калориметрии титрования (ITC).
Согласно настоящему изобретению также предложена молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность ДНК, которая кодирует белок согласно настоящему изобретению. Специалисту в данной области понятно, как получить последовательность ДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность белка согласно настоящему изобретению, и как получить и выделить молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую указанную последовательность ДНК, с применением общеизвестных технологий рекомбинантной ДНК. В предпочтительном варианте последовательность молекулы нуклеиновой кислоты подвергают кодон-оптимизации для экспрессии в клетке-хозяине согласно настоящему изобретению. В этом случае используют кодоны, которые способствуют высоким уровням экспрессии в конкретной клетке-хозяине.
Согласно настоящему изобретению также предложен вектор экспрессии, содержащий молекулу
- 9 045357 нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.
В предпочтительном варианте молекулы нуклеиновой кислоты встраивают в вектор экспрессии с использованием методик рекомбинантной ДНК, известных специалистам в данной области. Векторы экспрессии в контексте настоящего изобретения относятся к экспрессии белка согласно настоящему изобретению в клетке-хозяине. В предпочтительном варианте эти векторы-экспрессии реплицируются в клетке-хозяине, либо в виде эписом, либо в виде части хромосомной ДНК. Далее, в случае экспрессии белка в эукариотических клетках вектор экспрессии предпочтительно содержит (i) сильный промотор/энхансер, такой как промотор цитомегаловируса (CMV) или промотор SV40, (ii) оптимальную последовательность инициации трансляции, такую как сайт связывания рибосомы и старт-кодон, предпочтительно консенсусную последовательность KOZAK, и (iii) последовательность терминации транскрипции, включая сигнальную последовательность поли(А). Подходящие векторы экспрессии включают плазмиды и вирусные векторы, такие как аденовирусы, аденоассоциированные вирусы и ретровирусы. Специалист в данной области поймет, что применяемый вектор экспрессии зависит от клетки-хозяина, применяемой для экспрессии рекомбинантного белка. В предпочтительном варианте вектор экспрессии согласно настоящему изобретению подходит для экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению в прокариотической клетке, включая бактериальную клетку, или, в более предпочтительном варианте, в эукариотической клетке-хозяине, такой как клетка дрожжей и клетка млекопитающего. Особенно предпочтительным является вектор экспрессии для экспрессии в клетках млекопитающих pCMV4.
В альтернативном варианте молекула нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению может быть встроена в геном клетки-хозяина. Указанная вставка предпочтительно находится в локусе или в области, которая обеспечивает экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению в клетке-хозяине.
Согласно настоящему изобретению также предложена клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. В предпочтительном варианте осуществления согласно настоящему изобретению предложена клетка-хозяин, экспрессирующая молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, в результате чего продуцируется белок согласно настоящему изобретению. Указанный белок продуцируется либо внутри клетки-хозяина, либо, в предпочтительном варианте, секретируется из клетки-хозяина.
Подходящие клетки-хозяева для применения в настоящем изобретении включают прокариотические и эукариотические клетки, такие как клетки бактерий, клетки дрожжей, клетки насекомых, клетки животных, клетки млекопитающих, клетки мыши, клетки крысы, клетки овцы, клетки обезьяны и клетки человека. Примеры подходящих эукариотических клеток включают следующие, но не ограничиваются ими: клетки HEK 293, линии клеток хомяка СНО и BHK-21, мышиные клетки-хозяева NIH3T3, NSO и С127, клетки-хозяева обезьяны COS и Vero. и человеческие клетки-хозяева HeLa, PER.C6, U-937 и Hep G2. Подходящие клетки можно достать в общедоступных источниках, таких как Американская коллекция типовых культур (АТСС) и Life Technologies. В данной области известен ряд методик трансфекции, см., например, Graham с соавт., 1973. Virology 52: 456, Green с соавт., 2012. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL Press, Davis с соавт., Basic Methods in Molecular Biology, 1986, Elsevier и Chu с соавт., 1981. Gene 13: 197. В предпочтительном варианте специалисты в данной области применяют методики, описанные в этих источниках для введения одной или более эндогенных молекул нуклеиновой кислоты в подходящие клетки-хозяева.
Особенно предпочтительной клеткой-хозяином для получения белка согласно настоящему изобретению является клетка HEK293.
Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая композиция, содержащая белок согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль, и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество. В предпочтительном варианте фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит один или более разбавителей, наполнителей, солей, буферов, стабилизаторов, солюбилизаторов и других материалов, известных в данной области. Как известно специалистам, характеристики носителя будут зависеть от пути введения. Для снижения потенциального риска тромбообразования при введении сериновой протеазы FXa фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению в предпочтительном варианте содержит белок согласно настоящему изобретению, который после введения субъекту инактивируется.
Термин субъект относится к группе млекопитающих, предпочтительно людям.
Термин фармацевтическая композиция в контексте настоящего изобретения относится к комбинации белка согласно настоящему изобретению с носителем, инертным или активным, который делает композицию подходящей для терапевтического применения in vivo или ex vivo.
Термин фармацевтически приемлемый в настоящем документе относится к нетоксичному материалу, который совместим с физическими и химическими характеристиками белка согласно настоящему изобретению и не снижает эффективность биологического действия указанного белка.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть приспособлена для введения композиции энтеральным путем, при котором композиция всасывается через пищеварительный
- 10 045357 тракт, например, путем перорального проглатывания или ректального введения. Указанные композиции в предпочтительном варианте инкапсулированы, например, с использованием липосом, для предотвращения протеолитического расщепления.
Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению в предпочтительном варианте применяют местно, например, на или в ране или в кровеносном сосуде, предпочтительно, артерии, которая снабжает кровью область раны. Указанное местное введение представляет собой топическое введение, например, в форме кремы, пенки, геля, лосьона или мази, или парентеральное введение, например, путем инъекции или вливания, для получения местного или системного терапевтического эффекта. Топическое введение белка согласно настоящему изобретению для получения местного эффекта снижает риск возможного системного тромбообразования.
Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению, предпочтительно содержащую фактор свертывания крови X или зрелый фактор свертывания крови X, который содержит измененный полипептид фактора свертывания Ха, в предпочтительном варианте вводят системно, предпочтительно парентеральным путем. Системное введение неактивного препробелка или неактивного пробелка приводит к образованию активного протромбиназного комплекса, который состоит из фактора свертывания крови Ха, связанного с FVa, на отрицательно заряженных фосфолипидных мембранах, где он превращает неактивный протромбин в активную сериновую протеазу тромбин.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению в предпочтительном варианте приспособлена для парентерального введения, при котором композицию вводят внутривенно, внутриартериально, подкожно и/или внутримышечно. Парентеральное введение включает введение фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению путем инъекции или вливания в ткань тела или физиологическую жидкость, для чего предпочтительно применять шприц, иглу или катетер. В альтернативном варианте в качестве средства парентерального введения может применяться введение под высоким давлением без применения игл. Для инъецируемых композиций (например, композиций для внутривенного введения), носитель может представлять собой водный или масляный раствор, дисперсию, эмульсию и/или суспензию. В предпочтительном варианте носитель представляет собой водный раствор, предпочтительно дистиллированную стерильную воду, солевой раствор, буферный солевой раствор или другое фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество для инъекций.
В предпочтительном варианте фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению применяют в различных терапевтических приложениях. Например, фармацевтическую композицию можно применять в качестве препарата шунтирующего действия в лечении или облегчении нарушений, при которых нарушено нормальное свертывание крови, таких как гемофилия А и В, в том числе в группах пациентов с ингибиторной гемофилией А или при дефиците фактора X.
Согласно настоящему изобретению также предложен белок согласно настоящему изобретению или фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению для применения в способе полного или частичного обращения антикоагулянтного эффекта ингибитора свертывания крови у субъекта.
Термин антикоагулянтное действие относится к терапевтическому действию, такому как предотвращение свертывания крови, которое является результатом действия ингибиторов свертывания крови.
Согласно настоящему изобретению также предложено применение белка согласно настоящему изобретению для изготовления лекарственного средства для полного или частичного обращения антикоагулянтного эффекта ингибитора свертывания крови у субъекта.
В предпочтительном варианте ингибитор свертывания крови представляет собой прямой ингибитор фактор Ха (DFXI), более предпочтительно прямой ингибитор FXa, выбранный из группы, состоящей из ривароксабана (5-хлор-N-[[(5S)-2-оксо-3-[4-(3-оксо-4-морфолинил)фенил]-5-оксазолидинил]метил]-2тиофенкарбоксамида), апиксабана (1 -(4-метоксифенил)-7-оксо-6-[4-(2-оксопиперидин-1 -ил)фенил] 4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пиразоло[3,4-с]пиридин-3-карбоксамида), эдоксабана Щ'-(5-хлоропиридин-2-ил)N-[(1S,2R,4S)-4-(диметилkαрбαмоил)-2-[(5-метил-6,7-дигидро-4Н-[1,3]тиαзоло[5,4-с]nиридин-2карбонил)амино]циклогексил]оксамида, 4-метилбензолсульфоновой кислоты) и/или бетриксабана (N-(5хлоропиридин-2-ил)-2-[[4-(N,N-диметилкарбамимидоил)бензоил]амино]-5-метоксибензамида).
Далее согласно настоящему изобретению предложен способ полного или частичного обращения антикоагулянтного эффекта ингибитора свертывания крови у субъекта, причем указанный способ включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества белка согласно настоящему изобретению или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. В предпочтительном варианте способ согласно настоящему изобретению применяют для предотвращения или облегчения осложнений в виде кровотечений, которые связаны с антикоагулянтной терапией.
Термин терапевтически эффективное количество в настоящем документе означает, что количество активного ингредиента, содержащееся в фармацевтической композиции для введения, имеет достаточное значение для достижения предполагаемой цели, такой как, в данном случае, полностью или частично обратить антикоагулянтное действие ингибитора свертывания крови. В предпочтительном варианте количество активного ингредиента, т.е. белка согласно настоящему изобретению в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению лежит в диапазоне от приблизительно 50 мг до приблизительно 600 мг. В предпочтительном варианте фармацевтическую композицию согласно настоящему
- 11 045357 изобретению вводят только однократно, дважды или три раза, предпочтительно только однократно, субъекту, нуждающемуся в полном или частичном обращении антикоагулянтного эффекта ингибитора свертывания крови.
Для целей ясности и точности описания признаки описаны в настоящем документе в составе одного или разных вариантов осуществления; однако подразумевается, что объем настоящего изобретения может включать варианты реализации, содержащие комбинации всех или некоторых описанных признаков.
SEQ ID NO: 1 (белок человеческого фактора свертывания X) mgrplhlvll saslagllll geslfirreq annilarvtr ansfleemkk ghlerecmee tcsyeearev fedsdktnef wnkykdgdqc etspcqnqgk ckdglgeytc tclegfegkn
121 celftrklcs Idngdcdqfc heeqnsvvcs cargytladn gkaciptgpy pcgkqtlerr
181 krsvaqatss sgeapdsitw kpydaadldp tenpfdlldf nqtqpergdn nltrivggqe
241 ckdgecpwqa llineenegf cggtilsefy iltaahclyq akrfkvrvgd rnteqeegge
301 avhevevvik hnrftketyd fdiavlrlkt pitfrmnvap aclperdwae stlmtqktgi
361 vsgfgrthek grqstrlkml evpyvdrnsc klsssfiitq nmfcagydtk qedacqgdsg
421 gphvtrfkdt yfvtgivswg egcarkgkyg iytkvtaflk widrsmktrg Ipkakshape
481 vitssplk
SEQ ID NO: 2 (легкая цепь человеческого фактора свертывания Ха) ansfleemkk ghlerecmee tcsyeearev fedsdktnef wnkykdgdqc etspcqnqgk
161 ckdglgeytc tclegfegkn celftrklcs Idngdcdqfc heeqnsvvcs cargytladn
121 gkaciptgpy pcgkqtler 139
SEQ ID No: 3 (тяжелая цепь человеческого фактора свертывания Ха) ivggqeckdg ecpwqallin eenegfcggt ilsefyilta ahclyqakrf kvrvgdrnte
161 qeeggeavhe vevvikhnrf tketydfdia vlrlktpitf rmnvapaclp erdwaestlm
121 tqktgivsgf grthekgrqs trlkmlevpy vdrnscklss sfiitqnmfc agydtkqeda
181 cqgdsggphv trfkdtyfvt givswgegca rkgkygiytk vtaflkwidr smktrglpka
241 kshapevits splk
SEQ ID NO: 4 tkfvppnyyyvhqnfdrvay
SEQ ID NO: 5 kkfvppkksqefyekfdlvsy
SEQ ID NO: 6 (ген человеческого фактора свертывания крови X; 1-1473 п.о.) atggcgcacgtccgaggcttgcagctgcctggctgcctggccctggctgccctgtgtagccttgtgcacagccagcatgtgttcctg gctcctcagcaagcacggtcgctgctccagcgggtccggcgagccaattcctttcttgaagagatgaagaaaggacacctcgaa agagagtgcatggaagagacctgctcatacgaagaggcccgcgaggtctttgaggacagcgacaagacgaatgaattctgga ataaatacaaagatggcgaccagtgtgagaccagtccttgccagaaccagggcaaatgtaaagacggcctcggggaatacac ctgcacctgtttagaaggattcgaaggcaaaaactgtgaattattcacacggaagctctgcagcctggacaacggggactgtgac cagttctgccacgaggaacagaactctgtggtgtgctcctgcgcccgcgggtacaccctggctgacaacggcaaggcctgcatt cccacagggccctacccctgtgggaaacagaccctggaacgcaggaagaggtcagtggcccaggccaccagcagcagcg gggaggcccctgacagcatcacatggaagccatatgatgcagccgacctggaccccaccgagaaccccttcgacctgcttgac ttcaaccagacgcagcctgagaggggcgacaacaacctcacgcgtatcgtgggaggccaggaatgcaaggacggggagtgt ccctggcaggccctgctcatcaatgaggaaaacgagggtttctgtggtggaactattctgagcgagttctacatcctaacggcagc ccactgtctctaccaagccaagagattcaaggtgagggtaggtgaccggaacacggagcaggaggagggcggtgaggcggt gcacgaggtggaggtggtcatcaagcacaaccggttcacaaaggagacctatgacttcgacatcgccgtgctccggctcaaga cccccatcaccttccgcatgaacgtggcgcctgcctgcctccccgagcgtgactgggccgagtccacgctgatgacgcagaag acggggattgtgagcggcttcgggcgcacccacgagaagggccggcagtccaccaggctcaagatgctggaggtgccctacg tggaccgcaacagctgcaagctgtccagcagcttcatcatcacccagaacatgttctgtgccggctacgacaccaagcaggag gatgcctgccagggggacagcgggggcccgcacgtcacccgcttcaaggacacctacttcgtgacaggcatcgtcagctggg gagagggctgtgcccgtaaggggaagtacgggatctacaccaaggtcaccgccttcctcaagtggatcgacaggtccatgaaa accaggggcttgcccaaggccaagagccatgccccggaggtcataacgtcctctccattgaaa
- 12 045357
SEQ ID NO: 7 (последовательность ДНК модифицированного человеческого фактора X типа А; 11509 п.о.)
Atggcgcacgtccgaggcttgcagctgcctggctgcctggccctggctgccctgtgtagccttgtgcacagccagcatgtgttcctg gctcctcagcaagcacggtcgctgctccagcgggtccggcgagccaattcctttcttgaagagatgaagaaaggacacctcgaa agagagtgcatggaagagacctgctcatacgaagaggcccgcgaggtctttgaggacagcgacaagacgaatgaattctgga ataaatacaaagatggcgaccagtgtgagaccagtccttgccagaaccagggcaaatgtaaagacggcctcggggaatacac ctgcacctgtttagaaggattcgaaggcaaaaactgtgaa.ttattcacacggaagctctgcagcctggacaacggggactgtga ccagttctgccacgaggaacagaactctgtggtgtgctcctgcgcccgcgggtacaccctggctgacaacggcaaggcctgcat tcccacagggccctacccctgtgggaaacagaccctggaacgcaggaagaggtcagtggcccaggccaccagcagcagcg gggaggcccctgacagcatcacatggaagccatatgatgcagccgacctggaccccaccgagaaccccttcgacctgcttgac ttcaaccagacgcagcctgagaggggcgacaacaacctcacgcgtatcgtgggaggccaggaatgcaaggacggggagtgt ccctggcaggccctgctcatcaatgaggaaaacgagggtttctgtggtggaactattctgagcgagttctacatcctaacggcagc ccactgtctctaccaagccaagagattcaaggtgagggtaggtgaccggaacacggagcaggaggagggcggtgaggcggt qcacqaqqtqqaqqtqqtcatcaaqcacaccaaqttcqtqccccctaactactattacqtccaccaqaattttqaccqqqt gcjcctatgacttcgacatcgccgtgctccggctcaagacccccatcaccttccgcatgaacgtggcgcctgcctgcctccccgag cgtgactgggccgagtccacgctgatgacgcagaagacggggattgtgagcggcttcgggcgcacccacgagaagggccgg cagtccaccaggctcaagatgctggaggtgccctacgtggaccgcaacagctgcaagctgtccagcagcttcatcatcacccag aacatgttctgtgccggctacgacaccaagcaggaggatgcctgccagggggacagcgggggcccgcacgtcacccgcttca aggacacctacttcgtgacaggcatcgtcagctggggagagggctgtgcccgtaaggggaagtacgggatctacaccaaggtc accgccttcctcaagtggatcgacaggtccatgaaaaccaggggcttgcccaaggccaagagccatgccccggaggtcataa cgtcctctccattgaaa
SEQ ID NO: 8 (последовательность ДНК модифицированного человеческого фактора X типа В; 11512 п.о.) atggcgcacgtccgaggcttgcagctgcctggctgcctggccctggctgccctgtgtagccttgtgcacagccagcatgtgttcctg gctcctcagcaagcacggtcgctgctccagcgggtccggcgagccaattcctttcttgaagagatgaagaaaggacacctcgaa agagagtgcatggaagagacctgctcatacgaagaggcccgcgaggtctttgaggacagcgacaagacgaatgaattctgga ataaatacaaagatggcgaccagtgtgagaccagtccttgccagaaccagggcaaatgtaaagacggcctcggggaatacac ctgcacctgtttagaaggattcgaaggcaaaaactgtgaattattcacacggaagctctgcagcctggacaacggggactgtgac cagttctgccacgaggaacagaactctgtggtgtgctcctgcgcccgcgggtacaccctggctgacaacggcaaggcctgcatt cccacagggccctacccctgtgggaaacagaccctggaacgcaggaagaggtcagtggcccaggccaccagcagcagcg gggaggcccctgacagcatcacatggaagccatatgatgcagccgacctggaccccaccgagaaccccttcgacctgcttgac ttcaaccagacgcagcctgagaggggcgacaacaacctcacgcgtatcgtgggaggccaggaatgcaaggacggggagtgt ccctggcaggccctgctcatcaatgaggaaaacgagggtttctgtggtggaactattctgagcgagttctacatcctaacggcagc ccactgtctctaccaagccaagagattcaaggtgagggtaggtgaccggaacacggagcaggaggagggcggtgaggcggt qcacQaqqtqqaqqtqqtcatcaaQcacaagaaattcgtgccccctaagaaaagccaggagttctacgaaaagtttgac ctqqtctcctatqacttcqacatcqccqtqctccqqctcaaqacccccatcaccttccqcatqaacqtqqcqcctqcctqcctccc cgagcgtgactgggccgagtccacgctgatgacgcagaagacggggattgtgagcggcttcgggcgcacccacgagaaggg ccggcagtccaccaggctcaagatgctggaggtgccctacgtggaccgcaacagctgcaagctgtccagcagcttcatcatcac ccagaacatgttctgtgccggctacgacaccaagcaggaggatgcctgccagggggacagcgggggcccgcacgtcacccg cttcaaggacacctacttcgtgacaggcatcgtcagctggggagagggctgtgcccgtaaggggaagtacgggatctacacca aggtcaccgccttcctcaagtggatcgacaggtccatgaaaaccaggggcttgcccaaggccaagagccatgccccggaggt cataacgtcctctccattgaaa
SEQ ID NO: 9 kkfvppkksqefyekfdlaay
SEQ ID NO: 10 kkfvppnyyyvhqnfdlaay
SEQ ID NO: 11 kkfvppqkaykfdlaay
- 13 045357
Описание фигур
Фиг. 1. Структура фактора свертывания крови Ха. А: схематичная структура доменов γкарбоксиглутамата ('GLA'), EGF-1 -2 ('EGF') и сериновой протеазы ('SP') фактора свертывания крови Ха. В: кристаллическая структура сериновой протеазы FXa человека (pdb 2W26). Показана каталитическая триада His-276, Asp-322, Ser-419, остатки области контакта с ривароксабаном/апиксабаном Тгу-319 и Phe-396, положение остатков 316-317 (в кружках) и остатки Gly-289, Glu-297, Val-305, и His-311. С: выравнивание области 311-322 в плазматических факторах FX различных видов с показанными консервативными остатками (выделены), остатком области контакта Tyr-319 и каталитическим остатком Asp-322. * обозначает фактор свертывания крови X из яда со вставкой в области, соответствующей области между Gly-289 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1.
Фиг. 2. Ингибирование хромогенной активности фактора FXa прямыми ингибиторами FXa. А: превращение пептидильного субстрата (SpecFXa, 250 мкМ) рекомбинантного человеческого фактора свертывания крови Ха (hFXa, 2 нМ, кружки) или фактора свертывания крови Ха из яда P. textilis (vptFXa, 10 нМ, треугольники) в присутствии повышающихся концентраций (1нМ - 10мкМ) ривароксабана ('riva', значки с заливкой) или апиксабана ('api', значки без заливки). Превращение субстрата показано на графике в виде % от инкубаций в отсутствие ингибитора. В,С: Образование тромбина в плазме с дефицитом фактора свертывания крови X инициировали при помощи 0.5 нМ человеческого фактора Ха (hFXa, изображение В) или фактора Ха яда змеи (vptFXa, рисунок С) в отсутствие (серая линия / серый столбик) или в присутствии 0.4 мкМ ривароксабана ('riva', черная линия / черный столбик) или 2 мкМ апиксабана ('api', штрихованная линия / белый столбик). Образование тромбина оценивали с использованием флюорогенного субстрата, на врезках показаны пиковые концентрации тромбина в различных инкубациях.
Фиг. 3. (А) - флуоресцентный вестерн-блоттинг рекомбинантного FX (200 нг), полученного из клеточных линий HEK293, которые стабильно экспрессируют рекомбинантный человеческий FX (r-hFX, дорожки 1, 5), модифицированный человеческий FX-A (mod А, дорожка 2, 6), или модифицированный человеческий FX-B (mod В, дорожки 3, 7), до (дорожки 1,2, 3) или после (дорожки 5, 6, 7) инкубации с активатором RW-X. Тяжелая цепь эндогенного FXa плазмы человека мигрирует при ~29 КДа (дорожка 9). Показана относительная масса (КДа) белковых маркеров (дорожки 4, 8). (В) - рекомбинантный FX в кондиционированной среде из клеточных линий HEK293, стабильно экспрессирующих человеческий рекомбинантный FX (черный столбик), или модифицированный FX-A (белый столбик), или модифицированный человеческий FX-B (серый столбик) измеряли с использованием FX-специфичного ИФА (ELISA). Каждый отдельный столбик представляет одну стабильную клеточную линию с максимальной достигнутой экспрессией варианта FX.
Фиг. 4. Активация макромолекулярного субстрата. Превращение тромбина (1.4 мкМ) в присутствии 50 мкМ PCPS , 20 нМ FV (FV810, рекомбинантного FV, укороченного по В-домену) и 0.1 нМ модифицированного человеческого фактора свертывания крови Ха типа A (m-hFXa А), типа В (m-hFXa В), рекомбинантного (r-hFXa) или полученного из плазмы (pd-hFXa) FXa. Превращение субстрата отложено на графике в нМ/мин/нМ фермента, данные представляют собой среднее значения по двум независимым экспериментам ± стандартное отклонение.
Фиг. 5. Ингибирование химерного FXa типа А прямыми ингибиторами фактора Ха. Превращение пептидильного субстрата (SpecFXa, 250 мкМ) RW-X-активированного модифицированного человеческого фактора свертывания крови Ха типа A (m-hFXa A, 1 нМ) в сравнении с рекомбинантным человеческим фактором свертывания крови Ха (r-hFXa, 3 нМ), полученным из плазмы человеческим фактором свертывания крови Ха (pd-FXa, 2 нМ) и FXa из яда P. textilis (vptFXa, 1 нМ). Скорости превращения определяли в присутствии 0.001 - 100 мкМ ривароксабана (фиг. А) или апиксабана (фиг. В). Данные приведены в виде среднего значения по двум независимым экспериментам, за исключением r-hFXa (n=1).
Фиг. 6. Ингибирование модифицированного человеческого FX-A модифицированного человеческого FX -В прямыми ингибиторами фактора Ха. Превращение пептидильного субстрата (SpecFXa, 250 мкМ) RVV-X-активированным модифицированным человеческим FX-A (m-hFXa A, 1 нМ) и модифицированным человеческим FX -В (m-hFXa В, 7 нМ, в сравнении с RW-X активированным рекомбинантным человеческим фактором свертывания крови Ха (r-hFXa, 6 нМ). Скорости превращения определяли 0.001 100 мкМ ривароксабана (фиг. А) и апиксабана (фиг. В). Данные представляют собой средние значения по двум независимым экспериментам.
Фиг. 7. Ингибирование модифицированного человеческого FX-A или модифицированного человеческого FX -В прямыми ингибиторами фактора Ха в присутствии кофактора Va и фосфолипидов. Превращение пептидильного субстрата (SpecFXa, 250 мкМ) RVV-X-активированным модифицированным человеческим FX -А (m-hFXa А, 2 нМ) и активированным модифицированным человеческим FX-B (mhFXa В, 4 нМ) в сравнении с RW-X-активированным рекомбинантным человеческим фактором свертывания крови Ха (r-hFXa, 3 нМ), в присутствии 50 мкМ PCPS и 30 нМ FV (FV810, рекомбинантный, укороченный по В-домену В). Скорости превращения определяли в присутствии 0.001 - 100 мкМ ривароксабана (фиг. А) или апиксабана (фиг. В). Данные представляют собой средние значения по двум независимым экспериментам.
- 14 045357
Фиг. 8. Множественное выравнивание белков фактора свертывания крови X различных видов. Аминокислотную последовательность человеческого фактора свертывания крови X (№ доступа в Genbank: AAH46125.1) (HUM) сравнивают с аминокислотными последовательностями фактора свертывания крови X М. musculus ((№ доступа в Genbank: AAC36345.1) (MUS), фактора свертывания крови XX. tropicalis (Genbank Accesion No.: NP_001015728) (Xtr), фактора свертывания крови X D. rerio (№ доступа в Genbank: AAM88343.1) (Dre), фактора свертывания крови X Т. rubripes (№ доступа в Genbank: NP_001027783.1) (Tru), изоформы 1 фактора свертывания крови X P. textilis (№ доступа в UniprotKB: Q1L659) (Pte1), изоформы 2 фактора свертывания крови X P. textilis (№ доступа в UniprotKB: Q1L658) (Pte2), фактора свертывания крови X P. textilis (предшественник каталитической субъединицы псеутарина С; № доступа в Genbank: AAP86642.1) (Pte3) и фактора свертывания крови X N. scutatus (№ доступа в UniprotKB P82807.2) (Nsc). На этой фигуре жирным шрифтом и подчеркиванием показаны Gly-289, Asp320, Tyr-319, Glu-297, Val-305 и His-311 последовательности SEQ ID NO: 1. Эта фигура показывает, что области аминокислотных остатков, соответствующей области между Gly-289 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1, различаются у белков фактора свертывания крови X различных видов. Аминокислотные остатки, консервативные у всех видов, показаны в консенсусной последовательности.
Фиг. 9. Аминокислотный состав эндогенного hFX и химерных вариантов FX. Остатки Histidine91 и Tyrosine99 домена, обладающего активностью сериновой протеазы ( нумерация по химотрипсину; соответствуют His 311 и Tyrosine 319, соответственно, фактора FX, представленного последовательностью SEQ ID NO:1) эндогенного человеческого (hFX) при выравнивании с химерным FX типа A (c-FX А, в середине; последовательность между His 311 и Asp 320 соответствует SEQ ID NO:9), типа В (с-FX В; последовательность между His 311 и Asp 320 соответствует SEQ ID NO:10), и типа С (c-FX С; последовательность между His 311т Asp 320 соответствует SEQ ID NO:11).
Фиг. 10. Исследование FXa: А: окрашивание красителем кумасси 5 мкг вариантов FXa на 4-12% Bis-Tris-гелях. слева направо: фактор Ха из плазмы (pd-FXa), r-hFXa, химерный фактор Ха типа А, В и С (- А, - В, - С). В: превращение протромбина (1.4 мкМ) в присутствии 50 мкМ PCPS (75% фосфатидилхолина, 25% фосфатидилсерина) и 20 нМ FV (FV810, рекомбинантный, укороченный по В-домену, FV) и 0.1 нМ pd-FXa, r-hFXa, c-FXa - A, c-FXa - В и c-FXa - С. Отложенные значения представляют среднее значение по двум независимым экспериментам.
Фиг. 11. Ингибирование вариантов FXa прямыми пероральными антикоагулянтами. Нормированное превращение протромбина под действием 1 нМ pd-FXa (треугольники), r-hFXa (кружки), химерного FXa -А (квардратики), - В (ромбы) и - С (крестики) оценивали в присутствии 0.001 - 100 мкМ апиксабана (слева, значки с заливкой) или эдоксабана (справа, значки без заливки). Константы ингибирования (определенные с использованием программного пакета Graphpad Prism 6) апиксабана для pd-FXa: 2 нМ, rhFXa: 4 нМ, c-FXa - А: 130 нМ, - В: 760нМ - С: 1270 нМ и эдоксабана для r-hFXa: 0.5 нМ, c-FXa - А: 3 нМ, - В: 140 нМ - С: 270 нМ.
Фиг. 12. Профили инициированного фактором FXa образования тромбина (TG) для вариантов FXa. Образование тромбина в плазме в отсутствие (А) и в присутствии (В) прямого перорального антикоагулянта апиксабана (2 мкМ). Инициация образования тромбина вариантами pd-FXa, r-hFXa, c-FXa - A, cFXa - В и c-FXa - С в плазме с дефицитом FX. Кривые представляют среднее по меньшей мере по 3 независимым экспериментам.
Фиг. 13. Профиль инициированного тканевым фактором (TF) образования тромбина для r-hFX и cFX - С. А: образование тромбина в плазме при низком уровне TF (2 пМ) в отсутствие и в присутствии 2 мкМ прямого перорального антикоагулянта апиксабана (Apixa) на 1 единицу r-hFX, r-hFX плюс апиксабан, c-FXa - С или c-FXa - С плюс апиксабан. Одну единицу r-hFX (7 мкг/мл) или c-FXa - С (16 мкг/мл) определяли в анализе свертывания на основе протромбинового времени с использованием нормальной человеческой плазмы для сравнения. Кривые представляют среднее по меньшей мере по 3 независимым экспериментам. В: образование тромбина в плазме при высоком уровне TF (20 пМ).
Фиг. 14. Профиль инициированного тканевым фактором (TF) образования тромбина для - r-hFX и cFX - С. (Верхний график): образование тромбина в плазме при низком уровне TF (2пМ) в отсутствие (пунктирная линия) и в присутствии 200 нМ (светлосерая), 600 нМ (темно-серая) 2000 нМ (черная) прямого перорального антикоагулянта эдоксабана на 1 единицу r-hFX (7 мкг/(мл). (Нижний график): образование тромбина в плазме при низком уровне TF (2пМ) с близкими концентрациями эдоксабана на 1 единицу c-FXa - С (16 мкг/мл). Кривые представляют среднее по 2 независимым экспериментам.
- 15 045357
Таблица 1
| Аминокислота | 3-буквенное обозначение [114] | 1-буквенное обозначение11141 | Полярность боковой цепи11141 | Заряд боковой цепи (pH 7,4)11141 | Индекс гидрофобности11151 | Поглощение Амакс (нм) [114] | ε при Амакс (х10'3М‘ 1СМ'1) [116] |
| Аланин | Ala | A | неполярная | нейтральный | 1,8 | ||
| Аргинин | Arg | R | полярная, основная | положительный | -4,5 | ||
| Аспарагин | Asn | N | полярная | нейтральный | -3,5 | ||
| Аспарагиновая кислота | Asp | D | полярная, кислотная | отрицательный | -3,5 | ||
| Цистеин | Cys | C | неполярная | нейтральный | 2,5 | 250 | 0,3 |
| Глутаминовая кислот | Glu | E | полярная, кислотная | отрицательный | -3,5 | ||
| Глутамин | Gin | Q | полярная | нейтральный | -3,5 | ||
| Глицин | Gly | G | неполярная | нейтральный | -0,4 | ||
| Г истидин | His | H | полярная, основная | положительный(10%) отрицательный(90%) | -3,2 | 211 | 5,9 |
| Изолейцин | lie | 1 | неполярная | нейтральный | 4,5 | ||
| Лейцин | Leu | L | неполярная | нейтральный | 3,8 | ||
| Лизин | Lys | К | полярная, основная | положительный | -3,9 | ||
| Метионин | Met | M | неполярная | нейтральный | 1,9 | ||
| Фенилаланин | Phe | F | неполярная | нейтральный | 2,8 | 257,200,188 | 0,2, 9,3, 00,0 |
| Пролин | Pro | P | неполярная | нейтральный | -1,6 | ||
| Серин | Ser | s | полярная | нейтральный | -0,8 | ||
| Треонин | Thr | T | полярная | нейтральный | -0,7 | ||
| Триптофан | Trp | w | неполярная | нейтральный | -0,9 | 280,219 | 5,6, 47,0 |
| Тирозин | Tyr | Y | полярная | нейтральный | -1,3 | 274,222,193 | 1,4, 8,0, 48,0 |
| Валин | Vai | V | неполярная | нейтральный | 2.4 |
Примеры
Пример 1.
Материалы и методы.
Ривароксабан и апиксабан получали из Alsachim (Иллкирш, Франция) и растворяли в ДМСО (~30 мг/мл). Пептидильный субстрат метоксикарбонилциклогексилглицилглициларгинин-п-нитроанилид (Spec-Xa) получали из Sekisui Diagnostics (Стэмфорд, Коннектикут, США). Все реагенты для культур тканей были из Life Technologies (Карлсбад, Калифорния), за исключением инсулин-трансферринселенита натрия (ITS, который получали из Roche (Базель, Швейцария). Малые однослойные фосфолипидные везикулы (PCPS), состоящие из 75% (об./об.) L-фосфатидилхолина куриных яиц и 25% (об./об.) L-фосфатидилсерина из мозга свиньи (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL), получали и исследовали как было описано ранее (Higgins и др., 1983. J Biol Chem 258: 6503-6508). Плазму человека без FX получали из Diagnostica Stago (Париж, Франция). Все функциональные исследования проводили в буферном солевом растворе с HEPES (20 мМ Hepes, 0,15 М NaCl, pH 7,5), содержащем 5 мМ CaCl2 и 0,1% полиэтиленгликоль 8000 (буфер для исследований). Вектор pCMV4 для экспрессии в млекопитающих (Andersson и др., 1989. J Biol Chem. 264: 8222-8229), содержащий рекомбинантный FX человека (r-hFX) был получен в дар от Rodney M. Camire (Camire и др., 2000. Biochemistry 39: 14322-14329). Вектор pcDNA3 получали из Invitrogen, а кДНК РАСЕ была получена в дар от Genetics Institute, Бостон, Массачусетс. Вектор, содержащий фурин, - конвертазу белков-предшественников, описан в патенте США № 5,460,950.
Рекомбинантный фактор V человека (FV) получали, очищали и характеризовали как описано ранее (Bos и др., 2009. Blood 114: 686-692). Рекомбинантный P. textilis змеи FXa (vpt-FXa) получали, очищали и характеризовали как описано ранее (Verhoef и др., Toxin Reviews (2013) (doi:10,3109/15569543,2013,844712). Фактор Ха человека, полученный из плазмы (pd-hFXa), DAPA, протромбин человека и моноклональный IgG мыши против фактора X человека (АНХ-5050) получали из Haematologic Technologies (Эссекс Джанкшн, Вермонт, США). Парные антитела против антигена FX для иммуноферментного анализа ELISA получали из Cedarlane (Берлингтон, Канада). Активатор RW-X получали из Diagnostica Stago (Париж, Франция), или Haematologic Technologies. Эндонуклеазу рестрикции Apal получали из New England Biolabs (Ипсвич, Массачусетс, США). ДНК лигазу Т4 получали из Roche (Roche Applied Science, Индианаполис, Индиана, США).
Последовательность ДНК, кодирующая модифицированный FX-A человека, представлена как SEQ ID NO: 7. Последовательность ДНК, кодирующая модифицированный FX-B человека, представлена как SEQ ID NO: 8. Нуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 4 (для получения модифицированного FX-A человека) или SEQ ID NO: 5 (для получения модифицированного FX-B человека), содержащую на концах участки узнавания Apal синтезировали в Genscript (Piscataway, Нью-Джерси, США), субклонировали в вектор pCMV4 для экспрессии в млекопитающих с использованием Apal и ДНК лигазы Т4- и секвенировали для подтверждения соответствия. Модифицированный FX-А человека и модифицированный FX - В человека также обозначали как mod-hFX-A и mod-hFX-B, соответственно. Стабильные линии клеток HEK293, экспрессирующие r-hFX или модифицированный hFX, получали как
- 16 045357 описано ранее (Larson и др.., 1998. Biochemistry 37, 5029-5038). Клетки HEK293 совместно трансфицировали векторами pCMV4 и pcDNA-PACE с использованием Липофектамина 2000 в соответствии с инструкциями производителя. Экспрессию FX трансфицированными клетками оценивали с помощью модифицированного одностадийного теста на свертываемость с использованием плазмы человека без FX. Трансфицированные клетки с наивысшими уровнями экспрессии переносили в колбы с культурой Т175 и выращивали 24 ч в среде для экспрессии (питательная среда DMEM-F12 без фенолового красного, содержащая: пенициллин/стрептомицин/фунгизон, 2 мМ L-глутамин, 10 мкг/мл ITS, 100 мкг/мл генетицин418 сульфат и 6 мкг/мл витамин K). Среду после выращивания собирали, центрифугировали при 10 000 g для удаления осадка клеток, концентрировали с помощью фильтра с ограниченной полосой пропускания в 10 кДа (Millipore, Дармштадт, Германия), промывали буферным солевым раствором с HEPES и хранили в 50% глицерине при -20°С. Уровни антигена FX в растворах для хранения в глицерине оценивали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа ELISA в соответствии с инструкциями производителя с использованием собранной плазмы человека в качестве стандартного образца, предполагая концентрацию FX в плазме, равную 10 мкг/мл.
Среду для экспрессии добавляли на 24 часа к стабильным линиям клеток, экспрессирующим либо rhFX, либо модифицированный FX-A человека, либо модифицированный FX-B человека. Аликвоту среды после культивирования инкубировали с RW-X (10 нг/мкл; Haematologic Technologies) в течение 120 минут при 37°С. Модифицированный FX-A человека или модифицированный FX-B человека после активации также обозначается как m-hFXa А или m-hFXa В, соответственно. Предполагая, что все варианты FXa имеют близкие аффинности в отношении субстратов, последовательно определяли концентрацию FXa в среде по превращению пептидильного субстрата (Spec-Xa, 250 мкМ) с использованием известных концентраций pd-hFXa в качестве стандарта. Стационарные начальные скорости расщепления макромолекулярного субстрата определяли с интервалами при 25°С, как описано ранее (Camire, 2002. J Biol Chem 277: 37863-70). Вкратце, кривые реакций активации протромбина получали при инкубации PCPS (50 мкМ), DAPA (10 мкМ) и протромбина (1,4 мкМ) с рекомбинантным FV-810 человека (укороченным по домену В, константно активный) и указанные реакции инициировали либо с использованием 0,1 нМ pdhFXa, r-hFXa, m-hFXa В, либо 0,033 нМ m-hFXa А. Скорость превращения протромбина измеряли как описано ранее (Krishnaswamy и др., 1997. Biochemistry 36, 3319-3330).
Рекомбинантный FX и модифицированный FX-A человека и модифицированный FX-B человека (200 нг) активировали с помощью RVV-X (0,5 U/мл) в течение 60 мин при 37°С и подвергали электрофорезу в восстанавливающих условиях (30 мМ дитиотреитол) с использованием готовых гелей с градиентом 4-12% и буферной системы MES (Life Technologies), и переносили на нитроцеллюлозную мембрану с использованием системы Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Калифорния, США). Мембрану обрабатывали антителами против тяжелой цепи FX и визуализировали дорожки белков с использованием флюоресцентных антител Dyelight-800 против мыши антител (Thermo Scientific, Рокфорд, Иллинойс, США). В качестве стандарта использовали hFXa (200 нг), полученный из плазмы.
Образование тромбина осуществляли с помощью адаптированных протоколов, описанных ранее (Hemker и др.., 2003. Pathophysiol Haemost Thromb, 33: 4-15). Вкратце, плазму без FX смешивали с кукурузным трипсиновым ингибитором (70 мкг/мл), буфером (25 мМ HEPES, 175 мМ NaCl, 5 мг/мл БСА, рН 7,5) и PCPS (20 мкМ) и инкубировали в течение 10 мин при 37°С в 96-луночном микропланшете. Образование тромбина инициировали путем добавления pd-hFXa (0,5 нМ) или vpt-FXa (0,5 нМ), предварительно инкубированных с ривароксабаном (0,4 мкМ) или апиксабаном (0,2 мкМ), содержащих FluCa, и немедленно переносили в смесь с плазмой. Конечный объем реакции составлял 120 мкл, из которых 64 мкл составляла плазма без FX. Образование тромбина определяли каждые 20 с в течение 30 мин и корректировали с помощью калибратора с использованием программного обеспечения (Thrombinoscope, версия 5.0). Средний потенциал эндогенного тромбина (площадь под кривой образования тромбина) рассчитывали по, по меньшей мере, двум независимым экспериментам. Калибратор и флуоресцентный субстрат (FluCa) приобретали в Thrombinoscope (Маастрихт, Нидерланды).
Превращение пептидильного субстрата (Spec-Xa, конечная концентрация 250 мкМ) для каждого варианта FXa осуществляли в отсутствие и в присутствии прямых ингибиторов FXa ривароксабана и апиксабана (конечная концентрация 0,001 мкМ - 100 мкМ) при температуре окружающей среды. Исходные растворы pd-hFXa (конечная концентрация 2 нМ) или vpt-FXa (конечная концентрация 10 нМ) без кальция разбавляли буфером для исследования и инкубировали в 96-луночном микропланшете в присутствии буфера для исследования или ингибитора в течение 2 мин. Превращение субстрата инициировали с помощью Spec-Xa и измеряли абсорбцию в течение 10 мин при 405 нМ на планшетном ридере SpectraMax M2e, оснащенном программным обеспечением Softmax Pro (Molecular Devices, Саннивэйл, Калифорния, США). Для того, чтобы оценить чувствительность к DFXI каждого рекомбинантного варианта FX, исходные растворы в глицерине (5-40 мкл) r-hFX, модифицированного FX-A человека и модифицированного FX-B человека разбавляли буфером для исследования и инкубировали с RW-X (0,5 U/мл) в течение 60 мин при 37°С. Активированные исходные растворы последовательно разбавляли буфером для исследования, инкубировали в течение 2 мин в 96-луночном микропланшете в присутствии буфера для иссле- 17 045357 дования или ингибитора и определяли превращение субстрата, как описано ранее. Относительные концентрации rhFX, m-hFXa А и m-hFXa В оценивали по скорости превращения субстрата в отсутствие ингибитора с использованием известных концентраций pd-hFXa в качестве стандарта.
Результаты.
(Vpt)-FXa, полученный из яда змеи P. textilis, устойчив к ингибированию прямыми ингибиторами фактора Ха DFXI.
Биохимическая характеристика очищенного рекомбинантного FXa (vptFXa), полученного из яда змеи P. textilis, выявила, что эта протеаза, в отличие FXa всех других видов, известных в настоящее время, устойчива к ингибированию прямыми антикоагулянтами ривароксабаном и апиксабаном, которые были сконструированы для обратимого блокирования активного сайта FXa. В соответствии с предыдущими наблюдениями, Ki ингибирования FXa человека (hFXa) составляла примерно 1 нМ (Perzborn, 2005. J Thromb Haemost, 3, 514-521), при этом ингибирование vptFXa было по меньшей мере в 1000 раз снижено (фиг. 2А). Эти наблюдения подтвердились в системе с плазмой, имитирующей образование фибрина in vivo, демонстрируя, что физиологические концентрации ингибиторов FXa практически не оказывали влияние на образование тромбина, инициированное vptFXa, в то время как в присутствии hFXa наблюдалось его значительное снижение (фиг. 2В, С).
Химерные FXa человека и яда змеи P. textilis.
Обнаруженный структурный элемент, который не только ограничен vptFXa, но также присутствует в FX из яда австралийской змеи Notechis scutatus, составляет измененный аминокислотный состав в положении рядом с активным сайтом hFXa (фиг. 1С). С учетом его расположения, мы предположили, что эта уникальная спираль может модулировать взаимодействие не только с ривароксабаном и/или апиксабаном, но и с FVa, поскольку указанный сайт связывания FVa является С-концевым в этой спирали (Lee и др., 2011. J Thromb Haemost 9: 2123-2126). Для проверки этой гипотезы, мы создали две кодирующие белок конструкции ДНК, обозначенные как SEQ ID NO: 7 и 8. Химера mod-hFX-A, обозначенная как SEQ ID NO: 7, содержит соответствующую последовательность ДНК N. scutatus (обозначенную жирным шрифтом и подчеркнутую), а химера mod-hFX-B, обозначенная как SEQ ID NO: 8, содержит соответствующую часть последовательности P. textilis (обозначенную жирным шрифтом и подчеркнутую).
С использованием этих конструкций ДНК мы создали линии клеток HEK293, которые стабильно продуцировали оба химерных белка, и последовательно определяли уровни экспрессии модифицированного FX человека в клетках HEK293 посредством культивирования указанных клеток в среде для экспрессии в течение 24 ч. Анализ методом Вестерн-блот выявил экспрессию полноразмерного FX для обоих химерных вариантов, сходную с экспрессией природного FX (фиг. 3А). Инкубация с активатором из яда гадюки Рассела (RVV-X) приводила к протеолитической активации примерно 30% зимогена FX в FXa, проявлявшейся в появлении дорожки тяжелой цепи размером ~29 кДа. Тяжелая цепь как модифицированного FXa-A человека, так и модифицированного FXa-B человека, двигалась как белок несколько большей массы, что соответствует введению последовательности из змеи, которая на 12 или 13 остатков длиннее, по сравнению с последовательностью FXa человека, соответственно. Анализ уровней антигена FX в среде для выращивания показал, что в то время как экспрессия mod-hFX-A была снижена примерно в 7 раз, экспрессия mod-hFX-B была близка к экспрессии природного FX человека (фиг. 3В). Низкие уровни FX антигена mod-hFX-A коррелировали с такими же низкими уровнями активности FX, которые мы наблюдали при использовании модифицированного анализа коагулирующей активности. Это указывает на то, что экспрессия белка mod-hFX-A является близкой к оптимальной по сравнению с экспрессией других вариантов FX, его функция FX не нарушается.
Для проверки активности зимогена FX мы превращали rFX и модифицированный FX-A человека и модифицированный FX-B человека в FXa с использованием активатора FX из яда гадюки Рассела (RVVX). Как модифицированный FXa-A человека, так и модифицированный FXa-B человека продемонстрировали протеазную активность при активации RVV-X, что определили по превращению низкомолекулярного пептидильного субстрата SpectroZyme Xa, специфичного к FXa. В дополнение, скорости протромбинового превращения в присутствии кофактора FVa человека были близки к скоростям в присутствии FXa человека (как pd-hFXa, так и r-hFXa) (фиг. 4). В совокупности, эти наблюдения позволяют предположить, что вставки последовательности змеи не вызывают значительных изменений ферментативных свойств FX человека
Ингибирование химер FXa прямыми ингибиторами фактора Ха. Для оценки константы ингибирования (Ki) ривароксабана и апиксабана для модифицированного FX-A человека, активированного RW-X, активированный рекомбинантный белок предваритель но инкубировали с 0,001 до 100 мкМ ингибитора и затем изучали его каталитическую активность в отношении SpectroZyme Xa. Хотя инкубация с 0,5 мкМ ривароксабана приводила к полному ингибированию r-hFXa и pd-hFXa, mod-hFXa-A оставался полностью активным в этих условиях (фиг. 5А). Более того, указанный химерный вариант демонстрировал частичную хромогенную активность после инкубации с 100 мкМ ривароксабана, также как и FXa змеи P. textilis. Эти данные указывают на то, что Ki при ингибировании mod-hFXa-A по меньшей мере в 100 раз выше, чем константа FXa человека. Мы наблюдали сходное снижение чувствительности к ингибированию апиксабаном (фиг. 5В).
- 18 045357
Оценка ингибирования mod-hFXa-B ривароксабаном и апиксабаном показала, что Ki близка к значению этой константы для mod-hFXa-A (фиг. 6А и 6В). Таким образом, была продемонстрирована сниженная чувствительность к ингибированию апиксабаном и ривароксабаном. И наконец, ингибирование прямыми ингибиторами фактора Ха химерных FXa вариантов не изменялось в присутствии кофактора FVa и отрицательно заряженных фосфолипидных везикул, что позволяет предположить, что как свободная протеаза, так и протеаза, связанная в комплексе FVa-FXa-липиды, в равной степени устойчива к ингибированию ривароксабаном и апиксабаном (фиг. 7А, В).
Пример 2.
Материалы и методы.
Если не указано иное, материалы и методы, использованные в настоящем Примере, совпадали с материалами и методами, указанными в примере 1, или были аналогичны им.
Конструкции для экспрессии рекомбинантного FX: ДНК, кодирующую химерный FX-A (c-FX А), химерный FX-B (c-FX В) и химерный FX-C (c-FX С), синтезировали в Genscript (Пискатауэй, НьюДжерси, США), субклонировали в вектор pCMV4 для экспрессии в млекопитающих с использованием Apal и ДНК лигазы Т4 и секвенировали для проверки. Стабильные линии клеток HEK293, экспрессирующих рекомбинантный FX человека или рекомбинантный химерный FX, получали, как было описано ранее (Larson и др., 1998. Biochemistry 37, 5029-5038). Клетки HEK293 одновременно трансфицировали векторами pCMV4 и pcDNA-PACE с помощью Lipofectamine2000 в соответствии с инструкциями производителя.
Очистка химерного FX(a): Рекомбинантные химерные продукты FXA, В и С получали, очищали и исследовали, в соответствии с описанной ранее процедурой (Camire и др., 2000), за исключением того, что иммуноаффинную очистку заменяли очисткой FX в градиенте кальция на сефарозной колонке POROS HQ20. Обычный выход полностью γ-карбоксилированного рекомбинантного FX составлял 0,9 мг/л среды для выращивания. Очищенный рекомбинантный химерный FX активировали RW-X (0,1 U/мг FX), выделяли гель-фильтрацией на колонке Sephacryl S200 HR (Vt 460 мл) и хранили при -20°С в HBS, содержащем 50% об./об. глицерина. Очищенные продукты визуализировали окрашиванием кумасси.
Активация макромолекулярного субстрата: Стационарные начальные скорости реакции расщепления макромолекулярного субстрата определяли прерывисто при 25°С как описано ранее (Camire, 2002). Вкратце, кривые реакций активации протромбина получали при инкубации PCPS (50 мкМ), DAPA (10 мкМ), и протромбина (1,4 мкМ) с рекомбинантным FV-810 человека (20 нМ, с укороченным доменом В, константно активный FV), и реакцию инициировали с использованием 0,1 нМ pd-hFXa, r-hFXa, c-FXa A, c-FXa В или c-FXa С. Скорость превращения протромбина измеряли как описано ранее (Krishnaswamy и др., 1997). Превращение протромбина исследовали в отсутствие или в присутствии прямых ингибиторов FXa эдоксабана (регистрационный номер CAS 912273-65-5; произведенный Daiichi Sankyo, продающийся как Savaysa) и апиксабана (конечная концентрация 0,001 мкМ - 100 мкМ) для определения чувствительности DOAC каждого рекомбинантного варианта FXa.
Исследования образования тромбина: Протокол образования тромбина адаптировали на основании ранее описанного протокола (Hemker и др., 2003). Вкратце, кривые образования тромбина получали путем добавления в плазму, не содержащую FX, тканевого фактора (TF, конечная концентрация 2 или 20 пМ), ингибитора трипсина из кукурузы (70 мкг/мл), препарата фосфолипидов PCPS (20 мкМ) и 1 Ед (протромбиновая активность свертывания к определенному времени) r-hFX (7 мкг/мл) или химерного FX-C (16 мкг/мл). Образование тромбина инициировали добавлением субстратного буфера (Fluca) к плазме. Кривые образования тромбина в присутствии FXa получали путем добавления в плазму, не содержащую FX, кукурузного трипсинового ингибитора (70 мкг/мл), буфера для исследования и PCPS (20 мкМ). Образование тромбина инициировали путем добавления FXa, предварительно смешанного с ривароксабаном или апиксабаном, буфером для исследования без кальция и буфером Fluca. Конечный объем реакции составлял 120 мкл, из которых 64 мкл составляла плазма без FX. Образование тромбина определяли каждые 20 секунд в течение 30 минут и корректировали с помощью калибратора с использованием программного обеспечения Thrombinoscope. Время задержки, средний потенциал эндогенного тромбина (площадь под кривой образования тромбина), время удерживания и пик образования тромбина рассчитывали на основании по меньшей мере 3 независимых экспериментов.
Результаты.
Вставка 9-13 остатков в доменах сериновой протеазы змеи P. textilis, изоформы FXa змей P. textilis и N. scutatis побудила к конструированию химерных FX человека и змеи. Авторы создали три конструкции ДНК, кодирующие белки, включающие каждую из этих вставок в FXa человека (фиг. 9). С использованием этих конструкций ДНК создали линии клеток HEK293, которые стабильно продуцируют один из: нормального рекомбинантного FX человека (r-hFX) и трех типов химерного FX (c-FX A, c-FX В и c-FX С). Уровни экспрессии рекомбинантного FX человека и химерных FX в клетках HEK293 определяли путем выращивания этих клеток в среде для экспрессии в течение 24 ч, после чего активность свертывания среды оценивали с помощью модифицированного одностадийного исследования свертывания РТ в плазме без FX. Рекомбинантный γ-карбоксилированный FX очищали от среды для выращивания последова
- 19 045357 тельными стадиями ионообменной хроматографии. Фракции растворов FX последовательно активировали активатором FX из яда гадюки Рассела, выделяли гель-фильтрацией и охарактеризовали с помощью SDS-ПААГ. Тяжелая цепь очищенного фактора Ха, выделенного из плазмы, двигалась как смесь 50/50 с FXa-α и FXa-β размером ~34-31 кДа. Хотя автопротеолитическое отщепление С-концевого участка FXaα (остатки 436-447) приводит к образованию β формы FXa, обе изоформы функционально являются сходными в отношении образования комплекса с протромбиназой, активации протромбина, узнавания антитромбина и превращения пептидильного субстрата (Pryzdial и Kessler, 1996).
Очищенные продукты r-hFXa и химерные FXa-В и -С двигались главным образом как FXa-β, в то время как химерный FXa-А двигался как смесь 50/50 α и β FXa (фиг. 10А). Кинетика активации макромолекулярного субстрата с помощью r-hFXa и химерных FXa (А/В/С) в отрицательно заряженных фосфолипидных везикулах (PCPS) в присутствии кофактора FVa продемонстрировала, что все химерные варианты включаются в комплекс протромбиназы. Однако, скорость катализа химерных вариантов FXaА, -В и -С в , соответственно, 8,2-, 6,8- и 2,3 раза ниже по сравнению с рекомбинантным FXa человека. Более того, рекомбинантно полученный FXa человека демонстрирует незначительное снижение эффективности катализа по сравнению с FXa, полученным из плазмы (фиг. 10В).
Для определения константы ингибирования (Ki) DOACs (апиксабан, эдоксабан) для химерных FXa (А/В/С), исследовали кинетику активации протромбина в присутствии 0,001-100 мкМ DOAC. Несмотря на то, что FXa, полученный из плазмы и рекомбинантный FXa человека полностью ингибировались близкими к эквимолярным концентрациями DOAC, все химерные варианты FXa были способны осуществлять превращение протромбина при значительно более высоких концентрациях ингибиторов FXa (Ki апиксабана:130-1270 нМ, Ki эдоксабана: 3-270 нМ) (фиг. 11). Учитывая то, что химерные варианты FXa содержат сходным образом расположенные вставки различной длины и различного состава аминокислот, авторы предположили, что сниженная чувствительность к разным DOAC является прямым следствием расположения этих вставок в непосредственной близости к остатку Tyr99, координирующему DOAC, и/или активному центру.
Для оценки потенциала химерного FXa в восстановлении образования тромбина в плазме, обогащенной прямыми пероральными антикоагулянтами, проводили исследование образования тромбина (TG). Образование тромбина в плазме человека без FX, инициированное FXa (5нМ), продемонстрировало нормальный профиль TG для варианта c-FXa С, и близкие к нормальным профили для вариантов cFXa А и В А и В. (фиг. 12А). Несмотря на то, что апиксабан (2 мкМ) существенным образом увеличивал время запаздывания и снижал пик образования тромбина в исследовании образования тромбина, инициированного pd-FXa- и r-hFXa, эти параметры не изменялись в присутствии химерных вариантов FXa (фиг. 12В) (табл. 2). Эти результаты показывают, что химерные варианты FXa способны восстанавливать гемостаз в плазме, содержащей прямые пероральные антикоагулянты. В дополнение, зимогенная форма химерного FX-C также способна поддерживать образование тромбина плазме без FX. Инициация коагуляции низкими концентрациями тканевого фактора (TF, 2 пМ) приводило к получению устойчивой кривой TG для химерного FX-C, не подверженной влиянию апиксабана, в отличие от TG для r-hFX (фиг. 13). При низких концентрациях TF химерный FX-C демонстрирует короткое запаздывание в начале TG и время для пика, в дополнение, химерный FX-C имеет более высокий эндогенный тромбиновый потенциал (ЭТП) и более высокий пик образования тромбина (табл. 3). Однако, эти значения нормализуются при высоких концентрациях TF (20 пМ) (фиг. 13) (табл. 3). Основываясь на наблюдениях, сделанных в исследовании образования тромбина, инициированном FXa, мы ожидаем, что зимогенные формы химерных вариантов FX A и В также поддерживают образование тромбина, инициируемое тканевым фактором, в плазме, обогащенной прямые пероральные антикоагулянты. Фиг. 14 в комбинации с табл. 4 обеспечивают дальнейшие доказательства влияния химерных вариантов FXa на восстановление гемостаза в плазме, содержащей ингибиторы прямых пероральных антикоагулянтов. Суммируя вышесказанное, эти результаты демонстрируют, что химерный FX(a) способен восстанавливать гемостаз в плазме, содержащей ингибиторы DOAC, как в виде зимогенной формы, так и в форме протеазы.
Таблица 2
Влияние апиксабана на параметры образования тромбина, инициированного FXa pd-FXa r-hFXa c-FXa-А c-FXa-Β c-FXa-C
| Блокировка времени запаздывания, сек | 299 | 293 | 61 | 12 | 3 |
| Задержка времени появления пика, сек | 515 | 467 | 120 | 30 | 7 |
- 20 045357
| Пик образования тромбина, % от опыта без апиксабана | 26 | 33 | 78 | 85 | 99 |
| Площадь под кривой, % от опыта без апиксабана | 67 | 76 | 89 | 92 | 101 |
Приведенные значения обозначают значения образования тромбина, полученные в присутствии апиксабана с поправкой на значения образования тромбина, полученные в отсутствие апиксабана.
Таблица 3
Суммарные данные экспериментов по образованию тромбина, инициированных низкой и высокой концентрациями TF
Низкая r-hFXa r-hFXa + c-FXa-C c-FXa-C + концентрация апиксабан апиксабан
TF, 2 п/М
| Время запаздывания, сек | 132 ±5 | 696 ±162 | 185 ± 12 | 186 ±6 |
| Время появления пика, сек | 324 ±6 | нет пика | 480 ± 24 | 492 ± 23 |
| Пик тромбина нМ | 61 ±4 | 8±4 | 78 ± 1 | 72 ±4 |
| ЭТП, нМ | 567 ± 61 | нет ЭТП | 830 ±131 | 756 ± 38 |
| Высокая концентрация TF, 20 п/М | r-hFXa | r-hFXa + апиксабан | c-FXa-C | c-FXa-C + апиксабан |
| Время запаздывания, сек | 48 ± 1 | 138 ± 12 | 72 ±2 | 78 ±2 |
| Время появления пика, сек | 114 ± 6 | 804 ± 36 | 138 ±6 | 144 ±9 |
| Пик тромбина нМ | 338 ±8 | 32 ±4 | 334 ± 15 | 321 ± 15 |
| ЭТП, нМ | 973 ± 18 | 694 ± 67 | 1027± 19 | 1012 ±33 |
- 21 045357
Таблица 4
Влияние эдоксабана на параметры TG, инициированного TF, для r-hFX и c-FX-C r-hFX
| Эд оксабан, нМ | контроль | 50 | 100 | 200 | 400 | 600 | 1000 | 2000 |
| Время запаздывания, сек | 115 | 247 | 297 | 397 | 538 | 679 | 874 | 1180 |
| Оставшийся ЭТП | 100 % | 99,3 | 87,1 | нет ЭТП | нет ЭТП | нет ЭТП | нет ЭТП | нет ЭТП |
| Высота пика, % | 100 % | 41,2 | 30,8 | 23,1 | 15,9 | 13,0 | 10,1 | 7,1 |
| Время появления пика, сек c-FX-C | 265 | 618 | 756 | 1290 | 1890 | 1932 | 2472 | 2562 |
| Эд оксабан, нМ | контроль | 50 | 100 | 200 | 400 | 600 | 1000 | 2000 |
| Время запаздывания, сек | 188 | 161 | 161 | 12 | 182 | 197 | 212 | 232 |
| Оставшийся ЭТП | 100 % | 87,9 | 92,5 | 88,3 | 92,7 | 96,8 | 92,7 | 82,0 |
| Высота пика, % | 100 % | 109,3 | 112,3 | 101,0 | 94,6 | 88,7 | 77,5 | 65,3 |
| Время появ- | 433 | 382 | 388 | 418 | 448 | 483 | 538 | 578 |
ления пика, сек
Приведенные значения обозначают экспериментальные значения TG, полученные в присутствии повышающихся концентраций эдоксабана.
Claims (16)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Рекомбинантный белок, содержащий полипептид фактора свертывания Ха млекопитающего, причем указанный полипептид имеет изменение или делецию аминокислотного остатка, соответствующего аминокислотному остатку Phe-396 последовательности SEQ ID NO:1, причем указанный измененный белок каталитически активен и имеет сниженную чувствительность к ингибированию прямым ингибитором фактора Ха по сравнению с неизмененным полипептидом фактора Ха.
- 2. Белок по п.1, отличающийся тем, что изменение или делеция аминокислотного остатка, соответствующего аминокислотному остатку Phe-396, скомбинирован с вставкой 1-20 аминокислотных остатков в области, соответствующей области аминокислотных остатков между His-311 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1.
- 3. Белок по п.2, дополнительно содержащий замену от 1 до 8 аминокислотных остатков в области аминокислотных остатков между His-311 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1.
- 4. Белок по п.2 или 3, отличающийся тем, что область аминокислотных остатков, соответствующая области аминокислотных остатков между His-311 и Asp-320 последовательности SEQ ID NO: 1, имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11.
- 5. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность ДНК, которая кодирует рекомбинантный белок по любому из пп. 1-4.
- 6. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.5.
- 7. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.5 или вектор экспрессии по п.6.
- 8. Фармацевтическая композиция, содержащая белок по любому из пп.1-4 и фармацевтически приемлемый носитель для лечения кровотечений.
- 9. Применение белка по любому из пп.1-4 для лечения или предотвращения осложнений в виде кровотечений, связанных с антикоагулянтной терапией с применением прямого ингибитора фактора Ха.- 22 045357
- 10. Применение белка по любому из пп.1-4 для приготовления лекарственного средства для полного или частичного обращения осложнений в виде кровотечений, связанных с применением прямого ингибитора фактора Ха у субъекта.
- 11. Применение по п.9 или 10, отличающееся тем, что прямой ингибитор фактора Ха представляет собой ривароксабан (5-хлор-М-[[(5 S)-2-okco-3 - [4-(3-оксо-4-морфолинил)фенил]-5-оксазолидинил] метил] 2-тиофенкарбоксамид), апиксабан (1-(4-метоксифенил)-7-оксо-6-[4-(2-оксопиперидин-1-ил)фенил]4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пиразоло[3,4-с]пиридин-3-карбоксамид), эдоксабан (N'-(5-хлоропиридин-2-ил)-N[(1 S,2R,4S)-4-(диметилкарбамоил)-2-[(5 -метил-6,7-дигидро-4Н- [ 1,3]тиазоло[5,4-с]пиридин-2карбонил)амино]циклогексил]оксамида, 4-метилбензолсульфоновая кислота) и/или бетриксабан (N-(5хлоропиридин-2-ил)-2-[ [4-(N,N-диметилкарбамимидоил)бензоил] амино]-5 -метоксибензамид).
- 12. Применение фармацевтической композиции по п.8 для лечения или предотвращения осложнений в виде кровотечений, связанных с антикоагулянтной терапией с применением прямого ингибитора фактора Ха.
- 13. Применение фармацевтической композиции по п.8 для приготовления лекарственного средства для полного или частичного обращения осложнений в виде кровотечений, связанных с применением прямого ингибитора фактора Ха у субъекта.
- 14. Применение по п.12 или 13, отличающееся тем, что прямой ингибитор фактора Ха представляет собой ривароксабан (5-хлор-Щ[(5 S)-2-okco-3 - [4-(3-оксо-4-морфолинил)фенил]-5-оксазолидинил] метил] 2-тиофенкарбоксамид), апиксабан (1-(4-метоксифенил)-7-оксо-6-[4-(2-оксопиперидин-1-ил)фенил]4,5,6,7-тетрагидро-1Н-пиразоло[3,4-с]пиридин-3-карбоксамид), эдоксабан (N'-(5-хлоропиридин-2-ил)-N[(1 S,2R,4S)-4-(диметилкарбамоил)-2-[(5 -метил-6,7-дигидро-4Н- [ 1,3]тиазоло[5,4-с]пиридин-2карбонил)амино]циклогексил]оксамида, 4-метилбензолсульфоновая кислота) или бетриксабан (N-(5хлоропиридин-2-ил)-2-[ [4-(N,N-диметилкарбамимидоил)бензоил] амино]-5 -метоксибензамид).
- 15. Способ полного или частичного обращения антикоагулянтного эффекта прямого ингибитора фактора Ха у субъекта, причем указанный способ включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества белка по любому из пп.1-4 или фармацевтической композиции по п.8.
- 16. Способ по п.15, отличающийся тем, что прямой ингибитор фактора Ха представляет собой ривароксабан (5 -χλορ-Ν-[[(5 S)-2-okco-3- [4-(3-оксо-4-морфолинил)фенил] -5-оксазолидинил]метил] -2- тиофенкарбоксамид), апиксабан (1-(4-метоксифенил)-7-оксо-6-[4-(2-оксопиперидин-1-ил)фенил]-4,5,6,7тетрагидро-1Н-пиразоло[3,4-с]пиридин-3-карбоксамид), эдоксабан (N'-(5-хлоропиридин-2-ил)-N[(1 S,2R,4S)-4-(диметилкарбамоил)-2-[(5 -метил-6,7-дигидро-4Н- [ 1,3]тиазоло[5,4-с]пиридин-2карбонил)амино]циклогексил]оксамида, 4-метилбензолсульфоновая кислота) или бетриксабан (N-(5хлоропиридин-2-ил)-2-[ [4-(N,N-диметилкарбамимидоил)бензоил] амино]-5 -метоксибензамид).
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP14169895.1 | 2014-05-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA045357B1 true EA045357B1 (ru) | 2023-11-17 |
Family
ID=
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102057767B1 (ko) | 응고 인자 및 다중특이적 항체의 조합 요법 | |
| US20220288172A1 (en) | Prohemostatic proteins for the treatment of bleeding | |
| KR20120061898A (ko) | 출혈성 장애의 치료요법 및 예방 치료에 있어서의 비정맥내 투여를 위한 알부민 융합 응고 인자 | |
| US11560436B2 (en) | Anti-VWF D'D3 single-domain antibodies fuse to clotting factors | |
| JP6629744B2 (ja) | 第Ｘａ因子の半減期を延ばす組成物および方法 | |
| EA045357B1 (ru) | Прогемостатические белки для лечения кровотечений | |
| KR20180089439A (ko) | 재조합 세린 프로테아제 | |
| Dagher et al. | Toward non-factor therapy in hemophilia: an antithrombin insensitive Gla-domainless factor Xa as tissue factor pathway inhibitor bait | |
| WAN | Identification and Characterization of Novel Anticoagulants from Bungarus fasciatus Venom |