CN109963866A - 因子VIIa糖形 - Google Patents
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Abstract
公开了具有这样的糖基化模式的因子VII糖蛋白以及制备和使用的相关方法和制剂,所述糖基化模式使得其适合于治疗适应症,例如需要短半衰期以及快速和高清除率的产后出血。
Description
序列表的引用
本申请包含通过EFS-网络提交的序列表,从而满足37 C.F.R. §1.821-1.825的要求。
发明领域
本公开内容属于生物技术领域,并且涉及人凝血蛋白因子VII。更具体地,它涉及具有从哺乳动物体内的高清除率的因子VII和因子VIIa糖形。
发明背景
血液凝固是由各种血液成分(或因子)的复杂相互作用组成的过程,其最终产生纤维蛋白凝块。一般地,参与已被称为凝血“级联”的过程的血液成分是酶促失活的蛋白(酶原(proenzymes或zymogens)),其通过活化剂(其本身是活化的凝血因子)的作用转变为蛋白水解酶。已经历此类转变的凝血因子一般被称为“活性因子”,并且通过在凝血因子的名称上加上字母“a”来指定(例如因子VIIa)。
止血过程的起始通过组织因子和因子VIIa之间的复合物形成来介导,所述组织因子在对血管壁的损伤后暴露于循环血液,所述因子VIIa在循环中以对应于约1%的总因子VII蛋白质量的量存在。该复合物锚定至携带组织因子的细胞,并且在细胞表面上将因子IX和X转变为其活性形式因子IXa和因子Xa。因子Xa在携带组织因子的细胞上将凝血酶原转变为凝血酶,其活化因子VIII、因子V、因子XI和因子XIII。此外,在止血的该初始步骤中形成的有限量的凝血酶也活化血小板。在凝血酶作用于血小板后,血小板改变形状并且在其表面上暴露带电荷的磷脂。该活化的血小板表面形成模板用于进一步的因子X活化和完全凝血酶生成。活化的血小板表面上进一步的因子X活化经由在活化的血小板的表面上形成的因子IXa和因子VIIIa复合物而发生,并且因子Xa然后仍然在所述表面上将凝血酶原转变为凝血酶。凝血酶然后将纤维蛋白原转变为纤维蛋白,所述纤维蛋白是不溶的并且稳定了初始血小板栓。该过程局限于组织因子暴露的部位,从而最小化凝血系统的全身活化的风险。已发现因子VII和组织因子是血液凝固的主要起始者。
还已知如果以足够高的水平给予,则因子VIIa在没有因子VIIIa或IXa的情况下直接活化因子X,其中它不依赖于组织因子起作用。因此,因子VIIa以高于生理水平在治疗上用于促进患有血友病A和B的患者的凝血,特别是用于具有针对重组因子VIII或因子IX(其限制了用这些因子的替代疗法的有效性)的抑制性抗体的患者。
因子VIIa由其前体因子VII产生,所述因子VII在肝脏中合成且分泌到血液内,在血液中它作为单链糖蛋白(约50,000 Da的分子量)循环。如本文使用的,野生型人因子VII具有图1和2中公开的核苷酸序列和氨基酸序列(分别为SEQ ID NO. 1和2)。野生型因子VII通常在残基152和153之间被切割,以产生因子VIIa。重组产生的因子VIIa多肽在美国以商品名NOVOSEVEN由Novo Nordisk在商业上销售。
术语“因子VII”意指以其未切割形式(酶原形式)的因子VII多肽。术语“因子VIIa”意指以其活化的双链形式的因子VIIa多肽。当SEQ ID NO:2的氨基酸序列在本文中用于描述因子VIIa的氨基酸序列时,应理解链之一包含氨基酸残基1-152,而另一条链包含氨基酸残基153-406。
野生型因子VII是具有N联糖基化位点的糖蛋白,在所述N联糖基化位点中附接称为聚糖的糖残基。野生型人因子VII具有两个N联聚糖,一个在N145处且另一个在N322处。
一般而言,糖蛋白的聚糖促成新生多肽链例如在内质网中的折叠,并且作用于保护蛋白部分免受蛋白酶的作用,并且作用于调节糖蛋白的生物活性。与遗传调节的糖蛋白的多肽链的合成形成对比,寡糖单元或聚糖通过一系列酶反应附接且加工。糖蛋白因此一般作为起因于不同酶促活性的不同糖形的混合物出现。
糖蛋白的N-聚糖结构的寡糖组分可以影响治疗功效、物理稳定性、对蛋白酶攻击的抗性、药代动力学、与免疫系统的相互作用和特异性生物活性。例如,参见Jenkins等人(1996)Nature Biotechnol. 14:975-981。
美国专利申请公开号20140363419(Bauzon等人)公开了可用于治疗急性出血和类似病症的短效因子VII多肽。Bauzon等人公开了因子VII变体,其中在野生型或突变型因子VII的寡糖上发现的末端唾液酸分子缺失,其被称为脱唾液酸化的因子VII。Bauzon等人公开了此类脱唾液酸化的变体具有增强的从血液中的清除率和功效持续时间中的减少。Bauzon公开了脱唾液酸化的野生型因子VIIa在凝血测定中是有效的,但没有显示可观察到的全身性凝血。由于治疗出血、特别是急性出血的巨大医学需要,需要改进和替代的短效因子VIIa糖蛋白。
美国专利申请公开号20080058255(Bolt等人)公开了糖基化破坏的因子VII变体,例如在N145或N322处、或者在N145和N322两者处具有糖基化破坏取代的变体。Appa等人,Thrombosis and Haemostasis 104.2/2010,第243-251页,报道了关于重组因子VIIa的清除机制的调查,其中使用神经氨酸酶琼脂糖经由重组因子VIIa的酶促水解来制备无唾液酸-r因子VIIa。Toso等人Blood(摘要),2000年11月16日公开了与野生型人因子VIIa相比,具有导致糖基化改变(包括脱唾液酸化)的突变的因子VIIa。
糖蛋白的脱唾液酸化是已知的。例如,美国专利申请号20080226681(GlycotopeGmbH)涉及使用突变细胞(具有唾液酸的合成中的突变)来引起蛋白的脱唾液酸化。培养基补充有唾液酸前体。通过所述方法,使用者可以确定特定蛋白的适当的唾液酸化程度,以引起特定蛋白的最高活性。
重组因子VIIa的治疗用途是已知的。然而,存在关于急性出血状况,例如产后出血的速效治疗的强烈需要。快速体内清除并且对创伤区域外的区域具有很少的负面凝血作用的速效的、有效的因子VIIa是期望的。特别地,存在对于具有很少或没有全身凝血作用的速效促凝血治疗剂的需要。具有因子VIIa促凝活性和快速和/或高清除率的改进的因子VIIa糖形对于急性出血的治疗是期望的。
因此,本发明的一个目的是具有因子VIIa糖形及其组合物,其在凝血活性、半衰期和清除率方面展示出有利于用于急性出血的药代动力学性质,并且具有低或没有可观察到的全身性凝血活性。
概述
本公开内容涉及具有包含聚糖的N联糖基化模式的因子VII或因子FVIIa糖蛋白;其中所述糖基化模式包含:
(1)基本上不含具有末端N-乙酰神经氨酸的聚糖,和
(2)大量聚糖,所述聚糖为式I:(GlcNAc)4(Man)3(Gal)2(Fuc)的聚糖,和
(3)痕量或更少的选自式II:(GlcNAc)5(Man)3(Gal)(Fuc)的聚糖和式III:(GlcNAc)6(Man)3 (Fuc)的聚糖的一种或多种聚糖。
本说明书包括上述因子VII或因子VIIa糖蛋白,其进一步包含(1)式IV:(GlcNAc)5(Man)3(Gal)3(Fuc)的聚糖和/或(2)式V:(GlcNAc)6(Gal)4(Man)3(Fuc)的聚糖。在另一个实施方案中,本文所述的因子VII或因子VIIa糖蛋白具有痕量或更少的式II的聚糖。在一个进一步的实施方案中,本文所述的因子VII或因子VIIa糖蛋白具有痕量或更少的式III的聚糖。在一个进一步的实施方案中,本文所述的因子VII或因子VIIa糖蛋白包含相对于SEQ IDNO:2具有三个或更少突变的氨基酸序列。在一个进一步的实施方案中,因子VII或因子VIIa是因子VIIa糖蛋白并且包含重链;其中所述重链具有包含聚糖的N联糖基化模式;并且进一步地,其中所述糖基化模式包含:(1)基本上不含具有末端N-乙酰神经氨酸的聚糖,和(2)大量聚糖,所述聚糖为式I:(GlcNAc)4(Man)3(Gal)2(Fuc)的聚糖,(3)痕量或更少的选自式II:(GlcNAc)5(Man)3(Gal)(Fuc)的聚糖和式III:(GlcNAc)6(Man)3 (Fuc)的聚糖的一种或多种聚糖;在一个进一步的实施方案中,具有痕量或更少的式III的聚糖和式I的聚糖。
在一个实施方案中,如上文和本文进一步描述的因子VII或因子VIIa糖蛋白具有痕量或更少的式II的聚糖和/或式III的聚糖。本公开内容还包括制备本文所述的因子VII或因子VIIa糖蛋白的方法,用于治疗患有其中期望血凝块形成的疾病或病症的哺乳动物的方法,所述治疗方法通过施用治疗有效量的本文所述的因子VII或因子VIIa糖蛋白、以及与药学上可接受的赋形剂组合的本文所述的因子VII和因子VIIa糖蛋白的药物制剂。
附图简述
图1阐述了人野生型因子VII的cDNA序列(SEQ ID NO:1)和人野生型因子VII氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
图2阐述了编码人野生型因子VII的DNA序列(SEQ ID NO:3)。编码信号肽的区域是加下划线的。
图3阐述了将罗马数字与糖基化结构相关联的表。“式”指可以通过总体聚糖质量确定的化学式,例如通过质谱法测量的。“示例性结构”显示了通过质量鉴定的式范围内的可能的聚糖连接的实例。示例性结构可能考虑到先前公开的聚糖的研究,其提供了实验确定的聚糖糖的次序以及它们如何连接。
图4阐述了产脲节杆菌(Artherobacter urefaciens)唾液酸酶催化结构域的密码子优化的DNA序列(SEQ ID NO:4)。
图5阐述了产脲节杆菌唾液酸酶催化结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)。加入来自人生长激素基因的分泌信号序列(matgsrtslllafgllclpwlqegsa)并且是加下划线的。
图6是唾液酸酶表达质粒pMB279的质粒图谱。碱基表达载体是利用人CMV启动子的3 Kb UCOE载体(Millipore)。将嘌呤霉素抗性基因改变为杀稻瘟素抗性(GenBankD83710.1的氨基酸序列),其进行密码子优化用于哺乳动物表达。
图7是来自用编码唾液酸酶和因子VIIa的核酸转染的CHO K-1细胞(亚克隆9和11)中产生的因子VIIa克隆的中性N-聚糖的MALDI(基质辅助激光解吸/电离)质谱法数据,以及参考制剂的MALDI数据,所述参考制剂是NOVOSEVEN重组因子VIIa,在本文中称为“NOVO 7”,其通过与唾液酸酶接触而脱唾液酸化。
图8是在用2-AA(2-氨基苯甲酸)标记后,分析在CHO K-1细胞(亚克隆9、11和9 DS)中产生的因子VIIa和脱唾液酸化的参考产物NOVO 7的N-聚糖的HPLC数据。亚克隆9 DS指已进一步纯化的亚克隆9。
图9显示了因子VIIa重链的质谱,其解析分子上存在的聚糖。上图显示了在也表达唾液酸酶的CHO细胞中产生的本发明的因子VIIa中的因子VIIa重链的N-聚糖分布。图9(下图)显示了通过与唾液酸酶接触而脱唾液酸化的NOVOSEVEN重组因子VIIa的因子VIIa重链的N-聚糖分布。向下的箭头标记根据本公开内容的脱唾液酸化的因子VIIa上的聚糖与脱唾液酸化的NOVOSEVEN因子VIIa上的聚糖之间的某些差异。
发明详述
本文描述了具有特异性N联糖基化模式的因子VII和因子VIIa糖蛋白、其制造和使用方法、包含其的药物组合物、其中期望血液凝固的病症的治疗方法、以及产生其的细胞系。因子VII和因子VIIa糖蛋白具有相对于野生型人因子VII减少的唾液酸含量、和快速清除。
申请人已发现了重组因子VII和因子VIIa糖蛋白,其从人体中快速清除,并且其药代动力学特性使它们适合于急性出血病症中的治疗用途。在出血消退后,糖蛋白的快速清除减少了对促血栓形成分子的不必要暴露。当与NOVOSEVEN重组因子VIIa(Novo Nordisk)相比时,并且当与根据现有教导通过与唾液酸酶接触已脱唾液酸化的NOVOSEVEN重组因子VIIa相比时,本公开内容的糖蛋白具有不同的糖基化概况。
定义
除非另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语一般都具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。一般地,本文使用的命名法以及细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学和杂交中的实验室程序是本领域众所周知和通常采用的那些。标准技术用于核酸和多肽合成。本文使用的命名法以及下文描述的分析化学和有机合成中的实验室程序是本领域众所周知和通常采用的那些。标准技术或其修改用于化学合成和化学分析。用于基因工程的程序是众所周知的,并且可以例如在Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y中找到。本文公开的所有美国专利和美国专利申请都通过引用整体并入本文。
术语“唾液酸”或“唾液酸基(sialyl)”指九碳羧化糖家族的任何成员。唾液酸家族的最常见成员是N-乙酰神经氨酸(2-酮-5-乙酰氨基-3,5-双脱氧-D-甘油-D-半乳壬碳吡喃糖-1-酸(2-keto-5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galactononulopyranos-1-onic acid)(经常缩写为Neu5Ac、NeuAc或NANA))。
术语“多肽”和“蛋白”在本文中可互换使用,并且指其中单体为氨基酸并通过酰胺键连接在一起的聚合物。如本文使用的,“多肽”和“蛋白”分别指糖基化和未糖基化的多肽和蛋白两者。
术语“糖蛋白”指附接至少一个聚糖的蛋白。应理解,聚糖通过细胞中的酶促过程产生且形成。
如本文使用的,术语“糖形”指含有一种或多种特定碳水化合物结构的糖蛋白。具有多于一个糖基化位点的糖蛋白可以具有与每个糖基化位点附接的相同聚糖种类,或者可以具有与不同糖基化位点附接的不同聚糖种类。以这种方式,不同模式的聚糖附接产生糖蛋白的不同糖形。
术语“糖基化模式”和“糖基化概况”在本文中可互换使用,并且意指代表性N-聚糖种类的特征性“指纹”,所述N-聚糖种类已从糖蛋白组合物或糖蛋白产物中酶促或化学释放,然后例如使用LC-HPLC或MALDI-TOF MS等等分析其碳水化合物结构。参见例如,CurrentAnalytical Chemistry,第1卷,No. 1(2005),第28-57页中的综述;通过引用整体并入本文。
术语“痕量”的聚糖意指与糖蛋白中的其他聚糖的量相比,存在非常低水平的该聚糖。非限制性地,“痕量或更少的”聚糖意指MALDI-TOF MS、LC-HPLC或类似的分析测试显示这样的糖基化概况,其中聚糖以所述概况中出现的N-聚糖种类的总量的小于10%,优选小于5%,优选小于4%、小于3%、小于2%、小于1%和小于0.5%或小于0.1%存在,或者在分析测试中是无法检测的。
术语“显著聚糖”或“大量聚糖”指在MALDI-TOF MS、LC-HPLC或类似的分析测试下观察到的聚糖在糖基化概况中作为所述概况中出现的N-聚糖种类的总量的多于10%、多于20%、多于25%或多于30%存在。可以例如通过LC-MS分析进行聚糖的定量测定,其中比较峰的曲线下面积(AUC),以确定蛋白批次中每种聚糖的相对数量。可选地,“显著聚糖”或“大量聚糖”可以在糖基化概况中作为产物的糖基化概况中出现的N-聚糖种类的总量的10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、 30%;31%、32%、33%、34%、35%或更多存在。
“N-聚糖”、“N联聚糖”和“聚糖”可互换使用,并且指N联寡糖,例如,由与蛋白中的天冬酰胺残基的酰胺氮连接的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基附接的N联寡糖。糖蛋白上发现的占优势糖是葡萄糖、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(如N-乙酰神经氨酸(NeuAc))。在聚糖的末端处的“*”代表与天冬酰胺结合的糖链的还原末端。N联聚糖可以通过符号描述例如图3中的那些显示。图3中公开的符号用于其他图中,并且在其在本文中的使用自始至终具有相同的含义。
复合N-聚糖的“寡甘露糖苷核心结构”或“三甘露糖核心结构”意指包含三个甘露糖(Man)和两个N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)单糖残基的核心结构,所述单糖残基与糖蛋白的天冬酰胺残基附接。随后的糖基化步骤产生最终的复合N-聚糖结构。
与糖蛋白附接的N-聚糖在包含加入三甘露糖核心结构中的外周糖(例如,GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸)的分支(触角(antennae))数目方面不同。N-聚糖通常根据其分支的组成成分(例如,复合物、高甘露糖或杂合物(hybrid))分类。“复合”型N-聚糖通常具有与1,3甘露糖臂附接的至少一个GlcNAc、以及与“三甘露糖”核心的1,6甘露糖臂附接的至少一个GlcNAc。当一个GlcNAc与每个甘露糖臂附接时,N联聚糖的种类指示为"GlcNAc2Man3GlcNAc2"。当仅附接一个GlcNac时,N-聚糖种类指示为"GlcNAc1Man 3GlcNAc2",其中GlcNac附接至1,3甘露糖臂(指示为“MGn”)或1,6甘露糖臂(指示为“GnM”)。复合N-聚糖也可以具有半乳糖(“Gal”)或N-乙酰半乳糖胺(“GalNAc”)糖残基,其任选地用唾液酸或衍生物(例如,“NeuAc”,其中“Neu”指神经氨酸且“Ac”指乙酰基)修饰。当半乳糖糖残基与每个甘露糖臂上的每个GlcNAc附接时,N联聚糖的种类指示为"Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2"。复合N-聚糖还可以具有包含“二等分”GlcNAc和核心岩藻糖(“Fuc”)的链内取代。复合N-聚糖也可以具有在“三甘露糖核心”上的多重触角,经常称为“多重触角聚糖”。“高甘露糖”型N-聚糖具有五个或更多个甘露糖残基。“杂合”N-聚糖具有在三甘露糖核心的1,3甘露糖臂的末端上的至少一个GlcNAc、以及在三甘露糖核心的1,6甘露糖臂上的零个或多个甘露糖。
本公开内容的许多分子在人中具有非常高的从循环中的清除。清除可以通过本领域普通技术人员已知的手段进行测量,例如通过测量终末半衰期,其在分子的任何初始分布发生之后进行测量。
例如,通过以下可以在测试动物中测定半衰期:施用约25-250微克/kg制剂的剂量;在施用后的预定时间获得血浆样品;并且使用凝血测定(或任何生物测定)、免疫测定或等价物中的一种或多种,测定样品中因子VIIa多肽的含量。数据可以用图解展示,然后将生物利用度测定为曲线下面积。在某些实例中,大鼠或鼠模型用于半衰期测量。因子VIIa多肽或其组合物的相对生物利用度指短效因子VIIa多肽的曲线下面积与野生型因子VIIa或另一种适当的比较物多肽或蛋白的曲线下面积的比率。
本公开内容的糖蛋白可以在宿主细胞中产生。当通过本领域普通技术人员已知的任何正常生长和培养技术,例如正常有丝分裂细胞分裂、克隆如单细胞稀释克隆等,从宿主细胞获得细胞时,细胞可以“衍生自”宿主细胞。“衍生自”宿主细胞还包括对宿主细胞进行的重组修饰,其不影响表达因子VII和唾液酸酶的主要功能。异源蛋白是细胞已被改造以产生的蛋白。
优选实施方案
在一个实施方案中,因子VII或VIIa糖蛋白包含一个或两个,优选两个N联聚糖,并且具有特征在于与野生型人因子VII或VIIa相比减少的唾液酸化的糖基化模式。优选地,糖蛋白中每摩尔N联聚糖的缀合唾液酸的摩尔数小于0.05、小于0.1、小于1.0、小于2.0、小于3.0、小于4.0、小于5.0或小于6.0,或者每摩尔N联聚糖的缀合唾液酸的摩尔比在选自以下的范围内:(1)0至8;(2)0至7;(3)0至6;(4)0至5;(5)0至4;(6)0至3;(7)0至2;(8)0至1和(9)0至0.5,或者1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、2至3、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、4至8、4至7、4至6、4至5和0.1至1的比率。该比率是与糖蛋白结合的唾液酸的摩尔数相对于糖蛋白上的聚糖数的测量值。最优选地,糖蛋白具有一个或两个N联聚糖、以及痕量或更少的与这些聚糖共价附接的唾液酸。再更优选地,糖蛋白基本上不含具有末端N-乙酰神经氨酸的聚糖,并且具有两个N联聚糖。聚糖的数目指与糖蛋白中的N联聚糖附接的糖部分的数目,其中一个N联糖基化位点可以仅支持如本文定义的一个聚糖用于该比率的目的。
使用唾液酸荧光标记试剂盒,例如由Takara Bio Inc.出售的那种(目录#4400),来测定该比率。此类唾液酸荧光标记试剂盒包括从结合的糖蛋白中释放唾液酸的步骤,例如通过部分酸水解或通过使用唾液酸酶,例如产脲节杆菌唾液酸酶。然后用荧光团如1,2-二氨基-4,5-亚甲基氧基苯(“DMB”)标记游离的唾液酸。然后使用HPLC并将峰高与校准曲线进行比较,来定量测量标记的唾液酸。因此,测量的比率是从组合物的所有因子VII或因子VIIa糖蛋白中释放的每摩尔聚糖的唾液酸摩尔数的比率。
通过具有减少的唾液酸化,因子VII和VIIa糖蛋白具有比野生型因子VII或VIIa更短的终末半衰期。
在一系列实施方案中,因子VII或因子VIIa糖蛋白的组合物或者分离的多肽本身具有如在人或哺乳动物血浆(例如鼠或大鼠血浆)中测量的小于2小时、小于1.5小时、小于1小时、小于0.75小时、小于0.5小时、小于0.25小时、小于0.1小时的终末半衰期,或者如此短使得它无法合理地进行测量。
因子VII或因子VIIa糖形优选具有N联糖基化模式,其具有如上文公开的基本上减少的唾液酸化,例如基本上不含具有末端N-乙酰神经氨酸的聚糖,并且具有其为式I的聚糖的大量聚糖,以及痕量或更少的式II的聚糖和/或式III的聚糖。在另一个实施方案中,因子VII或因子VIIa糖形具有痕量或更少的式III的聚糖,在另一个实施方案中,具有痕量或更少的式II和III的聚糖,并且在另一个实施方案中,具有式I的聚糖以及痕量或更少的式II和III的聚糖。在另一个实施方案中,因子VII或因子VIIa糖形具有N联糖基化模式,其具有如上文公开的基本上减少的唾液酸化,例如基本上不含具有末端N-乙酰神经氨酸的聚糖,并且具有式IV的聚糖,在另一个实施方案中,具有式IV和式V的聚糖,在另一个实施方案中,具有式IV、V和XI的聚糖,并且在另一个实施方案中,具有式IV、V、XI和I的聚糖。在一个实施方案中,因子VII或因子VIIa糖形具有N联糖基化模式,其具有如上文公开的基本上减少的唾液酸化,例如基本上不含具有末端N-乙酰神经氨酸的聚糖,并且具有痕量或更少的式II和/或式III的聚糖。
如本文所述的聚糖模式由质量衍生的式描述,所述式可以是通用的,以涵盖具有相同质量但具有聚糖之间的不同连接的多于一种结构。图3中的“示例性结构”栏显示了式I-XI中每一个的结构的可能的聚糖连接。
使用鉴定特定聚糖连接并且与本文所述的聚糖质量数据一致的命名法,本发明的一个实施方案是具有包含聚糖的N联糖基化模式的因子VII或因子VIIa糖蛋白;其中所述糖基化模式包含:
(1)基本上不含具有末端N-乙酰神经氨酸的聚糖,和
(2)大量聚糖,所述聚糖为下式Ia的聚糖
和
(3)痕量或更少的一种或多种聚糖,其选自式IIa的聚糖:
和式IIIa的聚糖:
。
在一个进一步的实施方案中,刚刚在上文描述的因子VII或因子VIIa糖蛋白具有糖基化模式,其进一步包含:
(1)式IVa的聚糖
和/或(2)式Va的聚糖
。
上述因子VII或因子VIIa糖蛋白可具有痕量或更少的式IIa的聚糖和/或式IIIa的聚糖。在本发明的另一个实施方案中,因子VIIa糖蛋白包含重链;其中所述重链具有包含聚糖的N联糖基化模式;并且进一步,其中所述糖基化模式包含:
(1)基本上不含具有末端N-乙酰神经氨酸的聚糖,和
(2)大量聚糖,所述聚糖为式Ia的聚糖:
和
(3)痕量或更少的一种或多种聚糖,其选自式IIa的聚糖:
和式IIIa的聚糖:
。
在某些实施方案中,因子VII或因子VIIa糖蛋白的氨基酸序列包含以下、含有以下、基本上由以下组成或由以下组成:野生型人因子VII或因子VIIa的氨基酸序列(SEQ IDNO:2)。在一个实施方案中,糖蛋白具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异的氨基酸序列,并且当存在取代时,优选具有保守性氨基酸取代。在另一个实施方案中,因子VII或因子VIIa糖蛋白的氨基酸序列包含以下、含有以下、基本上由以下组成或由以下组成:SEQ ID NO:2的氨基酸序列,并且具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异的氨基酸序列,条件是所述氨基酸序列不包含具有突变P10Q、K32E、A34E、R36E、T106N和V253的SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。在一个实施方案中,糖蛋白具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸差异的氨基酸序列,并且所述氨基酸序列不包含仅具有突变P10Q、K32E、T106N和V253N、或者仅具有突变P10Q、K32E、A34E、R36E、T106N和V253N的SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。应理解“仅具有突变”意指具有额外突变以及所列出的突变的氨基酸序列在要求保护内容的范围之内。
在另一个实施方案中,糖蛋白具有这样的氨基酸序列并且具有因子VII或因子VIIa活性,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、75或70%的同源性。在另一个实施方案中,糖蛋白具有这样的氨基酸序列并且具有因子VII或因子VIIa活性,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、75或70%的同源性,条件是该氨基酸序列不包含仅具有突变P10Q、K32E、A34E、R36E、T106N和V253的SEQ ID NO:2或由其组成。在一个进一步的实施方案中,糖蛋白具有这样的氨基酸序列,所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、75或70%的同源性,并且所述氨基酸序列不包含具有仅在P10Q、K32E、T106N和V253N处的突变、或者具有仅在P10Q、K32E、A34E、R36E、T106N和V253N处的突变的SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。
在另一个实施方案中,因子VII或因子VIIa糖蛋白由核酸序列编码,所述核酸序列编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列,或者编码这样的多肽,所述多肽具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、75或70%的同源性的氨基酸序列并且具有因子VII或因子VIIa活性。在另一个实施方案中,因子VII或因子VIIa糖蛋白由核酸序列编码,所述核酸序列编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列,或者编码这样的多肽,所述多肽具有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、75或70%的同源性的氨基酸序列并且具有因子VII或因子VIIa活性,并且所述氨基酸序列不包含具有突变P10Q、K32E、T106N和V253N、或者具有突变P10Q、K32E、T106N和V253N、以及P10Q、K32E、A34E、R36E、T106N和V253N的SEQID NO:2的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中,因子VII或因子VIIa糖蛋白由核酸编码,所述核酸包含以下、含有以下、基本上由以下组成或由以下组成:编码野生型人因子VII的核苷酸序列(SEQ IDNO:1)。在一个实施方案中,编码糖蛋白的核苷酸序列与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核酸差异,并且编码具有因子VII或因子VIIa活性的多肽,在一个实施方案中,条件是该多肽的氨基酸序列不由仅具有突变P10Q、K32E、A34E、R36E、T106N和V253的SEQ ID NO:2组成;并且在另一个实施方案中,条件是该多肽的氨基酸序列并非仅具有突变P10Q、K32E、T106N和V253N。在另一个实施方案中,编码糖蛋白的核苷酸序列具有这样的核苷酸序列,其与SEQ ID NO:1的核苷酸序列具有99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、75或70%的同源性,并且编码具有因子VII或因子VIIa活性的蛋白,在一个实施方案中,条件是该蛋白的氨基酸序列不由仅具有突变P10Q、K32E、A34E、R36E、T106N和V253N的SEQ ID NO:2组成;并且在另一个实施方案中,条件是所述氨基酸序列并非仅具有突变P10Q、K32E、T106N和V253N。在另一个实施方案中,因子VII糖蛋白由这样的核酸编码,所述核酸编码野生型人因子VII,并且其序列通过对宿主细胞的密码子优化来确定。在一个实施方案中,编码本公开内容的因子VII糖蛋白的核酸包含以下、含有以下或由以下组成:SEQ ID NO:3的核酸序列,或者包含核苷酸序列、含有核苷酸序列或由核苷酸序列组成的核酸序列,所述核苷酸序列与SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、75或70%的同源性,并且编码具有因子VII或因子VIIa活性的蛋白,在一个实施方案中,条件是该蛋白的氨基酸序列不由仅具有突变P10Q、K32E、A34E、R36E、T106N和V253N的SEQ ID NO:2组成;并且在另一个实施方案中,条件是该蛋白的氨基酸序列不由仅具有突变P10Q、K32E、T106N和V253N的SEQ ID NO:2组成。
在例如实施例中的条件下或在允许合适细胞生产力用于重组蛋白表达和回收的其他培养条件下,本公开内容的糖蛋白可以在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中重组产生,所述细胞系是CHO K-1或CHO-S细胞系。考虑到各种CHO细胞系的知识,本领域普通技术人员通过常规测试可以鉴定其他合适的CHO细胞系。参见例如,Wurm,Florian,“CHO Quasispecies –Implications for Manufacturing Processes,” Processes(2013),1,296-311;doi:10.3390/pr1030296。用编码因子VII的核酸和编码唾液酸酶的核酸重组转染CHO宿主细胞。在某些实施方案中,唾液酸酶核酸来自物种产脲节杆菌或例如通过密码子优化由其衍生,例如具有SEQ ID NO:4的核酸序列,在任一种情况下表达如图5所示包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列(具有或不具有分泌信号序列)的唾液酸酶。在另一个实施方案中,用编码唾液酸酶(具有或不具有分泌信号序列)的核酸转染宿主细胞,所述唾液酸酶与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少99%、98%、97%、96% 、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%或80%的同一性。经转染的宿主细胞可以在下述条件下培养:具有6 mM GlutaMAX ®培养基(Gibco)的CD-Fusion培养基(Sigma-Aldrich),所述培养基含有L-谷氨酰胺和30 ng/mL维生素K。认为本公开内容的糖蛋白可以由在ActiCHO细胞培养基(GE Healthcare)中培养的CHO宿主细胞产生,所述培养基补充有如对于CHO细胞系适当的谷氨酰胺和维生素K。CHO细胞可以在其中生长的其他培养基也可能是合适的(例如,来自ThermoFisher Scientific的CD-CHO培养基)。
因子VII或因子VIIa糖蛋白的药物制剂及其包含因子VII或因子VIIa多肽和药学上可接受的赋形剂或载体的组合物也是有用的。在某些实例中,药物制剂用于肠胃外施用,例如通过静脉内、皮下或肌内施用,并且给药可以是单次推注剂量、间歇给药或连续静脉内输注。局部制剂也是有用的。一个实施方案包括呈冻干制剂的包含如本文所述的因子VII或因子VIIa糖蛋白的药物制剂,所述冻干制剂在使用时重构。可选地,药物制剂可以是不需要重构的稳定的液体即用型制剂。药物制剂可以是在1、2、5或8 mg因子VII多肽的一次性使用的小瓶中的冻干粉末。在用规定体积的液体(例如含有组氨酸的无菌水)重构后,最终溶液可以含有产生疗效的因子VII或因子VIIa糖蛋白的任何合适量,例如但不限于0.2 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL (1000微克/mL)、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、1-2 mg/mL、1-3mg/mL、1-5 mg/mL、1-10 mg/mL、0.2-1.0 mg/mL、0.5-1 mg/mL、0.5-2 mg/mL、0.5-5 mg/mL、0.5-4 mg/mL或0.5-10 mg/mL的因子VIIa或因子VII糖蛋白。基于例如患者的体重、所治疗的出血病症或发作的类型、以及所采用的具体因子VIIa或因子VII多肽的活性,本领域技术人员可以容易地确定用于对患者施用的适当剂量。在某些实例中,给药可以在70-110微克/kg、70-90微克/kg或80-100微克/kg的范围内,并且可以是90微克/kg。冻干粉末可以用含水载体例如水、缓冲水、0.4%盐水、0.3%甘氨酸等重构。用于制备可肠胃外施用的组合物的实际方法对于本领域技术人员而言是已知的或显而易见的,并且在例如Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1990)中详细描述。局部施加,例如在创伤的情况下是可行的,可以借助于喷雾剂、灌注、导管、支架、血管移植物或支架、软膏或本领域已知的其他制剂来进行。在某些实例中,局部施用可以借助于固体(sold)或半固体基质,例如手术海绵或胶原基质,其已用包含因子VIIa变体的组合物处理、输注、涂布或在其中浸泡。制备此类基质的方法是本领域众所周知的(参见例如,Thrombosis/Hemostasis 12:445,2006),并且技术人员将能够容易地确定施加组合物在给定基质上的适当剂量和方法。
在一个实施方案中,本公开内容涉及包含因子VII或因子VIIa糖蛋白的试剂盒。在某些实例中,试剂盒包含含有即用型液体的小瓶,所述液体含有在合适的药物组合物中的糖蛋白。在其他实例中,试剂盒包含小瓶,所述小瓶含有冻干的因子VII或因子VIIa糖蛋白、或者包含糖蛋白的冻干制剂、以及用于重构的稀释剂。在其他实例中,试剂盒包含因子VII或因子VIIa糖蛋白的局部制剂,例如软膏、喷雾剂或液体、以及基质例如海绵或其他医用基质,局部制剂可以在施用于患者之前施加于所述基质上。
本文所述的因子VII或因子VIIa糖蛋白和组合物可用于治疗血液凝固病症以及获益于血液凝固、特别是用具有比野生型因子VII更短的半衰期的药物凝固的那些病症,并且可用于制备治疗这些病症的药剂。相应地,本文的因子VII或因子VIIa糖蛋白和组合物可用于出血,穿透性创伤性损伤;钝性创伤性损伤;选择性手术中的出血;心脏手术中的出血;脊柱手术中的出血;矫形手术;神经手术;肿瘤手术;产后手术;产后出血;月经过多;干细胞移植中的出血;肝移植中的出血;胃肠道出血;肝硬化中的活动性静脉曲张出血;肝硬化中的非静脉曲张出血;弥漫性肺泡出血;主动脉瘤;脑内出血;创伤性脑损伤;脑挫伤;华法林的逆转;肝素的逆转;抗凝剂的逆转;抗血栓药的逆转;因子VII缺乏;烧伤;用抑制剂在血友病患者中的预防;用于非肝硬化和肝硬化患者的肝部分切除术;获得性血友病;特发性血小板减少性紫癜;血小板无力症;血小板输注难治性血小板无力症以及巨大血小板综合征。在某些实施方案中,本公开内容的因子VII糖形可用于治疗出血、胃肠道出血、不受控制的出血、经历移植或切除或手术的哺乳动物中的出血、静脉曲张出血、血小板减少症、血友病、颅内出血、主动脉瘤和抗凝剂的过度施用。
产后出血是产妇死亡率的主要原因。因此,存在对于可以通过本公开内容的因子VII糖形满足的有效治疗的需要。产后出血已定义为经阴道分娩后超过500 mL或剖宫产后超过1000 mL的失血。患有预先存在的贫血或某些其他病症的女性可能具有较低的应对此类失血的能力,并且因此可能经受失血量低于上文鉴定那些的产后出血。考虑到这点,一些临床医生建议产后出血应该定义为包括威胁女性的血液动力学稳定性的任何量的失血。产后出血的快速识别和诊断,随后为适当管理的快速启动,对于病症的成功管理是至关重要的。
实施例
将从SAFC(Sigma-Aldrich)获得的中国仓鼠卵巢(CHO-K1)细胞系用作用于转染的亲本细胞系。在CD-Fusion培养基中制备该CHO-K1细胞系的冷冻保存的细胞库,并且在其用于细胞系构建之前测试无菌性、支原体和非内源性病毒(外来病毒和鼠微小病毒)。
在具有6 mM GlutaMAX ®培养基(Gibco)和30 ng/mL维生素K的CD-Fusion培养基中执行细胞系构建。使用U-023程序,使用具有Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V(Lonza Biologics,Slough,UK)的Amaxa Nucleofector II装置,用线性化pMB246质粒DNA转染CHO-K1细胞。pMB246质粒含有编码SEQ ID NO:2的人野生型因子VII的核酸序列。将核酸进行密码子优化。在转染后二十四小时,将转染子直接在含有10 ug/ml嘌呤霉素(Invitrogen)的CD-Fusion选择培养基的96孔板中铺板。在药物选择和筛选后,选择来自最佳生产、药物抗性的、单一转化灶孔的细胞用于扩增。在基于特异性发色活性的最佳克隆的进一步表征后,选择最终候选细胞系并产生研究细胞库(RCB)。使用如上所述的类似方法,用线性化的pMB279质粒DNA(参见图6)超转染(super-transfected)这些细胞。在转染后二十四小时,将细胞直接在96孔板中铺板,并且使用含有30或50 ug/ml杀稻瘟素选择抗生素(Invitrogen)的CD-Fusion选择培养基。在药物选择和筛选后,选择药物抗性的单一转化灶孔用于扩增。在基于蛋白质量和生产力的最佳八个克隆的进一步表征后,选择最终的五个候选细胞系,并且生成这五个细胞系的研究细胞库(RCB)。
唾液酸酶和因子VII两者均由经改造的细胞系分泌。如下文详细讨论的,使用已知方法的修改,将收获物中的因子VII酶原纯化并活化为活性因子VIIa。参见例如,美国专利申请公开20090047723,“Method for Purification of Factor VII”,(Rikke BoldingJensen和Frank Bech Nygaard)。
在哺乳动物细胞中表达的因子VII具有许多翻译后修饰,包括通过维生素K依赖性羧化在其N末端Gla结构域内至多10个谷氨酸残基的修饰,以形成γ-羧基谷氨酸(Gla)残基。由于因子VII可以用可变数目的Gla残基表达,所以纯化的关键目标是分离具有高含量的Gla修饰(对于野生型大多为9至10)的脱唾液酸化的因子VII。
在纯化的第一步中,将收获培养基更换成缓冲溶液,浓缩并冷冻用于以后加工。第二步,通过阴离子交换层析(AIEC)的产物捕获,允许产物的进一步浓缩和准备用于第三步羟基磷灰石层析(HAC)。该后一个步骤提供了产物的实质性纯化,并且还可以去除以低含量的Gla修饰存在的FVII形式。第四步是第二AIEC,其例如通过改变蛋白浓度且更换缓冲液,使蛋白产物准备用于溶液内活化步骤。
因为因子VII以单链酶原形式表达,所以需要活化步骤以通过R和I(成熟蛋白的残基153)之间的切割来活化蛋白。使用“溶液内活化步骤”,其涉及在室温下在促进因子VII自动蛋白酶解切割为因子VIIa的条件下的蛋白温育。活化步骤随后为精制步骤(polishingstep)(第三AIEC)和最终产物透析到配制缓冲液内。最终的蛋白贮存于-70℃下。
通过酶处理去除N联聚糖,并且使用MALDI质谱法分析聚糖。结果显示于图7中。关于图7中使用的罗马数字的图例在图3中找到。如图7中所示,来自脱唾液酸化的克隆的N联聚糖大多是岩藻糖基化的双触角(参见例如,制剂 I峰)以及三触角和四触角结构(参见例如,式IV和V峰)。峰的质量和强度可以用于确定聚糖组成,以及可检测的聚糖结构的相对丰度。图7和8中的数据为与脱唾液酸化的NOVOSEVEN相比的CHO-K1细胞系亚克隆9、11和(对于图8)9 DS,所述9 DS是纯化至大于标记为亚克隆9的样品的程度的亚克隆9。将亚克隆9和亚克隆11纯化并自动活化。使用切向流过滤进一步纯化亚克隆9 DS。因此,所有样品都被活化(即脱唾液酸化的野生型FVIIa)。
图8显示了在2-AA标记后,通过HPLC的方法分析来自NOVOSEVEN和来自经改造的CHO K-1细胞的克隆的聚糖。N联聚糖被酶促释放,使用标准方法用2-AA标记,然后通过HPLC分析。如图8的标题中的“ds”指基本上脱唾液酸化的糖蛋白。聚糖如下表中所示进行定量:
nd = 未检测出。
重组因子VIIa的重链的N-糖基化模式使用LC-质谱法对结构表征进行分析,在活化的因子VIIa分子还原后通过HPLC解析。因此,这些数据仅显示HC上的那些N联聚糖,其是完整的HC和HL异二聚体上存在的N联聚糖的总库的子集。图9报道了参考产物NOVOSEVEN重组因子VIIa以及本公开内容的因子VIIa糖蛋白的脱唾液酸化重链(“HC”)的糖基化概况。脱唾液酸化的NOVOSEVEN重组因子VIIa可以通过在室温下将神经氨酸酶-琼脂糖珠(SigmaN5254)的浆液和rFVIIa的缓冲溶液轻柔混合约16-24小时来产生。普通技术人员可以设想生成此类酶促脱唾液酸化的另外方法。参考脱唾液酸化的NOVOSEVEN因子VIIa产物的重链上的N联糖基化主要是双触角结构,其具有二等分和不同的唾液酸化(末端唾液酸含量:0、1或2)。观察到非常少量的三触角结构。
相比之下,本公开内容的因子VIIa糖蛋白的重链具有与参考脱唾液酸化的NOVOSEVEN产物不同的糖基化模式。图9(上图)显示了使用由编码重组野生型人因子VII和产脲节杆菌的唾液酸酶活性结构域的核苷酸转染的CHO-S细胞,在研究细胞系中产生的根据本发明的脱唾液酸化的因子VIIa上HC的N-聚糖分布。在图9中,向下的箭头显示存在于脱唾液酸化的NOVOSEVEN中、但基本上或完全不存在于本发明的因子VII糖形中的两种聚糖。如图9中所示,当通过LC-MS分析时,本发明的糖蛋白未显示对应于式II和式III的糖形。然而,参考产物的HC显示显著量的这些糖形中的每一种。
如通过磷脂-因子Xa(PL-Xa)活化测量的,亚克隆9 DS在体外保留了活性。还可以在正常的合并人血浆中,使用标准凝血酶生成测定条件评价因子VIIa的活性。1 pM组织因子是活化剂,并且样品在4微摩尔脂质浓度下运行。可以在体外肝细胞清除测定中测量清除率。可以在大鼠中在体内和在HemA PK研究中测量增加的清除率。
本公开内容的因子VII和因子VIIa糖蛋白具有聚糖,其可以充当清除受体例如肝脏中的无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的配体。该受体与具有末端半乳糖残基的聚糖结合。具体地,ASGPR结合具有以man-GlcNAc-Gal终止的多重臂的聚糖。本文公开的糖蛋白具有减少水平的在其他重组因子VII和因子VIIa分子,例如NOVOSEVEN重组因子VIIa上发现的聚糖,或以GlcNAc结束的聚糖。这些聚糖具有与其他细胞受体例如Man/GlcNAc受体相互作用的潜力,所述细胞受体促进摄入巨噬细胞和其他细胞例如树突状细胞内。不希望以任何方式受理论限制,认为与本文公开的糖蛋白相比,此类聚糖可以促进不同的清除机制,并且因此具有不同的临床效用。例如,摄入巨噬细胞内的速率可以不同于通过ASGPR的摄入,导致不同的作用持续时间和生物分布。重要的是,经由Man/GlcNAc受体摄入树突状细胞内已与更高的免疫原性率相关。不同聚糖结构的作用对于清除进一步改变以去除唾液酸的分子(例如本发明的那些)可能是特别重要的。
Claims (14)
1.具有包含聚糖的N联糖基化模式的因子VII或因子FVIIa糖蛋白;其中所述糖基化模式包含:
(1)基本上不含具有末端N-乙酰神经氨酸的聚糖,和
(2)大量聚糖,所述聚糖为式I:(GlcNAc)4(Man)3(Gal)2(Fuc)的聚糖,和
(3)痕量或更少的选自式II:(GlcNAc)5(Man)3(Gal)(Fuc)的聚糖和式III:(GlcNAc)6(Man)3 (Fuc)的聚糖的一种或多种聚糖。
2.权利要求1的因子VII或因子VIIa糖蛋白,其中所述糖基化模式进一步包含:
(1)式IV:(GlcNAc)5(Man)3(Gal)3(Fuc)的聚糖,和/或
(2)式V:(GlcNAc)6(Gal)4(Man)3(Fuc)的聚糖。
3.权利要求1或2的因子VII或因子VIIa糖蛋白,其中所述糖基化模式具有痕量或更少的式II的聚糖。
4.权利要求1或2的因子VII或因子VIIa糖蛋白,其中所述糖基化模式具有痕量或更少的式III的聚糖。
5.权利要求1-4中任一项的因子VII或因子VIIa糖蛋白,其中所述糖蛋白包含相对于SEQ ID NO:2具有三个或更少突变的氨基酸序列。
6.权利要求1的因子VII或因子VIIa糖蛋白,其中所述糖蛋白是因子VIIa糖蛋白并且包含重链;其中所述重链具有包含聚糖的N联糖基化模式;并且进一步,其中所述糖基化模式包含:
(1)基本上不含具有末端N-乙酰神经氨酸的聚糖,和
(2)大量聚糖,所述聚糖为式I:(GlcNAc)4(Man)3(Gal)2(Fuc)的聚糖;
和
(3)痕量或更少的选自式II:(GlcNAc)5(Man)3(Gal)(Fuc)的聚糖和式III:(GlcNAc)6(Man)3 (Fuc)的聚糖的一种或多种聚糖。
7.权利要求6的因子VIIa糖蛋白,其中所述糖基化模式具有痕量或更少的式II的聚糖。
8.权利要求5或6的因子VIIa糖蛋白,其中所述糖基化模式具有痕量或更少的式III的聚糖。
9.权利要求5-8中任一项的因子VIIa糖蛋白,其中所述糖蛋白包含相对于SEQ ID NO:2具有三个或更少突变的氨基酸序列。
10.制备权利要求2-9中任一项的因子VII或因子VIIa糖蛋白的方法,其包括:
在CHO K-1宿主细胞中表达编码因子VII或因子VIIa糖蛋白的氨基酸序列的重组核酸,所述CHO K-1宿主细胞已重组改造以表达唾液酸酶;和
分离由此产生的所述因子VII或因子VIIa糖蛋白。
11.权利要求10的方法,其中所述唾液酸酶包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
12.用于治疗患有其中期望血凝块形成的疾病或病症的哺乳动物的方法,所述方法包括向有此需要的哺乳动物施用有效量的权利要求1-9中任一项的因子VII糖蛋白,其中所述疾病或病症选自出血、胃肠道出血、不受控制的出血、经历移植或切除或手术的哺乳动物中的出血、静脉曲张出血、血小板减少症、血友病、颅内出血、主动脉瘤和抗凝剂的过度施用。
13.权利要求12的方法,其中所述疾病或病症是其为产后出血的出血。
14.药物组合物,其包含权利要求1-9中任一项的因子VII或因子VIIa糖蛋白和药学上可接受的赋形剂。
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