DE60106763T2

DE60106763T2 - Glutaminsäure decarboxylase (gad) abgabesystem zur behandlung neurodegeneraliver erkrankungen

Info

Publication number: DE60106763T2
Application number: DE60106763T
Authority: DE
Inventors: Matthew During; Michael Kaplitt
Original assignee: Thomas Jefferson University; Neurologix Inc
Current assignee: Thomas Jefferson University; Neurologix Inc
Priority date: 2000-05-23
Filing date: 2001-05-23
Publication date: 2006-01-26
Anticipated expiration: 2021-05-24
Also published as: ATE280590T1; CA2409674A1; EP1299126A2; CA2409674C; US20060099179A1; AU6808001A; US7645446B2; AU2001268080B2; US6780409B2; WO2001089583A3; EP1299126B1; US20020091094A1; WO2001089583A2; DE60106763D1

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Vektors zur Herstellung eines Medikaments, um neurodegenerative Erkrankungen, wie beispielsweise die Parkinson Krankheit, unter Verwendung viraler und nicht-viraler Zufuhrsysteme zu behandeln, die therapeutische Agenzien an spezifische Regionen des Gehirns liefern. Es wird insbesondere ein adenoassoziierter viraler Vektor verwendet, um eine Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD) codierende Nukleotidsequenz an spezifische Regionen des Gehirns zu liefern, die bei neurodegenerativen Erkrankungen überstimuliert oder nicht gehemmt sind.
Der hauptsächliche hemmende Neurotransmitter im Gehirn ist gamma-Aminobuttersäure (GABA), (Roberts et al., GABA in Nervous System Function, Raven Press: New York, 1976; McGeer E. G. et al., Glutamine, Glutamate, and GABA in the Central Nervous System; Hertz L., Kvamme E., McGeer E. G., Schousbal A, eds., Liss: New York, 1983; 3–17). Ein Verlust der GABA-Signalgabe durch eine Freisetzungsverringerung, Verlust von GABA synthetisierenden Neuronen, oder Antagonismus von GABA-Rezeptoren, führt zu einer Enthemmung und Übererregung und kann abhängig von der spezifisch involvierten Hirnregion zu Epilepsie, Bewegungsstörungen oder anderen neurologischen Ausfällen und Symptomen führen.
Es hat sich heraus gestellt, dass Erkrankungen wie beispielsweise die Parkinson Krankheit, Huntington Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose (ALS oder Lou Gehrig Krankheit), Epilepsie und Alzheimer Krankheit schwierig zu behandeln sind. Wenige, wenn überhaupt irgendeine Therapie, konnten nachgewiesen werden bei einer Verlangsamung oder Hemmung des degenerativen Prozesses wirksam zu sein, der mit diesen Erkrankungen assoziiert ist. Bei der Parkinson Krankheit (PD) wird angenommen, dass die hauptsächliche neurochemische Störung in dem Verlust der dopaminergen (DA) Neuronen der Substantia nigra liegt. Dieser Verlust von DA-Neuronen führt zu einem tief greifenden Mangel von DA in den Projektionsbereichen des Caudate und Putamens und führt zu einem Verlust einer Signalgabe durch Dopaminrezeptoren in den postsynaptischen Neuronen. Diese Neuronen kontaktieren über Efferenzen, die als die direkten und indirekten Wege bezeichnet werden, an andere Zellen in der Basalganglienverschaltung. Von größter Bedeutung für PD ist, dass der Verlust von Dopaminrezeptoren in der Basalganglienverschaltung zu einem Verlust eines Antriebs bei dem GABAergen Hemmungsinput auf den Nucleus Subthalamicus führt.
Der Verlust eines hemmenden GABAergen Antriebs auf den Nucleus Subthalamicus (STN) führt zu einer gesteigerten Aktivität des STN, der erregende (glutaminerge) Afferenzen an den ventral medialen (VM) Thalamus, die Substantia nigra pars reticulata (SNPR) und eine kleinere Projektion an die Pars compacta als auch an andere Zellen innerhalb der Basalganglien einschließlich des Globus pallidus sendet. Wenn die Konzentration von GABA in dem Gehirn unter einen Schwellenwert abnimmt, dann können Bewegungsstörungen und Krämpfe auftreten (siehe bspw., Karisson et al., (1974) Biochem. Pharmacol. 23: 3053–3061). Die GABA-Synthese wird durch die Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD) reguliert. GAD liegt im Gehirn in zwei Isoformen, der GAD-65 und der GAD-67 vor. Wenn die GABA-Mengen im Gehirn steigen enden die Krämpfe (siehe bspw., Hayashi (1959) Physiol. 145: 570–578). Bei krampfartigen Erkrankungen wird die Verringerung der GABA-Menge im Gehirn häufig durch eine verminderte GAD-Menge begeleitet (McGeer, et al., GABA in Nervous System Function; Roberts E, Chase T. N., Tower D. B., eds., Raven Press: New York 1976: 487–495; Butterworth et al., (1983) Neurochem. 41: 440–447; Spokes et al., (1978) Adv. Exp. Med. Biol. 123: 461–473).
Levodopa (L-Dopa) war geschichtlich das Medikament der Wahl, um die Parkinsonkrankheit zu behandeln. L-Dopa ist ein Vorläufer von Dopamin und kann die Blut-Hirn-Schranke durchdringen, um auf das Gehirn zu wirken. Um die umfassenden Wirkungen von L-Dopa zu verringern, wird es häufig mit Carbidopa, einem peripheren Decarboxylasehemmstoff gegeben, der den Metabolismus von L-Dopa in peripheren Geweben senkt. Leider ist die Reaktion auf L-Dopa nicht nachhaltig. Die meisten Patienten entwickeln nach Langzeitverwendung von L-Dopa abträgliche Wirkungen und häufig verschwinden die Vorteile einer Behandlung, wenn die Erkrankung fortschreitet. Außerdem sind einige gewöhnliche Typen einer Zentralnervensystemstörung und periphere Nebenwirkungen mit der Gabe von L-Dopa assoziiert. Toxische Nebenwirkungen auf das Zentralnervensystem umfassen mentale Änderungen, wie beispielsweise Verwirrung, Agitation, Halluzinationen, Täuschungen, Depression, Manie und übermäßiges Schlafen. Zusätzlich kann L-Dopa maligne Melanome oder andere Hautläsionen verschlimmern und kann entgegengesetzte (untowards) Wirkungen in Patienten mit kardiovaskulärer oder pulmonaler Erkrankung, Asthma oder Nieren-, Leber- oder Drüsenerkrankung haben.
Andere Verfahren zur Behandlung von Parkinson Krankheit umfasst eine Transplantation von Zellen, die dazu verwendet werden Regionen des durch Neurodegeneration geschädigten Gehirns zu reparieren. Diese Zellen können derart konstruiert sein, dass sie neuroaktive Substanzen wie beispielsweise L-Dopa abgeben. Das Verfahren erfordert eine Zelltransplantation in das Striatum. Eine Reparatur der geschädigten Regionen und Abgabe von L-Dopa hängt von den transplantierten Zellen ab, ob sie synaptischen Kontakt mit verschiedenen Strukturen wieder herstellen können, die in beträchtlicher Entfernung von dem Bereich der Neurodegeneration liegen. Eine Zelltransplantation ist jedoch ein kompliziertes Verfahren, das Spendergewebe erfordert und es wurde über eine mit diesem Verfahren assoziierte Mortalität berichtet.
Alternative Formen Parkinson Krankheit zu behandeln erfordert Vorrichtungen für eine Tiefengehirnstimulation (Deep-Brain-Stimulation; DBS) in spezifischen Regionen des Gehirns. Beispielsweise eine DBS des STN. Diese Vorrichtungen sind gewöhnlich in das STN implantierte Elektroden. Die Elektrode wird dann bei einer gewünschten Frequenz stimuliert, um die Wirkung der Parkinson Krankheit zu verringern. Die Signifikanz der STN-Überaktivität wird durch den Erfolg einer abtragenden Chirurgie des STN in sowohl Tiermodellen der Parkinson Krankheit als auch bei der Parkinson Krankheit im Mensch selbst wieder gespiegelt. Zusätzlich zu Abtragung, wird gewöhnlich Implantation neutronischer Stimulatoren angewendet. Es wird angenommen, dass der Mechanismus der Stimulatoren durch lokale Hemmung (durch GABE Signalgabe) vermittelt und durch lokale Infusion von GABA Agonisten verdoppelt wird.
Jede dieser Vorgehensweisen wie chirurgisches Abtragen, elektrische Stimulation und Infusion pharmakologischer GABA Agonisten ist bei der Krankheitslinderung wirksam, aber weist jeweils beträchtliche Nebenwirkungen auf. Beispielsweise weist eine umfangreiche invasive Chirurgie ein hohes Infektionsrisiko und potentielle Schädigung des Gehirns auf und in dem Fall einer Arzneimittelinfusion eine sehr kurze Wirksamkeit.
Außerdem sind durch den Stand der Technik (WO-A-9 525 805 und Gebe Ther., vol. 4(11), 97, pp. 1235–1245) virale Vektoren zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen bekannt, die eine Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD) ohne 3' post-transkriptionelles Regulationselement kodieren.
Daher sind die Behandlungen von neurodegenerativen Erkrankungen zur Linderung am Besten geeignet und von begrenzter und vorübergehender Wirksamkeit. Somit besteht ein Bedarf für eine therapeutische Herangehensweise, die Vorteile in der zu erzielenden Spezifität, sowohl Kurz- und Langzeitwirksamkeit als auch Neuroprotektion ohne umfangreiche Chirurgie oder Nebenwirkungen, aufweist.
Die Erfindung basiert zumindest teilweise auf der Entdeckung, dass eine lokalisierte bzw. örtlich begrenzte Zufuhr eines ein therapeutisches Mittel bzw. Agens umfassenden Vektors an eine spezifische Hirnregion, die bei neurodegenerativen Erkrankungen überstimuliert oder enthemmt ist, die Wirkung einer Überstimulation verringern kann und die Verbesserung der neurodegenerativen Erkrankung fördert. Die Erfindung betrifft insbesondere Verfahren und Zusammensetzungen, die verwendet werden, um einen Vektor (bspw. einen adenoassoziierten viralen Vektor (AAV)), der eine die Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD) kodierende Nukleotidsequenz umfasst an Zielzellen, bspw. dem Nucleus Subthalamicus der Basalganglien, zuzuführen bzw., zu liefern.
Besonders bevorzugte Verfahren einer Zufuhr des Vektors an spezifische Regionen des Gehirns sind solche Verfahren, die einfach und sicher sind und ein mit ihnen verbundenes geringeres Risiko als Läsionen, Elektrodenimplantation oder Zelltransplantation aufweisen. Beispielsweise eine Zufuhr des Vektors unter Verwendung von stereotaktischen Mikroinjektionsverfahren, oder Zufuhr des Vektors unter Verwendung spezialisierter Proben bzw. Sonden, oder perkutane Zufuhr durch einen Durchbruch der Blut-Hirn-Schranke. Eine Zufuhr des Vektors unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens führt zu minimalen immunologischen oder inflammatorischen Reaktionen innerhalb der Hirnregion, wodurch die Notwendigkeit einer Immunsuppression beseitigt wird. Nach einer Zufuhr des Vektors an eine spezifische Hirnregion ereignet sich eine regionale Dispersion und/oder Diffusion des Vektor, wodurch eine lokale Verteilung des Gens und eine stabile Genexpression sichergestellt wird.
Die Verfahren und Zusammensetzungen sind besonders zur Behandlung neurodegenerativen Erkrankungen nützlich, wie beispielsweise der Parkinson Krankheit, Huntington Krankheit, Amyotrophe Lateralsklerose (ALS oder Lou Gehrig Krankheit), Alzheimer Krankheit als auch Epilepsie.
Demgemäß ist in einer Ausführungsform die Erfindung durch die Verwendung eines Vektors zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Verminderung einer neurodegenerativen Erkrankung in einem Subjekt gekennzeichnet, umfassend:
Identifizieren einer Targetstelle in dem Zentralnervensystem, das eine Modifikation erfordert;
Zuführen eines Vektors, der eine eine Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD) kodierende Nukleotidsequenz und eine 3' post-transkriptionelle Regulationselement umfasst zu der Targetstelle im Zentralnervensystem; und
Exprimieren der GAD an der Targetstelle in einer Menge, die wirksam ist die neurodegenerativen Erkrankung zu behandeln oder zu verringern.
In einer Ausführungsform ist der Vektor ein viraler Vektor und ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adenovirus-Vektoren, Herpesvirus-Vektoren, Parvovirus-Vektoren und Lentivirus-Vektoren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der virale Vektor ein adeno-assoziierter viraler Vektor.
In einer anderen Ausführungsform ist der Vektor ein nicht-viraler Vektor. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der nicht-virale Vektor ein Liposomen-vermittelter Zufuhrvektor.
In einer Ausführungsform wird der Vektor an eine spezifische Targetstelle des Zentralnervensystem geliefert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Vektor unter Verwendung einer stereotaktischen Zufuhr zugeführt oder die Zufuhr geschieht unter Verwendung spezialisierter Proben. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Targetstelle des Zentralnervensystems eine Region des Gehirns dar. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Region des Gehirns ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Basalganglien, Nucleus Subthalamicus (STN), Nucleus Pedunculopontinus (PPN), Substantia nigra (SN), Thalamus, Hippocampus, Cortex und Kombinationen hiervon, wobei in einer noch bevorzugteren Ausführungsform die Hirnregion der Nucleus Subthalamicus (STN) ist.
In einer Ausführungsform ist die neurodegenerativen Erkrankung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Parkinson Krankheit und verwandten Bewegungsstörungen, Alzheimer Krankheit, senile Demenz, Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und Epilepsie.
In einer anderen Ausführungsform kennzeichnet die Erfindung die Verwendung eines Vektors zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Verringerung einer Parkinson Krankheit in einer Subjekt, umfassend:
Identifizieren einer oder mehrerer Regionen des Gehirns, die eine Modifikation erfordern;
Zuführen eines Vektors, der eine eine Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD) kodierende Nukleotidsequenz umfasst, zu der Region des Gehirns; und
Exprimieren der GAD in der Region des Gehirns in einer Menge, die wirksam ist Parkinson Krankheit zu behandeln oder zu verringern.
In einer noch anderen Ausführungsform kennzeichnet die Erfindung einen Vektor zur Expression von GAD in Zellen des Zentralnervensystems, welcher einen gewebespezifischen Promotor, der an eine die GAD kodierende Nukleinsäure funktionsfähig verknüpft ist, und ein post-transkriptionelles Regulationselement umfasst.
In einer Ausführungsform ist der Promotor spezifisch für Zellen und Gewebe des Zentralnervensystems, wie beispielsweise die Zellen und Gewebe des Gehirns. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor der Neuronen spezifische Enolase (NSE)-Promotor.
Der Vektor umfasst ebenso post-transkriptionelle Regulationselemente, um eine Expression des kodierten Proteins zu verstärken. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das posttranskriptionelle Regulationselement das Woodchuck post-transkriptionelle Regulationselement. in einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die GAD ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GAD-65 und GAD-67.
1 zeigt Bilder von neuronalen Primärkulturen vom Nucleus Subthalamicus, die mit GAD-67 (zwei obere Felder) exprimierenden AAV-Virus-Vektoren, oder mit GAD-65 (zwei mittlere Felder) exprimierenden Virusvektoren infiziert sind. Die unteren 2 Felder zeigen Zellen, die mit dem GAD-65 Plasmid (unteres linkes Feld) und dem GAD-67 Plasmid (unteres rechtes Feld) infiziert sind.
1A–1F sind Mikrofotographien, die eine erfindungsgemäße Plasmidtransfektion zeigen; Figuren A und D zeigen eine Plasmidtransfektion von HEK 293 Zellen mit 1 μg rAAV DNA und Figuren B und E zeigen eine rAAV-Vektortransduktion von HEK 293 Zellen mit 5 μg rAAV Vektor, während Figuren C und F nicht-transfizierte HEK 293 Zellen zeigen.
2 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung einer rAAV Transduktion auf die GABA Freisetzung von primär kultivierten Striatumneuronen zeigt.
3 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung einer rAAV-GAD Behandlung von Apomorphin-induzierter Drehung bei an Parkinson Krankheit chronisch erkrankten Ratten zeigt.
4 ist eine graphische Darstellung, die die neuroprotektive Wirkung einer rAAV-GAD Behandlung von Apomorphin-induzierter Drehung zeigt.
5A ist eine graphische Darstellung, die die potente neuroprotektive Wirkung von GAD65 auf Apomorphindrehung zeigt.
5B ist eine andere graphische Darstellung, die die potente neuroprotektive Wirkung von GAD65 auf Apomorphindrehung zeigt.
6A ist eine graphische Darstellung, die zeigt, dass 2 Monate nach rAAV Transduktion in an Parkinson Krankheit chronisch erkrankten Ratten keine signifikante Verringerung in der Kopfstellungsvorspannung geschieht.
6B ist eine weitere graphische Darstellung, die zeigt, dass 4 Monate nach rAAV Transduktion in an Parkinson Krankheit chronisch erkrankten Ratten keine signifikante Verringerung in der Kopfstellungsvorspannung geschieht.
7A ist eine graphische Darstellung, die darstellt, dass die Kopfstellungsvorspannung in mit rAAV-GAD65 transduzierten Ratten verbessert war.
7B ist eine weitere graphische Darstellung, die zeigt, das rAAV-GAD65 transduzierte Ratten ausgeprägte Wirkungen auf die Kopfstellungsvorspannung zeigten.
8 ist eine graphische Darstellung, die eine direkte Korrelation zwischen einer Apomorphindrehung und einer Kopfstellungsvorspannung zeigt.
9 ist eine graphische Darstellung, die zeigt, dass die Pfotenberührungsanzahl in allen rAAV-GAD- und Ibotensäureläsionsgruppen signifikant verbessert war.
10 ist eine weitere graphische Darstellung, die zeigt, dass rAAV-GAD-65 eine ausgeprägte neuroprotektive Wirkung auf die Pfotenberührungsanzahl aufweist.
11A ist eine graphische Darstellung, die zeigt, dass eine ausgeprägte Verbesserung bei der Fortbewegungsaktivität in Parkinson-Ratten mit kombiniertem rAAV-GAD65 und 67 beobachtet wurde.
11B ist eine graphische Darstellung, die weiterhin zeigt, dass eine ausgeprägte Verbesserung bei der Fortbewegungsaktivität bei Parkinson-Ratten mit kombiniertem rAAV-GAD65 und 67 beobachtet wurde.
12A ist eine graphische Darstellung, die zeigt, dass ebenso Beweisanzeichen von neuroprotektiven Wirkungen auf eine Fortbewegungsaktivität durch rAAV-GAD Transduktion vorkommen.
12B ist eine graphische Darstellung, die eine neuroprotektive Wirkung auf eine Fortbewegungsaktivität durch rAAV-GAD Transduktion zeigt.
13 ist eine graphische Darstellung einer extrazellulären GABA Konzentration während einer STN Stimulation.
14 ist eine graphische Darstellung einer extrazellulären Glutamatkonzentration während einer STN Stimulation.
15 ist ein Histogramm, dass die Antwort von Neuronen in der Substantia nigra auf elektrische Stimulation in dem STN einer normalen Ratte zeigt.
16 ist ein Histogramm, dass die Antwort von Neuronen in der Substantia nigra auf elektrische Stimulation in der STN in einer rAAV-GAD transduzierten Ratte zeigt.
17A ist eine graphische Darstellung einer extrazellulären GABA Konzentration in der SN während STN Stimulation in naiven Ratten.
17B ist eine graphische Darstellung einer extrazellulären GABA Konzentration in der SN während STN Stimulation in rAAV-GAD Ratten.
18A–18F sind Mikrophotographien, die eine rAAV-GAD Expression in vivo zeigen. 18A, B, C und D zeigen eine GAD65 Expression in dem STN, die mit AD65 Ab (Boehringer) festgestellt wurde. 18A und C stammen aus naiven STN, die eine endogene GAD65 Expression zeigen. 18B und D basieren auf rAAV-GAD transduzierter STN, so dass ein Anstieg in GAD exprimierenden Zellkörpern gesehen wird, während 18E und F eine GAD65 Expression in dem Hippocampus zeigen. (18E ist naiv und 18F ist rAAV-GAD transduziert).
19A beziehungsweise 19B sind Rasterdiagramme, die eine Aktivität in einem Affen vor einer GAD67 Behandlung zeigen.
20 ist eine Mikrophotographie, die eine GFP Immunfärbung an einer Injektionsstelle zeigt.
21A und 21B sind ausführlichere Bilder, die in 21A mit GFP Antikörper gefärbte Neuronen ähnliche Zellen zeigen und in 21B mit GFP Antikörper gefärbte Glia ähnliche Zellen zeigen.
22 ist ein Foto einer GAD Immunfärbung einer rAAV-GAD behandelten Affen, das einen Anstieg in der Immunfärbung auf der rAAV-GAD behandelten rechten Seite zeigt, während die Morphologie der Region nach Chirurgie unverändert erhalten bleibt.
Bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung werden, wenn nicht anderweitig erwähnt gewöhnliche Verfahren aus der Virologie, Mikrobiologie, Molekularbiologie und der rekombinanten DNA-Technologie verwendet, die innerhalb des Könnens des Fachmanns liegen. Derartige Techniken werden vollständig in der Literatur erklärt. (Siehe bspw. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Current Edition); DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotides Synthesis (N. Gait, ed., Current Edition); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition); CRC Handbook of Parvoviruses, Vol. I & II (T. Tijessen, ed.); Fundamental Virology, 2^nd Edition, Vol. I & II (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.)).
Um die Erfindung klarer zu verstehen, werden die folgenden Begriffe festgelegt:
Der Begriff "neurodegenerative Störung" wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Erkrankung, die eine morphologische und/oder funktionelle Anomalie einer Neuronenzelle oder einer Population neuronaler Zellen verursacht. Die neurodegenerative Störung kann zu einer Beeinträchtigung oder einer Abwesenheit einer normalen neurologischen Funktion oder einer Anwesenheit einer anormalen neurologischen Funktion in einem Subjekt führen. Beispielsweise können neurodegenerative Störungen die Folge von Erkrankung, Verletzung und/oder Alter sein. Nicht begrenzende Beispiele morphologischer und funktioneller Anomalien umfassen körperlichen Zerfall und/oder Tod neuronaler Zellen, ein anormales Wachstumsmuster neuronaler Zellen, Anomalien in der körperlichen Verbindung zwischen neuronalen Zellen, Unter- oder Überproduktion einer Substanz oder von Substanzen, beispielsweise eines Neurotransmitters durch neuronale Zellen, Störung bzw. Ausfall neuronaler Zellen eine Substanz oder Substanzen herzustellen, die sie normalerweise produzieren, Herstellung von Substanzen, bspw. von Neurotransmittern und/oder Übertragung elektrischer Impulse in anormalen Mustern oder zu anormalen Zeiten. Neurodgeneration kann sich in irgendeinem Bereich des Gehirns einer Subjekt ereignen und zeigt sich bei vielen Erkrankungen, beispielsweise einschließlich bei Kopftrauma, Schlaganfall, ALS, Multipler Sklerose, Huntington Krankheit, Parkinson Krankheit und Alzheimer Krankheit.
Der Begriff "Subjekt" wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf irgendeinen lebenden Organismus, in dem eine Immunantwort hervorgerufen wird. Der Begriff Subjekt umfasst, ist aber nicht auf Menschen, nicht menschliche Primaten, wie beispielsweise Schimpansen und andere Menschenaffen und Affenarten, Nutztiere wie beispielsweise Rinder, Schafe, Schweine, Ziegen und Pferde, Haustiere wie beispielsweise Hunde und Katzen, Labortiere einschließlich Nagern wie beispielsweise Mäuse, Ratten und Meerschweinchen und dergleichen begrenzt. Der Begriff bezeichnet kein besonderes Geschlecht oder Alter. Daher wird beabsichtigt, erwachsene und neugeborene Subjekte, als auch Feten, ob männlich oder weiblich, einzuschließen. Der Begriff "Zentralnervensystem" oder "ZNS" wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die in dem Fachgebiet anerkannte Verwendung des Begriffs. Das ZNS betrifft das Gehirn, craniale Nerven und Rückenmark. Das ZNS umfasst ebenso die Cerebrospinalflüssigkeit, die die Ventrikel des Gehirns und den zentralen Kanal des Rückenmarks füllt.
Der Begriff "ändern" oder "geändert" wird hierin wechselweise verwendet und bezieht sich auf die Hinaufregulation oder Herunterregulation eine Targetgens oder eines Targetproteins. Der Begriff verändern oder verändert bzw. modifiziert bezieht sich ebenso auf der Anstieg bzw. Erhöhung, Abnahme, Anstieg, oder Erniedrigung von Vorgängen oder Signaltransduktionskaskaden, die ein Targetgen oder ein Targetprotein erfordern. Beispielsweise kann ein Targetprotein ein GABA sein. Eine Modifikation an der GABA Konzentration kann sich ereignen, wenn ein therapeutisches Agens, beispielsweise GAD die GABA Konzentration ändert. Modifikationen führen beispielsweise zu einem Anstieg in der GABA Konzentration durch die Expression von GAD in glutaminergen Neuronen und intrinsischen Zellen des STN. Modifikationen können ebenso von der Zugabe eines therapeutischen Agens herrühren, das die GABA Aminotransferase inaktiviert. Die Wirkung besteht darin den Abbau von GABA zu blockieren und dadurch seine Konzentration zu erhöhen. Verschiedene auf der Wirkungsweise basierende GABA Aminotransferaseinaktivatoren sind bekannt (siehe bspw. Silverman Mechanism-Based Enzyme Inactivation: Chemistry and Enzymology, Vol. I & II. CRC: Boca Raton 1988). Der Begriff ändern bzw. modifizieren umfasst ebenso ein Erhöhen oder Aktivieren von GAD mit therapeutischen Agenzen, die GAD aktivieren, wie beispielsweise Natriumvalporat. Der Anstieg von GAD führt zu einem Anstieg von GABA, das anschließend eine Überstimulation von Basalganglienverschaltungen verringert.
Nicht begrenzende Beispiele von Modifikationen umfassen Modifikationen morphologischer und funktioneller Vorgänge, Unter- und Überproduktion oder Expression einer Substanz oder Substanzen, bspw. eines Neurotransmitters durch neuronale Zellen, Störung neuronaler Zellen eine Substanz oder Substanzen, die sie normalerweise produzieren, herzustellen, Produktion von Substanzen, bspw. von Neurotransmittern und/oder Übertragung elektrischer Impulse.
Der Begriff "gewebespezifischer Promotor" wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Promotor, der in Zellen des Zentralnervensystem (ZNS) in funktionsfähig ist. Beispiele von Promotoren des ZNS umfassen, sind aber nicht auf solch begrenzt, Neuronen-spezifische Promotoren (bspw. der Neurofilamentpromotor; Byrne und Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473–5477) und Glia-spezifische Promotoren (Mori et al., (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 175: 185–191). Vorzugsweise ist der Promotor gewebespezifisch und im Wesentlichen außerhalb des Zentralnervensystems nicht aktiv oder die Aktivität des Promotors ist im Zentralnervensystem höher als in anderen Systemen. Beispielsweise ist ein Promotor spezifisch für das Rückenmark, den Hirnstamm, (Medulla, Pons und Mittelhirn), das Cerebellum, Diencephalon (Thalamus, Hypothalamus), Telencephalon (Corpus Striatum, cerebraler Cortex, oder innerhalb des Cortex, den Okzipital-, Temporal-, Parietal- oder Frontallappen) STN, SN oder Kombinationen hiervon. Der Promotor kann ebenso einer sein, der in Kombination mit einem AAV zu einer höheren Expression führt. Beispielsweise arbeitet ein Zytomegalie-Virus Enhancer/Hühnchen-Actin (CBA) Hybridpromotor in Zellen des ZNS (Xu et al., (2001) Hum Gene Ther. 12: 563–73).
Der Begriff "Homologie" oder "Identität" wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die prozentuale Gleichheit zwischen Nukleinsäuremolekülen. Um die Homologie oder prozentuale Identität zweier Aminosäuresequenzen oder zweier Nukleinsäuresequenzen festzustellen, werden die Sequenzen zu optimalen Vergleichszwecken (bspw. können für eine optimale Anordnung Lücken in eine oder beide einer ersten und einer zweiten Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenz eingefügt und nicht-homologe Sequenzen können für Vergleichszwecke vernachlässigt werden) angeordnet. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Länge einer zu Vergleichszwecken angeordneten Referenzsequenz mindestens 30%, vorzugsweise mindestens 40%, noch bevorzugter mindestens 50%, sogar noch bevorzugter mindestens 60% und sogar noch bevorzugter mindestens 70%, 80%, oder 90% der Länge der Bezugssequenz. Die Aminosäurereste oder Nukleotide werden dann bei entsprechenden Aminosäurepositionen oder Nukleotidpositionen verglichen. Wenn eine Position in der ersten Sequenz durch den gleichen Aminosäurerest oder das Nukleotid wie die entsprechende Position in der zweiten Sequenz besetzt wird, dann sind die Moleküle an dieser Position (wie hierin verwendet ist Aminosäure oder Nukleinsäure "Identität" zu der Aminosäure oder Nukleinsäure "Homologie" äquivalent) identisch. Die prozentuale Identität zwischen den zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl der von den Sequenzen geteilten identischen Positionen, wobei die Anzahl der Lücken und die Länge jeder Lücke, die für eine optimale Anordnung der zwei Sequenzen eingefügt werden muss, berücksichtigt werden.
Der Vergleich von Sequenzen und Feststellen einer prozentualen Identität zwischen zwei Sequenzen kann unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus ausgeführt werden. Beispielsweise kann die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäuresequenzen unter Verwendung des Needleman und Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. (48): 444–453) Algorithmus festgestellt werden, der in das GAP Programm in das GCG Softwarepaket (erhältlich bei http://www.gcg.com) eingefügt wurde, das entweder eine Blossom 62 Matrix oder eine PAM250 Matrix und eine Lückengewichtung von 16, 14, 12, 10, 8, 6, oder 4 und eine Längengewichtung von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 verwendet. In einem anderen Beispiel wird die prozentuale Identität zwischen zwei Nukleotidsequenzen unter Verwendung des GAP-Programms in dem GCG Softwarepaket (erhältlich bei http://www.gcg.com) festgestellt, das ein NWSgapdna.CMP Matrix und eine Lückengewichtung von 40, 50, 60, 70 oder 80 und eine Längengewichtung von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 verwendet. In noch einem anderen Beispiel wird die prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäuresequenzen unter Verwendung des Algorithmus von E. Meyers und W. Miller (CABIOS, 4: 11–17 (1989)) festgestellt, der in das ALIGN Programm (Version 2.0) eingefügt wurde, das eine PAM120 Restegewichtungstabelle, eine Lückenlängenstrafe von 12 und eine Lückenstrafe verwendet. Die Erfindung wird in den folgenden Unterabschnitten ausführlich beschrieben
I. Neurodegenerative Erkrankungen
(a) Parkinson Krankheit
Die Parkinson Krankheit ist mit Störungen der Körperhaltung, Fortbewegung, Gesichtsausdruck oder Sprache assoziiert. Die Manifestationen können asymmetrisch sein, bspw. wird ein leichtes Zittern der Finger an einer nicht bewegten Hand dann beidseitig. Symptome der Parkinson Krankheit werden durch den Verlust von Nervenzellen in der pigmentierten Substantia nigra pars compacta (SNPC) und dem Locus coeruleus im Mittelhirn verursacht. Das Striatum oder Corpus striatum ist eine Struktur in den Gehirnhälften, die aus zwei Basalganglien (dem Nucleus caudatus und Putamen) und der Faser der inneren Kapsel, die sie trennt, bestehen. Die Parkinson Krankheit beeinflusst im Menschen hauptsächlich die subcorticalen Strukturen, insbesondere die Substantia nigra und den Locus ceruleus. Sie ist durch den Verlust von Dopaminneuronen in der Substantia nigra gekennzeichnet, deren hauptsächliches Targetorgan die Basalganglien sind. Ein Zellverlust ereignet sich ebenso in dem Globus pallidus und dem Putamen.
Die Parkinson Krankheit ist ebenso mit eosinophilen intraneuronalen Inklusionkörnchen (Lewy Körperchen) assoziiert, die in den Basalganglien, dem Hirnstamm, Rückenmark und den sympathischen Ganglien vorkommen. Die Pars compacta Neuronen der Substantia nigra (SN) stellen dopaminergen Input in das Striatum bereit, das Teil der Basalganglien ist. Diese dopaminergen Neurone modulieren eine monosynaptische gamma-Aminobuttersäure (GABA) Hemmleistung in dem Globus pallidus interna und der Pars reticulata der Substantia nigra. Bei der Parkinson Krankheit führt der Verlust dopaminerger Zellen in der Substantia nigra zu einer Dopaminverarmung im Striatum. Dieser Dopaminverlust ändert die Aktivität von Neuronen innerhalb der Basalganglienverschaltung, einschließlich übermäßigem Zünden und Aktivität dieser Zellen. Demgemäß kann zur Behandlung einer neurodegenerativen Erkrankung der Substantia nigra ein ein therapeutisches Agens enthaltender Vektor, bspw. eine die GAD kodierende Nukleotidsequenz, an die Stelle eines dopaminergen Zellverlusts oder anderen Regionen der Basalganglien und Ausgabe-Kerne (output nuclei) zugeführt werden. In einer Ausführungsform kann der Vektor ein therapeutisches Agens enthalten, das an die Substantia nigra geliefert wird. In einer anderen Ausführungsform kann der Vektor ein therapeutisches Agens enthalten, das an die Substantia nigra pars reticulata (SNRP) geliefert wird.
(b) Alzheimer Krankheit
Die Alzheimer Krankheit ist durch einen schrittweisen Verlust intellektueller Fähigkeiten gekennzeichnet. Eine Post-mortem Untersuchung des Gehirns zeigt eine allgemeine Atrophie. Bei der Alzheimer Krankheit gibt es umfangreiche histologische Änderungen, die durch die Anwesenheit intrazellulärer amyloider Plaques und neurofibrillärer Webnetze (tangles) dominiert werden. In den Basalganglien und der Substantia nigra sind jedoch die Plaques und Webnetze selten. Viel Proben von Alzheimer Krankheit Patienten zeigen einen Verlust der Pigmentierung in dem Bereich des Locus ceruleus, der eine Hauptquelle noradrenerger Synthese im Gehirn darstellt.
II. Gamma-Aminobuttersäure (GABA) und Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD)
Gamma-Aminobuttersäure (GABA) und Glutaminsäure sind zwei Hauptneurotransmitter, die in die Regulation der neuronalen Gehirnaktivität verwickelt sind. GABA stellt den hauptsächlichen hemmenden Neurotransmitter und 1-Glutaminsäure einen erregenden Transmitter (Roberts et al., GABA in Nervous System Function, Raven Press: New York, 1976; McGeer et al., Glutamine, Glutamate, and GABA in the Central Nervous System; HertzL, Kvamme E, McGeer E. G., Schousbal A, eds., Liss; New York, 1983; 3–17) dar. GABA wird von dopaminergen Zellen freigesetzt. Ein Ungleichgewicht in der Konzentration dieser Neurotransmitter kann zu krampfartigen Zuständen führen. Wenn die Konzentration von GABA im Gehirn unter einen Schwellenwert abnimmt, entstehen Krämpfe (Karlsson et al., (1974) Biochem. Pharmacol. 23: 3053–3061). Wenn die GABA-Werte im Gehirn ansteigen enden die Krämpfe (Hayashi (1959) supra). Bei einigen krampfartigen Störungen werden die verringerten GABA-Werte von einem verringerten Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD) Aktivitätsniveau (McGeer et al., GABA in Nervous System Function; Roberts E, Chase T. N., Tower D. B., eds., Raven Press: New York ^976: 487–495; Butterworth et al., (1983) Neurochem. 41: 440–447) begleitet. Die GAD und GABA Konzentration variieren parallel, da eine abgesenkte GAD Konzentration zu einer geringeren GABA Produktion führt.
GABA wechselwirkt mit mindestens zwei Rezeptoren, dem GABA-A und GABA-B. Die GABA-A Rezeptoren wurden gut beschrieben und sind an Chloridkanäle (Bormann (1988) Trends Neurosci. 11: 112–116) gekoppelt. Die GABA-A Rezeptoren sind mit ligandenkontrollierten Ionenkanälen verwandt, die zu der gleichen Superfamilie gehören wie die Nikotinrezeptor für Acetylcholin. In Gegensatz dazu werden die GABA-B Rezeptoren weniger gut verstanden, obwohl Berichte beschreiben, dass die GABA-B Rezeptoren entweder mit Calcium- oder Kaliumkanälen gekoppelt sind (Bormann (1988) Trends Neurosci. 11: 11–116 supra).
Der Hauptanteil der Neurone im Striatum (Caudatus-Putamen, dorsales Striatum; Nucleus accumbens; ventrales Striatum) und in Projektionsregionen des Striatums (dem Pallidum, dem Nucleus entopeduncularis und Substantia nigra reticulata) verwenden GABA als Transmitter und exprimieren GAD bei der Synthese von GABA. Das Gehirn enthält mindestens zwei molekulare Formen von GAD, dem Hauptsyntheseenzym für GABA. Die zwei Formen, GAD-65 und GAD-67 genannt, sind die Produkte zweier Gene und unterscheiden sich in der Sequenz, dem Molekulargewicht und dem Grad der Expression innerhalb von Hirnregionen. GAD-65 scheint zu einem höheren Maß als GAD-67 in Nervenendigungen angeordnet zu sein, das gleichmäßiger über die Zelle verteilt erscheint. Obwohl GAD-65 und GAD-67 in einigen Eigenschaften beträchtlich verschieden sind, weisen sie ebenso wesentliche Ähnlichkeiten und Wechselwirkungen auf und die Gegenwart individueller GAD Formen in bestimmten Zelltypen, stimmt mit der Vorstellung überein, dass GAD-65 und GAD-67 jeweils GABA synthetisieren können. Somit scheinen GAD-65 und GAD-67 ein Doppelsystem zur Steuerung der neuronalen GABA Synthese bereitzustellen. Spezifische Änderungen in der Aktivität bei Subpopulationen von GABA Neuronen des Striatums, vermitteln die bei der Parkinson Krankheit vorkommenden Dopamin abhängigen Wirkungen (Lindefors (1993) Prog. Neuropsychopharmacol. Biol Psychiatry 17: 887–903).
Menschliches GAD-65 und GAD-67 wurden durch Bu et al. (1992) Proc. Natl. Acad Sci 89: 2115–2119 isoliert und kloniert. Menschliche GAD-65 cDNA kodiert ein Polypeptid mit einem MG 65.000 mit 585 Aminosäureresten (Genbank Accession No. NM000818; M81882), menschliche GAD-67 kodiert ein Polypeptid mit einem MG 67.000 mit 594 Aminosäurenresten (Genbank Accession No. NM013445; M81883).
In einer Ausführungsform kennzeichnet die Erfindung einen Vektor, der eine GAD-65 kodierende Nukleotidsequenz umfasst. In einer anderen Ausführungsform kennzeichnet die Erfindung einen Vektor, der eine GAD-67 kodierende Nukleotidsequenz umfasst.
Ebenfalls innerhalb des Umfangs der Erfindung liegt ein durch eine Nukleotidsequenz kodiertes Polypeptid, das mindestens 60% Homologie zu GAD-65 oder Fragmenten hiervon aufweist. Ein Polypeptid, das durch eine/die Nukleotidsequenz kodiert wird, weist ungefähr 70% Homologie, ungefähr 75% Homologie, ungefähr 80% Homologie, ungefähr 85% Homologie, ungefähr 90% Homologie, ungefähr 95% Homologie, ungefähr 99% Homologie zu GAD-65 oder einem Fragment hiervon auf. Ebenfalls innerhalb des Bereichs der Erfindung liegt ein Polypeptid, das durch eine Nukleotidsequenz kodiert wird, die mindestens 60% Homologie zu GAD-67 oder einem Fragment hiervon aufweist. Ein Polypeptid, das durch die Nukleotidsequenz kodiert wird, weist ungefähr 70% Homologie, ungefähr 75% Homologie, ungefähr 80% Homologie, ungefähr 85% Homologie, ungefähr 90% Homologie, ungefähr 95% Homologie, ungefähr 99% Homologie zu GAD-67 oder einem Fragment hiervon auf.
Die GAD Transduktion in Targetzellen des STN wird den lokalen Hemmtonus spezifisch erhöhen, der durch Erhöhen des extrazellulären GABA's wirkt und durch Einwirken auf sowohl die GABA-A als auch die GABA-B Rezeptor die neuronale Aktivität in der STN hemmt. Die Genexpression unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens stellt vollständig stabile Mengen der Transgenexpression für mindestens 15 Monate in vivo bereit (siehe Beispiel 3). Das aus den tranduzierten Zellen freisetze GABA diffundiert lokal, bindet an die GABA Rezeptoren, was zu einer signifikanten Unterdrückung einer Aktivität führt. Wichtigerweise kommt der Gentransfer unter Verwendung von AAV, unähnlich entweder der Abtragung oder dem DBS, ohne irgendein zelluläres Eindringen, irgendeine Mikrogliazellaktivierung und fehlender reaktiver Astrocytose aus. Jede dieser ausgleichenden oder inflammatorischen Antworten auf die Abtragungs- oder den DBS-Versuche wird die Wirksamkeit dieser entsprechenden Strategien wahrscheinlich verringern und möglicherweise andere aufweisen.
III. Vektoren
Die Vektoren der Erfindung können den Zellen des Zentralnervensystem unter Verwendung viraler Vektoren oder unter Verwendung nicht-viraler Vektoren zugeführt werden. in einer bevorzugten Ausführungsform, verwendet die Erfindung adeno-assoziierte virale Vektoren, die eine GAD kodierende Nukleotidsequenz zur Genzufuhr umfassen. AAV-Vektoren können unter Verwendung bekannter Techniken zusammengebaut werden, um mindestens die in funktionsfähiger Weise gekoppelten Bestandteile von Steuerelementen bereitzustellen, einschließlich einer Transkriptionsinitiationsregion, eines exogenen Nukleinsäuremoleküls, einer Transkriptionsterminationsregion und mindestens eine post-transkriptionelle Regulationsequenz. Die Steuerelemente werden ausgesucht, um in der Targetzelle funktionsfähig zu sein. Das sich ergebende Konstrukt, das die funktionsfähig gekoppelten Bestandteile enthält, wird an der 5'- und 3'-Region von funktionellen AAV ITR Sequenzen flankiert.
Die Nukleotidsequenzen der AAV ITR-Regionen sind bekannt. Die ITR-Sequenzen für AAV-2 sind beispielsweise bei Kotin et al. ((1994) Human Gene Therapy 5: 793–801; Berns "Parvoviridae and their Replication" in Fundamental Virology, 2nd Edition, (B. N. Fields and D. M. Knipe eds.)) beschrieben. Dem Fachmann wird klar sein, dass AAV ITR's unter Verwendung von Standardverfahren der Molekularbiologie verändert werden können. Demgemäß müssen die in den Vektoren der Erfindung verwendeten AAV ITRs keine Wildtyp Nukleotidsequenz aufweisen und können, beispielsweise durch Insertion, Deletion oder Substitution von Nukleotiden geändert werden. Außerdem können AAV ITRs von irgendeinem der AAV Serotypen stammen, einschließlich aber nicht begrenzt auf AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAVX7 und dergleichen. Weiterhin müssen die 5'- und 3'-ITRs, die eine ausgewählte Nukleotidsequenz in einem AAV-Expressionsvektor flankieren, nicht notwendigerweise identisch sein oder von den gleichen AAV Serotyp oder Isolat stammen, so lange wie die beabsichtigte ITR Funktion, d.h. das Ausschneiden und die Replikation der gebundenen Nukleotidsequenz von Interesse gestattet ist, wenn AAV rep Genprodukte in der Zelle vorhanden sind.
Dem Fachmann ist klar, dass die Regulationssequenzen häufig von allgemein verwendeten Promotoren, die von Viren wie beispielsweise Polyoma, Adenovirus 2, Zytomegalie-Virus und Simian Virus 40 stammen, bereitgestellt werden können. Eine Verwendung von viralen Regulationssequenzen, u die Expression des Proteins zu steuern, kann in verschiedenen Wirtszellen einen hohen konstitutiven Expressionsgrad gestatten. Allgegenwärtig verwendete exprimierende Promotoren können ebenfalls verwendet werden, beispielsweise einschließlich des early-Zytomegalie-Virus Promotors (Boshart et al. (1985) Cell 41: 521–530), Herpesvirus Thymidinkinase (HSV-TK) Promotor (McKnight et al. (1984) Cell 37: 253–262), den β-Aktin Promotoren (bspw. der menschliche β-Actin Promotor wie durch Ng et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5.2720–2732, beschrieben) und dem Colony Stimulating Factor-1 (CSF-1) Promotor (Ladner et al. (1987) EMBO J. 6: 2693–22698).
Alternativ können die Regulationssequenzen des AAV Vektors die Expression des Gens vorzugsweise in einem besonderen Zelltyp steuern, d.h. gewebespezifische Regulationselemente können verwendet werden. Nicht begrenzende Beispiele von gewebespezifischen Promotoren, die einschließlich spezifischer Promotoren des Zentralnervensystems (ZNS), wie beispielsweise neuronenspezifische Promotoren (bspw. der Neurofilamentpromotor; Byrne and Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473–5477) und gliaspezifischen Promotoren (Mori et al. (1991) Biochem. Biophys Res. Commun. 175: 185–191) verwendet werden können. Vorzugsweise ist der Promotor gewebespezifisch und im Wesentlichen außerhalb des Zentralnervensystems nicht aktiv oder die Aktivität des Promotors ist im Zentralnervensystem höher als in anderen Systemen. Beispielsweise ist ein Promotor spezifisch für das Rückenmark, den Hirnstamm, (Medulla, Pons und Mittelhirn), das Cerebellum, Diencephalon (Thalamus, Hypothalamus), Telencephalon (Corpus Striatum, cerebraler Cortex, oder innerhalb des Cortex, den Okzipital-, Temporal-, Parietal- oder Frontallappen), oder Kombinationen hiervon. Der Promotor kann für einen besonderen Zelltypen, wie beispielsweise Neuronen und Gliazellen im ZNS Spezifisch sein. Wenn er in Gliazellen aktiv ist, dann kann er für Astrozyten, Oligodendrozyten, Ependymalzellen, Schwannzellen oder Mikroglia spezifisch sein. Wenn er in Neuronen aktiv ist, dann kann er für besondere Neuronentypen, bspw. Motorneurone, sensorische Neuronen oder Interneurone spezifisch sein. Vorzugsweise ist der Promotor für Zellen in besonderen Hirnregionen, beispielsweise dem Cortex, dem Striatum nigra und dem Hippocampus spezifisch.
Geeignete neuronenspezifische Promotoren umfassen, sind aber nicht begrenzt auf neuronenspezifische Enolase (NSE) (Olivia et al. (1991) Genomics 10: 157–165, GenBank Accession No.: X51956) und menschlichen Neurofilament-Leichtketten Promotor (NEFL) (Rogaev et al. (1992) Hum. Mol. Genet. 1: 781, GenBank Accession No.: L04147). Gliaspezifische Promotoren umfassen, sind aber nicht begrenzt auf Gliafibrillen saures Protein (GFAP) Promotor (Mori et al. (1991) Biochem. Biophys Res. Commun. 175: 185–191, Genbank Accession No: M65210), S 100 Promotor (Mori et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 175: 185–191; GenBank Accession No: M65210) und den Glutaminsynthase Promotor (Van den et al. (1991) Biochem. Biophys Acta. 2: 249–251; GenBank Accession No: X59834). In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Gen stromaufwärts (d.h. 5') durch den neuronenspezifischen Enolase (NSE) Promotor flankiert. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Gen von Interesse stromaufwärts (d.h. 5') durch den Elongationsfaktor 1 alpha (EF) Promotor flankiert.
Der AAV Vektor, der die Nukleotidsequenz trägt, die ein Protein von Interesse, bspw. GAD und eine post-transkriptionelle Regulationssequenz (PRE) kodiert, die durch AAV ITRs flankiert wird, kann durch unmittelbares Einfügen der das Protein von Interesse und die PRE kodierenden Nukleotidsequenz in ein AAV Genom, aus dem die hauptsächlichen AAV offenen Leserahmen ("ORFs") herausgeschnitten wurden, zusammengebaut werden. Andere Abschnitte des AAV Genoms können ebenso beseitigt werden, so lange ein ausreichender Abschnitt der ITRs erhalten bleibt, um Replikations- und Verpackungsfunktionen zu gestatten. Diese Konstrukte können unter Verwendung der im Stand der Technik gut bekannten Techniken gestaltet werden. (Siehe bspw. Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell Biol. 8: 3988–3998; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter (1992) Current Opinion in Biotechnology 3: 533–539; Muzyczka et al. (1994) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158: 97–129; Kotin (1994) Human Gene Therapy 5: 793–801; Shelling et al. (1992) Gene Therapy 1: 165–169 und Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179: 1867–1875).
Alternativ können AAV ITRs aus dem Virusgenom oder aus einem AAV Vektor, der die gleichen enthält, herausgeschnitten werden und 5' und 3' von einem ausgewählten Nukleinsäurekonstrukt, das in einem anderen Vektor vorkommt unter Verwendung von Standardligationstechniken fusioniert werden, wie beispielsweise denen, die in Sambrook et al., supra, beschrieben werden. Einige AAV Vektoren sind von der American Type Culture Colletion ("ATCC") unter den Hinterlegungsnummern 53222, 53223, 53224, 53225 und 53226 erhältlich.
Um rekombinante AAV Partikel herzustellen, kann ein AAV Vektor in eine geeignete Wirtszelle unter Verwendung bekannter Verfahren, wie beispielsweise durch Transfektion, eingefügt werden. Eine Anzahl Transfektionsverfahren sind im Allgemeinen im Stand der Technik bekannt. Siehe bspw., Graham et al. (1973) Virology, 52: 456; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Habour Laboratories, N. Y.; Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, and Chu et al., (1981) Gene 13: 197. Besonders geeignete Transfektionsverfahren umfassen Calciumphosphat Co-Präzipitation (Graham et al. (1973) Virol. 52: 456–467), direkte Mikroinjektion in kultivierte Zellen (Capecchi (1980) Cell 22: 479–488), Elektroporation (Shigekawa et al. (1988) Bio Techniques 6: 742–751), Liposomen-vermittelter Gentransfer (Mannino et al. (1988) Bio Techniques 6: 682–690), Lipid-vermittelte Transduktion (Feigner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413–7417) und Nukleinsäurezufuhr unter Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektilen (klein et al. (1987) Nature 327: 70–73).
Geeignete Wirtszellen zur Herstellung rekombinanter AAV Partikel umfassen, sind aber nicht begrenzt auf Mikroorganismen, Hefezellen, Insektenzellen und Säugerzellen, die als Empfänger eines exogenen Nukleinsäuremoleküls verwendet werden können oder verwendet wurden. Somit bezieht sich eine "Wirtszelle" wie sie hierin verwendet wird im Allgemeinen auf eine Zelle, die mit einem Nukleinsäuremolekül transfiziert wurde. Die Wirtszelle umfasst irgendeine eukaryotische Zelle oder Zelllinie, so lange die Zelle oder die Zelllinie nicht mit dem zu exprimierenden Protein, dem gewählten Selektionssystem oder dem verwendeten Fermentationssystem verträglich sind. Nicht begrenzende Beispiele umfassen CHO dhfr-Zellen (Urlaub and Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216–4220), 293 Zellen (Graham et al. (1977) J. Gen. Virol. 36: 59) oder Myelomazellen wie SP2 oder NS0 (Galfre and Milstein (1981) Meth. Enzymol. 73(B): 3–46).
In einer Ausführungsform werden Zellen von der stabilen menschlichen Zelllinie 293 (ahne weiteres erhältlich durch bspw. ATCC unter der Hinterlegungsnummer ATCC CRL1573) bei der Umsetzung der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Insbesondere ist die menschliche Zelllinie 293 eine menschliche embryonale Nierenzelllinie, die mit Adenovirus Typ-5 DNA-Fragmenten (Graham et al. (1977) J. Gen. Virol. 36: 59) transfiziert wurde und die adenoviralen E1a und E1b Gene (Alello et al. (1979) Virology 94: 460)) exprimiert. Die Zelllinie 293 ist bereits transfiziert und stellt eine besonders bequeme bzw. praktische Plattform bereit, bei der rAAV Viruspartikel hergestellt werden können.
Wirtszellen, die die vorstehend beschriebenen AAV Vektoren beinhalten, müssen befähigt werden AAV Helferfunktionen auszuüben, um replizieren und die Expressionskassette enkapsieren zu können, die durch die AAV ITRs flankiert werden, um rekombinante AAV Partikel zu bilden. AAV Helferfunktionen sind im Allgemeinen AAV-abgeleitete kodierende Sequenzen, die exprimiert werden können, um AAV Genprodukte bereitzustellen, die wiederum für eine produktive AAV Replikation in trans funktionieren. AAV Helferfunktionen werden hierin verwendet, um notwendige AAV Funktionen, die auf den AAV Vektoren fehlen, zu ergänzen. Daher umfassen die AAV Helferfunktionen einen oder beide der hauptsächlichen offenen Leserahmen (ORFs) von AAV, namentlich die rep und die cap kodierenden Regionen oder funktionelle Homologe hiervon.
Die AAV rep kodierende Region des AAV Genoms, kodiert die Replikationsproteine Rep 78, Rep 68, Rep 52 und Rep 40. Es wurde festgestellt, dass diese Rep Expressionsprodukte viele Funktionen besitzen, einschließlich Erkennung, Bindung und Brechen bzw. Nicking des AAV Ursprungs der DNA Replikation, DNA Helikaseaktivität und Modulation einer Transkription von AAV (oder anderen exogenen) Promotoren. Die Rep Expressionsprodukte werden gemeinsam für ein Replizieren des AAV Genoms erfordert. Die AAV cap kodierende Region des AAV Genoms, kodiert die Kapsidproteine VP1, VP2 und VP3 oder funktionelle Homologe hiervon. AAV Helferfunktionen können durch Transfizieren der Wirtszelle mit einem AAV Helferkonstrukt, entweder vor oder gleichzeitig mit der Transfektion des AAV Vektors, der die Expressionskassette enthält, in die Wirtszelle eingefügt werden, wobei die AAV Helferkonstrukte somit verwendet werden, um mindestens eine vorübergehende Expression von AAV rep und/oder cap Genen bereitzustellen, um die fehlenden AAV Funktionen, die für eine produktive AAV Infektion notwendig sind, zu ergänzen. AAV Helferkonstrukten fehlen AAV ITRs und können sich weder selbst replizieren noch verpacken. Diese Konstrukte können in der Form eines Plasmids, Phagen, Transposons, Cosmids, Virus oder Viruspartikels vorliegen. Es wurde eine Anzahl von AAV Helferkonstrukten beschrieben, wie beispielsweise die allgemein verwendeten Plasmide pAAV/Ad und plM29 + 45, die die beiden Rep und Cap Expressionsprodukte kodieren. (Siehe bspw. Samulski et al. (189) J. Virol. 63: 3822–3828; und McCarty et al. (1991) J. Virol. 65: 2936–2945). Eine Anzahl anderer Vektoren wurde beschrieben, die die Rep und/oder Cap Expressionsprodukte kodieren. Siehe bspw. US Pat. No. 5,139,941.
Als Folge der Infektion der Wirtszelle mit einem Helfervirus, werden die AAV Rep und/oder Cap Proteine hergestellt. Die Rep Proteine dienen ebenfalls dem AAV Genom zum Verdoppeln. Die exprimierten Cap Proteine ordnen sich zu Kapsiden und das AAV Genom wird in den Kapsiden verpackt. Dies führt dazu, dass die AAV in rekombinante AAV Partikel verpackt werden, die die Expressionskassette enthalten. Anschließend an die rekombinante AAV Replikation können die AAV Partikel von der Wirtszelle unter Verwendung verschiedener gewöhnlicher Aufreinigungsverfahren, wie beispielsweise CsCl Gradienten, gereinigt werden. Die sich ergebenden AAV Partikel stehen dann zur Verwendung bei einer Genzufuhr an verschiedene Zelltypen bereit.
Alternativ kann ein Vektor der Erfindung ein anderes Virus als das adeno-assoziierte Virus oder ein Abschnitt hiervon sein, der eine Expression eines Nukleinsäuremoleküls, das in die virale Nukleinsäure eingefügt wird, gestattet. Beispielsweise können replikationsdefekte Retroviren, Adenoviren und Lentivirus verwendet werden. Vorschriften zum Herstellen rekombinanter Retroviren und Infizieren von Zellen in vitro oder in vivo mit derartigen Viren können in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (eds) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10–9.14 und anderen Standard Laborhandbüchern gefunden werden. Beispiele geeigneter Retroviren umfassen pLJ, pZIP, pWE und pEM, die dem Fachmann gut bekannt sind. Beispiele geeigneter verpackender Viruslinien umfassen Crip, Cre, 2 und Am. Das Adenovirusgenom kann derart manipuliert werden, dass es die Proteine von Interesse kodiert und exprimiert, aber in dem Sinne seiner Fähigkeit in einem normalen lytischen Viruslebenszyklus zu replizieren inaktiviert ist. Siehe bspw. Berker et al. (1988) Bio Techniques 6: 616; Rosenfeld et al. (1991) Science 252: 431–434; and Rosenfeld et al. (1992) Cell 68: 143–155. Geeignete adenovirale Vektoren, die von dem Adenovirusstamm Ad Typ 5 d1324 oder anderen Adenovirusstämmen (bspw. Ad2, Ad3, Ad7 etc.) stammen sind dem Fachmann gut bekannt.
Alternativ kann der Vektor unter Verwendung eines nicht-viralen Zufuhrsystems zugeführt werden. Dies umfasst eine Zufuhr des Vektors zu dem erwünschten Gewebe ein in einem kolloidalen Dispersionssystem, das beispielsweise makromolekulare Komplexe, Nanokapseln, Mikrokügelchen, Kügelchen und Lipid-basierte Systeme einschließlich Öl-in Wasser Emulsionen, Mizellen, gemischte Mizellen und Liposomen umfasst.
Liposomen sind künstliche Membranvesikel, die in vitro und in vivo als Liefer- bzw. Zufuhrvehikel nützlich sind. Um ein wirksames Gentransfervehikel zu sein sollte ein Liposom folgende Eigenschaften aufweisen: (1) Verkapselung des genetischen Materials mit hohem Wirkungsgrad während die biologische Aktivität nicht beeinträchtigt wird; (2) bevorzugtes und wesentliches Binden an eine Targetzelle verglichen mit einer Nicht-Targetzelle; (3) Zufuhr bzw. Auslieferung des wässrigen Inhalts des Vesikels an das Targetzellzytoplasma mit hohem Wirkungsgrad; und (4) genaue und wirksame Expression einer genetischen Information (Mannino et al. (1988) Biotechniques 6: 682). Beispiele geeigneter Lipide zur Herstellung von Liposomen umfassen Phosphatidylverbindungen, wie beispielsweise Phosphatidylglycerol, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Sphingolipide, Cerebroside und Ganglioside. Zusätzliche Beispiele von Lipiden umfassen, sind aber nicht darauf begrenzt, Polylysin, Protamin, Sulfat und 3b-[N-(N',N'-dimethylaminoethan)carbamoyl]Cholesterol.
Alternativ kann der Vektor zur Auslieferung mit einem Träger gekoppelt sein. Beispielhafte und bevorzugte Träger sind Keyhole limpet Hämocyanin (KLH) und humanes Serumalbumin. Andere Träger können verschiedene Lymphokine und Adjuvantien, wie beispielsweise INF, IL-2, IL-4, IL-8 und andere umfassen. Mittel, um ein Peptid an ein Trägerprotein zu konjugieren, sind im Stand der Technik gut bekannt und umfassen Glutaraldehyd, m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester, Carbodiimid und bis-Biazotized Benzidin. Der Vektor kann durch gentechnische Verfahren, die im Stand der Technik gut bekannt sind, an einen Träger konjugiert werden. (Siehe bspw. US 4,608,251 ; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; 4,578,770).
In einer Ausführungsform, kann eine Partikel vermittelte Übergabe unter Verwendung einer Genkanone als ein Verfahren verwendet werden, um den Vektor zuzuführen. Geeignete Partikel für eine Genkanonen basierende Übergabe umfassen Goldpartikel. In einer Ausführungsform kann der Vektor als nackte DNA ausgeliefert werden. Eine Genkanonen basierende Auslieferung wird beispielsweise bei Braun et al. (1999) Virology 265: 46–56; Drew et al. (1999) Vaccine 18: 692–702; Degano et al. (1999) Vaccine 18: 623–632 und Robinson (1999) Int J Mol Med 4: 549–555; Lai et al. (1998) Crit. Rev Immunol 18: 449–84, beschrieben; siehe bspw. Accede et al. (1991) Nature 332: 815–818; und Wolff et al. (1990) Science 247: 1465–1468; Murashatsu et al. (1998) Int. J. Mol. Med. 1: 55–62; Agracetus et al. (1996) J. Biotechnol. 26: 37–42; Johnson et al. (1993) Genet Eng. 15: 225–236). Ebenfalls innerhalb des Umfangs der Erfindung liegt die Auslieferung des Vektors in einer oder mehreren Kombinationen der vorstehend aufgeführten Zuführverfahren.
IV. Auslieferungssysteme
Auslieferungssysteme umfassen Verfahren einer in vitro, in vivo und ex vivo Auslieferung des Vektors. Für eine in vivo Auslieferung kann der Vektor einer Subjekt mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht werden. Der hierin verwendete Begriff "pharmazeutisch verträglicher Träger", bezieht sich auf irgendeinen physiologisch verträglichen Träger für eine in vivo Gabe des erfindungsgemäßen Vektors. Derartige Träger induzieren keine Immunantwort, die für das die Zusammensetzung empfangende Individuum schädlich ist und werden in Abschnitt V ausgeführt. In einer Ausführungsform kann der Vektor durch Injizieren des Vektors in den Liquor cerebrospinalis bzw. Gehirn-Rückenmark-Flüssigkeit, bspw. durch Lumbalpunktion (siehe bspw. Kapadia et al. (1996) Neurosurg 10: 585–587) über eine weite Region des ZNS verteilt werden.
Alternativ kann eine genaue Auslieferung des Vektors an spezifische Stellen des Gehirns unter Verwendung stereotaktischer Mikroinjektionstechniken ausgeführt werden. Beispielsweise kann die zu behandelnde Subjekt in eine stereotaktische Rahmenbasis (MRI kompatibel) gelegt werden und dann unter Verwendung hoch auflösender MRI abgebildet zu werden, um das dreidimensionale Positionieren der zu behandelnden besonderen Region zu bestimmen. Die MRI-Bilder können dann zu einem Computer übertragen werden, der die geeignete stereotaktische Software aufweist und eine Anzahl von Bildern wird dazu verwendet, um eine Targetstelle und eine Bahn bzw. Trajektorie für die Antikörpermikroinjektion zu bestimmen. Die Software übersetzt die Bahn in dreidimensionale Koordinaten, die für den stereotaktischen Rahmen genau eingetragen werden. In dem Fall einer intracranialen Auslieferung wird der Schädel bloßgelegt, Bohrlöcher werden über der Eintrittsstelle gebohrt und die stereotaktische Vorrichtung wird verwendet, um die Nadel zu positionieren und eine Implantation bei einer bestimmten Tiefe sicherzustellen. Der Vektor kann Regionen zugeführt werden, wie beispielsweise Zellen des Rückenmarks, Hirnstamms, (Medulla, Pons und Mittelhirn), Cerebellum, Diencephalon (Thalamus, Hypothalamus), Telencephalon (Corpus Striatum, cerebraler Cortex oder innerhalb des Cortex, Okzipital-, Temporal-, Parietal- oder Frontallappen) oder Kombinationen hiervon. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird der Vektor unter Verwendung anderer Auslieferungsverfahren, die für eine lokalisierte Auslieferung geeignet sind, ausgeliefert, wie beispielsweise eine lokalisierte Permeation der Blut-Hirn-Schranke. Besonders bevorzugte Auslieferungsverfahren sind solche, die den Vektor an Regionen des Gehirns ausliefern, die eine Modifikation erfordern. Eine Modifikation wie sie hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Änderung in der zellulären Aktivität in der mit dem Vektor injizierten Hirnregion. Die Änderung in der zellulären Aktivität kann von einer Änderung der Expression oder einer Produktion von für ein Stimulieren einer Zelle verantwortlichen Genen ausgehen. Beispielhaft ist die Auslieferung eines Vektors der eine GAD kodierende Nukleotidsequenz umfasst an eine überstimulierte Hirnregion, wie beispielsweise die Basalganglien. Insbesondere wird eine Auslieferung des Vektors an die STN, die bei Krankheiten wie beispielsweise Parkinson überaktiv ist, zu einer Expression von GAD in dieser Region führen. Obwohl es nicht erforderlich ist eine Wirkungsmechanismus bereitzustellen, führt die Expression von GAD in der STN zur Herstellung von GABA innerhalb der Zellen des STN und die STN-Zellen setzen GABA lokal frei, so dass das freigesetzte GABA an die GABA-A und GABA-B Rezeptoren auf den STN-Zelloberflächen bindet. GABA-Bindung an die GABA Rezeptoren führt zu einer Verringerung in der Zellstimulation, wodurch eine Überaktivität in den STN-Zellen verringert und eine neuronale Zerstörung verhindert wird.
V. Pharmazeutische Zusammensetzungen und pharmazeutische Verabreichung
Der Vektor der Erfindung kann in pharmazeutische Zusammensetzungen, die für eine Verabreichung an eine Subjekt geeignet ist, eingefügt werden. Für gewöhnlich umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung den Vektor der Erfindung und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Wie hierin verwendet, umfasst "pharmazeutisch verträglicher Träger" irgendeinen und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und gegen Pilze gerichtete Mittel, isotonische und eine Absorption verzögernde Mittel, und dergleichen, die physiologisch verträglich sind. Beispielhafte pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen einen oder mehrere von Wasser, Salzlösung, Phosphat gepuffertes Salzlösung, Dextrose, Glycerol, Ethanol und dergleichen, als auch Kombinationen hiervon. In vielen Fällen werden bevorzugt isotonische Mittel, beispielsweise Zucker, Polyalkohole, wie beispielsweise Mannitol, Sorbitol oder Natriumchlorid in die Zusammensetzung aufgenommen. Pharmazeutisch verträgliche Träger können weiter geringe Mengen von Hilfssubstanzen, wie beispielsweise eines Benetzungs- oder Emulgierungsmittel, Konservierungsmittel oder Puffer umfassen, die die Haltbarkeit oder Wirksamkeit des Antikörpers oder Antikörperabschnitts erhöhen.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können in verschiedenen Formen vorliegen. Diese umfassen beispielsweise flüssige, halbfeste und feste Verabreichungsformen bzw. Dosierungsformen, wie beispielsweise Flüssiglösungen (bspw. injizierbare und infundierbare Lösungen), Dispersionen oder Suspensionen, Tabletten, Pillen, Pulver, Liposomen und Zäpfchen. Die bevorzugte Form ist abhängig von der beabsichtigten Art einer Verabreichung und therapeutischen Anwendung. Gewöhnlich bevorzugte Zusammensetzungen liegen in der Form injizierbarer oder infundierbarer Lösungen vor, wie beispielsweise Zusammensetzungen, die denen ähnlich sind, die zur passiven Immunisierung von Menschen verwendet werden. Die bevorzugte Art einer Verabreichung ist parenteral (bspw. intravenös, subcutan, intraperitoneal, intramuskulär). In einer Ausführungsform wird der Vektor durch intravenöse Infusion oder Injektion verabreicht. In einer anderen Ausführungsform wird der Vektor durch intramuskuläre oder subkutane Injektion verabreicht. In einer anderen Ausführungsform wird der Vektor peroral verabreicht. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform wird der Vektor unter Verwendung einer Stereotaxiszufuhr an einen spezifischen Ort ausgeliefert.
Therapeutische Zusammensetzungen müssen gewöhnlich unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung steril und stabil sein. Die Zusammensetzung kann als eine Lösung, Mikroemulsion, Dispersion, Liposom oder eine andere geordnete Struktur formuliert sein, die geeignet ist eine hohe Arzneimittelkonzentration aufzuweisen. Sterile, injizierbare Lösungen können durch Einfügen der aktiven Verbindung (d.h. Antigen, Antikörper oder Antikörperabschnitt) in der erforderlichen Menge in einem geeigneten Lösungsmittel mit einer oder einer Kombination von vorstehend aufgezählten Bestandteilen, wie erforderlich gefolgt durch Sterilfiltration, hergestellt werden.
Im Allgemeinen werden Dispersionen durch Einfügen der aktiven Verbindung in ein steriles Vehikel hergestellt, das ein basisches Dispersionsmedium und die anderen vorstehend aufgezählten erforderlichen Bestandteile umfasst. In dem Fall steriler, gefriergetrockneter Pulver zur Herstellung steriler injizierbarer Lösungen, bestehen die bevorzugten Verfahren zur Herstellung im Vakuumtrocknen und Sprühtrocknen, die ein Pulver des aktiven Bestandteils plus irgendeines zusätzlichen erwünschten Bestandteils aus der vorher steril gefilterten Lösung gewinnen. Die passende Fließfähigkeit einer Lösung kann beispielsweise durch die Verwendung eines Beschichtungsmittels, wie beispielsweise Lecithin, durch die Erhaltung der erforderlichen Partikelgröße in dem Fall einer Dispersion und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Stoffen, erhalten werden. Eine verlängerte Absorption injizierbarer Zusammensetzungen kann dadurch erreicht werden, dass der Zusammensetzung ein Mittel, das die Absorption verzögert, beispielsweise MonostearatSalzlösunge und Gelatine, beigemischt wird.
Der erfindungsgemäße Vektor kann durch verschiedene im Stand der Technik bekannte Verfahren verabreicht werden. Wie dem Fachmann klar sein wird, wird die Route und/oder die Art einer Verabreichung abhängig von den erwünschten Ergebnissen variieren. In bestimmten Ausführungsformen kann die aktive Verbindung mit einem Träger hergestellt werden, der die Verbindung gegen schnelle Freisetzung schützt, wie beispielsweise eine gesteuerte Freisetzungsformulierung, die Implantate, transdermale Pflaster und mikroverkapselte Auslieferungssysteme einschließt. Biologisch abbaubare biologisch verträgliche Polymere, wie beispielsweise Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglycolsäure, Collagen, Polyorthoester und Polylactatsäure können verwendet werden. Viele Verfahren zur Herstellung derartiger Formulierungen sind patentiert oder dem Fachmann allgemein bekannt. Siehe bspw. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können eine "therapeutisch wirksame Menge" oder eine "prophylaktisch wirksame Menge" des Vektors der Erfindung umfassen. Eine "therapeutisch wirksame Menge" bezieht sich auf eine wirksame Menge, die bei Dosierungen und für notwendige Zeitperioden zu dem erwünschten therapeutischen Erfolg führt. Eine therapeutisch wirksame Menge des Vektors kann wegen entsprechender Faktoren, wie beispielsweise dem Krankheitszustand, Alter, Geschlecht und Gewicht des Individuums und die Fähigkeit des Vektors eine erwünschte Antwort in dem Individuum hervorzurufen, variieren. Eine therapeutisch wirksame Menge ist ebenso eine, bei der irgendwelche toxischen oder schädlichen Wirkungen des Vektors durch die therapeutisch vorteilhaften Wirkungen übertroffen werden. Eine prophylaktisch wirksame Menge bezieht sich auf eine wirksame Menge, die bei Dosierungen und für notwendige Zeitperioden zu dem erwünschten prophylaktischen Erfolg führt. Gewöhnlich wird, da eine prophylaktische Dosis bei Subjekten vor oder bei einer/einem früheren Stufe/Stadium einer Erkrankung verwendet wird, die prophylaktisch wirksame Menge geringer als die therapeutisch wirksame Menge ausfallen.
Dosierungsregime können dazu angepasst werden, um die optimal erwünschte Antwort (bspw. therapeutische oder prophylaktische Antwort) bereitzustellen. Beispielsweise kann angezeigt durch die Notwendigkeiten der therapeutischen Situation ein einziger Bolus verabreicht, einige aufgeteilte Dosen können über eine Zeit oder die Dosis kann verhältnismäßig verringert oder erhöht werden. Es ist insbesondere vorteilhaft parenteral zu verabreichende Zusammensetzungen in einer Dosierungseinheitsform zu formulieren, so dass die Verabreichung und Einheitlichkeit der Dosierung erleichtert wird. Eine wie hierin verwendete Dosierungseinheitsform, bezieht sich auf körperlich getrennte Einheiten, die als Einheitsdosierungen für zu behandelnde Säugersubjekte geeignet sind, wobei jede Einheit eine bestimmte Menge einer aktiven Verbindung umfasst, die berechnet wird, um die erwünschte therapeutische Wirkung in Verbindung mit dem erforderlichen pharmazeutischen Träger zu erzeugen. Die Spezifikation der Dosierungseinheitsformen wird vorgeschrieben durch und ist unmittelbar abhängig von (a) den einzigartigen Eigenschaften der aktiven Verbindung und der besonderen zu erreichenden therapeutischen oder prophylaktischen Wirkung und (b) den inhärenten Begrenzungen im Stand der Technik beim Vermischen einer derart aktiven Verbindung zur Behandlung von Empfindlichkeit bei Individuen.
Einem Fachmann werden basierend auf den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung klar werden. Demgemäß wird die Erfindung nicht durch das begrenzt was besonders gezeigt und beschrieben wurde, sondern durch die beigefügten Ansprüche.
Beispiele
Beispiel 1: Verfahren und Materialien
(I) Vektoraufbau
Dieses Beispiel beschreibt den Aufbau eines adeno-assoziierten Virusvektors mit einer GAD cDNA. Eine menschliche Volllängen GAD-65 cDNA wurde unter der Kontrolle eines 5' von der GAD cDNA gelegenen 1,8 Kb Ratten NSE (neuronenspezifische Enolase) Promotors (Foress-Petter et al. (1986) J. Neurosci. Res. 16, 141–156 (1998), gefolgt durch das Woodchuck Hepatitis post-transkriptionelle Regulationselement (WPRE) und einer zwischen den AAV invertierten terminalen Wiederholungen gelegenen Rinderwachstumshormon (BGH) Polyadenylierungsstelle, wie vorhergehend beschrieben (During et al. (1998) Nature Med. 4: 1131–1135), subkloniert. Das sich ergebende Plasmid wird als pAAV-NSE-GAD-WPRE bezeichnet.
Die Plasmide wurden verpackt, um unter Verwendung eines optimierten Protokolls, das auf dem ursprünglichen durch Samulski et al. ((1989) J. Virol. 63: 3822–3828) beschriebenen Helfer-freien transienten Transfektionsverfahren basiert, aber unter Verwendung eines, wie durch Grimm et al. ((1999) Hum Gene Ther 10, 2445–2450) beschriebenen, verbesserten 4 rd Generationenhelferplasmids, pDG modifiziert wurde, hohe Titer von rAAV-GAD Viruspartikeln zu erzeugen. Das Helferplasmid enthält sowohl die Rep als auch die Cap offenen Leserahmen, als auch den Minimalsatz, von für die Helferfunktionen notwendigen, adenoviralen Gene. Die Vektoren wurden unter Verwendung einer Calciumphosphat-Transfektion von beiden Plasmiden in 293 Zellen erzeugt. Vektorstämme wurden unter Verwendung von Ammoniumsulfat, gefolgt durch doppeltes Cäsium bandieren (double cesium banding) gereinigt. Diese Banden, die das Viruspartikel enthielten, wurden aus der Cäsiumchloridpräparation isoliert und in einem geeigneten Puffer dialysiert.
Partikeltiter wurden unter Verwendung eines im Handel erhältlichen (Progen, Inc.) ELISA Testkits festgestellt, der einen intakte Partikel erkennenden A20 monoklonalen Antikörper verwendet. Aufreinigung der Viruspartikel wurde, wie durch Clark et al. ((1999) Hum. Gene. Ther. 10: 1031–1039 und Zolutkhin et al. (1999) Gene Therapy 9: 973–985) beschrieben, ausgeführt.
(II) Verpackungsprotokoll
Um die rekombinanten Vektoren zu verpacken wurden menschliche embryonale Nierenzellen, 293 Zellen (von American Type Culture Collection (ATCC #CRL-1573)) aus Passage 4–12 verwendet. Die 293 Nierenzellen (1,5 × 10⁷ Zellen) wurden in vierzig 15 cm Platten in komplettem DMEM (Gibco) ausgesät, das 10% fetales Rinderserum (Hyclone), 0,1 mM MEM nicht-essentielle Aminosäurelösung (Gibco), 1 mM MEM Natriumpyruvat (Gibco), 0,05% Penicillin-Streptomycin (5.000 Einheiten/ml, Gibco) enthält und wurden über Nacht bei 37°C inkubiert. Waren die Zellen 70% konfluent und 2–3 Stunden vor einer Transfektion, dann wurden die Zellen mit frischem Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM, Gibco), das 10% fetales Rinderserum (Hyclone) ohne Antibiotika enthält, gefüttert.
Alle Plasmide wurde durch das Alkalilyseverfahren (Sambrook et al. supra) aus den Zellen isoliert und wurden durch HPLC (BioCAD, Sprint, PerSeptive Biosystems) weiter aufgereinigt und durch 2 Volumen 100% Ethanol (AR Grad, BDH) angereichert. Alle zur Reinigung verwendeten HPLC Elutionspuffer (Puffer A: 250 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH-Wert 8.0; Puffer B: 25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 2 M NaCl, pH 8.0; Puffer C: Milli Q Wasser) wurden autoklaviert und vor einer Verwendung mit einem Filter sterilisiert. Für jede 15 cm Gewebekulturplatte wurden insgesamt 60 μg Plasmid DNA in 3,0 ml einer 0,25 M CaCl₂ Lösung gelöst und schnell mit 3,0 ml eines HEPES gepufferten Salzlösung (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na₂HPO₄ [pH 7.05–7.10] gemischt, für 2 Min. inkubiert und dann zu den Zellen gegeben. Das Medium wurde 6–8 Stunden nach Transfektion abgesaugt und die Zellen wurden mit IMDM, das mit 10% fetalem Rinderserum ohne Antibiotika ergänzt war, gewaschen. Das Waschmedium wurde abgesaugt und durch frisches IMDM (Gibco), das 10% fetales Rinderserum und Spuren von Pen./Strep. enthält, ersetzt. Die Zellen wurden 48 Stunden nach der Transfektion geerntet. Nach Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge wurden die Zellpellets in 20 ml von Opti-MEM (Gibco) resuspendiert und einer Ultraschallbehandlung unter Verwendung von 15–20% Energie für 50 Puls von 1 Min. Dauer ausgesetzt. Die Zelltrümmer wurde durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit entfernt. Der geklärte Überstand wurde in einem 50 ml Polypropylenröhrchen gesammelt, wobei die Zellpellets für eine Reextraktion in 20 ml Opti-MEM resuspendiert wurden. Die Überstände wurde zusammengeführt.
Ein Drittel Volumen eisgekühlten, gesättigten (NH₄)₂SO₄ wurde dem Überstand zugegeben, gemischt und für 10 Minuten in Eis gestellt. Die Probe wurde dann bei 8.000 Upm bei 4°C für 10 Min. zentrifugiert, der Überstand wurde auf ein Polypropylenröhrchen übertragen, 2/3 Volumen des ursprünglichen Lysats einer gesättigten (NH₄)₂SO₄ Lösung wurden zugegeben und gut gemischt, dann für 20 Min. auf Eis gestellt bevor bei 12.000 Upm für 20 Min. bei 4°C zentrifugiert wurde. Das Pellet wurde wieder in einer CsCl-Phosphat gepuffertem Salzlösung (PBS) (pH 7.4) Lösung (Dichte 1,37 g/L) gelöst und in einem Beckman SW41 Rotor bei 80.000 Upm (für 24 Stunden mit einem 0,5 ml CsCl-PBS-Polster (Dichte 1,5 g/L) zentrifugiert.
Die Bande, die das rekombinante AAV Partikel (rAAV) enthält wurde gesammelt und wie vorstehend beschrieben für weiter 24 Stunden zentrifugiert. Anschließend an die zweite CsCl-Zentrifugation wurde die rAAV Bande schließlich gesammelt und gegen einen Liter sterilen, 50 mM NaCl, 5 mM Tris-HCl und 0,5 mM MgCl₂ (pH 7.4) enthaltenden Dialysepuffers für anfänglich 4 Stunden dialysiert. Die Dialyse wurde unter Verwendung von einem Liter frischen, kalten, sterilen Dialysepuffers für weitere 4 Stunden wiederholt und schließlich unter Verwendung einer Dialysemembran (Spectrapor) mit einem Rückhaltevermögen bei einem Molekulargewicht von 50.000 und frischem sterilem Dialysepuffer über Nacht dialysiert. Der AAV Viruspartikeltiter wurde unter Verwendung eines durch Wistuba et al. ((1997) J. Virol. 71: 1341–1352) beschriebenen ELISA Verfahrens festgestellt. In Kürze wird ein für AAV zusammengesetzte Kapside spezifischer monoklonalen Antikörper auf Mikrotiterstreifen beschichtet und verwendet, um AAV-Partikel einzufangen. Ein Biotin konjugierter monoklonaler Antikörper, der gegen AAV gerichtet ist, wird an den Immunkomplex gebunden, wobei ein Strepavidin-Peroxidasekonjugat mit den Biotinmolekülen reagiert. Zugabe einer Substratlösung führt zu einer Farbreaktion, die proportional zu den spezifisch gebundenen Viruspartikeln ist und die quantitative Bestimmung eines unbekannten Partikeltiters gestattet.
Der Viruspartikeltiter wurde ebenso durch den AAV-Titrations ELISA Kit, der von Progen (Germany) bereitgestellt wird, festgestellt. Einhundert Mikroliter eines gebrauchsfertigen Waschpuffers, einer Positiv-, Negativkontrollen und Verdünnungen eines Standards und von Proben wurden in entsprechende Vertiefungen bzw. Löcher der Mikrotiterstreifen pipettiert, die mit einer Klebefolie verschlossen wurden. Nach einer Inkubation für 1 Stunde bei 37°C, wurde die Lösung entfernt und jede Vertiefung wurde 3 Mal mit 200 μl Waschpuffer für 30 Sekunden gespült. Der Waschpuffer wurde entfernt und 100 μl gebrauchsfertigen Biotinkonjugats wurde zugegeben. Die Streifen wurden mit Klebefolie verschlossen und für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Streifen wurden wie vorstehend beschrieben gewaschen. Ein Volumen von 100 μl gebrauchsfertigen Streptavidinkonjugats wurde zugegeben und die Streifen wurden mit Klebefolie verschlossen und für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Waschschritte wurden dann wie vorstehend beschrieben wiederholt. Ein Volumen von 100 μl Substrat wurde in jede Vertiefung pipettiert und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μl Stopplösung in jede Vertiefung gestoppt. Die Absorption von jeder Vertiefung wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm photometrisch erfasst.
(III) Bestimmung von AAV-Partikel zu transduzierendem Einheitenverhältnis
Um das transduzierende Einheitenverhältnis der AAV-Partikel zu bestimmen, werden 293 Zellen mit einer Zellzahl von 5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung auf einer mit Collagen beschichteten Platte mit 24 Vertiefungen ausgesät. Die Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle Medium (DMEM, Gibco), das 10% fetales Rinderserum (Hyclone), 0,1 mM MEM nicht-essentielle Aminosäurelösung (Gibco), 1 mM MEM Natriumpyruvat (Gibco), 0,05% Penicillin-Streptomycin (5.000 Einheiten/ml, Gibco) enthält, bei 5% CO₂ und 37°C über Nacht gezüchtet. AAV/gfap-TH Virus wurde mit einem Volumen von 0,5 ml zu jeder Vertiefung zugegeben und für 48 Stunden inkubiert.
Um primäre Neuronen und Glia der Ratte bereitzustellen, wurden E15 Ratten für eine Nigra und Cortex Präparation verwendet, während E18 Ratten für eine Präparation von primären Zellen des Hippocampus und des Striatums verwendet wurden. Die Primärkulturen wurden mit 250.000 Zellen pro Loch in Poly-1-Lysin behandelte 24 Lochplatten pipettiert und bei 5% CO₂, 37°C für 24–48 Stunden inkubiert. Anschließend an die Inkubation, wurde Medium B, das 15% FCS, 0,6% Glucose, 100 E/100 μg pro ml Pen/Strep in DMEM/F12 enthält, zu den Kulturen zugegeben und die Kulturen inkubiert. Nach 3 Tagen Inkubation wurden 0,5 ml AAV-Virus auf die Cortexkulturen gegeben. Nach 4–5 Tagen Inkubation wurden 0,5 ml AAV/gfpa-TH Virus auf Nigra-, Hippocampus- und Striatumkulturen gegeben. Das gesamte Medium wurde ein Tag vor der Viruszugabe durch frisches Kulturmedium ersetzt und die Kulturen wurden bei 5% CO₂, bei 37°C für 3 Tage inkubiert. Die Zellen wurden dann mit 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7.4) für 15 Min. fixiert und mit Triton × 100 enthaltendem Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. TH-Antikörper (Verdünnung 1:500, Boehringer Mannheim) wurden verwendet, um die gesamte TH-Menge zu bestimmen, während Hämogglutin bzw. Hämagglutinin (HA) Antikörper (Verdünnung 1:500, Berkley Antibody Company) verwendet wurden, um die exogene TH Immunreaktivität zu bestätigen. Es wurde die Anzahl positiver Zellen gezählt.
Beispiel 2: In vitro Transduktion der AAVGAD Vektoren
Die GAD-65 und GAD-67 Vektoren wurden in primäre Neuronenkulturen aus dem Nucleus subthalamicus transduziert. Die 1 zeigt ein Bild von Zellen, die in transienten Tranfektionsexperimenten mit GAD-67 exprimierenden (obere zwei Felder) AAV Vektoren mit einer MOI von 10 (Infektionsmultiplizität) infiziert wurden. Die Antikörper wurden unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Antikörpers zum immuncytochemischen Nachweis nachgewiesen. Ein ähnliches Experiment wurde unter Verwendung von GAD-65 exprimierenden AAV-Vektoren mit einer MOI von 10 (mittlere zwei Felder) ausgeführt und unter Verwendung eines für GAD-65 spezifischen Antikörpers nachgewiesen. Diese Daten zeigen eine erfolgreiche Transduktion von Vektoren und eine erfolgreiche in vitro Expression der Vektoren in primären Neuronenkulturen aus dem Nucleus subthalamicus.
Beispiel 3: Zusätzliche Vektorkonstrukte und Materialien
Andere AAV Plasmidkonstrukte, die verwendet werden können, umfassen solche, die verschiedene Enhancer und Promotoren enthalten. Beispielhaft ist ein AAV Plasmidkonstrukt für GAD65 mit einem 1,1 Kb Zytomegalie-Virus Enhancer/Hühnchen-Aktin (CBA) Hybridpromotor, 1760 Basenpaaren (Bp) einer menschlichen GAD65 cDNA (Genbank Accession Number M81882), 647 Bp Woodchuck Hepadnavirus posttranskriptionellem Regulationselement (WPRE), 269 BP Rinderwachstumshormon Polyadenylierungssequenz (BGH-PolyA) flankiert von 145 Bp AAV invertierter terminaler Wiederholungen (ITRs). Dieses Konstrukt wird als pAM/CBA-hGAD65-WPRE-BGHpolyA bezeichnet.
Ein anderes AAV Plasmidkonstrukt für GAD67 ist eines mit einem 1,1 Kb CBA Promotor, 1780 Bp menschlicher GAD67 cDNA (Genbank Accession Number M81883), 647 Bp WPRE, 269 Bp BGH-PolyA, flankiert durch 145 Bp AAV ITRs. Dieses Konstrukt wird als pAM/CBA-hGAD67-WPRE-BGH-PolyA bezeichnet.
Die vorteilhafte Verwendung von CBA wurde durch Xu et al. vorgeführt, der zeigte, dass ein AAV Vektor mit einem CBA Promotor nach einer Pfortaderinjektion verglichen mit einem AAV Vektor mit einem EF1alpha Promotor zu einer 9,5-fach höheren Expression führt, und einer 137-fach höheren Expression verglichen mit einem AAV Vektor mit einem CMV Promotor/Enhancer (Xu et al. (2001) Hum Gene Ther. 12: 563–573).
Die Konstrukte enthalten ebenso ein 647 Bp Woodchuck Hepadnavirus postregulatorisches Element (WPRE), das sich von der 3' Region des viralen S Transkripts ableitet und unmittelbar stromabwärts der menschlichen GAD Gene liegt. WPRE scheint für eine hochgradige Expression nativer mRNA Transkripte wichtig zu sein, wobei es wirkfähig mRNA Bearbeitung und Transport Intron-freier Gene (Donello et al. (1998) J. Virol. 72: 5085–92) erhöht.
Die in den Konstrukten verwendete Rinderwachstumshormon-Polyadenylierungs (BGH-PolyA) Sequenz steuert höhere Expression als andere PolyA Sequenzen, wie beispielsweise SV40 early PolyA und menschliches Collagen-PolyA, und wurde somit eingebaut, um die Expression (Pfarr et al. (1986) DNA 5: 115–122) zu erhöhen.
(i) Aufbau eines pAM/CB-hGAD65-WPRE-BGH und eines pAM/CB-hGAD67-WPRE-BGH
Die DNA-Kassette, die in jedes AAV-Viruspartikel verpackt wurde, enthält die AAV invertierten terminalen Widerholungen, die von pSub201 (pSub201), ebenso bekannt als pSSV9, abgeleitet sind. pSub201 wurde zuerst in dem J. Virol. (1987) 61: 3096–3101 durch R. Samulski und Mitarbeiter beschrieben. Dieser Vektor enthält alle der Adeno-assoziierten Virus Typ 2 (AAV-2) Wildtyp kodierenden Regionen und die in ein Plasmidrückgrat klonierten cis-wirkenden, terminalen Wiederholungen. Dieser Vektor ist vorbildlich zum Klonieren und wurde derart konstruiert, dass ein Resriktionsverdau mit Xba I die Entfernung der AAV kodierenden Region gestattet, während die AAV terminalen Wiederholungen in dem Plasmidrückgrat intakt bleiben. Dies ist wichtig, da die terminalen Wiederholungen die einzigen cis-wirkenden Sequenzen darstellen, die für eine rekombinante Virusproduktion erforderlich sind.
Das nicht verpackte Rückgrat des AAV Plasmids (pAM) wurde von dem Plasmid pSV2-gpt (ATCC 37145) abgeleitet. Das Insert enthält das Ampicillinresistenzgen, den E. coli Ori und der SV40 Ori wurde unter Verwendung der EcoRI- und HindIII-Stellen aus dem pSV2-gpt herauskloniert. Das pSub201 Rückgrat wurde gegen das pSV2-gpt Insert ausgetauscht, was die AAV ITRs zurücklässt. Der SV40 Ori wurde angrenzend an die 5' gelegene ITR eingefügt. WPRE-BGH wurde in SacI- und SalI-Stellen eingefügt, was pAM-pL-WPRE-BGH erzeugte. Als nächstes wurde der Neuronen spezifische Enolase (NSE) Promotor (Peel, Zolotukhin et al. 1997) der Ratte, der als ein intermediärer Promotor wirkt, bei der 5' ITR unter Verwendung von Asp718 und HindIII in das rAAV/pL-WPRE-BGH eingefügt. Dieser NSE-Polylinker-WPRE-BGH Klonierungsplasmid, stellte die Basis zum Klonieren von CBA-GAD65-WPRE und CBA-GAD67-WPRE dar.
(ii) PCR um eine GAD65 und GAD67 PCR-Amplifikation zu erhalten und Subklonieren von AAV/CBA-hGAD65-WPRE
pBluescript II SK+ Plasmide, die menschliches GAD65 und GAD67 enthalten, wurden verwendet. Zuerst wurden durch PCR-Amplifikation unter Verwendung der folgenden Primer
hGAD65up (5' ATATATCTCGAGATGGCATCTCGGGGCTC 3') (SEQ ID No: 1)
und
hGAD65lo (5' GCGCGCGAATTCTTATAAATCTTGTCCAAGGCG 3') (SEQ ID No: 2)
das ATG Startcodon und 5' und 3' flankierende Sequenzen entfernt.
Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung einer Expand Polymerase (Roche Molecular Biochemicals) mit den folgenden Zyklusparametern: Zyklus 1: 94°C 5 Min; Zyklen 2–4: 94°C 30 Sek., 50°C 30 Sek., 72°C 2 Min.; Zyklen 5–24: 94°C 30 Sek., 72°C 2 Min.; Zyklus 25: 72°C 5 Min., amplifiziert. Das 1,76 Kb Produkt wurde mit EcoRI und XhoI verdaut und als Zwischenklonierungsschritt in einem EcoRI und XhoI verdauten pBSII KS + subkloniert.
Das 1,76 Kb hGAD65 Insert wurde mit XhoI (glatt) und EcoRI aus dem pBSII Sk+ entfernt und in NotI (glatt) und EcoRI von pAM/NSE-pl-WPRE-bGH eingefügt um pAM/NSE-hGAD65-WPRE bGH zu erzeugen.
Der CMV Enhancer/Hühnchen B-Aktin (CBA) Hybridpromotor wurde aus dem pBACMAM3 (Novagen) mit HgaI (glatt/teilweise) und EcoRI (glatt) entfernt und in Asp718 (glatt) und EcoRI (glatt) verdauten pAM/NSE-hGAD65-WPRE eingefügt, um pAM/CBA-hGAD65-WPRE zu erzeugen.
(iii) PCR Amplifikation und Subklonieren von AAV/CBA-hGAD67-WPRE
Das entsprechende Plasmid, das das hGAD67 (1,78 Kb) enthält, wurde durch PCR Amplifikation von hGAD67 aus pBSII SK+/hGAD67 (2,01 Kb) konstruiert. Die folgenden Primer wurden verwendet:
hGAD67up (5' TATATCTCGAGATGGCGTCTTCGACCCA 3') (SEQ ID No: 3)
und
hGAD67lo (5' CAGCTGAATTCTTACAGATCCTGGCCCAG 3') (SEQ ID No: 4).
Die verwendeten PCR Bedingungen waren zu denen für die hGAD65 Amplifikation (siehe vorstehend) identisch. Das 1,78 Kb PCR Produkt wurde mit XhoI und EcoRI verdaut und in XhoI und EcoRI verdauten pBSII KS+ als Zwischenklonierungsstelle eingefügt. hGAD67 wurde mit XhoI (glatt) und EcoRI aus dem pBSII KS+/hGAD67 entfernt und in BamHI (glatt) und EcoRI von pAM/CBA-hGAD65-WPRE eingefügt, um pAM/CBA-hGAD67-WPRE zu erzeugen.
(iv) Protokoll für eine Vektorproduktion und Reinigung, Zellwachstum
Die 293 Zellen wurden unter Bedingungen kultiviert, um eine Transfektion zu optimieren. (Konfluenz und Medien ausführlich in SOP).
Transfektion
Calciumchlorid wurde in Verbindung mit dem AAV Plasmid (enthält GAD65 und 67) und den Verpackungs-/Helferplasmiden (pRV1 und PfΔ6) verwendet, um 293 Zellen mit beiden Plasmiden zu transfizieren. Dann wurde mit Medium gewaschen.
Ernten der Zellen
Die Zellen wurden in PBS gewaschen, dann wurde Natriumdeoxycholat und Benzonase zugegeben. Natriumdeoxycholat wird verwendet um die Zellmembranen zu lysieren und Benzonase ist eine Endonuklease, um zelluläre DNA und RNA abzubauen (breat-up). Das Gemisch wurde zentrifugiert, um zelluläre Bestandteile/Trümmer zu pelletieren, während die AAV Fraktion im Überstand verbleibt.
Heparinsäulenreinigung
Eine Heparinsäule wurde basierend darauf, dass Heparin ein Ligand für rAAV ist, zur Reinigung von rAAV verwendet. Das eluierte rAAV wurde dann durch Zentrifugation und zweimaliges Dialysieren konzentriert. Das dialysierte rAAV wurde dann durch Filtration weiter gereinigt und schließlich aliquotiert.
Quantitätskonstrolle
Das vorstehend beschriebene rAAV wurde in einem Proteingel aufgetrennt und mit Coomassie-brilliant-Blau gefärbt, um die Reinheit zu beurteilen. Ein Western-Blot wurde mit Anti-VP1, 2 & 3 durchgeführt, um die Anwesenheit der viralen Kapsidproteine (Identitätstest) zu bestätigen.
(v) Genomtitertest für rAAV
Genomisches Titrieren wurde unter Verwendung des Perkin Elmer 7700 quantitativen PCR Verfahrens ausgeführt. Dieses Verfahren gestattet die Quantifizierung einer genomischen Kopienanzahl. Zwei Proben des Vektormaterials wurde in PCR-Puffer (eine 1:50 Verdünnung erzeugt gewöhnlich einen genomischen Titer von 10⁹/ml) verdünnt, wobei dann einer als eine nicht DNase-Kontrolle verwendet wurde. Daraufhin wurden 350 Einheiten DNase I (Boehringer Mannheim) zu einer Probe zugegeben und bei 37°C für 30 Min. inkubiert. Anschließend an die DNase Behandlung wurden zu beiden Proben 10 μg Proteinase K zugegeben und wurden bei 50°C für 1 Stunde inkubiert. Die Proteinase K wurde dann durch Erhitzen auf 95°C für 20 Min. inaktiviert. Eine Verdünnungsreihe wurde dann für beide Proben erstellt. Eine Verdünnungsreihe des die GAD Isoform enthaltenden rAAV Plasmids wurde dann unter Berücksichtigung hergestellt, dass eine lineare Amplifikation innerhalb des Bereichs von 10⁷–10¹² Gesamtkopien pro ml möglich ist. Sowohl Plasmid und Probenverdünnungen wurden weiter 1:4 verdünnt und 5 μl von jedem wurden zu einem getrennten Reaktionsröhrchen gegeben. Eine SYBR Green Probe wurde dann mit der PCR-Reaktion hergestellt. Dreifache Ausfertigungen jeder Probe, ein Standard und eine keine Matrize enthaltende Kontrolle wurden mit einem Gesamtvolumen für jede Reaktion von 25 μl hergestellt. Der ABI Prism 7700 wurde verwendet, um die PCR Reaktion und den Einbau der SYBR-Probe in das PCR-Produkt bei jedem Zyklus nachzuweisen. Eine Standardkurve wurde dann aufgestellt, in dem die Durchschnittswerte für jeden Punkt in dem linearen Bereich der Verdünnungsreihe des Standardplasmids genommen wurden und der Log der Kopienzahl gegen den Durchschnitts C_T-Wert für jeden Punkt graphisch aufgetragen wurde. Eine Anpassung wurde gemacht, um zu berücksichtigen, dass das Genom des rAAV verglichen mit dem doppelsträngigen Standard einzelsträngig ist. Jeder 10 fache Unterschied in der Kopienzahl sollte ungefähr 3 PCR-Zyklen entsprechen. Für weitere Details siehe den Artikel von Clark et al. (1999) Human Gene Therapy 10: 1031–1039. Ein standardisierter genomischer Titer (Dosis) von 1 × 10¹⁰ Genomen pro ml ist für eine Verwendung in einem Patienten ausreichend. Material kann zu der Endformulierung in 1 × PBS verdünnt werden.
(vi) Infektionstitertest für rAAV
Der Infektionstiter ist ein Anzeichen für die Konzentration von rAAV Partikeln, die die Fähigkeit besitzen in eine Zelle einzudringen und ihre DNA-Kassette in das zelluläre Milieu freizusetzen. Dieses Verfahren als ein Zwischenklonierungsschritt liefert unabhängig von dem besonderen Transgen in dem rAAV verlässliche Infektionstiter für verschiedene rAAVs. Eine Replikation erfordert die Anwesenheit eines Helfervirus als auch Wildtyp AAV-Gene, die in den Viruspartikelaufbau und Verpackung einbezogen sind. Daher wurde eine permissive Zelllinie (C12), die die rep und cap Gene aus dem Wildtyp AAV Genom enthält in Kombination mit Konfektion unter Verwendung des Adenovirus 5 verwendet, wodurch die replikative Produktion von rAAVs ermöglicht wird, wenn rAAV zugegeben wird. Quantitative PCR wurde verwendet, um die Quantität von rAAV Genomen nach Zugabe zu C12 Zellen zu beurteilen. Ein Verdünnungsgradient wurde von dem AAV hergestellt. Aliquots von rAAV mit abnehmenden Konzentrationen wurden zu vorher mit Adenovirus 5 tranfizierten C12 Zellen zugegeben. Nach dem Zeit zur Replikation bereitgestellt wurde, wurde quantitative PCR verwendet, um die Zahl von rAAV Genomen zu beurteilen, die bei jeder zu den Zellen zugegebenen Verdünnung von rAAV erzeugt wurde. Zwei Kontrollen wurden in diesem Test verwendet. Der erste Satz von Kontrollen für die PCR Amplifikation der ursprünglichen rAAVs, die zu den Zellen gegeben wurden. Aliquots von dem rAAV Verdünnungsgradienten wurden zu C12 Zellen ohne Adenovirus gegeben. Ohne die Anwesenheit eines Helfervirus ereignet sich keine rAAV Replikation. Die quantitative PCR Technik ist empfindlich genug, um ein PCR-Produkt von den ursprünglich den Zellen zugegebenen rAAV Genomen zu amplifizieren, aber es waren über vier PCR Amplifikationszyklen notwendig, um die gleiche Menge des rAAV Amplicons zu erzeugen, die vorhanden wäre, wenn sich eine Replikation ereignet hätte. Die niedrigste Verdünnung, bei der die Schwellenamplifikation mit mindestens 4 Zyklen früher in den Zellen, die sowohl zugegebenen rAAV als auch Adenovirus aufweisen, erreicht wurde, wurde verwendet, um den Infektionstiter zu berechnen. Die zweite Kontrolle ist die Negativkontrolle, die C12 Zellen ohne Zugabe von entweder rAAV oder Adenovirus verwendet. Lediglich Materialien mit einem Infektionstiter größer als 1 × 109 infektiöser Partikel pro ml werden verwendet werden (Mengenfreisetzungsbeschreibung).
(vii) Ableitung des Verpackungs-/Helferplasmids pRVI
Das pRV1 Plasmid wurde basierend auf zwei AAV Helferplasmiden, pCLR1-1,5k und pCLV1 mit einem in die Rep kodierende Region beziehungsweise VP1 kodierende Region eingefügten Introns, entwickelt (Cao et al. (2000) J. Virol. 74: 11456–63). Das 850 Bp umfassende menschliche β-Globinntron 2 wurde durch PCR von menschlicher genomischer DNA unter Verwendung von Primern:
INS1 (5' Gtt ttg gga cgt ttc ctg agt cag gtg agt cta tgg gac cct tga tg 3') (SEQ ID No. 5)
und
INA2 (5' cag ttt ttc gcg aat ctg tgg gag gaa gat aag agg tat g 3') (SEQ ID No. 6)
amplifiziert.
Ein AAV Fragment wurde mit den Primern:
VS1 (5' ccg tgg ccg aga agc tgc agc gcg act ttc 3') (SEQ ID No: 7)
und
INA1 (5' cat caa ggg tcc cat aga ctc acc tga ctc agg aaa cgt ccc aaa ac 3') (SEQ ID No: 8)
amplifiziert.
Das Intron Fragment und AAV Fragment wurden durch PCR Amplifikation unter Verwendung der Primer VS1 und INA2 verbunden. Das sich ergebende Fragment wurde mit SfiI und NruI verdaut und in die gleichen Stellen in pSub201 kloniert, um p1AAV zu erhalten. Das sich ergebende Plasmid p1AAV weist das β-Globinintron an der Position 654 auf. Das Helferplasmid pCLR1 wurde durch Einbau der SfiI-NruI Stelle von pIAAV850 in pAd/AAV (Samulski et al. (1999) J. Virol. 63: 3822–8) kloniert. Das 1,5 Kb Lamda DNA Fragment (EcoRI/HindIII Verdau) wurde in die in dem Globinintron befindliche MfeI Stelle in pCLR1 kloniert, um pCLR1-1,5k zu erzeugen.
Das Plasmid pCLV1 wurde durch ein ähnliches Verfahren aufgebaut. Das menschliche β-Globinintron 2 wurde unter Verwendung der Primer:
D2 (5' cca cca cca cca aag ccc gca ggt gag tct atg gga ccc ttg at 3') (SEQ ID No: 9)
und
D4 (5' cct gct gtc gtc ctt atg ccg ctc tgt ggg agg aag ata aga ggt 3') (SEQ ID No: 10)
amplifiziert.
Ein AVV Fragment wurde von pAAV/Ad mit den Primern:
XF (5' agt ctc tag agt cct gta tta gag gtc acg 3') (SEQ ID No: 11)
und
D2 (5' atc aag ggt ccc ata gac tca cct gcg ggc ttt ggt ggt ggt gg 3') (SEQ ID No: 12)
amplifiziert.
Ein anderes AAV Fragment wurde mit den Primern:
D3 (5' acc tct tat ctt cct ccc aca gag cgg cat aag gac gac agc agg 3') (SEQ ID No: 13)
und
XR (5' cgg gtg acg tag tag tct aga gca tgg aaa 3') (SEQ ID No: 14)
amplifiziert.
Das Intronfragment und 2 AAV Fragmente wurden durch PCR Amplifikation unter Verwendung der Primer XF und XR verbunden. Das sich ergebende Fragment wurde mit XbaI verdaut und an die gleichen Stellen in pAAV/Ad kloniert, um pCLR1 zu erhalten. Das sich ergebende Plasmid pCLR1 weist an der Position 2309 das β-Globinintron auf. Diese Insertionsstellen in pCLR1-1,5k und pCLV1 entsprechen der Position in der RNA für Rep78/68 beziehungsweise VP1. Bei all diesen Insertionen wurden die Consensus-Sequenzen für die Spleißspenderstellen und Akzeptorstellen in den Helferplasmiden beibehalten. Das pRV1 Plasmid wurde durch Ersetzen des XhoI Fragments in pCLR1-1,5k mit dem entsprechenden XhoI Fragment aufgebaut, das das Globinintron in VP1 von pCLV1 enthält. Das pRV1 Plasmid weist ein bei Position 654 eingebautes Intron und das andere bei 2309 auf.
(viii) Ableitung eines Verpackungs-/Helferplasmids pF6
Das Helferplasmid pF6 wurde aus dem Plasmid pBHG10 aufgebaut. Das pBHG10 Plasmid wurde von Microbix (Canada) gekauft. Das Plasmid padF1 wurde durch Klonieren des Asp700/sal I Fragments mit einer PmeI-Sgf I Deletion, die aus pBHG10 isoliert wurde, in pBluescript, aufgebaut. Weitere Deletionen eines 2,3 Kb NruI Fragments und eines 0,5 Kb RsriI/NruI Fragments erzeugten das Helferplasmid pF6.
(viiii) Verpacken der Viruspartikel
Menschliche embryonale 293 Nierenzellen wurden zum Verpacken verwendet. Die 293 Zellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC # CRL-1573) erhalten und exprimieren das transformierende Gen von Adenovirus 5 (E1 Gen). Die 293 Zelllinie ist eine beständige Linie einer primären menschlichen embryonalen Niere, die durch gescherte menschliche Adenovirus Typ 5 (Ad 5) DNA transformiert ist. Die Master Zellbank wurde unter Verwendung von Zellen erzeugt, die durch die Amerikanische Gewebekultur Sammlung (ATCC # CRL-1573) geliefert werden. Wildtyp AAV ist ein Dependovirus, das heißt, dass es für eine normale Replikation die Anwesenheit eines Helfervirus erfordert. Zusätzlich zu den AAV Helferplasmiden pVR1 und pF6 liefern die 293 Zellen die restlichen Helfervirussequenzen, die für eine AAV Kapsidherstellung und ein Genomverpacken notwendig sind.
(x) Transduktion von Neuronen
Targetzellen sind die intrinsischen Neurone des nucleus Subthalamicus (STN). Der Vektor wurde mit einer Dosis von 3,5 × 10⁹ Viruspartikeln in einem Volumen von 35 Mikrolitern (basierend auf dem genomischen Titer von rAAV Materialien von 10¹¹/ml) mit zusätzlichen 15 μl von USP 25% Mannitol als ein Spülmittel verabreicht. Basierend auf der umfassenden Analyse einer Vektorverteilung unter Verwendung von AAV im Nagerhirn, konnte gezeigt werden, dass die besten Transduktionsgrade erhalten werden, wenn rAAV bei niedriger Infusionsrate (< 1,0 μl/Min.) zugeführt wird. Außerdem wird der Vektor mit hoher Effizienz an die Zellen in der unmittelbaren Umgebung des Injektionskanals geliefert, wobei sich ein exponentieller Abfall in der Genexpression ausgehend von der Spitze der Injektionskanüle ergibt. Unter Verwendung von Volumen von 3 Mikrolitern, die 5 × 10⁹ Viruspartikel ausliefern, liegen 80% der transduzierten Zellen innerhalb von 1 mm der Injektionsstelle, mit weniger als 5% der transduzierten Zellen, die weiter als 2 mm von der Injektionsstelle liegen. Bei der Untersuchung unter Verwendung von 351 Volumen des Vektors (12-fach höheres Volumen), aber mit einem ungefähr 15–20-fach geringeren Titer (d.h. ungefähr äquivalente Anzahl von Vektorgenomen zugeführt) war die Genexpression auf ein Volumen von einigen Millimetern begrentzt. Dies würde den Vektor auf den STN, dessen Ausmaße ungefähr 4,8 mm × 5 mm × 6 mm oder ~140 mm begrenzen.
xi Effizienz des Transduktion
Transduktionseffizienzen können in permissiven Zelllinien und permissiven Targetzellen in vivo 100% erreichen, wenn ausreichend MOI verwendet werden. Basierend auf Nagerdaten wird erwartet, dass ein Infektionsvolumen von 35 Mikrolitern mit der absoluten Anzahl von Viruspartikeln von ~3,5 × 10⁹ in einem menschlichen STN, wahrscheinlich von 70–175000 Zellen transduzieren wird. Dies stellt ungefähr 25–60% transduzierter Targetzellen dar.
xii Gentransfer und Expression
Unter Verwendung von Nagerdaten wurden sowohl GAD-65, GAD-67, Kombinationen als auch HA-markiertes GAD-65 und GAD-67 und unter Verwendung von Injektionsvolumina von 2 μl Vektormaterialien von ungefähr 5 × 10¹⁰ genomischen Partikeln pro ml, d.h. einer Gesamtheit von 10⁸ Vektorgenomen, ungefähr 2000 Zellen in dem Nager-STN (50.000 Vektorgenome für 1 transduziertes Neuron) transduziert. Diese Anzahl spiegelt 15% der gesamten STN Neurone (~13.600 in der Ratte (Oorshcot (1996) J Comp Neurol. 366: 580– 99) wieder und ist sowohl ausreichend für eine teilweise Verhaltenserholung bzw. Verhaltensgenesung als auch, wie durch die Daten gezeigt, andeutend für eine Neuroprotektion. Das Verhältnis von Expression zu verabreichter Vektordosis erscheint ziemlich linear zu sein, mit 1 transduzierten Neuron für jede ~50.000 genomischen AAV Partikel. Folglich, um 100.000 transduzierte STN Neurone in dem menschlichen STN zu erhalten, wurde eine Vektordosis von (100.000 Zellen × 50.000 Viruspartikel) oder 5 × 10⁹ Vektorgenomen geschätzt.
Beispiel 4: In vitro Expressionsuntersuchungen mit rAAV-GAD65 und rAAV-GAD67
HEK 293 Zellen wurden vor Zugabe von 5 μl Virus in 100 μl DMEM pro Loch mit einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen/Loch auf einer 24 Lochplatte ausplattiert. Die Zellen wurden achtundvierzig Stunden später für die Immunzytochemie bearbeitet. Die Medien wurden abgesaugt, dann wurden die Zellen mit 1 × PBS gewaschen. 1 ml 4% Paraformaldehyd wurde pro Loch zugegeben und für 15 Minuten (Min.) inkubiert. Nach Absaugen des 4% PFA wurden die Zellen mit 1 × PBS gewaschen, dann kurz in 1% H₂O₂ in Methanol inkubiert. Die Zellen wurden in 1 × PBS gewaschen, dann über Nacht in Immun-Puffer, der die entsprechende Verdünnung des Antikörpers enthält, bei Raumtemperatur inkubiert. (GAD65, Boehringer Mannheim, 1/1000; GAD67, Chemicon, 1/1000). Nach zwei fünfminütigen Waschgängen in 1 × PBS wurden die Zellen in einem Immun-Puffer, der den entsprechenden zweiten Antikörper (GAD65, 2 Maus, 1/500, Sigma; GAD67, 2 Kaninchen, 1/500) enthält für drei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach zwei fünfminütigen Waschgängen in 1 × PBS wurden die Zellen in einem Immun-Puffer, der ExtrAvidin, 1/500, Sigma enthält, für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach zwei fünfminütigen Waschgängen in 1 × PBS wurde das Antigen nachgewiesen, für fünf Minuten mit Diaminobenzidin, wobei eine braune Farbänderung die Anwesenheit positiver Zellen anzeigt.
Ergebnisse
Die Ergebnisse zeigten, dass eine GAD65/GAD67 Expression nach Plasmidtransfektion und Virustransduktion von HEK 293 Zellen nachgewiesen wurde. Es wurde kein GAD65 oder GAD67 in nicht-transfizierten oder nicht-transduzierten Zellen nachgewiesen. 1A und 1D zeigen eine Plasmidtransfektion von HEK 293 Zellen mit 1 μg von rAAV DNA. 1B und 1E zeigen eine rAAV Vektortransduktion von HEK 293 Zellen mit 5 μl rAAV Vektor. 1C und 1F zeigen nicht-transfizierte HEK 293 Zellen.
Beispiel 5: GABA Freisetzung aus primären kultivierten Striatumneuronen, die mit rAAV-GAD Vektoren transduziert sind
Primäre Striatumkulturen wurden aus Tag 15 Embryonen hergestellt und für Striatumkultur auf Poly-I-Lysin beschichtete Löcher einer 24 Lochplatte in einer Dichte von 2,5 × 10⁵ ausplattiert und 48 Stunden später wurden 21 die folgenden Viren jedem Loch in dreifacher Ausfertigung zugegeben:
AAV/CB-hGAD65-WPRE
AAV/CB-hGAD67-WPRE
AAV/CB-EGFP-WPRE (Kontrollvirus).
Zehn Tage später wurden die Zellen fünf Mal in PBS gewaschen und dann für 5 Min. in 200 μl aCSF (erstes Waschen) inkubiert. Dieses wurde gesammelt und dann wurden die Zellen in 200 μl aCSF + 56 mM KCl für 10 Min. bei 37°C (hoch K+) inkubiert. Eine HPLC wurde durchgeführt, um die Menge freigesetzten GABAs festzustellen.
Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl die GAD67 als auch GAD65 Expression verglichen mit der GFP Kontrolle signifikant die basale und K+ induzierte Freisetzung von GABA erhöhten (siehe 2).
Beispiel 6: In-vivo Nageruntersuchungen mit neuroprotektiven und chronischen Verletzungs-Parkinson Krankheit's Modellen
Methoden
a) Tiere
Männliche Sprague-Dawley Ratten (275–325 g) wurden von Charles River erhalten und unter Standardbedingungen mit konstanter Temperatur (22 ± 1°C), Feuchtigkeit (relative, 30%), 12 Stunden Licht-/Dunkelzyklen (Lichtperiode 7 Uhr morgens/7 abends) gehalten. Die Tiere hatten freien Zugang zu Nahrung (Nagernahrung, Labdiet 5001) und Wasser.
b) Chirurgie
Alle operativen Behandlungen wurden unter frisch gemischten Ketamin (67 mg/kg)/Xylazin (6,7 mg/kg)) (i. p.) Injektionen ausgeführt, wobei die Tiere in einem Stereotaxisrahmen der Serie KOPF 900 befestigt waren. Der Schädel wurde freigelegt und ein Loch wurde oberhalb des Bereichs von Interesse gebohrt. Jede intracerebrale Injektion wurde durch stereotaktische Infusion mit einer 26-Gauge rostfreien Stahlnadel mit einer 10 l Hamiltonspritze und einer Mikrospritzenpumpe (World Precision Instruments) ausgeführt.
c) Unilaterale Läsion des Medialen Vorderhirn Strangs (MFB):
Halb-Parkinson Rattenmodelle wurde durch 6-Hydroxydopamin (6-OHDA)-Verletzung des linken MFB erzeugt. Dreißig Minuten vor Verletzung wurde den Tieren Desipramin (10 mg/kg, s.c.) (Sigma) (ein Noradrenalinaufnahmehemmstoff, um eine Schädigung noradrenerger Neuronen zu minimieren) injiziert. Jedes Tier erhielt eine unilaterale Injektion von 8 μg/4 μg sterilen 6-Hydroxydopamin-HCl (Sigma) mit 0,1% Ascorbinsäure (Sigma) in das linke MFB bei Koordinaten –2,2 mm von Bregma, 1,5 mm von der Mittelinie und 7,8 mm unterhalb der Dura, wobei der Schneideschieber bei +5 mm oberhalb horizontal Null eingestellt wurde. Die Injektion wurde über einen Zeitraum von 4 Minuten (1 μl/Min.) ausgeführt. Die Nadel wurde für zusätzliche 5 Min. vor Entfernung in-situ belassen.
d) rAAV Vektortransduktion in den Nucleus Subthalamicus (STN)
Bei der intra-STN Transduktion wurden hochtitrige Vektoren verwendet. Die Konzentrationen oder Vektoren waren: rAAV CBA-hGAD65-WPRE-BGH (6 × 10¹⁰ Patrikel/ml), rAAV CBA-hGAD67-WPRE-BGH (5 × 10¹⁰ Partikel/ml) und rAAV CBA-EGFP-WPRE-BGH (5 × 10¹⁰ Partikel/ml).
Um die Genexpression zu erhöhen wurde eine kombinierte Injektion von rAAV mit Mannitol (2 μl:1 μl) verwendet. Ein Gesamtvolumen von 3 μl rAAV Vektoren oder Kontrollvektor (Salzlösung) wurden in den ipsilateralen (links) STN bei Koordinaten –3,8 mm von Bregma, 2,4 mm von der Mittelinie und 7,7 ± 0,1 mm unterhalb der Dura injiziert, wobei der Schneideschieber bei 3,5 0,3 mm unterhalb der horizontal Null eingestellt wird. Die intracerebrale Vektorinjektion wurde mit einer Geschwindigkeit von 0,2 μl/Min. perfundiert. Die Nadel wurde für weitere 5 Min. vor Entfernung in situ belassen.
e) Ibotensäureläsion des Nucleus Subthalamicus (STN):
Da sowohl Tiefhirnstimulation (DBS) als auch direkte Verletzungen des STN gezeigt haben die Hauptsymptome in klinischen und präklinischen Untersuchungen verbessert zu haben, wurde eine Ibotensäureverletzung bzw. Ibotensäureläsion der STN Gruppe verwendet, um die therapeutische Wirksamkeit einer rAAV-GAD Transduktion von STN Neuronen zu vergleichen. Ibotensäurelösung (3 μg/1,5 μl, gelöst in 10 mM Phosphat gepuffertem Salzlösung, pH-Wert mit NaOH auf 7.4 eingestellt) wurde unter Verwendung der folgenden Stereotaxiskoordinaten: –3,8 mm von der Bregma, 2,4 mm lateral der Mittelinie und 7,7 ± 0,1 mm von der Duraoberfläche in den ipsilateralen STN injiziert. Die intracerebrale Infusion wurde mit einer Geschwindigkeit von 0,2 μl/Min. verabreicht und die Nadel wurde für weitere 5 Min. vor Entfernung in situ belassen.
f) Verhaltenstests
i) Apomorphin induzierte Drehung
Ratten wurden auf ein durch Apomorphin induziertes Drehbewegungsverhalten getestet. Für jeden Test wurde der Ratte Apomorphinhydrochlorid (0,1 mg/Kg, s.c.) (Sigma) gelöst in steriler 0,1%-iger Ascorbatsalzlösung injiziert und 15 Min. nach Injektion wurde jedes Tier in halbkugelförmige Wannen mit einem Durchmesser von 60 cm gesetzt und die Gesamtzahl kontralateraler Drehbewegungen über 5 Min. gezählt. Der erste Drehbewegungstest begann drei Wochen nach 6-OHDA-Verletzung des MFB und die folgenden Tests wurden alle drei Wochen ausgeführt. 6-OHDA verletzte Tiere, die weniger als 15 Apomorphin-induzierte Drehbewegungen in den gesamten 5 Testminuten zeigten, wurden von der Gentherapie der chronischen PD-Gruppe ausgeschlossen.
i) Kopfposition
Vor den Operationen wurde die Position des Kopfes relativ zu der Körperachse erfasst und alle drei Wochen nach der Verletzung und rAAV Transduktion bis zum Ende des Experiments. Die Ratten wurden in standardisierte Käfige gesetzt in denen sie sich frei bewegen konnten und die Position des Kopfes (> 10 Abweichungen links oder rechts der Mittellinie oder neutral) wurde innerhalb von 60 Sekunden (Sek.) gezählt. Die ipsilaterale Kopfpositionsvorspannung unilateraler Parkinsonratten wurde unter Verwendung des durchschnittlichen prozentualen Anteils in dem der Kopf in der ipsilateralen, kontralateralen oder neutralen Richtung ausgerichtet war, zum 2. Monat und 4. Monat nach der Vektortransduktion analysiert.
iii) Pfotenberühren
Der Pfotenberührungstest beurteilt die unabhängige Verwendung der Vorderpfoten für Berührungsbewegungen. Ratten wurden in Kunststoffzylinder (Höhe 30 cm, Durchmesser 25 cm) gesetzt. Die Anzahl wie häufig sich die Ratte aufstellte und die Zylinderwand mit entweder der linken, rechten oder beiden Vorderpfoten berührte wurde in einem 3 Minutentest gezählt. Die abnehmenden Pfotenberührungsbewegungen und Vorspannung unilateraler Parkinsonratten wurden am 2. Monat und 4. Monat nach der Vektortransduktion analysiert.
iv) Fortbewegungsaktivität
Die Fortbewegungsaktivität jeden Tiers wurde am 3. und 6. Monat nach Vektortransduktion unter Verwendung von MED Associate Activity Monitors (ENV-515) erfasst. An Testtagen wurde jede Ratte einzeln in eine Aktivitätsmonitorkammer (43,18 × 43,18 × 30,48 cm bzw. 17 × 17 × 12 Inch) aus Polycarbonat gesetzt. Die Aktivität wurde durch Infrarotlichtstrahlsensoren (sechzehn Strahlen pro Seite), die in den X, Y und Z-Ebenen angeordnet sind, überwacht. Die zurückgelegte Entfernung wurde für sechzig Minuten in 5 Minutenintervallen mit einem Pentium II PC Computer und einer Aktivitätsüberwachungssoftware (Version 4) erfasst. Die in der 60 Minutenperiode durchschnittlich zurückgelegte Entfernung wurde dann analysiert.
g) In vivo Elektrophysiologie der Substantia nigra während STN Stimulation
Zehn männliche Sprague-Dawley Ratten (450–700 g) wurden in diesen Experimenten verwendet. Die Tiere wurden anfänglich mit 3% Halothan betäubt, wobei 1,5% Halothan während der Operation und dem Experiment aufrechterhalten wurde, um einen tiefen und konstanten Betäubungsgrad aufrechtzuerhalten, wie sie durch Ausbleiben einer Bewegung auf starkes Schwanzkneifen festgestellt wird. Die Tiere wurden in eine Stereotaxisvorrichtung (Cartesian Research) gesetzt, wobei der Schneideschieber gewinkelt ist, um einen flachen Kopf zwischen Lamba und Bregma herzustellen. Die Körpertemperatur wurde mit einem Thermistor gesteuerten Heizkissen (FHC, Inc.) bei 37°C gehalten.
(h) Implantation einer Stimulationselektrode in den Nucleus Subthalamicus (STN)
Das Gewebe an der rostralen Schädelgrenze wurde zurückgeworfen und die Schädelknochen wurden teilweise entfernt. Das Einsetzen von Stimulationselektroden wurde unter Verwendung von Stereotaxiskoordinaten (–0,6 mm Bregma, 2,6 mm lateral zu Mittellinie, 15 Gradwinkel, 8,1 mm Tiefe) ausgeführt. Die Stimulationselektroden bestehen aus einem Paar gedrehter 150 Mikrometer Durchmesser aufweisender rostfreier Stahldrähte, die abgesehen von glatt geschnittenen Spitzen isoliert sind. Die elektrischen Stimuli waren einpolige Impulse (0,5 ms Dauer) von einem Rechteckimpulsgenerator (AMPI, Master 8) und einer Dauerstromstimulationsisolierungseinheit (AMPI, Iso-Flex). Massenimpulse (logic pulses), die mit STN Stimulation synchronisiert wurden, wurden zu einem Computer geleitet, um ein online Peristimulus-Zeithistogramm zu erzeugen.
(i) Aufnahmen von der Substantia nigra
Es wurde ein Loch mit einem Durchmesser von 3 mm wurde in den Schädel oberhalb der SN (5,3 mm caudal zum Bregma und 2 mm lateral zur Mittellinie) gebohrt und die Dura wurde zurückgeworfen bzw. widerspiegelt. Es wurden extrazelluläre Aufnahmen von einzelnen Neuronen erhalten, wobei die Glasmikropipetten (2–4 μm Spitzendurchmesser, 10–20 MOhm Widerstand) mit 1% Pontamin himmelblau Farbe in 0,5 M Natriumacetat, 0,5 M NaCl gefüllt waren. Die Aufnahmen wurden durch elektrophysiologische Standardverfahren erhalten und bearbeitet. Eine spontane Grundlinienentladung wurde für 1–3 Min. überwacht und durch einen Computer on-line gesammelt. Neuronale Antworten auf Einzelimpuls STN Stimulation wurden untersucht und die Schwelle für synaptische Aktivierung (die ungefähr die Hälfte der Stimuli antreibt) wurde bestimmt. PSTHs von SN antworten auf eine STN-Stimulation für mindestens 30 aufeinander folgende Stimulusversuche, die mit l/s (bis zu 5 mA) vorliegen.
(j) Datenanalyse
Spontane Spitzenentladungsraten wurden aus Computeraufzeichnungen, die über 1 Min. gemittelt wurden, berechnet. Um die Wirkungen einer STN Stimulation zu quantifizieren wurden einzelne PSTHs durch den Computer analysiert, um erregende und hemmende Epochen zu bestimmen. Eine Grundliniendauer wurde als die der Stimulation vorangehende 200 ms Epoche festgelegt und die mittlere und die Standardabweichung von Anzahlen pro Grundliniekasten wurden bestimmt. Der Beginn signifikanter Erregung wurde festgelegt als der erste von 5 aufeinander folgenden Lätzchen (bzw. bibs) (10 ms Kastenweite), deren Durchschnittswert die mittlere Grundlinienaktivität durch zwei Standardabweichungen übersteigt.
(k) In vivo Substantia nigra Mikrodialyse während einer STN Stimulation
Die Experimente wurden im vierten bis fünften Monat nach Vektortransduktion in das STN ausgeführt. Die Ratten wogen zwischen 550–650 g. Die Tiere wurden durch Isofluran mit Sauerstoff betäubt und in die Stereotaxisvorrichtung (Anilam, Cartesian Research, Inc.) gesetzt.
(i) STN Stimulation
Der Stimulator wurde bei den Koordinaten –0,6 mm von der Bregma und 2,6 mm von der Mittellinie eingestellt und der Stimulator wurde 8,2 ± 0,1 mm von der Dura mit einem Winkel von 15 Grad von dorsal nach ventral eingesetzt. Die Stimuli wurden durch einen AMPI Akkupulser (Master-B, AMPI) und Stimulationsisolationseinheiten ausgeliefert, die einen Rechteckimpuls abgeben. Nieder- und hochfrequente Stimulations- (LFS, HFS) Parameter wurden verwendet: Frequenz, 10 Hz; Impulsbreite, 500 μs; Stärke 500 μA für STN-LFS und Frequenz, 130 Hz; Impulsbreite, 500 μs und Stärke 50 μA für STN-HFS.
(m) Substantia nigra Mikrodialyse
Die CMA Mikrodialysesonden waren maßgefertigt und mit einer aktiven Dialysemembranlänge von 0,5–0,7 mm speziell für eine Mikrodialyse in kleinen Räumen angepasst. Die Probenmembran (Cuprophan) wies ein Molekulargewicht von 6000 Dalton auf und der äußere Durchmesser der Probe war 0,24 mm. Wenn sie eingebaut wurde, dann wurde die Spitze der Mikrodialysesonde in die SN bei: –5,8 mm von der Bregma, 2,4 mm von der Mittellinie und 8,3 ± 0,2 mm ventral von der Dura mater eingesetzt.
Die Proben, die unter Verwendung einer Quarzgutrohrleitung (1,2 μl/100 mm) mit 1-ml Glasspritzen verbunden sind, die an eine CMA/100 Mikroinjektionspumpe angebracht sind, wurden 2–3 Stunden vor der Mikrodialyseuntersuchung eingesetzt. Das Dialysesystem wurde bei 1,0 μl/Min. mit einer sterilisierten, Pyrogen-freien künstlichen Extrazellularflüssigkeit (aECF) perfundiert (Zusammensetzung in mmol/L: NaCL, 135; KCl, 3; MgCl2, 1,0; CaCl2, 1,2; Ascorbat, 0,2 und 2 mM Natriummono- und doppelbasiches Phosphat auf pH 7.4). Die Sammelperiode betrug S Min. während der STN Stimulation.
Am Ende des Experiments wurden die Mikrodialysesonden entfernt und zwischen den Experimenten in destilliertem Wasser gelagert. Die Tiere wurden mit Euthasol betäubt und intracardial mit 0,01 M PhosphatSalzlösungpuffer gefolgt von 4% Paraformaldehyd perfundiert. Das Gehirn wurde entfernt und unter Verwendung eines Gefrier-Cryostats in 20 μm Abschnitte geschnitten. Kresylviolettfärbung wurde ausgeführt, um die Position der Mikrodialysesonden und der Stimulationselektrode zu überprüfen. Alle Tiere, die fehlerhaft angeordnete Mikrodialysesonden oder eine Stimulationselektrode vorweisen wurden eliminiert.
(n) Chromatographisches Verfahren zur Aminosäureanalyse
Der Aminosäuregehalt von jeder Probe (insbesondere GABA und Glutamat) wurden unter Verwendung einer binär Gradienten Hoch-Leistungs-Flüssigkeits Chromatographie (HPLC) (Shimazu) mit Fluorezenznachweis und einer Vorsäulen Derivatisierung mit Ophthalaldehyd (OPA) (erhalten von Pierce) analysiert. Ein Proben zu Reagenzverhältnis von 1:3 (V/V) wurde verwendet (5 μl Dialysatprobe + 15 μl OPA). Nach einer Reaktion von 60 Sekunden wurden automatisch 15 μl jeder Probe in die Säule (100 × 3,3 μm, 120A, Keystone) injiziert. Die zur Trennung verwendeten mobilen Phasen waren A: 0,03 M Natriumacetat, 1,0% Tetrahydrofuran-Lösung (pH 6.88) und B: 0,02 M Natriumacetat, 80,0% Acetonitril-Lösung (pH 6.82).
(o) Histologie
Ungefähr 4–5 Monate nach der rAAV Transduktion wurden die Tiere mit Euthasol stark betäubt und intracardial mit 0,01 M PhosphatSalzlösungpuffer gefolgt von 4% Paraformaldehyd perfundiert. Das Gehirn wurde entfernt und für ungefähr 4 Stunden in 4% Paraformaldehyd gelegt und dann für 48 Stunden in 20% und 30% Sucroselösung überführt. Koronale 20 μm Gewebeschnitte wurden bei –20°C unter Verwendung eines Gefrier-Cryostats (Leica, Germany) auf dem Pallidalen-, Subthalamischen und Nigra-Niveaus geschnitten.
(p) quantitative RT-PCR für Genexpression in Realzeit
3–4 Monate nach der rAAv Tranduktion wurden die Tiere mit Euthasol betäubt und die Gehirne wurden schnell entfernt. Bilateral wurden die STN, Nigra und GPe seziert. Gesamt-RNA wurde von jeder Hirnregion unter Verwendung von TRizol-Reagenz (Life Technologies, Inc.) nach der Vorschrift des Herstellers' isoliert. Vor der RT-PCR wurde die RNA mit RQ DNase (Rnase frei) für 30 Min. bei 37°C, gefolgt durch Hitzedenaturierung für 5 Min. bei 75°C inkubiert.
Die mRNA für WPRE wurde durch quantitative Realzeit RT-PCR unter Verwendung mit dem PE Applied Biosystem Prism Modell 7700 Sequenznachweissystems erfasst. Die Sequenzen der vorwärts und entgegengesetzten Primer waren 5'- TGGCGTGGTGTGCACTGT-3' (SEQ ID No: 15) beziehungsweise 5'-GTTCCGCCGTGGCAATAG-3' (SEQ ID No: 16). Die WPRE-Taqman-Fluoreszenzsonde war (5'-6FAM-TCCGGGACTTTCGCTTTCCCCC-TAMRA-3' SEQ ID No: 17)
Die mRNA für GAPDH in jeder Probe diente als die endogene Kontrolle, um die Quantifizierung von hGAD65/67 mRNA für unterschiedliche Mengen der jeder Reaktion zugegebenen Gesamt-RNA zu normalisieren. Es wurde der Tagman Nager GAPDH Kontroll-Kit von PE Applied Biosystem verwendet. Die Sequenzen der Primer und der Sonde sind Eigentum der Firma. Die RT-PCR wurde entsprechend der Firmenvorschrift ausgeführt. Die Targets und die endogene Kontrolle wurden in demselben Röhrchen mit unterschiedlichen Reporterfarbstoffen durchgeführt. Detla Ct stellt den WPRE Schwellenzyklus dar, der auf GAPDH (ΔCt- Ct WPRE-Ct GAPDH) normalisiert ist.
(q) Statistische Analyse
Eine statistische Analyse wurde an Hand der Daten unter Verwendung des STATVIEW Programms für ANOVA und t-Test durchgeführt.
(r) Zusammenfassung des experimentellen Aufbaus
i) Gentherapie von chronischer PD Studie 1
In dieser Studie wurden drei bis vier Monate nach der unilateralen Läsion mit 6-OHDA von MFB rAAV verabreicht. Die Tiere wurden entsprechend der in Tabelle 1 gezeigten stabilen Grundlinie der Apomorphin-induzierten Drehdaten gleichmäßig gruppiert.
Tabelle 1
ii) Gentherapie von chronischer PD Studie 2
In dieser Studie wurde drei Monate nach der unilateralen Läsion mit 6-OHDA von MFB rAAV verabreicht. Die Tiere wurden entsprechend der in Tabelle 2 gezeigten stabilen Grundlinie der Apomorphin-induzierten Drehdaten gleichmäßig gruppiert.
Tabelle 2
iii) rAAV neuroprotektive Studie
In dieser Studie wurde rAAVGAD65/67 drei Wochen vor der ipsilateralen Läsion mit 6-OHDA von MFB verabreicht. Die Gruppen sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
HA-GAD65/67 bezieht sich auf die Zugabe einer HA-Epitopmarkierung an den N-Terminus des Proteins, wodurch ein immunhistochemischer Nachweis von rekombinantem GAD65/67 gestattet wird, das von endogenem Protein unterschieden werden soll.
(s) Ergebnisse
i) Verhaltenstest
Apomorphin-induzierte Drehasymmetrien
Bei der Untersuchung chronischer Parkinson Krankheit zeigten rAAV-GAD Behandlungsgruppen unter Apomorhin verringerte Drehbewegungen verglichen mit der progressiven PD-Gruppe, die Ähnlichkeit mit der Ibotensäureläsion von STN zeigte. 3 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung einer rAAV-GAD-Behandlung auf Apomorphin-induzierte Drehbewegung in Ratten mit chronischer Parkinson Krankheit zeigt.
In neuroprotektiven Untersuchungen zeigten alle Ratten, denen rAAV-GAD65/67 verabreicht wurde Schutz gegenüber einer 6-OHDA-Beeinträchtigung. 4 ist eine graphische Darstellung, die die neuroprotektive Wirkung einer rAAV-GAD Behandlung auf eine Apomorphin-induzierte Drehbewegung zeigt. Ratten mit rAAV-GAD65 zeigten die beste schützende Wirkung, wobei über 69% der Ratten absolut keine Drehasymmetrie zeigten. 5a und 5b sind graphische Darstellungen, die die neuroprotektive Wirkung einer rAAV-GAD Behandlung auf eine Apomorphin-induzierte Drehbewegung zeigen. Gemeinschaftlich zeigen diese Daten, das GAD65 und GAD67 injizierte Tiere über 15–20 Min. verringerte Apomorphin-induzierte Drehbewegungen zeigen.
Kopfposition
Die 6-OHDA-Läsion induziert eine ipsilaterale Vorspannung. Dies wurde als einer der quantitativen Marker des Parkinsonphänotyps verwendet. Es wurde keine signifikante Verringerung bei der 6-OHDA-Läsion induzierten ipsilateralen Kopfpositionsvorspannung in chronischen Hemiparkinsonratten (6a und 6b) beobachtet, denen rAAV-GAD65, 67 oder 65 und 67 verabreicht wurde. In Ratten mit rAAV-GAd65 war diese Asymmetrievorspannung jedoch stark verbessert (7a und 7b). Die GAD67-Gruppewurde nicht an der 14. Woche getestet. 8 ist eine graphische Darstellung, die zeigt, dass eine direkte Korrelation zwischen einer Apomorphindrehbewegung und einer Kopfpositionsvorspannung vorliegt.
Pfotenberührung
Die 6-OHDA-Läsion induzierte eine verminderte Aufsteh- und Berührungsbewegung mit den Vorderpfoten als auch eine ipsilaterale Vorspannung. Die Vorderpfotenberührungsbewegung war in allen rAAV-GAD und Ibotensäure-Läsionsgruppen chronischer PD-Ratten signifikant verbessert. 9 ist eine graphische Darstellung, die zeigt, dass in allen rAAV-GAD und Ibotensäureläsionsgruppen die Pfotenberührungshäufigkeiten signifikanten verbessert waren. Die GAd65/67-Gruppe wurde nicht an der 14. Woche getestet. Vorherige Verabreichung von rAAV-GAD65 schützte wirksam gegen den durch Setzen einer 6-OHDA-Läsion im MFB induzierten Ausfall einer Pfotenberührungsbewegung. 10 ist eine graphische Darstellung, die zeigt, dass rAAV-GAD-65 eine hervorstechende neuroprotektive Wirkung auf die Pfotenberührungshäufigkeit aufweist.
Fortbewegungsaktivität
Die horizontale Fortbewegungsaktivität sinkt zunehmend bei chronischen Parkinsonratten. Kombinierte rAAV-GADbS und 67 Transduktion von Ratten zeigte hervorstechende Verbesserungen in ihrer Forbewegungsaktivität. 11a und 11b sind graphische Darstellungen, die eine hervorstechende Verbesserung in der Forbewegungsaktivität zeigen, die in rAAV-GAD65 und 67 kombiniert behandelten Parkinsonratten beobachtet wurde.
Die vorherige Verabreichung von rAAVGAD65 schützte ebenso gegen die verringerte horizontale Fortbewegungsaktivität, die durch die 6-OHDA-Läsion im MFB induziert wird. 12a und 12b sind graphische Darstellungen, die zeigen, dass es Belege bzw. Anzeichen für neuroprotektive Wirkungen durch rAAV-GAD Transduktion auf die Forbewegungsaktivität gibt.
ii) In vivo Substantia nigra-Elektrophysiologie während einer STN Stimulation
Elektrophysiologie und Mikrodialyse wurde in der Substantia nigra (SN) normaler Ratten und mit Ratten ausgeführt, die mit dem CBA-GAD65 Virus behandelt wurden, der die menschliche Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD65/67) enthält, die in Neuronen Glutamat zu GABA umsetzt. In Ratten die das Virus erhielten wurden drei Wochen nach Virusinjektion in den Nucleus Subthalamicus (STN) 6-OHDA-Läsionen des Medialen Vorderhirn Stranges ausgeführt, um die Degeneration von Dopaminneuronen in PD nachzubilden. Elektrophysiologie und Mikrodialyse wurden mindestens 4 Monate nach der Virustransduktion ausgeführt.
Hemmende GABA enthaltende Verbindungen wurden unter Verwendung von Elektrophysiologie und Mikrodialyse von dem STN zu dem SN festgestellt. In den Mikrodialyseexperimenten wurde auf Grund einer niederfrequenten Elektrostimulation des STN verglichen mit einem 3-fachen Anstieg in Kontrollratten ein 10-facher Anstieg in GABA festgestellt. Die Tabelle 4 zeigt für GAD-Ratten #304 und Kontrollratten #217 die von GABA-, Glutamat- und Aspartatkonzentration in dem SN, die vor und nach niederfrequenter Stimulation erhalten wurden. Die Probenmarkierungen sind Basal # für die vor der Stimulation genommenen Proben, ST1 – # für aufeinanderfolgende Proben nach der ersten niederfrequenten Stimulation für 2 Minuten und ST2 – # für aufeinderfolgende Proben nach der ersten niederfrequenten Stimulation für 5 Minuten. 13 und 14 sind graphische Darstellungen, die die extrazelluläre GABA-Konzentration während STN-Stimulation zeigen und den GABA- und Glutamatdaten in Tabelle 4 entsprechen.
Tabelle 4
15 und 16 zeigen die Antwort von Neuronen in der Substantia nigra (SN) auf elektrische Stimulation des STN. Diese Figuren zeigen ein Histogramm (20 ms Kästen) von Spitzenhäufigkeiten nach einer elektrischen Stimulation bei t = 0. Jeder verwendete Stimulationsversuch wird eingeschlossen, um das Histogramm zu erzeugen und wird durchlaufend in der Darstellung markiert. 15 ist eine graphische Darstellung, die die Antwort von Neuronen in der Substantia nigra auf elektrische Stimulation in der STN einer normalen Ratte zeigt und zeigt, dass in normalen Ratten sich ein starker Anstieg in der Impulsaktivität aufgrund einer STN-Stimulation ereignet. 16 ist eine graphische Darstellung, die die Antwort von Neuronen in der Substantia nigra auf elektrische Stimulation in der STN bei rAAV-GAD transduzierten Ratten zeigt und zeigt eine Hemmung spontanen Feuerns des Neurons in der SN aufgrund einer STN-Stimulation. Die Stimulation in jeder der 15 und 16 ereignen sich zum Zeitpunkt = 0. Die Histogramme und Rasterdiagramme zeigen zum Vergleich der Impulsrate sofort nach Stimulation 200 ms vor und 800 ms nach der Stimulation.
iii) Extrazelluläre GABA- und Glu-Konzentrationen bei der Mikrodialyse der Substantia nigra während einer STN-Stimulation
Die gegenwärtigen Daten zeigen nach niederfrequenter Stimulation des STN in GAD65 transduzierten verglichen mit naiven Ratten einen signifikanten Anstieg bei extrazellulärem GABA. Während der ersten 15 Min.-Fraktionen nach der LFS ergab sich in der GAD65 transduzierten Gruppe verglichen mit einem 1,5-fachen Anstieg bei der naiven Kontrolle ein 4,4-facher Anstieg in der durchschnittlichen GABA-Konzentration. Ebenso wurde ansteigendes extrazelluläres Glutamat in sowohl naiven als auch GAD65 transduzierten Ratten beobachtet. 17a ist eine graphische Darstellung, die die extrazelluläre GABA-Konzentration in dem SN während einer STN Stimulation in naiven Ratten (N04) zeigt. 17b ist eine graphische Darstellung, die die extrazelluläre GABA-Konzentration in dem Sn während einer STN-Stimulation in rAAV-GAD-Ratten (N = 3) zeigt. NB: ST1- 2 Min. niederfreq. Stim., ST2- 5 Min. niederfreq. Stim..
18A–F ist eine Fotographie, die in vivo die AAV-GAD65 Expression in naiven und GAD65 transduzierten Tieren zeigt. A, B, C und D zeigen die GAD65 Expression im STN, die mit GAD65 Ab (Boehringer) festgestellt wird. A und C zeigen eine endogene GAD65 Expression von naivem STN. In B und D, rAAV-GAD65 transduzierter STN wird ein Anstieg von GAD65 exprimierenden Zellkörpern gezeigt. E und F, GAD65 Expression im Hippocampus. E, naiv. F, rAAV-GAD65 transduziert.
Beispiel 7: In Vivo Primatenuntersuchungen
Methoden
i) Subjekte
In den biologischen Forschungslaboren an der Universität von Illinois wurden sieben Rhesusaffen gehalten. Die Affen wurden in Quartieren mit einem 12 Stunden dauernden Licht-/Dunkelzyklen gehalten. Die Tiere erhielten ad libitum Nahrung und Wasser. Die Untersuchung wurde gemäß den bundesstaatlichen Vorschriften geeigneter Tierpflege und mit Zustimmung von sowohl der Schule der Presbyterianer als auch dem Tierpflegekomitee der Universität von Illinois ausgeführt.
Tabelle 5
ii) Verhaltenstest
Klinische Bewertung
Eine klinische Bewertungsskala (CR-Skala) wurde monatlich vor und nach der MPTP-Verabreichung verwendet, um den klinischen Zustand der Affen unter Verwendung einer vorher bestätigten Erfassung (Kurlan et al. (1991) Ann Neurol. 29: 677–9; (Kurlan et al. (1991) Mov. Disord. 16: 111–8; Jagust et al. (1997) Ann N Y Acad Sci. 826: 254–62; Emborg et al. (1998) J Comp Neurol. 401_253–65) quantitativ zu beurteilen. Alle Beurteilungen wurden von Videobandaufnahmen durch einen trainierten Beobachter erhalten, der blind für die Behandlungsbedingungen ist. Die Skala umfasst Beurteilungen von Zittern (0–3 für jeden Arm), Haltung (0–2), Gang (0–5), verlangsamte Bewegungen (0–5), Gleichgewicht (0–2), Gesamtbewegungsfähigkeit (gross motor skills) (0–4 für jeden Arm), Verteidigungsreaktion (0–2) und Frieren (0–2). Die Punktezahl wurde als die Summe der Merkmale aus insgesamt 32 Punkten erhalten, wobei 0 einer normalen Punktebewertung und 32 einer äußerst ernsten Unfähigkeit entspricht. Auftreten von Dyskinesie, psychologischen Störungen und Erbrechen wurden ebenso aufgenommen.
Aktivitätsüberwachen
Jeder Affe wurde mit Ketamin (10 mg/Kg, i.m.) beruhigt und mit einer Affenweste ausgestattet, die einen PAM2 Aktivitätsmonitor (IM Systems, Baltimore, MD; Emborg et al., (1998) J Comp Neurol. 401: 253–65) in der innenseitigen Rücktasche enthält. Diese Monitore erfassen Beschleunigung. Jedesmal tastet ein Monitor eine Beschleunigung ab, die einen Schwellenwert von 0,1 G überschreitet und ein elektrischer Impuls wird erzeugt und aufgezeichnet. Somit stellt jeder Impuls 234 ms einer Beschleunigung über den 0,1 G-Schwellenwert dar. Die Anzahl der Impulse wird für einen vorgewählten Zeitraum (1 Min.) ausgedrückt. Nach einer Dauer von einer Woche wurden die Tiere erneut mit Ketamin (15 mg/Kg, i.m.) beruhigt, die Jacken entfernt, und der Aktivitätsmonitor an einen Macintosh Computer angeschlossen und die Daten werden heruntergeladen. Die Daten werden als Mittelwerte eines jeden 12 Stunden dauernden Licht/Dunkelzyklus ausgedrückt.
iii) MRI-Scanning (MRI)
Alle stereotaktischen Injektionen wurden unter MRI-Führung ausgeführ. Die MRI-Szintigramme wurden in einer 1,5 T Sigmaeinheit ausgeführt. Die Tiere wurden für den Transport und das Scanning mit Telazol (4–6 mg/Kg, i. m.) betäubt. Atropin (0,02–-0,04 mg/Kg, s. c.) wurde ebenfalls verabreicht. Lebenszeichen wurden über den Vorgang und bis zur Aufwachantwort überwacht. Die Tiere wurden in einen MRI verträglichen Stereotaxisrahmen gesetzt bzw. gelegt. Die Kopforientierungskoordinaten wurden aufgenommen, um die Kopfposition während der Operation zu wiederholen. T1 und T2 gewichtete Bilder wurden erhalten als auch eine 3D Rekonstruktion mit einer Scheibendicke von 1 mm. Die Koronalnull bzw. Frontalnullebene wurde durch die Lokalisation von mit einem Pflanzenöl gefüllten Ohrstäbchen identifiziert.
iii) Chirurgische Verfahren
MPTP Behandlung
Injektionen in die Carotiden wurden gemäß unserer vorher veröffentlichten Protokolle (Kordower et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 10898–902), (Emborg and Colombo (1994) Mol Chem Neuropathol. 21: 5–82), (Emborg et al. (1998) J. Comp Neirol. 401: 253–65) ausgeführt. Die Affen wurden zuerst mit Ketamin (10 mg/Kg, i. m.) beruhigt und dann wurde die Betäubung mit Isofluran (1–2%) eingeleitet und aufrechterhalten. Jedes Tier erhielt vor dem Einschneiden eine prophylaktische Antibiotikabehandlung (Cefazolin 25 mg/Kg, i. v.). Die Tiere wurden in die Rückenlagenposition gebracht, wobei der Nacken überstreckt und leicht nach links gedreht wird. Unter sterilen Bedingungen wurde eine Nummer 15 Klinge verwendet, um die Haut entlang der Medialkante des Musculus Esternocleidomastoide durchzuschneiden. Die Karotishülle wurde unter Verwendung von genauen Irisscheren (fine iris scissors) geöffnet und die Arteria carotis communis, Vena jugularis interna und die Vagusnerven wurden identifiziert. Die Arteria carotis communis wurde unterhalb der Karotisverzweigung aufgedeckt bzw. freigelegt. Ein Seidenfaden (2.0) wurde um die Arteria carotis communis gewunden, während die Arteria carotis externa identifiziert wurde, wobei die Arteria thyroidea superior distal zu der Gabelung abzweigend gesehen wird und abgeklemmt wird. Eine 27-G Butterflynadel wurde in die Arteria carotis communis in einer retrograden Richtung zu der Richtung des Blutflusses eingefügt und 20 ml einer 3 mg MPTP-HCl enthaltenden Salzlösung wurden mit einer Rate von 1,33 ml/Min. (15 Min.) infundiert. Nachdem die Infusion abgeschlossen war wurden 3 ml einer NachspülSalzlösung zugeführt. Die Nadel wurde aus der Arteria carotis herausgezogen und ein kleines Stück eines Gelschaums wurde verwendet, um einen fokalen Druck auf das durchstoßene Gefäß anzuwenden. Die Muskulatur, SC-Gewebe und die Haut wurden dann auf routinemäßige Weise geschlossen. Buprenex (0,01 mg/Kg, i. m.) wurde auf die Aufwachantwort und 24 Stunden nach der Operation gegeben.
rAAV Injektionen
Mindestens 6 Monate nach der letzten unilateralen MPTP Verabreichung (siehe Tabelle 6) in die Karotis erhielten die Tiere intracerebrale AAV Injektionen. Die Affen wurden mit Isofluran (1–2%) intubiert und betäubt. Die Affen wurden in der gleichen Orientierung, die während des MRI-Szintigramms verwendet wurde in den Stereotaxisrahmen gelegt. Unter sterilen Bedingungen wurde über die Kopfhaut ein koronaler bzw. kranzförmiger Einschnitt gemacht. Der Eintrittspunkt wurde entsprechend zu seiner Entfernung von der MRI berechneten Nullmarke identifiziert und dann wurde ein Eintrittsloch gebohrt. Die Bloßlegung des Sinus sagitalis superior diente als der Mittelliniennullpunkt. Bevor die Spritze mit dem Vektor beladen wurde, wurde eine 20%-ige Mannitollösung aufgezogen. Der Vektor wurde nach Schütteln der Ampulle für einige Sekunden vor Injektion aufgezogen. Der Vektor wurde in einem Verhältnis von einem Teil Virus + ½ Teil 20% Mannitol (bspw. 10 μl AAV + 5 μl Mannitol) vermischt. Die Erfassung der Rindenoberfläche wurde aufgenommen und die Hamiltonspritze wurde auf das Target gesenkt. Die Infusion des Vektors wurde mit einer an dem Stereotaxismikromanipulator angebrachten Infusionspumpe ausgeführt. Die Infusionsrate betrug 1,0 μl/Min. Nachdem die Injektion abgeschlossen war, wurde 3 Minuten gewartet bevor die Spritze zurückgezogen wurde. Die Nadelstärke betrug 22S (25 μl und 50 μl Spritzen gemäß des gesamten Endvolumens, wobei die Hamiltonspritzenmodelle 1701 und 1705 entfernbare Nadeln und Teflonspitzentauchkolben aufweisen). Das Target war der Nucleus Subthalamicus, ipsilateral zu der MPTP Infusion in die Karotis. Identische Infusionsverfahren wurden für die experimentellen und Kontrolltiere verwendet. Anschließend an die Injektionen wurden die Bohrlöcher mit einem Gelschaum gefüllt und die Haut wurde in/mit den anatomischen Schichten geschlossen. Schmerzmittel bzw. Analgetika (Buprenex, 0,01 mg/Kg, i. m.) wurden nach der Aufwachantwort und 24 Stunden nach der Operation verabreicht. Von einer prophylaktischen Antibiotikabehandlung wurde abgesehen, um eine mögliche Wechselwirkung mit einer Lentivirustransfektion zu verhindern.
Tabelle 6
iv) Autopsie, Gewebepräparation
Drei Monate rAAV Infusionen, wonach 4 Affen (siehe Tabelle 5) mit Pentobarbital (25 mg/kg, i. v.) betäubt und transcardial (vorherige intraventrikuläre Injektion von 1 ml Heparin) mit normaler Salzlösung (300 ml), gefolgt durch 4% Zamboni's Fixierungsmittel (400 ml) perfundiert wurden. Die Gehirne wurden dann in einem 4%-igen Zamboni's Fixierungsmittel für eine 48 Stunden dauernde Nachfixierung untergetaucht und durch Eintauchen in eine abgestufte (10–40%) Sucrose/0,1 M Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS, pH 7.2) gefriergeschützt. Die Hirne wurden auf einem Gleitmessermikrotom gefroren geschnitten. Alle Schnitte wurden vor Bearbeiten in einem Frostschutzmittel aufbewahrt.
Proben und Gewebe wurden für eine Analyse unspezifischer Nebenwirkungen oder Verbreitung von Viruspartikeln erhalten. Die Serumproben wurden vor den Autopsieverfahren erhalten. Bevor das Zamboni's Fixierungsmittel perfundiert wurde, wurden Proben vom Herz, der Leber, Niere, dem gestreiften Muskel und der Hoden erhalten und sofort für eine nachfolgende PCR-Analyse auf eine Gegenwart von AAV eingefroren. Außerdem wurden Nieren- und Leberproben erhalten und in Zamboni's für die Histopathologie nachfixiert.
v) Immunhistochemie
Die Schnitte durch das Mittelhirn und Striatum wurden gemäß unseres vorausgehend veröffentlichten Protokolls für immunhistochemisches Färben von TH und GAD verwendet. Die endogene Peroxidaseaktivität wurde mit einer 20 Minuten dauernden Inkubation in einer 0,1 M Natriumperjodatlösung entfernt. Nach 3 × 10 Minuten Waschen in PBS plus 0,05% Triton-X (Verdünnungsmedium) wurde die Hintergrundfärbung durch eine Inkubation von 1 Stunde in einer Tris gepufferten Salzlösung, die 3% normales Pferdeserum, 2% Rinderserumalbumin und 0,05% Triton X-100 enthält, blockiert. Die Schnitte wurden dann mit einem monoklonalen TH (1:20.000; Chemicon Inc., CA) Primärantikörper für 48 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Schnitte wurden dann für 1 Stunde in biotinyliertem Pferd Antimaus (TH) Sekundärantikörpern (1:100; Vector Laboratories, Burlingame, CA) inkubiert. Nach 12 × 10 Minuten Waschen in Verdünnungsmedium werden die Schnitte für 75 Minuten in das Avidin-Biotin (ABC; „Elite" kit, Vector Laboratories) Substrat (1:1.000) gestellt. Die Schnitte wurden dann in einem 0,1 M Imidazol/1,0 M Acetatpuffer, pH 7.4 gewaschen und dann in einer Farbstofflösung, die 0,05% 3,3'-Diaminobenzidin und 0,05% H₂O₂ enthält, zur Reaktion gebracht.
Die Kontrollen bilden auf identische Weise bearbeitetes Gewebe, abgesehen von einer Verwendung des Primärantikörperlösungsmittels oder eines irrelevanten Immunglobulin G (IgG) anstelle des Primärantikörpers. Die Schnitte wurden auf Gelatine beschichtete Objekträger aufgebracht, dehydriert und Deckgläser wurden mit Permount aufgeschichtet.
Zusätzliche Schnitte wurden aufgebracht und mit DPX mit einem Deckglas eingedeckt, um mit Ultraviolettlicht eine GFP Fluoreszenz zu beobachten.
Ergebnisse
i) Allgemeine Beobachtungen
Alle Tiere vertrugen ohne Komplikationen die MPTP-Läsion und die AAV Injektionen. Die Tiere erhöhten oder behielten ihr Gewicht über die Untersuchung hinweg und zeigen keine Hinweise auf Übelkeit, Erbrechen, Diarrhoea, Anzeichen von Schwachheit, Fieber oder Infektion. Über die Untersuchung hin zeigten sie sich während der Testsitzungen kooperativ und sprachen auf Futterstimuli (siehe nachfolgende Tabelle 7) an.
Tabelle 7
ii) Klinische Beurteilung
Vor der Verabreichung von MPTP zeigten alle Tiere ein Verhalten, dass auf normale junge erwachsene männliche Rhesusaffen deutet. Sie waren schnell mit regelmäßigen Bewegungen und zeigten keine neurologischen Störungen. Wie unter Verwendung der Beurteilungsskala beurteilt punkteten in dem Vor-MPTP Zustand alle Tiere 0. Es gab keine Änderungen in der klinischen Beurteilungspunktzahl während der zwei Wochen vor der MPTP Behandlung.
Nach der Infusion in die Karotis ergab sich eine signifikante Variabilität bei dem Parkinsonzustand der Tiere und weiterhin in ihren motorischen Störungen. Die MPTP Infusionen wurden wiederholt. Nach dem dritten MPTP schienen einige Tiere leicht bzw. mild Halbparkinsonsch zu sein, während insbesondere ein Tier (6474) schwer Halbparkinsonsch erschien, Zittern, gebeugte Haltung und beeinträchtigte motorische Fähigkeiten in der Hand kontralteral zu der Infusion zeigte, als auch eine Gleichgewichtsstörung, gebückte Haltung, Bradykinesie und langsames spontanes sich im Kreis bewegen ipsilateral zu der Läsionsseite (siehe Tabelle 8).
Die Tiere erholten sich ereignislos von der rAAV Operation. Zwei Affen zeigten eine mittelmäßige Verbesserung in ihrer klinischen Punktezahl bzw. ihrem Score. Interessanterweise verbesserte 6446, der das höchste Gesamtvolumen von Vektor und Mannitol erhielt, seine Punktzahl. Ein anderer Affe, 6485, zeigte ebenfalls eine gewisse Verbesserung. Die übrigen Tiere zeigten keine signifikanten Änderungen.
Tabelle 8
Vor einer Behandlung waren die allgemeinen spontanen Aktivitätsgrade, die in dem Heimatkäfig (home cago) mit einem persönlichen Aktivitätsmonitor, der in einer Primatenjacke lokalisiert war, erfasst wurden, denen ähnlich, die in vorhergehenden Untersuchungen beobachtet wurden. Wie bei der klinischen Beurteilung zeigen die Tiere nach MPTP Behandlung unterschiedliche Aktivitätsgrade während des Tages. 19A und 19B sind Rasterdiagramme, die die Aktivität vor (A) und nach (B) GAD67 Behandlung (Affe 6482) zeigen. Beachte die Hügel und Täler, die der Aktivität während des Tages beziehungsweise der Nacht entsprechen. In allen den Fällen wurde ein zirkadianer Rhythmus beobachtet und blieb nach AAV Operation (19) unverändert.
Im Allgemeinen nahm die Aktivität des Tieres während des Tages nach MPTP Behandlung ab. Nach AAV Operation war die Aktivität von zwei Tieren, die GAD67 erhielten, erhöht (9).
Tabelle 9
iv) TH Immunfärbung
Die Schnitte durch das Mittelhirn zeigten unterschiedliche Grade einer Degeneration von TH immunreaktiven Neuronen innerhalb der Substantia nigra pars compacta ipsilateral zu der MPTP Infusion in die Karotis Rhesusaffe 6474 zeigte einen umfassenden Verlust von TH-ir Neuronen innerhalb der zentralen und ventrolateralen Abschnitte der A9 Region, während der ventral tegmantale A10 Bereich minimal beeinflusst war. Außerdem wurde ebenfalls ein starker Verlust von TH-ir positiven Fasern in dem Caudate und Putamen beobachtet. Drei der 4 Tiere (Rh # 6436, 6442, 6482) zeigten eine minimale neuronale Degeneration innerhalb der Substantia nigra pars compacta als auch eine milde Abnahme einer TH Immunfärbung in dem Striatum ipsilateral zu der Stelle der MPTP Infusion in die Karotis.
Diese Untersuchungsergebnisse entsprechen den mit der klinischen Beurteilungspunktzahl erhaltenen Daten, bspw. zeigte RH 6474 starken Parkinsonismus (höhere Punkzahl in der Beurteilungsskala) und hatte den umfangreichsten Verlust von TH positiven Zellen und Fasern in dem nigrastriatalen System.
v) GFP Immunfluoreszenz
Die rAAV-GFP behandelten Affen (6436 und 6442) zeigten GFP positive Zellen, die auf den Nucleus Subthalamicus ipsilateral zu der rAAV Injektion begrenzt sind. Die Zellkörper wurden leicht identifiziert und in der Zahl auf 6–10 positive neuronenähnliche Zellen pro Tier begrenzt. Im Gegensatz dazu zeigten keine Affen, die rAAV-GAd erhielten GFP positive Zellen. 20A und 20B sind Fotographien einer GFP Immunfärbung an der Injektionsstelle (GFP Antikörper von Clontech Palo Alto California). 21 ist ein ausführlicheres Bild von 16, die in (A) mit GFP Antikörper gefärbte neuronenähnliche Zellen zeigen, während in (B) mit GFP Antikörper gefärbte gliaähnliche Zellen gezeigt sind.
vi) GAD Immunfärbung
Die rAAV-GFP und rAAV-GAD behandelten Tiere zeigten keine Anzeichen einer anatomischen Zerstörung in dem Bereich der Injektion und die Neuronen zeigten eine normale Morphologie. In den rAAV-GFP behandelten Tieren (6442 und 6436) wurde GAD in den Bereichen, in denen es normalerweise gefunden wird, wie beispielsweise der Substantia nigra pars reticulata, dem Striatum, Thalamus und cerebralen Cortex beobachtet. Die Immunfärbung zeigte keine Unterschiede zwischen der AAV-GFP behandelten Seite und der einen nicht behandelten.
Im Vergleich zeigten die rAAV-GAd behandelten Tiere eine erhöhte GAD Färbung in dem Nucleus Subthalamicus ipsilateral zu der AAV Injektion. RH 6474 (GAD65) zeigte lediglich einen leichten Anstieg von GAD positiven Fasern. Rh 6485 (GAD67) zeigte jedoch eine kräftige Expression von GAD, die über den NEUROPIL des subthalamischen und unmittelbar angrenzenden Bereich verteilt ist. 22 ist eine Fotographie einer GAD Immunfärbung von rAAV-GAD behandelten Affen. Es kommt dort ein Anstieg bei der Immunfärbung auf der rAAV-GAD behandelten rechten Seite vor. Die Morphologie der Region bleibt nach der Operation unverändert.
Der experimentellen Ergebnisse scheinen zu zeigen, dass die MPTP-Läsion in den meisten der Tiere ein leichtes parkinsonsches Syndrom induziert. In drei der vier Tiere, die einer post mortem Bewertung unterzogen wurden zeigten der dopaminerge Marker TH eine minimale neuronale Degeneration innerhalb der Substantia nigra pars compacta als auch eine leichte Abnahme der TH Immunfärbung in dem Striatum ipsilateral zu der Seite einer MPTP Infusion in die Karotis.
Die AAV Operation beeinträchtigte die Tiere nicht weiter. Die Affen hielten oder erhöhten ihr Körpergewicht über die Untersuchung hinweg, ihr zirkadianer Rhythmus blieb intakt (wie durch den Aktivitätsmonitor erfasst) und die Tiere zeigten keine Anzeichen einer unspezifischen neurologischen Störung oder Infektion.
Verhaltensmäßig zeigten 6446 (GAD65 20 + 10) und 6485 (GAD67 10 + 5), wie durch die klinische Bewertungsskala erfasst, mittelmäßige Verbesserungen in ihren Parkinsonschen Anzeichen. Die Aktivität erhöhte sich in den zwei Tieren, die GAD67 erhielten. Histologisch zeigten lediglich rAAV-GFP Affen eine GFP Immunfluoreszenz in 6–10 Zellen in dem Nucleus Subthalamicus ipsilateral zu der rAAV Injektion. Die rAAV-GAD behandelten Tiere zeigten einen leichten bis starken Anstieg der GAD Expression in dem Nucleus Subthalamicus.
Gemeinsam zeigen diese Ergebnisse die phänotypische Verbesserung von Parkinsonratten anschließend an eine stereotaktische Injektion eines rAAV, das Glutaminsäure-Decarboxylase 65 und 67 in dem Nucleus Subthalamicus exprimiert. Halbparkinsonsche Ratten wurden durch unilaterales Setzen einer Läsion in dem medianen Vorderhirn Strang mit 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) erzeugt. Die 6-OHDA Läsion erzeugte eine ipsilaterale Vorspannung in der Kopfposition und eine Drehbewegungsasymmetrie, wobei die abnehmende Vorderpfoten berührungs- und Fortbewegungsaktivität als quantitative Marker des PD Phänotyps verwendet wurden. Um die STN Aktivität zu hemmen, wurden hochtitrige rekombinante AAV Vektoren erzeugt, die menschliche Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD65/67) exprimieren und stereotaktisch in den ipsilateralen STN injiziert wurden. Die Expression der transgenen menschlichen GAD65/67 mRNA und Proteine wurde durch Realzeit quantitative RT-PCR und Immunhistochemie nachgewiesen. Unter Verwendung einer in vivo Mikrodialyse wurde das extrazelluläre GABA und Glutamat in dem SN in Reaktion auf die niederfrequente Stimulation des STN (STN-LFS) bewerte bzw. abgeschätzt. In chronischen (gealterten) PD-Ratten, denen rAAVGAD65/67 in das STN verabreicht wurde, wurde die Drehbewegungsasymmetrie gelindert und die Vorderpfotenberührungs- und Fortbewegungsaktivität wurde verbessert. Von Interesse ist, dass in Ratten, denen vor der MFB 6-OHDA Läsion rAAVGAD65/67 Vektoren verabreicht wurden, alle Asymmetrien merklich verbessert wurden, wobei sich der Verhaltensphänotyp dem normaler Tiere annäherte. Mikrodialysedaten zeigen ebenfalls einen signifikanten Anstieg von extrazellulärem GABA in GAD transduzierten Ratten verglichen zu normalen Ratten nach STN-LFS. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Transduktion von GAD Isoformen in die STN unter Verwendung von rAAV Vektor die Überaktivität von Targetneuronen in PD-Ratten hemmen können und könnte einen starker Schutz gegenüber neurotoxischen INSULTS auf dopaminerge Neurone bereitstellen.
Beispiel 8: GAD65 Transduktion des Nucleus Subthalamicus ändert die Wirkung erregender Projektionen zu der Substantia nigra.
Dieses Beispiel zeigt die Änderung bei erregenden Projektionen zu der Substantia nigra. Der Nucleus Subthalamicus weist eine bedeutende erregende Verbindung mit der Substantia nigra (SN) auf. Bei der Parkinson Krankheit führt eine Überaktivität in der STN zu einer fortschreitenden Degeneration von Dopaminneuronen in der SN, als auch den gemeinsamen Merkmalen des Parkinsonismus, wie beispielsweise Zittern, Steifigkeit und Bradykinesie.
Die SN normaler Ratten und Ratten, die mit dem rekombinanten assoziierten-Adenovirus (rAAV), das das Gen für menschliche Glutaminsäure-Decarboxylase 65 (rAAV CBA-hGAD65) enthält, welche in Neuronen Glutamat zu GABA umwandelt, behandelt wurden, wurden verwendet, um extrazelluläre Elektrophysiologie und Mikrodialyse durchzuführen. Der mediale Vorderhirnstrang wurde mit einer Läsion versehen nachdem das Virus in den STN injiziert wurde, um PD nachzubilden.
Die Ergebnisse von den extrazellulären Aufnahmen des SN während einer STN-Stimulation in normalen Ratten (n = 4) zeigten 78% (n = 14/19 Neurone) erregende Antworten, 5% (n = 1/19) hemmende und 21% (n = 4/19) mit keiner Antwort. In GAD transduzierten Ratten (n = 5) zeigten die Ergebnisse 17% (n = 3/18 Neurone) erregende Antworten, 78% (n = 14/18) mit hemmenden und 5% (n = 1/18) mit keiner Antwort. Die Mikrodialyseexperimente ermittelten einen 4,4 fachen Anstieg in der durchschnittlichen GABA-Konzentration im SN von GAD transduzierten Ratten (n = 4) während niederfrequenter (10 Hz, 5') elektrischer Stimulation des STN verglichen zu einem 1,5 fachen Anstieg bei den Kontrollratten (n = 3).
Diese Experimente zeigen, das GAD Transduktion von Neuronen im STN die Hemmung im SN erhöht und die erregende Wirkung einer STN Stimulation auf Neurone in der SN vermindert, was die Symptome von PD lindern kann. Dies zeigt, dass Auswechseln einer erregenden Projektion von dem STN zu der SN in eine hemmende Projektion unter Verwendung eines Gen-therapeutischen Ansatzes die Symptome von PD lindert.
Sequenzliste

Claims

Verwendung eines Vektors, welcher eine für eine Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD) und ein 3'-post-transkriptionelles Regulationselement kodierende Nukleotidsequenz umfasst, zur Herstellung eines Medikaments für eine neurodegenerative Erkrankung in einem Subjekt, umfassend: Identifizieren einer Target-Stelle in dem Zentralnervensystem, beispielsweise einer Gehirnregion, die einer Modifikation bedarf; Zuführen des Vektors, welcher umfasst, eine für GAD und das 3'-post-transkriptionelle Regulationselement kodierende Nukleotidsequenz, zur Target-Stelle in dem Zentralnervensystem; und Exprimieren der GAD an der Target-Stelle in einer wirksamen Menge, um Neuroprotektion, Verbesserung oder Verringerung der neurodegenerativen Erkrankung bereitzustellen; wobei optional der Vektor unter Verwendung von einer Stereotaxis-Zuführung zugeführt wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Vektor ein viraler Vektor oder ein nicht-viraler Vektor ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei der virale Vektor (i) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Adenovirus-Vektoren, Herpesvirusvektoren, Parvovirus-Vektoren, und Lentivirus-Vektoren; oder (ii) ein adeno-assoziierter viraler Vektor ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei der nicht-virale Vektor ein Liposom-vermittelter Zuführungsvektor ist.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Gehirnregion ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Basalganglia, Nucleus Subthalamicus (STN), Nucleus Pedunculopontinus (PPN), Substantia nigra (SN), Thalamus, Hippocampus, Cortex, und Kombinationen hiervon.
Verwendung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die neurodegenerative Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Parkinson-Erkrankung, Alzheimer-Erkrankung, seniler Demenz, Amyloid-Lateral-Sklerose (ALS), und Epilepsie.
Vektor zum Exprimieren von GAD in Zellen des Zentralnervensystems, welcher umfasst: einen gewebespezifischen Promotor, beispielsweise den Neuron-spezifischen Enolase (NSE) – Promotor, der in funktionsfähiger Weise mit einer für GAD kodierenden Nukleotidsequenz verknüpft ist, und ein 3'-post-transkriptionelles Regulatorelement.
Vektor nach Anspruch 7, wobei der Vektor (i) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Adenovirus-Vektoren, Herpesvirusvektoren, Parvovirus-Vektoren, und Lentivirus-Vektoren; oder (ii) ein adeno-assoziierter viraler Vektor ist.
Vektor nach Anspruch 7, worin das post-transkriptionelle Regulationselement das posttranskriptionelle Woodchuck-Regulationselement ist.
Vektor nach Anspruch 7, worin die GAD ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus GAD-65 und GAD-67.