KR102047235B1 - 단작용성 인자 vii 폴리펩티드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 단작용성 인자 VII 펩티드에 관한 것이다. 단축된 반감기는 급성 출혈과 유사한 장애의 치료에 바람직하다. 인자 VII 및 그의 변이체의 시알릴화 및/또는 글리코실화 변성은 급성 출혈 증상을 치료하는데 유용한 펩티드를 제조한다. 인간 응고 인자 VII 변이체와 이러한 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이러한 변이체를 포함하여 발현하는 벡터 및 숙주세포, 변이체의 제조방법, 변이체의 사용방법, 변이체 조성물, 및 이들과 관련한 발명의 다른 특징을 본 원에서 제공하였다.

Description

단작용성 인자 VII 폴리펩티드{SHORT-ACTING FACTOR VII POLYPEPTIDES}

관련 출원

본 원은 2012년 12월 24일자로 출원된 미국 특허출원 제61/745,674호와 2013년 3월 15일자로 출원된 미국 특허출원 제61/787,026호에 대해 우선권을 주장하며, 이 출원들의 내용은 본 원에 그 전체가 참조로 포함되었다.

발명의 분야

본 원에서는 인간 응고인자 VII 변이체와 이러한 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이러한 변이체를 포함하고 발현하는 벡터 및 숙주세포, 이러한 변이체를 얻는 방법, 이러한 변이체를 사용하는 방법, 변이체의 조성물, 및 이에 관련된 추가적인 발명 특징을 제공한다.

혈액 응고는 결과적으로 피브린 응결을 일으키는 다양한 혈액 성분(또는 인자)의 복잡한 상호작용을 포함하는 과정이다. 일반적으로, 혈액 성분들은 응고 "캐스케이드(cascade)"라고 지칭되는 것에 참여하며, 활성제(자체가 활성화된 응고인자임)의 작용으로 단백질분해 효소로 전환되는 효소적으로 불활성인 단백질(프로효소 또는 자이모겐(zymogen))이다. 이러한 전환이 일어나는 응고인자를 일반적으로 "활성인자"라고 하며, 응고인자의 이름에 "a"를 붙여서 표시한다(예를 들어, 인자 VIIa).

지혈과정의 시작은 혈관벽이 손상된 후 순환하는 혈액에 노출된 조직인자와, 전체 인자 VII 단백질 질량의 약 1%에 해당하는 양으로 순환 중에 존재하는 인자 VIIa 간 복합체의 형성으로 매개된다. 이 복합체는 조직인자를 갖는 세포에 고착하여 세포 표면에서 팩터 IX와 X를 그들의 활성형태인 인자 IXa 및 인자 Xa로 전환한다. 인자 Xa는 조직인자를 갖는 세포에서 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환하여 인자 VIII, 인자 V, 인자 XI, 및 인자 XIII을 활성화한다. 게다가, 이러한 지혈의 초기 단계에서형성된 제한된 양의 트롬빈도 혈소판을 활성화한다. 혈소판에 트롬빈이 작용한 후, 혈소판은 형태가 변화하고 표면에서 전하를 띤 인지질을 노출한다. 활성화된 혈소판 표면은 다른 인자 X 활성화와 전체 트롬빈 생성을 위한 템플레이트를 형성한다. 활성화된 혈소판 표면에서 다른 인자 X 활성화는 활성화된 혈소판 표면에서 형성된 인자 IXa와 인자 VIIIa 복합체에 의해 발생하고, 이후 인자 Xa는 여전히 표면에 있으면서 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환한다. 이어서, 트롬빈이 피브리노겐을 불용성이고 초기 혈소판 플러그를 안정화하는 피브린으로 전환한다. 이 과정은 조직인자 노출 부위에 국한되어 응고 시스템의 전신적 활성화 위험을 최소화한다. 최근에, 인자 VII과 조직인자가 혈액 응고의 중요한 개시제인 것이 확인되었다.

인자 VIIa는 그의 전구체인 인자 VII로부터 생산되며, 이것은 간에서 합성되고 혈액으로 분비되어 단일사슬 당단백질(분자량 약 50,000 Da)로 순환한다. 본 원에서 사용된 야생형 인자 VII은 도 1과 2에 나타낸 아미노산 서열과 뉴클레오티드 서열을 갖는다. "인자 VII"이란 용어는 비절단 형태(자이모겐 형태)의 인자 VII 폴리펩티드 및, 단백질분해되거나 달리 처리되어 인자 VIIa라고 지칭되는 그의 개별적인 생체활성 형태를 얻는 것들을 포함하는 것을 의미한다. 야생형 인자 VII은 전형적으로 잔기 152와 153 사이에서 절단되어 인자 VIIa를 생성한다.

인자 VII은 시험관 내에서 2사슬 형태인 인자 VIIa로 인자 Xa, 인자 XIIa, 인자 IXa, 또는 트롬빈에 의해 전환된다. 지혈에 연관된 몇 가지 다른 혈장 단백질과 마찬가지로, 인자 VII은 그의 활성에 있어서 비타민 K에 의존하며, 비타민 K는 단백질의 아미노 말단에 가까이 모여있는 다수의 글루탐산 잔기의 감마 카복실화에 필요하다. 감마-카복실화된 글루탐산은 인지질과 인자 VII의 금속 이온 유도성 상호작용에 필요하다. 조직인자, 인지질 및 칼슘 이온의 존재 하에서, 2사슬 인자 VIIa는 제한된 단백질분해에 의해 인자 X 또는 인자 IX를 재빨리 활성화한다. 인자 VIIa는 단백질분해성 절단이 쉬워서 응고 활성을 갖지 않는 수많은 분해산물을 발생한다.

아미노산 하나 이상의 치환, 결실, 및/또는 삽입에 의해 야생형 인자 VII에서 유도된 아미노산 서열을 갖는 인자 VII은 공개되어 있다. 예를 들어, Dickinson 등(Proc. Natl. Acad. Sci USA (1996) 93, 14379-14384)은 Lysl57, Val158, Glu296, Met298, Asp334, Ser336, 또는 Lys227이 각각 Ala로 대체된 인자 VII 변이체에 관한 것이다. Iwanaga 등(Thromb. Haemost. (supplement August 1999), 466, abstract 1474)은 잔기 316-320이 결실되거나 잔기 311-322가 트립신에서 상응하는 잔기로 대체된 인자 VIIa 변이체에 관한 것이다. Bolt 등의 미국 특허출원 공개 제2008/0058255 A1호는 N145 또는 N322에서, 또는 N145 및 N322 모두에서 글리코실화 방해 치환을 갖는 인자 VII 변이체에 관한 것이다. Toso 등은 자연적으로 발생한 돌연변이에 기초한 일련의 인자 VII 구조 작용 시험을 보고하였다. 돌연변이성 재조합 인자 VII 단백질은 T324M, E385K를 포함하고, 2개의 돌연변이체 인자 VII 단백질은 인자 VII 중쇄(N322Q) 또는 인자 VII 경쇄 (N145Q) 내에 글리코실화 코어 서열이 결여되어 있다. [Toso 등, "Lack of Heavy chain Glycosylation in Patient with Factor VII Deficiency Not Responsible for Mutant FVIIa Activity," Blood, vol. 96, no. 11 , part 2 (16 Nov. 2000), p. 79b (42nd Annual Meeting of the American Society of Hematology)]

자연적으로 발생하는 펩티드와 단백질 대부분은 1차(primary) 펩티드 또는 단백질 사슬의 길이를 따라 아미노산의 선택 번호에 대해 특이적인 결합을 통해 펩티드 또는 단백질에 결합된 탄수화물 잔기를 함유한다. 따라서, 자연적으로 발생하는 많은 펩티드와 단백질을 각각 "당펩티드" 또는 "당단백질"이라 일컫는다. 주어진 펩티드 또는 단백질에서 글리코실화 패턴의 가변성은 펩티드 또는 단백질 작용에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 펩티드 또는 단백질 상에서 N-결합된 글리칸의 구조는 펩티드 또는 단백질의 다양한 특성, 예컨대 프로테아제 감수성, 세포내 수송(trafficking), 분비, 조직 타겟팅, 생물학적 반감기 및 세포 또는 유기체의 펩티드 또는 단백질의 항원성에 영향을 줄 수 있다. 이러한 특성 중 하나 이상의 변성은 자연적 설정 내에서 펩티드 또는 단백질의 효능에 영향을 미칠 수 있고, 또한 치료제로서 펩티드 또는 단백질의 효능에 그러한 목적으로 생성된 상황에서 영향을 미칠 수 있다.

펩티드 또는 단백질 사슬에 결합된 탄수화물 구조는 "글리칸" 분자로 알려져 있다. 펩티드 또는 단백질 상에 존재하는 특정 글리칸 구조는 펩티드 또는 단백질의 용해도와 응집 특성, 1차 펩티드 또는 단백질 사슬의 폴딩에 영향을 미치며, 따라서 그의 작용적 또는 효소적 활성, 단백질분해 시도에 대한 펩티드 또는 단백질의 저항성(resistance), 및 펩티드 또는 단백질의 불활성 형태를 활성 형태로 전환하는 것을 유도하는 단백질분해의 조절에 영향을 미친다. 예를 들어, 글리칸 분자에 존재하는 터미널 시알산 잔기는 포유동물의 순환계에서 펩티드 또는 단백질의 반감기 길이에 영향을 미친다. 터미널 시알산 잔기를 함유하지 않는 글리칸을 갖는 펩티드와 단백질은 일반적으로 훨씬 빨리 순환계에서 간에 의해 제거된다.

자연적으로 발생한 당펩티드와 당단백질 내에서 발견된 글리칸 구조체는 전형적으로 2종류, 즉 N-결합 및 O-결합 글리칸으로 분류된다. 야생형 인자 VIIa는 2개의 N-결합 및 2개의 O-결합 글리코실화 부위를 함유한다. N-결합 글리코실화는 진핵생물에서 가장 흔한 공유적 변성이다. N-결합 글리코실화는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser/Thr에서 발생하며, 여기서 글리칸은 아스파라긴의 아미노 그룹에 결합하고 X는 프롤린을 제외한 아미노산이다. N-결합 글리칸은 공통 코어 5당류, Man₃(GlcNAc)₂에 기초하며, 이것은 단당류, 예컨대 N-아세틸 갈락토사민, 갈락토스, 뉴라민산(neuraminic acid), N-아세틸글루코사민, 프룩토스, 만노스 및 퓨코스를 첨가하여 추가 변성할 수 있다. 터미널 시알산을 포함한 다양한 단당류를 갖는 Man₃(GlcNAc)₂ 코어는 N-아세틸글루코사민에 의해 Asn-X-Ser/Thr 컨센서스 서열의 Asn에 결합할 수 있다. 이 화학적으로 복잡한 동시번역 변성은 다양한 목적을 수반하고 적절한 폴딩, 작용그룹의 배향 및 제거율 등 다양한 방법으로 단백질의 생물학에 영향을 미친다.

미국 특허 제8,008,252호(DeFrees 등)에 기술된 것을 포함한 다양한 방법들이 당 분야에서 펩티드 또는 단백질의 글리코실화 패턴을 사용자 제작하기 위해 제안되었다.

대개는 대상에서 응고 캐스케이드를 자극하거나 향상하는 것이 바람직하다. 응고인자 결핍(예를 들어, 응고인자 XI 또는 VII의 혈우병 A 및 B 또는 결핍) 또는 응고인자 저해제로 유발된 출혈 장애를 조절하기 위해 인자 VIIa가 사용되었다. 노보 노르디스크(Novo Nordisk)가 상표명 NovoSeven^®으로 제조 및 판매하는 재조합 인자 VIIa는 인자 VIII 또는 인자 IX에 대한 저해제를 갖는 혈우병 A 또는 B 환자와 후천적 혈우병 환자에서 출혈 증상의 치료; 인자 VIII 또는 인자 IX에 대한 저해제를 갖는 혈우병 A 또는 B 환자와 후천적 혈우병 환자의 외과수술 또는 침습시술에서 출혈 방지; 선천적 인자 VII 결핍 환자에서 출혈 증상의 치료 및 선천적 인자 VII 결핍 환자에서 외과수술 또는 침습시술시 출혈 방지용으로 승인되었다. 미국 특허 제5,180,583호(Hedner)는 응고인자 결함 또는 응고인자 저해제로 유발된 것이 아닌 상황에서 과도한 출혈을 제어하기 위해 인자 VIIa를 사용하는 것을 기술하고 있다. Hedner는, 예를 들어 결함이 있는 혈소판 작용, 혈소판 감소증, 또는 폰 빌레브란트(von Willebrand)병으로 유발된 출혈장애의 치료와 여기에 사용하기 위한 조성물을 기술하였다.

선천성 또는 발달된 응고인자 결핍 또는 응고인자에 대한 저해제로 유발된 것이 아닌 장애로 인한 출혈의 치료가 필요하다. 여러 임상시험에서는 출혈을 제어하는 재조합 인자 VIIa의 효능이 입증되었다. 그러나, 이 분자를 사용하면 바람직하지 않은 혈전색전 발생이 증가할 우려가 있다. 출혈은 수많은 장애, 예컨대 수술과 관련하여, 수술후 합병증, 줄기 및 장기 이식, 두개내 출혈, 대동맥류(aortic aneurysm), 및 외상, 또는 특정 항응고제의 과다복용에서 중요한 문제이다.

단작용성인 인자 VII 폴리펩티드로 출혈 장애 및 발생을 치료하는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 일 목적은 단축된 반감기 등의 하나 이상의 약동학적 특성을 특징으로 하는 단작용성 인자 VII 폴리펩티드(야생형 또는 변이체)의 조성물을 제공하는 것이다. 표적부위와 치료 시간 프레임 외부에서 혈전증의 감소된 기회를 갖는 인자 VII 분자를 제공하는 것을 목적으로 한다. 변성된 글리코실화 패턴으로 인해 증강된 클리어런스(clearance)를 갖는 인자 VII 폴리펩티드(야생형 또는 변이체)를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 원에서는 변이체 인자 VII 폴리펩티드의 조성물을 기술하였으며, 여기서 변이체 인자 VII 폴리펩티드는 서열번호: 16의 아미노산 서열과 관련하여 적어도 2개의 서열 변경을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 적어도 2개의 서열 변경은 (1) 위치 10의 프롤린 잔기가 치환된 글루타민 잔기; 및 (2) 위치 32의 리신 잔기가 치환된 글루탐산 잔기이고; 조성물 중 컨쥬게이트된 시알산의 몰 대 N-결합 글리칸의 몰 비율은 0.05 미만, 0.1 미만, 1.0 미만, 2.0 미만, 3.0 미만, 4.0 미만, 5.0 미만 또는 6.0 미만이다. 또한, 본 원에서는 변이체 인자 VII 폴리펩티드의 조성물을 기술하였으며, 여기서 변이체 인자 VII 폴리펩티드는 서열번호: 16의 아미노산 서열과 관련하여 적어도 2개의 서열 변경을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 적어도 2개의 서열 변경은 (1) 위치 10의 프롤린 잔기가 치환된 글루타민 잔기; 및 (2) 위치 32의 리신 잔기가 치환된 글루탐산 잔기이고; N-결합 글리칸의 몰당 컨쥬게이트된 시알산의 몰 비율은 (1) 0 내지 5; (2) 0 내지 4; (3) 0 내지 3; (4) 0 내지 2; (5) 0 내지 1 및 (6) 0 내지 0.5로 구성되는 군에서 선택된 범위 내이다.

본 원에서는 서열번호: 16의 아미노산 서열과 관련하여 적어도 2개의 서열 변경을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 변이체 인자 VII 폴리펩티드를 기술하였으며, 여기서 적어도 2개의 서열 변경은 (1) 위치 10의 프롤린 잔기가 치환된 글루타민 잔기; 및 (2) 위치 32의 리신 잔기가 치환된 글루탐산 잔기이고; 폴리펩티드가 컨쥬게이트된 시알산의 몰 대 N-결합 글리칸의 몰의 비율 0.05 미만, 0.1 미만, 1.0 미만, 2.0 미만, 3.0 미만, 4.0 미만, 5.0 미만 또는 6.0 미만을 갖는다. 또한, 본 원에서는 서열번호: 16의 아미노산 서열(야생형 인자 VII)을 포함하고, 조성물 내에서 컨쥬게이트된 시알산의 몰 대 N-결합 글리칸의 몰의 비율이 (1) 1 내지 5; (2) 1 내지 4; (3) 1 내지 3; (4) 1 내지 2; 및 (5) 0.5 내지 1로 구성되는 군에서 선택된 범위 내이거나 컨쥬게이트된 시알산이 검출되지 않는 인자 VII 폴리펩티드의 조성물을 기술하였다.

또한, 본 원에서는 다음을 포함하는 군에서 선택된 단리된 변이체 인자 VII 폴리펩티드를 기술하였다:

(1) 서열번호: 16의 서열과 관련하여, (1) 위치 10의 프롤린 잔기가 치환된 글루타민 잔기, (2) 위치 32의 리신 잔기가 치환된 글루탐산 잔기, 및 (3) 위치 145의 N-결합 글리코실화를 방해하는 서열 변경으로 구성되는 서열 변경을 갖는 인자 VII 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;

(2) 서열번호: 16의 서열과 관련하여, (1) 위치 10의 프롤린 잔기가 치환된 글루타민 잔기, (2) 위치 32의 리신 잔기가 치환된 글루탐산 잔기, 및 (3) 위치 322의 N-결합 글리코실화를 방해하는 서열 변경으로 구성되는 서열 변경을 갖는 인자 VII 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;

(3) 서열번호: 16의 아미노산 서열과 관련하여, (1) 위치 10의 프롤린 잔기가 치환된 글루타민 잔기, (2) 위치 32의 리신 잔기가 치환된 글루탐산 잔기, 및 (3) 위치 145 및 322의 N-결합 글리코실화를 방해하는 서열 변경으로 구성되는 서열 변경을 갖는 인자 VII 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;

(4) 서열번호: 16의 아미노산 서열과 관련하여, (1) 위치 10의 프롤린 잔기가 치환된 글루타민 잔기, 및 (2) 위치 32의 리신 잔기가 치환된 글루탐산 잔기로 구성되는 서열 변경을 갖고, 위치 145 및 322가 아스파라긴이고 N-결합 글리코실화 결합된 인자 VII 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;

(5) 서열번호: 16의 아미노산 서열과 관련하여, (1) 위치 10의 프롤린 잔기가 치환된 글루타민 잔기, (2) 위치 32의 리신 잔기가 치환된 글루탐산 잔기, (3) 위치 34의 알라닌 잔기가 치환된 글루탐산 잔기, (4) 위치 36의 아르기닌 잔기가 치환된 글루탐산 잔기, 및 (5) 위치 145에서 N-결합 글리코실화를 방해하는 서열 변경으로 구성되는 서열 변경을 갖는 인자 VII 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;

(6) 서열번호: 16의 아미노산 서열과 관련하여, (1) 위치 10의 프롤린 잔기가 치환된 글루타민 잔기, (2) 위치 32의 리신 잔기가 치환된 글루탐산 잔기, (3) 위치 34의 알라닌 잔기가 치환된 글루탐산 잔기, (4) 위치 36의 아르기닌 잔기가 치환된 글루탐산 잔기, 및 (5) 위치 322에서 N-결합 글리코실화를 방해하는 서열 변경으로 구성되는 서열 변경을 갖는 인자 VII 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;

(7) 서열번호: 16의 아미노산 서열과 관련하여, (1) 위치 10의 프롤린 잔기가 치환된 글루타민 잔기, (2) 위치 32의 리신 잔기가 치환된 글루탐산 잔기, (3) 위치 34의 알라닌 잔기가 치환된 글루탐산 잔기, (4) 위치 36의 아르기닌 잔기가 치환된 글루탐산 잔기, 및 (5) 위치 145 및 322에서 N-결합 글리코실화를 방해하는 서열 변경으로 구성되는 서열 변경을 갖는 인자 VII 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및

(8) 서열번호: 16의 아미노산 서열과 관련하여, (1) 위치 10의 프롤린 잔기가 치환된 글루타민 잔기, (2) 위치 32의 리신 잔기가 치환된 글루탐산 잔기, (3) 위치 34의 알라닌 잔기가 치환된 글루탐산 잔기 및 (4) 위치 36의 아르기닌 잔기가 치환된 글루탐산 잔기로 구성되는 서열 변경을 갖고, 위치 145 및 322가 아스파라긴이고 N-결합 글리코실화 결합된 인자 VII 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드.

본 원에서는 또한 시알산과 인자 VII 폴리펩티드의 컨쥬게이션이 감소된 인자 VII 폴리펩티드를 기술하였다. 특정 예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 변경된 글리코실화 패턴을 생성하는 변이성 폴리펩티드이다. 다른 예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 시알산 컨쥬게이션이 감소된 야생형 인자 VII 폴리펩티드이다. 특정한 구체예에서, 감소된 시알산 컨쥬게이션은 폴리펩티드를 시알리다제(sialidase) 효소로 처리하여 유발할 수 있다. 다른 구체예에서, 감소된 시알산 컨쥬게이션은 펩티드의 시알릴화(sialylation)가 부분적으로 또는 완전히 결핍된 세포주에서 재조합 인자 VII 폴리펩티드를 제조하여 유발될 수 있다. 또다른 구체예에서, 감소된 시알산 컨쥬게이션은 재조합 인자 VII 폴리펩티드와 재조합 또는 외인성 시알리다제 효소를 세포주에서 동시발현하여 유발될 수 있다.

또한, 시알산 컨쥬게이션을 감소시키는 인자 VII 폴리펩티드의 유효량을 혈병(blood clot) 형성이 바람직한 질환 또는 장애의 치료가 필요한 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 혈병 형성이 바람직한 질환 또는 장애가 있는 포유동물의 치료방법을 기술하였다. 특정 구체예에서, 컨쥬게이트된 시알산의 몰 대 N-결합 글리칸 몰의 비율은 0.05 미만이다. 다른 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함한다. 또다른 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 야생형 인자 VII을 포함한다. 추가 구체예에서, 치료되는 질환 또는 장애는 출혈, 위장관 출혈, 비제어성 출혈, 이식 또는 절제 또는 수술이 시행되고 있는 포유동물의 출혈, 정맥류 출혈, 저혈소판증, 혈우병, 두개내 출혈, 대동맥 동맥류, 및 항응고제의 과투여로 구성되는 군에서 선택된다.

추가적인 변이체, 조성물, 방법 및 관련된 생성물, 그리고 공정을 이하에 상세히 기술하였다.

도 1a-1h는 본 원에서 사용된 인자 VII 분자의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다. "V1"은 서열번호: 16의 야생형 인간 아미노산 서열과 관련하여 4개의 아미노산 돌연변이를 갖는 인간 인자 VII의 변이체이다: (P10Q, K32E, T106N 및 V253N). "V2"는 서열번호: 16의 야생형 인간 아미노산 서열과 관련하여 6개의 아미노산 돌연변이를 갖는 인간 인자 VII의 변이체이다: (P10Q, K32E, A34E, R36E, T106N 및 V253N). 도 1은 또한 실시예에서 사용된 다양한 구조물에 대한 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 본 원에서 사용된 인자 VII 분자 3개의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 본 원에서 사용된 야생형 인간 인자 VII은 서열번호: 16의 아미노산 서열을 갖는다. V1은 서열번호: 17의 아미노산 서열을 갖는다. V2는 서열번호: 18의 아미노산 서열을 갖는다. V1과 V2에서, 서열번호: 16의 야생형 인자 VII에서의 변화는 진하게 표시하였다.
도 3은 본 원의 실시예에서 사용된 3개의 인자 VII 분자를 나타낸 그림이다. N-글리코실화 부위에서 글리칸의 결합을 나타내었다. 글리칸을 표시하는데 있어서, 검은색 사각형은 N-아세틸글루코사민을 나타내고, 음영 타원형은 만노스를 나타내며, 빈 타원형은 갈락토스, 검은색 마름모형은 시알산(N-아세틸뉴라민산(N-acetyl-neuraminic acid)으로도 알려짐), 검은색 삼각형은 퓨코스를 나타낸다. 글리칸 구조는 하나의 가능한 글리칸 변이체를 사용하여 나타낸 것으로 실제 측정된 글리칸을 나타내지는 않는다.
도 4는 Asn-X-Ser/Thr 컨센서스 서열의 Asn에 결합하고 있는 N-결합 글리칸을 나타낸 그림이다. 말단 시알산을 포함하는 다양한 단당류를 갖는 Man₃(GlcNAc)₂ 코어를 나타내고 있다.
도 5는 V2를 참조로 예시된, 인자 VII 변이체의 반감기를 감소하기 위해 본 명세서에서 사용된 2가지 방법을 나타낸 그림이다.
도 6은 하이포글리코실화(hypoglycosylated) 인자 VII 분자들을 나타낸 표이다.
도 7은 실험 조건에 따른 탈시알릴화(desialylation) 후에 V2 중쇄에 남아있는 시알산을 확인하는 LC-MS 방법의 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 시알산 함량에 대한 탈시알릴화 V2의 분석을 나타낸 것이다.
도 9는 인지질 FX 활성화 어세이 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 탈시알릴화 단백질에 대한 PL-TGA 어세이 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 하이포글리코실화 인자 VII 변이체의 발현을 나타낸 것이다.
도 12는 형질감염 상청액을 사용한 하이포글리코실화 FVII 변이체의 "특이적 활성"의 측정을 나타낸 표이다.
도 13은 정제된 하이포글리코실화 변이체 pMB121에 대한 PL-TGA 어세이 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 야생형 인자 VII과 비교한 탈시알릴화 V2의 시험관내 간세포 클리어런스를 나타낸 것이다.
도 15는 인자 VII 변이체를 사용한 시험관내 간세포 클리어런스 결과를 나타낸 것이다. 하이포글리코실화 변이체는 이 모델에서 클리어런스의 증가를 나타내지 않았다. 이러한 결과는 이 분자들의 클리어런스 메카니즘이 탈시알릴화 V2가 사용된 것과는 상이한 것을 시사한다.
도 16은 래트에서의 약동학 시험결과를 나타낸 것이다. 탈시알릴화 V2 및 V1의 반감기는 Sprague Dawley 래트에서 인자 VII ELISA로 측정하였을 때 이들의 비변성 친본 분자보다 훨씬 더 짧았다.
도 17은 HemA 마우스의 약동학 시험결과를 나타낸 것이다.
도 18은 HemA 마우스의 탈시알릴화 V2 효능 시험을 나타낸 것이다.
도 19는 TVT HemA 모델에서 탈시알릴화 V2 효능 시험을 나타낸 것이다.
도 20은 인자 VII과 비교하여 탈시알릴화 V2를 사용한 HemA 마우스에서 트롬빈-항트롬빈("TAT") 생성 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 컨쥬게이션 수용성 마우스에서 탈시알릴화 V2 효능 시험을 나타낸 것이다.
도 22는 시알산의 정상적 컨쥬게이션을 갖는 야생형 인자 VII과 비교한 탈시알릴화 야생형 인자 VII (dWT VIIa)의 시험관내 간세포 클리어런스를 나타낸 것이다.
도 23은 야생형 인자 VII과 비교하여 dWT VIIa에 대한 인간 조직인자 넉인 (knock-in) (TFKI) 마우스의 테일컷(tail cut) 시험 결과를 나타낸 것이다. 탈시알릴화 인자 VII이 야생형 인자 VII보다 훨씬 더 효과적인 것으로 확인되었다.
도 24는 dWT VIIa 또는 야생형 인자 VII을 투여한 후 트롬빈 항트롬빈(TAT) 복합체의 ELISA 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 FeCl₃ 혈전증 모델에서 혈전 형성의 분석 결과를 나타낸 것이다. 제조된 dWT VIIa의 제공된 용량으로 야생형 인자 VII과 비교하여 혈전 형성이 크게 감소하였다.
도 26은 형광원성 기질로 측정된 가용성 조직인자에 대한 dWT VIIa와 야생형 인자 VII의 외견 결합친화도를 나타낸 것이다.
도 27은 가용성 조직인자와, dWT VIIa 또는 야생형 인자 VII의 복합체에 의한 인자 X의 인자 Xa로의 전환을 나타낸 것이다.

본 원에서는 급성 출혈의 치료에서 혈전성 합병증을 제한하기 위한 재조합 인자 VII 폴리펩티드(야생형 또는 변이체)의 약동학을 조절하는 방법을 기술하였다. 또한 시알산 컨쥬게이션이 감소된 인자 VII 폴리펩티드를 기술하였다. 추가로 혈액으로부터의 클리어런스가 증가되고 효능 지속기간이 감소된 재조합 인자 VII의 변이체를 기술하였다. 이러한 변이체들은 변경된 글리코실화 패턴으로 인해 재조합 야생형 인자 VII보다 생체내 반감기가 더 짧다. 또한 이러한 단작용성 인자 VII 폴리펩티드의 제조 및 사용방법을 기술하였다.

인자 VII과 글리코실화를 설명하기 위해, 도 3과 4를 제공하였다. 도 3은 각각의 도메인을 갖는 인자 VII 분자의 3가지 예를 도해적으로 나타낸 것이다. 인자 VII은 Gla, EGF, 및 촉매 도메인을 포함하고, 2 N-결합 글리칸 (N145 및 N322)을 함유하는 단백질이다. V1은 4개의 돌연변이체(P10Q, K32E, T106N, V253N)를 갖는 인자 VII 변이체이다. V2는 6개의 돌연변이체(P10Q, K32E, A343, R36E, T106N, V253N)를 갖는 인자 VII 변이체이다. V1과 V2는 모두 활성화 혈소판에 대한 증가된 친화도를 가지며, 2개의 추가 N-글리코실화 부위를 함유하여 야생형 인자 VII과 비교하여 반감기가 더 길어진다. V2에서만 발견된 2개 돌연변이체(A34E, R36E)는 그의 조직인자 독립성의 원인인 것으로 생각된다.

도 4는 Asn-X-Ser/Thr 컨센서스 서열의 Asn에서 결합을 나타내는 N-결합 글리칸의 예를 도해적으로 나타낸 것이다. 말단 시알산을 포함하는 다양한 단당류를 갖는 Man₃(GlcNAc)₂ 코어를 나타냈다.

본 원에서는 목적하는 짧은 반감기를 갖는 인자 VII 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공하였다. 단작용성 인자 VII 폴리펩티드를 제조하는 2가지의 일반적 방법이 제공되었으며, 이 방법들은 별도로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 인자 VII 변이체의 일 예를 사용하여 도 5에 도해적으로 나타낸 바와 같이, 글리코실화 인자 VII 변이체는 탈시알릴화 또는 탈글리코실화에 의해 변이체의 글리코실화 패턴을 변경하여 그의 반감기를 변경, 바람직하게 단축할 수 있다. 이 방법은 또한 야생형 인자 VII 폴리펩티드를 탈시알릴화하기 위해 사용될 수도 있다.

탈시알릴화는 당분야에서 공지된 방법으로 일어날 수 있다. 적합한 방법은, 예를 들어 탈시알릴화 작용을 하는 공지된 효소, 예를 들어 비제한적으로 시알리다제(sialidase), 예컨대 뉴라미니다제-아가로스 비즈(beads)(Sigma N5254), 및 GI:40479와 FEBS Lett. 238 (1), 31-34 (1988)에서 동정된 클로스트리듐 퍼프링엔스(Clostridium perfringens)로부터의 뉴라미니다제와의 접촉에 의한 효소적 탈시알릴화를 포함한다. 이러한 탈시알릴화는 부분 정제된 재조합 인자 VII 폴리펩티드와 시험관 내에서 적합한 조건 하에 시알리다제와 접촉하거나 재조합 인자 VII 폴리펩티드를 발현하는 숙주세포에서 시알리다제의 동시 발현에 의해 달성될 수 있다. 시험관 내에서 접촉은 단지 부분적 탈시알릴화가 일어날 만큼 지속할 수 있다. 예를 들어, 목적하는 반감기가 인자 VII 폴리펩티드 조성물 중에서 N-결합 글리칸의 몰에 대해 컨쥬게이트된 시알산 0.5 내지 1몰의 비율을 갖는 분자로부터 얻어질 수 있는 경우, 이후 전체 탈시알릴화가 일어나기 전에 제한된 기간 동안 시알리다제와의 접촉이 필요할 수 있다. 부분적 탈시알릴화는 또한 변성 시알리다제를 사용하거나, 시알리다제의 전체 작용화를 둔화하거나 손상하는 조건하에서 시알리다제와 인자 VII 폴리펩티드를 접촉하거나, 단지 부분적으로 탈시알릴화된 폴리펩티드를 생산하기 위한 당업자들에게 명백한 다른 방법으로 얻어질 수 있다. 부분적 탈시알릴화는 전체적으로 탈시알릴화되어 있는 레퍼런스 제제에서 컨쥬게이트된 시알산 대 글리칸의 비율을 비교하여 측정할 수 있다.

탈시알릴화는 또한 시알산 첨가에 필요한 하나 이상의 세포 성분이 없거나 결핍된 세포주에서 인자 VII 폴리펩티드(야생형 또는 변이체)의 발현에 의해 얻을 수 있다. 특정 세포주는 시알릴화를 감소 또는 제거하기 위해 변성되었거나 변성할 수 있다. 예를 들어, 중국 햄스터 난소("CHO") 기원을 갖는 Lec2 세포는 야생형 세포보다 약 10배 미만의 시알산을 갖는 당단백질을 제조한다. 글리칸의 탈시알릴화로 Asialo당단백질 Receptor (ASGPR)을 포함하는 간 리셉터에 의해 활성적으로 소거될 수 있는 분자가 발생하고, 이러한 이유로 반감기를 단축하는 것으로 생각된다.

두 번째 방법은 인자 VII 변이체를 탈글리코실화하여 반감기가 단축된 분자를 얻는 것이다. 글리코실화 감소는 신장 클리어런스(50-60Kd 컷오프, 개정 Caliceti P and Veronese FM, "폴리(에틸렌 글리콜)-단백질 컨쥬게이트의 약동학 및 생체분포 특성", Adv Drug Deliv Rev. 2003;55(10): 1261-77, Weinstein T et al., "래트의 신장 세뇨관 상피에서 글리코사미노글리칸 분포", J Am Soc Nephrol. 1997;8(4):586-95, Choi HS et al., "양자점의 신장 클리어런스", Nat Biotechnol. 2007;25(10): 1165-70), 표면 전하와 등점점(pI) 변화(당단백질 순환의 증가와 연관, Byrne B. et al., "시알산: 생체약학적 단백질과 살아있는 세포의 생물학적 및 물리적 특성에 영향을 주는 탄수화물 잔기", Drug Discovery Today 2007;12(7-8):319의 리뷰 참조), 및 임의 수의 혈장 프로테아제로부터 극소수 당단백질 매개 보호(Ton G., et al, 2005, Nie Y et al, 2006)를 통해 인자 VII의 클리어런스를 증강한다.

본 원에서 사용된 탈글리코실화는 비제한적으로 레퍼런스 인자 VII 폴리펩티드와 비교하여 변경된 아미노산 서열을 얻는 인자 VII 폴리펩티드의 유전적 변성을 포함하며, 여기서 변경은 N-결합 글리코실화 부위를 제거한다. 예들 들어, 인자 VII 변이체는 N-결합 글리칸 컨센서스 서열, 즉 Asn-X-Ser/Thr(여기서 X는 프롤린을 제외한 아미노산을 나타낸다)에 필요한 하나 이상의 아미노산 잔기에서 글리코실화-방해(disrupting) 변경으로 제조할 수 있다. 본 원에서 사용된 인자 VII 아미노산 서열의 "글리코실화-방해(disrupting) 변경"이란 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 첨가 또는 결실을 야기하고 N-결합 글리코실화를 위한 하나 이상의 부위를 상실하는 야생형 인자 VII과 관련한 변경을 지칭한다. 예를 들어, N-결합 글리코실화 부위는 야생형 인자 VII에 존재하는 N145 및/또는 N322를 임의의 아미노산(자연적으로 발생 또는 비자연적으로 발생)으로 대체하여 제거할 수 있다. 글리코실화를 방해하기 위해 변경될 때 활성에 최소한의 영향을 미치는 글리코실화 부위가 동정되어야 한다. 다른 예에서, 탈글리코실화는 글리코실화를 위한 시스템이 없는 세포주에서 인자 VII 폴리펩티드(야생형 또는 변이체)의 발현으로 일어날 수 있다. 예를 들어, 박테리아 세포에서 생산된 인자 VII은 박테리아 세포가 글리코실화를 위한 세포내 시스템이 없기 때문에 완전히 글리코실화되지 않을 것으로 예상된다. 다른 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 말단 글리코실화 효소가 없거나 이러한 효소를 갖지만 하나 이상이 야생형 세포주에서 발견된 것보다 더 적은 활성을 갖는 세포주에서 생산된다. 예를 들어, Appa R. et al., 201 , Narita M et al., 1998, Seested et al., 2010 참조. 다른 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 인자 VII에 대한 글리칸의 합성 또는 결합과 연관된 효소의 결함 또는 CMP-시알산 트랜스포터의 합성과 연관된 효소의 결함이 있는 세포주에서 생산된다. 다른 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 데글리코실라제(deglycosylase) 또는 탈글리코실화를 위한 화학물질로 처리된다.

시알리다제, 데글리코실라제, 또는 인자 VII 폴리펩티드에서 글리칸을 감소하거나 제거하는 화학물질에 의한 처리는 발현, 정제에서 또는 정제 후에 일어날 수 있다.

일 구체예에서, 인자 VII 변이체 V1 (N322, N145) 또는 인자 VII 변이체 V2 (N322, N145, N106, N253)의 N-결합 글리코실화 부위 중 적어도 하나를 활성에 대한 효과를 최소화하면서 선택적으로 제거하였다. N-글리칸 부위는 N-글리칸 컨센서스 서열을 절단하여 DNA 수준에서 제거되었다. 이것은 N (아스파라긴) 코돈의 제거와 Q (글루타민) 코돈으로의 대체로 수행되었다. 도 6은 하이포글리코실화 변이체의 예를 나타내는 표이다. 글리코실화 변이체는 야생형 인자 VII(본 원에서는 "F7"이라 함), V1, 및 V2 주쇄에서 만들어졌다. V1과 V2의 조작된 N-글리칸 부위(N106, N253)는 그들의 야생형 서열(T106, V253)로 다시 복구되었다. 변이체 pMB113, pMB117, 및 pMB121은 2개의 내인성 N-글리코실화 부위(N145, N322)를 각각 함유하는 야생형 인자 VII, V1, 및 V2 구조물이다. 도 6의 다른 변이체들 모두는 N을 Q 돌연변이에 삽입하여 제거된 1 또는 2의 그의 내인성 N-글리칸 부위 (N145Q, N322Q)를 갖고 있다. 이러한 탈글리코실화 방법은 더 신속한 클리어런스를 야기한다.

본 명세서의 일 측면에서, 탈글리코실화와 탈시알릴화를 조합하여 바람직한 단축된 반감기를 갖는 인자 VII 폴리펩티드를 얻는다. 예를 들어, 인자 VII 분자는 유전적으로 변성되어 야생형 인자 VII에 존재하는 둘 초과의 추가적인 N-결합 글리코실화 부위를 포함할 수 있다. 이 변이체는 이후 본 원에서 기술된 방법들 중 하나를 사용하여 탈시알릴화될 수 있다. 얻어진 분자는 이후 말단 시알산 없이 각각의 N-결합 글리코실화 부위에서 글리칸 구조를 유지할 수 있다. 본 원에 보고된 실험에서, 출원인은 소수의 N-결합 글리코실화 부위를 갖는 유사한 탈시알릴화 인자 VII 변이체보다 제거시간이 더 빠른 변이체를 보고하였다. 마찬가지로, 야생형 인자 VII에서 발견된 2개 N-결합 글리코실화 부위만을 갖는 인자 VII 폴리펩티드는 이들 중 하나의 부위에서 탈글리코실화된 후, 탈시알릴화될 수 있다. 시알산이 없는 하나의 N-결합 글리칸을 갖는 얻어진 인자 VII 변이체는 본 원에 보고된 실험적 증거에 기초하여 제2 N-결합 글리코실화 부위가 결여되지 않은 유사한 인자 VII 폴리펩티드와는 상이한 약동학을 갖는다.

정의 및 구체예

달리 정의되지 않는 한, 본 원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 일반적으로 본 명세서가 속하는 분야에 숙련된 사람들이 일상적으로 이해하는 것과 같은 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 원에 사용된 명명법과 세포 배양, 분자 유전학, 유기화학과 핵산 화학 및 혼성화의 실험실 공정은 당분야에서 공지되고 통상적으로 사용된 것들이다. 표준 기술이 핵산과 폴리펩티드 합성에서 사용되었다. 본 원에서 사용된 명명법과 이하에 기술된 분석화학 및 유기 합성의 실험실 공정은 당분야에서 공지되고 통상적으로 사용된 것들이다. 표준 기술 또는 그의 변형이 화학적 합성과 화학적 분석에 사용되었다. 유전자 조작에 사용된 방법은 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.에서 찾아볼 수 있다.

"시알산" 또는 "시알릴"이란 용어는 9개 탄소 카복실화 당류의 성분을 지칭한다. 시알산류의 가장 통상적인 성분은 N-아세틸-뉴라민산 (2-케토-5-아세타미도-3,5-디데옥시-D-글리세로-D-갈락토노뉼로피라노스-1-온산(대개 Neu5Ac, NeuAc, 또는 NANA로 약칭))이다.

"폴리펩티드" 및 "단백질"이란 용어는 본 원에서 상호교환적으로 사용되었으며, 모노머가 아미노산이고 아미드 결합에 의해 함께 결합된 폴리머를 지칭한다. 또한, 비천연 아미노산, 예를 들어 β-알라닌, 페닐글리신 및 호모아르기닌도 포함된다. 유전자 코딩되지 않는 아미노산도 본 원에 기술된 방법으로 사용할 수 있다. 또한, 반응성 그룹, 글리코실화 부위, 폴리머, 치료 모이어티, 생분자 등을 포함하기 위해 변성된 아미노산도 사용할 수 있다. 본 원에서 사용된 모든 아미노산은 D- 또는 L-이성체이다. 일반적으로, L-이성체가 바람직하다. 본 원에서 사용된 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 글리코실화된 및 비글리코실화된 폴리펩티드와 단백질 각각을 지칭한다.

"아미노산"이란 용어는 자연발생 및 합성 아미노산뿐만 아니라, 자연적으로 발생한 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 동족체 및 아미노산 모조체(mimetics)를 지칭한다. 자연적으로 발생한 아미노산은 유전자 코드로 코딩된 것들과 나중에 변성된 아미노산, 예를 들어 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다. "아미노산 동족체"는 자연적으로 발생한 아미노산과 동일한 기본 화학구조, 즉 수소에 결합된 α 탄소, 카복실 그룹, 아미노 그룹, 및 R 그룹을 갖는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르루신(norleucine), 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 지칭한다. 이러한 동족체는 변성된 R 그룹(예를 들어, 노르루신) 또는 변성된 펩티드 주쇄를 갖지만, 자연적으로 발생한 아미노산과 동일한 기본 화학구조를 유지한다. "아미노산 모조체(mimetics)"는 아미노산의 일반적 화학구조와는 상이하지만 자연발생한 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 화학적 화합물을 지칭한다.

폴리펩티드 또는 단백질 약물을 환자에게 투여하는 내용에서 본 원에 사용된 "반감기" 또는 "t1/2"이란 용어는 환자에서 약물의 혈장 농도가 절반까지 감소되는데 필요한 시간으로 정의된다.

반감기는 시험 동물에서, 예를 들어 약 25-250 마이크로그람/kg의 제제 용량을 투여하고; 투여 후 소정의 시간에 혈장 샘플을 취하여; 하나 이상의 응고 어세이(또는 바이오어세이), 면역어세이 등을 사용하여 샘플에서 인자 VII 폴리펩티드의 함량을 측정하여 결정할 수 있다. 데이터를 그래프로 표시할 수 있으며, 이후 곡선 하의 면적으로 생체이용률을 측정할 수 있다. 특정예에서는 래트 또는 마우스 모델을 반감기 측정에 사용하였다. 인자 VII 폴리펩티드 또는 그의 조성물의 상대적 생체이용률은 단작용성 인자 VII 폴리펩티드의 곡선하 면적 대 야생형 인자 VII 또는 다른 적절한 비교 폴리펩티드 또는 단백질의 곡선하 면적의 비율을 지칭한다. 인자 VII의 혈액 응고 활성을 갖는 인자 VII 변이체는 본 원에 기술된 목적과 방법에 유용하다. 본 원에 사용된 인자 VII 변이체는 폴리펩티드이다. "변이체(변이성) 인자 VII 폴리펩티드"와 "인자 VII 변이체"란 용어는 본 원에서 상호교환적으로 사용되었다. 일 구체예에서, 인자 VII 변이체는 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 야생형 인자 VII(서열번호: 16)로부터 유도된 아미노산 서열을 갖는다. 아미노산 치환을 나타내는데 있어서, 첫 번째 문자는 야생형 인간 인자 VII에 존재하는 임의 위치의 아미노산이다. 다음 숫자는 인간 야생형 인자 FVII 내의 위치를 나타낸다. 두 번째 문자는 야생형에서 발견된 아미노산을 대체하는 아미노산을 나타낸다. 예를 들어, "P10Q"는 아미노산 위치 10의 프롤린(P)이 글루타민(Q)으로 치환된 것을 나타낸다.

특정한 예에서, 인자 VII 변이체는 P10Q, K32E, R36E, A34E, T106N, 및 V253N로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 다른 예에서, 인자 VII 변이체는 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6의 이러한 치환을 포함한다. 다른 예에서, 인자 VII 변이체는 서열번호: 16의 아미노산 서열(야생형 인간 인자 VII)과 관련하여 적어도 2개의 서열 변경을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 적어도 2개의 서열 변경은 (1) 위치 10의 프롤린 잔기가 치환된 글루타민 잔기, 및 (2) 위치 32의 리신 잔기가 치환된 글루탐산 잔기이다. 또다른 예에서, 인자 VII 변이체는 서열번호: 16의 아미노산 서열과 관련하여 적어도 3개의 서열 변경을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 적어도 3개의 서열 변경은 (1) 위치 10의 프롤린 잔기가 치환된 글루타민 잔기, (2) 위치 32의 리신 잔기가 치환된 글루탐산 잔기, 및 (3) 위치 36의 아르기닌 잔기가 치환된 글루탐산 잔기이다. 다른 예에서, 인자 VII 변이체는 서열번호: 16의 아미노산 서열과 관련하여 적어도 4개의 서열 변경을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 적어도 4개의 서열 변경은 (1) 위치 10의 프롤린 잔기가 치환된 글루타민 잔기, (2) 위치 32의 리신 잔기가 치환된 글루탐산 잔기, (3) 위치 36의 아르기닌 잔기가 치환된 글루탐산 잔기, 및 (4) 위치 34의 알라닌 잔기가 치환된 글루탐산 잔기이다. 구체적인 일 예에서, 인자 VII 변이체는 서열번호: 16의 아미노산 서열과 관련하여 적어도 6개의 서열 변경을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 적어도 6 또는 6개의 서열 변경은 (1) 위치 10의 프롤린 잔기가 치환된 글루타민 잔기, (2) 위치 32의 리신 잔기가 치환된 글루탐산 잔기, (3) 위치 36의 아르기닌 잔기가 치환된 글루탐산 잔기, (4) 위치 34의 알라닌 잔기가 치환된 글루탐산 잔기, (5) 위치 106의 트레오닌 잔기가 치환된 아스파라긴 잔기 및 (6) 위치 253의 발린 잔기가 치환된 아스파라긴 잔기이다. 또다른 구체적인 예에서, 인자 VII 변이체는 상기한 6개 변성만을 포함한다. 이러한 변이체들에 대한 상세는 Maxygen의 WO 200158935, 및 Pedersen 등의 미국특허 제7,371,543호에서 찾을 수 있고, 이 문헌들은 그 전체가 본 원에 참조로 포함되었다.

본 원에 기술된 인자 VII 변이체는 작용성 인자 VII 폴리펩티드를 출발 폴리펩티드로 사용하여 디자인할 수 있다. 특정한 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 인간 인자 VII 폴리펩티드이다. 다른 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 서열번호: 16의 인간 인자 VII 폴리펩티드, 또는 그의 변성된 형태 또는 대립형질 (allelic) 변이체이다. 유용한 출발 폴리펩티드는 또한 인자 VII 활성을 갖는 야생형 인간 인자 VII(서열번호: 16)의 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 또는 66% 일치하는 아미노산 서열을 포함하는 변성(modified) 또는 변이체(variant) 인자 VII 폴리펩티드를 포함한다. 또한, 특정한 예에서, 본 명세서의 변이체 인자 VII 폴리펩티드는 인자 VII 작용성(functionality)을 갖고, 서열번호: 16과 관련하여 본 원에서 언급된 하나 이상의 아미노산 변경도 함유하는 서열번호: 16의 서열에 대해 적어도 약 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 또는 66%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 서열번호: 16에 대해 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 또는 66% 초과의 상동성(homology) 및 인자 VII 활성을 갖고, 본 원에 기재된 하나 이상의 아미노산 변경을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

본 원에 사용된 인자 VII 변이체는 또한 야생형 인자 VII의 글리코실화 변이체를 포함한다. 예를 들어, 부분적 탈시알릴화 야생형 인자 VII 변이체와 그의 조성물은 야생형 인자 VII보다 반감기가 짧기 때문에 유용할 수 있다. 또한, 본 원에서는 부분적 또는 전체 탈시알릴화 야생형 인자 VII의 약학 제제 및, 인자 VII 활성을 갖는 단작용성 폴리펩티드가 유리한 본 원에 열거된 질환의 치료에서 이러한 폴리펩티드와 제제의 사용이 유용하다. 부분 또는 전체 탈시알릴화는 본 원에 기술된 인자 VII 폴리펩티드의 조성물 중 컨쥬게이트된 시알산의 몰 대 N-결합 글리칸의 몰 비율로 측정될 수 있다.

본 원의 인자 VII 변이체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또한 유용하다. 일 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 야생형 인자 VII의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1)에 대한 전체 길이에 걸쳐서 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 또는 66%의 동일성을 갖고, 작용성 인자 VII 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 코딩된다. 특정예에서, 뉴클레오티드 서열은 또한 서열번호: 16과 관련하여 본 원에서 언급된 하나 이상의 아미노산 변경을 함유하는 폴리펩티드를 코딩한다. 다른 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 야생형 인자 VII의 뉴클레오티드 서열(서열번호: 1)에 대해 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 또는 66% 초과의 상동성을 갖고, 작용성 인자 VII 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 코딩된다. 특정예에서, 뉴클레오티드 서열은 또한 서열번호: 16과 관련하여 본 원에서 언급된 하나 이상의 아미노산 변경을 함유하는 폴리펩티드를 코딩한다.

동일성 백분율은 전체 아미노산 또는 핵산 서열 영역에 대해 계산된다. 당업자라면 상이한 서열 비교를 위해 다양한 알고리즘에 기초한 일련의 프로그램을 입수할 수 있다. 적어도 하나의 구체예에서, 2개 아미노산 서열 간의 동일성 백분율은 EMBOSS 소프트웨어 패키지(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice, P., Longden, I., and Bleasby, A, Trends in Genetics 16(6), 276-277, 2000)의 니들 프로그램에 포함된 Needleman과 Wunsch 알고리즘(Needleman 1970, J. Mol. Biol. (48):444-453)으로 관련성이 적은 단백질에 대한 BLOSUM 45 또는 PAM250 점수화 매트릭스, 또는 밀접한 단백질들에 대한 BLOSUM 62 또는 PAM160 점수화 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 개시 패널티 (gap opening penalty)와 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 갭 확장 패널티 (gap extension panalty)를 사용하여 측정된다. EMBOSS 패키지의 로컬 설치와 웹 서비스 연결에 대한 가이드는 emboss.sourceforge.net에서 찾을 수 있다. 니들 프로그램을 사용하여 2개 아미노산 서열을 배열하는데 이용될 매개변수의 비제한적 예는 디폴트 매개변수, 예를 들어 EBLOSUM62 점수화 매트릭스, 10의 갭 개시 패널티 및 0.5의 갭 확장 패널티이다. 또다른 구체예에서, 2개 뉴클레오티드 서열 간의 동일성 백분율은 EDNAFULL 점수화 매트릭스와 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 개시 패널티와 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 갭 확장 패널티를 사용하는 EMBOSS 소프트웨어 패키지(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice, P., Longden, I., and Bleasby, A, Trends in Genetics 16(6), 276-277, 2000)의 니들 프로그램을 사용하여 측정된다. 니들 프로그램을 사용하여 2개 아미노산 서열을 배열하는데 이용될 매개변수의 비제한적 예는 디폴트 매개변수, 예를 들어 EDNAFULL 점수화 매트릭스, 10의 갭 개시 패널티 및 0.5의 갭 확장 패널티이다. 핵산과 단백질 서열은 또한, 예를 들어 다른 부류의 성분 또는 관련 서열을 동정하기 위해 공개 데이터베이스에 대한 검색을 수행하는 "미지 서열"로 사용될 수 있다. 이러한 검색은 Altschul 등(Altschul 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10)의 프로그램 중 BLAST 시리즈(버젼 2.2)를 사용하여 수행할 수 있다. 본 명세서의 핵산 서열을 미지 서열로 사용하는 BLAST는 BLASTn, BLASTx, 또는 tBLASTx 프로그램으로 디폴트 매개변수를 사용해서 수행하여 본 명세서의 핵산 서열로 코딩되는 서열과 상동인 뉴클레오티드 서열(BLASTn, tBLASTx) 또는 아미노산 서열(BLASTx)을 얻을 수 있다. 본 명세서의 핵산 서열에 의해 코딩되는 단백질 서열을 미지 서열로 사용하는 BLAST는 BLASTp 또는 tBLASTn 프로그램으로 디폴트 매개변수를 사용해서 수행하여 본 명세서의 서열과 상동인 아미노산 서열(BLASTp) 또는 핵산 서열(tBLASTn)을 얻을 수 있다. 비교 목적의 갭화(gapped) 배열을 얻기 위해, 디폴트 매개변수를 사용하는 갭화 BLAST는 Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402에 기술된 바와 같이 사용할 수 있다.

본 명세서의 폴리뉴클레오티드는 기본적으로 상기한 뉴클레오티드 서열로 구성되거나 상기한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 따라서, 이들은 다른 뉴클레오티드 서열도 함유할 수 있다. 특정한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 오픈리딩프레임 이외에도 코딩 유전자 영역의 3' 및/또는 5' 말단, 예를 들어 코딩 영역의 5' 말단의 상부로 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 초과 뉴클레오디드의 서열, 및/또는 코딩 유전자 영역의 3' 말단의 하부로 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 또는 초과 뉴클레오디드의 서열에서 다른 비번역 서열을 포함할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 하나의 짝이 위에 언급된 뉴클레오티드 서열로 코딩되는 폴리펩티드인 융합 단백질을 코딩할 수 있다. 이러한 융합 단백질은 이른바 "태그(tag)"를 포함할 수 있으며, 태그는 검출가능한 마커 또는 정제를 위한 보조수단으로 작용할 수 있다. 다른 목적의 태그가 당분야에 알려져 있으며 FLAG-태그, 6-히스티딘-태그, MYC-태그 등을 포함한다. 일 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 발현조절서열을 추가로 포함한다.

특정한 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 적합한 벡터에 삽입된다. 다양한 용도에 유용한 수많은 벡터들이 당분야에 알려져 있으며, 당업자라면 목적하는 용도에 적절한 벡터를 용이하게 선택할 수 있다. 특정예에서, 벡터는 클로닝 벡터 또는 발현벡터일 수 있다. 다른 예에서, 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드(cosmid), 또는 인공 염색체일 수 있다. 특정예에서, 인자 VII 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 적절한 프로모터의 조절 하, 및/또는 인접하여 위치할 수 있다. 다양한 목적에 유용한 수많은 프로모터가 당분야에 알려져 있으며, 당업자라면 목적하는 용도에 적절한 프로모터를 용이하게 선택할 수 있다. 특정예에서, 프로모터는 구성요소 프로모터, 유도성 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터일 수 있다.

특정 구체예에서, 인자 VII 폴리펩티드는 세포, 조직 또는 개체에서 재조합 생산된다. 특정 구체예에서, 이러한 재조합 생산은 숙주세포를 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 또는 이러한 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염하여 수행된다. 형질전환과 형질감염의 다양한 방법들이 당분야에 알려져 있으며, 당업자라면 목적하는 용도에 적절한 방법을 용이하게 선택할 수 있다.

이러한 재조합 생산은 또한 적합한 숙주세포, 조직 또는 개체를 사용하여 이루어질 수 있다. 적합한 세포, 조직 및 개체는 당분야에 잘 알려져 있으며, 당업자라면 목적하는 용도에 적절한 숙주를 용이하게 선택할 수 있다. 일부 구체예에서, 숙주세포는 포유동물 세포이다. 적합한 포유동물 세포주의 예는 COS-1 (ATCC CRL 1650), 새끼 햄스터 신장(BHK), HEK293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977), HEK293T (ATCC CRL 11268; DSM ACC 2494), 및 HEK293F (Invitrogen R79007) 세포주이다. 유용한 BHK 세포주는 tk³¹ ts13 BHK 세포주 (Waechter and Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1106-1110, 1982, 본 원에 참조로 포함)이며, 이하 BHK 570 세포라 칭하였다. BHK 570 세포주는 American Type Culture Collection(12301 Parklawn Dr., Rockville, Md. 20852)에 ATCC 기탁번호 CRL 10314로 기탁하였다. tk^- tsl3 BHK 세포주는 ATCC에서 기탁번호 CRL 1632로 입수할 수 있다. 또한, 다양한 다른 세포주들을 본 명세서 내에서 사용할 수 있으며, 예를 들어 래트 Hep I (Rat hepatoma; ATCC CRL 1600), 래트 Hep II (Rat hepatoma; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), 인간 폐(ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), CHO (ATCC CCL 61), CHO K1(ATCC CCI61), DUKX 세포(Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980) 및 CHO-DG44 세포(Urlaub et al. Cell 33: 405-412, 1983)이다.

인자 VII 폴리펩티드가 본 원에서 정의된 바와 같고 조성물 중에서 N-결합 글리칸의 몰당 컨쥬게이트된 시알산 몰의 비율이 0.05 미만, 0.1 미만, 1.0 미만, 2.0 미만, 3.0 미만, 4.0 미만, 5.0 미만 또는 6.0 미만인 인자 VII 폴리펩티드의 조성물, 또는 N-결합 글리칸의 몰당 컨쥬게이트된 시알산 몰의 비율이 (1) 0 내지 8; (2) 0 내지 7; (3) 0 내지 6; (4) 0 내지 5; (5) 0 내지 4; (6) 0 내지 3; (7) 0 내지 2; (8) 0 내지 1 및 (9) 0 내지 0.5, 또는 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 3, 3 내지 8, 3 내지 7, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 4 내지 8, 4 내지 7, 4 내지 6, 4 내지 5, 및 0.1 내지 1의 비율로 구성되는 군에서 선택된 범위 내에 있는 조성물이 유용하다. 비율은 당단백질 상의 글리칸 수와 관련하여 당단백질에 결합된 시알산 몰의 수치이다. 글리칸의 수는 당단백질 내에서 N-결합된 글리칸에 결합된 당 모이어티의 수를 지칭하며, 여기서 하나의 N-결합 글리코실화 부위는 이 비율의 목적에 대해 본 원에서 정의된 바와 같이 하나의 글리칸만을 지지할 수 있다. 이 비율은 시알산 형광 표지 키트, 예컨대 Takara Bio Inc. (cat. #4400)가 판매하는 키트를 사용하여 측정한다. 시알산 형광 표지 키트는, 예컨대 부분적 산 가수분해 또는 시알리다제, 예컨대 Arthrobacter ureafaciens 시알리다제를 사용하여 결합된 당단백질로부터 시알산을 유리하는 단계를 포함한다. 자유 시알산은 이후 형광단, 예컨대 1,2-디아미노-4,5-메틸렌옥시벤젠("DMB")으로 표지된다. 표지된 시알산은 HPLC를 사용하고 보정곡선과 피크 높이를 비교하여 정량적으로 측정된다. 따라서, 측정된 비율은 조성물의 모든 인자 VII 폴리펩티드로부터 방출된 글리칸 몰당 시알산 몰의 비율이다.

구체예의 일 시리즈에서, 인자 VII 폴리펩티드의 조성물 또는 단리된 폴리펩티드 자체는 인간 또는 포유동물 혈장, 예를 들어 마우스 또는 래트 혈장에서 측정된, 2시간 미만, 1.5시간 미만, 1시간 미만, 0.75시간 미만, 0.5시간 미간, 0.25시간 미만, 0.1시간 미만, 또는 적절하게 측정할 수 없는 정도의 짧은 반감기를 갖는다.

본 원에서 사용된 인자 VII 활성이란 당분야에서 알려진 바와 같이 인자 VII-결핍성 혈장 및 트롬보플라스틴을 사용한 제제의 혈액 응고를 촉진하는 능력을 측정하여 정량화될 수 있는 생물학적 활성이다. 특정예에서, 인자 VII 활성을 갖는 인자 VII 폴리펩티드는 동일 조건하에서 측정했을 때 야생형 인자 VII 활성의 적어도 25%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%를 나타낸다.

인자 VII 폴리펩티드의 약학 제제와, 인자 VII 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 첨가제 또는 담체를 포함하는 그의 조성물이 또한 유용하다. 특정예에서, 약학 제제는, 예컨대 정맥내, 피하 또는 근육내 투여에 의한 비경구 투여용이며, 투약은 단일 볼러스(bolus) 투여, 간헐적 투여, 또는 지속적인 정맥 주입으로 가능하다. 국소 제제가 또한 유용하다. 일 구체예는 본 원에 기술된 단리된 인자 VII 폴리펩티드를 포함하거나, 본 원에 기술된 인자 VII 폴리펩티드의 조성물을 포함하는 약학 제제를 사용시 재구성되는 동결건조 조제물로 포함한다. 경우에 따라, 약학 제제는 재구성을 필요로 하지 않는 바로 사용 가능한 안정한 액체 제제일 수 있다. 약학제제는 일회용 바이알 내의 1, 2, 5, 또는 8 mg 인자 VII 폴리펩티드의 동결건조 분말일 수 있다. 특정된 부피의 액체, 예컨대 히스티딘을 함유하는 멸균수로 재구성한 후, 최종 용액은 치료 효과를 나타내는 인자 VII 폴리펩티드의 적합한 양, 예컨대 비제한적으로 1 mg/mL (1000 마이크로그람/mL), 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 1-2 mg/mL, 1-3 mg/mL, 1-5 mg/mL, 1-10 mg/mL, 0.5-1 mg/mL, 또는 0.5-2 mg/mL의 인자 VII 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 환자에게 투여하는데 적합한 투여량은 당업자들이, 예를 들어 환자의 체중, 출혈장애 또는 치료 중인 증상의 종류 및 적용된 특정한 인자 VII 폴리펩티드의 활성에 기초하여 용이하게 결정할 수 있다. 특정예에서, 투여량은 70-110 마이크로그람/kg, 70-90 마이크로그람/kg, 또는 80-100 마이크로그람/kg의 범위일 수 있고, 90 마이크로그람/kg일 수 있다. 동결건조 분말은 수성 담체, 예컨대 물, 완충된 물, 0.4% 살린(saline), 0.3% 글리신 등으로 재구성할 수 있다. 비경구 투여가능한 조성물을 제조하는 실제 방법은 당업자들에게 공지되어 있거나 명확하고, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1990)에 상세히 기술되어 있다. 외상의 경우에 바람직할 수 있는 국소 사용은 스프레이, 관류, 카테터, 스텐트(stent), 혈관 이식 또는 스텐트, 연고, 또는 당분야에 알려진 다른 제제에 의해 수행될 수 있다. 특정예에서, 국소 투여는 고형 또는 반고형 매트릭스, 예컨대 외과적 스펀지 또는 콜라겐 매트릭스에 의한 것일 수 있고, 이것은 인자 VII 변이체를 포함하는 조성물로 처리, 주입, 코팅되거나 조성물 중에 침습된다. 이러한 매트릭스를 제조하는 방법은 당분야에 공지되어 있으며(예를 들어, Thrombosis/Hemostasis 12:445, 2006 참조), 당업자라면 적절한 투여량과 제공된 매트릭스 상에 조성물을 적용하는 방법을 용이하게 결정할 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명은 인자 VII 폴리펩티드를 포함하는 키트에 관한 것이다. 특정예에서, 키트는 적합한 약학 조성물 중에 인자 VII 폴리펩티드를 함유하는 바로 사용가능한 액체를 함유하는 바이알을 함유한다. 다른 예에서, 키트는 동결건조된 인자 VII 폴리펩티드, 또는 이 폴리펩티드를 포함하는 동결건조 제제를 함유하는 바이알, 및 재구성을 위한 희석제를 함유한다. 다른 예에서, 키트는 인자 VII 폴리펩티드의 국소 제제, 예를 들어 연고, 스프레이 또는 액체, 및 스펀지 같은 매트릭스 또는 국소 제제를 환자에게 투여하기 전에 적용될 수 있는 다른 의료용 매트릭스를 함유한다.

본 원에 기술된 인자 VII 폴리펩티드의 조성물 또한 유용하다. 인자 VII은 그의 자연적 분해산물과의 혼합물로 존재한다. 따라서, 인자 VII 폴리펩티드의 조성물은 본 원에 나열된 전체 아미노산 서열 중 하나를 갖는 폴리펩티드와 본 원에 기술된 것들 중 부분적 아미노산 서열을 갖는 분해산물을 포함한다. 게다가, 인자 VII은 당단백질이기 때문에, 인자 VII의 조성물은 조성물 중의 당단백질 각각이 다른 것들과 정확하게 동일한 글리코실화를 갖지 않는 인자 VII 폴리펩티드의 이종성 혼합물을 함유할 것으로 예상할 수 있다. 인자 VII 폴리펩티드의 조성물 또는 단리된 인자 VII 폴리펩티드란 개별 폴리펩티드가 상이한 글리코실화를 갖는 폴리펩티드의 혼합물을 포함하는 것을 의미하며, 따라서 "조성물" 또는 "단리된 인자 VII 폴리펩티드"라는 용어는 폴리펩티드 내에서 글리코실화 패턴의 이질성을 포함한다.

본 원에 기술된 인자 VII 폴리펩티드와 조성물은 혈액 응고 장애, 및 혈액 응고가 유리한 장애의 치료, 및 구체적으로 야생형 인자 VII보다 더 짧은 반감기를 갖는 약물을 사용한 응고에서 유용하다. 따라서, 본 원의 인자 VII 폴리펩티드 및 조성물은 관통성 외상성 손상; 무딘(blunt) 외상성 손상; 대기수술에서의 출혈; 심장 수술 중 출혈; 척추 수술 중 출혈; 정형외과 수술; 신경외과 수술; 암 수술; 산후 수술; 월경 과다; 줄기 세포 이식 중 출혈; 간 이식 중 출혈; 소화관 출혈; 간경변의 활동성 정맥류 출혈; 간경변의 비정맥류성 출혈; 미만성 폐포출혈; 대동맥 동맥류; 뇌출혈; 외상성 뇌 손상; 뇌 좌상; 와파린 역전; 헤파린 역전; 항응고제 역전; 항혈전성 약물의 역전; 인자 VII 결핍; 화상; 저해제를 가진 혈우병 환자에서 예방; 비간경변 및 간경변 환자를 위한 부분 간 절제술; 후천성 혈우병; 특발성 혈소판감소 자색반병; 글란츠만(Glanzmann) 혈소판 무력증; 혈소판 수혈에 대한 글란츠만 혈소판 무력증 내화 및 베르나르-슐리에 증후군에 유용하다.

본 원에서는 또한 인자 VII 등의 응고인자의 반감기를 측정하는 유용한 어세이를 기술하였다. 응고인자의 반감기를 측정하는 방법은, 살아있는 래트 간세포를 혈액응고인자와 인큐베이션하고, 시험시점 1에서 샘플을 취하고, 샘플 중의 세포에서 상청액을 분리하고, 샘플의 상청액 중 혈액응고인자의 활성 또는 양을 정량하는 것을 포함하고, 여기서 혈액응고인자의 활성 또는 양은 이중항체 샌드위치 ELISA 어세이를 사용하여 측정한다. 이 방법은 시간에 따른 혈액응고인자의 활성 또는 양의 플롯을 전개하기 위해 상이한 시점에서 반복할 수 있다.

실시예

탈시알릴화 인자 VII 폴리펩티드를 얻는 방법

폴리펩티드의 효소적 탈시알릴화, 시알릴화 결핍 세포주에서 인자 VII 폴리펩티드의 제조, 및 재조합 세포에서 인자 VII과 시알리다제의 동시 발현을 포함하는 다양한 방법들을 적용하여 탈시알릴화 인자 VII 폴리펩티드(야생형 및 변이체)를 생성하였다.

시알산 결핍 세포주의 생성

내인성 시알산을 포유동물 세포에서 32 효소로 구성되는 복잡한 경로와 관련하여 합성하였다(Wickramasinghe and Medrano 2011). 시알산의 생합성을 세포기질에서 개시하여 여러 효소, 예컨대 UDP-N-아세틸글루코사민-2-에피머라제/N아세틸만노사민 키나제(GNE), 시알산 9-포스페이트 신타제 (NANS), 및 시알산 9-포스페이트 포스파타제(NANP)를 포함하여 UDP-N-아세틸글루코사민 (UDP-GlcNAc)을 Neu5Ac로 전환하였다. 세포기질 내의 Neu5Ac를 핵공을 통해 핵 내에 이송하여 CMP-Sia 신타제 (CMAS)라는 효소에 의해 CMP-Neu5Ac로 전환하였다. 합성된 CMP-Neu5Ac를 골지체에서 추가 변성 및 컨쥬게이션을 위해 핵 기공을 통해 세포기질 내에 다시 옮겼다. CMP-NeuAc-하이드록실라제(CMAH) 효소는 세포기질 내에서 Neu5Ac의 Neu5Gc로의 전환을 촉매한다. 이후, CMP-Neu5Ac와 CMP-Neu5Gc를 중앙 트랜스-골지의 막에 위치한 소수성 타입 3 막 운반체, CMP-시알산 운반체 (SLC35A1)에 의해 골지 구획으로 옮겼다. CMP-시알산 운반체는 세포 시알릴화 경로의 중요한 요소이다(Hirschberg, et al. 1998). 이 유전자의 동종접합성 돌연변이는 마우스에서 출생후 치사를 유발한다(MGI 4.32, Homologene). 인간의 경우, SLC35A1의 돌연변이는 시알릴 컨쥬게이트의 감소 또는 완전한 상실과 연관되어 있다. SLC35A1의 일부 삽입과 결실 돌연변이는 인간에서 글리코실화의 선천적 장애와 연관되어 신경계 발달의 결함, 응고 및 면역 결핍증을 유발한다(Martinez-Duncker, et al., 2005). 일단 CMP-Neu5Ac/CMP-Neu5Gc가 골지체로 옮겨지면, 이들은 20개의 성분을 갖는 시알릴트랜스퍼라제(ST) 부류의 효소에 의해 탄수화물, 당단백질, 및 당지질과 컨쥬게이트된다.

CMP-시알산 운반체(SLC35A1)는 골지체에서 시알산 컨쥬게이션을 지원하는 중요한 분자이며, 이 운반체 단백질에 대한 돌연변이는 적절한 시알릴화가 결여된 단백질의 합성을 유발한다. 탈시알릴화 인자 VII을 제조하기 위해, CMP-시알산 운반체 유전자가 넉아웃(knockout)된 인자 VII 생산 세포주를 제조하였다. 경우에 따라, 탈시알릴화는 치료제 분자에서 시알릴화가 매우 낮은 수준이거나 없는 단백질 치료제를 생산하는 세포주에서 인자 VII 변이체의 발현에 의해 달성될 수 있다. 이 방법을 사용하여 환자에서 짧은 T1/2를 갖는 치료제 단백질을 생산할 수 있다.

중국 햄스터 난소(CHO) 기원을 갖는 Lec2 세포를 각각의 야생형 세포보다 당단백질 및 당지질에서 약 10배 적은 시알산을 제조하는 특성으로 동정하였다(Stanley and Siminovitch, 1977, Stanley, 1980 and 1983). 최근 연구에서는 Lec2 돌연변이체가 시험관내 어세이에서 골지 액포의 막을 관통하여 CMP-시알산을 전위할 수 없지만 다른 뉴클레오티드 유도체의 전위는 돌연변이 세포에서 비교적 정상인 것으로 나타났다(Deutscher, et al., 1984). 발현 클로닝을 사용하여 Lec2 세포의 CMP-시알산 운반체를 코딩하는 유전자가 보고되었다(Eckhardt et al., 1996). 다른 연구에서는 CMP-시알산 운반체 유전자에서 뉴클레오티드 575 - 751의 결실이 Lec2 표현형에 기여하는 것으로 나타났다(Eckhardt, et al., 1998). 1E3, 6B2, 8G8, 및 9D3 세포의 경우에서처럼 CMP-시알산 운반체 유전자 내 다른 돌연변이가 Lec2 표현형을 유도하였다(Eckhardt, et al., 1998).

실험 1

이 실험은 CMP-시알산 운반체, 예컨대 Lec2 세포의 경우에서 유전자 내 돌연변이가 정상적인 CHO 세포로부터 발현된 동일한 단백질과 비교하여 시알릴화가 결핍된 재조합 단백질(예를 들어, 인자 VII)을 발현하는지를 결정하도록 디자인하였다.

(1) Lec2 세포로부터 재조합 단백질, 예컨대 인자 VII의 발현 시험. 인자 VII 변이체 유전자(예를 들어, pMB117과 pMB121)를 함유하는 발현벡터를 정상적인 형질감염 조건하에서 Lec2 세포와 정상 CHO 세포에 형질감염하였다.

세포들의 세포 배양물에서 인자 VII의 발현농도를 인자 VII 활성 어세이로 관찰하였다. 형질감염된 세포의 배양물을 확장하고 배양 조건화된 배지를 인자 VII의 정제를 위해 수확하였다.

(2) 정상 CHO 세포에서 발현된 동일한 단백질과 비교하여 Lec2 세포에서 발현된 정제된 인자 VII의 시알산 함량 시험. 정상 인자 VII 정제 방법에 따라 조건화된 배지로부터 인자 VII을 정제하였다. Lec2 세포 또는 정상 CHO 세포에서 정제된 인자 VII을 정제된 인자 VII의 시알산 함량에 대해 분석하였다. 생물학적 활성과 약동학(PK) 매개변수들을 본 원에 기술된 바와 같이 분석하였다.

실험 2

발현된 재조합 단백질에서 시알산이 없는 인자 VII 변이체를 발현하는 생산 세포주를 제조하기 위해, 유전자 결실방법을 사용하여 인자 VII을 발현하는 세포주 (예를 들어, CHO 세포주)를 변성하는 CMP-시알산 운반체 유전자를 표적화하였다. 세포에서 시알릴화를 완전히 저해하기 위해, 다른 표적, 예컨대 도입부에 기재한 UDP-N-아세틸글루코사민-2-에피머라제/N아세틸만노사민 키나제(GNE), 시알산 9-포스페이트 신타제 (NANS), 시알산 9-포스페이트 포스파타제 (NANP), 및 CMP-Sia 신타제 (CMAS)를 또한, 경우에 따라 결실하여 CMP-시알산 운반체에 기질을 제공하는 CMP-Neu5Ac 생합성의 저해를 강화할 수 있다.

2종의 유전자 결실방법, Life Technologies의 TALE 뉴클레아제(TALEN) 및 Sangamo BioSciences/Sigma-Aldrich의 ZFP 뉴클레아제(ZFN)를 사용하여 시알산 합성 경로에서 CMP-시알산 운반체 유전자의 넉아웃 또는 다수 유전자의 넉아웃을 수행할 수 있다.

CMP-시알산 운반체 유전자가 넉아웃된 인자 VII 발현 세포주를 평가하여 CMP-시알산 운반체 유전자의 결실을 확인하였다. 확인된 세포주를 배양하여 인자 VII을 생산하였다. CMP-시알산 운반체 유전자가 결실된 세포주로부터 인자 VII을 정제하고, 본 원에 기술된 바와 같이 평가하여 친본 인자 VII 발현 세포주로부터 유래한 인자 VII과 분자상 시알산 함량에 대해 비교하였다.

인자 VII과 박테리아성 시알리다제의 동시발현에 의한 탈시알릴화 인자 VII의 제조

FVII의 탈시알릴화 형태를 생성하기 위해, Arthrobacter ureafaciens 시알리다제 (AU 시알리다제) (N-아세틸뉴라미네이트 글리코하이드롤라제, EC 3.2.1.18)로부터 유도된 박테리아성 시알리다제 변이체와 함께 FVII를 동시배양하였다. FVII을 안정하게 발현하는 CHO 세포(예를 들어, P10Q, K32E, A34E 및 R36E 돌연변이를 갖는 서열번호 16)를 AU 시알리다제로 pJ608 발현벡터를 사용하여 추가 형질감염하였다. 발현된 단백질은 N-말단에 단백질 분비를 촉진하는 성장호르몬 시그널 서열을 갖는다. 안정한 클론을 선택하였고, 이것은 배지에서 시알리다제에 대한 비색법에 의해 검출된 AU 시알리다제를 생산하였다. 또한, 세포가 지속적으로 고농도의 FVII 단백질을 발현하는 것을 확인하였으며, 이것은 ELISA 어세이, SDS PAGE 및 웨스턴 블로팅에 의해 프로브로서 FVII 특이적 항체를 사용하여 검출하였다. 렉틴(lectin) 블로팅 어세이에 의해 조건 배지에서 FVII 단백질에 대한 시알산을 정제된 FVII를 사용하여 검출할 수 없었다. 이에 비해, 시알리다제로 형질감염되지 않은 세포에서 유도된 비슷한 수준의 정제된 FVII는 강력한 렉틴 결합 시그널을 나타냈다. 정리하면, 이러한 결과는 AU 시알리다제가 세포에 의해 동시발현된 FVII를 효과적으로 탈시알릴화하는데 충분한 농도로 CHO 세포 배지에서 발현된 것을 시사한다.

가용성 시알리다제 처리를 사용한 탈시알릴화 인자 VII의 효소적 제조

다음과 같은 출발물질들이 본 실험에서 사용되었다:

인자 VII: 20mg 야생형 인자 VIIa, 약 1 mg/ml 농도

시알리다제: 20ug, 0.25mg/ml, 50000U/ml, P0720L (New England BioLabs으로부터 구입)

완충액 A: 25mM 히스티딘, 50mM NaCl, pH 6.4

완충액 B: 25mM 히스티딘, 1M NaCl, pH 6.4

FVIIa 제제 완충액: 2.3mg/ml 염화나트륨, 1.5mg/ml 염화칼슘 탈수화물, 1.3mg/ml 글리실그라이신, 0.1mg/ml 폴리소르베이트 80, 25mg/ml 만니톨, 10mg/ml 슈크로스, 0.5mg/ml 메티오닌, 1.6mg/ml 히스티딘, pH 6.0

정제 컬럼: 5ml HiTrap Q Sepharose HP 컬럼

이러한 재료들을 사용하여 다음 방법을 수행하였다:

1. 20 mg의 FVIIa (약 1 mg/ml)에, 20ug의 시알리다제 (0.25mg/ml, 1:1000 질량비) 첨가.

2. 반응물을 실온에서 밤새(약 19hr) 인큐베이션하고, 하기한 바와 같이 탈시알릴화 FVIIa를 크로마토그래피로 정제.

3. 탈시알릴화 FVIIa를 5 ml HiTrapQ Sepharose HP 컬럼에서 다음과 같이 정제:

a) Q-Sepharose 컬럼을 5CV의 완충액 A(25mM 히스티딘, 50mM NaCl, pH 6.4)로 평형화

b) 컬럼에 적용하기 전에, FVIIa와 시알리다제 반응물을 200ml의 완충액 A로 희석하여 pH 6.4로 조절

c) 2.5ml/min의 유속으로 AKTA Explorer 시스템을 사용하여 로딩하면서 A280을 관찰. 흐름을 통한 분획을 수집

d) 로딩을 완료한 후, 컬럼을 10CV의 완충액 A로 세척

e) 컬럼을 20CV의 0-50% 완충액 B(25mM 히스티딘, 1M NaCl, pH 6.4)로 40min 내에 용출. 피크 분획을 수집(탈시알릴화 NovoSeven)

f) 피크 분획 vs. FVIIa 제제 완충액을 4 ℃에서 밤새 투석

g) 샘플을 -80 ℃에서 분액으로 동결.

생성물은 SDS-PAGE, aSEC에 의해 고순도이고 FVIIa에 대한 생물학적 어세이에서 활성인 것으로 나타났다. 시알산 함량에 대한 어세이는 잔류 시알산을 나타내지 않았고, 중쇄의 LC-MS 분석은 시알산 제거 이외에 글리칸 구조의 심각한 변경을 나타내지는 않았다.

뉴라미니다제 - 아가로스 비즈(Beads)를 사용한 탈시알릴화 인자 VII의 효소적 제조

본 원에서 사용된 재조합 야생형 인자 VII은 Novo Nordisk에서 입수한 NovoSeven®이고, 본 원에서 "F7"이라 하였다. 다른 출발물질들은 위에 기술한 V1과 V2이다.

동결된 출발물질들을 37 ℃의 수조에서 급속 해동하여 모았다. 단백질을 원심분리하여 2.5배 농축하였고; 농축물을 피펫팅에 의해 서서히 혼합하여 단백질-필터 경계면에서 초고농축(응집)을 최소화하였다.

V2는 그의 V2 제제 완충액 (히스티딘, CaCl₂, 트레할로스, 메티오닌, 및 미량의 Tween®-20 함유, pH 6.4 - 6.6)에서 MES 완충액(lOmM MES, lOmM CaCl₂, 50mM NaCl 함유, pH 6.0, 멸균여과)으로 완충액을 교환하였다. 이는 3가지 방법 중 하나로 수행되었다. 첫 번째 방법으로, V2를 NAP-10 중력흐름 컬럼(GE, 17-0854-01)으로 완충액 교환하였고, 컬럼은 각각 3 컬럼-부피의 MES 완충액으로 3-5회 미리 세척하였다. 이후, V2를 컬럼에 로딩하였고, MES 완충액 로딩 부피의 1.5배로 용출하였다. 두 번째 방법으로, V2를 MES 완충액 중에서 밤새 투석하여 완충액 교환하였다. 투석 카세트를 미리 MES 완충액 중에 침지하고, V2를 시린지에 의해 3.500 MWCO slide-a-lyzer 카세트(Thermo Scientific, 66130)에 밤새 4 ℃에서 멸균여과된 MES 완충액을 갖는 10L 피처(pitcher)에서 로딩하였다. 세 번째 방법으로, V2를 Sephadex G-25 (Sigma, G-25-80) 겔 여과 컬럼에 의해 MES 완충액 내로 완충액 교환하고, MES 완충액으로 평형화시켰다.

완충액 교환된 V2를 뉴라미니다제-아가로스(Sigma N5254)로 탈시알릴화하였다. 아가로스 비드 제품을 50% 슬러리 혼합물로 제공하고, 암모늄 설페이트 완충액에 저장하였고; 비즈는 MES 완충액으로 3-5회 미리 세척하였고; 비드/완충액 혼합물을 lOOOrcf로 3분 동안 4℃에서 원심분리하여 분리하고, 상청액은 피펫팅으로 제거하였다. 세척된 비즈에 완충액 교환 V2를 첨가하고 회전에 의해 실온에서 16 내지 22시간 동안 서서히 혼합하였다. 단백질 1mg 당 2.08 mL의 패킹된 비즈를 탈시알릴화에 사용하였고; 더 큰 규모의 제조에 있어서 이것은 1:10, 단백질 1mg 당 0.208 mL의 비즈로 감소하였다. 이후, 탈시알릴화 V2를 원심분리로 회수하고 피펫팅하였다. 비즈를 1:1 부피비의 새로운 MES 완충액으로 회전에 의해 5분 동안 서서히 한번 세척하고; 세척 혼합물을 앞서와 같이 원심분리하여 상청액을 V2와 함께 모았다. 최종적으로 비즈를 0.2 마이크론 시린지 필터에 의한 멸균여과 또는 0.45 마이크론 필터에 의해 진공여과하여 제거하였다.

EndoTrap HD 수지(Hyglos)를 사용하여 내독소 제거를 여러 번 수행하였다. 수지를 MES 완충액으로 3-5회 세척하여 세척 완충액을 버렸다. 2 뱃치에서, 1-3 mL의 세척 수지를 탈시알릴화 V2와 밤새 실온에서 서서히 혼합하였다. 원심분리하여 수지를 제거한 다음, 시린지 또는 진공 필터를 통과시켜서 여과하였다.

탈시알릴화 V2를 Ultracels에서 10분 주기 동안 원심분리에 의해 2.1mg/mL로 4.75배 농축하고; 단백질-필터 경계면에서 응집을 감소하기 위해 농축물을 피펫팅으로 서서히 혼합하였다.

탈시알릴화된 V2를 추가로 고분자량 종(및 응집된 내독소)으로부터 HiLoad 26/60 Superdex 200 크기 배제 컬럼을 사용하여 분리하였다. 컬럼과 AKTA 정제기 시스템을 0.1N NaOH + 20% EtOH로 사전 살균하였다. 시스템을 pH-중화하고 물로 세정하여 재구성하여 모아진 V2 제제 완충액으로 평형시켰다. 여러 뱃치의 농축물을 수동으로 12mL 샘플 루프에 주입하여 크기배제 컬럼에 3mL/min의 유속으로 로딩하고; 용출액을 회수하여 Frac-900으로 폴리스티렌 튜브(17X100mm, Fisherbrand, 14-956-6D) 내에 분획하였다. 초기에, 고분자량 피크를 배제하고, 목적하는 V2 분획을 모아서 Charles River EndoSafe PTS 및 NanoDrop ND-1000을 사용하여 내독소 레벨과 농도를 시험하였다. V2 완충액을 사용하여 탈시알릴화 V2를 용출하였다.

5 뱃치의 크기배제를 수행하고, 모아진 용출액을 하나의 뱃치로 합하여 Ultracels에서 1.Omg/mL로 농축하였다. 최종 제제를 0.2 마이크론 시린지 필터에 의해 멸균여과하여 내독소와 농도를 시험하였다. 1mL 분액을 표지된 2mL 튜브 (Sarstedt, 72.694.006)에 피펫팅하고, 에탄올/드라이아이스 뱃치에서 급속동결한 후, 사용시까지 -80 ℃의 표지된 상자에 저장하였다.

특성화 - 단백질 분석 및 시험관내 어세이

최종 준비(prep) 물질과 미처리된 출발물질을 MES 러닝 완충액 중의 4-12% Bis-Tris NuPAGE(Novex NP0335BOX)를 사용한 단백질 겔 분석 및 분석용 크기배제(TSK3000 컬럼; 러닝 완충액: 200mM KH2P04, 150mM KC1, pH 6.8, 유속: 0.15ml/min, 형광 검출)에 의해 특성화하였다. 작은 시험 샘플을 본 원에 기술된 Takara Bio Inc. 키트를 사용하여 전체 단백질의 DMB-표지 시알산 정량뿐만 아니라 인자 VII 중쇄 상의 시알산 함량에 대해 LC-MS로 분석하였다. 활성은 인지질 의존성 인자 X 활성화와 트롬빈 생성 어세이로 시험하였다.

시알산 함량 분석

LC-MS 방법을 사용하여 미처리 대조용 인자 VII과 탈시알릴화 인자 VII의 중쇄 N-글리칸에서 시알산을 확인하였다. 10 μg의 단백질을 10mM DTT 믹스로 37 ℃에서 30분 동안 환원한 후, Agilent 1200 Capillary LC 시스템으로 분석하였다: 컬럼: PLRP-S 8μm 4000A, 0.3x150mm, 75 ℃. 완충액 시스템: A: 물 및 0.2% 포름산+0.01% TFA; B: ACN 및 0.2% 포름산+0.01% TFA. 그래디언트: 50μL/min, 10% B/2 min, 90% B까지 25 분, 90% B 세척 5 분, 10% B 5분 동안 평형.

Agilent 6520 Q-TOF 시스템: DualEsi 소스(source), 가스 온도: 350 ℃, 건조 가스: 7psi, 네불라이저: lOpsi, 스캔 범위: 500-3000 amu, 1 spectra/s. 레퍼런스 이온: 1221.990637 및 2421.91399 amu, 50ppm 윈도우, Min 1000 counts.

결과를 도 7에 보고하였다.

DMB 표지화 키트를 사용한 시알산 정량

시알산 형광 표지화 키트(Takara Bio Inc., Cat#4400)는 시알로글리코컨쥬게이트의 정량적이고 매우 민감한 분석용이다. 1,2-디아미노-4,5-메틸렌옥시벤젠 (DMB)을 사용한 HPLC 기반 시알산 형광 표지 기술은 단순하고 고도로 민간한 정량적 방법이다. 이 방법에서 자유 시알산을 DMB 표지 후에 역상 HPLC (GlycosepR, Glyko 제품, # 1-4727)로 분석하였다.

결론

V2 중쇄는 2개의 N-글리코실화 부위를 갖는다. N-글리칸은 퓨코실화된(fucosylated), 다량 시알릴화 비,트리- 및 테트라-구조이다. 탈시알릴화된 샘플에서 터미널 시알산은 발견되지 않았으며, 이것은 샘플이 완전히 탈시알릴화되었고 인자 VII N-글리칸 상에서 >99.9%의 시알산이 제거된 것을 나타낸다.

래트 간세포를 사용한 반감기 어세이

간세포 제조

동결보존된 프라이머리 래트 간세포는 CellzDirect (Invitrogen)로부터 입수하였다. 약 5백만 개의 세포를 함유하는 각각의 바이알을 해동하고, 세포를 10 ml의 해동 배지에 첨가한 다음, 60g으로 3분 동안 원심분리하였다. 세포를 인큐베이션 배지 + 0.25% BSA (약 4 ml)에 재현탁하고, 혈구계수기를 사용하여 세포를 계수하였다. Trypan 블루로 염색한 후, 살아있는 세포를 계수하여 죽은 세포를 확인하였다. 세포 생존율은 80-82%였다. 계수 직후에 세포를 클리어런스 어세이에서 사용하였다.

해동 배지: Invitrogen CM3000 Thawing/Plating Supplement Pack + 500 ml Williams E 배지. 인큐베이션 배지: Invitrogen CM4000 Cell Maintenance Supplement Pack + 500 ml Williams E 배지.

시험관내 간세포 클리어런스 어세이

프라이머리 래트 간세포를 ml당 100만 개의 생세포로 CellzDirect 인큐베이션 배지 + 0.25% BSA 중의 25 ng/ml의 다양한 인자 VII 변이체와 Eppendorf 튜브에서 1.2 ml의 출발 부피로 37 ℃에서 서서히 회전 혼합하면서 인큐베이션하였다. 각각의 지시된 시점에, 0.25 ml의 혼합물을 꺼내어 즉시 원심분리하여 세포를 펠렛화하였다(1000 rpm, 3 분, Eppendorf 원심분리기). 0.18 ml의 정화된 상청액을 꺼내어 급속냉동하고, -80 ℃에서 밤새 저장하였다. 다음날, 상청액 중의 인자 VII을 상응하는 정제된 돌연변이 단백질을 표준물로 사용하는 ELISA 어세이로 정량하였다. 인자 VII 변이체가 2시간 동안 37 ℃에서 배지로만 인큐베이션된 무세포 대조용 상청액을 제로 시점값으로 사용하였다. 각각의 인큐베이션을 3회 반복하였다. 고유 클리어런스값을 인큐베이션 부피와 세포수로 정규화된 계산식 CLint = 0.693 / 시험관내 T_1/2를 사용하는 Lu 등(Lu ref.)의 방법에 기초하여 계산하였다. 시험관내 반감기(T_1/2)를 WinNonLin (Pharsight Corporation, Sunnyvale, CA) 프로그램으로 계산하였다. 간세포 인큐베이션으로 얻어진 상청액을 이중 항체 샌드위치 ELISA 포맷으로 어세이하였다. 웰당 0.1 ml의 항-인자 VII 모노클로날 항체(1.0 μg/ml, PBS 사용)를 Greiner Microlon 655061 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 4 ℃에서 밤새 인큐베이션한 후에 플레이트를 웰당 0.2 ml의 1% 카제인 블로킹 완충액(50 mM TrisHCl, 100 mM NaCl, 0.05% Tween 20 pH7.2)으로 1.5시간 동안 37 ℃에서 블로킹하였다. 플레이트를 웰당 0.3 ml의 PBS + 0.05% Tween 20으로 4회 세척(BioTek ELx405 플레이트 세척기 사용)한 다음, 관련 인자 VII 표준물과 미지 샘플을 플레이트에 첨가하였다. 각각의 간세포 상청액 0.18 ml를 0.18 ml의 희석 완충액(50 mM TrisHCl, 100 mM NaCl, 0.1% 카제인, 0.05% Tween 20 pH 7.2)을 첨가하여 2배 희석하였다. 각각의 희석된 상청액 0.10 ml를 ELISA 플레이트에 3회 반복하여 첨가하였다. 표준물을 희석 완충액으로 희석된 상응하는 정제된 인자 VII 변이체로부터 제조하였다. 희석 완충액으로 표준물을 2배 연속 희석하여 최종 농도 50 내지 0.8 ng/ml 범위의 희석을 얻었다. 인자 VII 표준물과 샘플(웰당 0.1 ml)을 2시간 동안 실온(21 ℃)에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 상기한 바와 같이 4회 세척한 다음, 비오틴화 검출 항체 1 μg/ml 희석 완충액(50 mM TrisHCl, 100 mM NaCl, 0.1% 카제인, 0.05% Tween 20 pH 7.2)을 첨가(웰당 0.1 ml)하여 1.5시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 상기한 바와 같이 4회 세척한 다음, 희석 완충액으로 1/1000 희석된 스트렙타비딘-호오스래디쉬 퍼옥시다제를 첨가(웰당 0.1 ml)한 후, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 세척하여 Ultra-TMB를 웰당 0.1 ml 첨가하였다. 10 내지 15분 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 웰 당 0.05 ml의 2 M H₂S0₄를 첨가하여 반응을 중지하였다. 450 nm에서 Molecular Devices Spectramax M2 플레이트 판독기를 사용하여 흡광도를 측정하였다. 데이터 분석은 Softmax Pro 5.4 (Molecular Devices)를 사용하여 수행하였다.

동결보존된 래트 간세포, 해동 배지, 및 인큐베이션 배지(CellzDirect)는 Invitrogen/Life Technologies (Grand Island, NY)로부터 입수하였다. 1-Step Ultra-TMB (One Step) 기질(카탈로그 번호 34028)는 Thermo Scientific (Rockford, IL)으로부터 입수하였다. 스트렙타비딘-호오스래디쉬 퍼옥시다제(SA-HRP)(카탈로그 번호 DY998)는 R&D Systems(Minneapolis, MN)로부터 입수하였다. 인산염-완충 살린(saline), pH 7.2은 Invitrogen (Carlsbad, CA)으로부터 입수하였다. Sprague-Dawley 래트 혈장(5% 시트르산나트륨 항응고제)은 Bioreclamation (Westbury, NY)으로부터 입수하였다. Greiner Microlon 플레이트(cat. no. 655061)는 Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)으로부터 입수하였다.

탈글리코실화 변이체의 수득방법 : 분자적 변이체

야생형 인자 VIIa는 2개의 N-글리칸(N322와 N145)을 가지며, VI과 V2는 각각4개의 N-글리칸(N106, N145, N253, N322)을 가지고 있다. VI과 V2에서 발견된 추가적인 2개의 N-글리칸(N106, N253)은 원래 반감기를 증가하기 위해 디자인되었다. 이 작업을 위해, 이 부위들은 이들을 야생형 인자 VII의 내인성 아미노산 서열(T106, V253)로 다시 복귀시켜서 제거하였다. 남아있는 2개의 내인성 N-글리칸 부위(N145와 N322)를 이후 DNA 수준에서 이 부위에서 N->Q 돌연변이로 조작하여 제거하였다(도 6).

야생형 인자 VII을 pmCMV로 클론하여 pMB 113을 제조하였다. 위치 aa145 또는 322의 단일 N→Q 돌연변이뿐만 아니라 이중 돌연변이체(aa 145 및 322)를 함유하는 삽입물을 합성하고 pMB113에 XbaI과 PmlT 부위를 사용하여 클론하여 클론 pMB114-116을 얻었다. 이후에 V1과 V2의 Gla 도메인을 코딩하는 삽입물을 AscI과 AfeI을 사용하여 pMB113-116에 클론하여 구조물 pMB117-120(V1-계 변이체)과 pMB121-124(V2-계 변이체)를 얻었다. 모든 구조물은 서열 확인되었다(McLab). 포유동물 세포(CHO 유도성 세포주)는 일시적으로 전기천공법에 의해 각 구조물로 6 웰 포맷에서 형질감염되었다. 형질감염 후 4일째에 상청액을 모아서 웨스턴 블롯으로 발현에 대해 어세이한 다음, hFVII ELISA (AssayPro) 및 FVII 활성 어세이를 수행하였다. 변이체 서브세트를 단일세포 클론하였다. pMB121이라 지칭되는 V2 2-N글리칸 변이체를 정제하여 추가 분석을 위해 활성화하였다.

10L WAVE 발현에서 FVIIa의 정제/활성화 방법

방법의 요약

정용여과(diafiltered) 농축 및 조건화된 배지로부터 FVII의 정제 및 활성화는 다단계 공정으로 여러 날 동안 수행되었다. 먼저, 배지를 해동하고 원심분리하여 동결/해동에서 형성될 수 있는 응집물을 제거하였다. CaCl₂로 용출된 음이온 교환 컬럼(Q-Sepharose)을 사용하는 의사친화도(psuedoaffinity) 캡처 단계를 사용하여 FVII 단백질을 추가 농축하고 완충액을 교환하였다. 다음으로, 하이드록시아파타이트 컬럼을 사용하여 FVII 단백질을 추가 정제하였다. 이후, 더 작은 Q-Sepharose 컬럼을 사용하여 FVII을 추가 정제한 다음, 이것을 pH 7.8 - 8.2의 용액에서 24시간 동안 활성화하였다. pH를 4.0으로 저하시켜서 활성화 반응을 중지하였다. 마지막으로 FVIIa를 제제 완충액(pH 6.5)으로 투석하여 동결 저장하였다.

최종 정제된 단백질을 SDS-PAGE, aSEC, ELISA, 당분석(glycoanalysis), 내독소, 및 FVIIa 활성 어세이에 의해 특성화하였다.

FVII ELISA

Zymutest FVII 효소결합 면역어세이(Aniara, West Chester, Ohio). ELISA는 96-웰 마이크로플레이트의 웰에 결합된 래빗 항-FVII 폴리클로날 항체를 사용한 2부위 면역어세이이다. 샘플과 호오스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)에 결합된 래빗 항-FVII 폴리클로날 항체를 차례로 삽입하였다. 어세이는 제조업체의 지시에 따라 수행하였다. 요약하면, 샘플과 교정물질(calibrator)을 96-웰 둥근바닥 폴리프로필렌 희석 플레이트에서 어세이 완충액으로 희석하였다. 50 μL의 희석된 샘플 분액을 제공된 래빗 항-FVII 코팅 플레이트에 옮겨서 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 200 μL의 HRP 결합 래빗 항-FVII를 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 300 μL의 제공된 세척 완충액으로 5회 세척하였다. TMB를 200 μL/웰 첨가하고 약 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 50 μL의 0.45 M 황산을 첨가하여 반응을 중지하였다. 450 nm에서 흡광도를 판독하였다. 인자 VII 농도를 샘플값을 4 매개변수 곡선 보정으로 생성된 V2 보정곡선과 비교하여 유도하였다.

인자 VII 발색 어세이

비오펜(Biophen) FVII 발색 어세이(Aniara, West Chester, Ohio)를 사용하였다. 발색 어세이 원리는 샘플 유래의 인자 VII과 제조업체가 공급한 래빗 트롬보플라스틴(조직인자)으로 구성되는 효소 복합체의 형성을 포함한다. 과량으로 첨가된 FX는 FXa로 활성화되고, 결과적으로 FXa 특이적 발색 기질(SXa-11)을 절단하여 pNA를 생성한다. 유리된 pNA의 양은 FXa 활성에 정비례한다. 어세이는 제조업체의 지시에 따라 수행하였다. 요약하면, 샘플과 보정물질을 Tris-BSA 어세이 완충액으로 96-웰 둥근바닥 폴리프로필렌 희석 플레이트(Fisher Scientific)에서 희석하였다. 키트 시료, R1, R2, 및 R3와 96 웰 편평바닥 폴리스티렌 어세이 플레이트(Costar)를 사용 전에 37℃로 가온하였다. 30 μL의 샘플과 보정물질을 희석 플레이트에서 어세이 플레이트로 옮긴 다음, 30 μL의 시료 R2, 이어서 60 μL의 시료 R1을 옮겼다. 어세이 플레이트를 혼합하고 7분 동안 37℃로 지터버그 플레이트 진탕기(Boekel Scientific)에서 인큐베이션하였다. 60 μL의 시료 R3를 첨가하고, SpectraMax Plus 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 흡광도 변화율(405 nm/min에서 OD의 변화)을 37 ℃에서 측정하였다. 인자 VII 농도를 샘플값을 4 매개변수 곡선 보정으로 생성된 V2 보정곡선과 비교하여 유도하였다.

인지질 의존성 트롬빈 생성 어세이

야생형 FVIIa와 비교하여, Gla-도메인(P10Q/K32E)의 변성은 추가적인 γ-카복실화로 인한 음이온성 인지질 또는 활성화 혈소판 존재하에 FX 활성화의 포텐시, 트롬빈 생성 및 전체 혈액 응고를 증가한다. PL-의존성 TGA를 음이온성 인지질 존재하에서 rFVIIa 활성을 측정하기 위해 디자인하여 트롬빈 보정물질과 기질 시료, FluCa-키트(Thrombinoscope, BV)를 사용하여 수행하였다. 20% 포스파티딜세린(PS), 40% 포스파티딜에탄올아민(PE),및 40% 포스파티딜콜린(PC)을 포함하는 인지질(PL) 소포체는 Avanti Polar Lipids로부터 입수하여 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl(pH 7.2)에서 10분 동안 초음파처리하여 제조하였다.

20 μL의 PL 소포체(500 μM) 또는 트롬빈 보정물질을 96웰 플레이트에 분산하였다. 다양한 농도의 rFVIIa를 인간 HemA 혈장에 희석하고 PL 혼합물에 3번 반복하여 첨가하고 37℃에서 10분 동안 평형시켰다. FluCa 용액을 첨가하여 트롬빈 생성 반응을 개시하고 반응을 Thrombinoscope^BV에 의해 요약된 Calibrated Automated Thrombography (CAT) 방법에 따라 60분 동안 지속적으로 관찰하였다. 데이타를 수득하고 트롬빈 보정물질을 사용하여 α2-마크로글로불린에 대해 수정된Thrombinoscope^BV(3.4.0) 소프트웨어로 분석하였다. 분석 매개변수인 '피크 높이'는 생성된 트롬빈의 최대 농도를 나타내고, '내인성 트롬빈 포텐셜'(ETP)은 생성된 트롬빈의 총량에 해당한다. 트롬빈 생성 매개변수를 4 매개변수 비선형 곡선 보정방법으로 Prism 4.0 (GraphPad Inc)을 사용하여 분석하였다.

인지질 의존성 FX 활성화 어세이

조직인자 없이 인지질 소포체 존재하에서 FX를 활성화하는 FVIIa의 능력을 PL 의존성 FX 활성화 어세이를 사용하여 측정하였다. 인자 VIIa 또는 FVIIa 변이체를 FX와 인지질 소포체 존재하에 인큐베이션하였다. FX의 활성화는 FXa의 발색 기질인 S-2765를 첨가하여 측정하였다. 요약하면, 보정물질과 샘플을 폴리프로필렌 둥근바닥 플레이트에서 Tris-HCl 완충액으로 희석하였다. 30 μL의 4 μg/mL FX (Haematologic Technologies Inc.)를 96웰 편평바닥 폴리스티렌 플레이트의 모든 웰에 첨가한 다음, 20:40:40의 wt.% 비율로 포스파티딜세린, 포스파티딜콜린, 및 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 인지질 30 μL를 첨가하였다. 30 μL의 희석 샘플과 보정물질을 FX/인지질 혼합물에 이송하였다. 플레이트를 밀봉하여 서서히 혼합하고 20-23시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 40μL의 5mM S-2765 (DiaPharma) 용액을 모든 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하여 6시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 405 nm에서 마이크로플레이트 판독기로 흡광도를 판독하였다. 샘플의 활성은 샘플의 FX 활성 수준을 F7 보정곡선과 비교하여 측정하였다.

래트 PK 시험-동물, 시험 프로토콜(prep의 주입, 혈액 및 prep의 샘플링, ELISA, 데이터 분석, 동물 희생)

단백질(F7, V2, V1, dV2 및 dV1)을 O.1 mg/kg으로 Sprague Dawley 래트에 정맥내 투여하였다. 혈장 샘플을 투여한 1분 후부터 취하여 FVII ELISA로 분석하였다.

HemA -PK 시험

단백질(F7, dV1)을 1.0mg/Kg으로 HemA 마우스에게 i.v. 투여하였다. 혈장 샘플을 투여한 5분 후부터 취하여 FVII ELISA와 sTF-PT 어세이로 분석하였다.

혈장샘플에 대한 FVII ELISA

재료

FVIIa에 대한 모노클로날 항체를 사용하였다. 또한, 하나의 모노클로날 항체를 비오틴화하였다. 정제된 FVIIa 변이체(야생형 또는 탈시알릴화)를 어세이 보정물질과 어세이 대조군으로 사용하였다. 블로킹 완충액은 30mM Tris pH 7.2 중의 1% (w/v) 카제인, 60mM NaCl, 0.03% Tween-20이다. 어세이 희석 완충액(ADB)은 0.1% (w/v) 카제인, 50mM Tris pH 7.2, 0.1M NaCl, 0.05% Tween-20이다. 어세이 세척 완충액은 PBS + 0.05% Tween-20이다. 면역어세이 플레이트는 Greiner Microlon 하이 바인딩 플레이트(#655061)이다. 스트렙타비딘-호오스래디쉬 퍼옥시다제(SA-HRP)는 R&D 시스템에서 입수하였다. HRP 기질 Ultra-TMB는 ThermoFisher Pierce에서 입수하였다. 마우스 혈장 블랭크는 CD1 또는 HemA 마우스로부터 상업적 방법 (Bioreclamation)에 의해 또는 자체 공급으로 얻었다. 다른 물질들(카제인, Tris, NaCl, Tween-20, PBS, 황산)은 모두 시약등급의 품질이었다.

FVIIa 샌드위치 면역어세이 방법

96웰 어세이 플레이트를 1μg/ml PBS의 FVIIa에 대한 항체 0.1ml/well로 밤새 4℃에서 코팅하였다. 플레이트를 흡인하여 적어도 2hr 동안 실온에서 회전(150rpm)하면서 0.2ml/well의 블로킹 완충액으로 블로킹하였다. 블로킹한 후, 웰을 0.3ml/well의 세척 완충액으로 4회 세척하였다. FVIIa 샘플 또는 표준품을 ADB 중 5% 혈장의 최종 농도로 1:20 희석하고, O.1ml/well을 적어도 1.5hr 동안 실온에서 회전하면서 인큐베이션하였다. 모든 표준품, 대조군, 및 샘플을 웰에서 3회 반복 측정하였다. 플레이트를 앞서 기술된 바와 같이 세척한 후, FVIIa에 대한 비오틴화 항체 42ng/ml ADB를 0.1 ml/well 첨가하여 플레이트를 회전하면서 적어도 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척한 후, 스트렙타비딘-HRP (1:1000/ADB)와 인큐베이션하고, 적어도 1시간 동안 실온에서 회전하면서 인큐베이션하였다. 플레이트의 최종 세척 후에 웰을 O.1ml/well의 Ultra-TMB로 전개하고, 반응을 2M 황산 0.05ml/well을 첨가하여 중지하였다. 중단된 반응물을 OD-450nm에서 판독하고, 그 결과를 분석하여 보정하였다. 어세이에서 정량의 하한값(LLOQ)은 전형적으로 100% 혈장에서 15-30 ng/ml FVIIa이다.

rFVIIa 활성을 측정하기 위한 가용성 조직인자 ( sTF ) 기반 변성 PT 어세이

Prothrombin Time (PT) 어세이를 수행하여 HemA 마우스 생체외 혈장 샘플에서 인간 rFVIIa의 활성을 측정하였다.

요약하면, aPTT 완충액 (0.15 M NaCl, 0.05 M Tris pH 7.5, 0.1% BSA) 중에 10%의 HemA 마우스 혈장과 50%의 인간 FVII 결핍 혈장(George King Inc)을 함유하는 샘플 50 μL를 50 μL의 sTF-PT 시약과 혼합하여 37℃에서 30초 동안 인큐베이션하였다. sTF-PT 시약은 1부피의 2 μM 재조합 인간 가용성 TF(sTF_1-221)와 1 부피의 8 μM 인지질 소포체(PS²⁰:PC⁴⁰:PE⁴⁰)를 포함하였다. 50 μL의 25 mM CaCl₂를 첨가하여 응고를 개시하였고, 응고시간을 STA 응고 분석기(Diagnostica Stago Inc)로 기록하였다. 표준품은 200부터 0.78 ng/mL까지 2배 연속 희석된 rFVIIa (wt-rFVII 또는 변성 rFVIIa 변이체)로 구성되었다.

혈우병 A ( HemA ) 마우스에서 탈시알릴화 V2의 효능

급성 테일컷 (Tail Cut) 효능 시험

혈액 손실을 측정하기 위해 마우스를 이소플루란으로 마취하고 꼬리를 15 ml 플라스틱 튜브 내의 37-38 ℃로 가온된 0.9% 살린 중에 10분 동안 배치하였다. 꼬리를 말단부터 메스를 사용하여 4 mm 절단하고, 즉시 10 ml 살린을 함유하는 별도의 예온된 15 ml 플라스틱 튜브에 다시 배치하였다. 마우스에서 40분 동안 자유 출혈을 허용하였다. 탈시알릴화 V2 및 F7을 테일컷 손상 5분 후 또는 15- 및 30-분 전에 정맥내 투여하였다. 혈액을 모으기 전과 후의 튜브를 칭량하여 중량측정으로 혈액 손실을 정량하였다.

꼬리정맥 횡절단 효능( TVT ) 시험

HemA 마우스에게 꼬리정맥 횡절단 손상 1 hr 전 또는 5분 후에 꼬리정맥 주사에 의해 탈시알릴화 V2 또는 F7을 투여하였다. 적절한 마취를 사용하였다. 꼬리정맥을 #11 스캘펄 스트레이트 블레이드로 횡절단하고, 타이머를 작동하였다. 이후, 마우스를 4X8 인치 히팅 패드의 상부에 흰색 종이 베딩(Versi-Dri™)이 있는 개별 클린 케이지로 돌려보냈다. 동물의 활동 상태를 이후 9시간 동안 매시간, 및 24시간 시점에 관찰하였다. 저하된 활동 수준의 징후를 나타내는 마우스를 모니터 형태로 주목하였고, 과도한 혈액 손실의 징후를 나타내는 마우스를 즉시 안락사하였다.

HemA 마우스 혈장에서 트롬빈- 항트롬빈 (TAT) 어세이

시약:

(1) 캡쳐 항체: Enzyme Research Labs의 항-트롬빈 폴리클로날 항체, Cat#TAT-EIA-C, (2) 검출 항체: HRP-컨쥬게이트 항-AT-III 폴리클로날 항체 (Enzyme Research Labs, Cat#TAT-EIA-D), (3) 어세이 용출액: Enzyme Research Labs로부터 입수, Cat#TAT-EIA-D, (4) HRP 기질: Amplex Red, Invitrogen, cat#A12216, (5) 알파-트롬빈: Enzyme Research Labs로부터 입수, Cat#HT-1002a, -80℃에 저장, (6) AT-III: Enzyme Research Labs로부터 입수, Cat# HAT, -80℃에 저장, (7) BSA: Sigma로부터 입수, Cat# A-7030, (8) AT-III 결핍 혈장: Enzyme Research Labs로부터 구입, Cat: AT-DP, -80℃에 저장.

완충액

(1) TAT 표준 완충액: 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15M NaCl, 1 mM EDTA, 0.05 U/mL 헤파린; (2) 코팅 완충액: 1정(tablet)의 중탄산염 + 100ml dH20, 4℃에 저장; (3) 블로킹 완충액: 2% BSA-PBS; (4) 샘플 희석 완충액: 0.1M HEPES, pH7.4, 0.15M NaCl, 1% BSA, 0.05% Tween 20을 첨가하고, 여과하여 분액, -20℃에 저장; (5) 기질 완충액: 50μL의 5 mg/mL Amplex Red, 20μl의 3% H202를 PBS 완충액에 첨가. 혼합하여 플레이트에 첨가하기 전에 새로 제조; (6) 1 μM TAT 표준 원액의 제조: 1.36 mg/ml의 인간 AT-III 100μL와 3.28 mg/mL의 인간 트롬빈 5.93μL를 419μL의 TAT 완충액에 첨가하고 혼합하여 10-20분 동안 37℃에서 인큐베이션; (7) 60 nM TAT 표준 원액의 제조: 50μL의 1μM TAT 복합체를 to 783μL의 AT-III 결핍성 혈장에 첨가하여 혼합. 바이알당 50μL 분액, -80℃에 저장.

어세이 방법

1. 항-트롬빈 pAb (캡쳐 항체)를 중탄산염 완충액으로 희석하였다(1:100 희석: 하나의 96-웰 플레이트에 있어서, 110μL의 항체를 11mL의 중탄산염 완충액에 첨가).

2. 100μL의 희석된 코팅 항체를 2HB Immulon 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 두드려서 모든 액체가 플레이트의 바닥을 덮도록 하였다. 플레이트를 밀봉하고 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다.

3. 300μL의 세척 완충액을 사용하여 자동화된 플레이트 세척기로 4회 세척하였다. 최종 세척 후에 플레이트를 뒤집어서 깨끗한 종이타올에 대고 두드렸다.

4. 150μL의 블로킹 완충액(2% BSA-PBS)을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다.

5. 300μL의 세척 완충액을 사용하여 자동화된 플레이트 세척기로 4회 세척하였다. 최종 세척 후에 플레이트를 뒤집어서 깨끗한 종이타올에 대고 두드렸다.

6. 100μL의 표준품, 샘플 및 QC를 각 웰에 3회 첨가하고 플레이트를 실온에서 2 hr 동안 인큐베이션하였다.

7. 300μL의 세척 완충액을 사용하여 자동화된 플레이트 세척기로 4회 세척하였다. 최종 세척 후에 플레이트를 뒤집어서 깨끗한 종이타올에 대고 두드렸다.

8. 100μL의 HRP-검출 항체(1/100, 110μL의 항체를 11ml의 컨쥬게이트 희석액에 첨가)를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.

9. 300μL의 세척 완충액을 사용하여 자동화된 플레이트 세척기로 4회 세척하였다. 최종 세척 후에 플레이트를 뒤집어서 깨끗한 종이타올에 대고 두드렸다.

10. 70μL의 (새로 제조된)Amplex Rd 기질을 각 웰에 첨가하였다.

11. 플레이트를 실온의 암실에 배치하여 15-30 분 동안 인큐베이션하였다.

12. 플레이트를 OD485nm/595nm에서 판독하였다.

13. 표준품을 4 매개변수 곡선 보정(fit)으로 플롯하였다; 대조군과 각 샘플의 농도를 각 ELISA 플레이트로부터 계산하였다.

응고 활성화 마우스에서 탈시알릴화 V2의 효능

응고 활성화(competent) 마우스에서 dV2의 효능을 측정하기 위해 급성 테일컷(tail cut) 시험을 수행하였다. 응고 활성화 마우스를 이소플루란으로 마취하고 꼬리를 15 ml 플라스틱 튜브 내의 37-38 ℃로 가온된 0.9% 살린 중에 10분 동안 배치하였다. 5 mg/kg의 조직 플라스미노겐 활성제(tPA)를 iv 투여한 후에 메스를 사용하여 꼬리를 말단부터 50mm 절단하고, 10 ml 살린을 함유하는 별도의 예온된 15 ml 플라스틱 튜브에 다시 배치하였다. 테일컷 손상 직후에 탈시알릴화 V2와 F7을 정맥내 투여하였다. 마우스에서 45분 동안 자유 출혈을 허용하였다. 혈액을 모으기 전과 후의 튜브를 칭량하여 중량측정으로 혈액 손실을 정량하였다.

결과

탈시알릴화 또는 탈글리코실화 단백질의 시험관내 특성화

dV2의 중쇄를 LC-TOF MS로 분석하였다. 분석 결과, 중쇄 상의 N-글리칸은 시알리다제 처리후에 시알산을 함유하지 않는 것으로 나타났다. 경쇄에 대한 이러한 분석은 Gla 도메인에 의해 복잡하게 되었다. 처리된 분자의 시알산 함량의 전반적 그림을 얻기 위해 시알산 형광 표지를 수행하였다. 이 방법에서는 99.9%를 넘는 시알산이 탈시알릴화 과정에서 V2 상에서 제거된 것으로 나타났다. 도 7은 시알산 함량에 대한 탈시알릴화 V2의 분석을 나타낸 것이다. LC-TOF MS 분석과 시알산 형광 표지를 사용하였다. 시알산 함량 분석을 dV1에 대해서도 수행하여 유사한 결과를 얻었다(데이터 미기재). 탈시알릴화 분자를 인지질-의존성 Xa 활성화와 인지질 의존성 TGA 어세이에 의해 활성을 시험하였다. PL-Xa와 PL-TGA 어세이는 탈시알릴화 이후 단백질의 활성이 감소되지 않았음을 입증하였다. (도 9와 도 10 참조). 도 9는 탈 시알릴화 단백질에 대한 PL-FXa 활성화 어세이를 나타낸 것이다. 탈시알릴화 V1과 V2(dV1, dV2)에 대해 인지질 FXa 활성화 어세이를 사용하여 활성을 시험하였다. 양 탈시알릴화 단백질은 이 어세이에서 변성되지 않은 이들의 친본 분자와 비교하여 약간 더 높은 활성을 나타냈다. 도 10은 탈시알릴화 단백질에 대한 PL-TGA 어세이를 나타낸 것이다. PL-TGA에 의하면 dV2와 dV1은 변성되지 않은 이들의 친본 분자보다 약간 증가된 활성을 나타냈다. 결과를 F7으로 정규화하였다.

PL-Xa 어세이에서는 dV2 및 dV1의 활성이 변성되지 않은 이들의 친본 분자보다 측정할 수 있는 정도 증가한 것으로 일관되게 나타났다. 하이포글리코실화 wtFVIIa, V2, 및 V1 분자를 발현하여(도 11) 정제되지 않은 발현 추출물로 발현과활성을 시험하였다. 도 11은 하이포글리코실화 FVII 변이체의 발현을 나타낸 것이다. 전기천공 4일 후의 배지 샘플을 FVII 발현에 대해 분석하였다. 항-Gla 도메인 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석에서는 변이체의 발현이 나타났다. N-글리칸 부위의 제거는 발현수준에 대해 정규화할 때 활성에 영향을 미치는 것으로 나타나지 않았다. 도 12는 형질감염 상청액을 사용한 하이포글리코실화 FVII 변이체의 "특이적 활성"의 측정을 나타낸 것이다. 하이포글리코실화 변이체의 일시적 형질감염 2종에서 유래한 미정제 발현 상청액의 활성을 Xa 활성 어세이로 분석하였다. ELISA에 의해 측정된 발현을 정규화했을 때 N-글리칸 제거로 인한 활성의 감소는 보이지 않았다. 이 어세이에서 예측된 바와 같이, V1과 F7 단백질은 비슷한 활성을 갖는 반면, V2 분자는 그의 TF 독립성의 결과로 활성이 더 낮다. 이는 또한 pMB121이라 지칭된 2N-글리칸(N322와 N145) 만을 갖는 정제된 하이포글리코실화 V2에 대해 수행된 PL-TGA 활성 어세이로 입증되었다. 도 13은 정제된 하이포글리코실화 변이체 pMB121에 대한 PL-TGA 어세이를 나타낸 것이다. PL-TGA 어세이에 따르면, pMB1212는 비변성 V2와 유사한 F7에 대한 증강된 활성을 나타냈다. 이러한 분자들의 시험관내 클리어런스를 간세포 클리어런스 모델에서 시험하였다. dV2가 비변성 V2에 대한 이 모델에서 유의한 클리어런스를 보였지만(도 14), 하이포글리코실화 변이체에서는 클리어런스의 증가가 없거나 근소하였다(도 15).

래트 PK 및 HemA PK

Sprague Dawley 래트의 약동학적 시험에서는 탈시알릴화 및 하이포글리코실화 단백질이 FVII ELISA에 의해 측정된 바와 같이 그의 비변성 대응물보다 훨씬 더 빨리 제거된 것으로 나타났다. 도 16은 래트의 약동학적 결과를 나타낸 것이다. 탈시알릴화 V2 및 V1의 반감기는 FVII ELISA에 의해 측정된 바와 같이 Sprague Dawley 래트에서 그의 비변성 친본 분자보다 상당히 더 짧았다. 이것은 탈시알릴화 V2, 탈시알릴화 V1, 및 pMB121 (하이포글리코실화 V2)에 대해서도 그대로였다. 양 탈시알릴화 분자의 tl/2이 1분 미만인 반면, 그의 친본 단백질의 tl/2은 약 2.5 hr이었다. 하이포글리코실화 V2 분자 pMB121의 클리어런스는 F7과 등가였고, tl/2은 1.6 hr이었다. HemA 마우스의 PK 시험은 각각 약 3분과 2.6시간의 반감기를 갖는 dV2 및 F7과 유사한 결과를 나타냈다(도 17 (A)). 짧은 반감기는 sTF-PTT 응고 어세이에 의해 확인되었다(도 17(B)). 도 17은 HemA PK 결과를 나타낸 것이다. 탈시알릴화 V2의 반감기는 A) FVII ELISA와 B) sTF-PT 어세이로 측정된 바와 같이 HemA 마우스에서 그의 비변성된 친본 분자보다 훨씬 더 짧았다.

HemA 효능 모델

dV2를 HemA 마우스에서 효능에 대해 시험하였다. HemA 테일컷 모델을 사용하여, dV2가 1mg/kg (볼러스, iv)의 투여량으로 효과적인 것이 입증되었다. 비교에 의해, 이 모델에서, F7의 효과적인 투여량은 2.5mg/kg(볼러스, iv)이었다. 이러한 결과는 dV2가 F7보다 더 효과적임을 입증하는 것이다(도 18 (A)). 또한, 이 모델을 dV2의 효능이 F7보다 더 빨리 소거되는 것을 입증하기 위해 사용하였다(도 18 (B)). 도 18은 HemA 마우스에서 탈시알릴화 V2 효능 시험 결과를 나타낸 것이다. dV2를 사용한 시험에서는 이 분자가 HemA 테일컷 모델에서 F7보다 A) 더 효과적이고, B) 효능 클리어런스가 더 빠른 것으로 나타났다.

더 민감한 TVT 모델을 사용하여 F7 대비 dV2의 더 빠른 효능 클리어런스를 입증하고 효과적인 투여량을 확인하였다. 도 19는 TVT HemA 모델에서 dV2 효능 시험을 나타낸 것이다. 민감성이 높은 효능 모델(TVT)을 사용하는 TVT 시험은 dV2가 F7보다 더빠른 효능 클리어런스를 갖는 것을 확인하였다. HemA 마우스에서 투여한 30분과 60분 후에 수행된 혈전원성(thrombogencity) 마커로서 트롬빈 항-트롬빈 (TAT) 측정은 dV2에 대해 상당히 낮은 수준을 나타냈다. 도 20은 TAT 측정을 나타낸 것이다. HemA 마우스에서, 유효량(1mg/kg)으로 투여된 dV2는 F7의 유효량(2.5mg/kg)보다 더 적은 트롬빈 Anti-트롬빈 (TAT)을 생성하였다. 이 데이터는 효능 데이터와 함께 dV2가 F7보다 더 양호한 치료지수를 가지는 것을 시사하였다.

응고 적합성 마우스(Coagulation Competent Mice)에서의 효능

dV2를 tPA-처리된, 응고 적합성 마우스에서 효능 시험하였다. 테일컷 모델을 사용하여 dV2는 0.3-1mg/kg(볼러스, iv)의 투여량에서 효과적인 것으로 나타났다. 비교에 의해, 이 모델에서, F7의 효과적인 투여량은 5mg/kg(볼러스, iv)이었다. 이러한 결과는 dV2가 F7보다 더 효과적임을 입증하는 것이다(도 21). 도 21은 tPA-처리된, 응고 적격 마우스에서 탈시알릴화 V2 효능 시험 결과를 나타낸 것이다.

탈시알릴화 야생형 인자 VII ( dWT VIIa )의 클리어런스와 효능

탈시알릴화 야생형 인자 VII(dWT VIIa)을 상기한 바와 같이 Novo Nordisk에서 입수한 NovoSeven®을 인자 VII 출발물질로 사용하고 출발 폴리펩티드를 상기한 바와 같이 가용성 시알리다제 효소를 사용하여 탈시알릴화하여 제조하였다. dWT VIIa가 >99%의 순도, 낮은 내독소를 가지며 시알산을 검출할 수 없는 것을 확인하였다. 또한, 질량 분광광도법 분석에서는 시알산의 선택적 제거가 나타났다.

이러한 dWT VIIa 물질의 활성을 분석하고 비오펜 FVII 발색 어세이와 변성된 PT 어세이를 상기한 바와 같이 사용하여 야생형 인자 VII과 비교하였다. 이러한 분석들 각각에서 dWT VIIa가 야생형 인자 VII 폴리펩티드와 거의 동일한 활성을 갖는 것으로 나타났다.

또한, dWT VIIa와 야생형 인자 VII (1 mg/kg)의 클리어런스를 분석하였고 인간 조직인자 넉인(TFKI) 마우스 모델을 사용하여 비교하였다. 도 22에서 보이는 바와 같이 dWT VIIa의 반감기는 야생형 인자 VII보다 훨씬 더 짧았고 클리어런스(ml/h kg)는 40배 이상 빨랐다.

야생형 인자 VII과 비교한 dWT VIIa의 효능을 TFKI 마우스와 상기한 테일컷 방법을 사용하여 시험하였다. 요약하면, 5 mg/kg tPA를 마우스에 정맥내 주입한 다음, 꼬리의 말단부터 50mm를 클리핑하였다. 이후, 야생형 인자 VII (NovoSeven®) 또는 dWT VIIa를 1-6mg/kg 범위의 용량으로 정맥내 주입하였다. 혈액을 꼬리에서 45분 동안 수집하고, 불안정한 혈병은 수집기간 동안 매 6분마다 분쇄하였다. 도 23에 나타낸 바와 같이, dWT VIIa가 놀라웁게도 야생형 인자 VII보다 상당히 더 효과적인 것을 발견하였다. 보다 구체적으로, 야생형 인자 VII 6 mg/kg 투약과 비교하여 dWT VIIa 3 mg/kg 투약이 혈액 손실을 감소하였다. 이러한 분석 결과를 고려하여 2 mg/kg dWT VIIa가 6 mg/kg 야생형 인자 VII과 생물학적 등가 용량인 것으로 결정되었다.

dWT VIIa와 야생형 인자 VII (NovoSeven®)의 전신적 응고를 유발하는 능력을 상기한 트롬빈 항-트롬빈 (TAT) 방법에 의해 시험하였다. 마우스를 생물학적 등가 용량의 dWT VIIa (2 mg/kg)와 야생형 인자 VII(6 mg/kg)로 처리한 다음, TAT 복합체의 형성을 ELISA로 측정하였다. 도 24에서 보이는 바와 같이, 야생형 NovoSeven® 인자 VII은 dWT VIIa보다 상당히 높은 수준의 TAT를 생성하였다. dWT VIIa가 기준선 TAT 수준만을 생성했다는 사실에 비추어, 이 실험은 dWT VIIa가 야생형 인자 VII만큼 효과적인 것에도 불구하고 이 용량이 관찰할 수 있는 전신적 응고가 나타나지 않은 것을 시사하고 있다.

또한, dWT VIIa와 야생형 인자 VII (NovoSeven®)의 혈전 형성을 유발하는 능력을 FeCl₃ 혈전증 모델에서 시험하였다. 마우스를 생물학적 등가 용량의 dWT VIIa (2 mg/kg)와 야생형 인자 VII(6 mg/kg)로 혈전증 시험의 개시 15분 전에 처리하였다. 이후, 혈전증이 3.25 % FeCl₃ 용액의 투여로 개시되면 혈전 형성을 Doppler에 의해 30분 동안 측정하였다. 생성된 혈류 데이터를 혈류 대 시간 그래프에 플롯한 다음, 대조용 샘플에 대해 곡선 하의 면적 비율을 계산하여 각각의 인자 VII 처리 그룹에서 혈전 형성으로 유발된 혈류감소를 측정하였다. 도 25에서 보이는 바와 같이, 야생형 NovoSeven® 인자 VII이 상당히 감소한 혈류(평균 약 40%)를 보인 반면, dWT VIIa는 혈류의 감소를 거의 나타내지 않았다(평균 >90%). 이 실험은 제공된 용량의 dWT VIIa가 야생형 인자 VII과 비교하여 혈전 형성이 상당히 감소된 것을 입증하였다.

야생형 인자 VII과 비교하여 dWT VIIa의 활성과 효능을 SN-17c 트리펩티드 형광원성 기질(HTI)을 사용하여 가용성 조직인자(sTF)에 대한 이 펩티드들의 겉보기 결합 친화도를 시험하여 조사하였다. 도 26에서 보이는 바와 같이, 이 분석에서는 dWT VIIa(dF7)와 야생형 인자 VII(F7)이 sTF에 대해 등가의 겉보기 결합 친화도를 갖는 것으로 나타났다. 그러나, 도 27에서 보이는 바와 같이, sTF-인자 VII 복합체 존재(0.5 nM 인자 VII [dWT VIIa 또는 야생형], 125 nM sTF)하에서 인자 X 농도를 적정하여 인자 X를 활성화하는 이 펩티드들의 능력을 시험하는 실험 모델에서, dWT VIIa와 야생형 인자 VII에 대한 Michaelis Menten 속도론은 dWT VIIa(dF7)가 야생형 인자 VII (F7)보다 인자 X를 더 효과적으로 활성화할 수 있음(약 2배)을 입증하고 있다. 이러한 결과는 dWT VIIa가 그의 야생형 대응물보다 인자 VII 활성부위마다 더 많은 인자 X를 인자 Xa 로 전환할 수 있음을 시사한다.

결론

급성 출혈의 치료에 효과적일 뿐만 아니라 혈전원성(thrombogenecity)을 감소하는 치료 약물의 개발을 위한 충족되지 않은 의학적 요구가 있다. 반감기가 짧은 효과적인 인자 VII 폴리펩티드가 잠재적으로 급성 출혈에 사용하는데 적합한 보다 큰 치료 영역을 갖는 분자를 생성할 것이다.

V2와 V1은 2개의 인자 VIIa 변이체이다(도 1-3). 이 변이체들은 활성화된 혈소판에 대해 친화도를 증가하는 Gla 도메인에 돌연변이를 함유하며, V2의 경우에 조직인자 독립성을 야기한다. 두 변이체들은 또한 야생형 인자 VIIa와 비교하여 길어진 반감기를 초래하는 2개의 추가 N-글리코실화 부위를 가지며, 혈우병 치료에 유리한 특징이 된다. 그러나, 급성 출혈의 치료제로서 그의 사용은 감소된 반감기가 유리하다. 이러한 변성은 오프타겟 효과의 위험을 감소하여, 그 결과 치료지수를 증가시킨다. 본 발명자들은 V2와 V1의 탄수화물 사슬에 존재하는 시알산 제거가 시험관내 간세포 클리어런스 모델에서 분자의 상당히 빠른 클리어런스를 유발하는 것을 확인하였다. 하이포글리코실화 변이체들은 이 시험관내 모델에서 빨리 소거되지 않았으며, 이는 탈시알릴화 및 하이포글리코실화 분자간 클리어런스 메카니즘이 다른 것을 보여준다. Sprague Dawley 래트에서 수행된 생체내 시험 결과, 탈시알릴화 분자(dV2 및 dV1)뿐만 아니라 하이포글리코실화 변이체 pMB121도 상당히 감소된 반감기를 갖는 것으로 나타났다. 흥미롭게도, 탈시알릴화 V2 및 V1 모두 탈시알릴화 야생형 FVIIa의 보고된 속도(Appa et al, Thrombosis and Haemostasis 104.2/2010)와 비교하여 클리어런스 속도가 증가하였고, 이것은 추가적인 2개의 N-글리칸 때문일 수 있는 특징이다. 본 원에서 주장된 것에 제한되지 않고, 이러한 활성에 대한 가능한 한 가지 이론은 추가의 N-글리칸이 탈시알릴화에 있어서 ASGPR 또는 유사한 리셉터에 대한 또다른 리간드가 되어 더빠른 클리어런스를 매개한다는 것이다. 이러한 분자들의 활성은 시험관내 활성 어세이로 측정된 바와 같이 그의 친본 분자와 비교하여 유지되거나 증가하였다. dV2의 빠른 클리어런스는 또한 HemA 마우스 PK 시험으로 생체내에서 확인되었고 HemA 꼬리 클리핑과 TVT 시험에서 효과적인 것으로 입증되었다.

또한, 야생형 인자 VII의 탈시알릴화는 야생형보다 훨씬 더 빠르게 소거된 인자 VII 폴리펩티드를 생산하였고, 또한 수많은 실험 모델에서 나타난 바와 같이 효능 증가의 놀라운 결과를 제공하였다.

인자 VIIa 또는 인자 VIIa 변이체의 N-글리칸 제거 또는 N-글리칸의 단당류 조성의 변성으로 더빠른 소거(clearing) 분자가 얻어진다. 이러한 분자들은 활성을 유지하며 생체내에서 효과적이다. 이러한 빠른 소거 인자 VIIa 분자의 개발은 급성 출혈 증상의 치료에 유리할 뿐만 아니라 잠재적으로 시장에서 다양한 항응고제에 대한 해결책이 될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Bayer HealthCare LLC Bauzon, Maxine Hermiston, Terry <120> Short Acting Factor VII Peptides <130> BHC115011 PCT <150> 61/754,674 <151> 2012-12-24 <150> 61/787,026 <151> 2013-03-15 <160> 18 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1218 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gccaacgcgt tcctggagga gctgcggccg ggctccctgg agagggagtg caaggaggag 60 cagtgctcct tcgaggaggc ccgggagatc ttcaaggacg cggagaggac gaagctgttc 120 tggatttctt acagtgatgg ggaccagtgt gcctcaagtc catgccagaa tgggggctcc 180 tgcaaggacc agctccagtc ctatatctgc ttctgcctcc ctgccttcga gggccggaac 240 tgtgagacgc acaaggatga ccagctgatc tgtgtgaacg agaacggcgg ctgtgagcag 300 tactgcagtg accacacggg caccaagcgc tcctgtcggt gccacgaggg gtactctctg 360 ctggcagacg gggtgtcctg cacacccaca gttgaatatc catgtggaaa aatacctatt 420 ctagaaaaaa gaaatgccag caaaccccaa ggccgaattg tggggggcaa ggtgtgcccc 480 aaaggggagt gtccatggca ggtcctgttg ttggtgaatg gagctcagtt gtgtgggggg 540 accctgatca acaccatctg ggtggtctcc gcggcccact gtttcgacaa aatcaagaac 600 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120 125 Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg 130 135 140 Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160 Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln 165 170 175 Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190 His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu 195 200 205 Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg 210 215 220 Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240 His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Asn Leu Thr Asp 245 250 255 His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270 Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu 275 280 285 Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300 Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320 Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350 Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys 355 360 365 Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile 370 375 380 Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400 Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

Claims (50)

1. 포유동물 숙주세포에서 생산된 단리된 변이체 인자 VII 폴리펩티드로서, 아미노산 서열은 서열번호: 16의 아미노산 서열과 관련하여 적어도 1개의 서열 변경을 갖고, 적어도 1개의 서열 변경은 V253N 이고, 변이체 인자 VII 폴리펩티드는 0 내지 5.0 의 컨쥬게이트된 시알산 몰 대 N-결합 글리칸 몰의 비율을 갖는 단리된 변이체 인자 VII 폴리펩티드.
2. 제 1 항에 있어서, 동일 조건하에서 측정했을 때 야생형 인자 VII 의 적어도 50% 의 혈액 응고 촉진 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 단리된 변이체 인자 VII 폴리펩티드.
3. 제 1 항에 있어서, 변이체 인자 VII 폴리펩티드는 2개 이상의 서열 변경을 포함하고, 1개의 서열 변경은 V253N 이고, 다른 서열 변경은 P10Q, K32E, R36E, A34E, 및 T106N 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단리된 변이체 인자 VII 폴리펩티드.
4. 제 1 항에 있어서, 변이체 인자 VII 폴리펩티드는 3개 이상의 서열 변경을 포함하고, 1개의 서열 변경은 V253N 이고, 다른 서열 변경은 P10Q, K32E, R36E, A34E, 및 T106N 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단리된 변이체 인자 VII 폴리펩티드.
5. 제 1 항에 있어서, 변이체 인자 VII 폴리펩티드는 4개 이상의 서열 변경을 포함하고, 1개의 서열 변경은 V253N 이고, 다른 서열 변경은 P10Q, K32E, R36E, A34E, 및 T106N 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 단리된 변이체 인자 VII 폴리펩티드.
6. 제 1 항에 있어서, 변이체 인자 VII 폴리펩티드는 P10Q, K32E, R36E, A34E, T106N, 및 V253N 의 서열 변경을 포함하는 단리된 변이체 인자 VII 폴리펩티드.
7. 제 1 항에 있어서, 변이체 인자 VII 폴리펩티드는 P10Q, K32E, T106N, 및 V253N 의 서열 변경을 포함하는 단리된 변이체 인자 VII 폴리펩티드.
8. 제 1 항에 있어서, 컨쥬게이트된 시알산 몰 대 N-결합 글리칸 몰의 비율이 0.1 미만인 단리된 변이체 인자 VII 폴리펩티드.
9. 제 1 항의 단리된 변이체 인자 VII 폴리펩티드를 제조하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
   (a) 펩티드를 시알릴화하는 능력이 결핍되어 0 내지 5.0 의 컨쥬게이트된 시알산 몰 대 N-결합 글리칸 몰의 비율을 갖는 탈시알릴화 인자 VII 폴리펩티드를 생산하는 재조합 포유동물 세포주에서, 서열번호: 16의 아미노산 서열과 관련하여 적어도 1개의 서열 변경을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 인자 VII 폴리펩티드를 생산하는 단계로서, 적어도 1개의 서열 변경은 V253N 인 단계;
   (b) 그에 따라 생산된 변이체 인자 VII 폴리펩티드를 단리하는 단계.
10. 하기 단계를 포함하는, 제 1 항의 단리된 변이체 인자 VII 폴리펩티드를 제조하는 방법:
    (a) 서열번호: 16의 아미노산 서열과 관련하여 적어도 1개의 서열 변경을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 (a) 재조합 인자 VII 폴리펩티드와 (b) 재조합 시알리다제 효소를 동시발현하는 재조합 포유동물 세포주를 수득하는 단계로서, 적어도 1개의 서열 변경은 V253N 인 단계;
    (b) 상기 재조합 포유동물 세포주를 배양하여 재조합 인자 VII 폴리펩티드와 재조합 시알리다제 효소를 모두 발현하는 것을 허용하는 단계로서, 상기 재조합 시알리다제 효소는 공유결합된 시알산 잔기의 충분한 양을 제거하여 0 내지 5.0 의 컨쥬게이트된 시알산 몰 대 N-결합 글리칸 몰의 비율을 갖는 탈시알릴화 인자 VII 폴리펩티드를 생산하는 단계; 및
    (c) 그에 따라 생산된 변이체 인자 VII 폴리펩티드를 단리하는 단계.
11. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 혈병 형성이 바람직한 질환 또는 장애의 치료에서 사용하기 위한 단리된 변이체 인자 VII 폴리펩티드로서, 질환 또는 장애는 출혈, 위장관 출혈, 비제어성 출혈, 이식 또는 절제 또는 수술이 시행되고 있는 포유동물의 출혈, 정맥류 출혈, 저혈소판증, 혈우병, 두개내 출혈, 대동맥 동맥류, 및 항응고제의 과투여로 구성되는 군에서 선택되는 단리된 변이체 인자 VII 폴리펩티드.
12. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 단리된 변이체 인자 VII 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 혈병 형성이 바람직한 질환 또는 장애의 치료에서 사용하기 위한 약학 조성물로서, 질환 또는 장애는 출혈, 위장관 출혈, 비제어성 출혈, 이식 또는 절제 또는 수술이 시행되고 있는 포유동물의 출혈, 정맥류 출혈, 저혈소판증, 혈우병, 두개내 출혈, 대동맥 동맥류, 항응고제의 과투여, 관통성 외상성 손상, 무딘(blunt) 외상성 손상, 대기수술에서의 출혈, 심장 수술 중 출혈, 척추 수술 중 출혈, 정형외과 수술 중 출혈, 신경외과 수술 중 출혈, 암 수술 중 출혈, 산후 수술 중 출혈, 월경 과다, 줄기 세포 이식 중 출혈, 간 이식 중 출혈, 간경변의 활동성 정맥류 출혈, 간경변의 비정맥류성 출혈, 미만성 폐포출혈, 뇌출혈, 외상성 뇌 손상, 뇌 좌상, 와파린 역전, 헤파린 역전, 항응고제 역전, 항혈전성 약물의 역전, 인자 VII 결핍, 화상, 저해제를 가진 혈우병 환자에서 예방, 비간경변 및 간경변 환자를 위한 부분 간 절제술, 후천성 혈우병, 특발성 혈소판감소 자색반병, 글란츠만(Glanzmann) 혈소판 무력증, 혈소판 수혈에 대한 글란츠만 혈소판 무력증 내화 및 베르나르-슐리에 증후군로 구성되는 군에서 선택되는 약학 조성물.
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