TWI546382B

TWI546382B - High purity soluble thrombin modulator and its manufacturing method

Info

Publication number: TWI546382B
Application number: TW100114937A
Authority: TW
Inventors: Yuji Ueno; Hiroki Shigematsu
Original assignee: Asahi Kasei Pharma Corp
Priority date: 2010-04-30
Filing date: 2011-04-28
Publication date: 2016-08-21
Also published as: JP2015071646A; EP2565269A4; SG10201500036WA; CN102858978A; TW201522633A; CA2796452A1; KR20130031262A; JP5722314B2; JP2016014067A; AU2011246021B2; US9127089B2; US20150322133A1; EP2565269A1; EP3150628A1; CA2796452C; EP2565269B1; KR101486835B1; JP5873578B2; SG184530A1; NZ602852A

Description

高純度可溶性凝血酶調節素及其製造方法

本發明係關於一種高純度可溶性凝血酶調節素及其製造方法。

已知凝血酶調節素係具有與凝血酶特異地結合而阻礙凝血酶之血液凝固活性同時、顯著地促進凝血酶之蛋白質C活化能之作用之物質，並且已知其具有強力之抗凝血作用。已知該凝血酶調節素可延長由凝血酶引起之凝固之時間，或抑制由凝血酶引起之血小板凝聚。蛋白質C係於血液凝固纖維蛋白溶解系統中承擔重要作用之維生素K依賴性之蛋白質，其藉由凝血酶之作用而活性化，成為活性化蛋白質C。已知該活性化蛋白質C於生物體內使血液凝固系因子之活性型第V因子、及活性型第VIII因子失活，又，與具有血栓溶解作用之纖維蛋白溶酶原活化物之產生有關(非專利文獻1)。因此，認為凝血酶調節素會促進該凝血酶對蛋白質C之活性化而用作抗血液凝固劑或血栓溶解劑，亦報告有對伴有血凝過快之疾病之治療、預防有效之動物實驗(非專利文獻2)。

自先前以來，凝血酶調節素係以表現於以人類為代表之各種動物種之血管內皮細胞上的糖蛋白質之形式發現獲得，其後選殖成功。即，使用基因工程學手法自人肺cDNA(complementary DNA，互補DNA)基因庫中選殖含有訊息肽之人類凝血酶調節素前驅物之基因，並且分析凝血酶調節素之全部基因序列，而明確含有訊息肽(通常例示18個胺基酸殘基)之575個殘基之胺基酸序列(專利文獻1)。已知訊息肽被切斷之成熟之凝血酶調節素係由自該成熟之肽之N末端側起之N末端區域(第1號~第226號：認為訊息肽為18個胺基酸殘基之情形時之位置表示，以下相同)、具有6個EGF(Epidermal Growth Factor，表皮生長因子)樣結構之區域(第227號~第462號)、O-糖基化區域(第463-498號)、跨膜區域(第499-521號)、及細胞質內區域(第522-557號)此5個區域所構成，並且作為具有與全長之凝血酶調節素相同之活性的部分(即最小活性單元)，於具有6個EGF樣結構之區域中主要為包含自N末端側起之第4號、第5號、第6號之EGF樣結構之部分(非專利文獻3)。

全長之凝血酶調節素於不存在界面活性劑之情況下難以溶解，作為製劑必需添加界面活性劑，相對於此，存在即使於不存在界面活性劑之情況下亦可充分溶解之可溶性凝血酶調節素。可溶性凝血酶調節素可以至少不含有跨膜區域之一部分或全部之方式製備，例如確認：僅包含N末端區域、具有6個EGF樣結構之區域及O-糖基化區域之3個區域(即包括序列編號1之第19位~第516位之胺基酸序列)之可溶性凝血酶調節素可利用重組技術之應用而獲得，並且該重組體可溶性凝血酶調節素具有天然之凝血酶調節素之活性(專利文獻1)。此外，作為可溶性凝血酶調節素之例，有若干報告(專利文獻2~9)。或作為天然型亦例示有源自人尿之可溶性凝血酶調節素等(專利文獻10、11)。

附帶而言，對於基因，根據自然之突變或獲得時之突變，如大量實例所確認般，即使於人類體內亦發現多型性之突變，現確認有包含上述575個殘基之胺基酸序列之人類凝血酶調節素前驅物之第473位胺基酸為Val者及Ala者。於編碼該胺基酸之鹼基序列中，於第1418位，分別相當於T與C之突變(非專利文獻4)。但是，於活性及物性方面毫無差異，可判斷兩者實質上相同。

報告有凝血酶調節素於治療DIC(Disseminated Intravascular Coagulation，彌散性血管內凝血)方面有效(非專利文獻5、6)。作為凝血酶調節素之用途，除上述以外，亦期待用於例如急性冠狀動脈症候群(ACS，Acute Coronary Syndrome)、血栓症、周邊血管閉塞、閉塞性動脈硬化症、血管炎、心臟手術繼發之功能性障礙、臟器移植之併發症、心絞痛、短暫性腦缺血發作、妊娠中毒症、糖尿病、肝VOD(Liver veno-occlusive disease，正肝靜脈閉塞病；猛爆性肝炎或骨髄移植後之肝靜脈閉塞)、深靜脈血栓症(DVT，Deep venous thrombosis)等、進而成人呼吸窘迫症候群(ARDS，Adult respiratory distress syndrome)之疾病之治療及預防。

作為考慮應用於醫藥品之前提，當然需大量且更廉價地製造可溶性凝血酶調節素，源自製造步驟之不同種類蛋白質，例如源自宿主細胞之蛋白質、源自培養基之牛血清蛋白質、源自抗體柱之小鼠IgG(immunoglobulin G，免疫球蛋白G)等成為免疫原性，就安全性方面指出有成為問題之可能性(非專利文獻7)。

考慮到應用於醫藥品，作為以工業水平製造可溶性凝血酶調節素之方法，例如已知有：使用承載針對凝血酶調節素之抗體之親和管柱層析作為主要純化步驟的方法；進而實質上不含有源自血清之物質及源自抗體之物質之高純度可溶性凝血酶調節素之製造方法，其特徵在於：於使藉由親和管柱層析而獲得之該可溶性凝血酶調節素，於比導電度為25~34 ms/cm、pH值為3~4之條件下接觸陽離子更換體之步驟中，以流過液(flow through)之形式獲得該可溶性凝血酶調節素(專利文獻12)。又，已知有於主要純化步驟之親和管柱層析步驟後組合強陰離子更換管柱層析之純化方法(專利文獻13)。

先前技術文獻 專利文獻

專利文獻1：日本專利特開昭64-6219號公報

專利文獻2：日本專利特開平2-255699號公報

專利文獻3：日本專利特開平3-133380號公報

專利文獻4：日本專利特開平3-259084號公報

專利文獻5：日本專利特開平4-210700號公報

專利文獻6：日本專利特開平5-213998號公報

專利文獻7：WO92/00325號公報

專利文獻8：WO92/03149號公報

專利文獻9：WO93/15755號公報

專利文獻10：日本專利特開平3-86900號公報

專利文獻11：日本專利特開平3-218399號公報

專利文獻12：日本專利特開平11-341990號公報

專利文獻13：WO2008/117735號公報

非專利文獻

非專利文獻1：鈴木宏治、醫學進展(Igaku no Ayumi)、第125卷、901頁(1983年)

非專利文獻2：K. Gomi等人Blood 75. 1396-1399(1990)

非專利文獻3：M. Zushi等人、J. Biol. Chem.,246,10351-10353(1989)

非專利文獻4：D. Z. Wen等人、Biochemistry,26,4350-4357(1987)

非專利文獻5：S. M. Bates等人、Br. J. Pharmacol.,144,1017-1028(2005)

非專利文獻6：H. Saito等人、J. Thromb Haemost,5(1),31(2007)

非專利文獻7：早川堯夫、生物醫藥品之開發與品質、安全性確保、273-274(2007)

本發明之課題在於提供一種源自宿主細胞之蛋白質之濃度相對於可溶性凝血酶調節素10,000 U而為未達10 ng之比率的高純度可溶性凝血酶調節素及其製造方法。

專利文獻13中記載有經純化之可溶性凝血酶調節素。尤其該文獻之實施例14中揭示有源自宿主之蛋白質(以下，於本說明書中有時簡稱為「HCP」)之濃度記載為「N.D.」(雖未明示但認為係指「未檢測到」)之可溶性凝血酶調節素。看到該記載之從業者通常認為降低HCP之混入之高純度可溶性凝血酶調節素達到充分，已不再需要繼續降低可溶性凝血酶調節素中之HCP，即已無降低可溶性凝血酶調節素中之HCP之混入之動機等。

然而，本發明者等人強烈意識到如下情形係嚴重問題：將經純化之可溶性凝血酶調節素用作醫藥品之情形時，若混入HCP，則會引起過敏性休克等無法預料之事態，有時甚至有致死之風險。因此，從業者通常因上述專利文獻13之實施例14中記載為「N.D.」故而認為已充分減少HCP之混入，但本發明者等人對上述專利文獻13之實施例14中記載之經純化之可溶性凝血酶調節素之HCP濃度進行了測定，結果雖為定量極限，但混入之HCP濃度相對於可溶性凝血酶調節素10,000 U(如後述之參考例1所記載般，只要無特別說明，則「U」係指表示促進蛋白質C活性化之作用(以下有時簡稱APC活性)之單元。以下中亦相同。)而顯示出未達70~80 ng之比率，本發明者等人首次確認，對於HCP之降低，有尚存改善餘地之可能性。關於該HCP濃度，本發明者等人獨自認為藉由於HCP測定中採用專利文獻13中未揭示之濃縮步驟之新步驟，可準確地測定濃度。

首次發現上述事實之本發明者等人發現如下新課題：考慮將可溶性凝血酶調節素更安全地用作醫藥品，獲得進一步降低可溶性凝血酶調節素中之HCP含量之經純化之凝血酶調節素，使過敏性休克之風險成為最小限度。

本發明者等人為了以工業水平製造HCP之混入進一步降低之高純度可溶性凝血酶調節素，而研究了導入新的管柱層析步驟。即，嘗試藉由於被認為去除HCP之效果最好之親和管柱層儀中組合複數個管柱層析儀而降低HCP，但產生如下問題：追加管柱層析步驟不僅會增加製造之勞力及時間，而且會降低可溶性凝血酶調節素之產率。又，即使於親和管柱層析儀中組合複數個管柱層析儀，亦無法獲得HCP濃度較先前進一步降低之高純度可溶性凝血酶調節素。進而，亦存在管柱層析之pH值或離子強度等僅稍微變化，便會導致HCP與可溶性凝血酶調節素之分離發生變化，而無法再現所期待之結果的問題，難以獲得高純度可溶性凝血酶調節素。

因此，本發明者等人為了找到操作較管柱層析簡便，於不降低可溶性凝血酶調節素之產率之情況下以工業水平效率良好地去除HCP，而獲得HCP之混入進一步降低之高純度可溶性凝血酶調節素之方法，而進行努力研究，結果發現：藉由使用尼龍及/或聚醚碸、尤其是尼龍，可解決獲得HCP濃度相對於可溶性凝血酶調節素10,000 U而未達10 ng之高純度可溶性凝血酶調節素之上述課題，從而完成本發明。

即，作為本發明，可列舉以下者。

[1]一種高純度可溶性凝血酶調節素，其係將包含編碼可溶性凝血酶調節素之鹼基序列之DNA轉染至宿主細胞所獲得之轉形細胞所產生者，並且源自該宿主細胞之蛋白質之含有率相對於可溶性凝血酶調節素10,000 U而為未達10 ng之比率。

[1-2]如上述[1]之高純度可溶性凝血酶調節素，其中上述高純度可溶性凝血酶調節素於總蛋白質中之純度為99%以上。

[1-3]如上述[1]或[1-2]之高純度可溶性凝血酶調節素，其中上述高純度可溶性凝血酶調節素為水溶液之形態。

[1-4]如上述[1-3]之高純度可溶性凝血酶調節素，其中上述高純度可溶性凝血酶調節素水溶液中之可溶性凝血酶調節素濃度為8 mg/mL以上。

[2]如上述[1]至[1-4]中任一項之高純度可溶性凝血酶調節素，其中上述可溶性凝血酶調節素係無血清培養該轉形細胞而產生之凝血酶調節素。

再者，如上述[1]至[1-4]所引用之項目編號以範圍表示，於其範圍內配置具有[1-2]等分枝編號之項目之情形時，係指亦引用具有[1-2]等分枝編號之項目。下文亦相同。

[2-2]如上述[1]至[2]中任一項之高純度可溶性凝血酶調節素，其中於測定源自該宿主細胞之蛋白質之含有率時，藉由利用至少包括以下步驟之方法進行測定，確認源自宿主細胞之蛋白質濃度相對於可溶性凝血酶調節素10,000 U而未達10 ng；(a)對包含編碼可溶性凝血酶調節素之鹼基序列之DNA轉染至宿主細胞而獲得之轉形細胞、或此宿主細胞中之任一者進行無血清培養，並由所獲得之培養上清液製備源自宿主細胞之蛋白質之步驟，(b)自利用上述(a)之源自該宿主細胞之蛋白質對兔子致敏而獲得之抗血清中純化源自抗宿主細胞之蛋白質抗體之步驟，構建包括下述(c1)~(c6)之測定系之步驟，(c1)使上述(b)之源自該抗宿主細胞之蛋白質抗體吸附至固相上之步驟，(c2-1)使吸附有源自該抗宿主細胞之蛋白質抗體之該固相接觸懷疑混入源自該宿主細胞之蛋白質的含有可溶性凝血酶調節素之受檢溶液之步驟，及使吸附有源自該抗宿主細胞之蛋白質抗體之該固相接觸已知濃度之含有源自宿主細胞之蛋白質之溶液之步驟，(c3)於該固相中添加生物素化之源自抗宿主細胞之蛋白質抗體之步驟，(c4)於該固相中添加抗生物素蛋白化之過氧化酶溶液之步驟，(c5)添加酶受質溶液進行顯色之步驟，及(c6)停止顯色，測定其吸光度之步驟，(d)利用上述測定系測定懷疑混入源自該宿主細胞之蛋白質的含有可溶性凝血酶調節素之受檢溶液的源自宿主細胞之蛋白質濃度，含有該可溶性凝血酶調節素之受檢溶液之源自宿主細胞之蛋白質濃度係藉由利用上述測定系並使用已知濃度之含有源自宿主細胞之蛋白質之溶液進行測定，而判斷是否處於預先確認之上述測定系之可測定範圍內之步驟，(e-1)於上述(d)中，於懷疑混入源自該宿主細胞之蛋白質的含有可溶性凝血酶調節素之受檢溶液中之源自宿主細胞之蛋白質濃度處於可測定範圍內之情形時，將該濃度設為源自該宿主細胞之蛋白質濃度之步驟，(e-2-1)於上述(d)中，於懷疑混入源自該宿主細胞之蛋白質的含有可溶性凝血酶調節素之受檢溶液中之源自宿主細胞之蛋白質濃度不在可測定範圍內之情形時，為了成為處於上述測定系之可測定範圍內之可測定濃度，視需要濃縮或稀釋含有可溶性凝血酶調節素之受檢溶液，並記錄其濃縮率或稀釋率之步驟，(e-2-2)利用將上述(c1)~(c6)所示之測定系中之(c2-1)換為以下所示之(c2-2)之測定系，測定於上述(e-2-1)中經濃縮或稀釋之含有可溶性凝血酶調節素之受檢溶液中之源自宿主細胞之蛋白質濃度，考慮濃縮率或稀釋率而求出源自該宿主細胞之蛋白質濃度之步驟，(c2-2)使吸附有源自該抗宿主細胞之蛋白質抗體之該固相接觸視需要進行濃縮或稀釋之含有可溶性凝血酶調節素之受檢溶液之步驟，及使吸附有源自該抗宿主細胞之蛋白質抗體之該固相接觸已知濃度之含有源自宿主細胞之蛋白質之溶液之步驟，及(f)算出(e-1)或(e-2-2)所求得之源自宿主細胞之蛋白質濃度相對於另行測定之含有可溶性凝血酶調節素之受檢溶液每單位體積之凝血酶調節素之APC活性的比例之步驟。

[2-3]如上述[2-2]之高純度可溶性凝血酶調節素，其中上述[2-2](a)中之宿主細胞為中國倉鼠卵巢細胞DXB11株。

[3]如上述[1]至[2-3]中任一項之高純度可溶性凝血酶調節素，其中該宿主細胞為中國倉鼠卵巢細胞。

[4]如上述[1]至[3]中任一項之高純度可溶性凝血酶調節素，其中該可溶性凝血酶調節素係具有下述(1)~(5)之性質的可溶性凝血酶調節素；(1)選擇性地與凝血酶結合之作用、(2)促進凝血酶對蛋白質C之活性化之作用、(3)延長由凝血酶引起之凝固之時間之作用、(4)抑制由凝血酶引起之血小板凝聚之作用、及(5)消炎作用。

[4-2]如上述[1]至[3]中任一項之高純度可溶性凝血酶調節素，其中該可溶性凝血酶調節素係具有下述(1)~(4)之性質之可溶性凝血酶調節素；(1)選擇性地與凝血酶結合之作用、(2)促進凝血酶對蛋白質C之活性化之作用、(3)延長由凝血酶引起之凝固之時間之作用、(4)抑制由凝血酶引起之血小板凝聚之作用。

[5]如上述[1]至[4-2]中任一項之高純度可溶性凝血酶調節素，其中該可溶性凝血酶調節素之分子量為50,000~80,000。

[6]如上述[1]至[5]中任一項之高純度可溶性凝血酶調節素，其中該高純度可溶性凝血酶調節素係利用包括以下步驟之方法而製造；(a)將包含編碼可溶性凝血酶調節素之鹼基序列之DNA轉染至宿主細胞而獲得轉形細胞之步驟，(b)培養該轉形細胞而獲得含有可溶性凝血酶調節素之溶液之步驟，及(c)使含有該可溶性凝血酶調節素之溶液與尼龍及/或聚醚碸接觸，獲得源自宿主細胞之蛋白質之含有率相對於可溶性凝血酶調節素10,000 U而為未達10 ng之比率之高純度可溶性凝血酶調節素之步驟。

[7]如上述[1]至[6]中任一項之高純度可溶性凝血酶調節素，其中該可溶性凝血酶調節素係含有(i)序列編號9或序列編號11中任一項之胺基酸序列中之第367位~第480位之胺基酸序列，且含有下述(ii-1)或(ii-2)中任一項之胺基酸序列之肽，並且該肽係具有下述(1)~(5)之性質之可溶性凝血酶調節素；(ii-1)序列編號9或序列編號11中任一項之胺基酸序列中之第19位~第244位之胺基酸序列、或(ii-2)上述(ii-1)之胺基酸序列之1個或複數個胺基酸經置換、缺失、或附加之胺基酸序列，(1)選擇性地與凝血酶結合之作用、(2)促進凝血酶對蛋白質C之活性化之作用、(3)延長由凝血酶引起之凝固之時間之作用、(4)抑制由凝血酶引起之血小板凝聚之作用、及(5)消炎作用。

[7-2]如上述[1]至[6]中任一項之高純度可溶性凝血酶調節素，其中該可溶性凝血酶調節素係含有(i)序列編號9或序列編號11中任一項之胺基酸序列中之第367位~第480位之胺基酸序列，且含有下述(ii-1)或(ii-2)中任一項之胺基酸序列之肽，並且該肽係具有下述(1)~(4)之性質之可溶性凝血酶調節素；(ii-1)序列編號9或序列編號11中任一項之胺基酸序列中之第19位~第244位之胺基酸序列，或(ii-2)上述(ii-1)之胺基酸序列之一個或複數個胺基酸經置換、缺失、或附加之胺基酸序列，(1)選擇性地與凝血酶結合之作用、(2)促進凝血酶對蛋白質C之活性化之作用、(3)延長由凝血酶引起之凝固之時間之作用、(4)抑制由凝血酶引起之血小板凝聚之作用。

[7-3]如上述[1]至[6]中任一項之高純度可溶性凝血酶調節素，其中該可溶性凝血酶調節素係含有下述(i-1)或(i-2)中任一項之胺基酸序列，且含有下述(ii-1)或(ii-2)中任一項之胺基酸序列之肽，並且該肽係具有下述之(1)~(5)之性質之可溶性凝血酶調節素；(i-1)序列編號9或序列編號11中任一項之胺基酸序列中之第367位~第480位之胺基酸序列，或(i-2)上述(i-1)之胺基酸序列之1個或複數個胺基酸經置換、缺失、或附加之胺基酸序列，(ii-1)序列編號9或序列編號11中任一項之胺基酸序列中之第19位~第244位之胺基酸序列，或(ii-2)上述(ii-1)之胺基酸序列之1個或複數個胺基酸經置換、缺失、或附加之胺基酸序列，(1)選擇性地與凝血酶結合之作用、(2)促進凝血酶對蛋白質C之活性化之作用、(3)延長由凝血酶引起之凝固之時間之作用、(4)抑制由凝血酶引起之血小板凝聚之作用、及(5)消炎作用。

[8]如上述[1]至[6]中任一項之高純度可溶性凝血酶調節素，其中該可溶性凝血酶調節素係具有(i-1)序列編號9或序列編號11中任一項之胺基酸序列中之第19位~第516位之胺基酸序列，或(i-2)上述(i-1)之胺基酸序列之1個或複數個胺基酸經置換、缺失、或附加之胺基酸序列中任一項之胺基酸序列之肽，並且該肽係具有下述(1)~(5)之性質之可溶性凝血酶調節素；(1)選擇性地與凝血酶結合之作用、(2)促進凝血酶對蛋白質C之活性化之作用、(3)延長由凝血酶引起之凝固之時間之作用、(4)抑制由凝血酶引起之血小板凝聚之作用、及(5)消炎作用。

[9]如上述[1]至[6]中任一項之高純度可溶性凝血酶調節素，其中包含編碼該可溶性凝血酶調節素之鹼基序列之DNA係編碼序列編號9或序列編號11中任一項之胺基酸序列之DNA。

[10]一種醫藥組合物，其含有上述[1]至[9]中任一項之高純度可溶性凝血酶調節素及藥學上所容許之載體。

[11]一種高純度可溶性凝血酶調節素之製造方法，其係源自宿主細胞之蛋白質之含有率相對於可溶性凝血酶調節素10,000 U而為未達10 ng之比率之高純度可溶性凝血酶調節素之製造方法，其包括使含有可溶性凝血酶調節素之溶液與尼龍及/或聚醚碸接觸之步驟，該可溶性凝血酶調節素係將包含編碼可溶性凝血酶調節素之鹼基序列之DNA轉染至宿主細胞而獲得之轉形細胞所產生者。

[12]如上述[11]之製造方法，其係藉由無血清培養該轉形細胞而產生可溶性凝血酶調節素。

[13]如上述[11]或[12]之高純度可溶性凝血酶調節素之製造方法，其中該可溶性凝血酶調節素係具有下述(1)~(5)之性質之可溶性凝血酶調節素；(1)選擇性地與凝血酶結合之作用、(2)促進凝血酶對蛋白質C之活性化之作用、(3)延長由凝血酶引起之凝固之時間之作用、(4)抑制由凝血酶引起之血小板凝聚之作用、及(5)消炎作用。

[14]如上述[11]至[13]中任一項之製造方法，其中該宿主細胞為中國倉鼠卵巢細胞。

[15]如上述[11]至[14]中任一項之製造方法，其中該可溶性凝血酶調節素之分子量為50,000~80,000。

[16]如上述[11]至[15]中任一項之製造方法，其中該可溶性凝血酶調節素係含有(i)序列編號9或序列編號11中任一項之胺基酸序列中之第367位~第480位之胺基酸序列，且含有下述(ii-1)或(ii-2)中任一項之胺基酸序列的肽，並且該肽係具有下述(1)~(5)之性質之可溶性凝血酶調節素；(ii-1)序列編號9或序列編號11中任一項之胺基酸序列中之第19位~第244位之胺基酸序列，或(ii-2)上述(ii-1)之胺基酸序列之一個或複數個胺基酸經置換、缺失、或附加之胺基酸序列，(1)選擇性地與凝血酶結合之作用、(2)促進凝血酶對蛋白質C之活性化之作用、(3)延長由凝血酶引起之凝固之時間之作用、(4)抑制由凝血酶引起之血小板凝聚之作用、及(5)消炎作用。

[17]如上述[11]至[15]中任一項之製造方法，其中該可溶性凝血酶調節素係具有(i-1)序列編號9或序列編號11中任一項之胺基酸序列中之第19位~第516位之胺基酸序列，或(i-2)上述(i-1)之胺基酸序列之1個或複數個胺基酸經置換、缺失、或附加之胺基酸序列中任一項之胺基酸序列的肽，且該肽係具有下述(1)~(5)之性質之可溶性凝血酶調節素；(1)選擇性地與凝血酶結合之作用、(2)促進凝血酶對蛋白質C之活性化之作用、(3)延長由凝血酶引起之凝固之時間之作用、(4)抑制由凝血酶引起之血小板凝聚之作用、及(5)消炎作用。

[18]如上述[11]至[15]中任一項之製造方法，其中包含編碼該可溶性凝血酶調節素之鹼基序列之DNA為編碼序列編號9或序列編號11之胺基酸序列之DNA。

[19]如上述[11]至[18]中任一項之製造方法，其中尼龍及/或聚醚碸之形態為過濾膜之形態。

[20]如上述[19]之製造方法，其中過濾膜之膜面積相對於源自宿主細胞之蛋白質1 mg而為0.01~0.5 m²。

[21]如上述[11]至[20]中任一項之製造方法，其中尼龍及/或聚醚碸為尼龍。

[22]一種製造方法，其係上述[11]至[20]之高純度可溶性凝血酶調節素之製造方法，並且具有[1-2]至[1~4]、[2-2]、[2-3]、[7-2]、或[7-3]中任一項之特徵。

[23]如上述[11]至[22]中任一項之製造方法，其係源自宿主細胞之蛋白質之含有率相對於可溶性凝血酶調節素10,000 U而為未達10 ng之比率之高純度可溶性凝血酶調節素之製造方法，且係包括如下步驟之製造方法，並且上述宿主細胞為中國倉鼠卵巢細胞；(a)將編碼序列編號9或序列編號11之胺基酸序列之DNA轉染至宿主細胞而獲得轉形細胞之步驟、(b)培養該轉形細胞而獲得含有可溶性凝血酶調節素之溶液之步驟、(c)將含有該可溶性凝血酶調節素之溶液純化至總蛋白質中之凝血酶調節素純度為99%以上之步驟、及(d)使含有該可溶性凝血酶調節素之溶液與尼龍接觸，單獨分離源自宿主細胞之蛋白質之含有率相對於可溶性凝血酶調節素10,000 U而為未達10 ng之比率之高純度可溶性凝血酶調節素之步驟。

[24]一種高純度可溶性凝血酶調節素，其係藉由上述[23]之方法而製造。

[25]一種去除可溶性凝血酶調節素中之源自宿主細胞之蛋白質之方法，其包括使含有可溶性凝血酶調節素之溶液與尼龍及/或聚醚碸接觸之步驟，該可溶性凝血酶調節素係將包含編碼可溶性凝血酶調節素之鹼基序列之DNA轉染至宿主細胞而獲得之轉形細胞所產生者。

[26]如上述[25]之製造方法，其係去除可溶性凝血酶調節素中之源自宿主細胞之蛋白質之方法，且係包括如下步驟之製造方法，並且上述宿主細胞為中國倉鼠卵巢細胞；(a)將編碼序列編號9或序列編號11之胺基酸序列之DNA轉染至宿主細胞而獲得轉形細胞之步驟、(b)培養該轉形細胞而獲得含有可溶性凝血酶調節素之溶液之步驟、(c)將含有該可溶性凝血酶調節素之溶液純化至總蛋白質中之凝血酶調節素純度為99%以上之步驟、及(d)使含有該可溶性凝血酶調節素之溶液與尼龍接觸。

[27]一種去除上述[25]之可溶性凝血酶調節素中之源自宿主細胞之蛋白質之方法，其具有上述[1]至[9]中任一項之特徵。

藉由使用本發明之製造方法，可獲得源自宿主細胞之蛋白質之含有率相對於可溶性凝血酶調節素10,000 U而為未達10 ng之比率的降低源自宿主細胞之蛋白質之混入之高純度可溶性凝血酶調節素。藉此，可進一步降低將可溶性凝血酶調節素用作醫藥品時之過敏性休克之風險。

以下，藉由若干較佳態樣(用以實施本發明之較佳之形態：以下，於本說明書中有時簡稱「實施形態」)對本發明進行詳細地說明，但本發明之範圍並不限定於下文所說明之特定態樣。

本實施形態之高純度可溶性凝血酶調節素可用作醫藥原料。亦可將本實施形態之高純度可溶性凝血酶調節素與其他藥學上容許之載體組合製成醫藥品而使用。

又，本實施形態之高純度可溶性凝血酶調節素實質上不含有可溶性凝血酶調節素以外之物質，可製成含有高純度可溶性凝血酶調節素之醫藥組合物而使用。亦可將本實施形態之高純度可溶性凝血酶調節素與其他藥學上容許之載體組合製成醫藥組合物而使用。

以下，包括高純度可溶性凝血酶調節素之醫藥原料在內，有時稱為高純度凝血酶調節素。又，包括含有高純度可溶性凝血酶調節素之醫藥組合物在內，有稱為高純度可溶性凝血酶調節素，該高純度可溶性凝血酶調節素實質上不含有可溶性凝血酶調節素以外之物質。

已知本實施形態中之凝血酶調節素已知(1)選擇性地與凝血酶結合(2)促進凝血酶對蛋白質C之活性化之作用。又，較佳為通常可見(3)延長由凝血酶引起之凝固之時間之作用、(4)抑制由凝血酶引起之血小板凝聚之作用、及/或(5)消炎作用。

凝血酶調節素活性較佳為具有上述(1)及(2)之作用，更佳為具有上述(1)~(4)之作用。又，作為凝血酶調節素活性，更佳為具有(1)~(5)之全部作用。

與凝血酶調節素之凝血酶之結合作用，例如可藉由以Thrombosis and Haemostasis 1993 70(3):418-422為首之各公知文獻中記載之試驗方法而確認。促進凝血酶對蛋白質C之活性化之作用，例如可藉由以日本專利特開昭64-6219號公報為首之各公知文獻中明確記載之試驗方法而容易地確認促進蛋白質C之活性化之作用之活性量或其之有無。又，關於延長由凝血酶引起之凝固之時間之作用、及/或抑制由凝血酶引起之血小板凝聚之作用亦可同樣容易地確認。進而，關於消炎作用，例如亦可藉由以blood 2008 112:3361-3670、The Journal of Clinical Investigation 2005 115 5:1267-1274為首之各公知文獻中記載之試驗方法而確認。

作為可溶性凝血酶調節素，可列舉於無界面活性劑之存在下可溶於水之可溶性凝血酶調節素。作為可溶性凝血酶調節素之溶解性之較佳例示，相對於水、例如注射用蒸餾水(於無TritonX-100或聚醚醇等界面活性劑之存在下，通常為中性附近)可列舉1 mg/ml以上、或10 mg/ml以上，較佳可列舉15 mg/ml以上、或17 mg/ml以上，更佳可例示20 mg/ml以上、25 mg/ml以上、或30 mg/ml以上，尤佳可列舉60 mg/ml以上，視情形可分別列舉80 mg/ml以上、或100 mg/ml以上。於判斷是否能溶解可溶性凝血酶調節素時，係理解為將如下情況作為明顯指標：於溶解後，例如於白色光源之正下方、約1000勒克斯之亮度之位置以肉眼觀察之情形時，溶液澄清，不含明顯可見之程度之不溶性物質。又，亦可進行過濾，確認有無殘渣。

可溶性凝血酶調節素如上述所示，具有凝血酶調節素活性，只要為可溶性，則其分子量並無限定，作為分子量之上限，較佳為100,000以下，更佳為90,000以下，更佳為80,000以下，尤佳為70,000以下，作為分子量之下限，更佳為50,000以上，尤佳為60,000以上。可溶性凝血酶調節素之分子量可藉由測定蛋白質之分子量之通常方法而容易地測定，較佳為藉由質譜法進行測定，更佳為藉由MALDI-TOF-MS(Matrix Assisted Laser Desorptio,Ionization Time o,Flight Mass Spectrometry，基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀)法。

為了獲得目標範圍之分子量之可溶性凝血酶調節素，可如下述般，對利用載體將編碼可溶性凝血酶調節素之DNA轉染至宿主細胞而製備之轉形細胞進行培養，將所獲得之可溶性凝血酶調節素利用管柱層析等進行區分而獲得。

作為可溶性凝血酶調節素，較佳為包含人類型之凝血酶調節素中之序列編號1之第19位~第132位之胺基酸序列、及序列編號9或序列編號11之第19位~第244位之胺基酸序列或可置換、缺失、附加該胺基酸序列之1個或複數個胺基酸的胺基酸序列。該序列編號1之第19位~第132位之胺基酸序列係凝血酶調節素活性中與促進凝血酶對蛋白質C之活性化之作用相關的序列。另一方面，序列編號9或序列編號11之第19位~第244位之胺基酸序列係凝血酶調節素活性中與消炎作用相關之序列。只要可溶性凝血酶調節素整體具有凝血酶調節素活性，則該序列編號1之第19位~第132位之胺基酸序列可自然或人工地突變，即可置換、缺失、附加序列編號1之第19位~第132位之胺基酸序列之1個或複數個胺基酸。只要具有凝血酶調節素活性，則所容許之突變之程度無特別限定，例如作為胺基酸序列可例示50%以上之同源性，較佳為70%以上之同源性，更佳為80%以上之同源性，更佳為90%以上之同源性，尤佳為95%以上之同源性，最佳為98%以上之同源性。將如此置換、缺失、附加胺基酸序列之1個或複數個胺基酸的胺基酸序列稱為同源突變序列。該等突變如下述般，使用通常之基因操作技術便可容易地實現。可溶性凝血酶調節素具有上述序列，只要至少可溶性凝血酶調節素整體具有與凝血酶選擇性地結合而促進凝血酶對蛋白質C之活性化之作用，則無特別限定，較佳為同時具有消炎作用。

序列編號3之序列係序列編號1之序列之第125位之胺基酸Val突變為Ala者，作為本實施形態中之可溶性凝血酶調節素，亦較佳為包含序列編號3之第19位~第132位之胺基酸序列。

如此，作為可溶性凝血酶調節素，只要至少具有序列編號1或序列編號3之第19位~第132位之序列或該等之同源突變序列、及序列編號9或序列編號11之第19位~第244位之序列或該等之同源突變序列，且至少可溶性凝血酶調節素整體具有與凝血酶選擇性地結合而促進凝血酶對蛋白質C之活性化之作用，則無特別限定，作為較佳例可列舉包含序列編號1或序列編號3中之第19位~第132位或第17~132位之序列的肽，或包含上述序列之同源突變序列及序列編號9或序列編號11之第19位~第244位之序列或該等之同源突變序列且至少可溶性凝血酶調節素整體具有凝血酶調節素活性之肽，更佳為包含序列編號1或序列編號3之第19位~第132位之序列、及序列編號9或序列編號11之第19位~第244位之序列或該等之同源突變序列之肽。又，亦有包含序列編號1或序列編號3中之第19位~第132位或第17~132位之同源突變序列、及序列編號9或序列編號11之第19位~第244位之序列或該等之同源突變序列且至少可溶性凝血酶調節素整體具有凝血酶調節素活性之肽更佳之其他態樣。

可溶性凝血酶調節素較佳為作為可溶性凝血酶調節素整體同時具有消炎作用。

又，作為可溶性凝血酶調節素之另一態樣，較佳為包含序列編號5之第19位~第480位之胺基酸序列，只要包含序列編號5之第19位~第480位之胺基酸序列，則無特別限定。只要具有凝血酶調節素活性，則該序列編號5之第19位~第480位之胺基酸序列亦可為其同源突變序列。

序列編號7之序列係序列編號5之序列之第473位之胺基酸之Val突變為Ala者，作為本實施形態中之可溶性凝血酶調節素，亦較佳為包含序列編號7之第19位~第480位之胺基酸序列。

如此，作為可溶性凝血酶調節素，只要為至少具有序列編號5或序列編號7之第19位~第480位之序列或該等之同源突變序列，且包含至少具有凝血酶調節素活性之肽序列，則無特別限定，作為較佳例可列舉包含序列編號5或序列編號7各自之第19位~第480位或第17位~第480位之序列的肽，或包含上述序列之同源突變序列且至少具有凝血酶調節素活性之肽，更佳為包含序列編號5或序列編號7之第19位~第480位之序列之肽。又，亦有包含序列編號5或序列編號7各自之第19位~第480位或第17位~第480位之同源突變序列且至少具有凝血酶調節素活性之肽更佳之其他態樣。

可溶性凝血酶調節素較佳為同時具有消炎作用。

又，作為可溶性凝血酶調節素之尤佳之另一態樣，較佳為包含序列編號9之第19位~第515位之胺基酸序列，只要包含序列編號9之第19位~第515位之胺基酸序列，則無特別限定。只要具有凝血酶調節素活性，則該序列編號9之第19位~第515位之胺基酸序列亦可為其同源突變序列。

序列編號11之序列係序列編號9之序列之第473位之胺基酸之Val突變為Ala者，作為本實施形態中之凝血酶調節素，亦較佳為包含序列編號11之第19位~第515位之胺基酸序列。

如此，作為可溶性凝血酶調節素，只要至少具有序列編號9或序列編號11之第19位~第515位之序列或該等之同源突變序列，且包含至少具有凝血酶調節素活性之肽序列，則無特別限定，作為更佳例可列舉包含序列編號9或序列編號11各自中之第19位~第516位、第19位~第515位、第19位~第514位、第17位~第516位、第17位~第515位、或第17位~第514位之序列之肽，或包含上述序列之同源突變序列且至少具有凝血酶調節素活性之肽，尤佳為包含序列編號9中之第19位~第516位、第19位~第515位、第19位~第514位、第17位~第516位、第17位~第515位、或第17位~第514位之序列之肽。作為較佳例亦可列舉該等之混合物。又，亦有包含序列編號11各自中之第19位~第516位、第19位~第515位、第19位~第514位、第17位~第516位、第17位~第515位、或第17位~第514位之序列之肽尤佳之其他態樣。作為較佳例亦可列舉該等之混合物。作為較佳例進而亦可列舉包含該等之同源突變序列且至少具有凝血酶調節素活性之肽。

可溶性凝血酶調節素較佳為同時具有消炎作用。

所謂具有同源突變序列之肽，亦指如上述般，可置換、缺失、附加成為對象之肽之胺基酸序列中之1個以上、即1個或複數個胺基酸、更佳為數個(例如1~20個，較佳為1~10個，更佳為1~5個，尤佳為1~3個)之胺基酸的肽。只要具有凝血酶調節素活性，則所容許之突變之程度無特別限定，例如作為胺基酸序列可例示50%以上之同源性，較佳為70%以上之同源性，更佳為80%以上之同源性，更佳為90%以上之同源性，尤佳為95%以上之同源性，最佳為98%以上之同源性。

進而，關於可溶性凝血酶調節素，作為較佳例亦可列舉包含日本專利特開昭64-6219號公報中之序列編號14之序列(462個胺基酸殘基)之肽、包含序列編號8之序列(272個胺基酸殘基)之肽、或包含序列編號6之序列(236個胺基酸殘基)之肽。

作為可溶性凝血酶調節素，只要為至少具有序列編號1或序列編號3之第19位~第132位之胺基酸序列及序列編號9或序列編號11之第19位~第244位之序列或該等之同源突變序列，且至少可溶性凝血酶調節素整體具有凝血酶調節素活性之肽，則無特別限定，其中較佳為至少具有序列編號5或序列編號7之第19位~第480位之胺基酸序列之肽，更佳為至少具有序列編號9或序列編號11之第19位~第515位之胺基酸序列之肽。關於至少具有序列編號9或序列編號11之第19位~第515位之胺基酸序列之肽，作為更佳例可列舉包含序列編號9或序列編號11各自中之第19位~第516位、第19位~第515位、第19位~第514位、第17位~第516位、第17位~第515位、或第17位~第514位之序列的肽。又，作為更佳例亦可列舉包含序列編號9或序列編號11各自中之第19位~第516位、第19位~第515位、第19位~第514位、第17位~第516位、第17位~第515位、或第17位~第514位之序列之肽之分別針對序列編號9或序列編號11之混合物。

於為上述混合物之情形時，作為序列編號9或序列編號11各自之自第17位開始之肽與自第19位開始之肽的混合比例，可例示(30:70)~(50:50)，較佳為(35:65)~(45:55)。

又，作為於序列編號9或序列編號11各自之第514位、第515位、及第516位終止之肽的混合比例，可例示(0:0:100)~(0:90:10)，視情形可例示(0:70:30)~(10:90：0)、(10:0:：90)~(20:10:70)。

該等肽之混合比例可藉由通常方法求得。

再者，序列編號1之第19位~第132位之序列相當於序列編號9之第367位~第480位之序列，序列編號5之第19位~第480位之序列相當於序列編號9之第19位~第480位之序列。

又，序列編號3之第19位~第132位之序列相當於序列編號11之第367位~第480位之序列，序列編號7之第19位~第480位之序列相當於序列編號11之第19位~第480位之序列。

進而，序列編號1、3、5、7、9、及11各自之第1~18位之序列均為相同序列。

該等可溶性凝血酶調節素如下所述，例如可由利用載體將編碼該等肽之DNA(具體而言，具有序列編號10之第1位~第732位之鹼基序列及序列編號2之第55位~第396位之鹼基序列的鹼基序列、具有序列編號10之第1位~第732位之鹼基序列及序列編號4之第55位~第396位之鹼基序列的鹼基序列、序列編號6、序列編號8、序列編號10、或序列編號12等之鹼基序列)轉染至宿主細胞所製備之轉形細胞而獲得。

進而，該等肽只要具有上述胺基酸序列即可，可附有糖鏈，或亦可不附有糖鏈，該方面並無特別限定。又，於基因操作中，根據使用之宿主細胞之種類之不同，糖鏈之種類、或附加位置或附加之程度亦有所不同，可使用任一者。關於糖鏈之結合位置及種類，已知日本專利特開平11-341990號公報中記載之事實，本實施形態之凝血酶調節素亦有於同樣位置附加同樣之糖鏈之情形。於本實施形態之可溶性凝血酶調節素上結合有岩藻醣基雙觸角型(fucosyl biantennary)與岩藻醣基三觸角型(fucosyl triantennary)之2種N結合型糖鏈，其比率可例示(100:0)~60:40)，較佳為(95:5)~(60:40)，更佳為(90:10)~(70:30)。該等糖鏈之比率可根據生物化學實驗法23糖蛋白質糖鏈研究法、學會出版中心(1990年)等中之記載之二維糖鏈圖譜而測定。進而，若調查本實施形態之可溶性凝血酶調節素之糖組成，則檢測出中性糖、胺糖及唾液酸，該等相對於蛋白質含量分別獨立以重量比計之比率可例示1~30%，較佳為2~20%，更佳為5~10%。該等糖含量可根據新生化學實驗講座3糖質I糖蛋白質(上)、東京化學同人(1990年)中記載之方法(中性糖：苯酚-硫酸法、胺糖：Elson-Morgan法、唾液酸：過碘酸-間苯二酚法)而測定。

於藉由基因操作而獲得可溶性凝血酶調節素之情形時，作為表現時可使用之訊息序列，可利用上述編碼序列編號9之第1~18位之胺基酸序列的鹼基序列、編碼序列編號9之第1~16位之胺基酸序列的鹼基序列、其他公知之訊息序列、例如人類組織型纖維蛋白溶酶原活化物之訊息序列(國際公開88/9811號公報)。

於將編碼可溶性凝血酶調節素之DNA序列導入宿主細胞中之情形時，較佳可列舉：將編碼可溶性凝血酶調節素之DNA序列組入載體、尤佳為可於動物細胞中進行表現之表現載體中再進行導入之方法。所謂表現載體，係指由啟動子序列、對mRNA賦予核糖體結合部位之序列、編碼欲表現之蛋白質之DNA序列、剪接訊息、終止轉錄之終止子序列、複製原點序列等所構成之DNA分子，作為較佳之動物細胞表現載體之例，可列舉R. C. Mulligan等人[Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78. 2072(1981)]報告之pSV2-X、或P. M. Howley等人[Method in Emzymology,101,387,Academic Press(1983)]報告之pBP69T(69-6)等。又，亦有組入可於微生物中進行表現之表現載體的其他較佳態樣。

作為製造該等肽時可使用之宿主細胞，可列舉動物細胞。

作為動物細胞，可列舉：中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、COS-1細胞、COS-7細胞、VERO(ATCC CCL-81)細胞、BHK細胞、源自狗腎之MDCK細胞、倉鼠AV-12-664細胞、NSO細胞等；又，作為源自人類之細胞，可列舉：HeLa細胞、WI38細胞、人類293細胞、PER. C6細胞。CHO細胞極為普通故而較佳，於CHO細胞中更佳為二氫葉酸還原酶(DHFR，dihydrofolate reductase)缺損CHO細胞。

又，於基因操作之過程或肽之製造過程中，亦較多地使用大腸桿菌等微生物，較佳為使用適合於各自之宿主-載體系，於上述之宿主細胞中，亦可選擇適當之載體系。現已.選殖出用於基因重組技術之凝血酶調節素之基因，並且揭示有使用凝血酶調節素之基因重組技術之製造例，進而亦已知用以獲得其純化品之純化方法[日本專利特開昭64-6219號公報、日本專利特開平2-255699號公報、日本專利特開平5-213998號公報、日本專利特開平5-310787號公報、日本專利特開平7-155176號公報、J. Biol. Chem.,264:10351-10353(1989)]。因此，本實施形態所使用之可溶性凝血酶調節素可藉由使用上述報告中記載之方法，或藉由依據該等中記載之方法而製造。例如日本專利特開昭64-6219號公報中揭示有包含含有編碼全長凝血酶調節素之DNA之質體pSV2凝血酶調節素J2的Escherichia coli K-12 strain DH5(ATCC寄存編號：67283號)。又，亦可使用將該菌株再寄存於生命研(現獨立行政法人產業技術綜合研究所專利生物寄存中心)之菌株(Escherichia coli DH5/SV2TM J2)(FERM BP-5570)。可將編碼該全長凝血酶調節素之DNA作為原料，藉由公知之基因操作技術，製備本實施形態之凝血酶調節素。

可溶性凝血酶調節素藉由先前公知方法或依據該方法進行製備即可，例如可參考上述山本等人之方法[日本專利特開昭64-6219號公報]、或日本專利特開平5-213998號公報。即，藉由基因操作技術，將源自人類之可溶性凝血酶調節素基因形成為例如編碼序列編號9之胺基酸序列之DNA，進而亦可視需要進行改型。作為該改型，例如為了形成為編碼序列編號11之胺基酸序列之DNA(具體而言由序列編號12之鹼基序列形成)，依據Methods in Enzymology[Methods in Enzymology,100:468 1983年),academic press(Academic Press)]中記載之方法，對編碼序列編號9之胺基酸序列之第473位之胺基酸的密碼子(尤其係第1418位之鹼基)進行部位特異性突變。例如可形成使用具有序列編號13所示之鹼基序列之突變用合成DNA將序列編號10之第1418位之鹼基T變換為鹼基C之DNA。

可將如此製備之DNA組入例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中，製成轉形細胞，適當選擇、培養該細胞，由所獲得之培養液，製造藉由公知方法純化之可溶性凝血酶調節素。較佳為如上述般將編碼序列編號9之胺基酸序列之DNA(序列編號10)轉染至上述宿主細胞中。

於培養上述轉形細胞時，可使用通常之細胞培養所使用之培養基，較佳為預先利用各種培養基培養該轉形細胞，並選擇最佳之培養基。例如可使用以MEM(Minimum Essential Medium)培養基、DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培養基、199培養基等公知培養基作為基本培養基，進而進行改良或添加各種培養基用之補充品而成的培養基。作為培養方法，可列舉利用添加有血清之培養基進行培養之血清培養、或利用未添加血清之培養基進行培養之無血清培養。培養方法並無特別限定，較佳為無血清培養。

關於血清培養，於培養基中添加血清之情形時較佳為牛血清。牛血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、成年牛血清等，只要適合細胞培養，則可使用任一者。另一方面，關於無血清培養，所使用之無血清培養基可使用市售之培養基。現市售有適合各種細胞之無血清培養基，例如對於CHO細胞，Invitrogen公司市售有CD-CHO、CHO-S-SFMII、CHO-III-PFM，Irvine Scientific公司市售有IS CHO、IS CHO-CD培養基等。該等培養基可直接、改良或添加補充品而使用。進而，作為無血清培養基，例示有以分別成為5 mg/L之方式添加有胰島素、轉鐵蛋白、及亞硒酸之DMEM培養基。如此，只要為可產生本實施形態之凝血酶調節素之培養基，則無特別限定。培養方法無特別限定，可為批式培養、反覆批式培養、饋料批式培養、灌注培養等培養法。

於藉由上述細胞培養方法製造可溶性凝血酶調節素之情形時，有時會因蛋白質之翻譯後修飾，而於N末端胺基酸中可見多樣性。例如序列編號9中之第17位、第18位、第19位、或第22位之胺基酸有時會成為N末端。又，例如有時會以第22位之麩胺酸變換為焦麩胺酸之方式修飾N末端胺基酸。較佳為第17位或第19位之胺基酸成為N末端，更佳為第19位之胺基酸成為N末端。又，亦有第17位之胺基酸成為N末端時較佳之其他態樣。關於以上之修飾或多樣性等，對於序列編號11亦可列舉相同之例。

進而，於使用具有序列編號10之鹼基序列之DNA來製造可溶性凝血酶調節素之情形時，有時可見C末端胺基酸之多樣性，有時會製造出短缺1個胺基酸殘基之肽。即，有時會以第515位之胺基酸成為C末端，進而該第515位發生醯胺化之方式修飾C末端胺基酸。又，有時亦會製造出短缺2個胺基酸殘基之肽。即，有時第514位之胺基酸成為C末端。因此，有時會製造出N末端胺基酸與C末端胺基酸之多樣性豐富之肽、或該等之混合物。較佳為第515位之胺基酸或第516位之胺基酸成為C末端，更佳為第516位之胺基酸成為C末端。又，亦有第514位之胺基酸成為C末端時較佳之其他態樣。關於以上之修飾或多樣性等，對於具有序列編號12之鹼基序列之DNA亦相同。

藉由上述方法獲得之凝血酶調節素有時為N末端及C末端可見多樣性之肽之混合物。具體而言，可列舉包含序列編號9中之第19位~第516位、第19位~第515位、第19位~第514位、第17位~第516位、第17位~第515位、或第17位~第514位之序列之肽之混合物。

根據本發明，可提供一種降低HCP之混入之高純度可溶性凝血酶調節素。

作為本實施形態之高純度可溶性凝血酶調節素，可列舉實質上不含有可溶性凝血酶調節素以外之蛋白質之較高純度之可溶性凝血酶調節素。具體而言，例如可列舉實質上不含有HCP之可溶性凝血酶調節素。較佳可列舉實質上不含有HCP、小鼠IgG、及牛血清蛋白質之可溶性凝血酶調節素。

本實施形態之高純度可溶性凝血酶調節素不含有源自人類之蛋白質。

HCP之含量只要為實質上不含有HCP之狀態，則無特別限定，相對於10,000 U可溶性凝血酶調節素，HCP較佳為未達10 ng之比率，更佳為未達8 ng之比率，更佳為未達7 ng之比率，尤佳為未達6 ng之比率，尤佳為未達5 ng之比率。認為本實施形態之高純度可溶性凝血酶調節素係由將包含編碼可溶性凝血酶調節素之鹼基序列之DNA轉染至宿主細胞而獲得之轉形細胞所產生，且無論如何純化，現實中均會混入痕量程度之HCP。HCP之含量越低越好，例如作為HCP之含量之下限，可例示相對於10,000 U可溶性凝血酶調節素HCP而為0.001 ng之比率。

小鼠IgG之含量只要為實質上不含有小鼠IgG之狀態，則無特別限定，相對於10,000 U可溶性凝血酶調節素，小鼠IgG較佳為未達10 ng之比率，更佳為未達2 ng之比率，更佳為未達0.6 ng之比率。

牛血清蛋白質之含量只要為實質上不含有牛血清蛋白質之狀態，則無特別限定，相對於10,000 U可溶性凝血酶調節素，較佳為未達10 ng之比率，更佳為未達2 ng之比率，更佳為未達0.6 ng之比率。該等蛋白質濃度較佳為藉由ELISA法進行測定，可參考生化學實驗法11酶免疫分析法東京化學同人(1992年)等進行測定。

又，作為本實施形態之高純度可溶性凝血酶調節素於總蛋白質中之純度，於HPLC法中，較佳為99%以上，更佳為99.5%以上，更佳為99.7%以上，尤佳為99.9%以上之純度。HPLC法中之層析法只要為可測定可溶性凝血酶調節素之純度者，則無限定，可例示凝膠過濾液相層析法、離子更換液相層析法及逆相液相層析法等，較佳為凝膠過濾液相層析法。於使用凝膠過濾液相層析法之情形時，所使用之管柱可根據可溶性凝血酶調節素之分子量進行選擇，例如可列舉使用TOSOH TSKgel G3000SWXL(日本、東曹)並利用pH值7.3之磷酸鹽緩衝液進行展開之方法。依據日本藥典之液相層析法<2.01>實施試驗即可。

進而，本實施形態之高純度可溶性凝血酶調節素中，相對於可溶性凝血酶調節素10,000U，源自宿主之DNA成分較佳為未達2 ng之比率，更佳為未達0.2 ng之比率，更佳為未達0.02 ng之比率。DNA量之測定只要使用Threshold System(美國、Molecular Devices)則可容易地測定。

本實施形態之高純度可溶性凝血酶調節素中，只要HCP之含量相對於該可溶性凝血酶調節素10,000 U而未達10 ng之比率，則其形態無特別限定，可以溶液或粉末之形態存在。較佳為以溶液之形態存在。又，亦有以粉末之形態存在時較佳之其他態樣。作為以溶液狀態存在之情形時之濃度，上限較佳為100 mg/mL以下，更佳為60 mg/mL以下，更佳為30 mg/mL以下，尤佳為15 mg/mL以下，下限較佳為2 mg/mL以上，更佳為4 mg/mL以上，更佳為6 mg/mL以上，尤佳為8 mg/mL以上，最佳為10 mg/mL以上。又，於以粉末之形態存在之情形時，作為較佳例，可列舉冷凍乾燥之形態。冷凍乾燥體可參考WO03/061687中記載之方法而獲得。

本實施形態之高純度可溶性凝血酶調節素可以實質上不含有內毒素者之形式獲得。作為內毒素含量，相對於可溶性凝血酶調節素10,000 U，較佳為未達1 EU(內毒素單位)，更佳為未達0.2 EU，更佳為未達0.04 EU。內毒素量可依據日本藥典一般試驗法之內毒素試驗法<4.01>進行測定。又，本實施形態之高純度可溶性凝血酶調節素由於係以不含有TFA(Trifluoroacetic Acid，三氟乙酸)等對生物有害之物質，而以接近無菌之狀態獲得，故而可用作醫藥品之原料。

本實施形態之降低HCP之混入之高純度可溶性凝血酶調節素可藉由使含有可溶性凝血酶調節素之溶液與尼龍及/或聚醚碸接觸而獲得，較佳為使用尼龍。又，亦有使用聚醚碸較佳之其他態樣。

作為接觸含有本實施形態之可溶性凝血酶調節素之溶液的尼龍，可列舉含有脂肪族骨架之聚醯胺，例如可例示尼龍6、尼龍66、尼龍46、或尼龍MXD6。只要為吸附HCP者，則其種類無限定，較佳為尼龍6。作為尼龍，例如可購買Sartorius公司銷售之Minisart NY。關於尼龍之形態，只要為膜狀、不織布、珠狀等可接觸溶液之形態，則無特別限定，較佳為成型為膜狀而用作過濾膜。此情形時之過濾膜之孔徑只要為可通過HCP之大小，則無限定，可例示0.01~10 μm，較佳為0.1~1 μm，更佳為0.01~0.06 μm。與尼龍接觸之含有可溶性凝血酶調節素之溶液之量可藉由預先使一部分溶液接觸少量尼龍，並評價HCP之去除能力而容易地確定。

本實施形態之高純度可溶性凝血酶調節素之獲得可一邊確認使含有HCP之含有可溶性凝血酶調節素之溶液與尼龍接觸後之溶液中之HCP含量相對於可溶性凝血酶調節素10,000 U成為未達10 ng之比率一邊進行，於HCP含量相對於可溶性凝血酶調節素10,000 U成為10 ng以上時停止獲得，或將使用中之尼龍更換為未使用者並重新開始獲得高純度可溶性凝血酶調節素。若例示HCP量與尼龍之量的關係，例如於尼龍為過濾膜之情形時，相對於1 mg之HCP之膜面積，上限可例示50 m²以下，較佳為5 m²以下，更佳為0.5 m²以下，更佳為0.1 m²以下，下限較佳為0.01 m²以上，更佳為0.02 m²以上，更佳為0.03 m²以上。重要的是根據欲降低之HCP量來設定膜面積。

接觸含有本實施形態之可溶性凝血酶調節素之溶液的聚醚碸，例如可購買Sartorius公司銷售之Minisart High-Flow。關於聚醚碸之形態，只要為膜狀、不織布、珠狀等可接觸溶液之形態，則無特別限定，較佳為成型為膜狀而用作過濾膜。此情形時之過濾膜之孔徑只要為可通過HCP之大小，則無限定，可例示0.01~10 μm，較佳為0.1~1 μm，更佳為0.01~0.06 μm。含有與聚醚碸接觸之可溶性凝血酶調節素之溶液之量可藉由預先使一部分溶液與少量聚醚碸接觸並評價HCP之去除能力而容易地確定。

本實施形態之高純度可溶性凝血酶調節素之獲得可一邊確認使含有HCP之含有可溶性凝血酶調節素之溶液接觸聚醚碸後之溶液中之HCP含量相對於可溶性凝血酶調節素10,000 U成為未達10 ng之比率一邊進行，於HCP含量相對於可溶性凝血酶調節素10,000 U成為10 ng以上時停止獲得，或將使用中之聚醚碸更換為未使用者並重新開始獲得高純度可溶性凝血酶調節素。若例示HCP量與聚醚碸之量之關係，例如於聚醚碸為過濾膜之情形時，相對於1 mg之HCP之膜面積，上限可例示50 m²以下，較佳為5 m²以下，更佳為0.5 m²以下，下限較佳為0.02 m²以上，更佳為0.03 m²以上，更佳為0.05 m²以上。重要的是根據欲降低之HCP量來設定膜面積。

本實施形態之降低HCP之混入之高純度可溶性凝血酶調節素之製造步驟包括使含有可溶性凝血酶調節素之溶液與尼龍及/或聚醚碸接觸之步驟，只要使HCP含量相對於該可溶性凝血酶調節素10,000 U成為未達10 ng之比率，則無特別限定，可例示以下之製造步驟。

包括使含有可溶性凝血酶調節素之溶液與尼龍及/或聚醚碸接觸之步驟的包含(a)~(g)之製造步驟。(a)培養轉形細胞並回收培養液(生產液)之步驟、(b)過濾生產液而獲得過濾後之生產液之步驟、(c)將過濾後之生產液供於陰離子交換管柱層析而獲得粗純化液之步驟、(d)將粗純化液供於承載有抗凝血酶調節素單株抗體之親和管柱層析而獲得純化液1之步驟、(e)將純化液1供於陽離子更換管柱層析步驟中獲得純化液2之步驟、(f)將濃縮之純化液2供於凝膠過濾管柱層析對該溶出液進行濃縮而獲得純化液3之步驟、及(g)利用病毒去除膜及無菌過濾膜過濾純化液3之步驟。

於上述製造步驟中，使含有可溶性凝血酶調節素之溶液接觸尼龍及/或聚醚碸之步驟可包含於(b)~(g)中之任一步驟、或複數個步驟中，較佳為包含於(d)~(g)中之任一步驟、或複數個步驟中。為了有效地去除HCP，極佳為於製造步驟之最後步驟、即(g)之後加入與尼龍及/或聚醚碸接觸之步驟。

又，為了使牛血清蛋白質之混入成為0，(a)之轉形細胞之培養更佳為無血清培養。

進而，作為本實施形態之降低HCP之混入之高純度可溶性凝血酶調節素之製造步驟，可列舉以下所示之製造步驟。

包括使含有可溶性凝血酶調節素之溶液與尼龍及/或聚醚碸接觸之步驟的包含(a)~(g)之製造步驟。(a)培養轉形細胞並回收培養液(生產液)之步驟、(b)過濾生產液而獲得過濾後之生產液之步驟、(c)將過濾後之生產液供於陰離子更換管柱層析而獲得粗純化液1之步驟、(d)將粗純化液1供於疏水管柱層析而獲得粗純化液2之步驟、(e)將粗純化液2供於承載有抗凝血酶調節素單株抗體之親和管柱層析而獲得純化液1之步驟、(f)將濃縮之純化液1供於凝膠過濾管柱層析而獲得純化液2之步驟、及(g)利用無菌過濾膜過濾純化液2之步驟。

於上述製造步驟中，使含有可溶性凝血酶調節素之溶液與尼龍及/或聚醚碸接觸之步驟可包含於(b)~(g)中之任一步驟、或複數個步驟中，較佳為包含於(e)~(g)中之任一步驟、或複數個步驟中。為了有效地去除HCP，有時亦較佳為於製造步驟之最後步驟、即(g)之後加入與尼龍及/或聚醚碸接觸之步驟。

本實施形態之高純度可溶性凝血酶調節素之獲得可一邊確認使含有HCP之含有可溶性凝血酶調節素之溶液與尼龍及/或聚醚碸接觸後之溶液中之HCP含量相對於可溶性凝血酶調節素10,000 U成為未達10 ng之比率一邊進行，於HCP含量相對於可溶性凝血酶調節素10,000 U成為10 ng以上時停止獲得，或將使用中之尼龍及/或聚醚碸更換為未使用者並重新開始獲得高純度可溶性凝血酶調節素。又，如上述般，本實施形態之降低HCP之混入之高純度可溶性凝血酶調節素之製造步驟包括使含有可溶性凝血酶調節素之溶液與尼龍及/或聚醚碸接觸之步驟，只要使HCP含量相對於該可溶性凝血酶調節素10,000 U成為未達10 ng之比率，則無特別限定。即，可於與尼龍及/或聚醚碸接觸之步驟後存在純化步驟，只要結果獲得HCP之含有率相對於可溶性凝血酶調節素10,000 U而為未達10 ng之比率之高純度可溶性凝血酶調節素即可。

作為可於與尼龍及/或聚醚碸接觸之步驟後存在之純化步驟，可列舉：陰離子交換管柱層析、親和管柱層析、陽離子交換管柱層析、凝膠過濾管柱層析、或疏水管柱層析等管柱層析步驟，膜濃縮步驟，去除病毒、無菌過濾等膜過濾步驟，或該等2種以上之組合，較佳為陽離子交換管柱層析、凝膠過濾管柱層析、膜濃縮、去除病毒、無菌過濾、或該等2種以上之組合。有時於與尼龍及/或聚醚碸接觸之步驟後較佳為存在陽離子交換管柱層析、凝膠過濾管柱層析、膜濃縮、去除病毒、及無菌過濾。又，於與尼龍及/或聚醚碸接觸之步驟後，陽離子交換管柱層析、凝膠過濾管柱層析、膜濃縮、去除病毒、及無菌過濾之純化步驟更佳可列舉以陽離子更換管柱層析、膜濃縮、凝膠過濾管柱層析、膜濃縮、去除病毒、及無菌過濾之順序存在。再者，作為陽離子交換管柱層析，可例示SP Sepharose Fast Flow、DEAE Sepharose Fast Flow、Capto S、Capto DEAE(GE healthcare公司)、S HyperCel(Pall公司)、TOYOPEARL GigaCap S-650(東曹公司)，較佳為SP Sepharose Fast Flow。作為濃縮膜，可例示MICROZA UF(旭化成化學公司)、Kvick Flow 10KD(GE healthcare公司)、Pellicon 2(Millipore公司)，較佳為MICROZA UF。作為凝膠過濾管柱層析，可例示Sephacryl S-300 HR、Superose 12 pg(GE healthcare公司)、TOYOPEARL HW(東曹)，較佳為Sephacryl S-300 HR。作為去除病毒膜，可例示PLANOVA 15N(旭化成醫療器材)、Biresolve NFP(Millipore公司)、Ultipor VF(Pall公司)，較佳為PLANOVA 15N。作為無菌過濾膜，可例示Millipak、Millidisk(Millipore公司)、Supore EVA(Pall公司)、Sartopore 2(Sartorius Stedim公司)，較佳為Millipak。

如此，藉由使本實施形態之含有可溶性凝血酶調節素之溶液與尼龍及/或聚醚碸接觸而獲得之高純度可溶性凝血酶調節素係含有相對於可溶性凝血酶調節素10,000 U而為未達10 ng之比率之HCP者。

本實施形態之可溶性凝血酶調節素1 U係定義為藉由以蛋白質C之活性化作為指標之APC分析於1分鐘內產生0.1 μmol之對硝基苯胺的量，其係依據Biologicals(2002)30、69-76中記載之方法，藉由包括以下步驟之方法進行測定。(a)於含有可溶性凝血酶調節素之受檢溶液中添加人類凝血酶並進行加溫之步驟、(b)添加人類蛋白質C並進行加溫之步驟、(c)添加肝素-抗凝血酶III並進行加溫之步驟、(d)添加合成受質S-2366(pyroGlu-Pro-Arg-pNA‧HCl)並進行加溫之步驟、(e)添加乙酸而停止受質切斷反應之步驟、(f)測定405 nm下之吸光度之步驟、及(g)依據下式測定含有可溶性凝血酶調節素之受檢溶液之活性的步驟。

[數1]

A_sample：試料溶液之吸光度

A_blank：對照(水)之吸光度

M：對硝基苯胺之莫耳吸光係數9.6×10^-3[1/μM]

V₁：測定吸光度時之液量　(L)

V₂：試料溶液之液量　(mL)

T：受質切斷反應時間　(分鐘)

k：由凝血酶調節素1 U生成之活性化蛋白質C游離之對硝基苯胺之莫耳數　0.1(μmol/分鐘/U)

關於本實施形態之高純度可溶性凝血酶調節素，每1 mg蛋白質可例示具有3,000 U之活性，較佳為4,000 U~9,000 U，更佳為5,000 U~8,000 U，更佳為6,000 U~7,000 U。蛋白質濃度可將牛血清白蛋白作為標準品，依據公知之蛋白濃度測定法進行測定。例如可例示Lowry法、Bradford法、BCA(Bicinchoninic acid，二喹啉甲酸)法等。

本實施形態之高純度可溶性凝血酶調節素之HCP含量係藉由至少包括以下步驟之方法進行測定。(a)對包含編碼可溶性凝血酶調節素之鹼基序列之DNA轉染至宿主細胞而獲得之轉形細胞、或此宿主細胞中之任一者進行無血清培養，並由所獲得之培養上清液製備源自宿主細胞之蛋白質之步驟，(b)自利用上述(a)之源自該宿主細胞之蛋白質對兔子致敏而獲得之抗血清中純化源自抗宿主細胞之蛋白質抗體之步驟，構建包括下述(c1)~(c6)之測定系之步驟，(c1)使上述(b)之源自該抗宿主細胞之蛋白質抗體吸附至固相上之步驟，(c2-1)使吸附有源自該抗宿主細胞之蛋白質抗體之該固相接觸懷疑混入源自該宿主細胞之蛋白質的含有可溶性凝血酶調節素之受檢溶液之步驟，及使吸附有源自該抗宿主細胞之蛋白質抗體之該固相接觸已知濃度之含有源自宿主細胞之蛋白質之溶液之步驟，(c3)於該固相中添加生物素化之源自抗宿主細胞之蛋白質抗體之步驟，(c4)於該固相中添加抗生物素蛋白化之過氧化酶溶液之步驟，(c5)添加酶受質溶液進行顯色之步驟，及(c6)停止顯色，測定其吸光度之步驟，(d)利用上述測定系測定懷疑混入源自該宿主細胞之蛋白質的含有可溶性凝血酶調節素之受檢溶液的源自宿主細胞之蛋白質濃度，含有該可溶性凝血酶調節素之受檢溶液之源自宿主細胞之蛋白質濃度係藉由利用上述測定系並使用已知濃度之含有源自宿主細胞之蛋白質之溶液進行測定，而判斷是否處於預先確認之上述測定系之可測定範圍內之步驟，(e-1)於上述(d)中，於懷疑混入源自該宿主細胞之蛋白質的含有可溶性凝血酶調節素之受檢溶液中之源自宿主細胞之蛋白質濃度處於可測定範圍內之情形時，將該濃度設為源自該宿主細胞之蛋白質濃度之步驟，(e-2-1)於上述(d)中，於懷疑混入源自該宿主細胞之蛋白質的含有可溶性凝血酶調節素之受檢溶液中之源自宿主細胞之蛋白質濃度不在可測定範圍內之情形時，為了成為處於上述測定系之可測定範圍內之可測定濃度，視需要濃縮或稀釋含有可溶性凝血酶調節素之受檢溶液，並記錄其濃縮率或稀釋率之步驟，(e-2-2)利用將上述(c1)~(c6)所示之測定系中之(c2-1)換為以下所示之(c2-2)之測定系，測定於上述(e-2-1)中經濃縮或稀釋之含有可溶性凝血酶調節素之受檢溶液中之源自宿主細胞之蛋白質濃度，考慮濃縮率或稀釋率而求出源自該宿主細胞之蛋白質濃度之步驟，(c2-2)使吸附有源自該抗宿主細胞之蛋白質抗體之該固相接觸視需要進行濃縮或稀釋之含有可溶性凝血酶調節素之受檢溶液之步驟，及使吸附有源自該抗宿主細胞之蛋白質抗體之該固相接觸已知濃度之含有源自宿主細胞之蛋白質之溶液之步驟，及(f)算出(e-1)或(e-2-2)所求得之源自宿主細胞之蛋白質濃度相對於另行測定之含有可溶性凝血酶調節素之受檢溶液每單位體積之凝血酶調節素之APC活性的比例之步驟。

於本說明書中，HCP係源自製作產生可溶性凝血酶調節素之基因重組細胞時所使用之宿主細胞的蛋白質，不包括可溶性凝血酶調節素。HCP可由培養與包含對凝血酶調節素編碼之鹼基序列之DNA之轉染所使用者相同種類之宿主細胞而獲得之培養上清液而製備。所謂相同種類之宿主細胞，例如於為CHO細胞之情形時，表示包括CHO-K1株(ATCC號CCL-61)、CHO-S株(美國、Invitrogen目錄號11619-012)、CHO-DXB11、CHO-DG44株(美國、Invitrogen目錄號12610-010)等分類為CHO細胞之株的概念，只要為分類為CHO細胞者，則可使用任一種株進行製備。就CHO細胞而言，作為相同種類之宿主細胞，較佳為使用DXB11株或CHO-K1株，更佳為使用DXB11株。又，亦有使用CHO-K1株較佳之其他態樣。

HCP係源自製作產生可溶性凝血酶調節素之基因重組細胞時所使用之宿主細胞的蛋白質，係定義為藉由至少包括上述(a)~(f)之步驟之方法所測定者，作為HCP之構成要素，如試驗例6所示可列舉組織蛋白H2B(Biochimie,61(1),61-69(1979))。

又，於將包含對凝血酶調節素編碼之鹼基序列之DNA轉染至相同種類之宿主細胞中，並由培養所獲得之轉形細胞而獲得之培養上清液進行製備之情形時，將該培養上清液供於以與凝血酶調節素特異性結合之抗體作為配體之抗體柱，並回收非吸附組分即可。該非吸附組分可於確認未檢測出凝血酶調節素之APC活性後，用作HCP。HCP較佳為視需要利用超濾膜進行濃縮。再者，關於培養宿主細胞或轉形細胞時所使用之培養基，為了避免混入其他蛋白質，較佳為無血清培養基，更佳為無血清培養基為無蛋白質培養基。由利用HCP對兔子致敏而獲得之抗HCP抗血清純化抗HCP抗體，可利用管柱層析，進而可例示硫酸銨鹽析法及管柱層析之組合。抗HCP抗體純化中之管柱層析較佳為使用蛋白質A管柱。亦有如下情況較佳之其他態樣：於製備HCP時，於使用將包含編碼凝血酶調節素之鹼基序列之DNA轉染至宿主細胞而獲得之轉形細胞之情形時，於純化抗HCP抗體時，利用蛋白質A管柱純化後使用凝血酶調節素管柱，獲得其非吸附組分而作為抗HCP抗體。

於構建HCP濃度測定系時，需明確其可定量之範圍，只要可測定每10,000 U凝血酶調節素之HCP含量未達10 ng，則可定量之範圍並無限定，可測定之濃度越低越好。作為可定量之範圍，下限可例示100 ng/mL以上，較佳為50ng/mL以上，更佳為25 ng/mL以上，上限可例示500 ng/mL。

於濃縮受驗溶液之情形時，可依據通常之蛋白質濃縮法，並無特別限定，較佳為利用超濾膜之濃縮。又，亦有藉由於冷凍乾燥後以少量水或緩衝液進行溶解而濃縮之方法較佳之其他態樣。再者，藉由進行濃縮，HCP以外之成分亦被濃縮，此情況存在影響HCP測定系之可能性，因此受檢溶液需濃縮至不會影響HCP測定系之範圍內。例如作為不會影響HCP測定系之含有可溶性凝血酶調節素之受檢溶液濃度之範圍之上限，可列舉5 mg/mL。

每10,000 U凝血酶調節素之HCP含量係依據下式算出。

a/b×10,000

a：每1 mL試料之HCP含量(ng/mL)

b：每1 mL試料之凝血酶調節素之APC活性(U/mL)

本實施形態之高純度可溶性凝血酶調節素係促進該凝血酶對蛋白質C之活性化，而大量產生顯示抗血液凝固作用與血栓溶解作用之活性型蛋白質C者。因此，本實施形態之高純度可溶性凝血酶調節素係大為有助於生物體之抗血液凝固及血栓溶解者。由於本實施形態之高純度可溶性凝血酶調節素具有抗血液凝固作用與血小板凝聚抑制作用及血栓溶解作用，故而可用作用以控制血液凝固、或用以控制血小板凝聚之醫藥組合物，具體而言，例如可用於心肌梗塞、血栓症、塞栓症、周邊血管閉塞、閉塞性動脈硬化症、血管內血液凝固症候群(DIC)、心絞痛、短暫性腦缺血發作、妊娠中毒症等疾病之治療及預防。

於製備本實施形態之醫藥組合物時，將本實施形態之高純度可溶性凝血酶調節素、與藥學上容許之載體混合即可。即，可將對治療或預防上述疾病有效之量之本實施形態之高純度可溶性凝血酶調節素與適當量之載體混合，而製備適合有效地投予患者之醫藥組合物。作為本實施形態之醫藥組合物，較佳為製成經冷凍乾燥之製劑。又，本實施形態之醫藥組合物較佳為製成血管內注射用製劑而使用。進而，較佳為製成點滴靜注用製劑。再者，於製造冷凍乾燥製劑時，可參考WO03/061687中記載之方法而進行。

於製成注射劑而使用之情形時，上述載體較佳為可製成藥劑進行投予且可溶解於生理鹽水或葡萄糖注射液之載體，作為該載體，可例示選自由蔗糖、純化明膠、白蛋白、甘露醇、葡萄糖及氯化鈉所組成之群中之1種以上，又，作為較佳例亦可列舉添加各種無機鹽之pH值調整劑等，於此情形時與本實施形態之高純度可溶性凝血酶調節素之組合中，醫藥組合物整體為可溶性，且可充分地冷凍乾燥，故而較佳。又，於本實施形態中，上述載體亦較佳為甘油。上述載體較佳為於製備製劑時添加，亦容許於使用時於溶解時進行添加。

本實施形態之高純度可溶性凝血酶調節素之成人每1次之投予量根據年齡、性別、體重、症狀等而有所不同，通常約為0.1~200 mg，1天1次或視需要數次，例如可例示藉由血管內注射、較佳為點滴靜注進行投予之方法。關於本實施形態之醫藥組合物，亦可以作為有效成分之可溶性凝血酶調節素換算計成為0.1~200 mg之方式1天1次或視需要數次，藉由例如血管內注射、較佳為點滴靜注進行投予。

實施例

根據以下之實施例，對本發明進行更具體地說明，但本發明之範圍並不受該等實施例之任何限制。

(參考例1)凝血酶調節素之APC活性之測定方法

依據Biologicals(2002)30,69-76，測定將蛋白質C之活性化作為指標之凝血酶調節素之APC活性。

於20 mM氯化鈣溶液75 μL中添加以含有0.05%聚山梨酸酯20之tris-咪唑緩衝液稀釋之試料溶液25 μL，冰冷後，添加40 U/mL之人類凝血酶(美國、西格瑪)溶液25 μL並攪拌，以37℃進行加溫。自添加人類凝血酶溶液開始10分鐘後，添加12 U/mL之人類蛋白質C(美國、Enzyme Research)溶液25 μL並攪拌，以37℃進行加溫。自添加人類蛋白質C溶液開始10分鐘後，添加肝素-抗凝血酶III溶液100 μL並攪拌，以37℃進行加溫。自添加肝素-抗凝血酶III溶液開始10分鐘後，添加預先加溫至37℃之合成受質S-2366(瑞典、Chromogenix)溶液250 μL並攪拌，以37℃進行加溫。自添加受質溶液開始10分鐘後，添加50%乙酸1.5 mL並攪拌，以水作為對照測定405 nm下之吸光度。

凝血酶調節素之APC活性係依據下式算出。再者，凝血酶調節素1 U係定義為1分鐘產生0.1 μmol之對硝基苯胺之量。

[數2]

A_sample：試料溶液之吸光度

A_blank：對照(水)之吸光度

M：對硝基苯胺之莫耳吸光係數　9.6×10^-3[1/μM]

V₁：吸光度測定時之液量　2.0×10^-3(L)

V₂：試料溶液之液量　0.025(mL)

T：受質切斷反應時間　10(分鐘)

k：由凝血酶調節素1 U生成之活性化蛋白質C游離之對硝基苯胺之莫耳數0.1(μmol/分鐘/U)

再者，試劑如以下所述。

<tris-咪唑緩衝液>

於B液100 mL中添加A液將pH值調整為8.4，以水稀釋至10倍。

A液：將2-胺基-2-羥基甲基-1,3-丙二醇3.03 g及咪唑1.70 g溶解於1 M鹽酸50 mL中，加水製成100 mL，添加氯化鈉11.7 g並溶解。

B液：將2-胺基-2-羥基甲基-1,3-丙二醇4.04 g、咪唑2.27 g及氯化鈉1.95 g溶解於水中製成100 mL，添加氯化鈉11.7 g並溶解。

<20 mM氯化鈣溶液>

於60 mM氯化鈣溶液1 mL中添加tris-咪唑緩衝液2 mL。

<肝素-抗凝血酶III溶液>

添加2 U/mL之抗凝血酶III(日本、三菱製藥)溶液7.5 μL、tris-咪唑緩衝液42.5 μL及30 U/mL之肝素(日本、持田製藥)溶液50 μL並振搖混合。用時製備，進行冰冷直至即將使用前。

(參考例2)HCP濃度之測定方法

無血清培養導入有凝血酶調節素基因之基因重組CHO細胞。將培養上清液供於抗凝血酶調節素抗體柱而獲得非吸附組分。針對該非吸附組分，依據參考例1測定凝血酶調節素之APC活性，確認未檢測到活性之後，將以超濾膜濃縮者作為HCP。利用硫酸銨析及蛋白質A管柱純化以HCP作為抗原對兔子致敏而獲得之抗HCP抗血清後，供於以凝血酶調節素作為配體之親和管柱而獲得非吸附組分。如此，獲得不識別凝血酶調節素之兔抗HCP抗體。

以使預測之HCP濃度成為0~500 ng/mL之方式，以含有0.05%聚山梨酸酯80之PBS(Phosphate Buffered Saline，磷酸鹽緩衝液)進行稀釋，製成試料溶液。再者，於試料溶液之HCP濃度較低之情形時，使用超濾膜等進行濃縮直至適當之濃度為止。另外於HCP中添加含有0.05%聚山梨酸酯80之PBS，製備於其1 mL中含有500、400、300、200、100、50、25、及0 ng之8種溶液，作為標準溶液。

於聚苯乙烯製之96孔培養盤中，以100 μL/孔添加以碳酸鈉緩衝液稀釋之25 μg/mL之兔抗HCP抗體溶液後，於25℃下靜置約2小時。繼而，以250 μL之含有0.05%聚山梨酸酯80之PBS清洗各孔5次，各添加含有1%明膠之PBS 200 μL，於25℃下靜置約1小時。以250 μL之含有0.05%聚山梨酸酯80之PBS清洗各孔5次後，於各孔中添加100 μL之試料溶液及標準溶液，於25℃下靜置約16小時。繼而，以250 μL之含有0.05%聚山梨酸酯80之PBS清洗各孔5次後，分別添加100 μL生物素化之兔抗HCP抗體溶液，於25℃下靜置約2小時。以250 μL之含有0.05%聚山梨酸酯80之PBS清洗各孔5次後，分別添加100 μL抗生物素蛋白-過氧化酶溶液，於25℃下靜置約2小時。以250 μL之含有0.05%聚山梨酸酯80之PBS清洗各孔5次後，分別添加100 μL酶受質溶液，於室溫暗處靜置。若適度顯色，則分別添加50 μL之25%硫酸而停止反應，利用96孔培養盤用吸光度計(日本、Tecan Japan)測定492 nm下之吸光度。根據利用標準溶液獲得之校準曲線，求出試料1 mL中之HCP含量。再者，本測定法之測定極限之一例為25 ng/mL。視需要依據下式算出每10,000 U凝血酶調節素之HCP含量。

每10,000 U凝血酶調節素之HCP含量(ng/10,000 U)=a/b×10,000

a：每1 mL試料之HCP含量(ng/mL)

b：每1 mL試料之凝血酶調節素之APC活性(U/mL)

再者，試劑如下所述。

<碳酸鈉緩衝液>

無水碳酸鈉0.16 g及碳酸氫鈉0.29 g中添加水並溶解，製成100 mL。

<抗生物素蛋白-過氧化酶溶液>

以含有0.05%聚山梨酸酯80之PBS將結合有抗生物素蛋白D之辣根過氧化酶原液(美國、VECTOR LABORATORIES)稀釋至約30,000倍。

<酶受質溶液>

將鄰苯二胺二鹽酸鹽10 mg添加至檸檬酸-磷酸鹽緩衝液(將檸檬酸一水合物2.56 g及磷酸氫二鈉十二水合物9.12 g溶解於水中製成500 mL)20 mL中並溶解，於即將使用之前添加雙氧水10 μL。

(參考例3)小鼠IgG濃度之測定方法

利用硫酸銨析及蛋白質A管柱純化以小鼠IgG作為抗原對兔子致敏而獲得之抗小鼠IgG抗血清，而獲得兔抗小鼠IgG抗體。

以使預測之小鼠IgG濃度成為0~25 ng/mL之方式，以含有0.05%聚山梨酸酯80之PBS進行稀釋，製成試料溶液。再者，於試料溶液之IgG濃度較低之情形時，使用超濾膜等進行濃縮直至適當濃度為止。另外於小鼠IgG中添加含有0.05%聚山梨酸酯80之PBS，製備於其1 mL中含有25、20、15、10、5、2.5、1.25、0.63及0 ng之9種溶液，作為標準溶液。

於聚苯乙烯製之96孔培養盤中，以100 μL/孔添加以碳酸鈉緩衝液稀釋之1.5 μg/mL之兔抗小鼠IgG抗體溶液後，於25℃下靜置約2小時。繼而，以250 μL之含有0.05%聚山梨酸酯80之PBS清洗各孔5次，分別添加含有1%明膠之PBS 200 μL，於25℃下靜置約1小時。以250 μL之含有0.05%聚山梨酸酯80之PBS清洗各孔5次後，於各孔中添加100 μL之試料溶液及標準溶液，於25℃下靜置約16小時。繼而，以250 μL之含有0.05%聚山梨酸酯80之PBS清洗各孔5次後，分別添加100 μL生物素化之兔抗小鼠IgG抗體溶液，於25℃下靜置約2小時。以250 μL之含有0.05%聚山梨酸酯80之PBS清洗各孔5次後，分別添加100 μL抗生物素蛋白-過氧化酶溶液，於25℃下靜置約2小時。以250 μL之含有0.05%聚山梨酸酯80之PBS清洗各孔5次後，分別添加100 μL酶受質溶液，於室溫暗處靜置。若適度顯色，則分別添加50 μL之25%硫酸而停止反應，利用96孔培養盤用吸光度計(日本、Tecan Japan)測定492 nm下之吸光度。根據利用標準溶液獲得之校準曲線，求出試料1 mL中之小鼠IgG含量。本測定法之測定極限之一例為0.63 ng/mL。視需要依據下式算出每10,000 U凝血酶調節素之小鼠IgG含量。

每10,000 U凝血酶調節素之小鼠IgG含量(ng/10,000 U)=a/b×10,000

a：每1 mL試料之小鼠IgG含量(ng/mL)

b：每1 mL試料之凝血酶調節素之APC活性(U/mL)

再者，試劑如下所述。

<碳酸鈉緩衝液>

於無水碳酸鈉0.16 g及碳酸氫鈉0.29 g中添加水並溶解，製成100 mL。

<抗生物素蛋白-過氧化酶溶液>

<酶受質溶液>

(參考例4)牛血清蛋白質濃度之測定方法

利用硫酸銨析及蛋白質A管柱純化以牛血清作為抗原對兔子致敏而獲得之抗牛血清蛋白質抗血清，而獲得兔抗牛血清蛋白質抗體。

以使預測之牛血清蛋白質濃度成為0~25 ng/mL之方式，以含有0.05%聚山梨酸酯80之PBS進行稀釋，製成試料溶液。再者，於試料溶液之牛血清蛋白質濃度較低之情形時，使用超濾膜等進行濃縮直至適當濃度為止。另外於牛血清中添加含有0.05%聚山梨酸酯80之PBS，製備於其1 mL中含有25、20、15、10、5、2.5、1.25、及0 ng之8種溶液，作為標準溶液。

於聚苯乙烯製之96孔培養盤中，以100 μL/孔添加以碳酸鈉緩衝液稀釋之10 μg/mL之兔抗牛血清蛋白質抗體溶液後，於25℃下靜置約2小時。繼而，以250 μL之含有0.05%聚山梨酸酯80之PBS清洗各孔5次，分別添加含有1%明膠之PBS 200 μL，於25℃下靜置約1小時。以250 μL之含有0.05%聚山梨酸酯80之PBS清洗各孔5次後，於各孔中添加100 μL之試料溶液及標準溶液，於25℃下靜置約16小時。繼而，以250 μL之含有0.05%聚山梨酸酯80之PBS清洗各孔5次後，分別添加100 μL生物素化之兔抗牛血清蛋白質抗體溶液，於25℃下靜置約2小時。以250 μL之含有0.05%聚山梨酸酯80之PBS清洗各孔5次後，分別添加100 μL抗生物素蛋白-過氧化酶溶液，於25℃下靜置約2小時。以250 μL之含有0.05%聚山梨酸酯80之PBS清洗各孔5次後，分別添加100 μL酶受質溶液，於室溫暗處靜置。若適度顯色，則分別添加50 μL之25%硫酸而停止反應，利用96孔培養盤用吸光度計(日本、Tecan Japan)測定492 nm下之吸光度。根據利用標準溶液獲得之校準曲線，求出試料1 mL中之牛血清蛋白質含量。本測定法之測定極限之一例為1.25 ng/mL。視需要依據下式算出每10,000 U凝血酶調節素之牛血清蛋白質含量。

每10,000 U凝血酶調節素之牛血清蛋白質含量(ng/10,000 U)=a/b×10,000

a：每1 mL試料之牛血清蛋白質含量(ng/mL)

b：每1 mL試料之凝血酶調節素之APC活性(U/mL)

再者，試劑如下所述。

<碳酸鈉緩衝液>

<抗生物素蛋白-過氧化酶溶液>

<酶受質溶液>

(比較例1)可溶性凝血酶調節素之製造1

依據日本專利特開平11-341990號公報之實施例1，製作利用基因操作技術組入編碼序列編號9中記載之胺基酸序列之DNA的基因重組CHO細胞後，接種於含有150 mg/L之L-脯胺酸(日本、Ajinomoto)、60 mg/L之康微素硫酸鹽(日本、明治製果)、1 mg/L之酒石酸泰樂菌素(日本、Mercian)、及10%牛血清(美國、Hyclone)之DMEM培養基(美國、Invitrogen)中，於CO₂培養箱內以37℃進行培養。離心分離培養液，將所獲得之細胞懸浮於含有150 mg/L之L-脯胺酸(日本、Ajinomoto)、60 mg/L之康微素硫酸鹽(日本、明治製果)、1 mg/L之酒石酸泰樂菌素(日本、Mercian)、10%二甲基亞碸(德國、Merck)、及10%牛血清(美國、Hyclone)之DMEM培養基(美國、Invitrogen)中，分注至小瓶中(4×10⁷ cells/瓶)，於液氮中冷凍保存。

將日本專利特開平11-341990號公報之成分表2所示之培養基之NaHCO₃濃度改變為5,700 mg/L，將NaCl濃度改變為2,410 mg/L者作為基本培養基進行細胞培養。增殖培養基係於基本培養基中添加60 mg/L之康微素硫酸鹽(美國、Invitrogen)、1 mg/L之酒石酸泰樂菌素(美國、Sigma-Aldrich)、及8%牛血清(美國、Hyclone)而使用。又，生產培養基係將增殖培養基之血清濃度設為3%。

熔融1瓶細胞小瓶，將其細胞接種於100 mL之增殖培養基中，於CO₂培養箱內、使用旋轉瓶以37℃攪拌培養5天。於活細胞密度成為7.0×10⁵ cells/mL以上時，將培養液全量於0.9 L之增殖培養基中繼代培養，於CO₂培養箱內、使用旋轉瓶以37℃攪拌培養5天。於活細胞密度成為7.0×10⁵ cells/mL以上時，將培養液全量於9 L之增殖培養基中繼代培養，使用培養槽以37℃、pH值7.2、溶氧50%之條件攪拌培養5天。於活細胞密度成為7.0×10⁵ cells/m L以上時，將培養液全量於120 L之增殖培養基中繼代培養，使用灌注培養槽以37℃、pH值7.2、溶氧50%之條件攪拌培養7天。於活細胞密度成為7.0×10⁵ cells/mL以上時，開始連續地進行生產培養基之添加與培養上清液之回收之灌注培養。培養條件設為37℃、pH值7.2、溶氧50%、培養基更換130~200 L/天、上面加壓0~0.2 MPa。自活細胞密度達到7.5×10⁶ cells/mL開始繼續培養36天，將培養上清液作為生產液而回收。回收之生產液係使用作為過濾器之SupradiskII(美國、Pall)、及Supor EBV(美國、Pall)而澄清化，作為過濾後生產液於2~10℃下保存。

將約700L之過濾後生產液供於以含有150 mM氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.7)平衡化之Q-Sepharose Fast Flow(美國、GE healthcare)管柱(直徑63 cm、高度25 cm)。繼而，以6管柱容積(CV)之含有180 mM氯化鈉之20 mM乙酸緩衝液(pH值5.5)進行清洗，進而以含有180 mM氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.7)進行清洗，直至280 nm下之吸收返回至基線為止，以含有300 mM氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.7)開始溶出，獲得自溶出液之吸光度280 nm之波峰立起開始之0.5管柱容積容量之溶出液作為粗純化液。反覆實施6次相同操作，獲得6批次之粗純化液。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為109 L/小時之條件下實施。

依據日本專利特開平11-341990號公報之實施例10，製作以源自人肺之凝血酶調節素作為抗原之抗凝血酶調節素單株抗體，使其與CNBr-activated Sepharose 4Fast Flow(美國、GE healthcare)接觸反應，偶合抗凝血酶調節素單株抗體，製作結合有抗凝血酶調節素單株抗體之Sepharose 4Fast Flow，填充至管柱中作為單株抗體柱。將約40 L之粗純化液供於以含有0.3 M氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)平衡化之單株抗體柱(直徑44 cm、高度13 cm)。流入6 CV之含有1.0 M氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)，進而流入3 CV之0.1 M乙酸緩衝液(pH值5.0)而進行清洗，以含有0.3 M氯化鈉之0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值3.0)開始溶出。獲得自溶出液之吸光度280 nm之波峰立起開始至下降為止之溶出液，於溶出液中添加1/10容量之0.5 M磷酸緩衝液(pH值7.3)獲得純化液1。反覆實施6次相同操作，獲得6批次之純化液1。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為46 L/小時之條件下實施。

以1.0 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值2.0)將6批次分之純化液1約170 L製備為pH值3.5，供於以含有0.3 M之NaCl之0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值3.5)平衡化之SP-SepharoseFF(美國GE healthcare bioscience)管柱(直徑45 cm、高度10 cm)。以含有0.3 M之NaCl之0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值3.5)開始清洗，獲得自吸光度280 nm之波峰立起開始至下降為止之流過液，立刻以0.5 M磷酸緩衝液(pH值7.3)中和至pH值7，獲得純化液2。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為160 L/小時之條件下實施。

利用超濾膜之Microza UF Module SIP-2013(日本、旭化成化學)將約200 L之純化液2濃縮直至約10 L為止後，供於以含有50 mM氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)平衡化之Sephacryl S-300 HR(美國GE healthcare bioscience)管柱(直徑63 cm、高度94 cm)。於獲得280 nm下之吸收最大之溶出波峰後，利用超濾膜之Microza UF Module SIP-1013(日本、旭化成化學)濃縮至約12 L為止，獲得純化液3。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為6.2 L/小時之條件下實施。

於室溫下，於壓力0.1 MPa以下，將純化液3通入以含有50 mM氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)平衡化之去除病毒膜之PLANOVA 15N(日本、旭化成醫療器材、膜面積1 m²)後，進而通入0.22 μm之PVDF(Polyvinylidene Fluoride，聚偏二氟乙烯)製之過濾膜(美國、Millipore)，回收全量。將其作為可溶性凝血酶調節素純化品。

藉由相同操作，獲得3批次(A1、A2、A3)之純化品。

A1、A2、A3之凝血酶調節素之APC活性分別為69000 U/mL、68000 U/mL、72000 U/mL。

A1、A2、A3之溶液中之可溶性凝血酶調節素濃度分別為10.5 mg/mL、10.2 mg/mL、10.3 mg/mL。

(比較例2)可溶性凝血酶調節素之製造2

將日本專利特開平11-341990號公報之成分表2所示之培養基用作基本培養基。增殖培養基係於基本培養基中添加60 mg/L之康微素硫酸鹽(美國、Invitrogen)、1 mg/L之酒石酸泰樂菌素(日本、鹽野義製藥)、及8%牛血清(美國、Hyclone)而使用。又，生產培養基係將增殖培養基之血清濃度設為4%。

熔融比較例1中製作之1瓶細胞小瓶，將該細胞接種於100 mL之增殖培養基中，於CO₂培養箱內、使用旋轉瓶以37℃攪拌培養3天。於活細胞密度成為5.0×10⁵ cells/mL以上時，將培養液全量於400 mL之增殖培養基中繼代培養，於CO₂培養箱內、使用旋轉瓶以37℃攪拌培養3天。於活細胞密度成為5.0×10⁵ cells/mL以上時，將培養液全量於2 L之增殖培養基中繼代培養，於CO₂培養箱內、使用球形瓶子以37℃攪拌培養3天。於活細胞密度成為5.0×10⁵ cells/mL以上時，將培養液全量於7.5 L之增殖培養基中繼代培養，於CO₂培養箱內、使用球形瓶子以37℃攪拌培養4天。於活細胞密度成為5.0×10⁵ cells/mL以上時，開始連續地進行生產培養基之添加與培養上清液之回收之灌注培養。培養條件設為37℃、pH值7.2、溶氧50%、培養基更換10 L/天、上面加壓0~0.2 MPa。自活細胞密度達到7.5×10⁶ cells/mL開始繼續40天培養，將培養上清液作為生產液而回收。

回收之生產液係使用孔徑0.7 μm及0.22 μm之過濾器(美國、Pall)而澄清化，作為過濾後生產液於2~10℃下保存。

將約400 L之過濾後生產液供於以含有150 mM氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.4)平衡化之Q-Sepharose Fast Flow(美國、GE healthcare)管柱(直徑44 cm、高度26 cm)。繼而，以6 CV之含有180 mM氯化鈉之20 mM乙酸緩衝液(pH值5.5)進行清洗，進而以含有180 mM氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.4)進行清洗，直至280 nm之吸收返回至基線為止，以含有300 mM氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.4)開始溶出，獲得自溶出液之吸光度280 nm之波峰立起開始之0.5管柱容積容量之溶出液作為粗純化液。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為45 L/小時之條件下實施。

將約20 L之粗純化液供於以含有0.3 M氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)平衡化之單株抗體柱(直徑44 cm、高度12 cm)。流入6 CV之含有1.0 M氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)，進而流入3 CV之0.1 M乙酸緩衝液(pH值5.0)而進行清洗，以含有0.3 M氯化鈉之0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值3.0)開始溶出。獲得自溶出液之吸光度280 nm之波峰立起開始至下降為止之溶出液，於溶出液中添加1/10容量之0.5 M磷酸緩衝液(pH值7.3)，獲得純化液1。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為45 L/小時之條件下實施。

以1.0 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值2.0)將約12 L之純化液1製備為pH值3.5，供於以含有0.3 M之NaCl之0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值3.5)平衡化之SP-SepharoseFF(美國GE healthcare bioscience)管柱(直徑14 cm、高度13 cm)。以含有0.3 M之NaCl之0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值3.5)開始清洗，獲得自吸光度280 nm之波峰立起開始至下降為止之流過液，立刻以0.5 M磷酸緩衝液(pH值7.3)中和至pH值7，獲得純化液2。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為15 L/小時之條件下實施。

利用超濾膜之Microza UF Module SIP-1013(日本、旭化成化學)將約16 L之純化液2濃縮直至約1.2 L為止後，供於以含有50 mM氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)平衡化之Sephacryl S-300 HR(美國GE healthcare bioscience)管柱(直徑25 cm、高度85 cm)。於獲得280 nm下之吸收最大之溶出波峰後，利用超濾膜之Microza UF Module SIP-1013(日本、旭化成化學)濃縮至約0.8 L為止，獲得純化液3。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為1 L/小時之條件下實施。

於室溫下，於壓力0.1 MPa以下，將純化液3通入以含有50 mM氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)平衡化之去除病毒膜之PLANOVA 15N(日本、旭化成醫療器材、膜面積0.3 m²)後，進而通過0.22 μm之PVDF製造過濾膜(美國、Millipore)，回收全量。將其作為可溶性凝血酶調節素純化品(批次：B1)。

B1之凝血酶調節素之APC活性分別為79000 U/mL。

B1之溶液中之可溶性凝血酶調節素濃度為12.6 mg/mL。

(比較例3)可溶性凝血酶調節素之製造3

將DMEM培養基(美國、Invitrogen)用作基本培養基。增殖培養基係於基本培養基中添加150 mg/L之L-脯胺酸(日本、Ajinomoto)、60 mg/L之康微素硫酸鹽(日本、明治製果)、1 mg/L之酒石酸泰樂菌素(日本、Mercian)、及10%牛血清(美國、Hyclone)而使用。又，生產培養基係係將增殖培養基之血清濃度設為1~3%。

熔融比較例1中製作之1瓶細胞小瓶，將該細胞接種於100 mL之增殖培養基中，於CO₂培養箱內、使用旋轉瓶以37℃攪拌培養5天。將培養液全量於400 mL之增殖培養基中繼代培養，於CO₂培養箱內、使用旋轉瓶以37℃攪拌培養5天。將培養液全量於1.6 L之增殖培養基中繼代培養，吹入空氣與CO₂並且使用球形瓶子以37℃攪拌培養5天。將培養液全量於6 L之增殖培養基中繼代培養，吹入空氣、CO₂及氧氣並且使用球形瓶子以37℃攪拌培養5天。將培養液全量於56 L之增殖培養基中繼代培養，吹入空氣、CO₂及氧氣並且使用球形瓶子以37℃攪拌培養4天。進行全量培養基更換後培養3天，進而於全量培養基更換後，自活細胞密度達到1×10⁶ cells/mL後更換為生產培養基。使用CC-100連續離心分離機(瑞典、Alfa Laval)，回收每天之生產液，更換為新鮮培養基。生產培養實施100天。回收之生產液係使用孔徑0.7 μm及0.22 μm之過濾器(美國、Pall)而澄清化，作為過濾後生產液於2~10℃下保存。

將約2400 L之過濾後生產液供於以含有150 mM氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.4)平衡化之Q-Sepharose Fast Flow(美國、GE healthcare)管柱(直徑44 cm、高度25 cm)。繼而，以6 CV之含有180 mM氯化鈉之20 mM乙酸緩衝液(pH值5.5)進行清洗，進而以2 CV之含有180 mM氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.4)進行清洗，以含有300 mM氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.4)開始溶出，將自溶出液之吸光度280 nm之波峰立起開始約15 L之溶出液作為粗純化液1而獲得。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為45 L/小時之條件下實施。

將上述粗純化液1供於以含有0.3 M氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.0)平衡化之丁基瓊脂糖凝膠FF(美國GE healthcare bioscience)管柱(直徑25 cm、高度10 cm)。以含有0.3 M氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.0)開始清洗，將自吸光度280 nm之波峰立起開始至下降為止之流過液作為粗純化液2而獲得。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為13 L/小時之條件下實施。

將約20 L之粗純化液供於以含有0.3 M氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)平衡化之單株抗體柱(直徑44 cm、高度18 cm)。流入6 CV之含有1.0 M氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)，進而流入3 CV之0.1 M乙酸緩衝液(pH值5.0)並清洗，以含有0.3 M氯化鈉之0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值3.0)開始溶出。獲得自溶出液之吸光度280 nm之波峰立起開始至下降為止之溶出液，於溶出液中添加1/10容量之1 M甘胺酸-氫氧化鈉緩衝液(pH值9.0)與1/25容量之0.5 M磷酸緩衝液(pH值7.3)作為純化液1而獲得。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為50 L/小時之條件下實施。

利用超濾膜之Microza UF Module SIP-1013(日本、旭化成化學)將約15 L之純化液1濃縮直至約1 L為止後，供於以含有150 mM氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)平衡化之Sephacryl S-300 HR(美國GE healthcare bioscience)管柱(直徑25 cm、高度80 cm)。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為1 L/小時之條件下實施。於獲得280 nm下之吸收最大之溶出波峰後，通過0.22 μm之PVDF製造過濾膜(美國、Millipore)，回收約3L。將其作為可溶性凝血酶調節素純化品(批次：B2)。

B2之凝血酶調節素之APC活性分別為28000 U/mL。

B2之溶液中之可溶性凝血酶調節素濃度為3.8 mg/mL。

(比較例4)可溶性凝血酶調節素之製造4

熔融比較例1中冷凍保存之1瓶細胞小瓶，接種於含有8 mM之L-麩醯胺(美國、Invitrogen)、50 μM之次黃嘌呤(美國、Invitrogen)、及8 μM之胸苷(美國、Invitrogen)之無血清培養基IS CHO-C D(美國、Irvine Scientific)中，於CO₂培養箱內、以37℃進行培養。將離心分離培養液而獲得之細胞懸浮於含有8 mM之L-麩醯胺(美國、Invitrogen)、50 μM之次黃嘌呤(美國、Invitrogen)、8 μM之胸苷(美國、Invitrogen)、及10%二甲基亞碸(美國、Sigma-Aldrich)之無血清培養基IS CHO-CD(美國、Irvine Scientific)後，分注於小瓶(2×10⁷ cells/瓶)中，於液氮中冷凍保存。

增殖培養基係於1 L水中溶解20.78 g之IS CHO-CD-A3(美國、Irvine Scientific)、4.06 g之氯化鈉(日本、富田製藥)、及2.20 g之碳酸氫鈉(日本、和光純藥工業)而製作。又，生產培養基係於1 L水中溶解20.78 g之IS CHO-CD-A3(美國、Irvine Scientific)、2.63 g之氯化鈉(日本、富田製藥)、及4.40 g之碳酸氫鈉(日本、和光純藥工業)而製作。

熔融1瓶細胞小瓶，將其細胞接種於100 mL之增殖培養基中，於CO₂培養箱內、使用T-燒瓶以36℃靜置培養5天。於活細胞密度成為7.0×10⁵ cells/mL以上時，將培養液40 mL於360 mL之增殖培養基中繼代培養，於CO₂培養箱內、使用旋轉瓶以36℃靜置培養7天。於活細胞密度成為7.0×10⁵ cells/mL以上時，將培養液80 mL於720 mL之增殖培養基中繼代培養，於CO₂培養箱內、使用旋轉瓶以36℃靜置培養6天。於活細胞密度成為7.0×10⁵ cells/mL以上時，將培養液全量於9.2 L之增殖培養基中繼代培養，使用灌注培養槽以36℃、pH值7.1、溶氧50%之條件攪拌培養8天。於活細胞密度成為7.0×10⁵ cells/mL以上時，開始連續地進行生產培養基之添加與培養上清液之回收之灌注培養。培養條件設為36℃、pH值7.1、溶氧50%、培養基更換10 L/天、上面加壓0~0.2 MPa。自活細胞密度達到7.5×10⁶ cells/mL開始繼續培養26天，將培養上清液作為生產液而回收。

回收之生產液係使用過濾器之SUPRAcap(美國、Pall)、及Supor EBV(美國、Pall)而澄清化，作為過濾後生產液於2~10℃下保存。

將約250 L之過濾後生產液供於以含有150 mM氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.7)平衡化之Q-Sepharose Fast Flow(美國、GE healthcare)管柱(直徑25 cm、高度25 cm)。繼而，以6 CV之含有180 mM氯化鈉之20 mM乙酸緩衝液(pH值5.6)進行清洗，進而以4 CV之含有180 mM氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.7)進行清洗，以含有290 mM氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.7)開始溶出，獲得自溶出液之吸光度280 nm之波峰立起開始之0.5管柱容積容量之溶出液作為粗純化液。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為18 L/小時之條件下實施。

將約6 L之上述粗純化液供於以含有0.3 M氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)平衡化之單株抗體柱(直徑44 cm、高度8 cm)。流入6 CV之含有1.0 M氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)，進而流入3 CV之0.1 M乙酸緩衝液(pH值5.0)並清洗，以含有0.3 M氯化鈉之0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值3.0)開始溶出。獲得自溶出液之吸光度280 nm之波峰自上升開始至下降為止之溶出液，於溶出液中添加1/10容量之0.5 M磷酸緩衝液(pH值7.3)，獲得純化液1。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為46 L/小時之條件下實施。

以1.0 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值2.0)將約14 L之純化液1製備為pH值3.5，供於以含有0.3 M之NaCl之0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值3.5)平衡化之SP-SepharoseFF(美國GE healthcare bioscience)管柱(直徑14 cm、高度13 cm)。以含有0.3 M之NaCl之0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值3.5)開始清洗，獲得自吸光度280 nm之波峰立起至下降為止之流過液，立刻以0.5 M磷酸緩衝液(pH值7.3)中和為pH值7，獲得純化液2。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為15 L/小時之條件下實施。

以超濾膜之Microza UF Module SIP-1013(日本、旭化成化學)濃縮約20 L之純化液2直至約1 L為止後，供於以含有50 mM氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)平衡化之Sephacryl S-300 HR(美國GE healthcare bioscience)管柱(直徑25 cm、高度79 cm)。於獲得280 nm下之吸收最大之溶出波峰後，以超濾膜之Microza UF Module SIP-1013(日本、旭化成化學)濃縮至約0.7 L為止，獲得純化液3。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為1 L/小時之條件下實施。

於室溫下，於壓力0.1 MPa以下，將純化液3全量通入以含有50 mM氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)平衡化之去除病毒膜之PLANOVA 15N(日本、旭化成醫療器材、膜面積0.12 m²)後，進而通過0.22 μm之PVDF製造過濾膜(美國、Millipore)，回收全量。將其作為可溶性凝血酶調節素純化品(批次：B3)。

(實施例1)高純度可溶性凝血酶調節素之製造1

將日本專利特開平11-341990號公報之成分表2所示之培養基之NaHCO₃濃度改變為5,700 mg/L，將NaCl濃度改變為2,410 mg/L者作為基本培養基而進行細胞培養。增殖培養基係於基本培養基中添加60 mg/L之康微素硫酸鹽(美國、Invitrogen)、1 mg/L之酒石酸泰樂菌素(美國、Sigma-Aldrich)、及8%牛血清(美國、Hyclone)而使用。又，生產培養基係將增殖培養基之血清濃度設為3%。

熔融比較例1中製作之1瓶細胞小瓶，將該細胞接種於100 mL之增殖培養基中，於CO₂培養箱內、使用旋轉瓶以37℃攪拌培養5天。於活細胞密度成為7.0×10⁵ cells/mL以上時，將培養液全量於0.9 L之增殖培養基中繼代培養，於CO₂培養箱內、使用旋轉瓶以37℃攪拌培養5天。於活細胞密度成為7.0×10⁵ cells/mL以上時，將培養液全量於9 L之增殖培養基中繼代培養，使用培養槽、以37℃、pH值7.2、溶氧50%之條件攪拌培養5天。於活細胞密度成為7.0×10⁵ cells/mL以上時，將培養液全量於120 L之增殖培養基中繼代培養，使用培養槽、以37℃、pH值7.2、溶氧50%之條件攪拌培養7天。於活細胞密度成為7.0×10⁵ cells/mL以上時，開始連續地進行生產培養基之添加與培養上清液之回收之灌注培養。培養條件設為37℃、pH值7.2、溶氧50%、培養基更換130~200 L/天、上面加壓0~0.2 MPa。若活細胞密度達到7.5×10⁶ cells/mL後繼續進行40天培養，將培養上清液作為生產液而回收。回收之生產液係使用過濾器之SupradiskII(美國、Pall)、及Supor EBV(美國、Pall)而澄清化，作為過濾後生產液於2~10℃下保存。

將約700 L之過濾後生產液供於以含有150 mM氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.7)平衡化之Q-Sepharose Fast Flow(美國、GE healthcare)管柱(直徑63 cm、高度25 cm)。繼而，以6 CV之含有180 mM氯化鈉之20 mM乙酸緩衝液(pH值5.5)進行清洗，進而以含有180 mM氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.7)進行清洗直至280 nm之吸收返回基線為止，以含有300 mM氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.7)開始溶出，獲得自溶出液之吸光度280 nm下之波峰立起開始之0.5管柱容積容量之溶出液作為粗純化液。反覆實施相同操作3次，獲得3批次之粗純化液。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為109 L/小時之條件下實施。

將約20 L之粗純化液供於以含有0.3 M氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)平衡化之單株抗體柱(直徑44 cm、高度13 cm)。流入6 CV之含有1.0 M氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)，進而流入3 CV之0.1 M乙酸緩衝液(pH值5.0)並清洗，以含有0.3 M氯化鈉之0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值3.0)開始溶出。獲得自溶出液之吸光度280 nm之波峰立起至下降為止之溶出液，於溶出液中添加1/10容量之0.5 M磷酸緩衝液(pH值7.3)，獲得純化液1。反覆實施相同操作6次，獲得6批次之純化液1。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為46 L/小時之條件下實施。

以5 L/分鐘之流速，將6批次之純化液1約130 L通過尼龍製之過濾膜(德國、Sartorius公司、SARTOLON Maxi Caps 5101307H3、孔徑0.4 μm+0.2 μm、膜面積1.8 m²)後(相對於1 mg之HCP約使用0.07 m²膜面積)，利用1.0 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值2.0)製備為pH值3.5，供於以含有0.3 M之NaCl之0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值3.5)平衡化之SP-SepharoseFF(美國GE healthcare bioscience)管柱(直徑45 cm、高度10 cm)。以含有0.3 M之NaCl之0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值3.5)開始清洗，獲得自吸光度280 nm之波峰立起開始至下降為止之流過液，立刻以0.5 M磷酸緩衝液(pH值7.3)中和成pH值7，獲得純化液2。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為160 L/小時之條件下實施。

以超濾膜之Microza UF Module SIP-2013(日本、旭化成化學)濃縮約160 L之純化液2直至約10 L為止後，供於以含有50 mM氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)平衡化之Sephacryl S-300 HR(美國GE healthcare bioscience)管柱(直徑63 cm、高度94 cm)。於獲得280 nm下之吸收最大之溶出波峰後，以超濾膜之Microza UF Module SIP-1013(日本、旭化成化學)濃縮直至約6 L為止，獲得純化液3。再者，於溫度2~10℃、層析流速為6.2 L/小時之條件下實施。

於室溫下，於壓力0.1 MPa以下，將純化液3通入以含有50 mM氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)平衡化之病毒去除膜之PLANOVA 15N(日本、旭化成醫療器材、膜面積1 m²)後，進而通過0.22 μm之PVDF製之過濾膜(美國、Millipore)，回收全量。將其作為可溶性凝血酶調節素純化品(批次：A4)。

A4之凝血酶調節素之APC活性為60000 U/mL。

A4之溶液中之可溶性凝血酶調節素濃度為9.3 mg/mL。

(實施例2)高純度可溶性凝血酶調節素之製造2

將實施例1中獲得之約2,000 L之過濾後生產液供於以含有150 mM氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.7)平衡化之Q-Sepharose Fast Flow(美國、GE healthcare)管柱(直徑63 cm、高度25 cm)。繼而，以6 CV之含有170 mM氯化鈉之20 mM乙酸緩衝液(pH值5.45)進行清洗，進而以4 CV之含有170 mM氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.7)進行清洗，以含有300mM氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.7)開始溶出，獲得自溶出液之吸光度280 nm下之波峰開始上升之0.5管柱容積容量之溶出液作為粗純化液。反覆實施相同操作2次，獲得2批次之粗純化液。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為109 L/小時之條件下實施。

將約10 L之粗純化液供於以含有0.3 M氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)平衡化之單株抗體柱(直徑44 cm、高度13 cm)。流入6 CV之含有1.0 M氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)，進而流入3 CV之0.1 M乙酸緩衝液(pH值5.0)並清洗，以含有0.3 M氯化鈉之0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值3.0)開始溶出。獲得自溶出液之吸光度280 nm之波峰立起至下降為止之溶出液，於溶出液中添加1/10容量之0.5 M磷酸緩衝液(pH值7.3)，獲得純化液1。反覆實施相同操作8次，獲得8批次之純化液1。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為46 L/小時之條件下實施。

以5 L/分鐘之流速，將6批次之純化液1約180 L通過尼龍製之過濾膜(德國、Sartorius公司、SARTOLON Maxi Caps 5101307H3、孔徑0.4 μm+0.2 μm、膜面積1.8 m²)後(相對於1 mg之HCP使用約0.05 m²膜面積)，利用1.0 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值2.0)製備為pH值3.5，供於以含有0.3 M之NaCl之0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值3.5)平衡化之SP-SepharoseFF(美國GE healthcare bioscience)管柱(直徑45 cm、高度10 cm)。以含有0.3 M之NaCl之0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值3.5)開始清洗，獲得自吸光度280 nm下之波峰立起開始至下降為止之流過液，立刻以0.5 M磷酸緩衝液(pH值7.3)中和成pH值7，獲得純化液2。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為160 L/小時之條件下實施。

以超濾膜之Microza UF Module SIP-2013(日本、旭化成化學)濃縮約220 L之純化液2直至約5 L為止後，供於以含有50 mM氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)平衡化之Sephacryl S-300 HR(美國GE healthcare bioscience)管柱(直徑63 cm、高度94 cm)。於獲得280 nm下之吸收最大之溶出波峰後，以超濾膜之Microza UF Module SIP-1013(日本、旭化成化學)濃縮至約10 L為止，獲得純化液3。再者，於溫度2~10℃、層析流速為6.2 L/小時之條件下實施。

於室溫下，於壓力0.1 MPa以下，將純化液3通入以含有50 mM氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)平衡化之病毒去除膜之PLANOVA 15N(日本、旭化成醫療器材、膜面積1 m²)後，進而通過0.22 μm之PVDF製造過濾膜(美國、Millipore)，回收全量。將其作為可溶性凝血酶調節素純化品(批次：A5)。

A5之凝血酶調節素之APC活性為69000 U/mL。

A5之溶液中之可溶性凝血酶調節素濃度為10.9 mg/mL。

(實施例3)高純度可溶性凝血酶調節素之製造3

熔融比較例1中製作之1瓶細胞小瓶，將其細胞接種於100 mL之增殖培養基中，於CO₂培養箱內、使用旋轉瓶以37℃攪拌培養5天。於活細胞密度成為7.0×10⁵ cells/mL以上時，將培養液全量於0.9 L之增殖培養基中繼代培養，於CO₂培養箱內、使用旋轉瓶以37℃攪拌培養5天。於活細胞密度成為7.0×10⁵ cells/mL以上時，將培養液全量於9 L之增殖培養基中繼代培養，使用培養槽、以37℃、pH值7.2、溶氧50%之條件攪拌培養5天。於活細胞密度成為7.0×10⁵ cells/mL以上時，將培養液全量於120 L之增殖培養基中繼代培養，使用培養槽、以37℃、pH值7.2、溶氧50%之條件攪拌培養7天。於活細胞密度成為7.0×10⁵ cells/mL以上時，開始連續地進行生產培養基之添加與培養上清液之回收之灌注培養。培養條件設為37℃、pH值7.2、溶氧50%、培養基更換130~200 L/天、上面加壓0~0.2 MPa。若活細胞密度達到7.5×10⁶ cells/mL後繼續培養36天，將培養上清液作為生產液而回收。回收之生產液係使用過濾器之SupradiskII(美國、Pall)、及Supor EBV(美國、Pall)而澄清化，作為過濾後生產液於2~10℃下保存。

將約700 L之過濾後生產液供於以含有150 mM氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.7)平衡化之Q-Sepharose Fast Flow(美國、GE healthcare)管柱(直徑63 cm、高度25 cm)。繼而，以6 CV之含有180 mM氯化鈉之20 mM乙酸緩衝液(pH值5.5)進行清洗，進而以含有180 mM氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.7)進行清洗直至280 nm之吸收返回基線為止，以含有300 mM氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.7)開始溶出，獲得自溶出液之吸光度280 nm下之波峰立起開始之0.5管柱容積容量之溶出液作為粗純化液。反覆實施相同操作6次，獲得6批次之粗純化液。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為109 L/小時之條件下實施。

將約20 L之粗純化液供於以含有0.3 M氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)平衡化之單株抗體柱(直徑44 cm、高度13 cm)。流入6 CV之含有1.0 M氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)，進而流入3 CV之0.1 M乙酸緩衝液(pH值5.0)並清洗，以含有0.3 M氯化鈉之0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值3.0)開始溶出。獲得自溶出液之吸光度280 nm之波峰立起至下降為止之溶出液，於溶出液中添加1/10容量之0.5 M磷酸緩衝液(pH值7.3)，獲得純化液1。反覆實施相同操作12次，獲得12批次之純化液1。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為46 L/小時之條件下實施。

以5 L/分鐘之流速，將12批次之純化液1約270 L通過尼龍製之過濾膜(德國、Sartorius公司、SARTOLON Maxi Caps 5101307H3、孔徑0.4 μm+0.2 μm、膜面積1.8 m²)後(相對於1 mg之HCP使用約0.05 m²膜面積)，利用1.0 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值2.0)製備為pH值3.5，供於以含有0.3 M之NaCl之0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值3.5)平衡化之SP-SepharoseFF(美國GE healthcare bioscience)管柱(直徑45 cm、高度10 cm)。以含有0.3 M之NaCl之0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值3.5)開始清洗，獲得自吸光度280 nm之波峰立起開始至下降為止之流過液，立刻以0.5 M磷酸緩衝液(pH值7.3)中和成pH值7，獲得純化液2。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為160 L/小時之條件下實施。

以超濾膜之Microza UF Module SIP-2013(日本、旭化成化學)濃縮約300 L之純化液2直至約11 L為止後，供於以含有50 mM氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)平衡化之Sephacryl S-300 HR(美國GE healthcare bioscience)管柱(直徑63 cm、高度94 cm)。於獲得280 nm下之吸收最大之溶出波峰後，以超濾膜之Microza UF Module SIP-1013(日本、旭化成化學)濃縮至約13 L為止，獲得純化液3。再者，於溫度2~10℃、層析流速為6.2 L/小時之條件下實施。

於室溫下，於壓力0.1 MPa以下，將純化液3通入以含有50 mM氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)平衡化之病毒去除膜之PLANOVA 15N(日本、旭化成醫療器材、膜面積1 m²)後，進而通過0.22 μm之PVDF製造過濾膜(美國、Millipore)，回收全量。將其作為可溶性凝血酶調節素純化品(批次：A6)。

A6之凝血酶調節素之APC活性為81000 U/mL。

A6之溶液中之可溶性凝血酶調節素濃度為11.9 mg/mL。

(實施例4)高純度可溶性凝血酶調節素之製造4

增殖培養基係將20.78 g之IS CHO-CD-A3(美國、Irvine Scientific)、4.06 g之氯化鈉(日本、富田製藥)、及2.20 g之碳酸氫鈉(日本、和光純藥工業)溶解於1 L之水中而製作。又，生產培養基係於1 L水中溶解20.78 g之IS CHO-CD-A3(美國、Irvine Scientific)、2.63 g之氯化鈉(日本、富田製藥)、及4.40 g之碳酸氫鈉(日本、和光純藥工業)而製作。

熔融比較例4中製作之1瓶細胞小瓶，將該細胞接種於100 mL之增殖培養基中，於CO₂培養箱內、使用T-燒瓶以36℃靜置培養5天。於活細胞密度成為7.0×10⁵ cells/mL以上時，將培養液全量於0.9 L之增殖培養基中繼代培養，於CO₂培養箱內、使用旋轉瓶以36℃靜置培養5天。於活細胞密度成為7.0×10⁵ cells/mL以上時，將培養液全量於9 L之增殖培養基中繼代培養，使用培養槽、以36℃、pH值7.1、溶氧50%之條件攪拌培養5天。於活細胞密度成為7.0×10⁵ cells/mL以上時，將培養液全量於120 L之增殖培養基中繼代培養，使用灌注培養槽、以36℃、pH值7.1、溶氧50%之條件攪拌培養7天。於活細胞密度成為7.0×10⁵ cells/mL以上時，開始連續進行生產培養基之添加與培養上清液之回收之灌注培養。培養條件係設為36℃、pH值7.1、溶氧50%、培養基更換130 L/天、上面加壓0~0.2 MPa。活細胞密度達到7.5×10⁶ cells/mL後，繼續培養20天，將培養上清液作為生產液而回收。

回收之生產液係使用過濾器之SupradiskII(美國、Pall)、及Supor EBV(美國、Pall)而澄清化，並作為過濾後生產液於2~10℃下保存。

將約1,400 L之過濾後生產液供於以含有150 mM氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.7)平衡化之Q-Sepharose Fast Flow(美國、GE healthcare)管柱(直徑63 cm、高度25 cm)。繼而，以6 CV之含有180 mM氯化鈉之20 mM乙酸緩衝液(pH值5.6)進行清洗，進而以4 CV之含有180 mM氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.7)進行清洗，以含有290 mM氯化鈉之20 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.7)開始溶出，獲得自溶出液之吸光度280 nm之波峰開始上升之0.5管柱容積容量之溶出液作為粗純化液。針對約900 L之過濾後生產液，亦進行相同操作，獲得2批次之粗純化液。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為109 L/小時之條件下實施。

將約13 L之粗純化液供於以含有0.3 M氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)平衡化之單株抗體柱(直徑44 cm、高度13 cm)。流入6 CV之含有1.0 M氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)，進而流入3 CV之0.1 M乙酸緩衝液(pH值5.0)並清洗，以含有0.3 M氯化鈉之0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值3.0)開始溶出。獲得自溶出液之吸光度280 nm下之波峰立起開始至下降為止之溶出液，於溶出液添加1/10容量之0.5 M磷酸緩衝液(pH值7.3)，獲得純化液1。反覆實施相同操作5次，獲得5批次之純化液1。再者，於溫度2~10℃、層析流速為46 L/小時之條件下實施。

以5 L/分鐘之流速，將5批次之純化液1約110 L通過尼龍製之過濾膜(德國、Sartorius公司、SARTOLON Maxi Caps 5101307H3、孔徑0.4 μm+0.2 μm、膜面積1.8 m²)後(相對於1 mg之HCP使用約0.03 m²膜面積)，利用1.0 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值2.0)製備為pH值3.5，供於以含有0.3 M之NaCl之0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值3.5)平衡化之SP-SepharoseFF(美國GE healthcare bioscience)管柱(直徑45 cm、高度10 cm)。以含有0.3 M之NaCl之0.1 M甘胺酸鹽酸緩衝液(pH值3.5)開始清洗，獲得自吸光度280 nm下之波峰立起開始至下降為止之流過液，立刻以0.5 M磷酸緩衝液(pH值7.3)中和成pH值7，獲得純化液2。再者，於溫度為2~10℃、層析流速為160 L/小時之條件下實施。

以超濾膜之Microza UF Module SIP-2013(日本、旭化成化學)濃縮約120 L之純化液2直至約10 L為止後，供於以含有50 mM氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)平衡化之Sephacryl S-300 HR(美國GE healthcare bioscience)管柱(直徑63 cm、高度94 cm)。於獲得280 nm下之吸收最大之溶出波峰後，以超濾膜之Microza UF Module SIP-1013(日本、旭化成化學)濃縮至約5 L為止，獲得純化液3。再者，於溫度2~10℃、層析流速為6.2 L/小時之條件下實施。

於室溫下，於壓力0.1 MPa以下，將純化液3通入以含有50 mM氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)平衡化之病毒去除膜之PLANOVA 15N(日本、旭化成醫療器材、膜面積1 m²)後，進而通過0.22 μm之PVDF製造過濾膜(美國、Millipore)，回收全量。將其作為可溶性凝血酶調節素純化品(批次：A7)。

A7之凝血酶調節素之APC活性為69000 U/mL。

A7之溶液中之可溶性凝血酶調節素濃度為10.4 mg/mL。

(試驗例1)藉由各種過濾膜之HCP去除評價

對將比較例1中獲得之純化液1(HCP濃度：462 ng/ml)通過不同材質之過濾膜後之HCP濃度進行比較。即，以1 ml/分鐘之流速，將5 ml之純化液1通過(1)PVDF(聚偏二氟乙烯)製(美國、Millipore、Millex GV)、(2)CA(cellulose acetate，纖維素乙酸酯)製(德國、Sartorius、Minisart)、(3)PES(Polyether sulfone，聚醚碸)製(德國、Sartorius、Minisart High-Flow)、(4)尼龍製(美國、Thermo Fisher Scientific、NALGENE Syringe Filter)、(5)CA+GF(glass fiber)(纖維素乙酸酯+玻璃纖維)製(Sartorius、Minisart Plus)之各過濾膜，將全量作為過濾液而回收。

針對過濾前後之溶液，進行蛋白質濃度與HCP濃度之測定。蛋白質濃度係由280 nm下之吸光度求出，HCP濃度係依據參考例2所示之方法測定。其結果為，針對全部過濾膜，幾乎未見到過濾前後之蛋白質濃度之變化，針對尼龍製之過濾膜及PES製之過濾膜可見較高之HCP去除效果，得知使HCP濃度分別減少至28%及36%(表1)。又，儘管為相同孔徑，HCP濃度之降低亦根據膜材質不同而大為不同，認為其原並非凝聚而去除不溶化之HCP，而是利用HCP之膜進行吸附去除。再者，評價之各過濾膜之直徑為25 mm或26 mm，根據各製造商之資料表記載之過濾膜之有效膜面積，相對於1 mg之HCP之膜面積為0.17 m²或0.23 m²。

(試驗例2)利用尼龍製及PES製之過濾膜之HCP去除能力比較

於試驗例1中，由於判明尼龍製之過濾膜與PES製之過濾膜具有較高之HCP去除能力，故而針對該等過濾膜，評價由通液量引起之HCP去除能力之變化。再者，過濾膜係針對各材質準備2家製造商之商品，所通過之純化液1係使用與試驗例2中使用之批次不同之批次(HCP濃度：303 ng/ml)。過濾膜係使用PVDF製(美國、Millipore、Millex GV：孔徑0.22 μm、膜徑25 mm、有效膜面積3.9 cm²)作為對照，使用(1)美國、Pall公司之Acrodisc AP-4436T、：孔徑0.2 μm、膜徑25 mm、有效膜面積3.9 cm²、及(2)德國、Sartorius公司之Minisart NY25：孔徑0.2 μm、膜徑25 mm、有效膜面積4.8 cm²作為尼龍製之過濾膜，使用(3)美國Pall公司之Acrodisc PN4612：孔徑0.2 μm、膜徑25 mm、有效膜面積2.8 cm²、及(4)Sartorius公司之Minisart High-Flow：孔徑0.2 μm、膜徑26 mm、有效膜面積5.3 cm²作為PES製之過濾膜。每1片過濾膜之純化液1之通液量係以10 ml/分鐘之流速設為100 ml，每通過20 ml對過濾液進行取樣，依據參考例2所示之方法測定HCP濃度，由280 nm下之吸收求出蛋白質濃度。

其結果為，全部樣品均未見蛋白質濃度之變化，但對於尼龍製之及PES製之過濾膜均可見HCP去除效果(表2)。尤其是尼龍製之過濾膜之HCP去除效果較高，使HCP濃度最大降低至25%。得知對過濾膜之通液量越少，即相對於1 mg之HCP之過濾膜面積越大，HCP去除效果越好。

(試驗例3)不同之液組成下之尼龍製之過濾膜之HCP去除能力評價

對緩衝液組成及可溶性凝血酶調節素濃度之不同對尼龍製之過濾膜之HCP去除能力所產生之影響進行評價。以1 mL/分鐘之流速，將比較例4中所獲得之純化液1、純化液2、純化液2濃縮後、純化液3、及純化品各5 mL通過膜徑25 mm、有效膜面積4.8 cm²、孔徑0.2 μm之尼龍製之過濾膜(德國、Sartorius公司、Minisart NY25)，將全量作為過濾液而回收。各樣品所含之相對於1 mg之HCP之過濾膜面積為純化液1：0.77 m²、純化液2：1.7 m²、純化液2濃縮後：0.43 m²、純化液3：0.72 m²、純化品：0.81 m²。針對所獲得之過濾液，依據參考例2所示之方法測定HCP濃度，由280 nm下之吸收求出蛋白質濃度。其結果為，尼龍製之膜對全部樣品均可見較高之HCP去除效果，蛋白質濃度回收率獲得90%以上之較高值(表3)。

(試驗例4)利用藉由各種製造方法獲得之可溶性凝血酶調節素純化品的HCP去除評價

進而將藉由不同製造方法獲得之可溶性凝血酶調節素通過尼龍製之過濾膜，藉此研究是否去除HCP。以1 mL/分鐘之流速，將比較例1~3中獲得之可溶性凝血酶調節素純化品(分別為A1、B1及B2)各5 mL通過膜徑25 mm、有效膜面積4.8 cm²、孔徑0.2 μm之尼龍製之過濾膜(德國、Sartorius公司、Minisart NY25)，將全量作為過濾液而回收。各可溶性凝血酶調節素純化品中所含有之相對於1 mg之HCP之過濾膜面積為A1:0.34 m²、B1:0.46 m²、B2:1.7 m²。針對過濾前後之液體，依據參考例2~4所示之方法測定HCP含量、小鼠IgG含量及牛血清蛋白質含量。全部純化品中，尼龍製之過濾膜僅對HCP可見較強之去除效果(表4)。由此認為，尼龍製之過濾膜並非非特異地吸附蛋白質，而是具有特異地吸附HCP之作用。

(試驗例5)根據有無使用尼龍製之過濾膜比較凝血酶調節素純化品之純度

針對藉由未使用尼龍製之過濾膜之工業化水平之製造(比較例1)及使用尼龍製之過濾膜之工業化水平之製造(實施例1~4)而獲得之凝血酶調節素純化品，依據參考例2~4所示之方法測定HCP含量、小鼠IgG含量及牛血清蛋白質含量。

未通過尼龍製之過濾膜之比較例1之3個批次(A1、A2及A3)具有10 ng/10,000 U以上之高HCP含量，通過尼龍製之過濾膜之實施例1~4之4個批次(A4、A5、A6及A7)之HCP含量未達測定極限。關於其他雜質之小鼠IgG含量及牛血清蛋白質含量，未根據有無使用尼龍製之過濾膜確認其含量(表5)。如此，於工業化水平之製造中，尼龍製之過濾膜對HCP具有特異性之去除能力，可製造HCP含量未達10 ng/10,000 U之高純度可溶性凝血酶調節素。

藉由凝膠過濾液相層析及離子交換液相層析，測定實施例1~4中獲得之高純度可溶性凝血酶調節素相對於總蛋白質之純度。關於凝膠過濾液相層析，係使用TOSOH TSKgel G3000SWXL(日本、東曹)，於含有0.1 M硫酸鈉之50 mM磷酸鹽緩衝液(pH值7.3)、溫度40℃、流速0.9 mL/分鐘之條件下進行測定，結果全部純化品(A4、A5、A6及A7)之純度均為99%以上。又，關於離子交換液相層析，係使用TOSOH DEAE 5PW(日本、東曹)，於自含有50 mM氯化鈉之20 mM哌鹽酸緩衝液(pH值5.6)向含有350 mM氯化鈉之20 mM哌鹽酸緩衝液(pH值5.6)線性梯度溶出30分鐘、溫度40℃、流速0.9 mL/分鐘之條件下進行測定，結果全部純化品(A4、A5、A6及A7)之純度均為99%以上。

又，利用SDS-PAGE，對依據比較例1而製造且利用MALDI-TOF MS(基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀)確認分子量為64,000之可溶性凝血酶調節素純化品、與實施例1~4中所獲得之高純度可溶性凝血酶調節素純化品之分子量進行比較，結果於相同位置檢測到條帶。由此認為高純度可溶性凝血酶調節素之分子量為64,000。

進而，依據日本藥典一般試驗法之內毒素試驗法<4.01>之凝膠化法實施試驗，結果內毒素含量為0.004~0.03 EU/10,000 U，為非常低之水平(表6)。

(試驗例6)經尼龍製之過濾膜去除之HCP之分析

藉由與實施例3相同之方法製造高純度可溶性凝血酶調節素後，將製造所使用之尼龍製之過濾膜(德國、Sartorius、SARTOLON Maxi Caps 5101307H3、孔徑0.4 μm+0.2 μm、膜面積1.8 m²)自濾膜套中取出，將膜切斷為約3 g之片段。以含有50 mM氯化鈉之20 mM磷酸緩衝液(pH值7.3)清洗5個片段後，於導入有40 mL之0.5% CHAPS、含有200 mM氯化鈉之50 mM之三羥甲基胺基甲烷酸緩衝液(pH值8.0)之試驗管中放入1個片段。藉由於室溫下振盪一晚，將吸附於膜中之蛋白質萃取至緩衝液中。使用超濾膜Vivaspin20(德國、Sartorius)與AmiconUltra-0.5 mL(美國、Millipore)濃縮萃取液全量直至成為15 μL為止。將該濃縮液中約1/5量供於SDS-PAGE(日本、ATTO、e-PAGEL5/20)，進行CBB染色(日本、和光純藥工業、Quick-CBB)。切斷出現於分子量10,000附近之條帶，以二硫蘇糖醇還原該凝膠片段後，利用碘代乙醯胺進行胺基甲酸甲酯化，徹夜實施利用胰蛋白酶之酶消化。將酶消化物供於LC/MS/MS，根據所獲得之質譜資料，使用NCBI(National Center for Biotechnology Information，美國國立生物技術信息中心)之資料庫進行Mascot檢索，分析酶消化物之胺基酸序列。

LC/MS/MS之測定條件

LC/MS/MS(測定裝置)：

DiNa-2A多通道自動進樣系統(日本、KYA technologies)

MS測定範圍：

MS1(m/z400-1500)MS2(m/z50-1500)×3(data dependent掃描模式)

離子化模式：nanoESI⁺

管柱：

PicoFrit Column BataBasic C18(美國、New Objective)

流動相：

流動相A：0.1%甲酸/2%乙腈

流動相B：0.1%甲酸/80%乙腈

梯度：0→30分鐘　流動相B 5→40%

30→40分鐘　流動相B 40→100%

40→60分鐘　流動相B 100%

流量：300 nL/分鐘

根據質譜資料預測之各片段之胺基酸序列如以下(1)~(7)所示，與以下所示之組織蛋白H2B(Biochimie,61(1),61-69(1979))之部分序列一致。由此得知利用尼龍過濾器去除之HCP之一為組織蛋白H2B。

(1) KESYSVYVYK

(2) VLKQVHPDTGISSK

(3) STITSREIQTAVR

(4) EIQTAVR

(5) EIQTAVRLLLPGELAK

(6) LLLPGELAK

(7) LLLPGELAKHAVSEGTK

[表7]

組織蛋白H2B胺基酸序列

PEPAKSAPAPKKGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSR AMGIMNSFVNDIFZRIAGEASRLAHYNKRAVTKYTSSK(□所包圍之序列表示組織蛋白H2B胺基酸序列中之與根據質譜資料預測之上述(1)~(7)之胺基酸序列一致之胺基酸序列範圍)

<110>　日商旭化成製藥股份有限公司

<120>　高純度可溶性凝血酶調節素及其製造方法

<130>　111151M

<140>　100114937

<141>　2011-04-28

<150>　2010-105421

<151>　2010-04-30

<160>　21

<210>　1

<211>　132

<212>　PRT

<213>　人類

<400>　1

<210>　2

<211>　396

<212>　DNA

<213>　人類

<400>　2

<210>　3

<211>　132

<212>　PRT

<213>　人類

<400>　3

<210>　4

<211>　396

<212>　DNA

<213>　人類

<400>　4

<210>　5

<211>　480

<212>　PRT

<213>　人類

<400>　5

<210>　6

<211>　1440

<212>　DNA

<213>　人類

<400>　6

<210>　7

<211>　480

<212>　PRT

<213>　人類

<400>　7

<210>　8

<211>　1440

<212>　DNA

<213>　人類

<400>　8

<210>　9

<211>　516

<212>　PRT

<213>　人類

<400>　9

<210>　10

<211>　1548

<212>　DNA

<213>　人類

<400>　10

<210>　11

<211>　516

<212>　PRT

<213>　人類

<400>　11

<210>　12

<211>　1548

<212>　DNA

<213>　人類

<400>　12

<210>　13

<211>　21

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　人工序列之說明：合成DNA

<400>　13

<210>　14

<211>　10

<212>　PRT

<213>　人類

<400>　14

<210>　15

<211>　14

<212>　PRT

<213>　人類

<400>　15

<210>　16

<211>　13

<212>　PRT

<213>　人類

<400>　16

<210>　17

<211>　7

<212>　PRT

<213>　人類

<400>　17

<210>　18

<211>　16

<212>　PRT

<213>　人類

<400>　18

<210>　19

<211>　9

<212>　PRT

<213>　人類

<400>　19

<210>　20

<211>　17

<212>　PRT

<213>　人類

<400>　20

<210>　21

<211>　125

<212>　PRT

<213>　人類

<400>　21

Claims

一種高純度可溶性凝血酶調節素，其係將包含編碼可溶性凝血酶調節素之鹼基序列之DNA轉染至宿主細胞而獲得之轉形細胞所產生之可溶性凝血酶調節素，並且源自宿主細胞之蛋白質之含有率係相對於可溶性凝血酶調節素10,000U為0.001ng以上、且未達10ng之比率。
如請求項1之高純度可溶性凝血酶調節素，其係於工業上製造者。
如請求項1之高純度可溶性凝血酶調節素，其係作為醫藥原料使用者。
如請求項1之高純度可溶性凝血酶調節素，其係作為醫藥原料使用者。
如請求項2之高純度可溶性凝血酶調節素，其係作為醫藥原料使用者。
如請求項1至5中任一項之高純度可溶性凝血酶調節素，其中高純度可溶性凝血酶調節素於總蛋白質中之純度為99%以上。
如請求項1至5中任一項之高純度可溶性凝血酶調節素，其中該可溶性凝血酶調節素係藉由無血清培養該轉形細胞而產生。
如請求項1至5中任一項之高純度可溶性凝血酶調節素，其中該宿主細胞為中國倉鼠卵巢細胞。
如請求項1至5中任一項之高純度可溶性凝血酶調節素，其中該可溶性凝血酶調節素係具有下述(1)~(5)之性質者：(1)選擇性地與凝血酶結合之作用、(2)促進凝血酶對蛋白質C之活性化之作用、(3)延長由凝血酶引起之凝固時間之作用、(4)抑制由凝血酶引起之血小板凝聚之作用、及(5)消炎作用。
如請求項1至5中任一項之高純度可溶性凝血酶調節素，其中該可溶性凝血酶調節素之分子量為50,000~80,000之範圍。
如請求項1至5中任一項之高純度可溶性凝血酶調節素，其中該高純度可溶性凝血酶調節素係由包括如下步驟之方法而製造：(a)將包含編碼可溶性凝血酶調節素之鹼基序列之DNA轉染至宿主細胞而獲得轉形細胞之步驟，(b)培養該轉形細胞而獲得含有可溶性凝血酶調節素之溶液之步驟，及(c)使含有該可溶性凝血酶調節素之溶液與尼龍及/或聚醚碸接觸，獲得源自宿主細胞之蛋白質之含有率係相對於可溶性凝血酶調節素10,000U為0.001ng以上、且未達10ng之比率之高純度可溶性凝血酶調節素之步驟。
如請求項1至5中任一項之高純度可溶性凝血酶調節素，其中該可溶性凝血酶調節素係具有序列編號9或序列編號11中任一項之胺基酸序列中之第19位~第516位之胺基酸序列的肽。
如請求項1至5中任一項之高純度可溶性凝血酶調節素，其中包含編碼該可溶性凝血酶調節素之鹼基序列之DNA係編碼序列編號9或序列編號11中任一項之胺基酸序列之DNA。
一種醫藥組合物，其含有請求項1至5中任一項之高純度可溶性凝血酶調節素及藥學上所容許之載體。
一種高純度可溶性凝血酶調節素之製造方法，其係源自宿主細胞之蛋白質之含有率係相對於可溶性凝血酶調節素10,000U為0.001ng以上、且未達10ng之比率之高純度可溶性凝血酶調節素之製造方法，其包括使含有可溶性凝血酶調節素之溶液與尼龍及/或聚醚碸接觸之步驟，該可溶性凝血酶調節素係將包含編碼可溶性凝血酶調節素之鹼基序列之DNA轉染至宿主細胞而獲得之轉形細胞所產生者。
如請求項15之製造方法，其中該高純度可溶性凝血酶調節素係於工業上製造者。
如請求項15之製造方法，其中該高純度可溶性凝血酶調節素係作為醫藥原料使用者。
如請求項16之製造方法，其中該高純度可溶性凝血酶調節素係作為醫藥原料使用者。
如請求項15至18中任一項之製造方法，其中高純度可溶性凝血酶調節素於總蛋白質中之純度為99%以上。
如請求項15至18中任一項之製造方法，其係無血清培養該轉形細胞而產生可溶性凝血酶調節素。
如請求項15至18中任一項之高純度可溶性凝血酶調節素之製造方法，其中該可溶性凝血酶調節素係具有下述(1)~(5)之性質之可溶性凝血酶調節素：(1)選擇性地與凝血酶結合之作用、(2)促進凝血酶對蛋白質C之活性化之作用、(3)延長由凝血酶引起之凝固時間之作用、(4)抑制由凝血酶引起之血小板凝聚之作用、及(5)消炎作用。
如請求項15至18中任一項之製造方法，其中該宿主細胞為中國倉鼠卵巢細胞。
如請求項15至18中任一項之製造方法，其中該可溶性凝血酶調節素之分子量為50,000~80,000。
如請求項15至18中任一項之製造方法，其中該可溶性凝血酶調節素係具有序列編號9或序列編號11中任一項之胺基酸序列中之第19位~第516位之胺基酸序列之肽。
如請求項15至18中任一項之製造方法，其中包含編碼該可溶性凝血酶調節素之鹼基序列之DNA為編碼序列編號9或序列編號11之胺基酸序列之DNA。
如請求項15至18中任一項之製造方法，其中尼龍及/或聚醚碸之形態為過濾膜之形態。
如請求項26之製造方法，其中過濾膜之膜面積對於源自宿主細胞之蛋白質1mg為0.01~0.5m²。
如請求項15至18中任一項之製造方法，其中尼龍及/或聚醚碸為尼龍。
如請求項15至18中任一項之製造方法，其係源自宿主細胞之蛋白質之含有率係相對於可溶性凝血酶調節素10,000U為0.001ng以上、且未達10ng之比率之高純度可溶性凝血酶調節素之製造方法，且係包括如下步驟之製造方法，並且上述宿主細胞為中國倉鼠卵巢細胞：(a)將編碼序列編號9或序列編號11之胺基酸序列之DNA轉染至宿主細胞而獲得轉形細胞之步驟、(b)培養該轉形細胞而獲得含有可溶性凝血酶調節素之溶液之步驟、(c)將含有該可溶性凝血酶調節素之溶液純化為總蛋白質中之凝血酶調節素純度為99%以上之步驟、及(d)使含有該可溶性凝血酶調節素之溶液與尼龍接觸，單獨分離源自宿主細胞之蛋白質之含有率係相對於可溶性凝血酶調節素10,000U為0.001ng以上、且未達10ng之比率之高純度可溶性凝血酶調節素之步驟。