CN105025913A

CN105025913A - 短效因子vii多肽

Info

Publication number: CN105025913A
Application number: CN201380073743.5A
Authority: CN
Inventors: M.鲍宗; T.赫米斯顿
Original assignee: Bayer Corp
Current assignee: Bayer Healthcare LLC; Bayer Corp
Priority date: 2012-12-24
Filing date: 2013-12-23
Publication date: 2015-11-04
Also published as: TW202026309A; NZ749488A; DK2938351T3; US20230295596A1; EP2938351B8; SG10201710593UA; BR112015015182A2; KR102047235B1; CA3185756A1; ES2746116T3; TW201431876A; EP2938351A4; PE20151206A1; ES2936485T3; PL3572090T3; JP6363677B2; US20140363419A1; BR112015015182B1; US20160376578A1; MX2015007712A

Abstract

本发明公开了短效因子VII肽。缩短的半衰期是急性出血和类似障碍的治疗所期望的。因子VII及其变体的唾液酸化和/或糖基化的修饰产生了可用于治疗急性出血病症的肽。本文中提供了人凝固因子VII变体和编码这样的变体的多核苷酸，包含和表达这样的变体的载体和宿主细胞，得到这样的变体的方法，使用这样的变体的方法，所述变体的组合物，和与之相关的其他发明特征。

Description

短效因子VII多肽

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年12月24日提交的美国申请序号61/745,674和2013年3月15日提交的美国申请序号61/787,026的优先权，它们在此通过引用整体并入。

技术领域

本文中提供了人凝固因子VII变体和编码这样的变体的多核苷酸，包含和表达这样的变体的载体和宿主细胞，得到这样的变体的方法，使用这样的变体的方法，所述变体的组合物，和与之相关的额外发明特征。

背景技术

血液凝固是由各种血液组分(或因子)的复杂相互作用组成的过程，所述复杂相互作用最终产生纤维蛋白凝块。通常，参与已被称为凝固“级联”的血液组分是在酶促方面失活的蛋白质(前酶或酶原)，其通过活化剂(其自身是活化的凝固因子)的作用而转化成蛋白水解酶。已经经历这样的转化的凝固因子一般被称为“活性因子”，并且通过向凝固因子的名称添加字母“a”来命名(例如，因子VIIa)。

止血过程的开始由组织因子(其在血管壁损伤以后暴露于循环血液)和因子VIIa(其以对应于总因子VII蛋白质量的约1%的量存在于循环中)之间的复合物的形成介导。该复合物锚定至带有组织因子的细胞并在细胞表面上将因子IX和X转化成它们的活性形式因子IXa和因子Xa。因子Xa在带有组织因子的细胞上将凝血酶原转化成凝血酶，所述凝血酶活化因子VIII、因子V、因子XI和因子XIII。此外，在止血的该初始步骤中形成的有限量的凝血酶也活化血小板。在凝血酶作用于血小板以后，血小板改变形状并将带电荷的磷脂暴露在它们的表面上。该活化的血小板表面形成其它因子X活化和完整凝血酶产生的模板。在活化的血小板表面上的其它因子X活化经由在活化的血小板的表面上形成的因子IXa和因子VIIIa复合物而发生，且因子Xa然后将凝血酶原转化成凝血酶，同时仍然在表面上。凝血酶然后将纤维蛋白原转化成纤维蛋白，所述纤维蛋白是不溶性的且稳定化最初的血小板栓。该过程定位至组织因子暴露部位，由此使凝固系统的全身活化的风险最小化。近年来，已经发现因子VII和组织因子是血液凝固的主要引发剂。

因子VIIa从它的前体因子VII产生，所述因子VII是在肝脏中合成并分泌进血液中，它在血液中作为单链糖蛋白(约50,000 Da的分子量)进行循环。本文中使用的野生型因子VII具有在图1和2中公开的氨基酸序列和核苷酸序列。术语“因子VII”意在包括处于它们的未切割形式(酶原形式)的因子VII多肽以及已经蛋白水解地或以其它方式加工以产生它们各自的生物活性形式(其可以被称作因子VIIa)的那些。野生型因子VII通常在残基152和153之间被切割以产生因子VIIa。

因子VII在体外被因子Xa、因子XIIa、因子IXa或凝血酶转化成双链形式因子VIIa。象参与止血的几种其它血浆蛋白一样，因子VII的活性依赖于维生素K，其是簇集在该蛋白的氨基端附近的多个谷氨酸残基的γ-羧基化所必需的。这些γ-羧化的谷氨酸是金属离子诱导的因子VII与磷脂的相互作用所必需的。在有组织因子、磷脂和钙离子存在下，双链因子VIIa通过有限的蛋白酶解快速地活化因子X或因子IX。因子VIIa易于发生蛋白水解性裂解，从而产生许多不具有凝固活性的降解产物。

已经公开了因子VII变体，其具有通过一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入而从野生型因子VII衍生出的氨基酸序列。例如，Dickinson等人(Proc. Natl. Acad. Sci USA (1996) 93, 14379-14384)涉及因子VII变体，其中Lys157、Val158、Glu296、Met298、Asp334、Ser336或Lys227已经个别地被Ala替换。Iwanaga等人(Thromb. Haemost. (1999年8月增刊), 466, 摘要1474)涉及因子VIIa变体，其中残基316-320缺失或残基311-322被得自胰蛋白酶的对应残基替换。Bolt等人的美国专利申请公开2008/0058255 A1涉及在N145或N322处、或者在N145和N322二者处具有破坏糖基化的取代的因子VII变体。Toso等人报道了一系列基于天然存在的突变的因子VII结构-功能研究。突变体重组因子VII蛋白包括T324M、E385K和两种在因子VII重链(N322Q)或因子VII轻链(N145Q)中缺少糖基化核心序列的突变体因子VII蛋白。Toso等人, “Lack of Heavy Chain Glycosylation in Patient with Factor VII Deficiency Not Responsible for Mutant FVIIa Activity,”Blood, 第96卷, 第11期, 第2部分(2000年11月16日), 第79b页(美国血液学会第42届年会(42^nd Annual Meeting of the American Society of Hematology))。

大多数天然存在的肽和蛋白含有碳水化合物部分，所述碳水化合物部分沿着肽或蛋白主链的长度经由与选定数目的氨基酸的特定键而连接至所述肽或蛋白。因而，许多天然存在的肽和蛋白分别被称作“糖肽”或“糖蛋白”。在任何给定的肽或蛋白上的糖基化模式的变异性可以影响该肽或蛋白的功能。例如，在肽或蛋白上的N-连接的聚糖的结构可以影响肽或蛋白的多种特征，包括蛋白酶易感性、细胞内运输、分泌、组织靶向、生物半衰期以及所述肽或蛋白在细胞或生物体中的抗原性。这些特征中的一种或多种的改变可以影响肽或蛋白在它的天然场合中的效力，且也可以影响肽或蛋白作为治疗剂的效力(在所述肽或蛋白已经为该目的而制备的情况下)。

与肽或蛋白链连接的碳水化合物结构被称作“聚糖”分子。存在于肽或蛋白上的具体聚糖结构影响肽或蛋白的可溶性和聚集特征、肽或蛋白主链的折叠，且因此影响它的功能或酶活性、肽或蛋白对蛋白水解性攻击的抵抗力、以及导致无活性形式的肽或蛋白向活性形式的转化的蛋白酶解的控制。例如，存在于聚糖分子上的末端唾液酸残基影响肽或蛋白在哺乳动物循环系统中的半衰期的长度。其聚糖不含有末端唾液酸残基的肽和蛋白通常被肝脏更快速地从循环中除去。

在天然存在的糖肽和糖蛋白中发现的聚糖结构通常分成两类：N-连接的聚糖和O-连接的聚糖。野生型因子VIIa含有两个N-连接的糖基化位点和两个O-连接的糖基化位点。N-连接的糖基化是在真核生物中最常见的共价修饰。N-连接的糖基化发生在共有序列Asn-X-Ser/Thr处，在该处聚糖连接至天冬酰胺的胺基，且X代表除了脯氨酸以外的任何氨基酸。N-连接的聚糖是基于共同核心戊糖Man₃(GlcNAc)₂，其可以通过添加单糖(诸如N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖、神经氨酸、N-乙酰基葡糖胺、果糖、甘露糖和岩藻糖)而进一步修饰。具有不同单糖(包括末端唾液酸)的Man₃(GlcNAc)₂核心可以经由N-乙酰基葡糖胺连接在Asn-X-Ser/Thr共有序列的Asn处。该化学上复杂的共翻译修饰用于多个目的，并以多种方式(包括适当折叠、官能团取向和清除率)影响蛋白的生物学。

在本领域中已经提出了多种定制肽或蛋白的糖基化模式的方法，包括在DeFrees等人的美国专利号8,008,252中描述的那些。

经常期望，刺激或提高受试者中的凝固级联。已经使用因子VIIa来控制由凝固因子缺乏(例如，A和B型血友病，或凝固因子XI或VII的缺乏)或凝固因子抑制剂造成的出血障碍。重组因子VIIa(由Novo Nordisk在商业名称NovoSeven^®下制造和销售)被批准用于治疗具有因子VIII或因子IX的抑制剂的A或B型血友病患者中和具有获得性血友病的患者中的出血发作；预防具有因子VIII或因子IX的抑制剂的A或B型血友病患者中和具有获得性血友病的患者中在外科手术干预或侵入性手术中的出血；治疗具有先天性因子VII缺乏的患者中的出血发作和预防具有先天性因子VII缺乏的患者中在外科手术干预或侵入性手术中的出血。Hedner的美国专利号5,180,583公开了使用因子VIIa来控制并非由凝固因子缺陷或凝固因子抑制剂造成的情形下的过度出血。Hedner公开了治疗例如由缺陷性血小板功能、血小板减少症或冯威里氏病造成的出血障碍和用于那些用途的组合物。

需要治疗并非由先天性的或发展的凝固因子缺乏或凝固因子抑制剂引起的障碍的出血。几个临床试验已经证实了重组因子VIIa用于控制出血的效力。但是，存在关于使用该分子引起的不希望的血栓栓塞性事件的增加的担忧。出血在许多障碍中是一个重大问题，诸如关于外科手术、外科手术以后的并发症、干(stem)和器官移植物、颅内出血、主动脉瘤和创伤或某些抗凝剂的剂量过量。

发明内容

一个目的是用短效的因子VII多肽治疗出血障碍和发作。本工作的一个目的是，提供短效的因子VII多肽(野生型或变体)的组合物，其特征在于一个或多个药代动力学特性，诸如缩短的半衰期。一个目的是提供这样的因子VII分子，其在靶位和治疗时间范围以外具有减小的血栓性事件的机会。一个目的是提供由于改变的糖基化模式而具有增强的清除率的因子VII多肽(野生型或变体)。

本文描述了变体因子VII多肽的组合物，其中所述变体因子VII多肽包含与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列相比具有至少2个序列改变的氨基酸序列，其中所述至少2个序列改变是(1) 谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，和(2) 谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基；且其中所述组合物中缀合的唾液酸的摩尔数与N-连接的聚糖的摩尔数的比率小于0.05、小于0.1、小于1.0、小于2.0、小于3.0、小于4.0、小于5.0或小于6.0。本文还描述了变体因子VII多肽的组合物，其中所述变体因子VII多肽包含与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列相比具有至少2个序列改变的氨基酸序列，其中所述至少2个序列改变是(1)谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，和(2)谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基；且其中缀合的唾液酸的摩尔数与N-连接的聚糖的摩尔数的比率是在选自以下的范围内：(1) 0-5；(2) 0-4；(3) 0-3；(4) 0-2；(5) 0-1和(6) 0-0.5。

本文还描述了一种分离的变体因子VII多肽，其包含与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列相比具有至少2个序列改变的氨基酸序列，其中所述至少2个序列改变是(1) 谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，和(2) 谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，其中所述多肽具有小于0.05、小于0.1、小于1.0、小于2.0、小于3.0、小于4.0、小于5.0或小于6.0的缀合的唾液酸的摩尔数与N-连接的聚糖的摩尔数的比率。本文还描述了因子VII多肽的组合物，其中所述因子VII多肽包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列(野生型因子VII)且所述组合物中缀合的唾液酸的摩尔数与N-连接的聚糖的摩尔数的比率是在选自以下的范围内：(1) 1-5；(2) 1-4；(3) 1-3；(4) 1-2；和(5) 0.5-1；或缀合的唾液酸是不可检测的。

本文还描述了一种分离的变体因子VII多肽，其选自：

(1) 多肽，其包含与SEQ ID NO: 16的序列相比具有序列改变的因子VII氨基酸序列，其中所述序列改变由以下组成：(1) 谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，(2) 谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，和(3) 使得在位置145处的N-连接的糖基化被破坏的序列改变；

(2) 多肽，其包含与SEQ ID NO: 16的序列相比具有序列改变的因子VII氨基酸序列，其中所述序列改变由以下组成：(1) 谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，(2) 谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，和(3) 使得在位置322处的N-连接的糖基化被破坏的序列改变；

(3) 多肽，其包含与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列相比具有序列改变的因子VII氨基酸序列，其中所述序列改变由以下组成：(1) 谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，和(2) 谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，和(3) 使得在位置145和322处的N-连接的糖基化被破坏的序列改变；

(4) 多肽，其包含与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列相比具有序列改变的因子VII氨基酸序列，其中所述序列改变由以下组成：(1) 谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，和(2) 谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，其中位置145和322是天冬酰胺且具有连接的N-连接的糖基化；

(5) 多肽，其包含与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列相比具有序列改变的因子VII氨基酸序列，其中所述序列改变由以下组成：(1) 谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，(2) 谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，(3) 谷氨酸残基取代位置34的丙氨酸残基，(4) 谷氨酸残基取代位置36的精氨酸残基，和(5) 使得在位置145处的N-连接的糖基化被破坏的序列改变；

(6) 多肽，其包含与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列相比具有序列改变的因子VII氨基酸序列，其中所述序列改变由以下组成：(1) 谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，(2) 谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，(3) 谷氨酸残基取代位置34的丙氨酸残基，(4) 谷氨酸残基取代位置36的精氨酸残基，和(5) 使得在位置322处的N-连接的糖基化被破坏的序列改变；

(7) 多肽，其包含与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列相比具有序列改变的因子VII氨基酸序列，其中所述序列改变由以下组成：(1) 谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，(2) 谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，(3) 谷氨酸残基取代位置34的丙氨酸残基，(4) 谷氨酸残基取代位置36的精氨酸残基，和(5) 使得在位置145和322处的N-连接的糖基化被破坏的序列改变；和

(8) 多肽，其包含与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列相比具有序列改变的因子VII氨基酸序列，其中所述序列改变由以下组成：(1) 谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，(2) 谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，(3) 谷氨酸残基取代位置34的丙氨酸残基，和(4) 谷氨酸残基取代位置36的精氨酸残基，其中位置145和322是天冬酰胺且具有连接的N-连接的糖基化。

本文还描述了具有减少的唾液酸与因子VII多肽的缀合的因子VII多肽。在某些实施例中，所述因子VII多肽是产生改变的糖基化模式的变体多肽。在其它实施例中，所述因子VII多肽是具有减少的唾液酸缀合的野生型因子VII多肽。在某些实施方案中，减少的唾液酸缀合可以通过用唾液酸酶处理多肽来实现。在其它实施方案中，减少的唾液酸缀合可以如下实现：在部分地或完全地缺乏肽的唾液酸化的细胞系中生产重组因子VII多肽。在其它实施方案中，减少的唾液酸缀合可以如下实现：在细胞系中共表达重组因子VII多肽和重组的或外源的唾液酸酶。

还描述了一种用于治疗患有需要血块形成的疾病或障碍的哺乳动物的方法，所述方法包括：给有此需要的哺乳动物施用有效量的具有减少的唾液酸缀合的因子VII多肽。在某些实施方案中，缀合的唾液酸的摩尔数与N-连接的聚糖的摩尔数的比率小于0.05。在其它实施方案中，所述因子VII多肽包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述因子VII多肽包含野生型因子VII。在其它实施方案中，要治疗的疾病或障碍选自：出血、胃肠出血、失控的出血、经历移植或切除术或外科手术的哺乳动物中的出血、静脉曲张所致的出血、血小板减少症、血友病、颅内出血、主动脉瘤和抗凝血剂的过度施用。

在下面详细公开了其它变体、组合物、方法和有关的产品和工艺。

附图说明

图1A-1H显示了在本申请中使用的三种因子VII分子的核苷酸序列。“V1”是与SEQ ID NO: 16的野生型人氨基酸序列相比具有4个氨基酸突变的人因子VII变体：(P10Q、K32E、T106N和V253N)。“V2”是与SEQ ID NO: 16的野生型人氨基酸序列相比具有6个氨基酸突变的人因子VII变体：(P10Q、K32E、A34E、R36E、T106N和V253N)。图1还显示了在实施例中使用的各种构建体的核苷酸序列。

图2显示了在本申请中使用的三种因子VII分子的氨基酸序列。本文中使用的野生型人因子VII具有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列。V1具有SEQ ID NO: 17的氨基酸序列。V2具有SEQ ID NO: 18的氨基酸序列。在V1和V2中，SEQ ID NO: 16的野生型因子VII的变化以粗体显示。

图3的图示描绘了在本申请的实施例中使用的三种因子VII分子。显示了聚糖在N-糖基化位点处的连接。为了描述聚糖，实心框代表N-乙酰基葡糖胺，带阴影的椭圆形代表甘露糖，空心椭圆形代表半乳糖，黑色菱形代表唾液酸(也被称作N-乙酰基神经氨酸)，且封闭的三角形代表岩藻糖。用聚糖的一种可能变体描绘聚糖结构，且不代表实际测量的聚糖。

图4的图示描绘了N-连接的聚糖，其显示了在Asn-X-Ser/Thr共有序列中的Asn处的连接。显示了具有不同单糖(包括末端唾液酸)的Man₃(GlcNAc)₂核心。

图5的图示描绘了参考V2举例说明的在本公开内容中使用的两个方案，其用于减小因子VII变体的半衰期。

图6是低糖基化的因子VII分子的表格。

图7显示了根据实验条件去唾液酸化以后，用LC-MS方法鉴别在V2的重链上剩余的唾液酸的结果。

图8显示了去唾液酸化的V2的唾液酸含量分析。

图9显示了磷脂FX活化测定的结果。

图10显示了关于去唾液酸化的蛋白的PL-TGA测定的结果。

图11显示了低糖基化的因子VII变体的表达。

图12的表格显示了使用转染上清液确定低糖基化的FVII变体的“比活性”。

图13显示了关于纯化的低糖基化的变体pMB121的PL-TGA测定的结果。

图14显示了去唾液酸化的V2相对于野生型因子VII的体外肝细胞清除。

图15显示了使用因子VII变体的体外肝细胞清除的结果。低糖基化的变体在该模型中没有显示出清除的增加。该结果提示这些分子的清除机制不同于去唾液酸化的V2所利用的清除机制。

图16显示了在大鼠中的药代动力学研究结果。如通过因子VII ELISA所测得的，在Sprague Dawley大鼠中，去唾液酸化的V2和V1的半衰期显著低于它们的未修饰的母体分子。

图17显示了在HemA小鼠中的药代动力学研究结果。

图18显示了在HemA小鼠中的去唾液酸化的V2效力研究。

图19显示了在TVT HemA模型中的去唾液酸化的V2效力研究。

图20显示了与因子VII相比，用去唾液酸化的V2在HemA小鼠中制备凝血酶-抗凝血酶(“TAT”)的结果。

图21显示了在凝固活性的小鼠中的去唾液酸化的V2效力研究。

图22显示了与具有正常唾液酸缀合的野生型因子VII相比，去唾液酸化的野生型因子VII (dWT VIIa)的体外肝细胞清除。

图23显示了与野生型因子VII相比，在人组织因子敲入(knock-in)(TFKI)小鼠中关于dWT VIIa的尾巴切割研究结果。发现去唾液酸化的因子VII比野生型因子VII明显更有效。

图24显示了施用dWT VIIa或野生型因子VII以后，凝血酶-抗凝血酶(TAT)复合物的ELISA分析的结果。

图25显示了在FeCl₃血栓形成模型中血栓形成分析的结果。与野生型因子VII相比，给定剂量的dWT VIIa产生了极大减少的血栓形成。

图26显示了用发荧光的底物测得的，dWT VIIa和野生型因子VII对可溶性组织因子的表观结合亲合力。

图27显示了可溶性组织因子与dWT VIIa或野生型因子VII的复合物将因子X转化为因子Xa。

具体实施方式

本文描述了用于调节重组因子VII多肽(野生型或变体)的药代动力学以限制急性出血的治疗中的血栓性并发症的方法。还描述了具有减少的唾液酸缀合的因子VII多肽。另外描述了重组因子VII的变体，其具有增强的血液清除率和效力持续时间的下降。由于改变的糖基化模式，这样的变体具有比重组野生型因子VII更短的体内半衰期。还描述了这样的短效因子VII多肽的生产和使用方法。

为了解释因子VII和糖基化，提供了图3和4。图3示意地显示了因子VII分子的3个实施例和它们的结构域。因子VII是由Gla、EGF和催化结构域组成且含有2个N-连接的聚糖(N145和N322)的蛋白。V1是具有4个突变(P10Q、K32E、T106N、V253N)的因子VII变体。V2是具有6个突变(P10Q、K32E、A343、R36E、T106N、V253N)的因子VII变体。V1和V2都具有增加的对活化的血小板的亲和力且含有2个额外的N-糖基化位点，从而导致与野生型因子VII相比更长的半衰期。认为仅存在于V2中的2个突变(A34E、R36E)造成了它的组织因子无关性。

图4示意地显示了N-连接的聚糖的一个实施例，其显示了在Asn-X-Ser/Thr共有序列中的Asn处的连接。显示了具有不同单糖(包括末端唾液酸)的Man₃(GlcNac)₂核心。

本文中提供了制备具有期望的短半衰期的因子VII多肽的方法。提供了两种一般方法来制备短效因子VII多肽，所述方法可以单独地或组合地使用。如在图5中使用因子VII变体的一个实施例示意地显示的，可以通过去唾液酸化或去糖基化来加工糖基化的因子VII变体以改变变体的糖基化模式和由此改变和优选地缩短它的半衰期。该方法也可以用于将野生型因子VII多肽去唾液酸化。

可以通过本领域已知的任意方法，进行去唾液酸化。合适的方法的例子包括通过与起去唾液酸化功能的任何已知酶接触进行的酶促去唾液酸化，所述酶包括、但不限于，唾液酸酶包括神经氨酸酶-琼脂糖珠子(Sigma N5254)以及在GI:40479和在FEBS Lett. 238 (1), 31-34 (1988)中鉴别出的得自产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的神经氨酸酶。这样的去唾液酸化可以如下完成：在合适的条件下使部分地纯化的重组因子VII多肽与唾液酸酶在体外接触，或在表达重组因子VII多肽的宿主细胞中共表达唾液酸酶。所述体外接触可以是使得仅发生部分去唾液酸化的持续时间。例如，如果在因子VII多肽的组合物中以0.5-1的缀合的唾液酸的摩尔数与N-连接的聚糖的摩尔数的比率可以从分子得到期望的半衰期，那么推荐在完全去唾液酸化发生之前与唾液酸酶接触有限的时间段。也可以如下使用经修饰的唾液酸酶得到部分去唾液酸化：在减慢或损害唾液酸酶的完全功能的条件下使因子VII多肽与唾液酸酶接触，或通过本领域技术人员明白的产生仅部分地去唾液酸化的多肽的其它方法。通过与已经完全去唾液酸化的参比制品中的缀合的唾液酸/聚糖的比率进行对比，可以测量部分去唾液酸化。

通过在缺少或缺乏唾液酸添加所需的一种或多种细胞组分的细胞系中表达因子VII多肽(野生型或变体)，也可以完成去唾液酸化。某些细胞系已经或可以进行修饰以减少或除去唾液酸化。例如，具有中国仓鼠卵巢(“CHO”)起源的Lec2细胞产生具有比野生型细胞少大约10倍的唾液酸的糖蛋白。据信，聚糖的去唾液酸化产生这样的分子：其可以被肝受体(包括无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR))主动清除，且由于该原因其半衰期被缩短。

第二个方案是将因子VII变体去糖基化，且由此得到具有缩短的半衰期的分子。糖基化的减少增强通过肾清除(50-60Kd截止，综述见Caliceti P和Veronese FM, “Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates,”Adv Drug Deliv Rev. 2003;55(10):1261-77, Weinstein T等人, “Distribution of glycosaminoglycans in rat renal tubular epithelium,”J Am Soc Nephrol. 1997;8(4):586-95, Choi HS等人, “Renal clearance of quantum dots,”Nat Biotechnol. 2007;25(10):1165-70)、表面电荷和等电点(pI)变化(其已经与糖蛋白循环的增加相关联，参见综述Byrne B. 等人, “Sialic acids: carbohydrate moieties that influence the biological and physical properties of biopharmaceutical proteins and living cells,”Drug Discovery Today 2007;12(7-8):319)和通过对于任何数目的血浆蛋白酶的更少的糖蛋白介导的保护(Ton G., 等人, 2005, Nie Y等人, 2006)对因子VII的清除。

本文中使用的去糖基化包括、但不限于，产生与参比因子VII多肽相比改变的氨基酸序列的因子VII多肽的遗传修饰，所述改变除去N-连接的糖基化位点。例如，可以用在N-连接的聚糖共有序列(即，Asn-X-Ser/Thr，其中X代表除了脯氨酸以外的任意氨基酸)所需的一个或多个氨基酸残基处的破坏糖基化的改变产生因子VII变体。本文中使用的因子VII氨基酸序列的“破坏糖基化的改变”表示相对于野生型因子VII的改变：其导致一个或多个氨基酸残基的取代、添加或缺失，且其导致N-连接的糖基化的一个或多个位点的缺失。例如，可以通过用任何氨基酸(天然存在的或非天然存在的)替换均存在于野生型因子VII中的N145和/或N322，除去N-连接的糖基化位点。应当鉴别出当被改变以破坏糖基化时对活性具有最小影响的糖基化位点。在另一个实施例中，可以通过在缺少糖基化机制的细胞系中表达因子VII多肽(野生型或变体)，而发生去糖基化。例如，预期在细菌细胞中产生的因子VII是完全未糖基化的，因为细菌细胞缺少糖基化的细胞机制。在另一个实施方案中，在这样的细胞系中生产因子VII多肽：其缺少末端糖基化酶，或其具有这样的酶，但是一种或多种酶的活性小于在野生型细胞系中发现的活性。参见，例如，Appa R. 等人, 201, Narita M等人, 1998, Seested等人, 2010。在另一个实施方案中，在这样的细胞系中生产因子VII多肽：其在参与聚糖的合成或聚糖与因子VII的连接的酶中具有缺陷，或在参与CMP-唾液酸转运蛋白的合成的酶中具有缺陷。在另一个实施方案中，将因子VII多肽用去糖基化酶或化学物质处理以去糖基化。

用唾液酸酶、去糖基化酶或化学物质处理以从因子VII多肽减少或除去聚糖，可以发生在表达、纯化或纯化后阶段。

在一个实施方案中，选择性地除去因子VII变体V1 (N322、N145)或因子VII变体V2 (N322、N145、N106、N253)中的至少一个N-连接的糖基化位点，且对活性具有最小影响。通过破坏N-聚糖共有序列，在DNA水平删除N-聚糖位点。这通过除去N (天冬酰胺)密码子和用Q (谷氨酰胺)密码子替换而实现。图6的表格显示了低糖基化的变体的实施例。在野生型因子VII (在本文中被称作“F7”)、V1和V2主链上制作糖基化变体。在V1和V2中的经工程改造的N-聚糖位点(N106、N253)恢复成它们的野生型序列(T106、V253)。变体pMB113、pMB117和pMB121是野生型因子VII、V1和V2构建体，其分别含有2个内源性N-糖基化位点(N145、N322)。图6中的所有其它变体通过引入N至Q突变(N145Q、N322Q)而除去了它们的内源性N-聚糖位点中的一个或两个。该去糖基化方案导致更快的清除。

在本公开内容的一个方面，将去糖基化和去唾液酸化组合以产生具有合乎需要的缩短的半衰期的因子VII多肽。例如，可以将因子VII分子遗传修饰以包括除了存在于野生型因子VII中的2个以外的额外N-连接的糖基化位点。然后可以使用本文所述的方法之一将该变体去唾液酸化。得到的分子然后可以保留在每个N-连接的糖基化位点处的聚糖结构，其没有末端唾液酸。在本文报告的实验中，申请人报告了这样的变体：其消除时间快于具有更少N-连接的糖基化位点的类似的去唾液酸化的因子VII变体。类似地，仅具有在野生型因子VII中发现的2个N-连接的糖基化位点的因子VII多肽可以在这些位点之一处去糖基化，并然后进行去唾液酸化。基于本文中报告的实验证据，得到的具有一个N-连接的聚糖(其缺乏唾液酸)的因子VII变体的药代动力学不同于不缺少第二个N-连接的糖基化位点的类似因子VII多肽。

定义和实施方案

除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语通常具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。通常，在本文中使用的命名法以及在细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学和杂交中的实验室规程是本领域中众所周知的和常用的那些。将标准技术用于核酸和多肽合成。在本文中使用的命名法以及在下面描述的分析化学和有机合成中的实验室规程是本领域中众所周知的和常用的那些。将标准技术或其改进用于化学合成和化学分析。用于基因工程的规程是众所周知的，且可以见于，例如，Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.。

术语“唾液酸”或“唾液酸基”表示九碳羧化的糖家族中的任何成员。唾液酸家族的最常见成员是N-乙酰基-神经氨酸(2-酮-5-乙酰氨基-3,5-二脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮吡喃-1-糖酸(常常缩写为Neu5Ac、NeuAc或NANA))。

术语“多肽”和“蛋白”在本文中可互换地使用，且表示这样的聚合物：其中单体是氨基酸且通过酰胺键连接在一起。另外，也包括非天然的氨基酸，例如，β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。不是由基因编码的氨基酸也可以与本文中公开的技术一起使用。此外，还可以使用已经被修饰以包括反应基团、糖基化位点、聚合物、治疗部分、生物分子等的氨基酸。在本文中使用的所有氨基酸可以是D-或L-异构体。L-异构体通常是优选的。本文中使用的“多肽”和“蛋白”分别表示糖基化的和未糖基化的多肽和蛋白。

术语“氨基酸”表示天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及以后经过修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。“氨基酸类似物”表示这样的化合物：其具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构，即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但是保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”表示这样的化学化合物：其结构不同于氨基酸的一般化学结构，但是其以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用。

在给患者施用多肽或蛋白药物的背景下，本文中使用的术语“半衰期”或“t1/2”被定义为，使药物在患者中的血浆浓度减小一半所需的时间。

可以在试验动物中确定半衰期，例如，通过施用约25-250微克/kg的剂量的制品；在施用以后的预定时间得到血浆样品；和使用凝固测定(或任何生物测定)、免疫测定或等效测定中的一种或多种确定样品中的因子VII多肽的含量。可以用图形展示数据，并然后将生物利用度确定为曲线下面积。在某些实施例中，将大鼠或鼠模型用于半衰期测量。因子VII多肽或其组合物的相对生物利用度表示短效因子VII多肽的曲线下面积与野生型因子VII或另一种适当的比较多肽或蛋白的曲线下面积的比率。具有因子VII的血液凝固活性的任何因子VII变体可用于本文描述的目的和方法。本文中使用的因子VII变体是多肽。术语“变体因子VII多肽”和“因子VII变体”在本文中可互换地使用。在一个实施方案中，因子VII变体具有通过一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入而从野生型因子VII (SEQ ID NO: 16)衍生出的氨基酸序列。在命名氨基酸取代中，第一个字母代表在一个位置存在于野生型人因子VII中的氨基酸。后面的数字代表在人野生型因子FVII中的位置。第二个字母代表替换在野生型中发现的氨基酸的氨基酸。例如，“P10Q”代表谷氨酰胺(Q)取代在氨基酸位置10处的脯氨酸(P)。

在某些实施例中，所述因子VII变体包含选自以下的一个或多个氨基酸取代：P10Q、K32E、R36E、A34E、T106N和V253N。在其它实施例中，所述因子VII变体包含这些取代中的至少2、3、4、5或6个。在其它实施例中，所述因子VII变体包含与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列(野生型人因子VII)相比具有至少2个序列改变的氨基酸序列，其中所述至少2个序列改变是(1) 谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，和(2) 谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基。在另一个实施例中，所述因子VII变体包含与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列相比具有至少3个序列改变的氨基酸序列，其中所述至少3个序列改变是：(1) 谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，(2) 谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，和(3) 谷氨酸残基取代位置36的精氨酸残基。在另一个实施例中，所述因子VII变体包含与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列相比具有至少4个序列改变的氨基酸序列，其中所述至少4个序列改变是：(1) 谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，(2) 谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，(3) 谷氨酸残基取代位置36的精氨酸残基，和(4) 谷氨酸残基取代位置34的丙氨酸残基。在一个特定实施例中，所述因子VII变体包含与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列相比具有至少6个序列改变的氨基酸序列，其中所述至少6个或6个序列改变是：(1) 谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，(2) 谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，(3) 谷氨酸残基取代位置36的精氨酸残基，(4) 谷氨酸残基取代位置34的丙氨酸残基，(5) 天冬酰胺残基取代位置106的苏氨酸残基，和(6) 天冬酰胺残基取代位置253的缬氨酸残基。在另一个特定实施例中，所述因子VII变体仅包含这6个改变。关于这些变体的更多细节参见Maxygen的WO 200158935和Pedersen等人的美国专利号7,371,543，它们二者通过引用整体并入本文。

可以使用任意功能因子VII多肽作为起始多肽，设计本文描述的因子VII变体。在某些实施方案中，所述因子VII多肽是人因子VII多肽。在其它实施方案中，所述因子VII多肽是SEQ ID NO: 16的人因子VII多肽或其经修饰的形式或等位基因变体。有用的起始多肽还包括修饰的或变体因子VII多肽，其包含与野生型人因子VII (SEQ ID NO: 16)的序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%或66%同一性的氨基酸序列，且其也具有因子VII活性。此外，在某些实施例中，本公开内容的变体因子VII多肽包括与SEQ ID NO: 16的序列具有至少约99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%或66%同一性的任意多肽，其具有因子VII功能性的且也含有本文中讨论的相对于SEQ ID NO: 16的氨基酸改变中的一个或多个。在另一个实施方案中，所述因子VII多肽包含与SEQ ID NO: 16具有超过99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%或66%同源性的氨基酸序列且具有因子VII活性，且其也具有一个或多个本文中提及的氨基酸改变。

本文中使用的因子VII变体也包括野生型因子VII的糖基化变体。例如，部分地去唾液酸化的野生型因子VII变体及其组合物可以是有用的，因为它具有比野生型因子VII更短的半衰期。在本文中还有用的是，部分地或完全地去唾液酸化的野生型因子VII的药物制剂，以及这样的多肽和制剂在治疗本文中列举的疾病中的用途，所述疾病受益于具有因子VII活性的短效多肽。通过如本文中所述的因子VII多肽的组合物中缀合的唾液酸的摩尔数与N-连接的聚糖的摩尔数的比率，可以测量部分的或完全的去唾液酸化。

编码本文中的因子VII变体的核苷酸序列也是有用的。在一个实施方案中，所述因子VII多肽由这样的核苷酸序列编码：其在全长中与野生型因子VII的核苷酸序列(SEQ ID NO: 1)具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%或66%同一性，且其编码功能因子VII多肽。在某些实施例中，所述核苷酸序列也编码含有本文中讨论的相对于SEQ ID NO: 16的氨基酸改变中的一个或多个的多肽。在另一个实施方案中，所述因子VII多肽由这样的核苷酸序列编码：其与野生型因子VII的核苷酸序列(SEQ ID NO: 1)具有超过99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%或66%同源性，且其编码功能因子VII多肽。在某些实施例中，所述核苷酸序列也编码含有本文中讨论的相对于SEQ ID NO: 16的氨基酸改变中的一个或多个的多肽。

在整个氨基酸或核酸序列区域上计算同一性百分比值。技术人员可得到基于多种算法的一系列程序用于对比不同的序列。在至少一个实施方案中，如下确定2个氨基酸序列之间的同一性百分比：使用Needleman和Wunsch算法(Needleman 1970, J. Mol. Biol. (48):444-453)，所述算法已经并入EMBOSS软件包的针程序中(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice, P., Longden, I., 和Bleasby, A, Trends in Genetics 16(6), 276-277, 2000)，使用BLOSUM 45或PAM250评分矩阵(对于远距离相关蛋白)或BLOSUM 62或PAM160评分矩阵(对于更紧密地相关的蛋白)以及16、14、12、10、8、6或4的缺口开放罚分和0.5、1、2、3、4、5或6的缺口延伸罚分。可以在emboss.sourceforge.net找到关于EMBOSS包的本地安装的指导以及与WEB-Services的链接。要使用所述针程序比对2个氨基酸序列的参数的一个非限制性例子是默认参数，包括EBLOSUM62评分矩阵、10的缺口开放罚分和0.5的缺口延伸罚分。在另一个实施方案中，如下确定2个核苷酸序列之间的同一性百分比：使用EMBOSS软件包中的针程序(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice, P., Longden, I., 和Bleasby, A, Trends in Genetics 16(6), 276-277, 2000)，使用具有16、14、12、10、8、6或4的缺口开放罚分和0.5、1、2、3、4、5或6的缺口延伸罚分的EDNAFULL评分矩阵。要使用所述针程序比对2个氨基酸序列的参数的一个非限制性例子是默认参数，包括EDNAFULL评分矩阵、10的缺口开放罚分和0.5的缺口延伸罚分。可以进一步将核酸和蛋白序列用作“查询序列”以执行针对公开数据库的检索，例如，以鉴别其它家族成员或有关的序列。这样的检索可以使用Altschul等人的BLAST系列的程序(2.2版)进行(Altschul 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10)。使用本公开内容的核酸序列作为查询序列的BLAST可以用BLASTn、BLASTx或tBLASTx程序使用默认参数执行，以得到与本公开内容的核酸序列编码的序列同源的核苷酸序列(BLASTn、tBLASTx)或氨基酸序列(BLASTx)。使用由本公开内容的核酸序列编码的蛋白序列作为查询序列的BLAST可以用BLASTp或tBLASTn程序使用默认参数执行，以得到与本公开内容的序列同源的氨基酸序列(BLASTp)或核酸序列(tBLASTn)。为了得到用于对比目的的含缺口比对，可以如在Altschul等人, 1997, Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402中所述利用使用默认参数的Gapped BLAST。

本公开内容的多核苷酸基本上由前述核苷酸序列组成，或者包含前述核苷酸序列。因而，它们同样可以含有其它核苷酸序列。在某些实施方案中，除了开放读码框以外，所述多核苷酸还可以包含在编码基因区域的3'末端和/或5'末端处的其它非翻译序列，例如在编码区的5'末端的上游的序列的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500或更多个核苷酸和/或在编码基因区域的3'末端的下游的序列的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500或更多个核苷酸。此外，所述多核苷酸可以编码融合蛋白，其中所述融合蛋白的一个配偶体是由上面列举的核苷酸序列编码的多肽。这样的融合蛋白可以包含所谓的“标签”，其可以充当可检测的标志物或充当用于纯化目的的辅助措施。用于不同目的的标签是本领域众所周知的，且包含FLAG-标签、6-组氨酸-标签、MYC-标签等。在一个实施方案中，所述多核苷酸进一步包含与核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。

在某些实施方案中，将编码因子VII多肽的核酸序列插入合适的载体中。众多可用于不同目的的载体是本领域众所周知的，且本领域技术人员能够为他们的期望应用容易地选择适当的载体。在某些实施例中，所述载体可以是克隆载体或表达载体。在其它实施例中，所述载体可以是质粒、病毒载体、粘粒或人工染色体。在某些实施例中，可以将编码因子VII多肽的核酸放置在适当的启动子附近和/或在适当的启动子控制下。众多可用于不同目的的启动子是本领域众所周知的，且本领域技术人员能够为他们的期望应用容易地选择适当的启动子。在某些实施例中，所述启动子可以是组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性的启动子。

在某些实施方案中，在细胞、组织或生物体中重组地生产因子VII多肽。在某些实施方案中，这样的重组生产如下完成：用编码变体多肽的核酸分子或含有这样的核酸的载体转化或转染宿主细胞。众多转化和转染方法是本领域众所周知的，且本领域技术人员能够为他们的期望应用容易地选择适当的方法。

这样的重组生产还可以使用任意合适的宿主细胞、组织或生物体完成。合适的细胞、组织和生物体是本领域众所周知的，且本领域技术人员能够为他们的期望应用容易地选择适当的宿主。在某些实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物。合适的哺乳动物细胞系的例子是COS-1 (ATCC CRL 1650)、幼仓鼠肾(BHK)、HEK293 (ATCC CRL 1573; Graham等人, J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977)、HEK293T (ATCC CRL 11268; DSM ACC 2494)和HEK293F (Invitrogen R79007)细胞系。一种有用的BHK细胞系是tk³¹ ts13 BHK细胞系(Waechter和Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982, 通过引用并入本文)，在下文中被称作BHK 570细胞。BHK 570细胞系已经在ATCC登录号CRL 10314下保持于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, Md. 20852)。tk^-ts13 BHK细胞系也可在登录号CRL 1632下从ATCC得到。另外，在本公开内容内可以使用许多其它细胞系，包括Rat Hep I (大鼠肝细胞瘤; ATCC CRL 1600)、Rat Hep II (大鼠肝细胞瘤; ATCC CRL 1548)、TCMK (ATCC CCL 139)、人肺(ATCC HB 8065)、NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1)、CHO (ATCC CCL 61)、CHO K1 (ATCC CCI61)、DUKX细胞(Urlaub和Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980)和CHO-DG44细胞(Urlaub等人. Cell 33: 405-412,1983)。

这样的因子VII多肽的组合物是有用的：其中因子VII多肽如本文中所定义，且所述组合物中缀合的唾液酸的摩尔数与N-连接的聚糖的摩尔数的比率小于0.05、小于0.1、小于1.0、小于2.0、小于3.0、小于4.0、小于5.0或小于6.0，或其中缀合的唾液酸的摩尔数与N-连接的聚糖的摩尔数的比率是在选自以下的范围内的组合物：(1) 0-8；(2) 0-7；(3) 0-6；(4) 0-5;(5) 0-4；(6) 0-3；(7) 0-2；(8) 0-1和(9) 0-0.5，或1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-8、4-7、4-6、4-5和0.1-1的比率。所述比率是与糖蛋白结合的唾液酸的摩尔数相对于糖蛋白上的聚糖的数目的量度。聚糖的数目表示糖蛋白中与N-连接的聚糖连接的糖部分的数目，其中一个N-连接的糖基化位点仅可以支持一个用于该比率目的的如本文中定义的聚糖。使用唾液酸荧光标记试剂盒诸如由Takara Bio Inc. 销售的试剂盒(目录号4400)，确定所述比率。这样的唾液酸荧光标记试剂盒包括从结合的糖蛋白释放唾液酸的步骤，诸如通过部分酸水解或通过使用唾液酸酶，诸如产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)唾液酸酶。然后用荧光团诸如1,2-二氨基-4,5-亚甲基氧基苯(“DMB”)标记游离的唾液酸。然后使用HPLC定量地测量经标记的唾液酸，并将峰高与校正曲线进行对比。因而，测量的比率是唾液酸的摩尔数与从组合物的所有因子VII多肽释放的聚糖的摩尔数的比率。

在一个系列的实施方案中，因子VII多肽的组合物或分离的多肽本身具有如在人或哺乳动物血浆(例如鼠或大鼠血浆)中测得的以下半衰期：小于2小时，小于1.5小时，小于1小时，小于75小时，小于5小时，小于25小时，小于0.1小时，或短至它不可适当地测量。

本文中使用的因子VII活性是可以如下定量的生物活性：如本领域众所周知的，使用因子VII-缺陷血浆和促凝血酶原激酶测量制品的促进血液凝固的能力。在某些实施例中，具有因子VII活性的因子VII多肽显示出在相同条件下测量的野生型因子VII的活性的至少25%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。

因子VII多肽的药物制剂及其包含因子VII多肽和药学上可接受的赋形剂或载体的组合物也是有用的。在某些实施例中，所述药物制剂用于胃肠外施用，诸如通过静脉内、皮下或肌肉内施用，且施用可以是作为单个单次剂量、间歇施用或作为连续静脉内输注。局部制剂也是有用的。一个实施方案包含这样的药物制剂：其含有如本文中所述的分离的因子VII多肽，或含有如本文中所述的因子VII多肽的组合物，呈在使用时重构的低压冻干制品的形式。可替换地，所述药物制剂可以是稳定的现成即可使用的液体制剂，不需要重构。所述药物制剂可以是在一次性使用的管形瓶中的1、2、5或8 mg因子VII多肽的低压冻干粉末。在用指定体积的液体(诸如含有组氨酸的无菌水)重构以后，最终的溶液可以含有产生治疗效果的任意合适量的因子VII多肽，例如，但不限于，1 mg/mL (1000微克/mL)、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、1-2 mg/mL、1-3 mg/mL、1-5 mg/mL、1-10 mg/mL、0.5-1 mg/mL或0.5-2 mg/mL的因子VII多肽。本领域技术人员基于例如患者的重量、要治疗的出血障碍或发作的类型、和采用的特定因子VII多肽的活性，可以容易地确定用于施用给患者的适当剂量。在某些实施例中，施用可以是在70-110微克/kg、70-90微克/kg、或80-100微克/kg的范围内，且可以是90微克/kg。低压冻干粉末可以用水性载体(诸如水、缓冲的水、0.4%盐水、0.3%甘氨酸等)重构。用于制备胃肠外施用的组合物的实际方法是本领域技术人员已知的或显而易见的，并且更详细地描述在，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1990)。局部施用(诸如在创伤的情况下是适当的)可以借助于喷雾剂、灌注法、导管、支架、血管移植物或支架、软膏剂或本领域已知的其它制品来实现。在某些实施例中，局部施用可以是通过固体或半固体基质，诸如外科手术海绵或胶原基质，其已经用包含因子VII变体的组合物处理、浸渍、包被或浸泡。制备这样的基质的方法是本领域众所周知的(参见，例如，Thrombosis/Hemostasis 12:445, 2006)，且技术人员能够容易地确定适当的剂量和将组合物应用于给定基质上的方法。

在一个实施方案中，本公开内容涉及包含因子VII多肽的试剂盒。在某些实施例中，所述试剂盒含有瓶，所述瓶装有现成即可使用的液体，所述液体含有在合适的药物组合物中的因子VII多肽。在其它实施例中，所述试剂盒含有瓶，所述瓶装有低压冻干的因子VII多肽、或包含多肽的低压冻干制剂以及用于重构的稀释剂。在其它实施例中，所述试剂盒含有因子VII多肽的局部制剂，例如，软膏剂、喷雾剂或液体，和在施用给患者之前可以向其应用局部制剂的基质，诸如海绵或其它医学基质。

本文描述的因子VII多肽的组合物也是有用的。因子VII与它的天然降解产物一起存在于混合物中。因此，因子VII多肽的组合物包括具有如本文中列举的完整氨基酸序列之一的多肽和具有本文描述的那些的部分氨基酸序列的降解产物。此外，因为因子VII是糖蛋白，可以预期因子VII的组合物含有因子VII多肽的异质混合物，其中所述组合物中的每种糖蛋白不具有与其它糖蛋白完全相同的糖基化。对因子VII多肽的组合物或分离的因子VII多肽的提及意在包括这样的多肽的混合物，其中所述各种多肽具有不同的糖基化，且因而术语“组合物”或“分离的因子VII多肽”包括在所述多肽内的糖基化模式的异质性。

本文描述的因子VII多肽和组合物可用于治疗血液凝固障碍，和从血液凝固受益的那些障碍，且特别是对于使用具有比野生型因子VII更短的半衰期的药物的凝固。因此，本文中的因子VII多肽和组合物可用于穿透性创伤损伤；钝性创伤损伤；在可选的外科手术中的出血；在心脏外科手术中的出血；在脊柱外科手术中的出血；矫形外科手术；神经外科；肿瘤学外科手术；产后外科手术；月经过多；在干细胞移植中的出血；在肝移植中的出血；胃肠出血；在肝硬化中的活跃静脉曲张所致的出血；在肝硬化中的非静脉曲张所致的出血；弥漫性肺泡出血；主动脉瘤；脑内出血；创伤性脑损伤；脑挫伤；华法林的反转；肝素的反转；抗凝血剂的反转；抗血栓剂的反转；因子VII缺乏；烧伤；用抑制剂在血友病患者中的预防；无肝硬化的和肝硬化的患者的部分肝切除术；获得性血友病；特发性血小板减少性紫癜；Glanzmann氏血小板无力症；血小板输注难治的Glanzmann氏血小板无力症和Bernard-Soulier综合征。

本文中还公开了一种用于测量凝固因子(诸如因子VII)的半衰期的有用测定。存在一种确定凝固因子的半衰期的方法，所述方法包括，将活的大鼠肝细胞与凝固因子一起温育，在试验时间点1取出样品，将样品中的上清液与细胞分离，和定量样品的上清液中的凝固因子的活性或量，其中所述凝固因子的活性或量使用双抗体夹心ELISA测定来确定。可以在不同的时间点重复该方法，以形成血液凝固因子的活性或量随时间的图。

实施例

得到去唾液酸化的因子VII多肽的方法

采用众多方法来制备去唾液酸化的因子VII多肽(野生型和变体)，包括将多肽酶促去唾液酸化、在唾液酸化-缺陷型细胞系中生产因子VII多肽和在重组细胞中共表达因子VII和唾液酸酶。

唾液酸缺陷型细胞系的制备

在包含由32种酶组成的复杂途径的哺乳动物细胞中合成内源性唾液酸(Wickramasinghe和Medrano 2011)。唾液酸的生物合成在胞质溶胶中开始，其将UDP-N-乙酰基葡糖胺(UDP-GlcNAc)转化成Neu5Ac，涉及几种酶，诸如UDP-N-乙酰基葡糖胺-2-差向异构酶/N乙酰基甘露糖胺激酶(GNE)、唾液酸9-磷酸合酶(NANS)和唾液酸9-磷酸磷酸酶(NANP)。胞质溶胶中的Neu5Ac穿过核孔输入核中并通过被称作CMP-Sia合酶(CMAS)的酶转化成CMP-Neu5Ac。合成的CMP-Neu5Ac再次经由核孔运输回胞质溶胶中用于在高尔基体中进一步修饰和缀合。胞质溶胶中Neu5Ac向Neu5Gc的转化由酶CMP-NeuAc-羟化酶(CMAH)催化。然后，CMP-Neu5Ac和CMP-Neu5Gc经由位于中间反-高尔基体(trans-Golgi)的膜中的疏水3型膜转运蛋白CMP-唾液酸转运蛋白(SLC35A1)运输进高尔基体隔室中。CMP-唾液酸转运蛋白是细胞唾液酸化途径中的一个关键元件(Hirschberg, 等人. 1998)。该基因的纯合突变在小鼠中造成出生后致死(MGI 4.32, 同源基因)。在人类中，SLC35A1中的突变与唾液酸基缀合物的减少或完全缺少有关。SLC35A1中的一些插入和缺失突变与人类的糖基化的先天性障碍有关，从而导致神经系统发育、凝固和免疫缺陷的缺陷(Martinez-Duncker, 等人, 2005)。CMP-Neu5Ac/CMP-Neu5Gc一旦被运输进高尔基体中，它们就通过具有20个成员的唾液酸转移酶(ST)家族中的酶与碳水化合物、糖蛋白和糖脂缀合。

CMP-唾液酸转运蛋白(SLC35A1)是支持高尔基体中的唾液酸缀合的关键分子，且该转运蛋白的突变导致缺乏适当唾液酸化的蛋白的合成。为了生产去唾液酸化的因子VII，制备敲除了CMP-唾液酸转运蛋白基因的因子VII生产细胞系。可替换地，可以通过在生产在治疗分子上具有非常低唾液酸化水平或没有唾液酸化的蛋白治疗剂的细胞系中表达因子VII变体，实现去唾液酸化。该技术可以用于生产在患者中具有短T1/2的治疗性蛋白。

鉴别出具有中国仓鼠卵巢(CHO)起源的Lec2细胞，其具有生产比各野生型细胞少大约10倍的糖蛋白和糖脂中的唾液酸的性质(Stanley和Siminovitch, 1977, Stanley, 1980和1983)。以后的研究表明，Lec2突变体不能在体外测定中跨高尔基囊泡的膜转移CMP-唾液酸，而其它核苷酸衍生物的易位在突变细胞中是比较正常的(Deutscher, 等人, 1984)。通过使用表达克隆，报告了得自Lec2细胞的编码CMP-唾液酸转运蛋白的基因(Eckhardt等人, 1996)。进一步研究指示，CMP-唾液酸转运蛋白基因中的核苷酸575-751的缺失引起Lec2表型(Eckhardt, 等人, 1998)。CMP-唾液酸转运蛋白基因中的其它突变(诸如在1E3、6B2、8G8和9D3细胞的情况下)也导致Lec2表型(Eckhardt, 等人, 1998)。

实验1

设计该实验以确定CMP-唾液酸转运蛋白的基因中的突变(诸如在Lec2细胞的情况下)是否导致表达的重组蛋白(例如，因子VII)与从正常CHO细胞表达的相同蛋白相比具有唾液酸化缺陷。

(1)试验得自Lec2细胞的重组蛋白(诸如因子VII)的表达。在正常转染条件下将含有因子VII变体基因的表达载体(例如，pMB117和pMB121)转染进Lec2细胞和正常CHO细胞中。通过因子VII活性测定，监测得自这些细胞的细胞培养物的因子VII的表达水平。将转染的细胞的培养放大，并将培养条件培养基收获用于纯化因子VII。

(2)试验纯化的从Lec2细胞表达的因子VII相对于从正常CHO细胞表达的相同蛋白的唾液酸含量。按照正常因子VII纯化方法，从这些条件培养基纯化因子VII。关于纯化的因子VII的唾液酸含量，分析纯化的得自Lec2细胞或正常CHO细胞的因子VII。如本文中所述，分析生物活性和药代动力学(PK)参数。

实验2

为了生产制造细胞系以表达因子VII变体(其在表达的重组蛋白上没有唾液酸)，使用靶向CMP-唾液酸转运蛋白基因的基因删除方法以修饰表达因子VII的细胞系(例如，CHO细胞系)。为了完全抑制细胞中的唾液酸化，还可以任选地删除其它靶标，诸如上面在介绍中列出的UDP-N-乙酰基葡糖胺-2-差向异构酶/N乙酰基甘露糖胺激酶(GNE)、唾液酸9-磷酸合酶(NANS)、唾液酸9-磷酸磷酸酶(NANP)和CMP-Sia合酶(CMAS)，以增强CMP-Neu5Ac生物合成的抑制，所述生物合成为CMP-唾液酸转运蛋白提供底物。

两种基因删除技术，得自Life Technologies的TALE nucleases (TALENs)和得自Sangamo BioSciences/Sigma-Aldrich的ZFP Nucleases (ZFNs)，可以用于进行CMP-唾液酸转运蛋白基因的敲除或唾液酸合成途径中的多个基因的敲除。

评价敲除了CMP-唾液酸转运蛋白基因的因子VII表达细胞系以证实CMP-唾液酸转运蛋白基因的删除。培养经证实的细胞系以生产因子VII。如本文中所述纯化和评价得自删除了CMP-唾液酸转运蛋白基因的细胞系的因子VII，并针对分子上的唾液酸含量与得自亲本因子VII表达细胞系的因子VII进行对比。

通过因子 VII 和细菌唾液酸酶的共表达来生产去唾液酸化的因子 VII

为了制备去唾液酸化形式的FVII，我们将FVII与衍生自产脲节杆菌唾液酸酶(AU唾液酸酶) (N-乙酰神经氨酸糖水解酶, EC 3.2.1.18)的细菌唾液酸酶变体一起共表达。使用pJ608表达载体，用AU唾液酸酶进一步转染稳定地表达FVII (例如，具有P10Q、K32E、A34E和R36E突变的SEQ ID NO 16)的CHO细胞。表达的蛋白具有在N-端处的生长激素信号序列以促进蛋白的分泌。选择生产AU唾液酸酶的稳定克隆，如通过产色测定针对培养基中的唾液酸酶所检测的。我们还证实，所述细胞继续表达高水平的FVII蛋白，这使用FVII特异性抗体作为探针通过ELISA测定、SDS PAGE和蛋白质印迹法检测到。使用凝集素印迹测定，我们使用纯化的FVII不能检测条件培养基中的FVII蛋白上的唾液酸。相反，经纯化的从未用唾液酸酶转染的细胞衍生出的FVII的类似水平表明强凝集素结合信号。总之，我们的数据表明，在CHO细胞培养基中表达的AU唾液酸酶的水平足以有效地去唾液酸化所述细胞共表达的FVII。

使用可溶性唾液酸酶处理酶促地制备去唾液酸化的因子 VII

在该实验性试验中利用下述起始原料：

因子VII：20mg野生型因子VIIa，浓度约1 mg/ml

唾液酸酶：20ug，0.25mg/ml，50000U/ml，P0720L，购自New England BioLabs

缓冲溶液A：25mM组氨酸，50mM NaCl，pH 6.4

缓冲溶液B：25mM组氨酸，1M NaCl，pH 6.4

FVIIa配制缓冲液:2.3mg/ml氯化钠, 1.5mg/ml脱水氯化钙, 1.3mg/ml甘氨酰甘氨酸, 0.1mg/ml聚山梨酯80, 25mg/ml甘露醇, 10mg/ml蔗糖, 0.5mg/ml甲硫氨酸, 1.6mg/ml组氨酸, pH 6.0

纯化柱: 5ml HiTrap Q Sepharose HP柱。

使用这些材料，进行下述规程：

1. 向20 mg FVIIa (约1 mg/ml)中加入20ug唾液酸酶(0.25mg/ml, 1:1000质量比)

2. 将反应物在室温温育过夜(约19小时)，然后如下所述通过色谱法纯化去唾液酸化的FVIIa。

3. 如下在5ml HiTrapQ Sepharose HP柱上纯化去唾液酸化的FVIIa：

a)用5柱体积的缓冲液A (25mM组氨酸, 50mM NaCl, pH 6.4)平衡Q-Sepharose柱。

b)在上柱之前，用200ml缓冲液A稀释FVIIa和唾液酸酶反应物，并将pH调至6.4。

c)使用AKTA Explorer系统以2.5ml/min的流速加载，同时监测A280。收集穿流级分。

d)加载结束以后，用10柱体积的缓冲液A洗涤柱。

e)在40min中用20柱体积的0-50%缓冲液B (25mM组氨酸, 1M NaCl, pH 6.4)洗脱柱。收集峰级分(Desialylated NovoSeven)

f)在4℃在FVIIa配制缓冲液中透析峰级分过夜。

g)在-80℃冷冻样品的等分试样。

通过SDS-PAGE、aSEC证实产物是高纯度的，且其在关于FVIIa的生物学测定中具有活性。关于唾液酸含量的测定表明没有残余的唾液酸，且重链的LC-MS分析表明，除了唾液酸的除去以外没有显著的聚糖结构改变。

使用神经氨酸酶 - 琼脂糖珠子酶促制备去唾液酸化的因子 VII

本文中使用的重组野生型因子VII是从Novo Nordisk得到的NovoSeven®，且在本文中被称作“F7”。其它起始原料是如上所述的V1和V2。

将冷冻的起始原料在37℃水浴中快速融化和合并。通过离心使蛋白浓缩2.5倍；通过吹打使浓缩物轻轻混合，以使在蛋白-过滤器界面处的任何超浓缩(聚集)最小化。

将V2从它的V2配制缓冲液(含有组氨酸、CaCl₂、海藻糖、甲硫氨酸和痕量水平的吐温®-20，在pH 6.4 - 6.6)缓冲液交换进MES缓冲液(含有10mM MES、10mM CaCl₂、50mM NaCl，pH 6.0，无菌过滤)中。这通过三种方式之一实现。在第一种选择中，将V2用NAP-10重力流动柱(GE, 17-0854-01)缓冲液交换，所述柱每次用3柱体积的MES缓冲液预洗涤3-5次。然后将V2加载到柱上，并用1.5倍加载体积的MES缓冲液洗脱。在第二种选择中，通过在MES缓冲液中透析过夜对V2进行缓冲液交换。将透析盒预浸泡在MES缓冲液中，并用注射器将V2加载进3.500 MWCO slide-a-lyzer盒(Thermo Scientific, 66130)中在含有无菌过滤的MES缓冲液的10L容器(pitcher)中在4℃过夜。在第三种选择中，将V2穿过Sephadex G-25 (Sigma, G-25-80)凝胶过滤柱缓冲液交换进MES缓冲液中，并用MES缓冲液平衡。

将缓冲液交换的V2用神经氨酸酶-琼脂糖(Sigma N5254)去唾液酸化。将琼脂糖珠子产品提供在50%浆混合物中，在硫酸铵缓冲液中储存；将珠子在MES缓冲液中预洗涤3-5次；通过在4℃在1000rcf离心3min，分离珠子/缓冲液混合物，并将上清液液体用移液器移出和抛弃。向经洗涤的珠子中加入缓冲液交换的V2，并通过在室温旋转16-22小时轻轻混合。将2.08 mL填充的珠子/mg蛋白用于去唾液酸化；对于更大规模的制备，将其1:10减小，达到0.208 mL珠子/mg蛋白。此后，将去唾液酸化的V2通过离心回收并用移液器移出。通过在1:1体积的新鲜MES缓冲液中旋转，将珠子再次轻轻洗涤5分钟；如前将洗液混合物离心，并将上清液与V2合并。最后通过穿过0.2微米注射器式滤器的无菌过滤或通过穿过0.45微米滤器的真空过滤，除去珠子。

用EndoTrap HD树脂(Hyglos)进行几轮内毒素除去。将树脂在MES缓冲液中洗涤3-5次，并抛弃洗涤缓冲液。在两批中，将1-3mL经洗涤的树脂与去唾液酸化的V2一起在室温轻轻混合过夜。通过离心除去树脂，然后穿过注射器或真空滤器过滤。

通过在Ultracels中离心10-分钟循环，将去唾液酸化的V2浓缩4.75倍至2.1mg/mL；将浓缩物通过吹打轻轻混合，以减少在蛋白-过滤器界面处的任何聚集。

用HiLoad 26/60 Superdex 200尺寸排阻柱，将去唾液酸化的V2与较高分子量物质(和聚集的内毒素)进一步分离。将柱和AKTA纯化器系统用0.1N NaOH + 20%EtOH预消毒。将该系统进行pH中和，用水冲洗，并用重构的和合并的V2配制缓冲液平衡。将几批浓缩物手工地注射进12mL样品环中，并以3mL/min的流速加载到尺寸排阻柱上；将洗脱液回收，并用Frac-900分级分离进聚苯乙烯试管(17X100mm, Fisherbrand, 14-956-6D)中。在早期，将高分子量峰排除，并将期望的V2级分合并，并使用Charles River EndoSafe PTS和NanoDrop ND-1000试验内毒素水平和浓度。使用V2缓冲液洗脱去唾液酸化的V2。

进行5批尺寸排阻，并将收集的洗脱液合并成一批，将其在Ultracels中浓缩至1.0mg/mL。将最终的制品穿过0.2微米注射器式滤器进行无菌过滤，并试验内毒素和浓度。将1mL等分试样移入标记的2mL试管(Sarstedt, 72.694.006)中，在乙醇/干冰批中快速冷冻，并在-80℃在标记的盒子中储存备用。

表征-蛋白分析和体外测定

通过使用在MES运行缓冲液中的4-12%Bis-Tris NuPAGE (Novex NP0335BOX)的蛋白凝胶分析和通过分析尺寸排阻(TSK3000柱；运行缓冲液: 200mM KH2PO4, 150mM KCl, pH 6.8, 流速: 0.15ml/min, 荧光检测)，表征最终的制备材料以及未处理的起始原料。与使用本文中讨论的Takara Bio Inc. 试剂盒进行总蛋白的DMB-标记的唾液酸定量一样，通过LC-MS分析小试验样品中因子VII重链上的唾液酸含量。通过磷脂依赖性的因子X活化和凝血酶产生测定，试验活性。

唾液酸含量分析

对于未处理的对照和去唾液酸化的因子VII，使用LC-MS方法鉴别因子VII的重链的N-聚糖上的唾液酸。将10µg蛋白用10mM DTT混合物在37℃还原30 min，然后在Agilent 1200 Capillary LC系统上分析：柱：PLRP-S 8µm 4000A，0.3x150mm，75℃。缓冲液系统：A：含有0.2%甲酸+0.01%TFA的水；B：含有0.2%甲酸+0.01%TFA的ACN。梯度：50µL/min, 在2 min中达到10%B，在25 min中达到90%B，90%B洗涤5 min，10%B平衡5 min。

Agilent 6520 Q-TOF系统：DualEsi源，气体温度：350℃，干燥气体：7psi，喷雾器：10psi，扫描范围：500-3000 amu，1波谱/s。参考离子：1221.990637和2421.91399 amu，50ppm窗，Min 1000计数。

结果报告在图7中。

使用DMB标记试剂盒的唾液酸定量

将唾液酸荧光标记试剂盒(Takara Bio Inc., 目录号4400)用于唾液酸糖缀合物的定量和高灵敏度分析。使用1,2-二氨基-4,5-亚甲基氧基苯(DMB)的该基于HPLC的唾液酸荧光标记技术是一种简单的且高灵敏度的定量方法。在该方法中，在通过DMB标记以后，通过反相HPLC (GlycosepR，得自Glyko，# 1-4727)分析游离的唾液酸。

结论

V2重链具有2个N-糖基化位点。N-聚糖是岩藻糖基化的、重度唾液酸化的二-、三-和四-结构。在去唾液酸化的样品上没有发现末端唾液酸，这提示样品被完全去唾液酸化，并且已经除去了因子VII N-聚糖上的>99.9%的唾液酸。

使用大鼠肝细胞的半衰期测定

肝细胞的制备

从CellzDirect (Invitrogen)得到冷冻保存的原代大鼠肝细胞。将每个含有大约500万个细胞的瓶融化，并将细胞加入10 ml融化培养基中，随后在60 g离心3分钟。将细胞再悬浮于温育培养基+ 0.25%BSA (约4 ml)中，并使用血球计数器计数细胞。在用锥虫蓝染色以鉴别死细胞以后，计数活细胞。细胞生存力是80-82%。在计数以后立即在清除测定中使用细胞。

融化培养基：将Invitrogen CM3000 Thawing/Plating Supplement Pack加入500 ml Williams E培养基中。温育培养基：将Invitrogen CM4000 Cell Maintenance Supplement Pack加入500 ml Williams E培养基中。

体外肝细胞清除测定

在Eppendorf管中将原代大鼠肝细胞(100万活细胞/ml)与25 ng/ml不同因子VII变体一起在CellzDirect温育培养基+ 0.25%BSA中在轻轻翻滚式混合下在37℃温育，开始体积为1.2 ml。在每个指定的时间点，将0.25 ml混合物除去并立即离心以沉淀细胞(1000 rpm，3分钟，在Eppendorf离心机中)。将0.18 ml澄清的上清液取出，快速冷冻，并在-80℃储存过夜。在次日，使用ELISA测定定量上清液中的因子VII，其中使用对应的经纯化的突变蛋白作为标准品。使用无细胞对照上清液(其中将因子VII变体在单独培养基中在37℃温育2小时)作为零时间点值。一式三份地进行每次温育。基于Lu等人(Lu参考文献)的方法，使用方程式CLint = 0.693/体外T_1/2，计算固有清除率值，针对温育体积和细胞数目标准化。使用程序WinNonLin (Pharsight Corporation, Sunnyvale, CA)，计算体外半衰期(T_1/2)。使用双抗体夹心ELISA形式，测定得自肝细胞温育的上清液。将0.1 ml/孔的抗-因子VII单克隆抗体(1.0µg/ml, 在PBS中)加入Greiner Microlon 655061 96-孔平板中。在4℃温育过夜以后，将平板用0.2 ml/孔的1%酪蛋白封闭缓冲液(50 mM TrisHCl, 100 mM NaCl, 0.05%吐温20 pH7.2)在37℃封闭1.5小时。将平板用0.3 ml/孔PBS + 0.05%吐温20 (使用BioTek ELx405平板清洗机)洗涤4次，然后将有关的因子VII标准品和未知样品加入平板中。通过加入0.18 ml稀释缓冲液(50 mM TrisHCl, 100 mM NaCl, 0.1%酪蛋白, 0.05%吐温20 pH7.2)，将0.18 ml每种肝细胞上清液稀释2倍。将0.10 ml每种稀释的上清液一式三份地加入ELISA板中。从在稀释缓冲液中稀释的对应的经纯化的因子VII变体制备标准品。在稀释缓冲液中制备标准品的2倍系列稀释物，以产生在50-0.8 ng/ml终浓度的范围内的稀释液。将因子VII标准品和样品(0.1 ml/孔)在室温(21℃)温育2小时。如上所述将平板洗涤4次，然后加入1µg/ml的在稀释缓冲液(50 mM TrisHCl, 100 mM NaCl, 0.1%酪蛋白, 0.05%吐温20 pH7.2)中的生物素化的检测抗体(0.1 ml/孔)，然后在室温温育1.5小时。如上所述将平板洗涤4次，然后加入在稀释缓冲液中1/1000稀释的抗生蛋白链菌素-辣根过氧化物酶(0.1 ml/孔)，随后在室温温育1小时。将平板再次洗涤，并加入0.1 ml/孔的Ultra-TMB。在室温温育10-15分钟以后，通过加入0.05 ml/孔的2 M H₂SO₄，停止反应。使用Molecular Devices Spectramax M2平板读数器，在450 nm读出吸光度。使用Softmax Pro 5.4 (Molecular Devices)进行数据分析。

冷冻保存的大鼠肝细胞、融化培养基和温育培养基(CellzDirect)得自Invitrogen/Life Technologies (Grand Island, NY)。1-Step Ultra-TMB (One Step)底物，目录号34028，得自Thermo Scientific (Rockford, IL)。抗生蛋白链菌素-辣根过氧化物酶(SA-HRP)，目录号DY998，得自R&D Systems, Minneapolis, MN。磷酸盐缓冲盐水(pH 7.2)得自Invitrogen (Carlsbad, CA)。Sprague-Dawley大鼠血浆(5%柠檬酸钠抗凝血剂)得自Bioreclamation (Westbury, NY)。通过Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)得到Greiner Microlon平板(目录号655061)。

得到去糖基化的变体的方法：分子变体

野生型因子VIIa具有2个N-聚糖(N322和N145)，且V1和V2各自具有4个N-聚糖(N106、N145、N253、N322)。最初设计了在V1和V2中发现的另外2个N-聚糖(N106、N253)以增加半衰期。为了该工作，通过将它们恢复成野生型因子VII的内源性氨基酸序列(T106、V253)来除去这些位点。然后通过在这些位点处工程设计N→Q突变(图6)，在DNA水平除去剩余的2个内源性N-聚糖位点(N145和N322)。

将野生型因子VII克隆进pmCMV中以制备pMB113。合成了含有在氨基酸位置145或322处的单个N至Q突变以及双突变体(氨基酸145和322)的插入序列，并使用XbaI和PmlI位点克隆进pMB113中，产生克隆pMB114-116。然后使用AscI和AfeI将编码V1和V2的Gla结构域的插入序列克隆进pMB113-116中，并产生构建体pMB117-120 (基于V1的变体)和pMB121-124 (基于V2的变体)。对所有构建体进行序列验证(McLab)。经由电穿孔，以6孔形式用每种构建体瞬时转染哺乳动物细胞(CHO衍生出的细胞系)。转染后4天，收集上清液，并通过蛋白质印迹测定表达，随后进行hFVII ELISA (AssayPro)和FVII活性测定。然后将一个变体子集进行单细胞克隆。将被称作pMB121的V2 2-N聚糖变体纯化和活化用于进一步分析。

从10L WAVE表达纯化/活化FVIIa的方法

方法简介

使用历时几天进行的多步法，从渗滤的浓缩条件培养基纯化和活化FVII。首先将培养基融化和离心，以除去在冷冻/融化过程中可能已经形成的任何聚集体。使用假亲和捕获步骤(其采用用CaCl₂洗脱的阴离子交换柱(Q-Sepharose))进一步浓缩FVII蛋白和改变缓冲液。接着，使用羟磷灰石柱进一步纯化FVII蛋白。然后使用更小的Q-Sepharose柱进一步纯化FVII，然后将它在pH 7.8 - 8.2的溶液中活化24小时。通过将pH降低至4.0，停止活化反应。最后将FVIIa在配制缓冲液(pH 6.5)中透析并冷冻保存。

通过SDS-PAGE、aSEC、ELISA、糖分析、内毒素和FVIIa活性测定，表征最终的纯化的蛋白。

FVII ELISA

Zymutest FVII酶联免疫测定(Aniara, West Chester, Ohio)。ELISA是使用与96-孔微量培养板的孔结合的兔抗-FVII多克隆抗体的双位点免疫测定。引入样品，随后引入与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的兔抗-FVII多克隆抗体。按照生产商的说明书进行测定。简而言之，在96-孔圆底聚丙烯稀释板中将样品和校准品在测定缓冲液中稀释。将50µL稀释的样品的等分试样转移至提供的兔抗-FVII包被的平板，并在室温温育15分钟。加入200µL HRP偶联的兔抗-FVII，并在室温温育1小时。将平板用300µL提供的洗涤缓冲液洗涤5次。以200µL/孔加入TMB并在室温温育大约5分钟。通过引入50µL 0.45 M硫酸，停止反应。在450 nm读出吸光度。通过将样品值与使用4-参数曲线拟合产生的V2校正曲线进行对比，推导出因子VII水平。

因子VII产色测定

使用Biophen FVII产色测定(Aniara, West Chester, Ohio)。产色测定原理涉及由得自样品的因子VII和生产商供给的兔促凝血酶原激酶(组织因子)组成的酶复合物的形成。以过量加入的FX被活化成FXa，其又切割FXa特异性的生色底物(SXa-11)，从而产生pNA。释放的pNA的量与FXa活性直接成比例。按照生产商的说明书进行测定。简而言之，在96-孔圆底聚丙烯稀释板(Fisher Scientific)中在Tris-BSA测定缓冲液中稀释样品和校准品。在使用之前，将试剂盒试剂R1、R2和R3和96孔平底聚苯乙烯测定板(Costar)温热至37℃。将30µL样品和校准品从稀释板转移至测定板，随后转移30µL试剂R2，然后转移60µL试剂R1。将测定板混合并在摇滚式板振荡器(Boekel Scientific)中在37℃温育7分钟。加入60µL R3，并使用SpectraMax Plus微量培养板读数器(Molecular Devices)在37℃测量吸光度的变化速率(在405 nm/min的OD变化)。通过将样品值与使用4-参数曲线拟合产生的V2校正曲线进行对比，推导出因子VII水平。

磷脂依赖性的凝血酶产生测定

与野生型FVIIa相比，作为额外γ-羧基化的结果，Gla-结构域的修饰(P10Q/K32E)增加在有阴离子磷脂或活化的血小板存在下FX活化、凝血酶产生和全血凝固的效能。设计PL依赖性的TGA以测量在有阴离子磷脂存在下的rFVIIa活性，并使用得自Thrombinoscope, BV的凝血酶校准品和底物试剂、FluCa-试剂盒进行。由20%磷脂酰丝氨酸(PS)、40%磷脂酰乙醇胺(PE)和40%磷脂酰胆碱(PC)组成的磷脂(PL)囊泡得自Avanti Polar Lipids，并通过在100 mM NaCl、50 mM Tris-HCl (pH 7.2)中声处理10分钟来制备。

将20 μL PL-囊泡(500 μM)或凝血酶校准品分配进96孔板中。将不同浓度的rFVIIa在人HemA血浆中稀释，一式三份地加入PL混合物中，并平衡37℃保持10 min。通过加入FluCa溶液，开始凝血酶产生反应，并按照Thrombinoscope^BV描述的Calibrated Automated Thrombography (CAT)方法连续地监测反应60分钟。使用Thrombinoscope^BV (3.4.0)软件获取和分析数据，将其使用凝血酶校准品校正α₂-巨球蛋白活性。分析参数‘峰高’代表产生的凝血酶的最大水平，‘内源性凝血酶潜力’(ETP)对应于产生的凝血酶的总量。使用Prism 4.0 (GraphPad Inc)用4-参数非线性曲线拟合方法分析凝血酶产生参数。

磷脂依赖性的FX活化测定

使用PL依赖性的FX活化测定，测量FVIIa在有磷脂囊泡存在下没有组织因子存在下活化FX的能力。在有磷脂囊泡存在下将因子VIIa或FVIIa变体与FX一起温育。通过加入S-2765(FXa的生色底物)，测量FX的活化。简而言之，在聚丙烯圆底平板中在Tris-HCl缓冲液中稀释校准品和样品。将30µL 4µg/mL FX (Haematologic Technologies Inc.)加入96-孔平底聚苯乙烯平板的所有孔中，随后加入30µL由重量%比率为20:40:40的磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺组成的磷脂囊泡。将30µL稀释的样品和校准品转移至FX/磷脂混合物。将平板密封，轻轻混合，并在37℃温育20-23小时。将40µL 5 mM的S-2765溶液(DiaPharma)加入所有孔中。将平板密封，并在37℃温育6小时。在微量培养板读数器中在405 nm读出吸光度。通过将样品的FX活化水平与F7校正曲线进行对比，确定样品的活性。

大鼠PK研究-动物、研究方案(制品的注射、血液和制品的取样、ELISA、数据分析、动物的处死)。

将0.1mg/kg的蛋白(F7、V2、V1、dV2和dV1)静脉内地施用进Sprague Dawley大鼠中。在施用后1min开始取血浆样品，并通过FVII ELISA进行分析。

HemA-PK研究

将1.0mg/Kg的蛋白(F7、dV1)静脉内地施用进HemA小鼠中。在施用后5min开始取血浆样品，并通过FVII ELISA和sTF-PT测定进行分析。

对血浆样品的FVII ELISA

材料

使用针对FVIIa的单克隆抗体。此外将一种单克隆抗体生物素化。使用经纯化的FVIIa变体(野生型或去唾液酸化的)作为测定校准品和测定对照品。封闭缓冲液是在30mM Tris pH 7.2、60mM NaCl、0.03%吐温-20中的1%(w/v)酪蛋白。测定稀释缓冲液(ADB)是0.1%(w/v)酪蛋白、50mM Tris pH 7.2、0.1M NaCl、0.05%吐温-20。测定洗涤缓冲液是PBS + 0.05%吐温-20。免疫测定平板是Greiner Microlon高结合平板(#655061)。抗生蛋白链菌素-辣根过氧化物酶(SA-HRP)得自R&D Systems。HRP底物Ultra-TMB得自ThermoFisher Pierce。空白小鼠血浆商业地(Bioreclamation)或通过内部来源得自CD1或HemA小鼠。所有其它材料(酪蛋白、Tris、NaCl、吐温-20、PBS、硫酸)具有试剂级质量。

用于FVIIa夹心免疫测定的方法

在4℃用0.1ml/孔的针对FVIIa的抗体(1µg/ml在PBS中)包被96-孔测定平板过夜。将平板抽吸并用0.2ml/孔的封闭缓冲液在室温在旋转(150rpm)下封闭至少2小时。封闭以后，用4 x 0.3ml/孔的洗涤缓冲液洗涤孔。将FVIIa样品或标准品在ADB中1:20稀释至5%血浆的终浓度，并在室温在旋转下温育0.1ml/孔至少1.5小时。一式三个孔地测量所有标准品、对照品和样品。如前所述洗涤平板以后，加入生物素化的针对FVIIa的抗体(42ng/ml在ADB中，0.1ml/孔)，并将平板在室温在旋转下温育至少1小时。将平板洗涤，随后与抗生蛋白链菌素-HRP(在ADB中1:1000)一起温育，在室温在旋转下温育至少1小时。最终的平板洗涤以后，用0.1ml/孔的Ultra-TMB使孔显影，用0.05ml/孔的2M硫酸停止反应。在OD-450nm读出停止的反应物，并将数据分析和校准。测定的定量下限(LLOQ)通常是在100%血浆中的15-30 ng/ml FVIIa。

用于测量rFVIIa活性的、基于可溶性组织因子(sTF)的改进的PT测定

进行凝血酶原时间(PT)测定以测量HemA小鼠离体血浆样品中的人rFVIIa的活性。

简而言之，将50µL含有在aPTT缓冲液(0.15 M NaCl, 0.05 M Tris pH 7.5, 0.1%BSA)中的10%的HemA小鼠血浆和50%的人FVII-缺陷血浆(George King Inc)的样品与50µL sTF-PT试剂混合，并在37℃温育30秒。sTF-PT试剂由1体积的2µM重组人可溶性的TF (sTF_1-221)和1体积的8µM磷脂囊泡(PS²⁰:PC⁴⁰:PE⁴⁰)组成。通过加入50µL 25 mM CaCl₂开始凝固，并在STA凝固分析仪(Diagnostica Stago Inc)上记录凝固时间。标准品由200-0.78 ng/mL的系列稀释2倍的rFVIIa (wt-rFVII或修饰的rFVIIa变体)组成。

去唾液酸化的V2在血友病A (HemA)小鼠中的效力

急性尾巴切割效力研究

为了确定失血，用异氟烷麻醉小鼠，并将尾巴放在15 ml塑料试管内的37-38℃温热的0.9%盐水中10 min。用解剖刀离尖端4 mm切割尾巴，并立即放回单独的预温热的含有10 ml盐水的15 ml塑料试管中。让小鼠自由地流血40 min。在尾巴切割损伤之后5分钟或之前15-和30-分钟，静脉内地施用去唾液酸化的V2和F7。通过在血液收集之前和之后将试管称重，通过重量分析法量化失血。

尾静脉横断效力(TVT)研究

通过在尾静脉横断损伤之前1小时或之后5 min的尾静脉注射，给HemA小鼠施用去唾液酸化的V2或F7。使用适当的麻醉。用#11解剖刀直刀片横断尾静脉，并启动计时器。然后让小鼠返回它的单个清洁笼，该笼具有放在4X8英寸加热垫的顶部上的白纸垫层(Versi-Dri™)。在接下来的9小时中每小时和在24小时时间点监测动物活动状态。在监测表上记录表现出减少的活动水平征象的任何小鼠，且立即将表现出过度失血征象的任何小鼠安乐死。

在HemA小鼠血浆中的凝血酶-抗凝血酶(TAT)测定

试剂：

(1)捕获抗体：抗凝血酶多克隆抗体，得自Enzyme Research Labs，目录号TAT-EIA-C.；(2)检测抗体：HRP-缀合的抗-AT-III多克隆抗体，得自Enzyme Research Labs，目录号TAT-EIA-D，(3)测定稀释剂：得自Enzyme Research Labs，目录号TAT-EIA-D，(4) HRP底物：Amplex Red，Invitrogen，目录号A12216，(5)α-凝血酶：得自Enzyme Research Labs，目录号HT-1002a，在-80℃保存，(6) AT-III：得自Enzyme Research Labs，目录号HAT，在-80℃保存，(7) BSA：得自Sigma，目录号A-7030；(8) AT-III缺陷型血浆：购自Enzyme Research Labs，目录号：AT-DP，在-80℃保存。

缓冲剂

(1) TAT标准缓冲液：20 mM Tris-HCl，pH7.4，0.15M NaCl，1 mM EDTA，0.05 U/mL肝素；(2)包被缓冲液：1片的碳酸氢盐+ 100ml dH20，在4℃保存；(3)封闭缓冲液：2%BSA-PBS；(4)样品稀释缓冲液：加入0.1M HEPES，pH7.4，0.15M NaCl，1%BSA，0.05%吐温20，过滤和等分，在-20℃保存；(5)底物缓冲液：向PBS缓冲液中加入50µL 5 mg/mL Amplex Red、20µl 3%H2O2。混合，在加入平板之前新鲜制备；(6) 1µM TAT标准储备液的制备：将100µL 1.36 mg/ml的人AT-III和5.93µL 3.28 mg/mL的人凝血酶加入419µL TAT缓冲液中，混合，在37℃温育10-20 min；(7) 60 nM TAT标准储备液的制备：将50µL 1µM TAT复合物加入783µL AT-III缺陷型血浆中，混合，等分成50µL/管形瓶，在-80℃保存。

测定规程

1. 在碳酸氢盐缓冲液中稀释抗凝血酶pAb (捕获抗体) (1:100稀释度：对于一个96-孔板，将110µL抗体加入11 mL碳酸氢盐缓冲液中)。

2. 将100µL稀释的包被抗体加入2HB Immulon 96-孔板上的每个孔中。轻轻敲平板以确保所有液体覆盖平板的底部。密封平板并在4℃温育过夜。

3. 在自动化的平板清洗机中用300µL洗涤缓冲液洗涤4次。在最后一次洗涤以后，倒置平板并在清洁纸巾上轻敲它。

4. 将150µL封闭缓冲液(2%BSA-PBS)加入每个孔中。密封平板并在室温温育1.5小时。

5. 在自动化的平板清洗机中用300µL洗涤缓冲液洗涤4次。在最后一次洗涤以后，倒置平板并在清洁纸巾上轻敲它。

6. 将100µL标准品、样品和质量控制(QC)一式三份地加入每个孔中，并在室温温育平板2小时。

7. 在自动化的平板清洗机中用300µL洗涤缓冲液洗涤4次。在最后一次洗涤以后，倒置平板并在清洁纸巾上轻敲它。

8. 将100µL HRP-检测抗体(1/100，将110µL抗体加入11 mL缀合物稀释剂中)加入每个孔中。密封平板并在室温温育1小时。

9. 在自动化的平板清洗机中用300µL洗涤缓冲液洗涤4次。在最后一次洗涤以后，倒置平板并在清洁纸巾上轻敲它。

10. 将70µL Amplex Rd底物(新鲜制备)加入每个孔中。

11. 将平板在室温置于暗处并温育15-30 min。

12. 在OD485nm/595nm读出平板。

13. 用4-参数曲线拟合绘制标准品；从每个ELISA板中的标准品计算得自对照和每个样品的浓度。

去唾液酸化的V2在凝固活性的小鼠中的效力

进行急性尾巴切割研究以确定dV2在凝固活性的小鼠中的效力。用异氟烷麻醉凝固活性的小鼠，并将尾巴放在15 ml塑料试管内的37-38℃温热的0.9%盐水中10 min。静脉内施用5 mg/kg组织型纤溶酶原激活物(tPA)以后，用解剖刀离尖端50 mm切割尾巴，并放回单独的预温热的含有10 ml盐水的15 ml塑料试管中。在尾巴切割损伤之后立即静脉内地施用去唾液酸化的V2和F7。让小鼠自由地流血45 min。通过在血液收集之前和之后将试管称重，通过重量分析法量化失血。

结果

去唾液酸化的或去糖基化的蛋白的体外表征

通过LC-TOF MS，分析dV2的重链。分析表明，在重链上的N-聚糖在唾液酸酶处理以后不含有唾液酸。Gla结构域的存在，使这样的对轻链的分析复杂化。为了得到经处理的分子的唾液酸含量的总图像，进行了唾液酸荧光标记。该方法表明，在去唾液酸化过程中除去了V2上的大于99.9%的唾液酸。图7显示了去唾液酸化的V2的唾液酸含量分析。利用LC-TOF MS分析和唾液酸荧光标记。对dV1进行唾液酸含量分析，也得到类似的结果(数据未显示)。通过磷脂依赖性的Xa活化和磷脂依赖性的TGA测定，试验了去唾液酸化的分子的活性。PL-Xa和PL-TGA测定证实，去唾液酸化以后蛋白的活性没有降低(参见图9和图10)。图9显示了对去唾液酸化的蛋白的PL-FXa活化测定。使用磷酸-脂质FXa活化测定，试验了去唾液酸化的V1和V2 (dV1、dV2)的活性。与它们的未修饰的母体分子相比，两种去唾液酸化的蛋白在该测定中具有稍微较高的活性。图10显示了对去唾液酸化的蛋白的PL-TGA测定。通过PL-TGA，dV2和dV1表现出与它们的未修饰的母体分子相比稍微增加的活性。将结果标准化至F7。

PL-Xa测定一致地表明dV2和dV1与它们的未修饰的母体分子相比可测量的活性增加。表达了低糖基化的wtFVIIa、V2和V1分子(图11)，并作为粗表达提取物试验了表达和活性。图11显示了低糖基化的FVII变体的表达。针对FVII表达，分析了电穿孔后4天的培养基样品。使用抗-Gla结构域抗体的蛋白质印迹分析显示变体的表达。当将表达水平标准化时，N-聚糖位点的除去似乎不影响活性。图12显示了使用转染上清液确定低糖基化的FVII变体的“比活性”。通过Xa活化测定，测定了得自低糖基化的变体的2次瞬时转染的粗表达上清液的活性。当将通过ELISA测得的表达标准化时，没有观察到由N-聚糖除去引起的活性的下降。如在该测定中预见到的，V1和F7蛋白具有类似的活性，而V2分子由于它的TF-无关性而具有更低的活性。这通过在纯化的低糖基化的V2(仅具有2N-聚糖(N322和N145)，被称作pMB121)上进行的PL-TGA活性测定进一步证实。图13显示了在纯化的低糖基化的变体pMB121上的PL-TGA测定。通过PL-TGA测定，pMB1212显示出与F7相比增强的活性，类似于未修饰的V2。在肝细胞清除模型中试验了这些分子的体外清除。dV2在该模型中表现出与未修饰的V2相比显著的清除(图14)，而对于低糖基化的变体而言观察到清除的边缘增加或无增加(图15)。

大鼠PK和HemA PK

在Sprague Dawley大鼠中的药代动力学研究证实，如通过FVII ELISA测量的，去唾液酸化的和低糖基化的蛋白比它们的未修饰的相应物显著更快地清除。图16显示了大鼠药代动力学结果。如通过FVII ELISA测得的，去唾液酸化的V2和V1在Sprague Dawley大鼠中的半衰期显著短于它们的未修饰的母体分子。对于去唾液酸化的V2、去唾液酸化的V1和pMB121 (低糖基化的V2)而言，这也适用。两种去唾液酸化的分子的t1/2小于1 min，而它们的亲本蛋白的t1/2大约2.5小时。低糖基化的V2分子pMB121的清除等同于F7的清除，具有1.6小时的t1/2。在HemA小鼠中的PK研究具有类似的结果，其中dV2和F7分别具有大约3 min和2.6小时的半衰期(图17 (A))。通过sTF-PTT凝固测定证实短半衰期(图17 (B))。图17显示了HemA PK结果。如通过A) FVII ELISA和B) sTF-PT测定所测得的，去唾液酸化的V2在HemA小鼠中的半衰期显著短于它的未修饰的母体分子。

HemA效力模型

在HemA小鼠中试验了dV2的效力。使用HemA尾巴切割模型，证实1mg/kg (静脉内推注)的剂量的dV2是有效的。通过对比，在该模型中，F7的有效剂量是2.5mg/kg (静脉内推注)。这些结果证实，dV2比F7更有效(图18 (A))。该模型也用于证实，dV2的效力比F7的效力更快地清除(图18 (B))。图18显示了在HemA小鼠中的去唾液酸化的V2效力研究的结果。使用dV2的研究证实，该分子在HemA尾巴切割模型中A)比F7更有效且B)具有比F7更快的效力清除。

使用更灵敏的TVT模型，也证实了dV2与F7相比更快的效力清除，并确认了有效剂量。图19显示了在TVT HemA模型中的dV2效力研究。使用具有较高灵敏度的效力模型(TVT)的TVT研究证实了dV2具有比F7更快的效力清除。在HemA小鼠中在施用后30和60min进行的凝血酶-抗凝血酶(TAT)测量(作为致血栓性的标志物)表明dV2的显著更低的水平。图20显示了TAT测量结果。在HemA小鼠中，与F7的有效剂量(2.5mg/kg)相比，在它的有效剂量(1mg/kg)施用的dV2产生了更少的凝血酶-抗凝血酶(TAT)。该数据与效力数据一起提示，dV2具有比F7更有利的治疗指数。

在凝固活性的小鼠中的效力

在tPA治疗的、凝固活性的小鼠中试验了dV2的效力。使用尾巴切割模型，证实了dV2在0.3-1mg/kg (静脉内推注)的剂量是有效的。通过对比，在该模型中，F7的有效剂量是5mg/kg (静脉内推注)。这些结果证实，dV2比F7更有效(图21)。图21显示了在tPA治疗的、凝固活性的小鼠中的去唾液酸化的V2效力研究的结果。

去唾液酸化的野生型因子VII (dWT VIIa)的清除和效力

使用得自Novo Nordisk的NovoSeven®作为起始因子VII材料，并如上所述使用可溶性唾液酸酶将该起始多肽去唾液酸化，如上所述生产去唾液酸化的野生型因子VII (dWT VIIa)。发现dWT VIIa具有>99%的纯度、低内毒素，且不具有可检测的唾液酸。另外，质谱法分析表明唾液酸的选择性除去。

使用如上所述的Biophen FVII产色测定和改进的PT测定，分析了该dWT VIIa材料的活性，并与野生型因子VII进行了对比。这些分析中的每一个表明dWT VIIa具有与野生型因子VII多肽几乎相同的活性。

还使用人组织因子敲入(TFKI)小鼠模型分析和对比了dWT VIIa和野生型因子VII (1 mg/kg)的清除。如在图22中所示，dWT VIIa的半衰期显著短于野生型因子VII，且清除(ml/h/kg)快了超过40倍。

使用TFKI小鼠和上述的尾巴切割方法，研究了dWT VIIa相对于野生型因子VII的效力。简而言之，将5 mg/kg tPA静脉内地注射进小鼠中，随后离尖端50 mm剪切尾巴。然后以在1-6mg/kg范围内的剂量静脉内地注射野生型因子VII (NovoSeven®)或dWT VIIa。然后从尾巴收集血液45分钟，在收集阶段中每6分钟破坏不稳定的凝块。如在图23中所示，令人惊讶地发现dWT VIIa比野生型因子VII明显更有效。更具体地，3 mg/kg剂量的dWT VIIa造成了与6 mg/kg剂量的野生型因子VII相比减少的失血。鉴于该分析的结果，确定2 mg/kg dWT VIIa是6 mg/kg野生型因子VII的生物等价剂量。

还通过上述的凝血酶-抗凝血酶(TAT)方法研究了dWT VIIa和野生型因子VII (NovoSeven®)的造成全身凝固的能力。用生物等价剂量的dWT VIIa (2 mg/kg)和野生型因子VII (6 mg/kg)处理小鼠，然后通过ELISA测量TAT复合物的形成。如在图24中所示，野生型NovoSeven®因子VII产生了比dWT VIIa显著更高的TAT水平。鉴于dWT VIIa仅产生基线TAT水平的事实，该实验提示该剂量的dWT VIIa不产生可观察的全身凝固，尽管事实上该多肽与野生型因子VII一样有效。

此外，还在FeCl₃血栓形成模型中研究了dWT VIIa和野生型因子VII (NovoSeven®)的造成血栓形成的能力。在血栓形成研究开始之前15分钟，用生物等价剂量的dWT VIIa (2 mg/kg)和野生型因子VII (6 mg/kg)处理小鼠。然后通过施用3.25%FeCl₃溶液开始血栓形成，然后用Doppler测量血栓形成30分钟。将得到的血流量数据绘制在血流量相对于时间的图上，然后计算对照样品的曲线下面积的百分比，以确定每个因子VII治疗组中由血栓形成造成的血流量的减小。如在图25中所示，野生型NovoSeven®因子VII产生了显著减小的血流量(平均约40%)，而dWT VIIa几乎没有显示出血流量的减小(平均>90%)。该实验证实，给定剂量的dWT VIIa产生了与野生型因子VII相比极大地减小的血栓形成。

通过使用SN-17c三肽发荧光底物(HTI)检查这些肽对可溶性组织因子(sTF)的表观结合亲合力，进一步研究了dWT VIIa相对于野生型因子VII的活性和效力。如在图26中所示，该分析证实，dWT VIIa (dF7)和野生型因子VII (F7)对sTF具有等同的表观结合亲和力。但是，如在图27中所示，在通过有sTF-因子VII复合物(0.5 nM因子VII [dWT VIIa或野生型], 125 nM sTF)存在下滴定因子X浓度来检查这些肽的活化因子X的能力的实验模型中，dWT VIIa和野生型因子VII的Michaelis Menten动力学证实，dWT VIIa (dF7)可以比野生型因子VII (F7)更有效地(大约2倍)活化因子X。该数据提示，dWT VIIa与它的野生型相应物相比能够在每个因子VII活性部位将更多的因子X转化成因子Xa。

讨论

关于开发对于急性出血的治疗而言是有效的、但是具有降低的致血栓性的治疗药物，存在未得到满足的医学需求。具有短半衰期的有效因子VII多肽可以潜在地产生适合用于急性出血中的具有较大治疗窗的分子。

V2和V1是两种因子VIIa变体(图1- 3)。这些变体含有对它们的Gla结构域的突变，所述突变增加它们对活化的血小板的亲和力，且在V2的情况下，导致组织因子无关性。两种变体还具有2个另外的N-糖基化位点，这导致与野生型因子VIIa相比延长的半衰期，即对于血友病的治疗而言有利的特性。但是，它们作为急性出血的治疗剂的用途可以受益于半衰期的缩短。该修饰可以降低脱靶效应的风险，且由此增加它们的治疗指数。我们在这里已经证实，存在于V2和V1的碳水化合物链上的唾液酸的除去导致所述分子在体外肝细胞清除模型中的显著更快的清除。低糖基化的变体在该体外模型中没有被更快地清除，这提示去唾液酸化的和低糖基化的分子之间的清除机制是不同的。在Sprague Dawley大鼠中进行的体内研究证实，去唾液酸化的分子(dV2和dV1)以及低糖基化的变体pMB121具有显著降低的半衰期。令人感兴趣的是，与报道的去唾液酸化的野生型FVIIa的清除率相比(Appa等人, Thrombosis and Haemostasis 104.2/2010)，去唾液酸化的V2和V1都具有增加的清除率，该特征可能归因于它们的2个另外的N-聚糖。不对本发明要求保护的内容具有限定作用，该活性的一种可能的理论是，这些额外的N-聚糖在去唾液酸化以后可以变成ASGPR或类似受体的额外配体并介导更快的清除。如通过体外活性测定所测得的，与它们的母体分子相比，这些分子的活性得到保留或增加。进一步在HemA小鼠PK研究中在体内证实了dV2的更快清除，且在HemA尾巴剪切和TVT研究中证实是有效的。

此外，野生型因子VII的去唾液酸化产生比野生型快得多地清除的因子VII多肽，同时也提供增加的效力的惊人结果，如在众多实验模型中所证实的。

因子VIIa或因子VIIa变体的N-聚糖的除去或N-聚糖的单糖组成的改变产生更快地清除的分子。这些分子保留活性且在体内是有效的。这些更快地清除的因子VIIa分子的开发对于急性出血适应症的治疗而言将是有益的，以及可能成为市场上的各种抗凝剂的解毒剂。

Claims

1.变体因子VII多肽的组合物，所述变体因子VII多肽包含与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列相比具有至少2个序列改变的氨基酸序列，其中所述至少2个序列改变是(1) 谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，和(2) 谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基；其中缀合的唾液酸的摩尔数/N-连接的聚糖的摩尔数的比率是在选自以下的范围内：(1) 0-5；(2) 0-4；(3) 0-3；(4) 0-2；(5) 0-1和(6) 0-0.5。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述变体因子VII多肽与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列相比包含至少4个序列改变，其中所述至少4个序列改变是：(1) 谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，(2) 谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，(3) 谷氨酸残基取代位置36的精氨酸残基，和(4) 谷氨酸残基取代位置34的丙氨酸残基。

3.一种分离的变体因子VII多肽，其包含与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列相比具有至少2个序列改变的氨基酸序列，其中所述至少2个序列改变是(1) 谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，和(2) 谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，其中所述多肽具有在0-5.0之间的缀合的唾液酸的摩尔数与N-连接的聚糖的摩尔数的比率。

4.根据权利要求3所述的分离的变体因子VII多肽，其中所述多肽进一步包含一个或多个选自以下的序列改变：a) 相对于SEQ ID NO: 16，谷氨酸残基取代位置36的精氨酸残基，b) 相对于SEQ ID NO: 16，谷氨酸残基取代位置34的丙氨酸残基，c) 相对于SEQ ID NO: 16，天冬酰胺残基取代位置106的苏氨酸残基，和d) 相对于SEQ ID NO: 16，天冬酰胺残基取代位置253的缬氨酸残基。

5.根据权利要求3所述的分离的变体因子VII多肽，其中所述多肽进一步包含2个或更多个选自以下的序列改变：a) 相对于SEQ ID NO: 16，谷氨酸残基取代位置36的精氨酸残基，b) 相对于SEQ ID NO: 16，谷氨酸残基取代位置34的丙氨酸残基，c) 相对于SEQ ID NO: 16，天冬酰胺残基取代位置106的苏氨酸残基，和d) 相对于SEQ ID NO: 16，天冬酰胺残基取代位置253的缬氨酸残基。

6.根据权利要求3所述的分离的变体因子VII多肽，其中所述多肽进一步包含3个或多个选自以下的序列改变：a) 相对于SEQ ID NO: 16，谷氨酸残基取代位置36的精氨酸残基，b) 相对于SEQ ID NO: 16，谷氨酸残基取代位置34的丙氨酸残基，c) 相对于SEQ ID NO: 16，天冬酰胺残基取代位置106的苏氨酸残基，和d) 相对于SEQ ID NO: 16，天冬酰胺残基取代位置253的缬氨酸残基。

7.根据权利要求3所述的分离的变体因子VII多肽，其中所述多肽进一步包含4个或多个选自以下的序列改变：a) 相对于SEQ ID NO: 16，谷氨酸残基取代位置36的精氨酸残基，b) 相对于SEQ ID NO: 16，谷氨酸残基取代位置34的丙氨酸残基，c) 相对于SEQ ID NO: 16，天冬酰胺残基取代位置106的苏氨酸残基，和d) 相对于SEQ ID NO: 16，天冬酰胺残基取代位置253的缬氨酸残基。

8.因子VII多肽的组合物，其中所述因子VII多肽包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列且所述组合物中缀合的唾液酸的摩尔数与N-连接的聚糖的摩尔数的比率是在选自以下的范围内：(a) 1-5；(b) 1-4；(c) 1-3；(d) 1-2；和(e) 0.5-1。

9.一种制备分离的去唾液酸化的因子VII多肽的方法，所述方法包括：

(1)得到唾液酸化的因子VII多肽；

(2)在一定条件下使唾液酸化的因子VII多肽与唾液酸酶接触，以致于从所述唾液酸化的因子VII多肽除去足够量的共价连接的唾液酸残基，以产生具有选自以下的缀合的唾液酸的摩尔数与N-连接的聚糖的摩尔数的比率的去唾液酸化的因子VII多肽：a)小于0.05，b)小于0.1，c)小于1.0，d)小于2.0，e)小于3.0，f)小于4.0，g)小于5.0；和h)小于6.0；和

(3)分离由此产生的去唾液酸化的因子VII多肽。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述因子VII多肽包含SEQ ID NO: 16的野生型因子VII序列。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述因子VII多肽包含含有相对于SEQ ID NO: 16的2个或更多个序列改变的变体序列。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述因子VII多肽包含含有相对于SEQ ID NO: 16的4个或更多个序列改变的变体序列。

13.根据权利要求9所述的方法，其中所述因子VII多肽包含含有相对于SEQ ID NO: 16的6个或更多个序列改变的变体序列。

14.一种制备分离的去唾液酸化的因子VII多肽的方法，所述方法包括：

(1)在重组细胞系中生产因子VII多肽，所述重组细胞系在其将肽唾液酸化的能力方面存在缺陷，使得它产生具有选自以下的缀合的唾液酸的摩尔数与N-连接的聚糖的摩尔数的比率的去唾液酸化的因子VII多肽：a)小于0.05，b)小于0.1，c)小于1.0，d)小于2.0，e)小于3.0，f)小于4.0，g)小于5.0；和h)小于6.0；和

(2)分离由此产生的去唾液酸化的因子VII多肽。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述因子VII多肽包含SEQ ID NO: 16的野生型因子VII序列。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述因子VII多肽包含含有相对于SEQ ID NO: 16的2个或更多个序列改变的变体序列。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述因子VII多肽包含含有相对于SEQ ID NO: 16的4个或更多个序列改变的变体序列。

18.根据权利要求14所述的方法，其中所述因子VII多肽包含含有相对于SEQ ID NO: 16的6个或更多个序列改变的变体序列。

19.一种制备分离的去唾液酸化的因子VII多肽的方法，所述方法包括

(1)制备共表达重组因子VII多肽和重组唾液酸酶的重组细胞系；

(2)培养所述重组细胞系以允许表达重组因子VII多肽和重组唾液酸酶，其中所述重组唾液酸酶除去足够量的共价连接的唾液酸残基以产生具有选自以下的缀合的唾液酸的摩尔数与N-连接的聚糖的摩尔数的比率的去唾液酸化的因子VII多肽：a)小于0.05，b)小于0.1，c)小于1.0，d)小于2.0，e)小于3.0，f)小于4.0，g)小于5.0；和h)小于6.0；和

(3)分离由此产生的去唾液酸化的因子VII多肽。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述因子VII多肽包含SEQ ID NO: 16的野生型因子VII序列。

21.根据权利要求19所述的方法，其中所述因子VII多肽包含含有相对于SEQ ID NO: 16的2个或更多个序列改变的变体序列。

22.根据权利要求19所述的方法，其中所述因子VII多肽包含含有相对于SEQ ID NO: 16的4个或更多个序列改变的变体序列。

23.根据权利要求19所述的方法，其中所述因子VII多肽包含含有相对于SEQ ID NO: 16的6个或更多个序列改变的变体序列。

24.一种分离的变体因子VII多肽，其选自：

(1) 多肽，其包含与SEQ ID NO: 16的序列相比具有序列改变的因子VII氨基酸序列，其中所述序列改变由以下组成：(1)谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，(2)谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，和(3)使得在位置145处的N-连接的糖基化被破坏的序列改变；

(2) 多肽，其包含与SEQ ID NO: 16的序列相比具有序列改变的因子VII氨基酸序列，其中所述序列改变由以下组成：(1)谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，(2)谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，和(3)使得在位置322处的N-连接的糖基化被破坏的序列改变；

(3) 多肽，其包含与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列相比具有序列改变的因子VII氨基酸序列，其中所述序列改变由以下组成：(1)谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，和(2)谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，和(3)使得在位置145和322处的N-连接的糖基化被破坏的序列改变；

(4) 多肽，其包含与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列相比具有序列改变的因子VII氨基酸序列，其中所述序列改变由以下组成：(1)谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，和(2)谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，其中位置145和322是天冬酰胺且具有连接的N-连接的糖基化；

(5) 多肽，其包含与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列相比具有序列改变的因子VII氨基酸序列，其中所述序列改变由以下组成：(1)谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，(2)谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，(3)谷氨酸残基取代位置34的丙氨酸残基，(4)谷氨酸残基取代位置36的精氨酸残基，和(5)使得在位置145处的N-连接的糖基化被破坏的序列改变；

(6) 多肽，其包含与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列相比具有序列改变的因子VII氨基酸序列，其中所述序列改变由以下组成：(1)谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，(2)谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，(3)谷氨酸残基取代位置34的丙氨酸残基，(4)谷氨酸残基取代位置36的精氨酸残基，和(5)使得在位置322处的N-连接的糖基化被破坏的序列改变；

(7) 多肽，其包含与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列相比具有序列改变的因子VII氨基酸序列，其中所述序列改变由以下组成：(1)谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，(2)谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，(3)谷氨酸残基取代位置34的丙氨酸残基，(4)谷氨酸残基取代位置36的精氨酸残基，和(5)使得在位置145和322处的N-连接的糖基化被破坏的序列改变；和

(8) 多肽，其包含与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列相比具有序列改变的因子VII氨基酸序列，其中所述序列改变由以下组成：(1)谷氨酰胺残基取代位置10的脯氨酸残基，(2)谷氨酸残基取代位置32的赖氨酸残基，(3)谷氨酸残基取代位置34的丙氨酸残基，和(4)谷氨酸残基取代位置36的精氨酸残基，其中位置145和322是天冬酰胺且具有连接的N-连接的糖基化。

25.一种用于治疗患有需要血块形成的疾病或障碍的哺乳动物的方法，所述方法包括：给有此需要的哺乳动物施用有效量的权利要求1所述的变体因子VII多肽的组合物，其中所述疾病或障碍选自：出血、胃肠出血、失控的出血、经历移植或切除术或外科手术的哺乳动物中的出血、静脉曲张所致的出血、血小板减少症、血友病、颅内出血、主动脉瘤和抗凝血剂的过度施用。

26.一种用于治疗患有需要血块形成的疾病或障碍的哺乳动物的方法，所述方法包括：给有此需要的哺乳动物施用有效量的根据权利要求3所述的分离的变体因子VII多肽，其中所述疾病或障碍选自：出血、胃肠出血、失控的出血、经历移植或切除术或外科手术的哺乳动物中的出血、静脉曲张所致的出血、血小板减少症、血友病、颅内出血、主动脉瘤和抗凝血剂的过度施用。

27.一种用于治疗患有需要血块形成的疾病或障碍的哺乳动物的方法，所述方法包括：给有此需要的哺乳动物施用有效量的根据权利要求8所述的因子VII多肽的组合物，其中所述疾病或障碍选自：出血、胃肠出血、失控的出血、经历移植或切除术或外科手术的哺乳动物中的出血、静脉曲张所致的出血、血小板减少症、血友病、颅内出血、主动脉瘤和抗凝血剂的过度施用。

28.一种用于治疗患有需要血块形成的疾病或障碍的哺乳动物的方法，所述方法包括：给有此需要的哺乳动物施用有效量的组合物，所述组合物包含通过权利要求9所述的方法制备的分离的去唾液酸化的因子VII多肽，其中所述疾病或障碍选自：出血、胃肠出血、失控的出血、经历移植或切除术或外科手术的哺乳动物中的出血、静脉曲张所致的出血、血小板减少症、血友病、颅内出血、主动脉瘤和抗凝血剂的过度施用。

29.一种用于治疗患有需要血块形成的疾病或障碍的哺乳动物的方法，所述方法包括：给有此需要的哺乳动物施用有效量的组合物，所述组合物包含通过权利要求14所述的方法制备的分离的去唾液酸化的因子VII多肽，其中所述疾病或障碍选自：出血、胃肠出血、失控的出血、经历移植或切除术或外科手术的哺乳动物中的出血、静脉曲张所致的出血、血小板减少症、血友病、颅内出血、主动脉瘤和抗凝血剂的过度施用。

30.一种用于治疗患有需要血块形成的疾病或障碍的哺乳动物的方法，所述方法包括：给有此需要的哺乳动物施用有效量的组合物，所述组合物包含通过权利要求19所述的方法制备的分离的去唾液酸化的因子VII多肽，其中所述疾病或障碍选自：出血、胃肠出血、失控的出血、经历移植或切除术或外科手术的哺乳动物中的出血、静脉曲张所致的出血、血小板减少症、血友病、颅内出血、主动脉瘤和抗凝血剂的过度施用。

31.根据权利要求1所述的变体因子VII多肽的组合物在治疗疾病或障碍中的用途，所述疾病或障碍选自：出血、胃肠出血、失控的出血、经历移植或切除术或外科手术的哺乳动物中的出血、静脉曲张所致的出血、血小板减少症、血友病、颅内出血、主动脉瘤和抗凝血剂的过度施用。

32.根据权利要求3所述的分离的变体因子VII多肽在治疗疾病或障碍中的用途，所述疾病或障碍选自：出血、胃肠出血、失控的出血、经历移植或切除术或外科手术的哺乳动物中的出血、静脉曲张所致的出血、血小板减少症、血友病、颅内出血、主动脉瘤和抗凝血剂的过度施用。

33.根据权利要求8所述的因子VII多肽的组合物在治疗疾病或障碍中的用途，所述疾病或障碍选自：出血、胃肠出血、失控的出血、经历移植或切除术或外科手术的哺乳动物中的出血、静脉曲张所致的出血、血小板减少症、血友病、颅内出血、主动脉瘤和抗凝血剂的过度施用。

34.包含通过权利要求9所述的方法制备的分离的去唾液酸化的因子VII多肽的组合物在治疗疾病或障碍中的用途，所述疾病或障碍选自：出血、胃肠出血、失控的出血、经历移植或切除术或外科手术的哺乳动物中的出血、静脉曲张所致的出血、血小板减少症、血友病、颅内出血、主动脉瘤和抗凝血剂的过度施用。

35.包含通过权利要求14所述的方法制备的分离的去唾液酸化的因子VII多肽的组合物在治疗疾病或障碍中的用途，所述疾病或障碍选自：出血、胃肠出血、失控的出血、经历移植或切除术或外科手术的哺乳动物中的出血、静脉曲张所致的出血、血小板减少症、血友病、颅内出血、主动脉瘤和抗凝血剂的过度施用。

36.包含通过权利要求19所述的方法制备的分离的去唾液酸化的因子VII多肽的组合物在治疗疾病或障碍中的用途，所述疾病或障碍选自：出血、胃肠出血、失控的出血、经历移植或切除术或外科手术的哺乳动物中的出血、静脉曲张所致的出血、血小板减少症、血友病、颅内出血、主动脉瘤和抗凝血剂的过度施用。

37.根据权利要求1所述的变体因子VII多肽的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗选自以下的疾病或障碍：出血、胃肠出血、失控的出血、经历移植或切除术或外科手术的哺乳动物中的出血、静脉曲张所致的出血、血小板减少症、血友病、颅内出血、主动脉瘤和抗凝血剂的过度施用。

38.根据权利要求3所述的分离的变体因子VII多肽在制备药物中的用途，所述药物用于治疗选自以下的疾病或障碍：出血、胃肠出血、失控的出血、经历移植或切除术或外科手术的哺乳动物中的出血、静脉曲张所致的出血、血小板减少症、血友病、颅内出血、主动脉瘤和抗凝血剂的过度施用。

39.根据权利要求8所述的因子VII多肽的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗选自以下的疾病或障碍：出血、胃肠出血、失控的出血、经历移植或切除术或外科手术的哺乳动物中的出血、静脉曲张所致的出血、血小板减少症、血友病、颅内出血、主动脉瘤和抗凝血剂的过度施用。

40.包含通过权利要求9所述的方法制备的分离的去唾液酸化的因子VII多肽的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗选自以下的疾病或障碍：出血、胃肠出血、失控的出血、经历移植或切除术或外科手术的哺乳动物中的出血、静脉曲张所致的出血、血小板减少症、血友病、颅内出血、主动脉瘤和抗凝血剂的过度施用。

41.包含通过权利要求14所述的方法制备的分离的去唾液酸化的因子VII多肽的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗选自以下的疾病或障碍：出血、胃肠出血、失控的出血、经历移植或切除术或外科手术的哺乳动物中的出血、静脉曲张所致的出血、血小板减少症、血友病、颅内出血、主动脉瘤和抗凝血剂的过度施用。

42.包含通过权利要求19所述的方法制备的分离的去唾液酸化的因子VII多肽的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗选自以下的疾病或障碍：出血、胃肠出血、失控的出血、经历移植或切除术或外科手术的哺乳动物中的出血、静脉曲张所致的出血、血小板减少症、血友病、颅内出血、主动脉瘤和抗凝血剂的过度施用。

43.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的变体因子VII多肽的组合物和药学上可接受的赋形剂。

44.一种药物组合物，其包含根据权利要求3所述的分离的变体因子VII多肽和药学上可接受的赋形剂。

45.一种药物组合物，其包含根据权利要求8所述的因子VII多肽的组合物和药学上可接受的赋形剂。

46.一种药物组合物，其包含通过权利要求9所述的方法制备的分离的去唾液酸化的因子VII多肽和药学上可接受的赋形剂。

47.一种药物组合物，其包含通过权利要求14所述的方法制备的分离的去唾液酸化的因子VII多肽和药学上可接受的赋形剂。

48.一种药物组合物，其包含通过权利要求19所述的方法制备的分离的去唾液酸化的因子VII多肽和药学上可接受的赋形剂。

49.一种用于治疗患有需要血块形成的疾病或障碍的哺乳动物的方法，所述方法包括：给有此需要的哺乳动物施用有效量的包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的因子VII多肽，其中缀合的唾液酸的摩尔数与N-连接的聚糖的摩尔数的比率小于0.05，其中所述疾病或障碍选自：出血、胃肠出血、失控的出血、经历移植或切除术或外科手术的哺乳动物中的出血、静脉曲张所致的出血、血小板减少症、血友病、颅内出血、主动脉瘤和抗凝血剂的过度施用。

50.根据权利要求29所述的方法，其中所述因子VII多肽不含有可检测的量的缀合的唾液酸。