CN108463553A - 重组丝氨酸蛋白酶 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包括丝氨酸蛋白酶多肽的重组蛋白，该丝氨酸蛋白酶多肽在丝氨酸蛋白酶抑制剂的存在下具有丝氨酸蛋白酶活性，并且能够例如在用丝氨酸蛋白酶抑制剂治疗的受试者中完全或部分逆转丝氨酸蛋白酶抑制剂的作用。更具体地，本文描述了用于完全或部分逆转凝血抑制剂的抗凝血作用的重组蛋白和方法。
Description
技术领域
本发明在用于医疗目的的制剂领域内。更具体地，本发明涉及特定的重组丝氨酸蛋白酶，其在丝氨酸蛋白酶抑制剂的存在下具有丝氨酸蛋白酶活性。
背景技术
目前正在开发不断增加数量的丝氨酸蛋白酶抑制剂，其防止或抑制丝氨酸蛋白酶进行其蛋白酶活性。丝氨酸蛋白酶(或丝氨酸肽链内切酶)是切割蛋白中的肽键的酶，其中丝氨酸在蛋白酶活性位点处充当亲核性氨基酸(Hedstrom，2002.Chem Rev 102：4501-4524)。在人体中，丝氨酸蛋白酶负责协调各种生理过程，包括消化、免疫应答、凝血和生殖(Hedstrom，2002.Chem Rev 102：4501-4524)。一些众所周知的丝氨酸蛋白酶包括凝血酶、凝血因子XIa、尿激酶类纤溶酶原激活物和胰蛋白酶，前两种参与凝血。
丝氨酸蛋白酶可被不同种类的抑制剂抑制，包括合成化学抑制剂和天然蛋白抑制剂。称作“serpins”(丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor)的缩写)的一族天然抑制剂可与丝氨酸蛋白酶形成共价键，从而抑制其功能。研究最多的丝氨酸蛋白酶抑制剂中的一些是抗凝血酶和α1-抗胰蛋白酶，由于其分别在凝血和肺气肿中的作用而为人所知。
正在开发诸如直接凝血酶抑制剂(DTI)的直接丝氨酸蛋白酶抑制剂，并且由于其疗效迅速、易于给药并且不需要监控，因此预期其在不久的将来会大规模替换诸如抗凝血酶的经典口服抗凝血剂(He等人，2015.Molecules 20，11046-11062；Wang等人，2015.ArchPharm 348：595-605)。这些抑制剂靶向丝氨酸蛋白酶的活性位点，并且通常是适合口服给药的小分子。单价DTI除了别的以外还包括阿加曲班、美拉加群或其前药、希美加群或其前药、达比加群或其前药、达比加群酯(Dabigatran Etexilate)或其类似物、肽或拟肽(peptidomimetic)抑制剂(Mehta等人，2014.Expert Opin Ther Pat 24：47-67)、RWJ-671818或其类似物(Lu等人，2010.J Med Chem 53：1843-1856)、3-(2-苯乙基氨基)-6-甲基-1-(2-氨基-6-甲基-5-亚甲基酰胺基甲基吡啶基)吡嗪酮或其类似物、(Sanderson等人，1998.J Med Chem 41：4466-4474)、(E)-N-(3-((1-(苯并[b]噻吩-2-基甲基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)苯基)-2-(3-氯苯基)乙烯磺酰胺或其类似物(Siles等人，2011.BioorgMed Chem Lett 21：5305-5309)、N-{3-[(3-氟苄基)氧基]苯基}-1-吡啶-4-基哌啶-4-甲酰胺或其类似物(de Candia等人，2013.J Med Chem 56：8696-8711)、以及Merck的化合物2或其类似物(Morrissette等人，2004.Bioorg Med Chem Lett 14：4161-4164)。单价DTI已经被专门设计为与凝血酶的活性位点紧密结合并停止其蛋白酶活性。
凝血因子XIa的单价直接抑制剂也已经找到，并且除了别的以外还包括4,5,6-三取代的嘧啶衍生物(美国专利US8609676 B2)、BMS-262084(Schumacher等人，2007.Eur JPharmacol 570：167-174)、Bristol-Meyers Squibb的化合物1或其类似物(Quan等人，JMed Chem 2014.57：955-969)、Bristol-Meyers Squibb的化合物2和33或其类似物(Pinto等人，2015.Bioorg Med Chem Lett 25：1635-1642)、AstraZeneca的化合物13或其类似物(Fjellstrom等人，2015.PLoS One 10：e0113705)、芳基硼酸(Lazarova等人，2006.BioorgMed Chem Lett 16：5022-5027)、以及大环吲哚(Hanessian等人，2010.Bioorg Med ChemLett 20：6925-6928)。
尿激酶类纤溶酶原激活物(激活子，activator)的单价抑制剂除了别的以外还包括WX-UK1或其前药Upamostat，还称作Mesupron，或WX-671或其类似物，以及APC-10302或其类似物(Katz等人，2001.Chem Biol 8：1107-1121)。有趣的是，已经发现直接凝血酶抑制剂美拉加群和直接尿激酶类纤溶酶原激活物抑制剂APC-10302也能够与胰蛋白酶的活性位点结合并抑制其丝氨酸蛋白酶活性(Dullweber等人2001.J Mol Biol 313：593-614；Katz等人，2001.Chem Biol 8：1107-1121。
使用丝氨酸蛋白酶抑制剂的一个缺点是，有效恢复正常的丝氨酸蛋白酶活性通常需要完全替换丝氨酸蛋白酶，或者从受试者有效除去抑制剂。这是一个劣势，由于在抑制之后诱导丝氨酸蛋白酶的活性在临床环境中和非临床环境中均优选应该是可立即且直接实现的，而不是随着时间逐渐实现。例如，在抗凝血剂疗法的情况下，总体上缺乏具体的逆转策略在施用抑制剂(例如凝血酶的抑制剂)之后可导致潜在的危及生命的出血并发症。后者以以下事实为例：仅仅在荷兰，每年超过5,000例接受抗凝血剂治疗的患者受害于严重的有害的出血事件，包括超过800例死亡(Adriaansen H.等人：“Samenvatting MedischeJaarverslagen van de Federatie van Nederlandse Trombosediensten”，2014；1-38)。
目前，直接和立即预防和停止丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制作用的逆转策略仍未找到。
发明内容
本发明通过提供包括选自包括凝血酶、凝血因子XIa、尿激酶类纤溶酶原激活物和胰蛋白酶的组的丝氨酸蛋白酶多肽的重组蛋白作为防止和停止丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制作用的适当逆转策略来解决这一问题，所述多肽在外表面肽结构中包括至少一个氨基酸残基的插入，其中所述肽结构为：SEQ ID NO:1的Gly-427与Asp-462之间、优选His-450与Asp-462之间、更优选His-450与Leu-459之间的氨基酸残基区域；SEQ ID NO:2的Val-463与Asp-480之间、优选His-469与Asp-480或Ser-477之间的氨基酸残基区域；SEQ ID NO:3的Leu-73与Asp-107之间、优选His-76与Asp-107之间、更优选Gln-87与Asp-107之间、最优选His-96与Leu-104或Asp-107之间的氨基酸残基区域；SEQ ID NO:4的Val-237与Asp-275之间、优选Phe-254或Val-256与Asp-275或Asn-274之间、更优选His-262与Asp-275、Asn-274或Ala-271之间的氨基酸残基区域。
优选地，丝氨酸蛋白酶多肽选自由凝血酶、凝血因子XIa、胰蛋白酶和尿激酶类纤溶酶原激活物组成的组，优先选自由人凝血酶、人凝血因子XIa、人胰蛋白酶和人尿激酶类纤溶酶原激活物组成的组。应注意，SEQ ID NO:1示出了人凝血酶原的氨基酸序列，SEQ IDNO:2示出了人凝血因子XI的氨基酸序列，SEQ ID NO:3示出了人胰蛋白酶-1的氨基酸序列，SEQ ID NO:4示出了人尿激酶类纤溶酶原激活物的氨基酸序列。
已经发现，具有改变的氨基酸组成，优选在凝血酶的SEQ ID NO:1的Gly-427与Asp-462之间的区域中、在凝血因子XIa的SEQ ID NO:2的Val-463与Asp-480或Ser-477之间的区域中、在胰蛋白酶的SEQ ID NO:3的Leu-73与Asp-107之间的区域中或在尿激酶类纤溶酶原激活物的SEQ ID NO:4的Val-237与Asp-275之间的区域中具有至少一个氨基酸的插入的选自由凝血酶、凝血因子XIa、胰蛋白酶和尿激酶类纤溶酶原激活物形成的组的丝氨酸蛋白酶多肽在丝氨酸蛋白酶抑制剂的存在下具有催化活性。这是令人惊讶的，由于可获得的与其抑制剂组成的复合物中的丝氨酸蛋白酶的晶体结构表明，外表面肽结构中的氨基酸残基并不接触抑制剂(参见(例如)图2-图4)。
另外，外表面肽结构中的氨基酸残基似乎会形成柔性环(loop)结构，它的组成(即氨基酸残基的身份(种类，identity))和氨基酸残基数量在凝血酶、人凝血因子XIa、人胰蛋白酶和人尿激酶类纤溶酶原激活物之间均是不保守的。通过插入至少一个氨基酸残基对该环的改变被认为不会改变抑制剂与丝氨酸蛋白酶的结合和/或结合抑制剂之后丝氨酸蛋白酶的活性。
另外，凝血酶、人凝血因子XIa、人胰蛋白酶和尿激酶类纤溶酶原激活物的已知抑制剂是在结构上不相关的化合物。这进一步使得不可能通过经验推测在凝血酶、凝血因子Xia、胰蛋白酶或尿激酶类纤溶酶原激活物丝氨酸蛋白酶的外表面肽结构中插入至少一个氨基酸残基产生对抑制剂的抑制具有降低的敏感性的丝氨酸蛋白酶。
与不具有所述改变的氨基酸组成的丝氨酸蛋白酶相比，重组丝氨酸蛋白酶对丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制具有降低的敏感性。因此，本发明提供丝氨酸蛋白酶抑制剂的解毒剂，其不依赖于游离的内源性丝氨酸蛋白酶的产生，并提供快速且直接的预防和停止丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制作用的逆转策略。
如本文所使用，术语“丝氨酸蛋白酶”是指通过水解肽键降解蛋白的酶，并且其主要特征在于在活性位点具有活性丝氨酸残基。丝氨酸蛋白酶通常还称作丝氨酸肽链内切酶。优选地，术语“丝氨酸蛋白酶”是指具有催化三联体氨基酸残基组氨酸、天门冬氨酸和丝氨酸(其通过示例的方式在SEQ ID NO:1中表示为His-406、Asp-462和Ser-568)的空间分布的酶。技术人员可容易地评估并找到丝氨酸肽链内切酶中的催化三联体氨基酸残基。该术语包括包括在(EC)3.4.21类酶中的丝氨酸肽链内切酶，例如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶、凝血因子VIIa、凝血因子IXa、凝血因子XIa、弹性蛋白酶、粒酶A、粒酶B、激肽释放酶8，以及这些丝氨酸蛋白酶的前体，例如非活性的前原-前体(prepro-precursors)和前-前体(pro-precursors)。丝氨酸蛋白酶多肽优选为凝血酶、凝血因子XIa、胰蛋白酶或尿激酶类纤溶酶原激活物多肽，优先选自由凝血酶、凝血因子XIa、胰蛋白酶或尿激酶类纤溶酶原激活物多肽组成的组。确定一种蛋白是否为丝氨酸蛋白酶的方法在本领域中是已知的，并且包括序列对比和使用例如Sigma-Aldrich的蛋白酶检测试剂盒。
人凝血酶原的氨基酸序列在SEQ ID NO:1中示出，并且可以在中在登录号(登记号，accession number)AAC63054.1下找到。具有SEQ ID NO:1中所列序列的凝血酶原是含有前原-前导序列(SEQ ID NO:1的氨基酸残基1到43)、随后的对应于活化肽片段1(氨基酸残基44-198)和随后的活化肽片段2(氨基酸残基199-327)的序列、随后的凝血酶轻链(氨基酸残基328-363)和凝血酶重链(氨基酸残基364-622)的前体。如本文所使用，术语“凝血酶原”是指非活性的凝血酶原前体蛋白。如本文所使用，术语“凝血酶”是指具有凝血酶轻链和重链的凝血酶原的催化活性形式。根据本文所使用的定义，凝血酶原包括凝血酶多肽。
在本发明的情况中，如果一种蛋白是前凝血剂丝氨酸蛋白酶，优选是可切割纤维蛋白原中的Arg-|-Gly键以形成纤维蛋白并释放纤维蛋白肽A和B的前凝血剂丝氨酸蛋白酶，那么它就是凝血酶原或凝血酶多肽。凝血酶还称作纤维蛋白原酶，优选包括对应于不同物种(种类，species)的凝血酶原或凝血酶多肽之间保守的氨基酸残基链段的氨基酸残基链段。例如，包括以下多肽的前凝血剂丝氨酸蛋白酶被认为是凝血酶原或凝血酶多肽，所述多肽含有对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基Arg-338到Glu-343、Pro-376到Leu-381、Ser-385到Leu-395、Arg-461到Leu-465、Lys-498到Leu-507、Lys-559到Lys-575和Gly-586到Arg-596的氨基酸残基链段。术语“凝血酶原”或“凝血酶”包括EC 3.4.21.5中提及的丝氨酸蛋白酶。
技术人员可例如通过对适合该目的的诸如以下的底物进行测试蛋白水解切割来确定一种丝氨酸蛋白酶实际上是否为凝血酶：(i)Chromogenix的S-2238TM底物(Instrumentation Laboratory(Bedford，MA，USA)的品牌，化学式为Bz-IIe-Glu(γ-OR)-Gly-Arg-pNA·HCl(R＝H(50％)且R＝CH3(50％)；分子量：741.3；料号：82 0316 39)，用于凝血酶，同时按照制造商的说明；和/或(ii)TH系列显色底物(DSMNutritional Products，CH)，化学式为：Tos-Gly-Pro-Arg-pNA·AcOH、H-D-CHG-Ala-Arg-pNA·2AcOH、H-D-CHG-But-Arg-pNA·2AcOH、H-D-CHG-Pro-Arg-pNA·2AcOH、H-D-CHA-Ala-Arg-pNA2AcOH、H-D-CHA-Gly-Arg-pNA·2AcOH、CH3OCO-Gly-Pro-Arg-pNA·AcOH和/或H-beta-Ala-Gly-Arg-pNA·2AcOH。
人凝血因子XI的氨基酸序列在SEQ ID NO:2中示出，并且可以在中在登录号AAA51985.1下找到。具有SEQ ID NO:2中示出的序列的凝血因子XI是含有信号肽(氨基酸残基1-18)、凝血因子XIa重链(氨基酸残基19-387)和凝血因子XIa轻链(氨基酸残基388-625)的前体蛋白。如本文所使用的术语“凝血因子XI”是指非活性的凝血因子XI前体蛋白。如本文所使用，术语“凝血因子XIa”是指凝血因子XI的催化活性形式，其具有凝血因子XIa重链和凝血因子XIa轻链。根据本文所使用的定义，凝血因子XI包括凝血因子XIa多肽。
在本发明的情况中，如果一种蛋白是选择性切割因子IX中的Arg-|-Ala键和Arg-|-Val键以形成因子IXa的前凝血剂，那么它就被视为凝血因子XI或凝血因子XIa多肽。所述蛋白的全长氨基酸序列优选包括对应于不同物种的凝血因子XI多肽或凝血因子XIa多肽之间保守的氨基酸残基链段的氨基酸残基链段。例如，包括含有对应于SEQ ID NO:2的氨基酸残基Asp-480到Ala-482、Cys-560到Gly-562、以及Gly-573到Leu-579的氨基酸残基链段的多肽的前凝血剂丝氨酸蛋白酶被认为是凝血因子XI或凝血因子XIa多肽。术语“凝血因子XI”或“凝血因子XIa”包括EC 3.4.21.27中提及的丝氨酸蛋白酶。技术人员可例如通过对适合该目的的诸如以下的底物进行测试蛋白水解切割来确认一种丝氨酸蛋白酶是凝血因子XI还是凝血因子XIa多肽：(i)Chromogenix的S-2366TM底物(Instrumentation Laboratory(Bedford，MA，USA)的品牌，化学式为pyroGlu-Pro-Arg-pNA·HCl(分子量为539.0；料号(Part Number)为82 109039)，同时按照制造商的说明；和/或(ii)FXIa显色底物(DSM Nutritional Products，CH)，化学式为Z-Aad-Pro-Arg-pNA AcOH)。
人胰蛋白酶-1的氨基酸序列在SEQ ID NO:3中示出，并且可以在中在“NP_002760.1”下找到。具有SEQ ID NO:3中示出的序列的胰蛋白酶-1是具有信号肽(氨基酸残基1-15)、活化肽(氨基酸残基16-23)、α-胰蛋白酶链1(氨基酸残基24-122)和α-胰蛋白酶链2(氨基酸残基123-247)的前体蛋白。双链形式通过在SEQ ID NO:3的残基Arg-122之后进行蛋白水解切割产生。应注意，α-胰蛋白酶链可作为一种催化活性的肽链(氨基酸残基24-247)存在。通常已知的是，胰蛋白酶是丝氨酸蛋白酶的原型。如本文所使用，术语“胰蛋白酶”是指非活性的胰蛋白酶前体蛋白，催化活性的单链形式和催化活性的双链形式具有分离的α-胰蛋白酶链1和α-胰蛋白酶链2。
在本发明的情况中，如果一种蛋白是优选切割Arg-|-Xaa、Lys-|-Xaa的丝氨酸蛋白酶，则它就被视为胰蛋白酶多肽。所述蛋白的全长氨基酸序列优选包括对应于不同物种的胰蛋白酶多肽之间保守的氨基酸残基链段的氨基酸残基链段。例如包括含有对应于SEQID NO:3的氨基酸残基Phe-47到Gly-50、Gly-191到Gln-197、Asp-199到Pro-203、以及Val-214到Gly-217的氨基酸残基链段的多肽的丝氨酸蛋白酶被认为是胰蛋白酶多肽。术语“胰蛋白酶”包括优选切割Arg-|-Xaa、Lys-|-Xaa的和/或EC 3.4.21.4中列出的丝氨酸蛋白酶。因此术语“胰蛋白酶”包括胰蛋白酶1之外的提及的胰蛋白酶蛋白，例如胰蛋白酶2、胰蛋白酶3、胰蛋白酶3、胰蛋白酶4、胰蛋白酶5和胰蛋白酶6。所述胰蛋白酶优选为胰蛋白酶1。技术人员可例如通过对适合该目的的诸如以下的底物进行测试蛋白水解切割来确认一种丝氨酸蛋白酶是否为胰蛋白酶：(i)Chromogenix的S-2222TM底物(Instrumentation Laboratory(Bedford，MA，USA)的品牌)，化学式为Bz-Ile-Glu(γ-OR)-Gly-Arg-pNA·HCl(R＝H(50％)且R＝CH3(50％)，分子量为741.3，目录号S820316，同时按照制造商的说明；和/或TRY(胰蛋白酶)显色底物(DSM Nutritional Products，CH)，化学式为Cbo-Val-Gly-Arg-pNA·AcOH。
人尿激酶类纤溶酶原激活物的氨基酸序列在SEQ ID NO:4中示出，并且可以在中在“AAK53822.1”下找到。具有SEQ ID NO:4中示出的序列的尿激酶类纤溶酶原激活物是具有信号肽(氨基酸残基1-20)和链(氨基酸残基21-431)的前体蛋白，所述链(氨基酸残基21-431)可再分为长链A(氨基酸残基21-177)、短链A(氨基酸残基156-177)和链B(氨基酸残基179-431)。如本文所使用，术语“尿激酶类纤溶酶原激活物”是指非活性的尿激酶类纤溶酶原激活物前体蛋白及其催化活性链形式。
在本发明的情况中，如果一种蛋白是特异性切割纤溶酶原中的Arg-|-Val键以形成纤溶酶的丝氨酸蛋白酶，则它就被视为尿激酶类纤溶酶原激活物。所述蛋白的全长氨基酸序列优选包括对应于不同物种的尿激酶类纤溶酶原激活物多肽之间保守的氨基酸残基链段的氨基酸残基链段。例如，包括含有对应于SEQ ID NO:4的氨基酸残基His-119到Asn-124和/或Asn-274到Leu-278的氨基酸残基链段并且特异性切割纤溶酶原中的Arg-|-Val键以形成纤溶酶的多肽的丝氨酸蛋白酶被认为是尿激酶类纤溶酶原激活物多肽。
技术人员可例如通过对适合该目的的诸如以下的底物进行测试蛋白水解切割来确认丝氨酸蛋白酶是否为尿激酶类纤溶酶原激活物：(i)Chromogenix的S-2444TM底物(Instrumentation Laboratory(Bedford，MA，USA)的品牌)，化学式为Glu-Gly-Arg-pNAHCl(分子量为498.9)，同时按照制造商的说明；和/或(ii)用于尿激酶类纤溶酶原激活物的uPA-系列显色底物(DSM Nutritional Products，CH)，化学式为Bz-beta-Ala-Gly-Arg-pNA·AcOH和/或Cbo-Glu(OtBu)-Gly-Arg-pNA AcOH。
如本文所使用，术语“重组体(重组子，recombinant)”是指使用本领域技术人员已知的重组DNA技术产生的蛋白。重组蛋白优选由于例如氨基酸组成不同(由于氨基酸残基的交换和/或一个或多个氨基酸残基的缺失或插入而导致)和/或由于诸如糖基化的翻译后修饰的差别而与天然蛋白不同。
如本文所使用，短语“包括丝氨酸蛋白酶的重组蛋白”旨在涵盖包括重组丝氨酸蛋白酶多肽、优选来源于哺乳动物的重组丝氨酸蛋白酶多肽、更优选来源于灵长类动物的重组丝氨酸蛋白酶多肽、以及最优选来源于人的重组丝氨酸蛋白酶多肽的蛋白。该短语包括例如重组的哺乳动物丝氨酸蛋白酶前体蛋白，例如凝血酶原，其被加工和/或活化为哺乳动物凝血酶多肽。因此，本发明的蛋白优选为重组的哺乳动物的、优选灵长类动物的、更优选人的或人源化的凝血酶、凝血因子XIa、胰蛋白酶或尿激酶类纤溶酶原激活物，其在外表面肽结构中包括至少一个氨基酸残基的插入，其中所述肽结构为：对应于凝血酶的SEQ IDNO:1的Gly-427与Asp-462之间、优选His-450与Asp-462之间、更优选His-450与Leu-459之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域；对应于凝血因子XIa的SEQ ID NO:2的Val-463与Asp-480之间、优选His-469与Asp-480或Ser-477之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域；对应于胰蛋白酶的SEQ ID NO:3的Leu-73与Asp-107之间、优选His-96与Asp-107或Leu-104之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域；以及对应于尿激酶类纤溶酶原激活物的SEQID NO:4的Val-237与Asp-275之间、优选Phe-254或Val-256与Asp-275或Asn-274之间、更优选His-262与Asp-275或Asn-274之间的区域的氨基酸残基区域。另外，所述短语包括这样的蛋白：其除了丝氨酸蛋白酶多肽之外还包括一种或多种另外的氨基酸序列，例如构成一种标签(例如如EP0150126中所述的FLAG标签)的氨基酸序列和/或一种或多种其它识别肽。
如本文所使用，术语“人源化的”是指将优选一个物种的蛋白的外部氨基酸残基替换或人源化为所述蛋白的人同源物中存在的氨基酸残基，以便第一物种的蛋白在给人施用时不会产生致免疫性(immunogenic)，或者产生更少的致免疫性。替换外部残基优选对内部结构域、或者对轻链与重链之间的域间接触几乎不具有影响，或者不具有影响。来源于非人、优选来源于哺乳动物、更优选来源于灵长类动物的本发明蛋白优选被人源化，以便当给人施用时降低所述蛋白的致免疫性。
本发明的非人蛋白优选包括人源化的哺乳动物丝氨酸蛋白酶多肽、更优选人源化的灵长类动物丝氨酸蛋白酶多肽，这是由于预期在人体中施用时抗原应答的风险与包括非人源化的丝氨酸蛋白酶多肽的本发明蛋白相比更低。
在人源化蛋白的情况下，可注意可应用于抗体的人源化方法。该方法利用现有的由Kabat et al.(1987)Sequences of Proteins of Immunological Interest，4th ed.，Bethesda,Md.，美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)编辑的人抗体可变结构域的序列数据、对该数据库的更新、以及其它可访问的美国和国外的数据库(核酸和蛋白)。用来产生人源化抗体的方法的非限制性实例包括：EP 519596；美国专利号6,797,492；以及Padlan等人，1991.Mol Immunol 28：489-498。对非人蛋白的人源化方法进一步举例说明，Sarkar等人，2012，Journal of Lipids，文章ID 610937，第1-13页描述了通过改变酶的表面成功地将对氧磷酶-1人源化，以反映人序列。
如本文所使用，术语“丝氨酸蛋白酶抑制剂”是指能够抑制丝氨酸蛋白酶活性的药剂。优选地，丝氨酸蛋白酶抑制剂为单价直接丝氨酸蛋白酶抑制剂，优选地为小分子或者肽或拟肽，其通过与丝氨酸蛋白酶的活性位点结合起作用。优选地，丝氨酸蛋白酶抑制剂为凝血酶抑制剂、凝血因子XIa抑制剂、胰蛋白酶抑制剂或尿激酶类纤溶酶原激活物抑制剂。
如本文所使用，术语“凝血酶抑制剂”包括但不限于直接凝血酶抑制剂，其包括诸如水蛭素、比伐卢定和重组水蛭素的二价直接凝血酶抑制剂，其通过与凝血酶的活性位点结合和通过与凝血酶的外部位点1结合起作用。外部位点1在功能上在凝血酶原中不能接近，但在活化之后就会暴露(Huntington，2005.J Thromb Haemos 3：1861-1872；Lane等人，2005.Blood：106：2605-2612)。术语“凝血酶抑制剂”进一步包括提及的单价直接凝血酶抑制剂，并且优选为单价直接凝血酶抑制剂，其通过与凝血酶的活性位点结合起作用。这些单价直接凝血酶抑制剂包括：阿加曲班((2R,4R)-1-[(2S)-5-(二氨基甲叉基氨基)-2-[(3-甲基-1,2,3,4-四氢喹啉-8-基)磺酰氨基]戊酰基]-4-甲基-哌啶-2-甲酸)或其生物活性类似物；美拉加群(2-[[(1R)-2-[(2S)-2-[(4-脒基苯基)甲基氨基甲酰基]氮杂环丁烷-1-基]-1-环己基-2-氧乙基]氨基]乙酸)及其前药希美加群(2-[[(1R)-1-环己基-2-[(2S)-2-[[4-[(Z)-N'-羟基脒基]苯基]甲基氨基甲酰基]氮杂环丁烷-1-基]-2-氧乙基]氨基]乙酸乙酯)或其生物活性类似物；达比加群(3-[[2-[(4-脒基苯胺基)甲基]-1-甲基苯并咪唑-5-羰基]-吡啶-2-基氨基]丙酸)或其生物活性类似物，例如达比加群酯(dabigatranetexilate)(3-[[2-[[4-[(Z)-N'-己氧基羰基脒基]苯胺基]甲基]-1-甲基苯并咪唑-5-羰基]-吡啶-2-基氨基]丙酸乙酯)；RWJ-671818(1-{N-[2-(脒基氨基氧基)乙基]氨基}羰基甲基-6-甲基-3-[2,2-二氟-2-苯乙基氨基]吡嗪酮)或其生物活性类似物；3-(2-苯乙基氨基)-6-甲基-1-(2-氨基-6-甲基-5-亚甲基酰胺基甲基吡啶基)吡嗪酮或其生物活性类似物；(E)-N-(3-((1-(苯并[b]噻吩-2-基甲基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)苯基)-2-(3-氯苯基)乙烯磺酰胺或其生物活性类似物；以及Merck的化合物2((S)-N-(2-(氨基甲基)-5-氯苄基)-1-((R)-2-羟基-3,3-二甲基丁酰基)吡咯烷-2-甲酰胺)或其生物活性类似物。优选地，直接凝血酶抑制剂为单价直接凝血酶抑制剂，优选为适合口服给药的小分子，例如阿加曲班、美拉加群及其前药、希美加群、或者达比加群及其前药达比加群酯(dabigatranetexilate)、或者这些分子的生物活性类似物。
可替代地，直接凝血酶抑制剂为肽或拟肽抑制剂(Mehta等人，2014.Expert OpinTher Pat 24：47-67)。
如本文所使用，术语“凝血因子XIa抑制剂”是指能够与凝血因子XIa的活性位点结合并抑制其蛋白酶活性的抑制剂。该术语包括直接凝血因子XIa抑制剂，优选为与凝血因子XIa的活性位点结合并抑制其蛋白酶活性的小分子。直接凝血因子XIa抑制剂的组包括：4,5,6-三取代的嘧啶衍生物；BMS-262084((2S,3R)-1-[4-(叔丁基氨基甲酰基)哌嗪-1-羰基]-3-[3-(二氨基甲叉基氨基)丙基]-4-氧基氮杂环丁烷-2-甲酸)或其生物活性类似物；Bristol-Meyers Squibb的化合物1(3'-[(2S,4R)-6-脒基-4-甲基-4-苯基-1,2,3,4-四氢喹啉-2-基]-4-氨基甲酰基-5'-[(3-甲基丁酰基)氨基]二苯基-2-甲酸)、2(反式-N-((S)-1-(4-(3-氨基-1H-吲唑-6-基)-5-氯-1H-咪唑-2-基)-2-苯乙基)-4-(氨基甲基)环己烷甲酰胺)和33((2E)-N-{(1S)-1-[4-(3-氨基-1H-吲唑-6-基)-1H-咪唑-2-基]-2-苯乙基}-3-[5-氯-2-(1H-四唑-1-基)苯基]丙-2-烯酰胺)、或其生物活性类似物；AstraZeneca的化合物13(N-[(1S)-1-苄基-2-[(6-氯-2-氧基-1H-喹啉-4-基)甲基氨基]-2-氧基-乙基]-4-羟基-2-氧基-1H-喹啉-6-carbo)或其生物活性类似物；芳基硼酸；大环吲哚；以及肽或拟肽抑制剂。优选地，凝血因子XIa抑制剂为直接凝血因子XIa抑制剂，优选为与凝血因子XIa的活性位点结合并抑制其蛋白酶活性的小分子，优选为适合口服给药的小分子。
如本文所使用，术语“尿激酶类纤溶酶原激活物抑制剂”是指能够与尿激酶类纤溶酶原激活物的活性位点结合并抑制其蛋白酶活性的抑制剂。该术语包括直接尿激酶类纤溶酶原激活物抑制剂，优选为与尿激酶类纤溶酶原激活物的活性位点结合并抑制其蛋白酶活性的小分子。直接尿激酶类纤溶酶原激活物抑制剂的组除了别的以外还包括WX-UK1(4-[(2S)-3-(3-脒基苯基)-2-[[2,4,6-三(丙烷-2-基)苯基]磺酰氨基]丙酰基]哌嗪-1-甲酸乙酯)或其前药Upamostat，还称作Mesupron，或WX-671(后者：Nα-(2,4,6-三异丙基苯磺酰基)-3-脒基-(L)-苯基丙氨酸-4-乙氧基羰基哌嗪)、APC-10302(6-氯-2-(2-羟基-二苯基-3-基)-1H-吲哚-5-甲脒)、或者这些化合物的生物活性类似物。可替代地，尿激酶类纤溶酶原激活物抑制剂为肽或拟肽抑制剂。优选地，直接尿激酶类纤溶酶原激活物为单价直接尿激酶类纤溶酶原激活物抑制剂，优选为适合口服给药的小分子，例如WX-UK1及其前药Upamostat。
如本文所使用，术语“胰蛋白酶抑制剂”是指能够与胰蛋白酶的活性位点结合并抑制其蛋白酶活性的抑制剂。该术语包括直接胰蛋白酶抑制剂，优选为与胰蛋白酶的活性位点结合并抑制其蛋白酶活性的小分子。直接胰蛋白酶抑制剂的组包括美拉加群及其前药希美加群(后者：2-[[(1R)-1-环己基-2-[(2S)-2-[[4-[(Z)-N'-羟基脒基]苯基]甲基氨基甲酰基]氮杂环丁烷-1-基]-2-氧乙基]氨基]乙酸乙酯)、APC-10302(6-氯-2-(2-羟基-二苯基-3-基)-1H-吲哚-5-甲脒)、以及这些分子的生物活性类似物。
如本文所使用，术语“生物活性类似物”或“类似物”是指所指出的参考化合物的衍生物或片段呈现出与参考化合物相同的生物功能并保持诸如抗凝作用或促凝作用的目标活性。因此类似物优选为所指出的参考化合物的结构类似物和功能类似物。
如本文所使用，术语“同源性”是指两种氨基酸序列之间的氨基酸序列同一性，表示为在对比两种氨基酸序列时相同氨基酸残基的百分比。所述对比优选在两种氨基酸序列的总长度上进行。
如本文所使用，术语“区域”是指以两个保守的氨基酸残基为界的氨基酸残基链段。该区域包括构成该区域的边界的两个氨基酸。如本文所应用的氨基酸残基的编号基于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列。如本文所使用，术语“氨基酸区域”包括对应于所述界定区域(例如非人凝血酶、凝血因子XIa、胰蛋白酶和/或尿激酶类纤溶酶原激活物中的区域)的氨基酸残基区域。技术人员应理解，如SEQ ID NO:1中所指示，该区域在例如非人凝血酶中的位置可以与在人凝血酶中的位置不同。但是，两个保守的氨基酸残基在所指示的区域的两侧，这会容许技术人员识别对应于非人蛋白中的所述界定区域的区域。
如本文所使用，术语“插入(insertion)”或“插入的(inserted)”是指在天然丝氨酸蛋白酶多肽的特定区域中添加至少一个氨基酸残基，从而与天然丝氨酸蛋白酶多肽的该区域中的氨基酸残基数量相比增加所述区域中的氨基酸残基数量。
如本文所使用，术语“替换(replacement)”或“替换的(replaced)”是指在丝氨酸蛋白酶多肽的特定区域中、或特定位点处取代一个或多个氨基酸残基，从而改变所述区域中的氨基酸序列，但不改变氨基酸残基数量。替换是缺失一个氨基酸残基接着在同一位置插入一个不同氨基酸残基的结果。
如本文所使用，术语“缺失(deletion)”或“缺失的(deleted)”是指在丝氨酸蛋白酶多肽的特定区域中或特定位点处缺失一个或多个氨基酸残基，从而与天然丝氨酸蛋白酶多肽的该区域中的氨基酸残基数量相比降低所述多肽的所述区域中的氨基酸残基数量。
如本文所使用，术语“天然丝氨酸蛋白酶多肽”是指天然存在于动物、优选哺乳动物、更优选灵长类动物、更优选人中的内源性丝氨酸蛋白酶多肽。
如本文所使用，术语“氨基酸组成”是指氨基酸残基链段的氨基酸顺序和长度，其中长度由该链段中氨基酸残基的数量确定。
插入、替换和/或缺失一个或多个氨基酸残基、优选插入一个或多个氨基酸残基可使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术进行。例如，本领域技术人员可使用合成DNA、PCR技术和分子克隆，以获得具有编码本发明蛋白的DNA序列的重组DNA构建体。在Green和Sambrook，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，CSHL Press，2012中描述了合适的方法和工具。
如本文所使用，术语“外表面肽结构”是指连续的氨基酸残基链段，还称作肽环(peptide loop)或肽螺圈(coil)，其出现在折叠的天然凝血酶、凝血因子XIa、胰蛋白酶和尿激酶类纤溶酶原激活物多肽的外部。优选地，肽结构是：对应于凝血酶的SEQ ID NO:1的Gly-427与Asp-462之间、优选His-450与Asp-462之间、更优选His-450与Leu-459之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域；对应于凝血因子XIa的SEQ ID NO:2的Val-463与Asp-480之间、优选His-469与Asp-480或Ser-477之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域；对应于胰蛋白酶的SEQ ID NO:3的Leu-73与Asp-107之间、优选His-96与Asp-107或Leu-104之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域；以及对应于尿激酶类纤溶酶原激活物的SEQ ID NO:4的Val-237与Asp-275之间、优选Phe-254或Val-256与Asp-275或Asn-274之间、更优选His-262与Asp-275或Asn-274之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域。
已经发现，在所述外表面肽结构中、优选在如本文以上所指出并且如图2-图4中所示的凝血酶、凝血因子XIa、胰蛋白酶和尿激酶类纤溶酶原激活物多肽的区域中插入至少一个氨基酸残基会产生对丝氨酸蛋白酶抑制剂、优选直接凝血酶、凝血因子XIa、胰蛋白酶或尿激酶类纤溶酶原激活物抑制剂的抑制的敏感性降低的蛋白。
与例如对应于SEQ ID NO:1的His-450与Asp-462或Leu-459之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域相关的短语“对应于...与...之间的氨基酸残基区域”在本文中用来表示对应于SEQ ID NO:1的His-450和Asp-462或Leu-459的另一种凝血酶的保守His和Asp残基的残基数量可与归属于SEQ ID NO:1中的所述His和Asp残基的残基数量不同。氨基酸残基数量的不同可以由例如氨基酸残基的不同编号方式导致。另外，并且以示例的方式，氨基酸残基数量的不同可以由凝血酶原多肽的长度与SEQ ID NO:1中所示的人凝血酶原多肽的长度的差别导致。类似地，当排列多个不同物种的多种凝血酶原多肽时，本领域技术人员应容易地认识到，SEQ ID NO:1的氨基酸残基Gly-427在不同物种的凝血酶原多肽之间是保守的。因此对对应于不同物种的丝氨酸蛋白酶中的所述氨基酸残基的氨基酸残基进行识别是可能的。因此本领域技术人员应理解，如本文所应用的氨基酸残基编号并非对本发明进行限制，而是仅仅为了清楚起见。
技术人员应了解如何识别对应于在如本文所述构成一个区域的边界的SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的所述保守氨基酸残基之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域。技术人员会例如直接确认SEQ ID NO:1的His-450和Asp-462是其它物种的丝氨酸蛋白酶多肽中也存在的高度保守的残基。
由于SEQ ID NO:1的His-450和Asp-462中的或周围的、或者非人丝氨酸蛋白酶多肽中相应的His和Asp残基中的或周围的氨基酸残基区域的高度保守的性质，本领域技术人员能够识别对应于SEQ ID NO:1的His-450与Asp-462之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域。同样的一般原则适用于如本文所述构成一个区域的边界的其它氨基酸残基。换言之，特定氨基酸残基的保守性质会给技术人员提供关于如本文所述非人丝氨酸蛋白酶多肽中的区域中包括哪个氨基酸残基的明确标志。如本文具体描述构成一个区域的边界的氨基酸残基被发现在各物种之间都是保守的并因此适合对区域进行界定。
本领域技术人员应理解，本发明尤其涉及对应于(i)凝血酶的SEQ ID NO:1的Gly-427与Asp-462之间、优选His-450与Asp-462之间、更优选His-450与Leu-459之间、(ii)凝血因子XIa的SEQ ID NO:2的Val-463与Asp-480之间、优选His-469与Asp-480或Ser-477之间、(iii)胰蛋白酶的SEQ ID NO:3的Leu-73与Asp-107之间、优选His-96与Asp-107或Leu-104之间、以及(iv)尿激酶类纤溶酶原激活物的SEQ ID NO:4的Val-237与Asp-275之间、优选Phe-254或Val-256与Asp-275或Asn-274之间、更优选His-262与Asp-275或Asn-274之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域的氨基酸组成。因此，本领域技术人员应理解，本发明蛋白剩余部分的氨基酸顺序可变化，条件是所述蛋白保持为，或者可被活化为，对丝氨酸蛋白酶抑制剂、优选直接凝血酶、凝血因子XIa、胰蛋白酶、或尿激酶类纤溶酶原激活物抑制剂的敏感性降低的丝氨酸蛋白酶多肽。因此所述本发明蛋白的剩余部分可随着它例如在不同类别的丝氨酸蛋白酶多肽之间变化而变化。
对应于根据本发明的区域的区域中的氨基酸残基数量在不同物种的丝氨酸蛋白酶多肽之间、特别在属于哺乳动物组或属于灵长类动物组的各物种之间是保守的。因此，氨基酸残基数量在丝氨酸蛋白酶多肽中也是保守的。对应于SEQ ID NO:1的Gly-427与Asp-462之间的区域的氨基酸残基区域中所述保守的氨基酸残基的数量为34，不包括Gly-427和Asp-462。对应于SEQ ID NO:1的His-450与Asp-462之间的区域的氨基酸残基区域中所述保守的氨基酸残基的数量为11，不包括His-450和Asp-462。对于SEQ ID NO:2、3和4，适用相同的原则。
已经发现，在对应于如本文所述的本发明蛋白中的区域的氨基酸残基区域中插入至少一个氨基酸残基得到催化活性的丝氨酸蛋白酶多肽，但是对丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制的敏感性降低。
优选地，在如本文所述的氨基酸残基区域中插入至少一个氨基酸残基与替换至少一个氨基酸残基相结合。
特别优选的是其中插入包括1-50、优选1-40、更优选1-30、以及最优选1-20个氨基酸残基的本发明蛋白。在对应于凝血酶的SEQ ID NO:1的His-450与Asp-462或Leu-459之间、凝血因子XIa的SEQ ID NO:2的His-469与Asp-480或Ser-477之间、胰蛋白酶的SEQ IDNO:3的His-96与Asp-107或Leu-104之间、或者尿激酶类纤溶酶原激活物的SEQ ID NO:4的His-262与Asp-275、Asn-274或Ala-271之间的区域的氨基酸残基区域中的插入优选包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个、更优选4个或5个氨基酸残基，或者由至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个、更优选4个或5个氨基酸残基组成。特别优选的是在对应于凝血酶的SEQ ID NO:1的His-450与Asp-462或Leu-459之间的区域的氨基酸残基区域中插入至少4个氨基酸残基，例如插入8个氨基酸残基。另外，特别优选的是在对应于凝血因子XIa的SEQ ID NO:2的His-469与Asp-480或Ser-477之间的区域的氨基酸残基区域中插入至少5个氨基酸残基，例如插入9个氨基酸残基。另外，特别优选的是在对应于胰蛋白酶的SEQ ID NO:3的His-96与Asp-107或Leu-104之间的区域的氨基酸残基区域中插入至少5个氨基酸残基，例如插入9个或11个氨基酸残基。另外，特别优选的是在对应于尿激酶类纤溶酶原激活物的SEQ ID NO:4的His-262与Asp-275、Asn-274或Ala-271之间的区域的氨基酸残基区域中插入至少3个氨基酸残基，例如插入7个氨基酸残基。本领域技术人员应理解，氨基酸残基可在对应于如本文所定义的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域中的任何位置插入。适合插入的氨基酸残基选自如表1所列的20种天然存在的氨基酸残基的组。本领域技术人员应理解，所述插入的氨基酸残基可经受翻译后的体内或体外化学改变。如本文以上所指出，本领域技术人员可使用合成DNA、PCR技术和分子克隆，以获得具有对在对应于如本文所定义的区域的氨基酸残基区域中包括1-50个氨基酸残基的插入的本发明蛋白进行编码的DNA序列的重组DNA构建体。
在对应于氨基酸残基区域的氨基酸残基区域中的插入优选：在凝血酶的SEQ IDNO:1的Trp-455与Arg-456之间；在凝血因子XIa的SEQ ID NO:2的Met-474与Ala-475之间；在胰蛋白酶的SEQ ID NO:3的Asp-100与Arg-101之间，在尿激酶类纤溶酶原激活物的SEQID NO:4的Thr-269与Leu-270之间，或者在对应于非人凝血酶、凝血因子XIa、胰蛋白酶或尿激酶类纤溶酶原激活物多肽中的这些氨基酸残基的两个氨基酸残基之间。
特别优选的是包括至少一个氨基酸残基的插入与1-30、优选1-8个氨基酸残基的替换相结合的本发明蛋白。所述替换优选包括1、2、3、4、5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个、优选5-8个氨基酸残基，或者优选由1、2、3、4、5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个、优选5-8个氨基酸残基组成。在对应于凝血酶的SEQ ID NO:1的His-450与Asp-462或Leu-459之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域中替换氨基酸残基优选包括7个或8个氨基酸残基，或者由7个或8个氨基酸残基组成。在对应于凝血因子XIa的SEQ ID NO:2的His-469与Asp-480或Ser-477之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域中替换氨基酸残基优选包括5个或6个氨基酸残基，或者由5个或6个氨基酸残基组成。在对应于胰蛋白酶的SEQ ID NO:3的His-96与Asp-107或Leu-104之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域中替换氨基酸残基优选包括7个氨基酸残基，或者由7个氨基酸残基组成。在对应于尿激酶类纤溶酶原激活物的SEQ ID NO:4的His-262与Asp-275之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域中替换氨基酸残基优选包括4个或7个氨基酸残基，或者由4个或7个氨基酸残基组成。
对应于本发明蛋白的如本文所定义的区域的区域中存在的氨基酸残基优选被表1所列氨基酸残基中的任一种替换，优选被如表1中的“侧链极性”和“侧链电荷”列中所示同一类的氨基酸替换。优选地，SEQ ID NO:1中第451-455个和第456-458个氨基酸残基中的一个或多个、SEQ ID NO:2中第470-474个和第475-476个氨基酸残基中的一个或多个、SEQ IDNO:3中第97-100个和第101-103个氨基酸残基中的一个或多个、SEQ ID NO:4中第262-269个和第270-274个氨基酸残基中的一个或多个、或其在非人丝氨酸蛋白酶中相应的氨基酸残基被选自如表1所示的氨基酸残基的不同氨基酸残基替换。
本领域技术人员应理解，当氨基酸残基在对应于本发明的非人丝氨酸蛋白酶的如本文所定义的区域的氨基酸残基区域中被替换时，只有优选的本发明蛋白中尚不存在的那些氨基酸残基优选被替换。本领域技术人员应理解，仅仅在对氨基酸残基在所指定的氨基酸残基区域中的替换进行举例说明的情况下才如以上所述提及SEQ ID NO。因此他会具有哪一个或多个氨基酸残基可在非人丝氨酸蛋白酶中替换哪一个其它氨基酸残基或哪几个其它氨基酸残基的指示。本发明涉及上述插入和替换的所有可能组合。
本发明的蛋白可进一步包括至少一个氨基酸残基在对应于如本文所定义的区域的氨基酸残基区域中的缺失，条件是当与天然丝氨酸蛋白酶多肽的该区域中的氨基酸残基数量对比时，所述区域中总的氨基酸残基数量在插入至少一个氨基酸残基并缺失至少一个氨基酸残基之后增加。特别优选的是具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、10、15、20或30个氨基酸残基的缺失的本发明蛋白。
一种优选的本发明蛋白包括插入和替换的组合，或者插入、替换和/或缺失的组合。插入和缺失可彼此独立发生，并因此可能在对应于如本文所定义的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域中不同的氨基酸位置处存在例如5个氨基酸残基的插入和4个氨基酸的缺失，从而增加本发明的丝氨酸蛋白酶多肽中总的氨基酸残基数量。技术人员应理解，插入或缺失会改变蛋白中的氨基酸残基编号。
本发明的蛋白最优选包括在凝血酶的SEQ ID NO:1的氨基酸残基His-450与Asp-462之间、或者在对应于非人凝血酶的SEQ ID NO:1的His-450和Asp-462的氨基残基之间具有氨基酸序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的氨基酸残基区域。
本发明的蛋白最优选包括在凝血因子XIa的SEQ ID NO:2的氨基酸残基His-469与Asp-480之间、或者在对应于非人凝血因子XIa的SEQ ID NO:2的His-469和Asp-480的氨基残基之间具有氨基酸序列SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸残基区域。
本发明的蛋白最优选包括在胰蛋白酶的SEQ ID NO:3的氨基酸残基His-96与Asp-107之间、或者在对应于非人胰蛋白酶的SEQ ID NO:3的His-96和Asp-107的氨基残基之间具有氨基酸序列SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸残基区域。
本发明的蛋白最优选包括在尿激酶类纤溶酶原激活物的SEQ ID NO:4的氨基酸残基His-262与Asp-275之间、或者在对应于非人尿激酶类纤溶酶原激活物的SEQ ID NO:4的His-262和Asp-275的氨基残基之间具有氨基酸序列SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸残基区域。
本发明还涵盖基本上与本发明蛋白同源且生物学等价的蛋白。本发明的蛋白优选具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4、或与其活化形式超过90％的同源性的氨基酸序列，其中所述蛋白是催化活性的，或者在加工/活化之后是催化活性的，并具有对丝氨酸蛋白酶抑制剂、优选直接凝血酶类、凝血FXIa类、胰蛋白酶、或尿激酶类纤溶酶原激活物抑制剂的降低的敏感性。
可替代的本发明蛋白是包括丝氨酸蛋白酶多肽的重组蛋白，所述丝氨酸蛋白酶多肽在对应于SEQ ID NO:1的Ile-542的氨基酸残基位置上具有氨基酸残基的替换或取代，其中所述丝氨酸蛋白酶多肽不是凝血因子X多肽或其天然加工形式或活化形式。例如，技术人员了解，SEQ ID NO:1的位置Ile-542对应于SEQ ID NO:2的位置His-552、SEQ ID NO:3的位置Gly-177、以及SEQ ID NO:4的位置Ser-353。技术人员在对应于可替代的丝氨酸蛋白酶多肽中SEQ ID NO:1的Ile-542、SEQ ID NO:2的His-552、SEQ ID NO:3的Gly-177、或SEQ IDNO:4的Ser-353的氨基酸残基位置的识别中不存在困难。优选地，替换在以下氨基酸残基位置发生：SEQ ID NO:1的Ile-542、SEQ ID NO:2的His-552、SEQ ID NO:3的Gly-177、或SEQID NO:4的Ser-353。替换或取代是突变，优选是保守性或非保守性突变。优选地，作为替换的氨基酸残基可以是如表1所示氨基酸残基中的任一种。更优选地，作为替换的氨基酸残基为丙氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸或谷氨酸。优选地，丝氨酸蛋白酶多肽为凝血酶(原)。如这一部分中所述的蛋白中氨基酸残基的替换可与本文所述的任何插入结合。
如在本发明的情况下所使用，术语“对丝氨酸蛋白酶抑制剂的降低的敏感性”或“对丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制的降低的敏感性”是指产生50％的最大抑制(Ki)需要的丝氨酸蛋白酶抑制剂的浓度。针对本发明的多肽的该浓度比针对天然丝氨酸蛋白酶多肽的该浓度更高。所述天然丝氨酸蛋白酶多肽优选来源于血浆或者重组产生。丝氨酸蛋白酶抑制剂的Ki优选通过以下确定：使用0.001到100μM的丝氨酸蛋白酶抑制剂对本发明的蛋白进行预孵育(预温育，pre-incubating)，随后进行其中分析催化活性的试验。
与在对应于如本文所定义的氨基酸区域的氨基酸残基区域中不具有至少一个氨基酸残基的插入的所述天然丝氨酸蛋白酶多肽的Ki相比，本发明蛋白的Ki优选增加超过2x，更优选增加50x至100x，以及最优选增加超过100x。
本发明进一步提供了一种核酸分子，其包括编码本发明蛋白的核苷酸序列、优选DNA序列。本领域技术人员应理解如何产生编码本发明蛋白的氨基酸序列的DNA序列以及如何使用通常已知的重组DNA技术来制造和分离具有所述DNA序列的核酸分子。核酸分子的序列优选针对在本发明的宿主细胞中的表达进行密码子优化。有利于在特定宿主细胞中进行高水平表达的密码子以这种方式使用。
本发明还提供了包括本发明核酸分子的表达载体。
核酸分子优选使用本领域技术人员已知的重组DNA技术插入表达载体中。在本发明的情况下，表达载体指导本发明蛋白在宿主细胞中的表达。这些表达载体优选可作为附加体(游离基因，episomes)或作为染色体DNA的一部分在宿主细胞中复制。另外，表达载体优选包括：(i)强的启动子/增强子，例如CMV或SV40启动子；(ii)最佳翻译起始序列，例如核糖体结合位点和起始密码子，优选为KOZAK共有序列；以及(iii)转录终止序列，当蛋白在真核细胞中表达时包括聚(A)信号。合适的表达载体包括质粒和病毒载体，例如腺病毒、腺伴随病毒和逆转录病毒。本领域技术人员应理解，待使用的表达载体取决于用来表达重组蛋白的宿主细胞。本发明的表达载体优选适合在包括细菌细胞的原核细胞中、或者更优选在诸如酵母细胞和哺乳动物细胞的真核宿主细胞中表达本发明的核酸分子。特别优选的是哺乳动物表达载体pCMV4。
作为一个替代，可将本发明的核酸分子插入宿主细胞的基因组中。所述插入优选在基因座上，或者在确保本发明的核酸分子在宿主细胞中表达的区域内。
本发明进一步提供一种宿主细胞，其包括根据本发明的核酸分子或表达载体。本发明优选提供表达本发明核酸分子从而产生本发明蛋白的宿主细胞。所述蛋白在宿主细胞内产生，或者优选从宿主细胞分泌。
用于本发明的合适的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞，例如细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞、哺乳动物细胞、小鼠(murine)细胞、大鼠(rat)细胞、绵羊细胞、猿细胞和人细胞。合适的真核宿主细胞的实例包括但不限于HEK 293细胞、仓鼠细胞系CHO和BHK-21、鼠宿主细胞NIH3T3、NSO和C127、猿宿主细胞COS和Vero、以及人宿主细胞HeLa、PER.C6、U-937和Hep G2。合适的细胞可从诸如ATCC和Life Technologies的公共来源得到。许多转染技术在本领域中是已知的，参见例如Graham等人，1973.Virology 52：456；Green等人，2012.“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，CSHL Press；Davis等人，“BasicMethods in Molecular Biology”，1986，Elsevier；以及Chu等人，1981.Gene 13：197。本领域技术人员优选采用如这些参考资料中所述的技术来将一种或多种外源性核酸分子引入合适的宿主细胞中。
特别优选的用来产生本发明的蛋白的宿主细胞是HEK 293细胞。
本发明进一步提供一种药物组合物，其包括本发明的蛋白，以及药用载体或赋形剂。本发明的药物组合物优选包括稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、以及本领域中已知的其它材料中的一种或多种。载体的特征将取决于给药途径，这对于技术人员而言是已知的。为了降低潜在的施用活化的丝氨酸蛋白酶多肽的血栓风险，本发明的药物组合物优选包括在给受试者施用之后才活化的本发明蛋白。
术语“受试者(对象，subject)”是指哺乳动物组，优选人。
在本发明的情况中，术语“药物组合物”是指本发明的蛋白与惰性载体或活性载体的组合，使得组合物适合体内或离体治疗用途。
如本文所使用，术语“药用(药学上可接受的，pharmaceutically acceptable)”是指与本发明的蛋白的物理和化学特征相容并且不会干扰所述蛋白的生物活性的有效性的非毒性材料。
可使得本发明的药物组合物适合组合物的肠内给药，其中所述组合物通过消化道吸收，例如口服摄取或直肠给药。所述组合物优选被例如脂质体包封，以防止蛋白水解降解。
优选使得本发明的药物组合物适合肠胃外给药，其中所述组合物通过静脉内、动脉内、皮下和/或肌内引入。肠胃外给药涉及将本发明的药物组合物注射或输注到身体组织或体液中，由此优选使用注射器、针头、或导管。作为替代，可使用无针头高压给药作为肠胃外给药的方法。
对于可注射组合物(例如静脉内组合物)，载体可以是水性或油性溶液、分散剂、乳剂和/或悬浮剂。优选地，载体是水性溶液，优选为蒸馏的无菌水、盐水、缓冲盐水(bufferedsaline)、或另一种用于注射的药用赋形剂。
包括本发明的凝血酶或凝血因子XIa蛋白的本发明药物组合物可局部施用到例如伤口处或伤口中，或施用到血管，优选为受伤区域供应血液的动脉。所述局部给药是外部给药，例如以霜剂(膏剂，cream)、泡沫剂、凝胶剂、洗剂或软膏剂(药膏剂，油膏剂，ointment)的形式)、或者肠胃外给药，例如通过注射或输注，以产生局部或全身性疗效。用来产生局部效果的本发明蛋白的外部给药会降低潜在的全身性血栓现象的风险。
本发明的药物组合物优选用于各种治疗应用中。例如，包括本发明的凝血酶或凝血因子XIa蛋白的药物组合物可在其中正常凝血受到损害的疾病(例如血友病A和B，包括血友病A和B抑制剂患者组)的治疗或改善中用作旁路试剂(bypassing agent)。血友病A和B抑制剂患者是已经产生针对用来治疗或防止出血发作的产品的抗体的患者。
因此本发明还提供根据本发明的蛋白或药物组合物作为药物的用途。
本发明进一步提供包括根据本发明的凝血酶或凝血因子XIa多肽的根据本发明的蛋白、或者包括凝血酶或凝血因子XIa多肽的根据本发明的药物组合物用于在受试者中完全或部分逆转凝血抑制剂的抗凝血作用的方法。
术语“抗凝血作用”是指疗效，例如由于凝血抑制剂作用而防止血凝。
本发明进一步提供包括凝血酶或凝血因子XIa多肽的本发明蛋白用于制备用于在受试者中完全或部分逆转凝血抑制剂的抗凝血作用的药物的用途。
本发明进一步提供在受试者中完全或部分逆转凝血抑制剂的抗凝血作用的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包括凝血酶或凝血因子XIa多肽的本发明蛋白、或者包括凝血酶或凝血因子XIa多肽的本发明药物组合物。优选地，本发明的方法用来防止或改善与抗凝血剂治疗相关的出血并发症。
如本文所使用的术语“治疗有效量”意思是待施用的药物组合物中含有的活性成分的量足以实现预期目的，例如，尤其在这种情况下，足以完全或部分逆转凝血抑制剂的抗凝血作用。根据本发明的药物组合物中的活性成分，即本发明的蛋白的量优选在约5mg到10克蛋白的范围内。
治疗有效量可取决于需要本发明蛋白的人的血液中的蛋白平均浓度。例如，治疗有效量(i)优选为5mg到10g、优选150mg到10克的根据本发明的凝血酶；(ii)5mg到600mg、优选5mg到300mg根据本发明的凝血因子XIa；(iii)100微克到7mg根据本发明的胰蛋白酶；以及(iv)0.004mg到0.3mg根据本发明的尿激酶类纤溶酶原激活物。技术人员应理解，根据本发明的蛋白各自的剂量可不同，这是由于这些蛋白的正常血浆水平或血清水平不同。
包括本发明蛋白(其包括本发明的凝血酶或凝血因子XIa多肽)的根据本发明的药物组合物优选向需要完全或部分逆转凝血抑制剂的抗凝血作用的受试者施用仅1次、2次或3次，优选仅1次。
本发明进一步提供包括本发明的胰蛋白酶多肽的本发明蛋白、或者包括本发明蛋白(其包括本发明的胰蛋白酶多肽)的本发明药物组合物用于在受试者中完全或部分逆转胰蛋白酶抑制剂的肽键水解抑制的方法。
在相同情况下，本发明提供在受试者中完全或部分逆转胰蛋白酶抑制剂的肽键水解抑制的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包括本发明的胰蛋白酶多肽的本发明蛋白、或者包括本发明蛋白(其包括本发明的胰蛋白酶多肽)的本发明药物组合物。优选地，所述受试者在施用本发明的蛋白之前用胰蛋白酶抑制剂治疗。
在相同情况下，本发明提供包括根据本发明的胰蛋白酶多肽的本发明蛋白用于制备用于在受试者中完全或部分逆转胰蛋白酶抑制剂的肽键水解抑制的药物的用途。
本发明进一步提供包括胰蛋白酶多肽的本发明蛋白在完全或部分逆转胰蛋白酶抑制剂的肽键水解抑制中的非治疗用途。
本发明进一步提供包括本发明的尿激酶类纤溶酶原激活物的本发明的蛋白用于在受试者中完全或部分逆转抗纤维蛋白溶解作用，优选地，所述抗纤维蛋白溶解作用由诸如尿激酶类纤溶酶原激活物抑制剂的抑制剂诱导。优选地，在这种情况下，抗纤维蛋白溶解作用会降低血凝块的破坏，优选在形成血栓的情况下，例如严重的或大量的深静脉血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞或者堵塞的静脉内或透析插管。进一步优选的是，尿激酶类纤溶酶原激活物抑制剂为Mesupron。
所述受试者优选是用Mesupron治疗的癌症患者。通常向癌症患者施用诸如Mesupron的尿激酶类纤溶酶原激活物抑制剂是为了防止会促进转移的组织降解。但是，施用诸如Mesupron的尿激酶类纤溶酶原激活物抑制剂可产生抗纤维蛋白溶解作用，其可使用根据本发明的重组尿激酶类纤溶酶原激活物治疗。
除了如本文所述的其它给药途径之外，本发明的尿激酶类纤溶酶原激活物还可配制成用于胸膜内给药，从而例如改善并发的胸腔积液和积脓的排出。
以同样的方式，本发明提供包括本发明的尿激酶类纤溶酶原激活物的本发明蛋白用于制备用于在受试者中完全或部分逆转抗纤维蛋白溶解作用的药物，优选地，所述抗纤维蛋白溶解作用由诸如尿激酶类纤溶酶原激活物抑制剂的抑制剂诱导。
以同样的方式，本发明提供了在受试者中完全或部分逆转抗纤维蛋白溶解作用的方法，优选地，所述抗纤维蛋白溶解作用由诸如尿激酶类纤溶酶原激活物抑制剂的抑制剂诱导，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包括尿激酶类纤溶酶原激活物多肽的本发明蛋白、或者包括尿激酶类纤溶酶原激活物多肽的本发明药物组合物。优选地，本发明的方法用来防止或改善与抗纤维蛋白溶解抑制剂疗法相关的血栓并发症。
可替代地，本发明提供了包括丝氨酸蛋白酶多肽的重组蛋白，所述多肽在外表面肽结构中包括至少一个氨基酸残基的插入，其中所述丝氨酸蛋白酶多肽不是凝血因子X多肽，或其催化活性形式或天然加工形式，例如凝血因子Xa多肽。
优选地，所述肽结构是对应于SEQ ID NO:1的His-450与Asp-462之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域。在这种情况下，术语“对应”用来指凝血酶和非凝血酶丝氨酸蛋白酶中的氨基酸残基区域。可替代地，丝氨酸蛋白酶多肽选自由凝血酶、凝血因子XIa、胰蛋白酶和尿激酶类纤溶酶原激活物组成的组，其中外表面肽结构如本文所指出。
在本发明的情况中，如果一种蛋白(可能)是前凝血剂丝氨酸蛋白酶并且如果所述蛋白的全长氨基酸序列包括对应于在不同物种的凝血FX因子之间保守的氨基酸残基链段或单独的氨基酸残基的的氨基酸残基链段或单独的氨基酸残基，那么该蛋白就是凝血FX或FXa多肽。例如，包括含有对应于人凝血因子X的氨基酸残基Cys-246到Ala-250、Phe-260到Leu-266和/或Asp-413到His-423(参见Genbank登录号AAH46125.1)的氨基酸残基链段的多肽的前凝血剂丝氨酸蛋白酶被认为是凝血FXa多肽。如本文以上所述，所指出的His和Asp氨基酸残基在不同丝氨酸蛋白酶多肽之间并且在不同物种之间是保守的。
为了清楚和简要说明起见，各特征在本文中描述为相同或不同实施例的部分，但应理解，本发明的范围可包括具有全部或部分所述特征的组合的实施例。
SEQ ID NO:1(人凝血凝血酶原蛋白)
SEQ ID NO:2(人凝血因子XI蛋白)
SEQ ID NO:3(人胰蛋白酶-1蛋白)
SEQ ID NO:4(人尿激酶类纤溶酶原激活物)
SEQ ID NO：5
1 kkfvppqkay kfdlaaldr
SEQ ID NO：6
1 ppqkaykfdl aaldr
SEQ ID NO：7
1 kkfvppqkay kfdlaasgy
SEQ ID NO：8
1 ppqkaykfdl aasgy
SEQ ID NO：9
1 kkfvppqkay kfdlaalnn
SEQ ID NO：10
1 kkfvppsqef yekfdlvsln n
SEQ ID NO：11
1 kkfvppqkay kfdlaahhn
SEQ ID NO：12
1 ppqkaykfdl aahhn
SEQ ID NO：13
1 pryvppqkay kfdlaaldr
SEQ ID NO：14
1 tkfvppnyyy vhqnfdrval dr
SEQ ID NO：15
1 pkyhqgsgpi lprrtldr
SEQ ID NO：16
1 prydsissky lkellekpld r
附图说明
图1.顶部区块(小图，panel)显示了人凝血酶原(SEQ ID NO：1)中从His-450到Asp-462的氨基酸残基区域以及在人FXI(SEQ ID NO：2)、人胰蛋白酶(SEQ ID NO：3)和人尿激酶类纤溶酶原激活物(SEQ ID NO：4)中对应于所述区域的氨基酸残基区域的排列(alignment)。下面三个区块显示了在对应于人凝血酶原中His-450到Asp-462的区域、人FXI中His-469与Asp-480之间的区域、胰蛋白酶中His-96与Asp-107之间的区域、以及尿激酶类纤溶酶原激活物中His-262与Asp-275之间的区域的氨基酸残基区域中具有插入的新产生的人凝血酶原、人FXI、人胰蛋白酶和人尿激酶类纤溶酶原激活物的‘A’和‘B’蛋白变体。保守残基组氨酸和天门冬氨酸突出显示。
图2.示出了阿加曲班-凝血酶复合物的晶体结构(PDB 1DWC)。阿加曲班-接触残基(His57、Tyr60A、Lys60F、Leu99、Ile174、Glu192、Ser195、Asp189、Glu192、Gly216、Gly218、Gly226；胰凝乳蛋白酶编号(Bode，W.等人1989.EMBO J 8：3467-3475))和催化三联体残基His57、Ser195和Asp102显示为棒状。His91环突出显示并用箭头指示。
图3.示出了化合物33-FXIa复合物的晶体结构(PDB 4X6P)。化合物33显示为棒状模型，FXIa以表面图像示出。接触残基(His40、Leu41、Cys42、Cys58、Tyr58b、Tyr143、Ile151、Asp189、Lys192、Gly193、Asp194、Ser195、Gly216、Gly218、Tyr228；胰凝乳蛋白酶编号(Bode，W.等人1989.EMBO J 8：3467-3475))、催化三联体残基His57、Ser195和His91环突出显示。后者另外还用箭头指示。
图4.示出了美拉加群-胰蛋白酶复合物的晶体结构(PDB1K1P)。接触残基(Asp189、Ser190、Gly216和Gly21；胰凝乳蛋白酶编号(Bode，W.等人1989.EMBO J 8：3467-3475))和催化三联体残基His57、Ser195显示为棒状。His91环突出显示并用箭头指示。
图5.在人凝血酶原(‘凝血酶’，SEQ ID NO:1)和在对应于人凝血酶原中His-450到Asp-462的区域的氨基酸残基区域中具有插入的新产生的人凝血酶原的蛋白变体(‘ISO1’、‘ISO2’、‘NSC’、‘KL10’、‘ALB’)中从His-450到Asp-462的氨基酸残基区域的排列。位于位置450处的保守残基组氨酸和位于位置462处的天门冬氨酸突出显示。
图6.直接凝血酶抑制剂达比加群对显色凝血酶活性的抑制-系列1。在增加浓度(20nM-20μM)的达比加群的存在下，5nM来源于血浆的凝血酶(‘IIa’；区块A)、活化的来源于血浆的凝血酶原(‘pd-IIa’；区块B)、重组凝血酶(‘r-IIa’；区块C)、重组凝血酶变体ISO1(‘ISO1’；区块D)、或重组凝血酶变体NSC(‘NSC’；区块E)的肽基(peptidyl)底物转化率(S-2238；100μM)。IC50浓度通过使用Graphpad Prism软件套装通过非线性回归对S-2238转化率(mOD/min)进行拟合获得。所有数据点均代表两个独立试验的平均值。区块F：底物转化率(速度)绘制为在不存在抑制剂的情况下的孵育速率。区块F中清楚地显示，各变体均显示比对照更高的归一化速度。
图7.直接凝血酶抑制剂达比加群对显色凝血酶活性的抑制-系列2。在增加浓度(20nM-20μM)的达比加群的存在下，5nM来源于血浆的凝血酶(‘IIa’；区块A)、重组凝血酶(‘r-IIa’；区块B)、重组凝血酶变体ALB(‘ALB’；区块C)、重组凝血酶变体KL10(‘KL10’；区块D)、或重组凝血酶变体ISO2(‘ISO2’；区块E)的肽基底物转化率(S-2238；100μM)。IC50浓度通过使用Graphpad Prism软件套装通过非线性回归对S-2238转化率(mOD/min)进行拟合获得。所有数据点均代表两个独立试验的平均值。区块F：底物转化率(速度)绘制为在不存在抑制剂的情况下的孵育速率。区块F中清楚地显示，各变体均显示比对照更高的归一化速度。
图8.与达比加群的复合物中凝血酶的晶体结构(PDB 1KTS)(Hauel等人，J MedChem 45：1757-1766(2002))。在棒状图中示出了活性位点残基His406、Asp462和Ser568以及达比加群相互作用残基Tyr410、Leu459、Ile542、Asp562、Trp590和Gly591。活性位点的S4次袋(subpocket)的位置通过椭圆形标记，并且指示残基Ile542。
图9.直接凝血酶抑制剂达比加群对显色凝血酶活性的抑制-系列3。在增加浓度(20nM-20μM)的达比加群的存在下，5nM来源于血浆的凝血酶(区块A)、重组凝血酶(区块B)、重组凝血酶变体I542F(区块C)、重组凝血酶变体I542A(区块D)、重组凝血酶变体I542E(区块E)、或重组凝血酶变体I542S(区块F)的肽基底物转化率(S-2238；100μM)。IC50浓度通过使用Graphpad Prism软件套装通过非线性回归对S-2238转化率(mOD/min)进行拟合获得。所有数据点均代表两个独立试验的平均值。
图10.归一化的直接凝血酶抑制剂达比加群对显色凝血酶活性的抑制。在增加浓度(20nM-20μM)的达比加群的存在下，5nM来源于血浆的凝血酶(‘IIa’)、重组凝血酶(‘r-IIa’)、重组凝血酶变体I542A、重组凝血酶变体I542E、重组凝血酶变体I542F、或重组凝血酶变体I542S的肽基底物转化率(S-2238；100μM)。底物转化率(速度)绘制为在不存在抑制剂的情况下的孵育速率。所有数据点均代表两个独立试验的平均值。清楚地显示，各变体均显示出比对照更高的归一化速度。
图11.人凝血酶原(‘凝血酶’，SEQ ID NO:1)中从Cys-536到Cys-550、人因子XI(‘FXIa’，SEQ ID NO:2)中从Cys-545到Cys-560、人胰蛋白酶-1(‘胰蛋白酶’，SEQ ID NO:3)中从Cys-171到Cys-185、以及人尿激酶类纤溶酶原激活物(‘uPA’，SEQ ID NO:4)中从Cys-345到Cys-361的氨基酸残基区域的排列。残基Ile-542(SEQ ID NO:1)、His-552(SEQ IDNO:2)、Gly-177(SEQ ID NO:3)、以及Ser-353(SEQ ID NO:4)突出显示。
表1
实施例
实施例1：材料和方法
材料：直接丝氨酸蛋白酶抑制剂从Alsachim和Adooq获得，玉米胰蛋白酶抑制剂来自Haematologic Technologies。FXI-缺失和凝血酶原-缺失的人血浆Neoplastin CI plus10以及TriniCLOT自动化的APTT从Diagnostica Stago获得。肽基底物S-2238、S-2366、S-2444和S-2222从Chromogenix获得。所有组织培养试剂均来自Life Technologies，除了胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(ITS)来自Roche。校准器和荧光底物(FluCa)来自Thrombinoscope BV。由75％(w/w)的鸡蛋L-磷脂酰胆碱和25％(w/w)的猪脑L-磷脂酰基丝氨酸(Avanti Polar Lipids)组成的小单层磷脂囊泡(PCPS)如前所述进行制备和表征(Higgins等人1983.J Biol Chem 258：6503-6508)。重组蛋白的一般生产技术和纯化技术如Green和Sambrook 2012年7月第4版的“Molecular Cloning”所述。
凝血酶的表达和纯化：使用LipofectAMINE 2000(Invitrogen)和pSV2neo作为可选择标记质粒，将编码凝血酶原变体A(在His-450与Asp-462之间具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的凝血酶原(SEQ ID NO:1))和B(在His-450与Asp-462之间具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的凝血酶原(SEQ ID NO:1))以及野生型凝血酶原的质粒(pcDNA3.1(+))引入HEK293细胞中。高表达克隆基本上如(Orcutt等人2004.J Biol Chem 279：54927-54936)所述基于凝血酶原特异性的ELISA和PT凝固试验进行选择。将所选克隆扩展为10-层细胞工厂(Nalge-Nunc，Naperville，IL)，并在用5μg/ml ITS和10μg/ml维生素K补充的Dulbecco改良的伊格尔培养基/F-12培养基中培养。经调整的培养基收集5-6天，离心，并在1mM苯甲脒的存在下在-20℃下储存。凝血酶原基本上如(Orcutt等人2004.J Biol Chem 279：54927-54936)所述采用Q-琼脂糖凝胶FF(GE Healthcare)、HQ POROS基质(AffinityBiologicals)、以及陶瓷羟基磷灰石基质(Bio-Rad)从经调整的培养基纯化。纯化的凝血酶原在-20℃下储存在含有50％vol/vol甘油的HBS中。蛋白纯度在还原条件下使用预制的4-12％梯度凝胶(Invitrogen)通过SDS-PAGE进行评估，接着用考马斯亮蓝R-250染色。在如(Lundblad等人，1976.Methods Enzymol 45：156-176)所述对凝血酶原进行预备活化之后对凝血酶进行纯化。
FXI的表达和纯化：使用LipofectAMINE 2000(Invitrogen)和pSV2neo作为可选择标记质粒，将编码FXI变体A(在His-469与Asp-480之间具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的FXI(SEQ ID NO:2))和B(在His-469与Asp-480之间具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的FXI(SEQ ID NO:2))以及野生型FXI的质粒(pcDNA3.1(+))引入乳仓鼠肾(BHK)细胞中，所述质粒(pcDNA3.1(+))通过其C-端与HPC4-抗体识别序列(氨基酸序列EDQVDPRLIDGK)融合以促进纯化。高表达克隆基本上如(Toso等人2004.J Biol Chem 279：21643-21650)针对因子V所述基于FXI-特异性ELISA和APTT凝固试验进行选择。所选克隆扩展到三口烧瓶(tripleflasks)(Nalge-Nunc，Naperville，IL)中，并在用5μg/ml ITS和1.0mg/ml Albumax(Invitrogen)补充的Dulbecco改良的伊格尔培养基/F-12培养基中培养。经调整的培养基收集5-6天，离心，并在1mM苯甲脒的存在下在-20℃下储存。经调整的培养基在37℃下解冻，合并，并加载到经pH 7.4的25mM Tris、0.05M NaCl、5mM CaCl2平衡的抗-HPC4琼脂糖凝胶柱上。该柱用平衡缓冲液洗涤，然后用pH 7.4的25mM Tris、0.5M NaCl、5mM EDTA洗脱，接着用pH 7.4的25mM Tris、2M NaCl、5mM EDTA洗脱。将具有FXI活性的级分合并，对(针对，对抗，versus)通过超滤(Millipore)浓缩的pH 7.4的20mM Hepes、150mM NaCl透析，并将纯化蛋白在-80℃下储存。蛋白纯度在还原条件下使用预制的4-12％梯度凝胶(Invitrogen)通过SDS-PAGE进行评估，接着使用考马斯亮蓝R-250染色。在如(Ogawa等人，2005.J BiolChem 280：23523-23530)所述对FXI进行预备活化之后对因子XIa进行纯化。
尿激酶类纤溶酶原激活物(uPA)的表达和纯化：使用LipofectAMINE 2000(Invitrogen)和pSV2neo作为可选择标记质粒，将编码人uPA变体A(在His-262与Asp-275之间具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的uPA(SEQ ID NO:4))和B(在His-262与Asp-275之间具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的uPA(SEQ ID NO:4))以及野生型uPA的质粒(pcDNA3.1(+))引入哺乳动物细胞(HEK 293为BHK)中，所述质粒(pcDNA3.1(+))通过其C-端与HPC4-抗体识别序列(氨基酸序列EDQVDPRLIDGK)或与His-标签(6His：HHHHHH或12His：HHHHHHHHHHHH)融合以促进纯化。高表达克隆基于人uPA-特异性ELISA(R&D Systems)进行选择。将所选克隆扩展到三口烧瓶(triple flasks)(Nalge-Nunc，Naperville，IL)中，并在用5μg/ml ITS和1.0mg/ml Albumax(Invitrogen)补充的Dulbecco改良的伊格尔培养基/F-12培养基中培养。经调整的培养基收集5-6天，离心，并在1mM苯甲脒的存在下在-20℃下储存。
基本上如针对FXI变体所述将经调整的培养基在37℃下解冻，合并，并使用抗-HPC4琼脂糖凝胶纯化。可替代地，His标记的uPA变体使用固定化金属亲和色谱纯化。经纯化的蛋白在-80℃下储存，蛋白纯度在还原条件下使用预制的4-12％梯度凝胶(Invitrogen)通过SDS-PAGE进行评估，接着使用考马斯亮蓝R-250染色。uPA变体通过人纤溶酶活化，并采用苯甲脒-琼脂糖凝胶纯化。
胰蛋白酶的表达和纯化：使用LipofectAMINE 2000(Invitrogen)和pSV2neo作为可选择标记质粒，将编码人胰蛋白酶原-1变体A(在His-96与Asp-107之间具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的胰蛋白酶(SEQ ID NO:3))和B(在His-96与Asp-107之间具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的胰蛋白酶(SEQ ID NO:3))以及野生型胰蛋白酶(SEQ ID NO:3)的质粒(pcDNA3.1(+))引入HEK 293细胞中，在所述质粒(pcDNA3.1(+))中前导序列被修饰为其缺乏胰蛋白酶类酶切割位点(参见专利EP 1141263A1)，并通过其C-端与HPC4-抗体识别序列(氨基酸序列EDQVDPRLIDGK)或与His-标签(6His：HHHHHH或12His：HHHHHHHHHHHH)融合以促进纯化。高表达克隆基于人胰蛋白酶原-特异性ELISA(MyBioSource)进行选择。所选克隆扩展到三口烧瓶(triple flasks)(Nalge-Nunc，Naperville，IL)中，并在用5μg/ml ITS和1.0mg/ml Albumax(Invitrogen)补充的Dulbecco改良的伊格尔培养基/F-12培养基中培养。经调整的培养基收集5-6天，离心，并在1mM苯甲脒的存在下在-20℃下储存。
基本上如针对FXI变体所述将经调整的培养基在37℃下解冻，合并，并使用抗-HPC4琼脂糖凝胶纯化。可替代地，His标记的胰蛋白酶原变体使用固定化金属亲和色谱纯化。纯化蛋白在-80℃下储存，蛋白纯度在还原条件下使用预制的4-12％梯度凝胶(Invitrogen)通过SDS-PAGE进行评估，接着使用考马斯亮蓝R-250染色。胰蛋白酶-1变体通过对胰蛋白酶原-1变体进行肠激酶-依赖性切割来制备，并采用SP-或苯甲脒-琼脂糖凝胶纯化。
实施例2：直接丝氨酸蛋白酶抑制剂对丝氨酸蛋白酶的抑制。起初，肽基底物水解的动力学(S-2388、S-2366、S-2444或S-2222分别作为凝血酶、FXIa、尿激酶类纤溶酶原激活物或胰蛋白酶的特异性底物)在上述凝血酶、FXIa、尿激酶类纤溶酶原激活物或胰蛋白酶变体和野生型的存在下使用增加浓度的底物(10-500μM)测量。直接丝氨酸蛋白酶抑制剂结合并抑制丝氨酸蛋白酶的能力通过评估采用典型竞争性抑制的抑制常数(Ki)来测试，所述评估通过在固定的肽基底物(在Km或在Km以上)和酶的浓度下使用增加浓度的直接抑制剂(1nM-10μM)对肽基底物的水解初始速度进行测量来进行。所有动力学测量均在pH 7.5的20mM Hepes、0.15M NaCl、0.1％(w/v)聚乙二醇8000、2mM CaCl2中进行。
实施例3：凝血酶的产生试验。凝血酶的产生从以前所述的方案(Hemker等人，2003.Pathophysiol Haemost Thromb 33：4-15)修改。简要地讲，凝血酶的产生曲线通过用玉米胰蛋白酶抑制剂(70μg/ml)、PCPS(20μM)和底物缓冲液(Fluca)补充缺少凝血酶原的或缺少FXI的血浆获得。凝血酶的形成通过添加1单位(特异性凝固活性)的凝血酶A变体或B变体、FXIa A变体或B变体、以及野生型凝血酶或FXIa(其预先与直接丝氨酸蛋白酶抑制剂混合)启动。在可替代的设置中，对蛋白变体的酶原形式进行评估。为了这么做，凝血酶原-缺失的或FXI-缺失的血浆分别用组织因子(TF(Innovin)，最终为2或20pM)、玉米胰蛋白酶抑制剂(70μg/ml)、PCPS(20μM)、直接抑制剂、以及1单位(特异性凝固活性)的重组凝血酶原或FXI变体补充。凝血酶的形成通过将Fluca添加到血浆中启动。使用Thrombinoscope软件(Thrombinoscope BV)在30分钟内每20秒对凝血酶的形成进行测定，并为校准器进行校正。延迟时间、平均内源性凝血酶潜能(凝血酶产生曲线下的面积)、达到峰值的时间、以及凝血酶的产生峰值从至少3次单独的试验计算。
实施例4：尿激酶类纤溶酶原激活物变体的凝块溶解时间评估。凝块溶解时间基本上如前所述进行评估(Mosnier等人，2001.Thromb Haemost 86：1035-1039)。简要地讲，组织因子(TF，Innovin)和PCPS在pH 7.4的25mM Hepes、137mM NaCl、3.5mM KCl、0.1％BSA中在37℃下孵育1小时。TF/PCPS混合物(最终为0.5pM/20μM)用血浆(50％v/v)、tPA(最终为150U/ml)、以及CTI(最终为70μg/ml)在37℃下孵育10分钟。凝血用37℃下预孵育的Ca2+(最终为17mM)启动。通过在SpectraMax M2e酶标仪中在37℃下测量405nm处的吸光度对凝块的形成和随后的溶解监控4小时。凝块溶解时间定义为清澈转变为浑浊的平均值到浑浊转变为清澈的平均值，其通过使用Graphpad Prism 5对浑浊度曲线进行S拟合来确定。
实施例5：在SEQ ID NO:1的区域His450-Asp462中具有插入的重组凝血酶原。
材料和方法
直接凝血酶抑制剂达比加群从Alsachim(法国)获得。来源于血浆的人凝血酶原、来源于血浆的人凝血酶(α-凝血酶，IIa)、来源于血浆的人因子Xa、来源于血浆的人因子Va、以及凝血酶抑制剂丹磺酰基精氨酸(dansylarginine)N-(3-乙基-1,5-戊烷二基)酰胺(DAPA)来自Haematologic Technologies。凝血酶原-缺失的人血浆和凝血酶原时间凝固试验试剂STA-Neoplastine CI plus 10从Diagnostica Stago获得。肽基底物S-2238从(Instrumentation Laboratory)获得。所有组织培养试剂均来自LifeTechnologies(Thermo Fisher Scientific)，除了胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(ITS)来自Roche。重组蛋白的一般生产技术和纯化技术如Green和Sambrook 2012年7月第4版的“Molecular Cloning”所述。由75％(w/w)的鸡蛋L-磷脂酰胆碱和25％(w/w)的猪脑L-磷脂酰基丝氨酸(Avanti Polar Lipids，Inc.，美国)组成的小单层磷脂囊泡(PCPS)如之前所述进行制备和表征(Higgins等人，J Biol Chem 258：6503-6508(1983))。
使用LipofectAMINE(Invitrogen)将编码野生型凝血酶原(SEQ ID NO:1)以及在His-450与Asp-462之间具有(i)SEQ ID NO:5(凝血酶原ISO1，来源于东部拟眼镜蛇同种型因子X中的同源区)、(ii)SEQ ID NO:13(凝血酶原ISO2)、(iii)SEQ ID NO:14(凝血酶原NSC，来源于澳洲虎蛇毒液因子X中的同源区)、(iv)SEQ ID NO:15(凝血酶原KL10，来源于人激肽释放酶10中的同源区)、或者(v)SEQ ID NO:16(凝血酶原ALB，来源于人白蛋白)的氨基酸序列的凝血酶原变体的质粒(pcDNA3.1(+))引入HEK 293细胞中。高表达克隆基本上如Orcutt等人，J Biol Chem，279：54927-54936(2004)所述基于凝血酶原特异性的ELISA和凝血酶原-时间凝固试验进行选择。所选克隆扩展到175cm2的烧瓶中，并在用5μg/ml ITS和10μg/ml维生素K补充的Dulbecco改良的伊格尔培养基/F-12培养基中培养。经调整的培养基收集24小时，使用30kDa旋转的过滤器浓缩到pH 7.5的HEPES-缓冲的盐水中，并在-20℃下储存在50％vol/vol的甘油中。凝血酶原抗原浓度使用用来检测凝血酶原的成对抗体ELISA(CL20111K，Cedarlane Laboratories)来测定。凝血酶原活性采用已知浓度的凝血酶原作为标准使用凝血酶原特异性的一阶段凝血酶原时间凝固试验使用缺乏凝血酶原的血浆中的STA-Neoplastin CI plus 10试剂来测定。比活性(U/mg)从凝血酶原活性(U/ml)与凝血酶原抗原浓度(mg/ml)的比例推导出。
直接凝血酶抑制剂达比加群对凝血酶的抑制
通过在5分钟内在环境温度下在10μM DAPA的存在下使用凝血酶原酶(1nM因子Xa、50nM因子Va、50μM PCPS、5mM钙)孵育将以上段落中所述的来源于血浆的凝血酶原(Haematologic Technologies)或重组野生型凝血酶原或重组凝血酶原变体(ISO1、ISO2、NSC、KL10和ALB)(125nM)活化为凝血酶。随后将样品在EDTA(最终为25mM)中淬灭，并在含有pH 7.5的EDTA(50mM)、NaCl(150mM)、0.1％PEG8000和HEPES(20mM)的缓冲液中稀释到5nM(最终)。直接凝血酶抑制剂达比加群结合并抑制活化的来源于血浆的凝血酶原(pd-IIa)或重组的活化的凝血酶原(r-IIa)或重组的活化的凝血酶原变体的能力通过对半最大抑制浓度(IC50)进行评估来测试，所述评估通过在固定的S-2238浓度下(100μM)使用增加浓度的达比加群(20nM-20μM)测量肽基底物S-2238的水解初始速度来进行。对肽基底物的残留显色活性在10分钟内在设在A405nm的酶标仪(SpectraMax M2e，Molecular Devices)中测定。IC50浓度通过使用Graphpad Prism 6软件套装通过非线性回归对S-2238转化率(mOD/min)进行拟合获得。使用来源于血浆的凝血酶(IIa，Haematologic Technologies)作为对照进行同样的试验。
结果
这些试验的结果在表2以及图6和图7中示出。从所有这些结果可以看出，在所声称的凝血酶原的氨基酸残基区域中的插入提供对诸如达比加群的直接凝血酶抑制剂的去敏作用，同时仍具有凝固可能性或促凝作用。
表2
表2示出了不同凝血酶原变体的特征。来源于血浆的凝血酶表示为IIa，重组野生型凝血酶表示为r-IIa。从使用凝血酶原特异性的一阶段凝血酶原-时间凝固试验测定的凝血酶原活性(U/ml)与凝血酶原抗原浓度(mg/ml)的比例推导出比活性(U/mg)。显色活性的百分比(％)表明与纯化的来源于血浆的凝血酶的标准曲线相关的每种凝血酶原变体的S-2238转化率。半最大抑制浓度(IC50)显示抑制50％的5nM凝血酶变体的显色活性需要的达比加群的浓度。
实施例6.在SEQ ID NO:1的位置Ile-542处具有氨基酸残基替换或取代的重组凝血酶原。
材料和方法
直接凝血酶抑制剂达比加群从Alsachim(法国)获得。来源于血浆的人凝血酶原、来源于血浆的人凝血酶(α-凝血酶，IIa)、来源于血浆的人因子Xa、来源于血浆的人因子Va、以及凝血酶抑制剂丹磺酰基精氨酸N-(3-乙基-1,5-戊烷二基)酰胺(DAPA)来自Haematologic Technologies。凝血酶原-缺失的人血浆和凝血酶原时间凝固试验试剂STA-Neoplastine CI plus 10从Diagnostica Stago获得。肽基底物S-2238从(Instrumentation Laboratory)获得。所有组织培养试剂均来自Life Technologies(Thermo Fisher Scientific)，除了来自Roche的胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(ITS)。重组蛋白的一般生产技术和纯化技术如Green和Sambrook 2012年7月第4版的“MolecularCloning”中所述。由75％(w/w)的鸡蛋L-磷脂酰胆碱和25％(w/w)的猪脑L-磷脂酰基丝氨酸(Avanti Polar Lipids，Inc.，美国)组成的小单层磷脂囊泡(PCPS)如之前所述进行制备和表征(Higgins等人，J Biol Chem 258：6503-6508(1983))。
使用LipofectAMINE(Invitrogen)将编码野生型凝血酶原(SEQ ID NO:1)和凝血酶原变体(其中位于SEQ ID NO:1的氨基酸残基位置542处的异亮胺酸被丙氨酸(I542A，无侧链)、丝氨酸(I542S，小侧链)、苯丙氨酸(I542F，巨大的大体积侧链)、或谷氨酸(I542E，带电荷的侧链)替换)的质粒(pcDNA3.1(+))引入HEK 293细胞中。高表达克隆基本上如Orcutt等人，J Biol Chem，279：54927-54936(2004)所述基于凝血酶原特异性的ELISA和凝血酶原-时间凝固试验进行选择。所选克隆扩展到175cm2的烧瓶中，并在用5μg/ml ITS和10μg/ml维生素K补充的Dulbecco改良的伊格尔培养基/F-12培养基中培养。经调整的培养基收集24小时，使用30kDa旋转的过滤器浓缩到pH 7.5的HEPES-缓冲的盐水中，并在-20℃下储存在50％vol/vol的甘油中。凝血酶原抗原浓度使用用来检测凝血酶原的成对抗体ELISA(CL20111K，Cedarlane Laboratories)测定。凝血酶原活性采用已知浓度的凝血酶原作为标准使用凝血酶原特异性的一阶段凝血酶原时间凝固试验使用缺乏凝血酶原的血浆中的STA-Neoplastin CI plus 10试剂测定。从凝血酶原活性(U/ml)与凝血酶原抗原浓度(mg/ml)的比例推导出比活性(U/mg)。
直接凝血酶抑制剂达比加群对凝血酶的抑制
通过在5分钟内在环境温度下在10μM DAPA的存在下使用凝血酶原酶(1nM因子Xa、50nM因子Va、50μM PCPS、5mM钙)孵育将重组野生型凝血酶原或重组凝血酶原变体(I542S、I542A、I542F和I542E)(125nM)活化为凝血酶。随后将样品在EDTA(最终为25mM)中淬灭，并在含有pH 7.5的EDTA(50mM)、NaCl(150mM)、0.1％PEG8000和HEPES(20mM)的缓冲液中稀释到最终为5nM。直接凝血酶抑制剂达比加群结合并抑制重组的活化的凝血酶原(r-IIa)或重组的活化的凝血酶原变体的能力通过对半最大抑制浓度(IC50)进行评估来测试，所述评估通过在固定的S-2238浓度下(100μM)使用增加浓度的直接抑制剂(20nM-20μM)测量肽基底物S-2238的水解初始速度来进行。对肽基底物的残留显色活性在10分钟内在设在A405nm的酶标仪(SpectraMax M2e，Molecular Devices)中测定。IC50浓度通过使用Graphpad Prism6软件套装通过非线性回归对S-2238转化率(mOD/min)进行拟合来获得。使用来源于血浆的凝血酶(IIa，Haematologic Technologies)作为对照进行相同的试验。
结果
这些试验的结果在表3以及图9和图10中示出。从所有这些结果可以看出，在SEQID NO:1的氨基酸残基位置Ile-542进行替换、取代或突变会提供对诸如达比加群的直接凝血酶抑制剂的去敏作用，同时仍具有凝固可能性或促凝作用。
表3.
表3示出了凝血酶原变体的特征。来源于血浆的凝血酶表示为IIa，重组野生型凝血酶表示为r-IIa。比活性(U/mg)由凝血酶原活性(U/ml)与凝血酶原抗原浓度(mg/ml)的比例推导出，所述凝血酶原活性使用凝血酶原特异性的一阶段凝血酶原-时间凝固试验确定。显色活性的百分比(％)表明与纯化的来源于血浆的凝血酶的标准曲线相关的每种凝血酶原变体的S-2238转化率。半最大抑制浓度(IC50)显示抑制50％的5nM凝血酶变体的显色活性需要的达比加群的浓度。
Claims (21)
1.一种重组蛋白，包括丝氨酸蛋白酶，所述丝氨酸蛋白酶在外表面肽结构中包括至少一个氨基酸残基的插入；其中所述丝氨酸蛋白酶多肽不是凝血因子X多肽或者其天然加工或活化形式。
2.根据权利要求1所述的蛋白，其中所述肽结构是对应于SEQ ID NO:1的His-450与Asp-462之间的氨基酸残基区域的氨基酸残基区域。
3.根据权利要求1所述的蛋白，其中所述丝氨酸蛋白酶选自凝血酶、凝血因子XIa、胰蛋白酶和尿激酶类纤溶酶原激活物；并且其中所述肽结构是：
凝血酶的SEQ ID NO:1的Gly-427与Asp-462之间、优选His-450与Asp-462之间、更优选His-450与Leu-459之间的氨基酸残基区域；
凝血因子XIa的SEQ ID NO:2的Val-463与Asp-480之间、优选His-469与Asp-480或Ser-477之间的氨基酸残基区域；
胰蛋白酶的SEQ ID NO:3的Leu-73与Asp-107之间，优选His-96与Asp-107或Leu-104之间的氨基酸残基区域；
尿激酶类纤溶酶原激活物的SEQ ID NO:4的Val-237与Asp-275之间、优选His-262与Asp-275或Asn-274之间的氨基酸残基区域。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的蛋白，其中所述插入包括1-50个、优选1-20个氨基酸残基。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的蛋白，其中所述插入包括4至50个、优选4至20个氨基酸残基。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的蛋白，其中在所述区域中所述至少一个氨基酸残基的插入与至少5个氨基酸残基的替换相结合。
7.根据权利要求2-6中任一项所述的蛋白，其中所述区域在插入和/或替换之后具有以下氨基酸序列：
SEQ ID NO:1的His-450与Asp-462之间的SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16；
SEQ ID NO:2的His-469与Asp-480之间的SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8；
SEQ ID NO:3的His-96与Asp-107之间的SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10；
和/或SEQ ID NO:4的His-262与Asp-275之间的SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12。
8.一种重组蛋白，包括丝氨酸蛋白酶多肽，所述丝氨酸蛋白酶多肽在对应于SEQ IDNO:1的Ile-542的氨基酸残基位置上具有氨基酸残基替换，其中所述丝氨酸蛋白酶多肽不是凝血因子X多肽或者其天然加工或活化形式。
9.一种核酸分子，包括编码根据权利要求1-8中任一项所述的蛋白的DNA序列。
10.一种表达载体，包括根据权利要求9所述的核酸分子。
11.一种宿主细胞，包括根据权利要求9所述的核酸分子或根据权利要求10所述的表达载体。
12.一种药物组合物，包括根据权利要求1-8中任一项所述的蛋白和药用载体。
13.根据权利要求1-8中任一项所述的蛋白或根据权利要求12所述的药物组合物，用作药物。
14.根据权利要求1-8中任一项所述的蛋白或根据权利要求12所述的药物组合物，用于在受试者中逆转凝血抑制剂的抗凝血作用的方法中使用，其中所述蛋白包括凝血酶或凝血因子XIa。
15.一种在受试者中逆转凝血抑制剂的抗凝血作用的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的以下各项：
根据权利要求1-8中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白包括凝血酶或凝血因子XIa，或者
根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述药物组合物包括含有凝血酶或凝血因子XIa的蛋白。
16.根据权利要求1-8中任一项所述的蛋白用于制备用于在受试者中逆转凝血抑制剂的抗凝血作用的药物的用途，其中所述蛋白包括凝血酶或凝血因子XIa。
17.根据权利要求1-8中任一项所述的蛋白或根据权利要求12所述的药物组合物，用于在受试者中逆转胰蛋白酶抑制剂的肽键水解抑制的方法中使用，其中所述蛋白包括胰蛋白酶，其中所述药物组合物包括胰蛋白酶。
18.一种在受试者中逆转胰蛋白酶抑制剂的肽键水解抑制的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-8中任一项所述的蛋白或根据权利要求12所述的药物组合物，其中所述蛋白包括胰蛋白酶，其中所述药物组合物包括含有胰蛋白酶的蛋白。
19.根据权利要求1-8中任一项所述的蛋白用于制备用于在受试者中逆转胰蛋白酶抑制剂的肽键水解抑制的药物的用途，其中所述蛋白包括胰蛋白酶。
20.根据权利要求1-8中任一项所述的蛋白在逆转胰蛋白酶抑制剂的肽键水解抑制中的非治疗用途，其中所述蛋白包括胰蛋白酶。
21.根据权利要求1-8中任一项所述的蛋白或根据权利要求12所述的药物组合物，用于在受试者中完全或部分逆转抗纤维蛋白溶解作用中使用，其中所述蛋白包括尿激酶类纤溶酶原激活物。
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