KR20180089439A

KR20180089439A - 재조합 세린 프로테아제

Info

Publication number: KR20180089439A
Application number: KR1020187017489A
Authority: KR
Inventors: 다니엘 버호프; 피터 에이치. 레잇스마; 메틴 에이치.에이. 보스
Original assignee: 아카데미슈 지켄후이스 라이덴
Priority date: 2015-11-25
Filing date: 2016-11-25
Publication date: 2018-08-08
Also published as: CA3006175A1; SG11201804413XA; AU2016358796A1; MA43312A; CN108463553A; US20180340163A1; EP3380610A1; HK1255343A1; JP2018537976A; EA201891012A1; MX2018006479A; IL259532A; WO2017091074A1; BR112018010603A2

Abstract

본 발명은 세린 프로테아제 저해제의 존재 하에서 세린 프로테아제 활성을 갖고 예를 들면 세린 프로테아제 저해제로 치료한 대상에서 세린 프로테아제 저해제 효과를 완전히 또는 부분적으로 길항할 수 있는 세린 프로테아제 폴리펩티드를 포함하는 재조합 단백질에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 명세서에는 응고 저해제의 항응고 효과를 완전히 또는 부분적으로 길항하기 위한 재조합 단백질과 방법이 기재되어 있다.

Description

재조합 세린 프로테아제

본 발명은 의료용 제제 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 세린 프로테아제 저해제의 존재 하에서 세린 프로테아제 활성을 가진 특이적 재조합 세린 프로테아제에 관한 것이다.

현재 세린 프로테아제의 프로테아제 활성을 수행하는 것을 방지 또는 저해하는 개발 중의 세린 프로테아제 저해제의 수가 꾸준히 증가하고 있다. 세린 프로테아제(또는 세린 엔도펩티다아제)는 세린이 프로테아제의 활성 부위에서 친핵성 아미노산으로 작용하여 단백질 내 펩티드 결합을 절단하는 효소이다(Hedstrom, 2002. Chem Rev 102: 4501-4524). 인체에서 세린 프로테아제는 소화, 면역반응, 혈액응고와 생식을 포함한 다양한 생리 과정을 조정하는 역할을 한다(Hedstrom, 2002. Chem Rev 102: 4501-4524). 잘 알려진 몇몇 세린 프로테아제에는 트롬빈, 혈액응고 인자 XIa, 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자와 트립신이 포함되며, 앞의 2개는 혈액응고에 관여한다.

세린 프로테아제는 합성 화학 저해제와 천연 단백질성 저해제를 포함한 다양한 군의 저해제들에 의해 저해될 수 있다. "serpins"(세린 프로테아제 저해제의 약칭)라고 하는 천연 저해제 계열은 세린 프로테아제와 공유 결합을 형성하여 그의 기능을 저해할 수 있다. 가장 잘 연구된 세린 프로테아제 저해제 중 일부는 각각 혈액응고와 폐기종에서의 역할이 알려져 있는 항트롬빈과 알파 1-항트립신이다.

직접 트롬빈 저해제(DTI)와 같은 직접 세린 프로테아제 저해제가 개발 중에 있으며, 치료 효과가 빠르고 투여가 용이하며 감시 요건이 없어 가까운 미래에 항트롬빈과 같은 전형적인 경구 항응고제를 크게 대체할 것으로 기대된다(He et al., 2015. Molecules 20, 11046-11062; Wang et al., 2015. Arch Pharm 348: 595-605). 이들 저해제는 세린 프로테아제의 활성 부위를 표적으로 하며 일반적으로 경구 투여에 적합한 소형 분자이다. 1가 DTI류는 특히 아르가트로반, 멜라가트란 -또는 그의 프로드러그(prodrug)인 지멜라가트란-, 다비가트란 -또는 그의 프로드러그인 다비가트란 에텍실레이트- 또는 이들의 유사체, 펩티드 또는 펩티드 모방체 저해제(Mehta et al., 2014. Expert Opin Ther Pat. 24: 47-67), RWJ-671818 또는 그의 유사체(Lu et al., 2010. J Med Chem 53: 1843-1856), 3-(2-페네틸아미노)-6-메틸-1-(2-아미노-6-메틸-5-메틸렌카르복사미도메틸피리디닐)피라지논 또는 그의 유사체(Sanderson et al., 1998. J Med Chem 41: 4466-4474), (E)-N-(3-((1-(벤조[b]티오펜-2-일메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)페닐)-2-(3-클로로페닐)에텐설폰아미드 또는 그의 유사체(Siles et al., 2011. Bioorg med Chem Lett 21: 5305-5309), N-{3-[(3-플루오로벤질)옥시]페닐}-1-피리딘-4-일피페리딘-4-카르복사미드 또는 그의 유사체(de Candia et al., 2013, J Med Chem 56: 8696-8711), Merck 사의 compound 2 또는 그의 유사체(Morrissette et al., 2004. Bioorg Med Chem Lett 14: 4161-4164)를 포함한다. 1가 DTI류는 트롬빈의 활성 부위에 견고하게 결합하여 그의 프로테아제 활성을 막도록 특별히 고안되었다.

응고 인자 XIa에 대한 1가의 직접 저해제 또한 발견되었고 특히 4,5,6-삼치환 피리미딘 유도체(US 특허 US8609676 B2), BMS-262084(Schumacher et al., 2007. Eur J Pharmacol 570: 167-174), Bristol-Meyers Squibb 사의 compound 1 또는 그의 유사체(Quan et al., J Med Chem 2014, 57: 955-969), Bristol-Meyers Squibb 사의 compound 2와 compound 33 또는 이들의 유사체(Pinto et al., 2015. Bioorg Med Chem Lett 25: 1635-1642), AstraZeneca 사의 compound 13 또는 그의 유사체(Fjellstrom et al., 2015. PLoS One 10: e0113705), 아릴보론산(Lazarova et al., 2006. Bioorg Med Chem Lett 16: 5022-5027) 및 대환식 인돌(Hanessian et al., 2010. Bioorg Med Chem Lett 20: 6925-6928)을 포함한다.

유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자에 대한 1가 저해제는 특히 WX-UK1 -또는 그의 프로드러그로서 메수프론(Mesupron) 또는 WX-671이라고도 알려져 있는 우파모스타트(Upamostat)- 및 APC-10302 또는 그의 유사체(Katz et al., 2001. Chem Biol 8: 1107-1121)를 포함한다. 흥미로운 것은 직접 트롬빈 저해제인 멜라가트란과 직접 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 저해제인 APC-10302 또한 트립신의 활성 부위에 결합하여 그의 세린 프로테아제 활성을 저해할 수 있는 것으로 밝혀졌다(Dullweber et al. 2001, J Mol Biol 313: 593-614, Katz et al., 2001. Chem Biol 8: 1107-1121).

세린 프로테아제 저해제의 사용을 방해하는 것은 정상적인 세린 프로테아제 활성의 효과적인 회복을 위해 일반적으로 세린 프로테아제의 완전한 치환이나 대상으로부터 저해제의 효과적인 제거가 필요하다는 점이다. 이는 저해 후 세린 프로테아제 활성의 유도를 바람직하게는 임상 및 비임상 환경 모두에서 시간 경과에 따라 점진적이 아닌 즉각적으로 그리고 직접적으로 달성할 수 있어야 하기 때문에 단점이다. 예를 들면 항응고제 요법과 관련하여 특이적 길항(reversal) 전략이 일반적으로 결여되어 예를 들면 트롬빈의 저해제 적용 후에 치명적일 수 있는 출혈 합병증이 나타날 수 있다. 후자의 경우에 네덜란드에서만 연간 항응고제로 치료받은 5,000명이 넘는 환자가 800명이 넘는 사망자를 포함하여 중증의 좋지 않은 출혈 사례를 겪는다는 사실을 예로 들 수 있다(Adriaansen H., et al.: "Samenvatting Medische Jaarverslagen van de Federatie van Nederlandse Trombosediensten", 2014, 1-38).

현재 세린 프로테아제 저해제의 저해 효과를 방지 및 중지시키는 직접적이고 즉각적인 길항 전략은 이용 가능하지 않다.

본 발명은 이 문제를 트롬빈, 응고 인자 XIa, 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자와 트립신을 포함하는 군으로부터 선택되는 세린 프로테아제 폴리펩티드를 포함하되 상기 폴리펩티드가 외부-표면(outer-surface) 펩티드 구조에 삽입된 적어도 하나의 아미노산 잔기를 포함하고 상기 펩티드 구조가 서열번호 1의 Gly-427과 Asp-462 사이, 바람직하게는 His-450과 Asp-462 사이, 보다 바람직하게는 His-450과 Leu-459 사이 아미노산 잔기의 영역; 서열번호 2의 Val-463과 Asp-480 사이, 바람직하게는 His-469와 Asp-480 또는 Ser-477 사이 아미노산 잔기의 영역; 서열번호 3의 Leu-73과 Asp-107 사이, 바람직하게는 His-76과 Asp-107 사이, 보다 바람직하게는 Gln-87과 Asp-107 사이, 가장 바람직하게는 His-96과 Leu-104 또는 Asp-107 사이 아미노산 잔기의 영역; 서열번호 4의 Val-237과 Asp-275 사이, 바람직하게는 Phe-254 또는 Val-256과 Asp-275 또는 Asn-274 사이, 보다 바람직하게는 His-262와 Asp-275, Asn-274 또는 Ala-271 사이 아미노산 잔기의 영역인 재조합 단백질을 세린 프로테아제 저해제의 저해 효과를 방지 및 중지시키는 충분한 길항 전략으로서 제공함으로써 해결한다.

바람직하게, 상기 세린 프로테아제 폴리펩티드는 트롬빈, 응고 인자 XIa, 트립신과 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자, 바람직하게는 인간 트롬빈, 인간 응고 인자 XIa, 인간 트립신과 인간 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 서열번호 1은 인간 프로트롬빈의 아미노산 서열을 제공하고, 서열번호 2는 인간 응고 인자 XI의 아미노산 서열을 제공하고, 서열번호 3은 인간 트립신-1의 아미노산 서열을 제공하고, 서열번호 4는 인간 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자의 아미노산 서열을 제공한다는 점을 분명히 한다.

트롬빈의 경우에는 서열번호 1의 Gly-427과 Asp-462 사이의 영역에서, 응고 인자 XIa의 경우에는 서열번호 2의 Val-463과 Asp-480 또는 Ser-477 사이의 영역에서, 트립신의 경우에는 서열번호 3의 Leu-73과 Asp-107 사이의 영역에서, 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자의 경우에는 서열번호 4의 Val-237과 Asp-275 사이의 영역에서 아미노산 조성이 변경, 바람직하게는 적어도 하나의 아미노산이 삽입된 트롬빈, 응고 인자 XIa, 트립신과 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자에 의해 형성된 군으로부터 선택된 세린 프로테아제 폴리펩티드가 세린 프로테아제 저해제의 존재 하에서 촉매 활성이라는 것이 밝혀졌다. 이는 세린 프로테아제 저해제와 복합한 세린 프로테아제의 이용 가능한 결정 구조가 외부-표면 펩티드 구조에서 아미노산 잔기가 저해제와 접촉하지 않는다는 것을 암시하기 때문에 놀랄만한 것이다(예를 들면 도 2-4 참조).

또한 상기 외부-표면 펩티드 구조에서 아미노산 잔기는 조성, 즉 아미노산 잔기의 동일성이나 아미노산 잔기의 수 어느 것도 트롬빈, 인간 응고 인자 XIa, 인간 트립신과 인간 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 사이에서 보존되지 않는 유연한 루프 구조를 형성하는 것으로 보인다. 적어도 하나의 아미노산 잔기의 삽입에 의한 이러한 루프의 변경은 세린 프로테아제에 대한 저해제의 결합 및/또는 저해제의 결합 후 세린 프로테아제의 활성을 변화시킬 것으로 생각되지 않았다.

또한 트롬빈, 인간 응고 인자 XIa, 인간 트립신과 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자의 공지된 저해제는 구조적으로 관련이 없는 화합물들이다. 이는 또한 선험적으로 트롬빈, 응고 인자 XIa, 트립신 또는 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 세린 프로테아제의 외부-표면 펩티드 구조에 적어도 하나의 아미노산 잔기를 삽입하면 저해제에 의한 저해에 대해 감수성이 감소한 세린 프로테아제가 나타나는 것을 예상할 수 없게 한다.

상기 재조합 세린 프로테아제는 상기 변경된 아미노산 조성을 갖지 않은 세린 프로테아제에 비해 세린 프로테아제 저해제에 의한 저해에 대해 감수성이 감소한다. 따라서 본 발명은 유리 내인성 세린 프로테아제의 발생에 의존하지 않고 세린 프로테아제 저해제의 저해 효과를 방지 및 중지시키는 빠르고 직접적인 길항 전략을 제공하는 세린 프로테아제 저해제에 대한 해독제를 제공한다.

본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "세린 프로테아제"는 펩티드 결합을 가수분해함으로써 단백질을 분해하고 기본적으로 활성 부위에 활성 세린 잔기를 갖는 것을 특징으로 하는 효소를 의미한다. 세린 프로테아제는 또한 통상적으로 세린 엔도펩티다아제라고도 한다. 바람직하게, 용어 "세린 프로테아제"는 예로서 서열번호 1에서 His-406, Asp-462과 Ser-568로서 나타나 있는 세작용기 촉매(catalytic triad) 아미노산 잔기인 히스티딘, 아스파르트산과 세린의 공간 배치를 갖는 효소를 의미한다. 당업자라면 세린 엔도펩티다아제에서 세작용기 촉매 아미노산 잔기를 용이하게 평가하고 찾을 수 있다. 상기 용어는 키모트립신, 트립신, 트롬빈, 응고 인자 VIIa, 응고 인자 IXa, 응고 인자 XIa, 엘라스타아제, 그랜자임 A, 그랜자임 B, 칼리크레인 8 및 불활성 프리프로-전구체 와 프로-전구체와 같은 이들 세린 프로테아제의 전구체와 같은 효소 분류(EC) 3.4.21에 포함되어 있는 세린 엔도펩티다아제를 포함한다. 바람직하게, 상기 세린 프로테아제 폴리펩티드는 트롬빈, 응고 인자 XIa, 트립신 또는 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 폴리펩티드이고, 바람직하게는 트롬빈, 응고 인자 XIa, 트립신 또는 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 단백질이 세린 프로테아제인지 여부를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있고 서열 비교와 예를 들면 Sigma-Aldrich 사의 프로테아제 검출 키트의 사용을 포함한다.

인간 프로트롬빈의 아미노산 서열은 서열번호 1에 제공되어 있고 GENBANK®에서 수탁번호 AAC63054.1로 찾아 볼 수 있다. 서열번호 1에 기재된 서열을 가진 프로트롬빈은 프리프로-리더 서열(서열번호 1의 아미노산 잔기 1번 내지 43번) 다음에 활성 펩티드 단편 1에 해당하는 서열(아미노산 잔기 44-198번)과 후속 활성화 펩티드 단편 2에 해당하는 서열(아미노산 잔기 199-327번), 다음에 트롬빈 경쇄(아미노산 잔기 328-363번)과 트롬빈 중쇄(아미노산 잔기 364-622번)를 포함하고 있는 전구체이다. 본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "프로트롬빈"은 불활성 프로트롬빈 전구체 단백질을 지칭한다. 본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "트롬빈"은 트롬빈 경쇄와 중쇄를 가진 프로트롬빈의 촉매 활성 형태를 지칭한다. 본 명세서에서 사용하고 있는 정의에 따르면, 프로트롬빈은 트롬빈 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명과 관련하여, 바람직하게는 피브리노겐 내 Arg-｜-Gly 결합을 절단하여 피브린을 형성하고 피브리노펩티드 A와 B를 방출할 수 있는 응혈촉진제인 세린 프로테아제인 경우에 단백질은 프로트롬빈 또는 트롬빈 폴리펩티드이다. 피브리노게나아제라고도 하는 트롬빈은 바람직하게는 서로 다른 종의 프로트롬빈 또는 트롬빈 폴리펩티드 사이에서 보존되는 아미노산 잔기의 스트레치(stretch)에 상응하는 아미노산 잔기의 스트레치를 포함한다. 예를 들면 서열번호 1의 아미노산 잔기 Arg-338 내지 Glu-343, Pro-376 내지 Leu-381, Ser-385 내지 Leu-395, Arg-461 내지 Leu-465, Lys-498 내지 Leu-507, Lys-559 내지 Lys-575 및 Gly-586 내지 Arg-596에 상응하는 아미노산 잔기의 스트레치를 함유한 폴리펩티드를 포함하는 응혈촉진제 세린 프로테아제는 프로트롬빈 또는 트롬빈 폴리펩티드인 것으로 간주된다. 용어 "프로트롬빈" 또는 "트롬빈"은 EC 3.4.21.5에 언급되어 있는 세린 프로테아제에 대한 참고 내용을 포함한다.

당업자는 예를 들어 (i) 트롬빈의 경우에 제조사 지시를 따라 화학식 Bz-IIe-Glu(gamma-OR)-Gly-Arg-pNA·HCl(R=H(50%) 및 R=CH3(50%); 분자량: 741.3); 부품번호: 82 0316 39)을 가진 Chromogenix의 S-2238^TM 기질(Instrumentation Laboratory(베드포드, MA, 미국)의 상표명) 및/또는 (ii) 화학식 Tos-Gly-Pro-Arg-pNA·AcOH; H-D-CHG-Pro-Arg-pNA·2AcOH, H-D-CHA-Ala-Arg-pNA·2AcOH; H-D-CHA-Gly-Pro-Arg-pNA·2AcOH; CH₃OCO-Gly-Pro-Arg-pNA·AcOH 및/또는 H-beta-Ala-Gly-Arg-pNA·2AcOH를 가진 Pefachrome® TH 시리즈 발색 기질(DSM Nutritional Products, CH)과 같은 목적에 적합한 기질 상에서 단백질 분해 절단을 시험함으로써 세린 프로테아제가 실제로 트롬빈인지 여부를 확증할 수 있다.

인간 응고 인자 XI의 아미노산 서열은 서열번호 2에 제공되어 있고 GENBANK®에서 수탁번호 AAA51985.1로 찾아 볼 수 있다. 서열번호 2에 제공되어 있는 서열을 가진 응고 인자 XI는 신호 펩티드(아미노산 잔기 1-18번), 응고 인자 XIa 중쇄(아미노산 잔기 19-387번) 및 응고 인자 XIa 경쇄(아미노산 잔기 388-625번)를 함유한 전구체 단백질이다. 본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "응고 인자 XI"는 불활성 응고 인자 XI 전구체 단백질을 지칭한다. 본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "응고 인자 XIa"는 응고 인자 XIa 중쇄와 응고 인자 XIa 경쇄를 가진 응고 인자 XI의 촉매 활성 형태를 의미한다. 본 명세서에서 사용하고 있는 정의에 따르면, 응고 인자 XI는 응고 인자 XIa 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명과 관련하여, 인자 IX 내 Arg-｜-Ala와 Arg-｜-Val 결합을 선택적으로 절단하여 인자 IXa를 형성하는 응혈촉진제인 경우에 단백질은 응고 인자 XI 또는 응고 인자 XIa 폴리펩티드인 것으로 간주된다. 상기 단백질의 전장 아미노산 서열은 바람직하게는 서로 다른 종의 응고 인자 XI 또는 응고 인자 XIa 폴리펩티드 사이에서 보존되는 아미노산 잔기의 스트레치에 상응하는 아미노산 잔기의 스트레치를 포함한다. 예를 들면 서열번호 2의 아미노산 잔기 Asp-480 내지 Ala-482, Cys-560 내지 Gly-562 및 Gly-573 내지 Leu-579에 상응하는 아미노산 잔기의 스트레치를 함유한 폴리펩티드를 포함하는 응혈촉진제 세린 프로테아제는 응고 인자 XI 또는 응고 인자 XIa 폴리펩티드인 것으로 간주된다. 용어 "응고 인자 XI" 또는 "응고 인자 XIa"는 EC 3.4.21.27에 언급되어 있는 세린 프로테아제에 대한 참고 내용을 포함한다. 당업자라면 예를 들면 (i) 제조사 지시를 따라 화학식 pyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl(분자량 539.0, 부품 번호 82 1090 39)를 가진 Chromogenix의 S-2366^TM 기질(Instrumentation Laboratory(베드포드, MA, 미국)의 상표명) 및/또는 (ii) 화학식 Z-Aad-Pro-Arg-pNA AcOH을 가진 Pefachrome® FXIa 발색 기질(DSM Nutritional Products, CH)과 같은 목적에 적합한 기질 상에서 단백질 분해 절단을 시험함으로써 세린 프로테아제가 응고 인자 XI 또는 응고 인자 XIa 폴리펩티드인지 여부를 확증할 수 있다.

인간 트립신-1의 아미노산 서열은 서열번호 3에 제공되어 있고 GENBANK®에서 "NP_002760.1"으로 찾아볼 수 있다. 서열번호 3에 제공되어 있는 서열을 가진 트립신-1은 신호 펩티드(아미노산 잔기 1-15번), 활성화 펩티드(아미노산 잔기 16-23번), 알파-트립신 사슬 1(아미노산 잔기 24-122번)와 알파-트립신 사슬 2(아미노산 잔기 123-247번)를 가진 전구체 단백질이다. 상기 2-쇄 형태는 서열번호 3의 잔기 Arg-122 이후 단백질 분해 절단에 의해 생성된다. 상기 알파-트립신 사슬은 하나의 촉매 활성 펩티드 사슬(아미노산 잔기 24-247번)로서 존재할 수 있다는 점을 분명히 한다. 트립신은 세린 프로테아제의 원형(archetype)인 것으로 일반적으로 알려져 있다. 본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "트립신"은 불활성 트립신 전구체 단백질, 촉매 활성 단쇄 형태 및 별도의 알파-트립신 사슬 1과 알파-트립신 사슬 2를 가진 촉매 활성 2-쇄 형태를 지칭한다.

본 발명과 관련하여, Arg-|-Xaa, Lys-|-Xaa를 우선적으로 절단하는 세린 프로테아제인 경우에 단백질은 트립신 폴리펩티드인 것으로 간주된다. 상기 단백질의 전장 아미노산 서열은 바람직하게는 서로 다른 종의 트립신 폴리펩티드 사이에서 보존되는 아미노산 잔기의 스트레치에 상응하는 아미노산 잔기의 스트레치를 포함한다. 예를 들면 서열번호 3의 아미노산 잔기 Phe-47 내지 Gly-50, Gly-191 내지 Gln-197, Asp-199 내지 Pro-203 및 Val-214 내지 Gly-217에 상응하는 아미노산 잔기의 스트레치를 함유한 폴리펩티드를 포함하는 세린 프로테아제는 트립신 폴리펩티드인 것으로 간주된다. 용어 "트립신"은 Arg-|-Xaa, Lys-|-Xaa를 우선적으로 절단하고/또는 EC 3.4.21.4에 열거되어 있는 세린 프로테아제에 대한 참고 내용을 포함한다. 이에 따라 용어 "트립신"은 트립신 2, 트립신 3, 트립신 3, 트립신 4, 트립신 5와 트립신 6과 같은 트립신 1 이외의 트립신 단백질에 대한 참고 내용을 포함한다. 상기 트립신은 바람직하게는 트립신 1이다. 당업자라면 예를 들면 제조사 지시에 따라 (i) 분자량이 741.3인 화학식 Bz-Ile-Glu(gamma-OR)-Gly-Arg-pNA·HCl(R=H(50%) 및 R=CH₃(50%); 카탈로그 번호 S820316)을 가진 Chromogenix의 S-2222^TM 기질(Instrumentation Laboratory 사(베드포드, MA, 미국)의 상표명) 및/또는 화학식 Cbo-Val-Gly-Arg-pNA·AcOH를 가진 Pefachrome® TRY(트립신) 발색 기질(DSM Nutritional Products, CH)과 같은 목적에 적합한 기질 상에서 단백질 분해 절단을 시험함으로써 세린 프로테아제가 트립신인지 여부를 확증할 수 있다.

인간 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자의 아미노산 서열은 서열번호 4에 제공되어 있고 GENBANK®에서 "AAK53822.1"로 찾아 볼 수 있다. 서열번호 4에 제공되어 있는 서열을 가진 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자는 신호 펩티드(아미노산 잔기 1-20번) 및 장쇄 A(아미노산 잔기 21-177번), 단쇄 A(아미노산 잔기 156-177번)와 사슬 B(아미노산 잔기 179-431번)로 세분화될 수 있는 사슬(아미노산 잔기 21-431번)를 가진 전구체 단백질이다. 본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자"는 불활성 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 전구체 단백질과 그의 촉매 활성 사슬 형태를 지칭한다.

본 발명과 관련하여, 플라스미노겐에서 Arg-|-Val 결합을 특이적으로 절단하여 플라스민을 형성하는 세린 프로테아제인 경우에 단백질은 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자인 것으로 간주된다. 상기 단백질의 전장 아미노산 서열은 바람직하게는 서로 다른 종의 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 폴리펩티드 사이에서 보존되는 아미노산 잔기의 스트레치에 상응하는 아미노산 잔기의 스트레치를 포함한다. 예를 들면 서열번호 4의 아미노산 잔기 His-119 내지 Asn-124 및/또는 Asn-274 내지 Lee-278에 상응하는 아미노산 잔기의 스트레치를 함유하고 플라스미노겐에서 Arg-|-Val 결합을 특이적으로 절단하여 플라스민을 형성하는 폴리펩티드를 포함하는 세린 프로테아제는 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 폴리펩티드인 것으로 간주한다. 당업자라면 예를 들면 (i) 제조사의 지시에 따라 화학식 Glu-Gly-Arg-pNA HCl(분자량 498.9)을 가진 Chromogenix의 S-2444^TM 기질(Instrumentation Laboratory 사(베드포드, MA, 미국)의 상표명) 및/또는 (ii) 화학식 Bz-beta-Ala-Gly-Arg-pNA·AcOH 및/또는 Cbo-Glu(OtBu)-Gly-Arg-pNA AcOH를 가진 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자용 Pefachrome® uPA 시리즈 발색 기질(DSM Nutritional Products, CH)과 같은 목적에 적합한 기질 상에서 단백질 분해 절단을 시험함으로써 세린 프로테아제가 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자인지 확증할 수 있다.

본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "재조합체"는 본 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있는 재조합 DNA 기술을 이용하여 생산되는 단백질을 의미한다. 재조합 단백질은 바람직하게는 예를 들면 아미노산 잔기의 교환 및/또는 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실 또는 삽입 및/또는 당화와 같은 번역후 변형 차이로 인해 아미노산 조성이 다르기 때문에 천연 단백질과 동일하지 않다.

본 명세서에서 사용하고 있는 문구 "세린 프로테아제를 포함하는 재조합 단백질"은 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 영장류, 가장 바람직하게는 인간 기원의 재조합 세린 프로테아제 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 망라하는 것으로 의도된다. 상기 문구는 예를 들면 포유류 트롬빈 폴리펩티드로 처리 및/또는 활성화되는 프로트롬빈과 같은 재조합 포유류 세린 프로테아제 전구체 단백질을 포함한다. 이에 따라, 본 발명의 단백질은 바람직하게는 외부-표면 펩티드 구조에 삽입된 적어도 하나의 아미노산 잔기를 포함하는 재조합 포유류, 바람직하게는 영장류, 보다 바람직하게는 인간 또는 인간화된 트롬빈, 응고 인자 XIa, 트립신 또는 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자로서, 상기 펩티드 구조는 트롬빈의 경우에는 서열번호 1의 Gly-427과 Asp-462 사이, 바람직하게는 His-450과 Asp-462 사이, 보다 바람직하게는 His-450과 Leu-459 사이 아미노산 잔기의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역; 응고 인자 XIa의 경우에 서열번호 2의 Val-463과 Asp-480 사이, 바람직하게는 His-469와 Asp-480 또는 Ser-477 사이 아미노산 잔기의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역; 트립신의 경우에 서열번호 3의 Leu-73과 Asp-107 사이, 바람직하게는 His-96과 Asp-107 또는 Leu-104 사이 아미노산 잔기의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역; 및 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자의 경우에 서열번호 4의 Phe-254 또는 Val-256과 Asp-275 또는 Asn-274 사이, 보다 바람직하게는 His-262와 Asp-275 또는 Asn-274 사이 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역이다. 또한 상기 문구는 세린 프로테아제 폴리펩티드 이외의 하나 이상의 추가 아미노산 서열, 예를 들면 EP0150126에 기재되어 있는 바와 같은 FLAG 표지와 같은 표지 및/또는 하나 이상의 다른 식별 펩티드를 구성하는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함한다.

본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "인간화"는 1종의 단백질의 바람직하게는 외부 아미노산 잔기를 상기 단백질의 인간 상동체에 존재하는 아미노산 잔기에 대해 치환 또는 인간화하여 인간에 적용시 제1 종의 단백질의 면역원성을 없게 하거나 거의 없도록 하는 것을 의미한다. 외부 잔기의 치환은 바람직하게는 내부 도메인 또는 경쇄와 중쇄 사이 도메인간 접촉에 대한 효과가 거의 또는 전혀 없다. 비-인간 기원, 바람직하게는 포유류 기원, 보다 바람직하게는 영장류 기원의 본 발명의 단백질은 바람직하게는 인간에 적용시 상기 단백질의 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다.

본 발명의 비-인간 단백질은 인체 투여시 항원 반응의 위험이 비-인간화된 세린 프로테아제 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 단백질에 비해 더 낮을 것으로 예상되므로 바람직하게는 인간화된 포유류, 보다 바람직하게는 인간화된 영장류 세린 프로테아제 폴리펩티드를 포함한다.

단백질의 인간화와 관련하여, 항체에 적용할 수 있는 인간화 과정에 주목할 수 있다. 이 과정은 Kabat 등(1987)이 편집한 인간 항체 가변 도메인에 대해 이용 가능한 서열 데이터(Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed., Bethesda, MD, National Institutes of Health)를 이용하고 상기 데이터베이스와 그외 접근 가능한 미국과 외국 데이터베이스(핵산과 단백질 모두)를 업데이트한다. 인간화된 항체를 만들기 위해 사용되는 방법의 비제한적인 예는 EP 519596; US 특허 6,797,492; 및 Padlan et al., 1991. Mol Immunol 28: 489-498을 포함한다. 비-인간 단백질의 인간화 과정을 더 예시하고 있는 Sarkar et al., 2012, Journal of Lipids, Article ID 610937, p. 1-13에는 파라옥소나아제-1이 인간 서열을 반영하기 위해서 효소의 표면을 변화시킴으로써 성공적으로 인간화되었음이 기재되어 있다.

본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "세린 프로테아제 저해제"는 세린 프로테아제 활성을 저해할 수 있는 작용제를 의미한다. 바람직하게, 상기 세린 프로테아제 저해제는 1가의 직접 세린 프로테아제 저해제, 바람직하게는 세린 프로테아제의 활성 부위에 결합하여 작용하는 소형 분자 또는 펩티드 또는 펩티드 모방체이다. 바람직하게, 상기 세린 프로테아제 저해제는 트롬빈 저해제, 응고 인자 XIa 저해제, 트립신 저해제 또는 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 저해제이다.

본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "트롬빈 저해제"는 트롬빈의 활성 부위에 결합하고 트롬빈의 엑소사이트(exosite) 1에 결합하여 작용하는 히루딘, 비발리루딘과 레피루딘과 같은 2가의 직접 트롬빈 저해제를 포함하는 직접 트롬빈 저해제를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 엑소사이트 1은 프로트롬빈에서 기능적으로 접근할 수 없고 활성화시 노출된다(Huntington, 2005. J Thromb Haemos 3: 1861-1872; Lane et al., 2005. Blood: 106: 2605-2612). 용어 "트롬빈 저해제"는 바람직하게는 트롬빈의 활성 부위에 결합하여 작용하는 1가의 직접 트롬빈 저해제로서 이에 대한 참고 내용을 더 포함한다. 이들 1가의 직접 트롬빈 저해제로는 아르가트로반((2R,4R)-1-[(2S)-5-(디아미노메틸리덴아미노)-2-[(3-메틸-1,2,3,4-테트라히드로퀴놀린-8-일)]설포닐아미노]펜타노일]-4-메틸-피페리딘-2-카르복실산) 또는 그의 생물학적으로 활성인 유사체; 멜라가트란(2-[(1R)-2-[(2S)-2-[(4-카르밤이미도일페닐)메틸카르 바모일]아제티딘-1-일]-1-시클로헥실-2-옥소에틸]아미노]아세트산) 및 이의 프로드러그인 지멜라가트란 (에틸 2-[[(1R)-1-시클로헥실-2-[(2S)-2-[[4-[(Z)-N'-히드록시카르밤이미도일]페닐]메틸카르바모일]아제티딘-1-일]-2-옥소에틸]아미노]아세테이트) 또는 그의 생물학적으로 활성인 유사체; 다비가트란(3-[[2-[(4-카르밤이미도일아닐리노)메틸]-1-메틸벤즈이미다졸-5-카르보닐]-피리딘-2-일아미노]프로판산) 또는 다비가트란 에텍실레이트(에틸 3-[[2-[[4-[(Z)-N'-헥스옥시카르보닐카르밤이미도일]아닐리노]메틸]-1-메틸벤즈이미다졸-5-카르보닐]-피리딘-2-일아미노]프로파노에이트)와 같은 그의 생물학적으로 활성인 유사체; RWJ-671818(1-{N-[2-(아미디노아미노옥시)에틸]아미노}카르보닐메틸-6-메틸-3-[2,2-디플루오로-2-페닐에틸아미노]피라지논) 또는 그의 생물학적으로 활성인 유사체; 3-(2-페네틸아미노)-6-메틸-1-(2-아미노-6-메틸-5-메틸렌카르복사미도메틸피리디닐)피라지논 또는 그의 생물학적으로 활성인 유사체; (E)-N-(3-((1-(벤조[b]티오펜-2-일메틸)-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)메톡시)페닐)-2-(3-클로로페닐)에텐설폰아미드 또는 그의 생물학적으로 활성인 유사체; 및 Merck 사의 compound 2((S)-N-(2-(아미노메틸)-5-클로로벤질)-1-((R)-2-히드록시-3,3-디메틸부타노일)피롤리딘-2-카르복사미드) 또는 그의 생물학적으로 활성인 유사체를 포함한다. 바람직하게, 상기 직접 트롬빈 저해제는 1가의 직접 트롬빈 저해제, 바람직하게는 아르가트로반, 멜라가트란 및 이의 프로드러그인 지멜라가트란 또는 다비가트란 및 이의 프로드러그인 다비가트란 에텍실레이트 또는 이들 분자의 생물학적으로 활성인 유사체와 같이 경구 투여에 적합한 소형 분자이다.

이와 달리, 상기 직접 트롬빈 저해제는 펩티드 또는 펩티드 모방체 저해제이다(Mehta et al., 2014. Expert Opin Ther Pat. 24: 47-67).

본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "응고 인자 XIa 저해제"는 응고 인자 XIa의 활성 부위에 결합할 수 있고 그의 프로테아제 활성을 저해할 수 있는 저해제를 지칭한다. 상기 용어는 응고 인자 XIa의 활성 부위에 결합하고 그의 프로테아제 활성을 저해하는 직접 응고 인자 XIa 저해제, 바람직하게는 소형 분자를 포함한다. 직접 응고 인자 XIa 저해제 군은 4,5,6-삼치환 피리미딘 유도체; BMS-262084((2S,3R)-1-[4-(tert-부틸카르바모일)피페라진-1-카르보닐]-3-[3-(디아미노메틸리덴아미노)프로필]-4-옥소아제티딘-2-카르복실산) 또는 그의 생물학적으로 활성인 유사체; Bristol-Meyers Squibb 사의 compound 1(3'-[(2S,4R)-6-카르밤이미도일-4-메틸-4-페닐-1,2,3,4-테트라히드로퀴놀린-2-일]-4-카르바모일-5'-[(3-메틸부타노일)아미노]비페닐-2-카르복실산), 2(트랜스-N-((S)-1-(4-(3-아미노-1H-인다졸-6-일)-5-클로로-1H-이미다졸-2-일)-2-페닐에틸)-4-(아미노메틸)시클로헥산카르복사미드) 및 compound 33((2E)-N-{(1S)-1-[4-(3-아미노-1H-인다졸-6-일)-1H-이미다졸-2-일]-2-페닐에틸}-3-[5-클로로-2-(1H-테트라졸-1-일)페닐]프로프-2-엔아미드) 또는 그의 생물학적으로 활성인 유사체; AstraZeneca 사의 compound 13(N-[(1S)-1-벤질-2-[(6-클로로-2-옥소-1H-퀴놀린-4-일)메틸아미노]-2-옥소-에틸]-4-히드록시-2-옥소-1H-퀴놀린-6-카르보) 또는 그의 생물학적으로 활성인 유사체; 아릴 보론산; 대환식 인돌; 및 펩티드 또는 펩티드 모방체 저해제를 포함한다. 바람직하게, 응고 인자 XIa 저해제는 응고 인자 XIa의 활성 부위에 결합하고 그의 프로테아제 활성을 저해하는 직접 응고 인자 XIa 저해제, 바람직하게는 경구 투여에 적합한 소형 분자이다.

본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 저해제"는 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자의 활성 부위에 결합할 수 있고 그의 프로테아제 활성을 저해하는 저해제를 지칭한다. 상기 용어는 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자의 활성 부위에 결합하고 그의 프로테아제 활성을 저해하는 직접 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 저해제, 바람직하게는 소형 분자를 포함한다. 직접 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 저해제 군은 특히 WX-UK1(에틸 4-[(2S)-3-(3-카르밤이미도일페닐)-2-[[2,4,6-트리(프로판-2-일)페닐]설포닐아미노]프로파노일]피페라진-1-카르복실레이트) -또는 그의 프로드러그로서 메수프론 또는 WX-671(후자: Nα-(2,4,6-트리이소프로필페닐설포닐)-3-아미디노-(L)-페닐알라닌-4-에톡시카르보닐피페라지드)이라고도 알려져 있는 우파모스타트, APC-10302(6-클로로-2-(2-히드록시-비페닐-3-일)-1H-인돌-5-카르복사미딘) 또는 이들 화합물의 생물학적으로 활성인 유사체를 포함한다. 이와 달리, 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 저해제는 펩티드 또는 펩티드 모방체 저해제이다. 바람직하게, 직접 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자는 1가의 직접 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 저해제, 바람직하게는 WX-UK1과 그의 프로드러그인 Upamostat와 같이 경구 투여에 적합한 소형 분자이다.

본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "트립신 저해제"는 트립신의 활성 부위에 결합할 수 있고 그의 프로테아제 활성을 저해하는 저해제를 의미한다. 상기 용어는 트립신의 활성 부위에 결합하고 그의 프로테아제 활성을 저해하는 직접 트립신 저해제, 바람직하게는 소형 분자를 포함한다. 직접 트립신 저해제 군은 멜라가트란과 그의 프로드러그인 지멜라가트란(후자: 에틸 2-[[(1R)-1-시클로헥실-2-[(2S)-2-[[4-[(Z)-N'-히드록시카르밤이미도일]페닐]메틸카르바모일]아제티딘-1-일]-2-옥소에틸]아미노]아세테이트), APC-10302(6-클로로-2-(2-히드록시-비페닐-3-일)-1H-인돌-5-카르복사미딘) 및 이들 분자의 생물학적으로 활성인 유사체를 포함한다.

본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "생물학적으로 활성인 유사체" 또는 "유사체"는 소정의 기준 화합물과 동일한 생물학적 기능을 나타내며 예를 들면 항응고 또는 응고 효과와 같은 원하는 활성을 유지하는 상기 기준 화합물의 유도체 또는 단편을 의미한다. 따라서 유사체는 바람직하게는 소정의 기준 화합물의 구조 및 기능적 유사체이다.

본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "상동성"은 2개의 아미노산 서열 간 아미노산 서열 동일성을 의미하는 것으로 2개의 아미노산 서열 비교시 동일한 아미노산 잔기의 백분율로서 표시된다. 상기 비교는 바람직하게는 2개의 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 수행된다.

본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "영역"은 2개의 보존 아미노산 잔기가 경계를 이루는 아미노산 잔기의 스트레치를 의미한다. 상기 영역은 영역의 경계를 이루는 2개의 아미노산을 포함한다. 본 명세서에서 적용되는 아미노산 잔기의 번호 표기는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3과 서열번호 4의 아미노산 서열을 기반으로 한다. 본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "아미노산의 영역"은 상기 정의한 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역, 예를 들면 비-인간 트롬빈, 응고 인자 XIa, 트립신 및/또는 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 내 영역을 포함한다. 당업자라면 예를 들면 비-인간 트롬빈 내 영역의 위치는 서열번호 1에 나타낸 바와 같이 인간 트롬빈 내 위치와 다를 수 있음을 이해할 것이다. 그러나 상기 소정 영역의 양 옆에는 2개의 보존 아미노산이 배치되어 있으며, 이는 당업자라면 상기 정의된 영역에 상응하는 비-인간 단백질 내 영역을 동정할 수 있을 것이다.

본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "삽입" 또는 "삽입된"은 천연 세린 프로테아제 폴리펩티드의 특정 영역에 적어도 하나의 아미노산 잔기를 첨가하여 상기 영역 내 아미노산 잔기의 수를 천연 세린 프로테아제 폴리펩티드의 상기 영역 내 아미노산 잔기의 수에 비해 증가시키는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "치환" 또는 "치환된"은 세린 프로테아제 폴리펩티드의 특정 영역 또는 특정 부위에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 대체하여 상기 영역 내 아미노산 잔기의 수가 아닌 아미노산 서열을 변경하는 것을 의미한다. 치환은 아미노산 잔기의 결실 후 동일한 위치에서 다른 아미노산 잔기를 삽입한 결과이다.

본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "결실" 또는 "결실된"은 세린 프로테아제 폴리펩티드의 특정 영역 또는 특정 부위에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실되어 상기 폴리펩티드의 상기 영역 내 아미노산 잔기의 수를 천연 세린 프로테아제 폴리펩티드의 상기 영역 내 아미노산 잔기의 수에 비해 감소시키는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "천연 세린 프로테아제 폴리펩티드"는 동물, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 영장류, 보다 바람직하게는 인간에서 자연 발생 내인성 세린 프로테아제 폴리펩티드를 의미한다.

본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "아미노산 조성"은 아미노산 잔기의 스트레치의 아미노산 서열과 길이로서, 상기 길이는 상기 스트레치 내 아미노산 잔기의 수에 의해 결정되는 것을 의미한다.

하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입, 치환 및/또는 결실, 바람직하게는 삽입은 본 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있는 재조합 DNA 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들면 본 기술 분야의 당업자는 합성 DNA, PCR 기술과 분자 클로닝을 이용하여 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 가진 재조합 DNA 구조물을 얻을 수 있다. 적합한 방법과 수단은 Green and Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", CSHL Press, 2012에 기재되어 있다.

본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "외부-표면 펩티드 구조"는 폴딩된 천연 트롬빈, 응고 인자 XIa, 트립신과 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 폴리펩티드의 외부에 드러나는 아미노산 잔기의 연속적인 스트레치를 지칭하는 것으로, 펩티드 루프 또는 코일이라고도 한다. 바람직하게, 상기 펩티드 구조는 트롬빈의 경우에 서열번호 1의 Gly-427과 Asp-462 사이, 바람직하게는 His-450과 Asp-462 사이, 보다 바람직하게는 His-450과 Leu-459 사이 아미노산 잔기의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역; 응고 인자 XIa의 경우에 서열번호 2의 Val-463과 Asp-480 사이, 바람직하게는 His-469와 Asp-480 또는 Ser-477 사이 아미노산 잔기의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역; 트립신의 경우에 서열번호 3의 Leu-73과 Asp-107 사이, 바람직하게는 His-96과 Asp-107 또는 Leu-104 사이 아미노산 잔기의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역; 및 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자의 경우에 서열번호 4의 Val-237과 Asp-275 사이, 바람직하게는 Phe-254 또는 Val-256과 Asp-275 또는 Asn-274 사이, 보다 바람직하게는 His-262와 Asp-275 또는 Asn-274 사이 아미노산 잔기의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역이다.

앞에서 나타내고 도 2-4에 도시한 바와 같이 상기 외부-표면 펩티드 구조, 바람직하게는 트롬빈, 응고 인자 XIa, 트립신 및 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 폴리펩티드의 영역에 적어도 하나의 아미노산 잔기를 삽입하였을 때 세린 프로테아제 저해제, 바람직하게는 직접 트롬빈, 응고 인자 XIa, 트립신 또는 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 저해제에 의한 저해에 대해 감수성이 감소된 단백질이 얻어지는 것으로 밝혀졌다.

예를 들면 서열번호 1의 His-450과 Asp-462 또는 Leu-459 사이 아미노산 잔기의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역과 관련하여 문구 "~사이 아미노산 잔기의 영역에 상응하는"은 본 명세서에서 서열번호 1의 His-450과 Asp-462 또는 Leu-459에 상응하는 또 다른 트롬빈의 보존 His와 Asp 잔기의 잔기 수가 서열번호 1에서 상기 His와 Asp 잔기에 해당하는 잔기 수와 다를 수 있음을 나타내기 위해 사용한 것이다. 아미노산 잔기 수의 차이는 예를 들면 아미노산 잔기의 번호를 표기하는 다른 방법의 결과일 수 있다. 또한 예로서 아미노산 잔기 수의 차이는 서열번호 1에 나타낸 인간 프로트롬빈 폴리펩티드의 길이와 비교했을 때 프로트롬빈 폴리펩티드의 길이 차이의 결과일 수 있다. 유사하게, 서열번호 1의 아미노산 잔기 Gly-427은 서로 다른 종의 다수의 프로트롬빈 폴리펩티드 정렬시 본 기술 분야의 당업자라면 쉽게 인식할 수 있는 바와 같이 서로 다른 종의 프로트롬빈 폴리펩티드 사이에서 보존된다. 따라서 다른 종의 세린 프로테아제에서 상기 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 잔기를 동정할 수 있다. 따라서 본 기술 분야의 당업자라면 본 명세서에서 적용하는 아미노산 잔기 번호 표기는 본 발명을 제한하는 것이 아니라 단지 명확성을 위해 적용하는 것임을 이해할 것이다.

당업자라면 본 명세서에 기재되어 있는 영역과 경계를 이루는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 상기 보존 아미노산 잔기 사이 아미노산 잔기의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역을 동정하는 방법을 알 것이다. 당업자라면 예를 들어 서열번호 1의 His-450과 Asp-462가 다른 종의 세린 프로테아제 폴리펩티드에 또한 존재하는 매우 보존적인 잔기라는 것을 직접 증명할 것이다.

서열번호 1의 His-450과 Asp-462 내 및 주변 또는 비-인간 세린 프로테아제 폴리펩티드에서 해당 His와 Asp 내 및 주변 아미노산 잔기의 영역의 높은 보존 속성으로 인해 본 기술 분야의 당업자는 서열번호 1의 His-450과 Asp-462 사이 아미노산 잔기의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역을 동정할 수 있다. 동일한 일반 원리가 본 명세서에 기재되어 있는 영역과 경계를 이루는 다른 아미노산 잔기에도 적용된다. 다시 말해, 특정 아미노산 잔기의 보존 속성은 비-인간 세린 프로테아제 폴리펩티드 내 본 명세서에서 정의하고 있는 영역에 어느 아미노산 잔기가 포함되는지에 대해 당업자에게 명확한 신호를 제공할 것이다. 본 명세서에 구체적으로 기재되어 있는 영역과 경계를 이루는 아미노산 잔기는 종간 보존되어 소정의 영역을 정의하기에 적합한 것으로 밝혀졌다.

본 기술 분야의 당업자라면 본 발명이 특히 (i) 트롬빈의 경우에 서열번호 1의 Gly-427와 Asp-462 사이, 바람직하게는 His-450과 Asp-462 사이, 보다 바람직하게는 His-450과 Leu-459 사이, (ii) 응고 인자 XIa의 경우에 서열번호 2의 Val-463과 Asp-480 사이, 바람직하게는 His-469와 Asp-480 또는 Ser-477 사이, (iii) 트립신의 경우에 서열번호 3의 Leu-73과 Asp-107 사이, 바람직하게는 His-96과 Asp-107 또는 Leu-104 사이 및 (iv) 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자의 경우에 서열번호 4의 Val-237과 Asp-275, 바람직하게는 Phe-254 또는 Val-256과 Asp-275 또는 Asn-274 사이, 보다 바람직하게는 His-262와 Asp-275 또는 Asn-274 사이 아미노산 잔기의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역의 아미노산 조성에 관한 것임을 이해할 것이다. 따라서 본 기술 분야의 당업자라면 본 발명의 단백질의 나머지 부분의 아미노산 서열은 상기 단백질이 보존되는 조건에서 다양화하거나 또는 세린 프로테아제 저해제, 바람직하게는 직접 트롬빈-, 응고 인자 XIa-, 트립신- 또는 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 저해제에 대해 감수성이 감소된 세린 프로테아제 폴리펩티드로 활성화될 수 있음을 이해할 것이다. 이에 따라 본 발명의 단백질의 상기 나머지 부분은 예를 들면 서로 다른 종의 세린 프로테아제 폴리펩티드 사이에서 다르기 때문에 다양할 수 있다.

본 발명에 따른 영역에 상응하는 영역 내 아미노산 잔기의 수는 서로 다른 종의 세린 프로테아제 폴리펩티드 사이, 특히 포유류 군 또는 영장류 군에 속하는 종 사이에서 보존된다. 그러므로 아미노산 잔기의 수 또한 세린 프로테아제 폴리펩티드에서 보존된다. 서열번호 1의 Gly-427과 Asp-462 사이의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역 내 아미노산 잔기의 상기 보존되는 수는 34개로, 이때 Gly-427과 Asp-462는 포함하지 않는다. 서열번호 1의 His-450과 Asp-462 사이의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역 내 아미노산 잔기의 상기 보존된 수는 11개로, 이때 His-450과 Asp-462는 포함하지 않는다. 서열번호 2, 3 및 4에 대해서도 동일한 원리가 적용된다.

본 발명의 단백질 내 본 명세서에서 정의하고 있는 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역에 적어도 하나의 아미노산 잔기를 삽입했을 때 비록 세린 프로테아제 저해제에 의한 저해에 대해 감수성은 감소하였지만 촉매 활성인 세린 프로테아제 폴리펩티드가 생성되는 것으로 밝혀졌다.

상기 삽입은 본 명세서에서 정의하고 있는 아미노산 잔기의 영역 내 적어도 하나의 아미노산 잔기의 치환과 조합하는 것이 바람직하다.

상기 삽입이 1-50개, 바람직하게는 1-40개, 보다 바람직하게는 1-30개, 가장 바람직하게는 1-20개의 아미노산 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질이 특히 바람직하다. 상기 삽입은 트롬빈의 경우에 서열번호 1의 His-450과 Asp-462 또는 Leu-459 사이, 응고 인자 XIa의 경우에 서열번호 2의 His-469와 Asp-480 또는 Ser-477 사이, 트립신의 경우에 서열번호 3의 His-96과 Asp-107 또는 Leu-104 사이 또는 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자의 경우에 서열번호 4의 His-262와 Asp-275, Asn-274 또는 Ala-271 사이의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역에서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개, 보다 바람직하게는 4 또는 5개의 아미노산 잔기를 포함하거나 이들 아미노산 잔기로 이루어지는 것이 바람직하다. 트롬빈의 경우에 서열번호 1의 His-450과 Asp-462 또는 Leu-459 사이의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역에 8개의 아미노산 잔기가 삽입되는 것과 같이 적어도 4개의 아미노산 잔기가 삽입되는 것이 특히 바람직하다. 또한 응고 인자 XIa의 경우에 서열번호 2의 His-469와 Asp-480 또는 Ser-477 사이의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역에 9개의 아미노산 잔기가 삽입되는 것과 같이 적어도 5개의 아미노산 잔기가 삽입되는 것이 특히 바람직하다. 또한 트립신의 경우에 서열번호 3의 His-96과 Asp-107 또는 Leu-104 사이의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역에 9 또는 11개의 아미노산 잔기가 삽입되는 것과 같이 적어도 5개의 아미노산 잔기가 삽입되는 것이 특히 바람직하다. 또한 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자의 경우에 서열번호 4의 His-262와 Asp-275, Asn-274 또는 Ala-271 사이의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역에 7개의 아미노산 잔기가 삽입되는 것과 같이 적어도 3개의 아미노산 잔기가 삽입되는 것이 특히 바람직하다. 본 기술 분야의 당업자라면 본 명세서에서 정의하고 있는 아미노산 잔기의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역 내 어느 위치에나 아미노산 잔기를 삽입할 수 있음을 이해할 것이다. 삽입에 적합한 아미노산 잔기는 표 1에 열거되어 있는 20개의 천연 아미노산 잔기의 군으로부터 선택된다. 본 기술 분야의 당업자라면 상기 삽입된 아미노산 잔기는 생체내 또는 시험관내 번역후 화학적 변화가 일어날 수 있음을 이해할 것이다. 본 명세서에서 위에 나타낸 바와 같이, 본 기술 분야의 당업자라면 합성 DNA, PCR 기술과 분자 복제를 이용하여 본 명세서에서 정의하고 있는 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역에 삽입된 1-50개 아미노산 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 가진 재조합 DNA 구조물을 얻을 수 있다.

상기 아미노산 잔기의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역에 삽입은 바람직하게는 트롬빈의 경우에 서열번호 1의 Trp-455와 Arg-456 사이; 응고 인자 XIa의 경우에 서열번호 2의 Met-474와 Ala-475 사이; 트립신의 경우에 서열번호 3의 Asp-100과 Arg-101 사이; 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자의 경우에 서열번호 4의 Thr-269와 Leu-270 사이 또는 비-인간 트롬빈, 응고 인자 XIa, 트립신 또는 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 폴리펩티드 내 이들 아미노산 잔기에 상응하는 2개의 아미노산 잔기 사이에서 이루어진다.

1-30개, 바람직하게는 1-8개의 치환된 아미노산 잔기와 조합한 적어도 하나의 삽입된 아미노산 잔기를 포함하는 본 발명의 단백질이 특히 바람직하다. 상기 치환은 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개, 바람직하게는 5-8개의 아미노산 잔기를 포함하거나 이들 아미노산 잔기로 이루어진다. 트롬빈의 경우에 서열번호 1의 His-450과 Asp-462 또는 Leu-459 사이 아미노산 잔기의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역에서 아미노산 잔기의 치환은 바람직하게는 7 또는 8개의 아미노산 잔기를 포함하거나 이들 아미노산 잔기로 이루어진다. 응고 인자 XIa의 경우에 서열번호 2의 His-469와 Asp-480 또는 Ser-477 사이 아미노산 잔기의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역에서 아미노산 잔기의 치환은 바람직하게는 5 또는 6개의 아미노산 잔기를 포함하거나 이들 아미노산 잔기로 이루어진다. 트립신의 경우에 서열번호 3의 His-96과 Asp-107 또는 Leu-104 사이 아미노산 잔기의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역에서 아미노산 잔기의 치환은 바람직하게는 7개의 아미노산 잔기를 포함하거나 이들 아미노산 잔기로 이루어진다. 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자의 경우에 서열번호 4의 His-262와 Asp-275 사이 아미노산 잔기의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역에서 아미노산 잔기의 치환은 바람직하게는 4 또는 7개의 아미노산 잔기를 포함하거나 이들 아미노산 잔기로 이루어진다.

본 명세서에서 정의하고 있는 본 발명의 단백질의 영역에 상응하는 영역에 존재하는 아미노산 잔기는 바람직하게는 표 1에 열거된 아미노산 잔기 중 어느 하나에 의해, 바람직하게는 표 1의 열 "측쇄 극성"과 "측쇄 전하"에 나타낸 바와 같이 동일한 군의 아미노산에 의해 치환된다. 바람직하게, 서열번호 1의 아미노산 잔기 451-455번과 456-458번 중 하나 이상; 서열번호 2의 아미노산 잔기 470-474번과 475-476번 중 하나 이상; 서열번호 3의 아미노산 잔기 97-100번과 101-103번 중 하나 이상; 서열번호 4의 아미노산 잔기 262-269번과 270-274번 중 하나 이상 또는 이들에 상응하는 비-인간 세린 프로테아제 내 아미노산 잔기는 표 1에 나타낸 아미노산 잔기로부터 선택된 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된다.

본 기술 분야의 당업자라면 본 명세서에서 정의하고 있는 본 발명의 비-인간 세린 프로테아제의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역에서 아미노산 잔기가 치환될 때 본 발명의 바람직한 단백질에 이미 존재하지 않는 아미노산 잔기만이 바람직하게는 치환된다는 것을 이해할 것이다. 본 기술 분야의 당업자라면 상기 서열번호들에 대해 위에서 언급한 내용은 아미노산 잔기의 특정 영역에서 아미노산 잔기의 치환을 예시하는 의미로만 참고된다는 것을 알 것이다. 따라서 당업자는 하나 이상의 어느 아미노산 잔기가 비-인간 세린 프로테아제에서 다른 어떤 아미노산 잔기 또는 잔기들에 대해 치환될 것인지 알 것이다. 본 발명은 위에 언급한 삽입과 치환의 모든 가능한 조합들에 관한 것이다.

본 발명의 단백질은 본 명세서에서 정의하고 있는 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역에서 적어도 하나의 아미노산 잔기의 결실을 적어도 하나의 아미노산 잔기의 삽입과 적어도 하나의 아미노산 잔기의 결실 후 상기 영역 내의 아미노산 잔기의 총수가 천연 세린 프로테아제 폴리펩티드의 상기 영역 내 아미노산 잔기의 수에 비해 증가한다면 더 포함할 수 있다. 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20 또는 30개의 아미노산 잔기가 결실된 본 발명의 단백질이 특히 바람직하다.

본 발명의 바람직한 단백질은 삽입과 치환의 조합 또는 삽입, 치환 및/또는 결실의 조합을 포함한다. 삽입과 결실은 서로 독립적으로 일어날 수 있으므로 예를 들면 본 명세서에서 정의하고 있는 아미노산 잔기의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역 내 서로 다른 아미노산 위치에 5개의 아미노산 잔기의 삽입과 4개의 아미노산의 결실이 존재하여 본 발명의 세린 프로테아제 내 아미노산 잔기의 총수가 증가할 수 있다. 당업자라면 삽입 또는 결실에 의해 단백질의 아미노산 잔기 번호 표기가 변하는 것을 이해할 것이다.

본 발명의 단백질은 가장 바람직하게는 트롬빈의 경우에 서열번호 1의 아미노산 잔기 His-450과 Asp-462 사이에 또는 비-인간 트롬빈의 경우에 서열번호 1의 아미노산 잔기 His-450과 Asp-462 사이에 상응하는 아미노산 잔기 사이에 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 또는 서열번호 16의 아미노산 서열을 가진 아미노산 잔기의 영역을 포함한다.

본 발명의 단백질은 가장 바람직하게는 응고 인자 XIa의 경우에 서열번호 2의 아미노산 잔기 His-469와 Asp-480 사이에 또는 비-인간 응고 인자 XIa의 경우에 서열번호 2의 His-469와 Asp-480에 상응하는 아미노 잔기 사이에 서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 가진 아미노산 잔기의 영역을 포함한다.

본 발명의 단백질은 가장 바람직하게는 트립신의 경우에 서열번호 3의 아미노산 잔기 His-96과 Asp-107 사이에 또는 비-인간 트립신의 경우에 서열번호 3의 His-96과 Asp-107에 상응하는 아미노 잔기 사이에 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 가진 아미노산 잔기의 영역을 포함한다.

본 발명의 단백질은 가장 바람직하게는 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자의 경우에 서열번호 4의 아미노산 잔기 His-262와 Asp-275 사이에 또는 비-인간 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자의 경우에 서열번호 4의 His-262와 Asp-275에 상응하는 아미노산 잔기 사이에 서열번호 11 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 가진 아미노산 잔기의 영역을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 단백질과 실질적으로 상동적이고 생물학적으로 동등한 단백질을 포함한다. 본 발명의 단백질은 바람직하게는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 4; 또는 그의 활성화된 형태와 90%를 초과하는 상동성이 있는 아미노산 서열을 갖는바, 상기 단백질은 촉매 활성이거나 처리/활성화 후에 촉매 활성이고 세린 프로테아제 저해제, 바람직하게는 직접 트롬빈-, 응고 FXIa-, 트립신- 또는 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 저해제에 대해 감감소된 감수성을 갖는다.

본 발명의 또 다른 단백질은 서열번호 1의 Ile-542에 상응하는 아미노산 잔기 위치의 아미노산 잔기가 치환 또는 대체된 세린 프로테아제 폴리펩티드를 포함하는 재조합 단백질로서, 상기 세린 프로테아제 폴리펩티드는 응고 인자 X 폴리펩티드 또는 그의 자연적으로 처리 또는 활성화된 형태가 아니다. 예를 들면 당업자라면 서열번호 1의 Ile-542 위치는 서열번호 2의 His-552 위치, 서열번호 3의 Gly-177 위치와 서열번호 4의 Ser-353 위치에 상응함을 알고 있다. 당업자라면 다른 세린 프로테아제 폴리펩티드에서 서열번호 1의 Ile-542, 서열번호 2의 His-552, 서열번호 3의 Gly-177 또는 서열번호 4의 Ser-353에 상응하는 아미노산 잔기 위치를 어렵지 않게 동정할 수 있다. 바람직하게, 서열번호 1의 Ile-542, 서열번호 2의 His-552, 서열번호 3의 Gly-177 또는 서열번호 4의 Ser-353 아미노산 잔기 위치에서 치환이 이루어진다. 치환 또는 대체는 돌연변이, 바람직하게는 보존적 또는 비보존적 돌연변이이다. 바람직하게, 치환되는 아미노산 잔기는 표 1에 나타낸 아미노산 잔기 중 어느 하나일 수 있다. 보다 바람직하게, 치환되는 아미노산 잔기는 알라닌, 세린, 페닐알라닌 또는 글루탐산이다. 바람직하게, 세린 프로테아제 폴리펩티드는 (프로)트롬빈이다. 이 절에 기재되어 있는 단백질에서 아미노산 잔기 치환은 본 명세서에 기재되어 있는 어느 삽입과도 조합할 수 있다.

본 발명과 관련하여 사용하는 용어 "세린 프로테아제 저해제에 대한 감수성 감소" 또는 "세린 프로테아제 저해제에 의한 저해에 대해 감수성 감소"는 최대 저해율의 50%를 얻기 위해 필요한 세린 프로테아제 저해제의 농도(Ki)이다. 이 농도는 천연 세린 프로테아제 폴리펩티드보다 본 발명의 폴리펩티드에 대해 더 높다. 상기 천연 세린 프로테아제 폴리펩티드는 바람직하게는 혈장으로부터 유래되거나 재조합에 의해 생산된다. 세린 프로테아제 저해제의 Ki는 바람직하게는 본 발명의 단백질을 0.001 내지 100 μM의 세린 프로테아제 저해제와 함께 전배양하고 이어서 촉매 활성을 분석하는 실험을 수행하여 결정한다.

본 발명의 단백질의 Ki는 본 명세서에서 정의하고 있는 아미노산 잔기의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역에 적어도 하나의 아미노산 잔기가 삽입되지 않은 상기 천연 세린 프로테아제 폴리펩티드의 Ki보다 바람직하게는 2배 넘게, 보다 바람직하게는 50배 내지 100배, 가장 바람직하게는 100배 넘게 증가한다.

본 발명은 또한 본 발명의 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 DNA 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 본 기술 분야의 당업자라면 본 발명의 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 어떻게 생성하는지 그리고 일반적으로 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 상기 DNA 서열을 가진 핵산 분자를 어떻게 제조 및 단리하는지 이해할 것이다. 상기 핵산 분자의 서열은 바람직하게는 본 발명의 숙주 세포에서 발현을 위해 코돈-최적화된다. 이러한 방식으로 특정 숙주 세포에서 높은 발현 수준을 위해 유리한 코돈이 사용된다.

본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

핵산 분자는 바람직하게는 본 기술 분야의 당업자에게 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 발현 벡터에 삽입된다. 본 발명과 관련하여 발현 벡터는 숙주 세포에서 본 발명의 단백질의 발현을 지시한다. 이들 발현 벡터는 바람직하게는 에피솜으로서 또는 염색체 DNA의 일부로서 숙주 세포에서 복제 가능하다. 또한 발현 벡터는 바람직하게는 (i) CMV 또는 SV40 프로모터와 같은 강력한 프로모터/인핸서, (ii) 리보솜 결합 부위와 개시 코돈과 같은 최적의 번역 개시 서열, 바람직하게는 KOZAK 공통 서열 및 (iii) 단백질이 진핵 세포에서 발현될 때 폴리(A) 신호를 포함한 전사 종결 서열을 포함한다. 적합한 발현 벡터는 플라스미드 및 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스와 레트로바이러스와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 본 기술 분야의 당업자라면 사용할 발현 벡터가 재조합 단백질의 발현을 위해 사용되는 숙주 세포에 의존한다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 바람직하게는 박테리아 세포를 포함한 원핵 세포 또는 보다 바람직하게는 효모 세포와 포유류 세포와 같은 진핵 숙주 세포에서 본 발명의 핵산 분자의 발현을 위해 적합하다. 포유류 발현 벡터 pCMV4가 특히 바람직하다.

이와 달리, 본 발명의 핵산 분자는 숙주 세포의 게놈에 삽입될 수 있다. 상기 삽입은 바람직하게는 숙주 세포에서 본 발명의 핵산 분자가 발현될 수 있도록 하는 위치에서 또는 영역 내에서 이루어진다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 바람직하게는 본 발명의 핵산 분자를 발현하여 본 발명의 단백질을 생산하는 숙주 세포를 제공한다. 상기 단백질은 숙주 세포 내에서 생산되거나 바람직하게는 숙주 세포로부터 분비된다.

본 발명에서 사용하기에 적합한 숙주 세포로는 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 동물 세포, 포유류 세포, 쥐 세포, 래트 세포, 양 세포, 원숭이 세포 및 인간 세포와 같은 원핵 및 진핵 세포를 포함한다. 적합한 진핵 숙주 세포의 예로는 HEK 293 세포, 햄스터 세포주 CHO와 BHK-21; 쥐 숙주 세포 NIH3T3, NSO와 C127; 원숭이 숙주 세포 COS와 Vero; 및 인간 숙주 세포 HeLa, PER.C6, U-937과 Hep G2를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 적합한 세포는 ATCC와 Life Technologies 사와 같은 공인된 공급처로부터 입수할 수 있다. 다수의 형질주입 기술이 본 기술 분야에 공지되어 있는바, 예를 들면 문헌 Graham et al., 1973; Virology 52: 456; Green et al., 2012. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", CSHL Press; Davis et al., "Basic Methods in Molecular Biology", 1986, Elsevier; Chu et al., 1981. Gene 13: 197을 참조할 것. 본 기술 분야의 당업자는 바람직하게는 이들 문헌에 기재되어 있는 기술을 이용하여 하나 이상의 외인성 핵산 분자를 적합한 숙주 세포에 도입할 수 있다.

본 발명의 단백질을 생산하기에 특히 바람직한 숙주 세포는 HEK 293 세포이다.

본 발명은 또한 본 발명의 단백질과 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하게는 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제 및 본 기술 분야에 공지되어 있는 다른 물질들 중 하나 이상을 포함한다. 담체의 특성은 당업자에게 공지 되어 있는 바와 같이 투여 경로에 따라 다를 것이다. 활성화된 세린 프로테아제 폴리펩티드 투여시 일어날 수 있는 혈전 위험을 줄이기 위해서 본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하게는 대상에 투여한 후에 활성화되는 본 발명의 단백질을 포함한다.

용어 "대상"은 포유류, 바람직하게는 인간 군을 의미한다.

본 발명과 관련하여 용어 "약제학적 조성물"은 본 발명의 단백질과 생체내 또는 생체외 치료용으로 상기 조성물이 적합하도록 불활성 또는 활성인 담체의 조합물을 의미한다.

본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "약제학적으로 허용되는"은 본 발명의 단백질의 물리 및 화학적 특성과 양립할 수 있고 상기 단백질의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않는 비독성 물질을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 소화관을 통해 흡수되는 조성물의 장내 투여, 예를 들면 경구 섭취 또는 직장 투여에 적합할 수 있다. 상기 조성물은 바람직하게는 단백질 분해를 방지하기 위해서 예를 들면 리포솜에 의해 캡슐화된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하게는 조성물이 정맥내, 동맥내, 피하 및/또는 근육내로 도입되는 비경구 투여에 적합하다. 비경구 투여는 바람직하게는 주사기, 바늘 또는 카테터를 사용하여 본 발명의 약제학적 조성물을 신체 조직 또는 체액 안으로 주사 또는 주입하는 것을 포함한다. 이와 달리, 비경구 투여를 위한 수단으로서 바늘을 사용하지 않는 고압 투여를 이용할 수 있다.

주사용 조성물(예를 들면 정맥내 조성물)의 경우, 담체는 수성 또는 유성 용액, 분산액, 유액 및/또는 현탁액일 수 있다. 바람직하게, 담체는 수용액, 바람직하게는 증류 멸균수, 식염수, 완충 식염수 또는 또 다른 약제학적으로 허용되는 주사용 부형제이다.

상처 부위에 혈액을 공급하는 트롬빈 또는 응고 인자 XIa인 본 발명의 단백질을 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물은 예를 들면 상처에 또는 안에 또는 상처에 혈액을 공급하는 혈관, 바람직하게는 동맥에 국소 도포될 수 있다. 상기 국소 투여는 국소 또는 전신 치료 효과를 생기게 하기 위한 예를 들면 크림, 발포제, 포말, 로션 또는 연고의 형태의 국부 투여 또는 예를 들면 주사 또는 주입에 의한 비경구 투여이다. 국소 효과를 위한 본 발명의 단백질의 국부 투여는 전신 혈전증의 잠재적인 발병 위험을 감소시킨다.

본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하게는 다양한 치료 분야에서 사용된다. 예를 들면 트롬빈 또는 응고 인자 XIa인 본 발명의 단백질을 포함하는 약제학적 조성물은 혈우병 A와 B 저해제 환자군을 포함하여 혈우병 A와 B와 같이 정상적인 혈액응고가 악화된 장애의 치료 또는 완화에 우회제제(bypassing agent)로서 사용될 수 있다. 혈우병 A 및 B 저해제 환자는 출혈 증상 발현을 치료 또는 예방하기 위해 사용되는 제품을 지향하는 항체가 만들어진 환자이다.

따라서 본 발명은 또한 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 단백질 또는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 트롬빈 또는 응고 인자 XIa 폴리펩티드를 포함하는 본 발명에 따른 단백질 또는 대상에서 응고 저해제의 항응고 효과를 완전히 또는 부분적으로 길항하는 방법에 사용하기 위해 트롬빈 또는 응고 인자 XIa 폴리펩티드를 포함하는 본 발명에 따른 약제학적 조성물을 제공한다.

용어 "항응고 효과"는 응고 저해제의 작용의 결과인 혈액응고의 예방과 같은 치료 효과를 의미한다.

본 발명은 또한 대상에서 응고 저해제의 항응고 효과를 완전히 또는 부분적으로 길항하는 약제의 제조를 위한 트롬빈 또는 응고 인자 XIa 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 단백질의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 대상에서 응고 저해제의 항응고 효과를 완전히 또는 부분적으로 길항하는 방법으로서, 상기 대상에 트롬빈 또는 응고 인자 XIa 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 단백질 또는 트롬빈 또는 응고 인자 XIa 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 본 발명의 방법은 항응고제 요법 관련 출혈 합병증을 예방 또는 완화하기 위해 적용된다.

본 명세서에서 사용하고 있는 용어 "치료 유효량"은 투여할 약제학적 조성물에 함유된 유효 성분의 양이 의도한 목적을 달성하기에 충분한 양, 특히 이 경우에 응고 저해제의 항응고 효과를 완전히 또는 부분적으로 길항하기에 충분한 양임을 의미한다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물 중 유효 성분, 즉 본 발명의 단백질의 양은 바람직하게는 약 5 mg 내지 10 그램 범위의 단백질이다.

치료 유효량은 본 발명의 단백질을 필요로 하는 사람의 혈중 단백질의 평균 농도에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 치료 유효량은 (i) 바람직하게는 본 발명에 따른 트롬빈 5 mg 내지 10 g, 바람직하게는 150 mg 내지 10 그램; (ii) 본 발명에 따른 응고 인자 XIa 5 mg 내지 600 mg, 바람직하게는 5 mg 내지 300 mg; (iii) 본 발명에 따른 트립신 100 마이크로그램 내지 7 mg; 및 (iv) 본 발명에 따른 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 0.004 mg 내지 0.3 mg이다. 당업자라면 본 발명에 따른 단백질 각각의 투여량은 이들 단백질의 정상 혈장 또는 혈청 농도가 다르기 때문에 달라질 수 있음을 이해할 수 있다.

본 발명의 트롬빈 또는 응고 인자 XIa 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 단백질을 포함하는 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 응고 저해제의 항응고 효과의 완전한 또는 부분적인 길항을 필요로 하는 대상에 바람직하게는 단 1회, 2회 또는 3회, 바람직하게는 단 1회만 투여된다.

본 발명은 또한 대상에서 트립신 저해제의 펩티드 결합 가수분해의 저해를 완전히 또는 부분적으로 길항하는 방법에 사용하기 위해 본 발명의 트립신 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 단백질 또는 본 발명의 트립신 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 단백질을 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물을 제공한다.

이와 같은 의미에서, 본 발명은 대상에서 트립신 저해제의 펩티드 결합 가수분해의 저해를 완전히 또는 부분적으로 길항하는 방법으로서, 상기 대상에 본 발명의 트립신 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 단백질 또는 본 발명의 트립신 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 단백질을 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 본 발명의 단백질을 투여하기 전에 상기 대상을 트립신 저해제로 치료한다.

이와 같은 의미에서, 본 발명은 대상에서 트립신 저해제의 펩티드 결합 가수분해의 저해를 완전히 또는 부분적으로 길항하기 위한 약제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 트립신 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 단백질의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 트립신 저해제의 펩티드 결합 가수분해의 저해를 완전히 또는 부분적으로 길항하는데 있어서 트립신 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 단백질의 비-치료 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 대상에서 항섬유소 용해 효과, 바람직하게는 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 저해제와 같은 저해제에 의해 유도되는 항섬유소 용해 효과를 완전히 또는 부분적으로 길항하는데 사용하기 위해 본 발명의 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자를 포함하는 본 발명의 단백질을 제공한다. 바람직하게, 이와 관련하여 항섬유소 용해 효과는 바람직하게는 중증 또는 대규모 심부 정맥 혈전증, 폐색전증, 심근경색 또는 폐색된 정맥내 또는 투석 캐뉼라와 같은 혈전증과 관련하여 혈전 분해의 감소로 나타난다. 상기 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 저해제는 메수프론인 것이 또한 바람직하다.

상기 대상은 바람직하게는 메수프론으로 치료한 암환자이다. 메수프론과 같은 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 저해제는 전이에 기여할 것으로 예상되는 조직 분해를 방지하기 위해서 종종 암환자에게 투여된다. 그러나 메수프론과 같은 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 저해제를 투여하면 본 발명에 따른 재조합 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자로 치료할 수 있는 항섬유소 용해 효과가 나타날 수 있다.

본 명세서에 기재되어 있는 다른 투여 경로 이외에도 본 발명의 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자는 예를 들면 복잡한 흉막 삼출액과 농흉의 배액을 개선하도록 흉막내 투여용으로 제형화할 수 있다.

동일한 방식으로, 본 발명은 대상에서 항섬유소 용해 효과, 바람직하게는 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 저해제와 같은 저해제에 의해 유도되는 항섬유소 용해 효과를 완전히 또는 부분적으로 길항하기 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자를 포함하는 본 발명의 단백질을 제공한다.

동일한 방식으로, 본 발명은 대상에서 항섬유소 용해 효과, 바람직하게는 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 저해제와 같은 저해제에 의해 유도되는 항섬유소 용해 효과를 완전히 또는 부분적으로 길항하는 방법으로서, 상기 대상에 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 단백질 또는 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 약제학적 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 바람직하게, 본 발명의 방법은 항섬유소 용해 저해제 요법 관련 혈전 합병증을 예방 또는 완화하기 위해 적용된다.

이와 달리, 본 발명은 외부-표면 펩티드 구조에 삽입된 적어도 하나의 아미노산 잔기를 포함하는 세린 프로테아제 폴리펩티드를 포함하는 재조합 단백질로서, 상기 세린 프로테아제 폴리펩티드가 응고 인자 X 폴리펩티드 또는 응고 인자 Xa 폴리펩티드와 같이 그의 촉매 활성 또는 자연 처리된 형태가 아닌 재조합 단백질을 제공한다.

바람직하게, 상기 펩티드 구조는 서열번호 1의 His-450과 Asp-462 사이 아미노산 잔기의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역이다. 이와 관련하여, 용어 "상응하는"은 트롬빈과 비-트롬빈 세린 프로테아제 내 아미노산 잔기의 영역을 언급하기 위해 사용된다. 이와 달리, 상기 세린 프로테아제 폴리펩티드는 트롬빈, 응고 인자 XIa, 트립신과 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자로 이루어진 군으로부터 선택되되 상기 외부-표면 펩티드 구조는 본 명세서에 나타낸 바와 같다.

본 발명과 관련하여, 단백질은 (잠재적으로) 응혈촉진제 세린 프로테아제이고 상기 단백질의 전장 아미노산 서열이 서로 다른 종의 응고 FX 인자 사이에 보존되는 아미노산 잔기의 스트레치 또는 단일 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 잔기의 스트레치 또는 단일 아미노산 잔기를 포함하는 경우에 응고 Fx 또는 FXa 폴리펩티드이다. 예를 들면 인간 응고 인자 X(Genbank 수탁번호 AAH46125.1 참조)의 아미노산 잔기 Cys-246 내지 Ala-250, Phe-260 내지 Leu-266 및/또는 Asp-413 내지 His-423에 상응하는 아미노산 잔기의 스트레치를 함유한 폴리펩티드를 포함하는 응혈촉진제 세린 프로테아제는 응고 FXa 폴리펩티드인 것으로 간주된다. 전술한 바와 같이, 상기 나타낸 His와 Asp 아미노산 잔기들은 서로 다른 세린 프로테아제 폴리펩티드 사이와 서로 다른 종 사이에서 보존된다.

명료성과 간결한 설명을 위해서, 본 명세서에서 동일하거나 개별적인 구현예들의 일부로서 특징들이 기술되어 있지만 본 발명의 범위가 기술된 특징들의 전부 또는 일부의 조합을 갖는 구현예들을 포함할 수 있는 이해되어야 할 것이다.

서열번호 1(인간 응고 전구 트롬빈 단백질)

1 mahvrglqlp gclalaalcs lvhsqhvfla pqqarsllqr vrrantflee vrkgnlerec

61 veetcsyeea fealesstat dvfwakytac etartprdkl aaclegncae glgtnyrghv

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481 vclpdretaa sllqagykgr vtgwgnlket wtanvgkgqp svlqvvnlpi verpvckdst

541 riritdnmfc agykpdegkr gdacegdsgg pfvmkspfnn rwyqmgivsw gegcdrdgky

601 gfythvfrlk kwiqkvidqf ge

서열번호 2(인간 응고 인자 XI 단백질)

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601 qrerpgvytn vveyvdwile ktqav

서열번호 3(인간 트립신-1 단백질)

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61 aghcyksriq vrlgehniev legneqfina akiirhpqyd rktlnndiml iklssravin

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241 ntiaans

서열번호 4(인간 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자)

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361 caadpqwktd scqgdsggpl vcslqgrmtl tgivswgrgc alkdkpgvyt rvshflpwir

421 shtkeengla l

서열번호 5

1 kkfvppqkay kfdlaaldr

서열번호 6

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서열번호 7

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서열번호 8

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서열번호 9

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서열번호 10

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서열번호 11

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서열번호 12

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서열번호 13

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서열번호 14

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서열번호 15

1 pkyhqgsgpi lprrtldr

서열번호 16

1 prydsissky lkellekpld r

도 1. 상부 패널은 인간 프로트롬빈(서열번호 1) 내 His-450으로부터 Asp-462까지 아미노산 잔기의 영역과 인간 FXI(서열번호 2), 인간 트립신(서열번호 3) 및 인간 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자(서열번호 4) 내 상기 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역을 정렬한 것을 보여주고 있다. 3개의 하부 패널은 His-450 내지 Asp-462의 상기 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역에 삽입이 있는 인간 프로트롬빈, His-469와 Asp-480 사이의 상기 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역에 삽입이 있는 인간 FXI, His-96과 Asp-107 사이의 상기 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역에 삽입이 있는 인간 트립신 및 His-262와 Asp-275 사이의 상기 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역에 삽입이 있는 인간 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자의 새로이 생성된 'A' 및 'B' 단백질 변이체를 보여주고 있다. 보존 잔기 히스티딘과 아스파르트산은 강조 표시되어 있다.
도 2. 아르가트로반-트롬빈 복합체의 결정 구조를 보여주고 있다(PDB 1DWC). 아르가트로반-접촉 잔기(His57, Tyr60A, Lys60F, Leu99, Ile174, Glu192, Ser195, Asp189, Glu192, Gly216, Gly218, Gly226; 키모트립신 번호 표기(Bode, W. et al., 1989. EMBO J 8: 3467-3475)) 및 세작용기 촉매 잔기 His57, Ser195 및 Asp102는 스틱으로 나타나 있다. His91 루프는 화살표로 강조되어 있고 표시되어 있다.
도 3. compound 33-FXIa 복합체의 결정 구조를 보여주고 있다(PDB 4X6P). Compound 33은 스틱 모델로 나타나 있다. FXIa는 표면 표현으로 나타나 있다. 접촉 잔기(His40, Leu41, Cys42, Cys58, Tyr58b, Tyr143, Ile151, Asp189, Lys192, Gly193, Asp194, Ser195, Gly216, Gly218, Tyr228; 키모트립신 번호 표기(Bode, W. et al., 1989. EMBO J 8: 3467-3475)) 세작용기 촉매 잔기 His57, Ser195 및 His91 루프는 강조 표시되어 있다. 후자는 추가로 화살표로 표시되어 있다.
도 4. 멜라가트란-트립신 복합체의 결정 구조를 보여주고 있다(PDB 1K1P). 접촉 잔기(Asp189, Ser190, Gly216 및 Gly21; 키모트립신 번호 표기(Bode, W. et al., 1989. EMBO J 8: 3467-3475)) 및 세작용기 촉매 잔기 His57과 Ser195는 스틱으로 나타나 있다. His91 루프는 화살표로 강조되어 표시되어 있다.
도 5. 인간 프로트롬빈('트롬빈', 서열번호 1) 내 His-450으로부터 Asp-462까지 아미노산 잔기의 영역과 인간 프로트롬빈 내 His-450 내지 Asp-462의 상기 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역에 삽입이 있는 인간 프로트롬빈의 새로이 생성된 단백질 변이체('ISO1', 'ISO2', 'NSC', 'KL10', 'ALB')의 정렬. 450번 위치의 보존된 잔기 히스티딘과 462번 위치의 아스파르트산이 강조 표시되어 있다.
도 6. 직접 트롬빈 저해제 다비가트란-serie 1에 의한 발색 트롬빈 활성의 저해. 다비가트란의 농도가 증가하는 상태에서(20 nM-20 μM) 5 nM 혈장 유래 트롬빈('IIa'; 패널 A), 활성화된 혈장 유래 프로트롬빈('pd-IIa'; 패널 B), 재조합 트롬빈('r-IIa'; 패널 C), 재조합 트롬빈 변이체 ISO1('ISO1'; 패널 D) 또는 재조합 트롬빈 변이체 NSC('NSC'; 패널 E)에 의한 펩티딜 기질 전환율(S-2238; 100 μM). IC50 농도는 Graphpad Prism 소프트웨어 세트를 사용하는 비선형 회귀법에 의해 S-2238 전환율(mOD/분)을 피팅하여 얻었다. 모든 데이터 포인트는 2회의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 패널 F: 기질 전환율(속도)은 저해제의 부재 상태에서 배양의 비로서 그래프로 나타내었다. 패널 F에서 변이체가 대조군보다 더 높은 정규화 속도를 보인다는 것이 명확히 나타나 있다.
도 7. 직접 트롬빈 저해제 다비가트란-serie 2에 의한 발색 트롬빈 활성의 저해. 다비가트란의 농도가 증가하는 상태에서(20 nM-20 μM) 5 nM 혈장 유래 트롬빈('IIa'; 패널 A), 재조합 트롬빈('r-IIa'; 패널 B), 재조합 트롬빈 변이체 ALB('ALB'; 패널 C), 재조합 트롬빈 변이체 KL10('KL10'; 패널 D) 또는 재조합 트롬빈 변이체 ISO2('ISO2'; 패널 E)에 의한 펩티딜 기질 전환율(S-2238; 100 μM). IC50 농도는 Graphpad Prism 소프트웨어 세트를 사용하는 비선형 회귀법에 의해 S-2238 전환율(mOD/분)을 피팅하여 얻었다. 모든 데이터 포인트는 2회의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 패널 F: 기질 전환율(속도)은 저해제의 부재 상태에서 배양의 비로서 그래프로 나타내었다. 패널 F에서 변이체가 대조군보다 더 높은 정규화 속도를 보인다는 것이 명확히 나타나 있다.
도 8. 다비가트란과 복합한 트롬빈의 결정 구조(PDB 1KTS)(Hauel et al., J Med Chem 45: 1757-1766(2002)). 활성 부위 잔기 His406, Asp462와 Ser568 및 다비가트란 상호작용 잔기 Tyr410, Leu459, Ile542, Asp562, Trp590과 Gly591은 봉선화(stick figure)로 나타나 있다. 활성 부위의 S4 서브포켓의 위치는 타원으로 표시되어 있고 잔기 Ile542가 표시되어 있다.
도 9. 직접 트롬빈 저해제 다비가트란-serie 3에 의한 발색 트롬빈 활성의 저해. 다비가트란의 농도가 증가하는 상태에서(20 nM-20 μM) 5 nM 혈장 유래 트롬빈(패널 A), 재조합 트롬빈(패널 B), 재조합 트롬빈 변이체 1542F(패널 C), 재조합 트롬빈 변이체 1542A(패널 D), 재조합 트롬빈 변이체 1542E(패널 E) 또는 재조합 트롬빈 변이체 1542S(패널 F)에 의한 펩티딜 기질 전환율(S-2238; 100 μM). IC50 농도는 Graphpad Prism 소프트웨어 세트를 사용하는 비선형 회귀법에 의해 S-2238 전환율(mOD/분)을 피팅하여 얻었다. 모든 데이터 포인트는 2회의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다.
도 10. 직접 트롬빈 저해제 다비가트란에 의한 발색 트롬빈 활성의 정규화 저해율. 다비가트란의 농도가 증가하는 상태에서(20 nM-20 μM) 5 nM 혈장 유래 트롬빈('IIa'), 재조합 트롬빈('r-IIa'), 재조합 트롬빈 변이체 1542A, 재조합 트롬빈 변이체 1542E, 재조합 트롬빈 변이체 1542F 또는 재조합 트롬빈 변이체 1542S에 의한 펩티딜 기질 전환율(S-2238; 100 μM). 기질 전환율(속도)은 저해제의 부재 상태에서 배양의 비로서 그래프로 나타내었다. 모든 데이터 포인트는 2회의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 변이체가 대조군보다 더 높은 정규화 속도를 보인다는 것이 명확히 나타나 있다.
도 11. 인간 프로트롬빈('트롬빈', 서열번호 1) 내 Cys-536으로부터 Cys-550까지, 인간 인자 XI('FXIa', 서열번호 2) 내 Cys-545로부터 Cys-560까지, 인간 트립신-1('트립신', 서열번호 3) 내 Cys-171로부터 Cys-185까지, 인간 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자('uPA', 서열번호 4) 내 Cys-345로부터 Cys-361까지 아미노산 잔기의 영역의 정렬. 잔기 Ile-542(서열번호 1), His-552(서열번호 2), Gly-177(서열번호 3)과 Ser-353(서열번호 4)은 강조 표시되어 있다.

실시예

실시예 1: 재료 및 방법

재료: 직접 세린 프로테아제 저해제는 Alsachim사와 Adooq사로부터 얻은 것이고, 옥수수 트립신 저해제는 Haematologic Technologies사로부터 얻은 것이다. FXI가 고갈된 인간 혈장과 프로트롬빈이 고갈된 인간 혈장, Neoplastin CI plus 10 및 TriniCLOT 자동화 APTT는 Diagnostica Stago사로부터 얻은 것이다. 펩티딜 기질 S-2238, S-2366, S-2444 및 S-2222는 Chromogenix사로부터 얻은 것이다. Roche사로부터 얻은 인슐린-트랜스페린-소듐 셀레나이트(ITS)를 제외한 모든 조직 배양 시약은 Life Technologies사로부터 얻은 것이다. 캘리브레이터(calibrator)와 형광성 기질(FluCa)은 Thrombinoscope BV사로부터 얻은 것이다. 75%(w/w) 계란 L-포스파티딜콜린과 25%(W/W) 돼지 뇌 L-포스파티딜세린(Avanti Polar Lipids)으로 구성된 소형 단일막 인지질 소포(PCPS)는 이전에 기술한 바와 같이 제조하여 특성을 확인한다(Higgins et al 1983, J Biol Chem 258: 6503-6508). 일반적인 재조합 단백질 생산과 정제 기술은 Green and Sambrook, Molecular Cloning, 4^th edition, July 2012에 기재된 바와 같다.

트롬빈의 발현 및 정제: 프로트롬빈 변이체 A(His-450과 Asp-462 사이에 서열번호 5의 아미노산 서열을 가진 프로트롬빈(서열번호 1))와 B(His-450과 Asp-462 사이에 서열번호 6의 아미노산 서열을 가진 프로트롬빈(서열번호 1)) 및 야생형 프로트롬빈을 코딩하는 플라스미드(pcDNA3.1(+))를 선택 가능한 마커 플라스미드로서 LipofectAMINE 2000(Invitrogen)과 pSV2neo을 사용하여 HEK 293 세포에 도입한다. Orcutt et al. 2004. J Biol Chem 279: 54927-54936에 기본적으로 기재되어 있는 바대로 프로트롬빈-특이적 ELISA와 PT 응고 분석을 토대로 고발현 클론을 선택한다. 선택한 클론을 10층 세포 공장(10-stacked cell factories)(Nalge-Nunc, 네이퍼빌, IL)으로 확장시키고 5 ㎍/ml ITS와 10 ㎍/ml Vitamin K가 부가된 둘베코 변형 이글 배지/F-12 배지에서 배양한다. 순화 배지를 5-6일 동안 수거하여 원심분리하고 1 mM 벤즈아미딘의 존재하 -20℃에서 보관한다. Orcutt et al. 2004. J Biol Chem 279: 54927-54936에 기본적으로 기재되어 있는 바대로, Q-Sepharose FF(GE Healthcare), HQ POROS 기질(Affinity Biologicals) 및 세라믹 히드록시아파타이트 기질(Bio-Rad)을 사용하는 순화 배지로부터 프로트롬빈을 정제한다. 정제한 프로트롬빈을 -20℃에서 50% vol/vol 글리세롤을 함유한 HBS에 보관한다. 단백질 순도는 환원 조건에서 프리-캐스트(pre-cast) 4-12% 구배 겔(Invitrogen)을 사용하는 SDS-PAGE에 의해 평가하고 Coomassie Brilliant Blue R-250으로 염색한다. Lundblad et al., 1976. Methods Enzymol 45: 156-176에 기재되어 있는 바대로 프로트롬빈의 예비 활성화 후 트롬빈을 정제한다.

FXI의 발현 및 정제: FXI 변이체 A(His-469와 Asp-480 사이에 서열번호 7의 아미노산 서열을 가진 FXI(서열번호 2))와 B(His-469와 Asp-480 사이에 서열번호 8의 아미노산 서열을 가진 FXI(서열번호 2)) 및 C-말단을 통해 HPC4-항체 인식 서열(아미노산 서열 EDQVDPRLIDGK)에 접합되어 정제가 용이한 야생형 FXI을 코딩하는 플라스미드(pcDNA3.1(+))를 선택 가능한 마커 플라스미드로서 LipofectAMINE 2000(Invitrogen)과 pSV2neo을 사용하여 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포에 도입한다.인자 V에 대해 Toso et al. 2004. J Biol Chem 279: 21643-21650에 기본적으로 기재되어 있는 바대로, FXI-특이적 ELISA와 APPT 응고 분석을 토대로 고발현 클론을 선택한다. 선택한 클론을 3중(triple) 플라스크(Nalge-Nunc, 네이퍼빌, IL)로 확장시키고 5 ㎍/ml ITS와 1.0 mg/ml Albumax(Invitrogen)가 부가된 둘베코 변형 이글 배지/F-12 배지에서 배양한다. 순화 배지를 5-6일 동안 수거하여 원심분리하고 1 mM 벤즈아미딘의 존재하 -20℃에서 보관한다. 순화 배지를 37℃에서 해동하고 모아서 25 mM 트리스, 0.05 M NaCl, 5 mM CaCl2, pH 7.4에서 평형화한 항-HPC4 세파로오스 컬럼에 로딩한다. 칼럼을 평형화 완충액으로 세척한 다음, 25 mM Tris, 0.5 M NaCl, 5 mM EDTA, pH 7.4로 용출시킨 후, 25 mM Tris, 2 M NaCl, 5 mM EDTA, pH 7.4로 용출한다. FXI 활성이 포함된 분획을 모아서 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.4에 대하여 투석하고, 한외여과(Millipore)에 의해 농축하고, 정제한 단백질을 -80℃에서 보관한다. 단백질 순도는 환원 조건에서 프리-캐스트 4-12% 구배 겔(Invitrogen)을 사용하는 SDS-PAGE에 의해 평가하고 Coomassie Brilliant Blue R-250으로 염색한다. Ogawa et al., 2005. J Biol Chem 280: 23523-23530에 기재되어 있는 바대로 FXI의 예비 활성화 후 인자 XIa를 정제한다.

유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자(uPA)의 발현 및 정제: 인간 uPA변이체 A(His-262와 Asp-275 사이에 서열번호 11의 아미노산 서열을 가진 uPA(서열번호 4))와 B(His-262와 Asp-275 사이에 서열번호 12의 아미노산 서열을 가진 uPA(서열번호 4)) 및 C-말단을 통해 HPC4-항체 인식 서열(아미노산 서열 EDQVDPRLIDGK) 또는 His-표지(6His: HHHHHH 또는 12His: HHHHHHHHHHHHH)에 접합되어 정제가 용이한 야생형 uPA를 코딩하는 플라스미드(pcDNA3.1(+))를 선택 가능한 마커 플라스미드로서 LipofectAMINE 2000(Invitrogen)과 pSV2neo을 사용하여 포유류 세포(HEK 293은 BHK임)에 도입한다. 인간 uPA-특이적 ELISA(R&D Systems)를 토대로 고발현 클론을 선택한다. 선택한 클론을 3중 플라스크(Nalge-Nunc, 네이퍼빌, IL)로 확장시키고 5 ㎍/ml ITS와 1.0 mg/ml Albumax(Invitrogen)가 부가된 둘베코 변형 이글 배지/F-12 배지에서 배양한다. 순화 배지를 5-6일 동안 수거하여 원심분리하고 1 mM 벤즈아미딘의 존재하 -20℃에서 보관한다.

순화 배지를 37℃에서 해동하고 모아서 FXI 변이체에 대해 기본적으로 기재되어 있는 바대로 항-HPC4 세파로오스를 사용하여 정제한다. 이와 다르게, 고정화 금속 친화성 크로마토그래피를 이용하여 His-표지된 uPA 변이체를 정제한다. 정제한 단백질을 -80℃에서 보관하고 단백질 순도는 환원 조건에서 프리-캐스트 4-12% 구배 겔(Invitrogen)을 사용하는 SDS-PAGE에 의해 평가하고 Coomassie Brilliant Blue R-250으로 염색한다. uPA 변이체를 인간 플라스민에 의해 활성화하고 벤즈아미딘-세파로오스를 이용하여 정제한다.

트립신의 발현 및 정제: 인간 트립시노겐-1 변이체 A(His-96과 Asp-107 사이에 서열번호 9의 아미노산 서열을 가진 트립신(서열번호 3))과 B(His-96과 Asp-107 사이에 서열번호 10의 아미노산 서열을 가진 트립신(서열번호 3)) 및 트립신-유사 효소 절단 부위가 없도록 리더 서열이 변형되고(특허 EP 1141263 A1 참조) C-말단을 통해 HPC4-항체 인식 서열(아미노산 서열 EDQVDPRLIDGK) 또는 His-표지(6His: HHHHHH 또는 12His: HHHHHHHHHHHHH)에 접합되어 정제가 용이한 야생형 트립신(서열번호 3)을 코딩하는 플라스미드(pcDNA3.1(+))를 선택 가능한 마커 플라스미드로서 LipofectAMINE 2000(Invitrogen)과 pSV2neo을 사용하여 HEK 293 세포에 도입한다. 인간 트립시노겐-특이적 ELISA(MyBioSource)를 토대로 고발현 클론을 선택한다. 선택한 클론을 3중 플라스크(Nalge-Nunc, 네이퍼빌, IL)로 확장시키고 5 ㎍/ml ITS와 1.0 mg/ml Albumax(Invitrogen)가 부가된 둘베코 변형 이글 배지/F-12 배지에서 배양한다. 순화 배지를 5-6일 동안 수거하여 원심분리하고 1 mM 벤즈아미딘의 존재하 -20℃에서 보관한다.

순화 배지를 37℃에서 해동하고 모아서 FXI 변이체에 대해 기본적으로 기재되어 있는 바대로 항-HPC4 세파로오스를 사용하여 정제한다. 이와 다르게, 고정화 금속 친화성 크로마토그래피를 이용하여 His-표지된 트립시노겐 변이체를 정제한다. 정제한 단백질을 -80℃에서 보관하고 단백질 순도는 환원 조건에서 프리-캐스트 4-12% 구배 겔(Invitrogen)을 사용하는 SDS-PAGE에 의해 평가하고 Coomassie Brilliant Blue R-250으로 염색한다. 트립신-1 변이체를 트립시노겐-1 변이체의 엔테로키나아제-의존성 절단으로부터 제조하고 SP- 또는 벤즈이미딘-세파로오스를 사용하여 정제한다.

실시예 2: 직접 세린 프로테아제 저해제에 의한 세린 프로테아제의 저해 . 먼저, 펩티딜 기질(트롬빈, FXIa, 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 또는 트립신에 대한 특이적 기질로서 각각 S-2388, S-2366, S-2444 또는 S-2222) 가수분해의 동역학을 위에서 언급한 트롬빈, FXIa, 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 또는 트립신 변이체와 야생형이 존재하는 상태에서 기질의 농도를 증가시켜(10-500 μM) 측정한다. 세린 프로테아제에 결합되어 저해하는 직접 세린 프로테아제 저해제의 능력은 직접 저해제의 농도를 증가시키고(1 nM-10 μM) 펩티딜 기질(Km 이상)과 효소의 농도는 고정시켜 펩티딜 기질 가수분해의 초기 속도를 측정함으로써 전형적인 경쟁적 저해를 전제로 하여 저해 상수(Ki)를 평가함으로써 시험한다. 모든 동역학 측정은 20 mM Hepes, 0.15 M NaCl, 0.1%(w/v) 폴리에틸렌글리콜 8000, 2 mM CaCl2, pH 7.5에서 수행한다.

실시예 3: 트롬빈 생성 분석. 앞서 기재한 프로토콜(Hemker et al., 2003. Pathophysiol Haemost Thromb 33: 4-15)에 맞춰 트롬빈을 생성한다. 요약하면, 트롬빈 생성 곡선은 프로트롬빈- 또는 FXI-결핍 혈장에 옥수수 트립신 저해제(70 ㎍/ml), PCPS(20 μM)와 기질 완충액(Fluca)을 부가하여 얻는다. 직접 세린 프로테아제 저해제와 미리 혼합한 1 Unit(특이적 응고 활성)의 트롬빈 A 또는 B 변이체, FXIa A 또는 B 변이체 및 야생형 트롬빈 또는 FXIa의 첨가에 의해 트롬빈 형성을 개시한다. 또 다른 장치에서는 단백질 변이체의 효소원(zymogen) 형태를 평가한다. 이와 같이 하기 위해서 프로트롬빈 또는 FXI가 고갈된 혈장에 조직 인자(TF(Innovin), 최종 2 또는 20 pM), 옥수수 트립신 저해제(70 ㎍/ml), PCPS(20 μM), 직접 저해제 및 1 Unit(특이적 응고 활성)의 재조합 프로트롬빈 또는 FXI 변이체 각각을 부가한다. 혈장에 Fluca를 첨가하여 트롬빈 형성을 개시한다. 30분간 20초마다 트롬빈 형성을 측정하고 Thrombinoscope 소프트웨어(Thrombinoscope BV)를 사용하여 캘리브레이터를 보정한다. 지체 시간, 평균 내인성 트롬빈 퍼텐셜(트롬빈 생성 곡선 아래의 면적), 피크 도달 시간 및 최대 트롬빈 생성을 적어도 3개의 개별 실험으로부터 계산한다.

실시예 4: 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자 변이체에 대한 응고 용해 시간 평가. 이전에 기재된 바와 같이(Mosnier et al., 2001. Thromb Haemost 86: 1035-1039) 기본적으로 혈전 용해 시간을 평가한다. 요약하면, 조직 인자(TF, Innovin)와 PCPS를 25 mM Hepes, 137 mM NaCl, 3.5 mM KCl, 0.1% BSA, pH 7.4에서 1시간 동안 37℃에서 배양한다. TF/PCPS 혼합물(최종 0.5 pM/20 μM)을 37℃에서 10분 동안 혈장(50% v/v), tPA(최종 150 U/ml)와 CTI(최종 70 ㎍/ml)와 함께 배양한다. 37℃에서 전배양한 Ca2+(최종 17 mM)로 응고를 개시한다. 혈전 형성과 후속 용해는 SpectraMax M2e 마이크로플레이트 판독기로 37℃에서 4시간 동안 405 nm에서의 흡광도를 측정하여 모니터링한다. 혈전 용해 시간은 투명 상태에서 탁한 상태로의 전이 시간의 평균 내지 탁한 상태에서 투명 상태로의 전이 시간의 평균으로 정의되는바, 이는 GraphPad Prism 5를 사용하여 탁도 그래프의 S자형 피팅에 의해 결정된다.

실시예 5: 서열번호 1의 영역 His450-Asp462에 삽입이 있는 재조합 프로트롬빈.

재료 및 방법

직접 트롬빈 저해제인 다비가트란은 Alsachim사(프랑스)에서 얻었다. 혈장 유래 인간 프로트롬빈, 혈장 유래 인간 트롬빈(알파-트롬빈, IIa), 혈장 유래 인간 인자 Xa, 혈장 유래 인간 인자 Va 및 트롬빈 저해제인 단실아르기닌 N-(3-에틸-1,5-펜탄디일)아미드(DAPA)는 Haematologic Technologies사로부터 입수하였다. 프로트롬빈이 고갈된 인간 혈장과 프로트롬빈 시간 응고 분석 시약인 STA-Neoplastine CI plus 10은 Diagnostica Stago사로부터 얻었다. 펩티딜 기질 S-2238은 Chromogenix®(Instrumentation Laboratory)로부터 얻었다. Roche사로부터 얻은 인슐린-트랜스페린-소듐 셀레나이트(ITS)를 제외한 모든 조직 배양 시약은 Life Technologies사로부터 얻었다. 일반적인 재조합 단백질 생산과 정제 기술은 Green and Sambrook, Molecular Cloning, 4^th edition, July 2012에 기재된 바와 같았다. 75%(w/w) 계란 L-포스파티딜콜린과 25%(W/W) 돼지 뇌 L-포스파티딜세린(Avanti Polar Lipids, Inc., 미국)으로 구성된 소형 단일막 인지질 소포(PCPS)는 이전에 기술한 바와 같이 제조하여 특성을 확인하였다(Higgins et al 1983, J Biol Chem 258: 6503-6508 (1983)).

야생형 프로트롬빈(서열번호 1)과 His-450과 Asp-462 사이에 (i) 서열번호 5(prothrombin ISO1, 슈도나자 텍스틸리스 동종형(isoform) 인자 X 내 상동 영역으로부터 유래), (ii) 서열번호 13(프로트롬빈 ISO2), (iii) 서열번호 14(프로트롬빈 NSC, 노테키스 스쿠타투스 뱀독 인자 X 내 상동 영역으로부터 유래), (iv) 서열번호 15(프로트롬빈 KL10, 인간 칼리크레인 10 내 상동 영역으로부터 유래) 또는 (v) 서열번호 16(프로트롬빈 ALB, 인간 알부민 유래)의 아미노산 서열을 가진 프로트롬빈 변이체를 코딩하는 플라스미드(pcDNA3.1(+))를 LipofectAMINE 2000®(Invitrogen)을 사용하여 HEK 293 세포에 도입하였다. Orcutt et al., J Biol Chem, 279: 54927-54936(2004)에 기본적으로 기재되어 있는 바대로 프로트롬빈-특이적 ELISA와 프로트롬빈-시간 응고 분석을 토대로 고발현 클론을 선택하였다. 선택한 클론을 175 cm² 플라스크로 확장시키고 5 ㎍/ml ITS와 10 ㎍/ml Vitamin K가 부가된 둘베코 변형 이글 배지/F-12 배지에서 배양하였다. 순화 배지를 24시간 동안 수거하고 30 kDa 스핀-필터를 사용하여 HEPES-완충 식염수(pH 7.5)에 농축하여 -20℃에서 50% vol/vol 글리세롤에 보관하였다. 프로트롬빈 항원 농도는 프로트롬빈 검출용 항체쌍(paired antibody) ELISA(CL20111K, Cedarlane Laboratories)를 이용하여 측정하였다. 프로트롬빈 활성은 프로트롬빈-결핍 혈장에서 STA-Neoplastin CI plus 10 시약을 사용하고 표준으로서 기지 농도의 프로트롬빈을 사용하는 프로트롬빈-특이적 1-단계 프로트롬빈 시간 응고 분석을 이용하여 결정하였다. 비활성도(U/mg)는 프로트롬빈 항원 농도(mg/ml) 대비 프로트롬빈 활성도(U/ml)의 비로부터 유도하였다.

직접 트롬빈 저해제 다비가트란에 의한 트롬빈의 저해

혈장 유래 프로트롬빈(Haematologic Technologies) 또는 이전 단락에서 기재한 재조합 야생형 프로트롬빈 또는 재조합 프로트롬빈 변이체(ISO1, ISO2, NSC, KL10 및 ALB)(125 nM)를 주위 온도에서 5분 동안 10 μM DAPA의 존재하 프로트롬비나아제(1 nM 인자 Xa, 50 nM 인자 Va, 50 μM PCPS, 5 mM 칼슘)와 함께 배양함으로써 트롬빈으로 활성화시켰다. 이어서 시료를 EDTA(최종 50 mM)에서 ?칭하고, EDTA(50 mM), NaCl(150 mM), 0.1% PEG8000과 HEPES(20 mM) (pH 7.5)를 함유한 완충액 중에 5 nM(최종)으로 희석하였다. 활성화된 혈장 유래 프로트롬빈(pd-IIa) 또는 활성화된 재조합 프로트롬빈(r-IIa) 또는 활성화된 재조합 프로트롬빈 변이체에 결합하여 저해하는 직접 트롬빈 저해제인 다비가트란의 능력은 다비가트란의 농도를 증가시키고(20 nM-20 μM) S-2238의 농도는 고정시켜(100 μM) 펩티딜 기질 S-2238 가수분해의 초기 속도를 측정함으로써 50% 최대 저해 농도(IC50)를 평가하여 시험하였다. 펩티딜 기질에 대한 잔류 발색 활성을 A405 nm로 설정한 마이크로플레이트 판독기(SpectraMax M2e, Molecular Devices)로 10분 동안 측정하였다. IC50 농도는 Graphpad Prism 6 소프트웨어 세트를 사용하는 비선형 회귀법에 의해 S-2238 전환율(mOD/분)을 피팅하여 얻었다. 대조군으로서 혈장 유래 트롬빈(IIa, Haematologic Technologies)을 사용하여 동일한 실험을 수행하였다.

결과

이들 실험의 결과를 표 2 및 도 6과 7에 나타내었다. 이 모든 것으로부터 프로트롬빈의 청구된 아미노산 잔기 영역에 삽입하면 응고 가능성 또는 응고 효과를 여전히 가지면서 다비가트란과 같은 직접 트롬빈 저해제에 대한 탈감작(desensitization)이 제공됨을 알 수 있다.

프로트롬빈 변이체	특이적 활성 (×10 ^-3 U/mg)	발색 활성 (%)	다비가트란 저해율 (IC ₅₀ (μM))
IIa	n.d.	92	0.05
r-IIa	3.88 - 4.15	96	0.06
ISO1	0.41	39	2.02
ISO2	0.50	70	1.36
NSC	0.14	4	2.55
KL10	0.69	43	1.70
ALB	1.17	30	3.80

표 2는 서로 다른 프로트롬빈 변이체의 특성을 보여주고 있다. 혈장 유래 트롬빈은 IIa로 표기되어 있고 재조합 야생형 트롬빈은 r-IIa로 표기되어 있다. 비활성도(U/mg)는 프로트롬빈 항원 농도(mg/ml) 대비 프로트롬빈-특이적 1-단계 프로트롬빈 시간 응고 분석을 이용하여 결정된 프로트롬빈의 활성(U/ml) 비로부터 유도한다. 발색 활성의 백분율(%)은 정제된 혈장 유래 트롬빈의 표준 곡선과 관련된 프로트롬빈 변이체 각각의 S-2238 전환율을 나타낸다. 50% 최대 저해 농도(IC50)는 5 nM 트롬빈 변이체의 발색 활성의 50%를 저해하는데 필요한 다비가트란의 농도를 나타낸다.

실시예 6. 서열번호 1의 Ile-542 위치에 치환 또는 대체된 아미노산 잔기를 가진 재조합 프로트롬빈.

재료 및 방법

직접 트롬빈 저해제인 다비가트란은 Alsachim사(프랑스)로부터 얻었다. 혈장 유래 인간 프로트롬빈, 혈장 유래 인간 트롬빈(알파-트롬빈, IIa), 혈장 유래 인간 인자 Xa, 혈장 유래 인간 인자 Va와 트롬빈 저해제인 단실아르기닌 N-(3-에틸-1,5-펜탄디일)아미드(DAPA)는 Haematologic Technologies사로부터 입수하였다. 프로트롬빈이 고갈된 인간 혈장과 프로트롬빈 시간 응고 분석 시약인 STA-Neoplastine CI plus 10은 Diagnostica Stago사로부터 얻었다. 펩티딜 기질 S-2238은 Chromogenix®(Instrumentation Laboratory)로부터 얻었다. Roche사로부터 얻은 인슐린-트랜스페린-소듐 셀레나이트(ITS)를 제외한 모든 조직 배양 시약은 Life Technologies사로부터 얻었다. 일반적인 재조합 단백질 생산과 정제 기술은 Green and Sambrook, Molecular Cloning, 4^th edition, July 2012에 기재된 바와 같았다. 75%(w/w) 계란 L-포스파티딜콜린과 25%(W/W) 돼지 뇌 L-포스파티딜세린(Avanti Polar Lipids, Inc., 미국)으로 구성된 소형 단일막 인지질 소포(PCPS)는 이전에 기술한 바와 같이 제조하여 특성을 확인하였다(Higgins et al 1983, J Biol Chem 258: 6503-6508 (1983)).

야생형 프로트롬빈(서열번호 1) 및 서열번호 1의 아미노산 잔기 542번 위치의 이소류신이 알라닌(I542A, 측쇄 없음), 세린(I542S, 작은 측쇄), 페닐알라닌(I542F, 부피가 큰 측쇄) 또는 글루탐산(I542E, 전하를 띤 측쇄)에 의해 치환된 프로트롬빈 변이체를 코딩하는 플라스미드(pcDNA3.1(+))를 LipofectAMINE 2000®(Invitrogen)을 사용하여 HEK 293 세포에 도입하였다. Orcutt et al., J Biol Chem, 279: 54927-54936(2004)에 기본적으로 기재되어 있는 바대로 프로트롬빈-특이적 ELISA와 프로트롬빈-시간 응고 분석을 토대로 고발현 클론을 선택하였다. 선택한 클론을 175 cm² 플라스크로 확장시키고 5 ㎍/ml ITS와 10 ㎍/ml Vitamin K가 부가된 둘베코 변형 이글 배지/F-12 배지에서 배양하였다. 순화 배지를 24시간 동안 수거하고, 30 kDa 스핀-필터를 사용하여 HEPES-완충 식염수(pH 7.5)에 농축하여 -20℃에서 50% vol/vol 글리세롤에 보관하였다. 프로트롬빈 항원 농도는 프로트롬빈 검출용 항체쌍 ELISA(CL20111K, Cedarlane Laboratories)를 이용하여 측정하였다. 프로트롬빈 활성은 프로트롬빈-결핍 혈장에서 STA-Neoplastin CI plus 10 시약을 사용하고 표준으로서 기지 농도의 프로트롬빈을 사용하는 프로트롬빈-특이적 1-단계 프로트롬빈 시간 응고 분석을 이용하여 결정하였다. 비활성도(U/mg)는 프로트롬빈 항원 농도(mg/ml) 대비 프로트롬빈 활성도(U/ml)의 비로부터 유도하였다.

직접 트롬빈 저해제 다비가트란에 의한 트롬빈의 저해

재조합 야생형 프로트롬빈 또는 재조합 프로트롬빈 변이체(I542S, I542A, I542F 및 I542E)(125 nM)를 주위 온도에서 5분 동안 10 μM DAPA의 존재하 프로트롬비나아제(1 nM 인자 Xa, 50 nM 인자 Va, 50 μM PCPS, 5 mM 칼슘)와 함께 배양함으로써 트롬빈으로 활성화하였다. 이어서 시료를 EDTA(최종 50 mM)에서 ?칭하고, EDTA(50 mM), NaCl(150 mM), 0.1% PEG8000과 HEPES(20 mM) (pH 7.5)를 함유한 완충액 중에 5 nM(최종)으로 희석하였다. 활성화된 재조합 프로트롬빈(r-IIa) 또는 활성화된 재조합 프로트롬빈 변이체에 결합하여 저해하는 직접 트롬빈 저해제인 다비가트란의 능력은 직접 저해제의 농도를 증가시키고(20 nM-20 μM) S-2238의 농도는 고정시켜(100 μM) 펩티딜 기질 S-2238 가수분해의 초기 속도를 측정함으로써 50% 최대 저해 농도(IC50)를 평가하여 시험하였다. 펩티딜 기질에 대한 잔류 발색 활성을 A405 nm로 설정한 마이크로플레이트 판독기(SpectraMax M2e, Molecular Devices)로 10분 동안 측정하였다. IC50 농도는 Graphpad Prism 6 소프트웨어 세트를 사용하는 비선형 회귀법에 의해 S-2238 전환율(mOD/분)을 피팅하여 얻었다. 대조군으로서 혈장 유래 트롬빈(IIa, Haematologic Technologies)을 사용하여 동일한 실험을 수행하였다.

결과

이들 실험의 결과를 표 3 및 도 9와 10에 나타내었다. 이 모든 것으로부터 서열번호 1의 아미노산 잔기 위치 Ile-542에서 치환, 대체, 또는 돌연변이는 응고 가능성 또는 응고 효과를 여전히 가지면서 다비가트란과 같은 직접 트롬빈 저해제에 대한 탈감작을 제공함을 알 수 있다.

프로트롬빈 변이체	특이적 활성 (×10 ^-3 U/mg)	발색 활성 (%)	다비가트란 저해율 (IC ₅₀ (μM))
IIa	n.d.	92	0.05
r-IIa	3.88 - 4.15	96	0.06
I542S	0.30	183	0.73
I542A	0.40	127	0.79
I542F	0.74	156	0.90
I542E	0.24	119	1.32

표 3은 프로트롬빈 변이체의 특성을 보여주고 있다. 혈장 유래 트롬빈은 IIa로 표기되어 있고 재조합 야생형 트롬빈은 r-IIa로 표기되어 있다. 비활성도(U/mg)는 프로트롬빈 항원 농도(mg/ml) 대비 프로트롬빈-특이적 1-단계 프로트롬빈 시간 응고 분석을 이용하여 결정된 프로트롬빈의 활성(U/ml) 비로부터 유도한다. 발색 활성의 백분율(%)은 정제된 혈장 유래 트롬빈의 표준 곡선과 관련된 프로트롬빈 변이체 각각의 S-2238 전환율을 나타낸다. 50% 최대 저해 농도(IC50)는 5 nM 트롬빈 변이체의 발색 활성의 50%를 저해하는데 필요한 다비가트란의 농도를 나타낸다.

<110> Academisch Ziekenhuis Leiden <120> Recombinant serine proteases <130> P109970PC00 <140> PCT/NL2016/050833 <141> 2016-11-25 <150> EP 15196291.7 <151> 2015-11-25 <160> 40 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 622 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala His Val Arg Gly Leu Gln Leu Pro Gly Cys Leu Ala Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Cys Ser Leu Val His Ser Gln His Val Phe Leu Ala Pro Gln 20 25 30 Gln Ala Arg Ser Leu Leu Gln Arg Val Arg Arg Ala Asn Thr Phe Leu 35 40 45 Glu Glu Val Arg Lys Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys Val Glu Glu Thr 50 55 60 Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Phe Glu Ala Leu Glu Ser Ser Thr Ala Thr 65 70 75 80 Asp Val Phe Trp Ala Lys Tyr Thr Ala Cys Glu Thr Ala Arg Thr Pro 85 90 95 Arg Asp Lys Leu Ala Ala Cys Leu Glu Gly Asn Cys Ala Glu Gly Leu 100 105 110 Gly Thr Asn Tyr Arg Gly His Val Asn Ile Thr Arg Ser Gly Ile Glu 115 120 125 Cys Gln Leu Trp Arg Ser Arg Tyr Pro His Lys Pro Glu Ile Asn Ser 130 135 140 Thr Thr His Pro Gly Ala Asp Leu Gln Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro 145 150 155 160 Asp Ser Ser Thr Thr Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Thr Val 165 170 175 Arg Arg Gln Glu Cys Ser Ile Pro Val Cys Gly Gln Asp Gln Val Thr 180 185 190 Val Ala Met Thr Pro Arg Ser Glu Gly Ser Ser Val Asn Leu Ser Pro 195 200 205 Pro Leu Glu Gln Cys Val Pro Asp Arg Gly Gln Gln Tyr Gln Gly Arg 210 215 220 Leu Ala Val Thr Thr His Gly Leu Pro Cys Leu Ala Trp Ala Ser Ala 225 230 235 240 Gln Ala Lys Ala Leu Ser Lys His Gln Asp Phe Asn Ser Ala Val Gln 245 250 255 Leu Val Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Glu Glu Gly Val 260 265 270 Trp Cys Tyr Val Ala Gly Lys Pro Gly Asp Phe Gly Tyr Cys Asp Leu 275 280 285 Asn Tyr Cys Glu Glu Ala Val Glu Glu Glu Thr Gly Asp Gly Leu Asp 290 295 300 Glu Asp Ser Asp Arg Ala Ile Glu Gly Arg Thr Ala Thr Ser Glu Tyr 305 310 315 320 Gln Thr Phe Phe Asn Pro Arg Thr Phe Gly Ser Gly Glu Ala Asp Cys 325 330 335 Gly Leu Arg Pro Leu Phe Glu Lys Lys Ser Leu Glu Asp Lys Thr Glu 340 345 350 Arg Glu Leu Leu Glu Ser Tyr Ile Asp Gly Arg Ile Val Glu Gly Ser 355 360 365 Asp Ala Glu Ile Gly Met Ser Pro Trp Gln Val Met Leu Phe Arg Lys 370 375 380 Ser Pro Gln Glu Leu Leu Cys Gly Ala Ser Leu Ile Ser Asp Arg Trp 385 390 395 400 Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Leu Tyr Pro Pro Trp Asp Lys Asn 405 410 415 Phe Thr Glu Asn Asp Leu Leu Val Arg Ile Gly Lys His Ser Arg Thr 420 425 430 Arg Tyr Glu Arg Asn Ile Glu Lys Ile Ser Met Leu Glu Lys Ile Tyr 435 440 445 Ile His Pro Arg Tyr Asn Trp Arg Glu Asn Leu Asp Arg Asp Ile Ala 450 455 460 Leu Met Lys Leu Lys Lys Pro Val Ala Phe Ser Asp Tyr Ile His Pro 465 470 475 480 Val Cys Leu Pro Asp Arg Glu Thr Ala Ala Ser Leu Leu Gln Ala Gly 485 490 495 Tyr Lys Gly Arg Val Thr Gly Trp Gly Asn Leu Lys Glu Thr Trp Thr 500 505 510 Ala Asn Val Gly Lys Gly Gln Pro Ser Val Leu Gln Val Val Asn Leu 515 520 525 Pro Ile Val Glu Arg Pro Val Cys Lys Asp Ser Thr Arg Ile Arg Ile 530 535 540 Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg 545 550 555 560 Gly Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val Met Lys Ser 565 570 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ALB variant <400> 36 His Pro Arg Tyr Asp Ser Ile Ser Ser Lys Tyr Leu Lys Glu Leu Leu 1 5 10 15 Glu Lys Pro Leu Asp Arg Asp 20 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Cys Lys Asp Ser Thr Arg Ile Arg Ile Thr Asp Asn Met Phe Cys 1 5 10 15 <210> 38 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Cys Gln Lys Arg Tyr Arg Gly His Lys Ile Thr His Lys Met Ile Cys 1 5 10 15 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Cys Glu Ala Ser Tyr Pro Gly Lys Ile Thr Asn Asn Met Phe Cys 1 5 10 15 <210> 40 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu Val Thr Thr Lys Met Leu 1 5 10 15 Cys

Claims

외부-표면 펩티드 구조에 삽입된 적어도 하나의 아미노산 잔기를 포함하는 세린 프로테아제를 포함하는 재조합 단백질로서; 상기 세린 프로테아제 폴리펩티드가 응고 인자 X 폴리펩티드 또는 그의 자연 처리 또는 활성화된 형태가 아닌 재조합 단백질.
제1항에 있어서, 상기 펩티드 구조가 서열번호 1의 His-450과 Asp-462 사이 아미노산 잔기의 영역에 상응하는 아미노산 잔기의 영역인 단백질.
제1항에 있어서, 상기 세린 프로테아제가 트롬빈, 응고 인자 XIa, 트립신과 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자로부터 선택되고; 상기 펩티드 구조가:
트롬빈의 서열번호 1의 Gly-427과 Asp-462 사이, 바람직하게는 His-450과 Asp-462 사이, 보다 바람직하게는 His-450과 Leu-459 사이 아미노산 잔기의 영역;
응고 인자 XIa의 서열번호 2의 Val-463과 Asp-480 사이, 바람직하게는 His-469와 Asp-480 또는 Ser-477 사이 아미노산 잔기의 영역;
트립신의 서열번호 3의 Leu-73과 Asp-107 사이, 바람직하게는 His-96과 Asp-107 또는 Leu-104 사이 아미노산 잔기의 영역;
유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자의 서열번호 4의 Val-237과 Asp-275 사이, 바람직하게는 His-262와 Asp-275 또는 Asn-274 사이 아미노산 잔기의 영역인 단백질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 삽입이 1-50개, 바람직하게는 1-20개의 아미노산 잔기를 포함하는 단백질.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 삽입이 4 내지 50개, 바람직하게는 4 내지 20개의 아미노산 잔기를 포함하는 단백질.
제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 아미노산 잔기의 삽입이 상기 영역 내 적어도 5개의 아미노산 잔기의 치환과 조합되는 단백질.
제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 영역이 삽입 및/또는 치환 후
서열번호 1의 His-450과 Asp-462 사이에 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 또는 서열번호 16;
서열번호 2의 His-469와 Asp-480 사이에 서열번호 7 또는 서열번호 8;
서열번호 3의 His-96과 Asp-107 사이에 서열번호 9 또는 서열번호 10;
및/또는 서열번호 4의 His-262와 Asp-275 사이에 서열번호 11 또는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 단백질.
서열번호 1의 Ile-542에 상응하는 아미노산 잔기 위치에 치환된 아미노산 잔기를 갖는 세린 프로테아제 폴리펩티드를 포함하는 재조합 단백질로서, 상기 세린 프로테아제 폴리펩티드가 응고 인자 X 폴리펩티드 또는 그의 자연 처리 또는 활성화된 형태가 아닌 재조합 단백질.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 핵산 분자.
제9항에 따른 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
제9항에 따른 핵산 분자 또는 제10항에 따른 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 단백질과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 단백질, 또는 제12항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 약제학적 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 대상에서 응고 저해제의 항응고 효과를 길항하는 방법에 사용하기 위해 트롬빈 또는 응고 인자 XIa를 포함하는 단백질, 또는 제12항에 있어서, 상기 단백질이 대상에서 응고 저해제의 항응고 효과를 길항하는 방법에 사용하기 위해 트롬빈 또는 응고 인자 XIa를 포함하는 약제학적 조성물.
대상에서 응고 저해제의 항응고 효과를 길항하는 방법으로서, 대상에 트롬빈 또는 응고 인자 XIa를 포함하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 단백질 또는
트롬빈 또는 응고 인자 XIa를 포함하는 제12항에 따른 약제학적 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법.
대상에서 응고 저해제의 항응고 효과를 길항하기 위한 약제를 제조하기 위한 트롬빈 또는 응고 인자 XIa를 포함하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 단백질의 용도.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 대상에서 트립신 저해제의 펩티드 결합 가수분해의 저해를 길항하는 방법에 사용하기 위해 트립신을 포함하는 단백질, 또는 제12항에 있어서, 대상에서 트립신 저해제의 펩티드 결합 가수분해의 저해를 길항하는 방법에 사용하기 위해 트립신을 포함하는 약제학적 조성물.
대상에서 트립신 저해제의 펩티드 결합 가수분해의 저해를 길항하는 방법으로서, 상기 대상에 트립신을 포함하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 단백질 또는 트립신을 포함하는 단백질을 포함하는 제12항에 따른 약제학적 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법.
대상에서 트립신 저해제의 펩티드 결합 가수분해의 저해를 길항하기 위한 약제를 제조하기 위한 트립신을 포함하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 단백질의 용도.
트립신 저해제의 펩티드 결합 가수분해의 저해를 길항하는데 있어서 트립신을 포함하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 단백질의 비-치료 용도.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 대상에서 항섬유소 용해 효과를 완전히 또는 부분적으로 길항하는데 사용하기 위해 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자를 포함하는 단백질, 또는 제12항에 있어서, 상기 단백질이 대상에서 항섬유소 용해 효과를 완전히 또는 부분적으로 길항하는데 사용하기 위해 유로키나아제형 플라스미노겐 활성화 인자를 포함하는 약제학적 조성물.