KR20020040783A

KR20020040783A - Ｄ-글루코노락톤 옥시다제 유전자 및 재조합ｄ-글루코노락톤 옥시다제의 제조 방법

Info

Publication number: KR20020040783A
Application number: KR1020027002226A
Authority: KR
Inventors: 미아스니코브안드레이; 살루스자르비투오마스; 오자모헤익키
Original assignee: 러세쓰 리차드 큐.; 다니스코 컬토 아메리카, 인코포레이티드.
Priority date: 1999-08-20
Filing date: 2000-08-18
Publication date: 2002-05-30
Also published as: CA2381710A1; WO2001014574A1; AU776922B2; JP2003507075A; EP1204762A4; EP1204762A1; CN1379822A; AU7062700A

Abstract

본 발명은 D-글루코노락톤의 전환에 의한 에리소르빈산의 제조에서 유용한 효소인 D-글루코노락톤 옥시다제(D-GLO)를 코딩하는 핵산 분자의 분리에 관한 것이다. 천연 발생 D-GLO의 효소적 활성을 보유하는 코딩된 단백질을 포함하여, 이러한 핵산 분자의 다양한 변형이 고려된다. 적절한 발현 벡터로 형질전환된 다양한 숙주 세포에서 본 발명의 핵산을 이용하여 D-글루코노락톤 옥시다제를 생산하는 재조합 방법이 바람직하다. 또한 글루코스를 에리소르빈산으로 전환시키고 특이적으로 D-글루코노락톤을 에리소르빈산으로 전환시키는 방법 중에 본 발명의 D-GLO를 이용하는 방법이 고려된다.

Description

Ｄ-글루코노락톤 옥시다제 유전자 및 재조합 Ｄ-글루코노락톤 옥시다제의 제조 방법{D-GLUCONOLACTONE OXIDASE GENE AND METHOD FOR PRODUCING RECOMBINANT D-GLUCONOLACTONE OXIDASE}

에리소르빈산은 아르코르브산의 C-5 에피머이며 항-산화 활성을 포함하여 본질적으로 동일한 화학적 특성을 갖는다. 그러나 에리소르빈산의 비타민 C 활성은 아르코르브산에 비해 현저히 낮으며 실제적인 비타민으로서 고려되지 않는다. 에리소르빈산은 GRAS 기능을 갖고 수많은 식품 및 그밖의 응용에서 항-산화제로서 이용된다. 에리소르빈산의 제조를 위해 현재 이용되는 화학적 방법은 2-케토글루콘산의 에르테르화에 이어 에스테르의 염기-촉매 고리화를 기반으로 소듐 에리소르베이트를 제공하는 것이다.

1960년대 이후 페니실리움(Penicillium)속에 속하는 특정한 야생-형 진균류가 글루코스상에서 배양시 소량의 에리소르빈산을 생산하는 것이 알려졌다(Yagi J. 외 Agric. Biol. Chem. 31(3) 340-345(1967)). 광범한 화학적 돌연 변이/선택 프로그램을 통해, 글루코산을 40%까지의 수율로 에리소르빈산으로 전환시킬 수 있는 페니실리움 노타툼(Penicillium notatum) 균주를 분리하였다(Shimizu K. 외, Agric. Biol. Chem 31(3) 346-352 (1967)). 그러나, 완전한 전환에 요구되는 발효 시간이 지나치게 길기(1-2주) 때문에 이 방법은 산업적 응용에 부적합하다.

페니실리움(Penicillium)에서 글루코스-에리소르빈산 경로의 효소학에 대한 후속적인 연구 결과 이 경로가 두가지 반응으로 구성됨을 확인하였다 (Takahashi T. Biotechnology and Bioengineering 11, 1157-1171 (1969)). 첫번째 반응은 잘 알려져 있는 글루코스 옥시다제에 의한 글루코스에서 글루코노락톤으로의 산화 반응이다. 이 경로의 두번째 반응은 에리소르빈산과 히드로겐 퍼옥사이드를 생성하는 산소 분자에 의한 D-글루코노락톤의 산화이다. 이 반응은 단지 수개의 진균류 종에서만 탐지되는 효소인 D-글루코노락톤 옥시다제(D-GLO)에 의해 촉매화된다. Takahashi와 공동-연구자들 (Takahashi T. 외, Agric. Biol. Chem. 40, 121-129 (1976))은 페니실리움 시아네오플붐(Penicillium cyaneofulvum) 균주로부터 D-GLO의 기본적인 효소 특성을 밝혀내었다.

본 발명은 에리소르빈산 및 그 관련염의 제조에 유용한 효소로서 D-글루코노락톤 옥시다제를 코딩하는 신규한 핵산 분자에 관한 것이다.

도 1은 MFα1 전전구펩타이드와 피.그리세오로세움(P.griseoroseum) GLO의성숙부를 코딩하는 플라스미드 pGTY (GLO)를 도해한다.

도 2는 형질전환되지 않은 에스.세레비지애(S.cerevisiae) 및 pGTY(GLO)로 형질전환된 에스.세레비지애(S.cerevisiae)의 세포 밀도 및 GLO 활성을 그래프로 나타낸 것이다.

도 3은 글루코스 옥시다제와 D-GLO를 이용하여 글루코스를 D-에리소르빈산으로 전환시키는 도식의 대표도이다.

도 4는 글루코스 디하이드로게나제와 D-GLO를 이용하여 글루코스를 D-에리소르빈산으로 전환시키는 도식의 대표도이다.

도 5는 피.파스토리스(P.pastoris) 프로모터의 조절하에 D-GLO의 완전한 코딩 영역을 포함하는 플라스미드 pPIC3.5K(GLO)를 나타낸다.

글루코스의 에리소르빈산으로의 직접적인 전환에 있어서 경제적으로 허용되는 비율과 관련된 문제들은 해결되지 않은 채로 남아있다. 본 발명은 에리소르빈산과 그 염을 생산하는 생물공학적 방법 중 유용한 D-GLO를 코딩하는 분리된 핵산을 제공한다.

본 발명은 에리소르빈산과 관련염의 생산에 유용한 효소 D-글루코노락톤 옥시다제(D-GLO)를 코딩하는 핵산 분자의 분리 및 동정에 관한 것이다.

따라서, 한 구체예에서 본 발명은 SEQ ID NO:1 (cDNA), SEQ ID NO:2(코딩) 및 SEQ ID NO:3(성숙)으로 정의되는 분리된 신규한 핵산 분자를 포함한다. 추가로 본 발명은 엄격한 조건하에 SEQ ID NOs.1-3 중 어느 하나로 혼성화되는 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 여기서 동정된 핵산 분자 중 어느 하나를 포함하는 벡터 뿐 아니라 이러한 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 또한 제공한다. D-GLO를 생산하기 위하여 동정된 핵산을 이용한 재조합 방법이 또한 본 발명에서 고려된다.

본 발명의 추가의 구체예는 SEQ ID NO:4로 확인된 단백질 및 SEQ ID NO:4와 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질을 포함하여 여기서 확인된 핵산 분자에 의해 코딩되는 D-GLO 단백질에 관한 것이다.

또한 본 발명의 또다른 구체예에서, 본 발명의 D-GLO를 이용하여 글루코스 및/또는 D-글루코노락톤을 전환시킴으로써 에리소르빈산 및 관련염을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 진균류 기원의 D-GLO를 코딩하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 바람직하게도 진균류는 페니실리움(Penicillium) 속, 예컨대 페니실리움 그리세오로세움(Penicillium griseoroseum), 페니실리움 노타툼(Penicillium notatum), 페니실리움 시아네움(Penicillium cyaneum) 및 페니실리움 디쿰벤스(Penicillium decumbens)이다. 여기서 이용된 "D- 글루코노락톤 옥시다제" (D-GLO)라는 용어는 진균류 D-GLO의 모든 천연 또는 합성 변종을 언급하며 또한 이들을 포함한다. 예를들어, 진균류 D-GLO를 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3의 서열; 또는 엄격한 조건하에 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3을 갖는 분리된 핵산 분자에 혼성화되는 서열; 또는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열과 약 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 서열을 가질 수 있다. 인터넷 사이트 http://www.ncbi.n/m.nih.gov/egi-bin/BLAST/를 찾아서 프로그램의 부족 변수를 이용하여 실행시킨 BLASTP 연산에 의해 확인된 정수의 백분율로서 약 70% 이상의 아미노산 서열 동일성을 정의할 수 있다(매트릭스 = Blosum 62; 격차 존재값 = 11; 격차 확장값 = 1).

보다 구체적으로, 본 발명의 핵산 분자는, 예컨대 결실, 삽입, 첨가 및 변이와 같은, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:3의 변종을 포함하며, 이 때 이러한 서열은 천연 발생의 D-GLO 효소 활성, 즉 에리소르빈산으로의 D-글루코노락톤의 전환능을 유지하는 단백질을 코딩한다.

또한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터와 형질전환된 숙주 세포 또는 변이된 유기체가 본 발명의 범위내에 있다. "벡터 또는 발현 벡터"는, 이에 제한하는 것은 아니나 원핵 또는 진핵 세포 또는 유기체에서의 발현을 목적으로 조절 인자 또는 정보제공 유전자를 포함하는 모든 핵산 분자 또는 바이러스를 의미한다. "형질전환된 숙주 세포"라는 것은, 분자 생물학 기술에 의해 바람직하게는 진균류 기원 그리고 가장 바람직하게는 페니실리움(Penicillium) 속으로부터 얻은 D-GLO를 코딩하는 핵산을 도입시킨 숙주 세포 (또는 그 선원)를 의미한다. 세포로 도입시킨 후, 이 핵산은 염색체외로 존재할 수 있고 또는 숙주 게놈으로 통합될 수 있다. 폭넓은 종류의 숙주 세포에서 이러한 핵산 분자가 코딩하는 D-GLO 단백질의 발현 및 분비를 달성하기 위해, 소망하는 프로모터와의 조작 가능한 결합상 본 발명의 핵산 분자가 존재하는 발현 벡터를 구성하는 것이 당업자에게 통상적이다. Sambrook 외 (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook, J., Fritsch, E.F., 및 Maniatis, T., 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press).

본 발명에서 실제적으로 유용한 숙주 세포는 형질 전환 과정을 수정할 수 있는 모든 유효한 숙주 세포이다. 예를 들어, 박테리아 세포, 예컨대 에스체리치아(Escherichia), 어비니아(Erwinia), 판토이(Pantoea), 바실러스(Bacillus), 락토바실러스(Lactobacillus) 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 속에 속하는 박테리아 세포를 이용할 수 있다. 또한 숙주 세포로서 효모를 이용할 수 있고, 예를 들어 사카로마이세스(Saccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피치아(Pichia), 한세눌라(Hansenula), 캔디다(Candida) 및 슈바니오마이세스(Schwanniomyces)속에 속하는 효모를 포함한다. 단세포 조류, 예를 들어 시네초시스티스(Synechosystis), 클라미도모나스(Chlamydomonas) 및 유글레나(Euglena)속의 단세포 조류를 이용할 수 있다. 본 발명의 분리된 핵산을 이용하여 고등 식물 세포를 형질 전환시킬 수 있다. 네이키드 DNA 또는, 식물에서 이종 유전자에 실시 가능하게 연결되어 기능하는 프로모터로 이루어진 벡터로써 식물 세포를 형질전환하는 방법이 당해 분야에 널리 알려져 있다. 예가 되는 식물로는 대두, 옥수수, 감자, 토마토, 사탕무 등이 있다. 포유류 세포를 또한 숙주 세포로서 이용할 수 있다. 바람직하게는 발현된GLO가 배양 배지에 표적화되거나, 예컨대 액포, 엽록체, 마이크로솜, 퍼옥시좀 등과 같은 세포 기관 중 하나에 표적화되어야 한다.

"핵산 또는 핵산 분자"는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성(예컨대, 화학적으로 합성되거나 변형된) DNA를 포함하여, RNA와 DNA 모두를 포괄하는 용어이다. 본 발명의 핵산 분자는 이중쇄(double-stranded)이거나 단일쇄(single-stranded)일 수 있다. 이중쇄에서 핵산은 의미쇄(sense strand) 또는 반의미쇄이다. "분리된 핵산"이라는 용어는, 플라스미드 또는 바이러스의 것들과 같이, 비-천연 서열들이 측면에 설 수 있는 핵산을 언급한다. 따라서, 핵산은 코딩 서열에 인접한 5' 비-코딩(예컨대, 프로모터) 서열을 전혀 포함하지 않거나 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. 따라서, 이 용어는, 예를 들어 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함하는 벡터 또는 페니실리움(Penicillium) 이외의 원핵 생물 또는 진핵 생물의 게놈 DNA에 병합되거나 그밖의 서열에 독립적인 분리된 분자(예컨대, PCR 또는 제한 효소 처리에 의해 생성된 cDNA 또는 게놈 DNA 단편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 또한 이 용어는 부가적인 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA 또는 RNA를 포함한다. 게다가, 이 용어는 천연으로 발생하지 않은 단편으로서 천연 상태에서는 발견되지 않는 핵산 단편을 의미한다.

추가로 이들 재조합 핵산은 다양한 재조합 숙주에서 D-GLO 코딩 서열의 전사를 증가, 조절 또는 변경시키는 모든 종류의 서열을 포함한다; 즉, 구성 또는 조절 프로모터, 전사 활성제 및 종료인자, 그리고 전사 억제제 결합, 감소 또는 반종료와 같은 여러가지 알려진 메카니즘에 의해 D-GLO의 발현을 조절하는 그밖의 서열.

"엄격한 조건하에 혼성화한다"는 것은 엄격하다고 간주된 저염과 고온의 조건 하에 핵산이 용액 또는 고체 지지체 상에서 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3의 핵산과 안정하고, 서열-특이적이며, 비-공유적인 결합을 형성하는 조건을 의미하고 Sambrook 외 (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook, J., Fritsch, E.F., 및 Maniatis, T., 2nd ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 기술되어 있다. 예를 들어 SEQ ID NO:1과 같은 기준 핵산은 니트로셀룰로스 필터상에 고정화될 수 있고, 68℃에서 0.2 X SSC (1.75g/l NaCl, 0.88g/l 소듐 니트레이트 디하이드레이트; pH 7.0)와 0.1% (w/v) 소듐 도데실술페이트의 존재하에 고정화된 기준 핵산에 특이적 및 비-공유적으로 결합하는 모든 그밖의 핵산은 엄격한 조건하에 혼성화된다고 볼 수 있다.

본 발명의 핵산 분자를 이용하여 형질전환된 숙주 세포로부터 얻은 GLO 제제 또는 D-GLO 단백질이 또한 본 발명의 범위내에 있다. 본 발명의 핵산 분자를 이용하여 형질전환된 숙주 세포를 배양시켜 배양된 세포로부터 D-GLO를 회수할 수 있다. D-GLO는 숙주 세포내에서 분비 또는 발현될 수 있다; 모든 D-GLO 코딩 영역 또는 코딩 영역의 일부는 어떠한 추가의 변형 없이 또는 개시 코돈 또는 올리고히스티딘 서열과 같은 다양한 C- 및 N-말단 확장의 첨가 이후에 발현될 수 있다. D-GLO와 D-GLO의 효소적 활성을 보유한 그밖의 단백질과의 융합 뿐 아니라 여기서 동정된 D-GLO-관련 단백질의 모든 변이된 형태가 본 발명의 범위내에 있다. 이들 돌연변이체는 임의의 또는 규제된 돌연변이에 의해 얻을 수 있다. D-GLO 활성을 갖는 이러한 단백질 제제는 가공하지 않은 것이거나 용액 중에서 정제될 수 있고 또는당해 분야에 알려진 다양한 담체 상에 고정화될 수 있다. 마찬가지로, 상기 단백질을 발현시키는 재조합 숙주 세포는 숙주 세포의 발효 중 또는 심지어 숙주 세포의 휴지기에도 에리소르빈산으로 D-글루코노락톤을 전환시키는 촉매 작용을 할 수 있다. 특히 본 발명의 사멸된 재조합 숙주 세포는 글루코스 및/또는 D-글루코노락톤을 에리소르빈산으로 전환시키는 D-글루코노락톤의 산화에 있어서 촉매로서 작용할 수 있다. 구체적으로, 글루코스 옥시다제 또는 글루코스 디하이드로게나제의 존재하에 글루코스를 D-글루코노락톤으로 전환시킬 수 있다; 그 다음 에리소르빈산을 생성하기에 충분한 시간 및 조건 하에 본 발명의 D-GLO와 D-글루코노락톤 기질을 접촉시킴으로써 D-글루코노락톤을 에리소르빈산으로 전환시킬 수 있다. 본 발명의 D-GLO에 대한 기질인 D-글루코노락톤은 글루콘산의 화학적 전환을 통해 또는 글루코스 옥시다제 또는 글루코스 디하이드로게나제에 의한 글루코스의 전환에 의해 제조할 수 있다. 이렇게 에리소르빈산을 생성하기에 충분한 시간 및 조건 하에 D-GLO와 기질을 접촉시켜 D-글루코노락톤을 에리소르빈산으로 전환한다.

총-길이의 D-GLO 코딩 서열을 어떠한 변형없이 이용하거나 당해 분야에 잘 알려진 방법에 의해 변형시킬 수 있다. 예를 들어, N- 또는 C-말단의 아미노산 서열을 삭제하거나 적절한 숙주에서 D-GLO의 분비를 개선하기 위해 알려져 있는 다양한 전- 또는 전전구-펩타이드(시그날 펩타이드)를 치환시킬 수 있다. D-GLO 폴리펩타이드의 분류 및 표적화를 조절하는 다양한 그밖의 아미노산 서열을 총 길이의 D-GLO 또는 GLO 활성을 보유하는 D-GLO 코딩 서열의 일부와 융합시킬 수 있다.

또한 본 발명의 D-GLO는 융합 단백질로서 발현 가능하다. 구체적으로, 이것은 보조제 및/또는 글루코스 옥시다제, 카타라제 등과 같은 연합 효소 활성을 제공하는 단백질 도메인에 융합될 수 있다. 마찬가지로, 특이적인 리간드에 대한 높은 친화력(예컨대, 스트렙타비딘, 말토스-결합 단백질, 셀룰로스- 및 그밖의 폴리사카라이드-결합 도메인)이나 융합 단백질의 개선된 안정성 및/또는 용해성(예컨대, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 또는 글루타치온 S-트랜스퍼라제)과 같은 알려져 있는 그밖의 유용한 기능을 제공하는 도메인에 D-GLO를 융합시킬 수 있다.

효소 처리 중 본 발명의 재조합 D-GLO를 중요한 요소로서 이용하여, 바람직하게는 섬유질 진균류(예컨대, 아스퍼질러스(Aspergillus) 또는 페니실리움(Penicillium)속에 속하는 진균류) 또는 고 분비력을 갖는 효모 종(예컨대, 피치아(Pichia) 또는 한세눌라(Hansenula)속에 속하는 효모)과 같이 글루코스를 에리소르빈산으로 전환시키는 유효한 숙주에서 에리소르빈산을 생성할 수 있다. D-GLO에 추가하여, 이러한 처리는 두가지 이상의 그밖의 효소를 포함시키며, 바람직하게는 글루코스 옥시다제(또는 글루코스 디하이드로게나제, 헥소스 옥시다제 또는 피라노스 옥시다제와 같이 중복 특이성을 갖는 효소) 및 카타라제를 포함한다. 글루코스 옥시다제와 GLO에 기초한 본 처리의 근간이 되는 화학 반응의 서열을 도 3에서 설명한다. 간단히, 산소 분자에 의해 글루코스를 D-글루코노-d-락톤으로 산화시킨다. 글루코스 옥시다제(또는 헥소스 옥시다제, 피라노스 옥시다제, 글루코스 디하이드로게나제 등)가 이 반응의 촉매 작용을 하며 부산물로서 히드로겐 퍼옥사이드를 생성한다. 이어서 D-글루코노-d-락톤으로부터 에리소르빈산으로의 전환에 D-GLO가 촉매 작용을 한다. 또한 이 반응에서 산소 분자가 소비되고 히드로겐 퍼옥사이드가 형성된다. 수용액 중 D-글루코노-d-락톤은 글루콘산 및 D-글루코노-γ-락톤과 평형상태에 있다고 알려져 있다. 또한 D-글루코노-γ-락톤은 D-GLO의 기질이다. 두가지 모두의 D-글루코노락톤은 GLO에 의해 동일한 생성물인 에리소르빈산으로 산화된다. 자발적인 글루코노락톤 가수분해 반응은 비교적 느리며, 만약 반응 혼합물 중에 충분히 높은 농도의 GLO 및 산소 분자가 존재한다면 가수분해 반응을 최소화할 수 있다. 게다가, 이 반응의 가역성 때문에, 글루콘산은 결국 에리소르빈산으로 산화가능한 락톤을 형성한다. 글루코스 옥시다제에 의해 그리고 D-GLO에 의해 촉매화되는 양 반응은 부산물로서 히드로겐 퍼옥사이드를 생성한다. 히드로겐 퍼옥사이드는 공정에 수반되는 효소를 불활성화시킬 수 있는 고도로 반응적인 기질이다. 따라서 히드로겐 퍼옥사이드는 반응 혼합물로부터 지속적으로 제거되어야 한다. 히드로겐 퍼옥사이드를 제거시키는 바람직한 방법은 카타라제를 이용하는 것이다. 여러가지 활성화 산소 종을 제거하는 그밖의 알려진 제거제, 예컨대 슈퍼옥사이드 디스뮤타제를 이용하는 것이 본 발명을 수행하는데 유리하다.

글루코스를 글루코노락톤으로 전환하는데 있어서 촉매로서 글루코스 디하이드로게나제를 이용하면, 글루코스 디하이드로게나제-촉매 반응 중 소비되는 NAD+의 재생과 히드로겐 퍼옥사이드의 제거가 결부될 수 있다. 도 4는 본 발명의 이러한 구체적인 실행에 대한 전체의 반응 도식이다. 본 발명에 따라 글루코스를 에리소르빈산으로 전환시키는 바람직한 방법은 단일한 반응기내에서 전체 반응을 수행하는 것이고, 이 때 글루코스와 글루코노락톤의 산화가 동시적으로 진행된다. 그러나, 글루코스에서 글루코노락톤으로의 전환 및 글루코노락톤에서 에리소르빈산으로의전환이 개별적으로 수행되는 실행 또한 가능하다. 또한 본 발명의 재조합 D-GLO를 이용하여 에리소르빈산을 생성하기 위해 출발 물질로서 글루코노락톤, 글루콘산 또는 이 둘의 혼합물을 이용하는 것이 유효하다.

또한 이미 글루코스를 글루코노락톤으로 전환시킬 수 있는 숙주에서 본 발명의 D-GLO 핵산을 발현시킬 수 있다. 수많은 이러한 미생물 숙주가 당해 분야에 알려져 있다. 통상적으로 이러한 미생물은 글루코스 옥시다제(예컨대, 아스퍼질러스(Aspergillus) 및 페니실리움(Penicillium)속에 속하는 많은 진균류 종) 또는 글루코스 디하이드로게나제를 이용하여 글루코스를 글루코노락톤으로 산화시킨다. 막-결합 글루코스 디하이드로게나제를 생성하는 여러가지 속에 속하는 수많은 박테리아 종이 적절할 것이다. 또한 높은 수준의 카타라제를 충분히 발생시키는 숙주를 선택하는 것이 유리하다. GLO를 발현시키는 이러한 재조합 숙주를 글루코스-함유 배양 배지상에서 발효시킬 때 글루코스로부터 직접 에리소르빈산을 얻을 수 있다.

추가로, 글루코스 옥시다제, 글루코스 디하이드로게나제, 및/또는 카타라제를 발생시키는 별개의 숙주와 함께 본 발명의 재조합 D-GLO-발현 숙주를 공동-배양할 수 있다. 이 구체예에서, 에리소르빈산은 한-단계 혼합 발효에 의해 생산될 수 있다.

구체적으로 글루코스에서 에리소르빈산으로의 직접 발효를 위해서는 두 종류의 재조합 숙주가 적절할 것이다 - 효모와 섬유질 진균류.

이에 대하여 실시예 9에서 D-GLO 유전자가 피치아 파스토리스(Pichiapastoris)와 같은 효모에서 효과적으로 발현될 수 있음을 입증하였다. 이종 단백질을 유효하게 분비한다고 알려진 그밖의 어떠한 효모 숙주, 예를 들어 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 또는 클루이베로마이세스 마르지아누스(Kluyveromyces marxianus)를 또한 이용할 수 있다. 실시예 9에서 이용된 발현계는 글루코스-억제 프로모터를 기반으로 하며 따라서 글루코스를 에리소르빈산으로 발효시키는 재조합 숙주의 구성에 매우 적절하지 않다. 그러나, 글루코스에 의해 억제되지 않는다고 알려진 강력한 프로모터를 기재로 하는 피.파스토리스(P.pastoris)의 동등하게 유효한 발현계, 예를 들어 스트라타젠의(Stratagene's) 발현 pGAPZ 벡터 시리즈를 기재로 하는 발현계가 알려져 있고 그러한 숙주의 구성에 이용되어야 한다. 해당 유전자의 그밖의 프로모터를 또한 이용할 수 있다.

GLO 유전자를 발현시키는 것에 추가하여, 이 발효 공정에 이용된 재조합 효모 숙주는 글루코스 옥시다제를 발현시켜야 한다. 예컨대 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)에서 얻은 글루코스 옥시다제는 효모에서 유효하게 발현된다고 알려져 있다(De Baetselier A. 외,Fermentation of a yeast producing A.niger glucose oxidate...Bio/Technology 9, 559-561(1991)). 또한 바람직하게 분비된 카타라제 유전자의 과-발현은 글루코스를 에리소르빈산으로 발효시키는 효모 숙주의 매우 유용한 유전적 추가 특성이다.

효모 숙주와 대조적으로, 수많은 야생-형 섬유질 진균류는 높은 수준의 글루코스 옥시다제와 카타라제를 발생시킨다. 따라서 이들 두 효소를 코딩하는 유전자를 유전적으로 처리하여 과-발현시키는 것은 효모 숙주의 경우처럼 그다지 필수적인 것이 아니다. D-GLO의 (과-) 발현에서, 고도로 발현된 해당 유전자의 프로모터가 적절하다. 글루코스상에서 배양되는 동안 높은 활성을 보유하는 그밖의 프로모터, 예를 들어 진균류의 TEF1 프로모터를 또한 이용할 수 있다.

효모와 달리, 수많은 섬유질 진균류는 글루코노락토나제를 생성한다. 예를 들어, 고 통기성 조건하에 성장한 에이.나이거(A.niger)에서 글루코노락토나제의 수준이 현저히 높다(Whtteveen C.F.B. 외,Induction of glucose oxidate, catalase and lactonase in Aspergillus niger , Curr. Genetics 24, 408-416 (1993)). 통상의 기질 글루코노-δ-락톤에 대하여 글루코로락토나제는 GLO와 경쟁하고, 따라서 에리소르빈산으로의 글루코스의 전환을 방해한다. 그 결과 글루코노락토나제는 바람직하게 불활성화되어야 한다. 글루코노락토나제 유전자(들)의 돌연 변이를 통한 유전적 방법 또는 GLO가 아닌 글루코노락토나제만을 선택적으로 억제하는 발효 조건을 선별함으로써 불활성화를 달성할 수 있다. 불활성화를 달성하는 한가지 바람직한 방법은 글루코노락토나제의 선택적인 저해제를 발효 배지에 첨가시키는 것이다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 충분히 높은 수준의 재조합 D-GLO를 발현시키는 각각의 미생물 숙주를 발효시킴으로써 글루코노락톤, 글루콘산 또는 이들 두 기질의 혼합물로부터 에리소르빈산을 생성한다.

본 발명을 다음 구체예로써 추가로 설명하나, 이에 제한하는 것은 아니다.

실시예 1

GLO 활성

글루코노-δ-락톤, 글루코노-γ-락톤(D-글루코노락톤) 및 글루콘산의 평형 혼합물을 기질로서 이용하여 GLO 활성을 측정하였다. 이 혼합물은, 결정성 글루코노-δ-락톤을 50% 농도(w/v)로 물에 용해시키고 며칠동안 50℃에 방치시킴으로써 제조한 것이다. 2mM 히드록시퀴놀린, 12μM 2,6-디클로로페놀인도페놀 및 70mM 기질을 포함하는 pH 5.6, 50mM 포타슘 비프탈레이트 완충액에서 반응을 수행하였다. 2,6-디클로로페놀인도페놀과 기질은 측정 직전에 원액 형태로 반응 혼합물에 첨가시켰다. 또한, 실험에 이용된 기질 용액의 일정 부분은 사용 직전에 pH 5.8로 신속히 조절하였다. 효소 반응에 이어 시간의 경과에 따라 에리소르빈산에 의한 2,6-디클로로페놀인도페놀의 감소가 야기하는 흡수를 600nm에서 기록한다. 효소 용액을 분석 전 2분간 끓였다는 점에서 반응 혼합물과 차이가 있는 대조군을 포함시켰다. 알려진 양의 에리소르빈산을 반응 혼합물에 첨가시킴으로써 얻은 눈금 곡선을 이용하여 이 반응에서 생성된 에리소르빈산의 양을 산출하였다. 상기 기술한 조건하 그리고 30℃에서 분당 생성되는 에리소르빈의 μ 몰로서 활성을 표시하였다.

실시예 2

피.그리세오로세움( P.griseoroseum )으로부터 동종 GLO의 정제

이전에 Takahashi T. 외, Agric. Biol. Chem. 40, 121-129 (1976)에서 발표된 것와 유사한 방법을 이용하여 피.그리세오로세움(P.griseoroseum) 균주 ATCC 10431로부터 GLO를 동질하게 정제하였다.

2 리터 얼렌멜리어(Erlenmelyer) 플라스크 중 YEPD 배지(2% 박토-펩톤, 1% 효모 추출물, 2% 글루코스)의 여러개의 200ml 부분을 감자-덱스트로스 아가(Difco) 플레이트에서 일주일동안 성장시킨 피.그리세오로세움(P.griseoroseum) 포자의 2ml 현탁액으로 접종시켰다. 이 배양액을 30℃에서 180rpm의 회전 세이커를 이용하여 2일동안 성장시키고, 15ℓ 발효기에서 이 배양액 0.5ℓ를 이용하여 10ℓ의 유도 배지(8% 글루코스, 0.2% KH₂PO₄, 0.1% (NH₄)₂SO₄, 0.1% (NH₂)₂CO, 0.1% NaNO₃, 0.1% MgSO₄·7H₂O, 1% MnSO₄·7H₂O, 0.001% ZnSO₄·7H₂O, 0.5% CaCO₃, pH 5.5)에 접종시켰다. 박테리아의 오염을 피하기 위해 몇몇 발효 중에 클로람페니콜(2.5mg/l)과 테트라시클린(3mg/l)을 사용하였다. 발효는 30℃에서 60시간 동안 진행되었다(통기-5ℓ/분, 교반-300rpm).

소결된 유리 필터상에서 여과에 의해 균사체를 수집하고 물과 완충액 A(10mM 포스페이트 완충액, pH 6.5, 0.1mM EDTA 포함)로 세척하였다. 1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드를 함유하는 동일한 완충액에서 유리알 분쇄기를 이용하여 세포를 붕괴시켰다. 붕괴 과정은 순환간 그리고 순환중 빙-수 냉각을 이용하여 주기적으로 이루어졌다. 주기의 길이는 4℃-22℃의 범위내에 현탁액의 온도를 유지하도록 조절되고 주기의 수는 적어도 90% 이상의 세포 파손(현미경으로 관찰)을 달성하도록 조절되었다. 동종물을 19000 x g에서 30분간 원심분리시키고 효소의 정제를 위해 상등액을 이용하였다.

세포 추출물 리터 당 약 80ml의 DEAE-세파로스 FF (Pharmacia)를 첨가하고 현탁액을 느린 교반과 함께 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 여과에 의해 수지를 제거하고 동일한 조건하에 새로운 DEAE-세파로스 부분을 이용하여 여과물을 처리하였다. 이 처리로 단지 미소량의 GLO를 수지 상에 흡착시키며 밸러스트 단백질의 상당한 부분을 제거시켰다. 암모늄 술페이트(60-100% 포화)를 이용하여 여과물로부터 GLO를 침전시켰다. 완충액 A의 여러 변경에 반하여 암모늄 술페이트 침전물을 투석시켰다. 투석된 효소 용액을 충분한 완충액 A로 희석시켜 그 도전율이 1.25mS가 되게 하고 동일한 완충액을 이용하여 평형화된 DEAE-세파로스 FF의 칼럼(샘플 ml 당 약 5ml 칼럼층 부피)에 적용시켰다. 280nm에서 배경 수치까지 떨어진 흡착에 이를 때까지 완충액 A를 이용하여 0.15 부피층/h로 칼럼을 용출시키고 이어서 완충액 A중 NaCl의 선형 구배를 이용하여 용출시켰다(0-100mM NaCl, 총 구배 부피 = 2 칼럼층 부피). 아미콘(Amicon) 초여과 장치 및 XM 50 막을 이용하여 활성 피크 분획을 혼주(pooled) 및 농축시키고 완충액 A에 평형화된 세파크릴 S-300 HR (Pharmacia)의 200cm 칼럼 상부에 적용시켰다. 칼럼을 선형률 0.5cm/분으로 용출시켰다. 겔 여과 칼럼에서 얻은 활성 분획을 수집하고 완충액 A에 평형화된 히드록시아파타이트 칼럼(Bio-Gel HT, Bio-Rad)의 상부에 적용시켰다. 칼럼층 부피는 샘플 부피의 0.13이고 용출률은 분당 0.1 층 부피였다. 암모늄 술페이트 선형 구배(0-7.5%)를 이용하여 완충액 A에서 칼럼으로부터 GLO를 용출시켰다. 구배의 총 부피는 약 36 칼럼층 부피였다. GLO의 가장 높은 활성을 갖는 분획을 혼주시키고 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 혼주물을 분석하였다. 68-80kDa의 분자량에 명백하게 상응하는 단일의 강한 확산 밴드와 약 34kDa에서 매우 약한 밴드가 관찰되었다. 전형적인 정제 실험 결과를 표 1에 요약하였다.

실시예 3

GLO의 아미노산 서열 분석

The Institute of Biotechnology, 헬싱키의 Protein Analysis Laboratory에서 상업용 서비스로써 분석이 이루어졌다. 실시예 2의 정제된 GLO 제제는 N-말단의 서열 분석에서 동종인 것으로 밝혀졌다. 다음의 N-말단 서열을 발견하였다: Tyr Arg Trp Phe Asn Trp Gln Phe Glu Val Thr Nnn Gln Ser Asp Ala Tyr Ile Ala Pro His Asn Glu His...(SEQ IN NO.:5) ("Nnn"은 이 위치에서 해석가능한 시그날이 관찰되지 않은 것을 의미하고, 대부분 유도되지 않은 시스테인 잔사 또는 글리코실화아미노산 서열의 존재로 설명할 수 있다). 추가로 이 단백질은 4-비닐피리딘으로 알킬화되고, Lys-C-프로테아제로 소화되며 역상 HPLC를 이용하여 소화물로부터 여러개의 펩타이드를 분리한다. 질량-분광계를 이용하여 다음 펩타이드 서열을 확정하였다:

펩타이드 1 - Glu His Asp Arg Met Thr Val Cys Gly Pro His Phe Asp Tyr Asn Ala Lys (SEQ ID NO:6);

펩타이드 2 - Glu Tyr Ile Cys Tyr Asp Glu Val Thr Asp Ala Ala Ser Cys Ser Pro Gln Gly Val Val (SEQ ID NO:7);

펩타이드 3 - Cys Gln Phe Val Asn Glu Phe Leu Val Glu Gln Leu Gly Ile Thr Arg (SEQ ID NO:8).

실시예 4

피.그리세오로세움( P.griseoroseum ) 염색체 DNA의 분리

실시예 2에서 기술한대로 YEPD 배지 중 피.그리세오로세움(P.griseoroseum)을 성장시켰다. 균사체를 물과 완충액(실시예 2)으로 세척하고 냉동-건조시켰다. 약 50mg의 건조 균사체를 액상 질소하에 모르타르에서 빻았다. 미세하게 분쇄된 균사체를 500㎕의 추출 완충액(250mM NaCl, 25mM EDTA, 20mM 트리스 HCl, pH 8.5, 0.5% SDS)에 현탁시키고, 350㎕의 페놀을 첨가시켰으며 이 혼합물을 교반시켜 균질한 현탁액을 형성하였다. 150㎕의 클로로포름을 현탁액에 첨가시키고 이어서 한시간 동안 고속 원심분리시켰다(탁자용 미니-원심분리기에서 13500rpm). 수상을 새로운 실험 튜브로 옮기고 10㎕의 10% 리보뉴클레아제 A 용액을 첨가시켰다. 이 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 1/10 부피의 5M Na-아세테이트 완충액(pH 5.4)을 용액에 첨가시키고 이어서 0.6 부피의 이소프로판올을 첨가시켰다. 원심분리(10분, 13500rpm)에 의해 DNA를 회수하고 70% 에탄올로 2회 세척하였으며, 진공-건조 및 100㎕ 물에 용해시켰다.

실시예 5

GLO를 코딩하는 염색체 DNA의 단편 클로닝

GLO SEQ ID NO:5 - SEQ ID NO:8의 부분적인 아미노산 서열을 기초로 수많은 별개의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였고 주형으로서 피.그리세오로세움(P.griseoroseum)의 염색체 DNA를 이용하여 이를 PCR 중 프라이머로서 시험하였다.

다음 프로그램을 이용한 PTC-255 DNA Engine 장치(MJ Research Inc., MA, USA)에서 PCR을 수행하였다; 94℃에서 2분; 10 주기 (94℃에서 30초; 50℃에서 45초; 72℃에서 3분)에 이어서 30주기(94℃에서 30초; 60℃에서 45초; 72℃에서 3분). 각 반응은, 약 25ng의 주형 DNA, Taq DNA 폴리머라제 0.75 유닛(Boehringer Mannheim), 올리고뉴클레오타이드 프라이머 각 0.75μM, 네가지 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트 각 200μM(dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 10 X 완충 농축물 1.5㎕(Taq 폴리머라제의 제조사에서 공급됨)를 함유하는 15㎕ 용액에서 수행된다. PCR의 생성물을 통상의 기술을 이용한 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다 (Maniatis T. 외, (1982) Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory).

한쌍의 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 우수한 결과를 나타내었다: 의미올리고뉴클레오타이드 TAYCGITGGTTYAAYTGGCA (SEQ ID NO:)와 반의미 올리고뉴클레오타이드 CCIARYTGYTCIACIARRAAYTCRTTIACRAAYTGRCA (SEQ ID NO:10). 이들 서열에서 "I"는 이노신 포스페이트 잔사, R - 아데노신과 구아노신 포스페이트 잔사의 혼합, 및 Y는 티미딘과 시토신 포스페이트 잔사의 혼합을 의미한다. 이 한쌍의 올리고뉴클레오타이드로 얻어진 PCR 생성물(약 1.2kb)을 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제하고 Invitrogen에서 공급한 TOPO TA 클로닝 키트를 이용하여 pCR2.1-TOPO 벡터(Invitrogen)으로 클로닝함으로써 플라스미드 pCR(GLO)을 야기시켰다.

실시예 6

피.그리세오로세움( P.griseoroseum ) cDNA 라이브러리의 구성

GLO 생성을 유발시키는 조건 하에(실시예 2) 미네랄 배지상에서 성장한 피.그리세오로세움(P.griseoroseum)으로부터 전체 RNA를 분리하였다. (-70℃에서 냉동 저장된) 균사체를 액상 질소하에 모르타르에서 분쇄하였다. 3g의 미세하게 분쇄된 균사체를 빙-냉 RNA-추출 완충액(4M 구아니딘 티오시아네이트, 0.5% Na 라우릴사르코신, 25mM Na 시트레이트, 100mM β-메르캅토에탄올) 10ml에 격렬한 교반과 함께 현탁시켰다. 이 혼합물을 4℃에서 10000rpm (SS-34 로터, Sorvall)으로 6분간 원심분리시켰다. 10ml의 상등액을 새로운 튜브에 옮기고 4g의 CsCl을 첨가시켰다. 후속의 단계에서 이용되는 모든 용액을 디에틸피로카르본이트-처리수 및 유리제를 이용하여 제조하였다. RNA-함유 용액을 1.2ml의 5.7M CsCl, 0.1M EDTA, pH 7의 상부에 층으로 깔고 15℃에서 33000rpm으로 약 20시간 동안 원심분리시켰다. 소량의 물을 이용하여 침전물을 신속히 씻어내고 100㎕의 물에 용해시켰다. 이 침전물로부터Oligotex Midi 키트(Qiagen)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 mRNA를 분리하였다. 스트라타젠의 cDNA 합성 키트 및 λZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning 키트를 이용하여 이들 키트가 제공하는 지시에 따라 피.그리세오로세움(P.griseoroseum)으로부터 cDNA 라이브러리를 제조하였다.

실시예 7

피.그리세오로세움( P.griseoroseum ) cDNA 라이브러리로부터 총-길이의 GLO cDNA의 분리

EcoRI 제한 효소와 예비 아가로스 겔 전기영동에 의해 염색체 GLO 유전자의 일부를 함유하는 1.2kb DNA 단편을 플라스미드 pCR(GLO) (실시예 5)로부터 분리하였다. 제한효소 소화, 플라스미드 DNA 및 DNA 단편 등의 분리를 위해 표준의 유전 공학 기술을 이용하였다 (Maniatis, T. 외, (1982) Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory). Random Primed DNA labeling 키트(Boehringer Mannheim)와 [αP³²]-dCTP를 이용하여 이 단편을 방사성 표지화하였다.

실시예 6의 λ-파지 라이브러리를 평판시키고 λZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning 키트를 이용하여 스트라타젠이 제공하는 매뉴얼에 따라서 표지화된 1.2kb 단편을 이용한 DNA 혼성화에 의해 스크린하였다. 수많은 양성 플라크가 확인되었고 이들 중 20개로부터 재조합 파지가 정제되었으며 동일한 매뉴얼의 프로토콜에 따라서 플라스미드 형태로 전환시켰다. 이들 20개의 플라스미드를 EcoRI와 XhoI를 갖는 제한 효소에 의해 분석하였고 별개의 크기를 갑는 삽입을 포함하는 것을 발견하였다. 한개의 작은 DNA 단편이 모든 플라스미에 존재하며 이것은 모든 cDNA 클론이 동일한 유전자로부터 유래되었음을 제안한다. 가장 큰 플라스미드(pGLO 1.8)는 약 1.8kb 크기의 삽입으로 포함된다. 전체 삽입은 Eurogentec Bel. S.A.(벨기에)의 상업용 서비스를 이용하여 서열화된다. 서열 분석으로 플라스미드 pGLO 1.8의 삽입이 GLO cDNA의 완전한 코딩 영역(1443bp, 종료 코돈 포함), 70bp의 5'-미번역 서열 및 261bp의 3'-미번역 서열 (SEQ ID NO:1)을 포함하는 것이 밝혀졌다. 이 서열은 480 아미노산 잔사의 단백질을 코딩한다(SEQ ID NO:4).

피.그리세오로세움(P.griseoroseum) GLO의 추론된 아미노산 서열을 인터넷을 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/nphnewblast?Jform=0)통해 GenBank가 제공하는 BLAST 서비스를 통해 알려진 단백질 아미노산 서열과 비교하였다. 많은 단백질 서열이 동일하다는 것을 확인하였다. 단지 기능이 확증된 단백질만을 고려한다면, 가장 높은 상동관계는 캔디다 알비칸스(Candida albicans)의 D-아라비노노락톤 옥시다제와 래트의 L-글루코노락톤 옥시다제와 같은 그밖의 락톤 옥시다제에서 관찰되었다.

피.그리세오로세움(P.griseoroseum)에서 정제된 GLO를 이용하여 결정되어진 N-말단의 아미노산 서열 (실시예 3, SEQ ID NO:5)은 아미노산 잔사 21에서 출발하여 추론된 GLO의 서열 (SEQ ID NO:4)과 동일하다. 이러한 관찰과, 번역된 GLO 코딩 서열의 1-20 영역에서 소수성 아미노산 잔사의 발군은 피.그리세오로세움(P.griseoroseum) GLO가 N-말단의 시그날 펩타이드를 포함한다는 것을 강력하게 시사한다. 그밖의 락톤 옥시다제가 시그날 펩타이드를 갖지 않으며분비된다고 알려진 바 또한 없기 때문에 GLO 내 시그날 펩타이드의 존재는 예상하지 못한 것이다. 게다가, 피.그리세오로세움(P.griseoroseum) GLO의 추론된 서열은 8 임시-결합된 글리코실화 부위를 포함한다. 분리된 GLO는 폴리아크릴아미드 겔 상에서 확산 밴드로서 나타나며 이것은 실제로 당단백질을 암시한다. 그러나, 본 발명자들은 피.그리세오로세움(P.griseoroseum)의 세포 추출물로부터 GLO를 분리하였다. 이것은 GLO가 그 천연의 숙주 중 골지(Golgi) 장치로부터 세포질내 세포기관으로 향했거나 또는 분비되었으나 세포와 결합하여 잔존하는 것으로 추측할 수 있다.

실시예 8

이종성 숙주에서 피.그리세오로세움( P.griseoroseum ) GLO 유전자의 발현

추론된 GLO 서열은 분비되는 단백질의 많은 특성을 표시하므로 효모 분비성 발현은 클론된 GLO cDNA의 기능성을 시험하는데 가장 적절할 것으로 보인다. GLO의 발현에 이용되는 발현 벡터는 잘 알려진 효모-이.콜라이(E.coli) 셔틀 벡터 pJDB207을 기재로 한다 (Beggs.J.D-, in Wiliamson R., (ed.) Genetic Engineering 2, Academic Press (1981)). 2 단계로 발현 벡터를 구성하였다. 첫째로, 세개의 DNA 단편을 동시에 결찰시켜 pAC109를 구성하였다: (1)사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) PHO5 유전자의 프로모터 영역에서 얻은 0.45kb BamHI-Eco47III 단편; (2)MFα1 유전자의 3'-비코딩 영역 중 116bp와 효모 α-인자 전구체 단백질의 전전구펩타이드 서열에 상응하는 코딩 영역의 일부(MFα1-전전구펩타이드)를 함유하는 에스.세레비지애(S.cerevisiae) MFα1 유전자에서 얻은 0.38kb HaeIII-HindIII 단편; (3)BamHI와 HindIII를 갖는 제한 효소에 의해 얻어진 pJDB207의 약 6.5kb 단편. 둘째로, 합성 폴리링커를 pAC109의 HindIII 부위로 삽입시켰다.

폴리링커는 두개의 올리고뉴클레오타이드로 구성된다: 상부쇄(top strand) 뉴클레오타이드는 AGCTCTCGAGATCTCCCGGGA (SEQ ID NO:11)이고 기부쇄(bottom strand) 뉴클레오타이드는 AGCTTCCCGGGAGATCTCGAC (SEQ ID NO:12)이다. HindIII 부위가 Mfα1 전전구-영역에 인접하게 위치하도록 이러한 배향으로 삽입된 폴리링커를 갖는 플라스미드를 선별하고 pGTY라 명명한다.

플라스미드 pGLO1.8을 주형으로서 이용하여 PCR을 수행함으로써 Mfα1 전전구펩타이드와 융합을 구성하기에 적절한 형태로 클론된 GLO 유전자의 DNA 서열을 변형시켰고, 두개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 GLO 유전자의 벡터 하류에 서냉상동결합(annealing)하는 "의미(sense)" 프라이머: GAAGAAGCTTACCGGTGGTTCAATTGGCAGTTTTTGGT (SEQ DI NO:13)과 "반-의미(anti-sense)" 프라이머: CACGACGTTGTAAAACGACGGCCAG (SEQ ID NO:14)이다. 이 단계에서 GLO 유전자로 변형이 도입되었다. 5'-비코딩 서열과 추론된 GLO 코딩 서열의 아미노산 잔사 1-20에 상응하는 서열 모두를 삭제하고 Mfα1-전저구펩타이드와 성숙 GLO의 인-프레임(in-frame) 융합이 가능한 위치에 HindIII 부위를 도입시켰다. 이 PCR 반응의 생성물을 HindIII와 XhoI로 소화시키고 동일한 쌍의 제한 효소로 소화된 pGTY와 결찰시켰다 .

생성된 플라스미드 pGTY(GLO) (도 1)은 Mfα1 전전구펩타이드와 피.그리세오로세움(P.griseoroseum) GLO (SEQ ID NO:15)의 가정의 성숙부로 구성된 융합 단백질을 코딩한다.

에스.세레비지애(S.cerevisiae) 균주 GRF18 (ATCC 64667, 게노타입: MATα, leu2-3, leu2-112, his3-11, his3-15은 "리튬" 형질전환법을 이용하여 류신 프로토트로피로 형질전환되었다 [Sherman F.외, Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Gentics pp-121-122, Cold Spring Harbor Laboratory (1986)].

대조군으로 이용된 수용체 균주 뿐 아니라 형질전환된 클론 중 하나를 0.3ℓ SC-his 배지(0.67% 효모 질소 기재 w/o 아미노산, Difco, 2% 글루코스, 100mg/l 히스티딘; 비-형질전환된 대조군 균주를 위해 100mg/l의 류신을 또한 첨가시켰다)에서 초기 정지기(회전 세이커, 180rpm, 30℃)까지 성장시켰다. 이 배양액에서 얻은 효모 세포를 각 10ℓ의 저-포스페이트 (PEP) 배지를 담고있는 두개의 동일한 15ℓ 발효기를 접종하는데 이용하였다. PEP 배지를 제조하기 위해 박토-펩톤 (Difco) 8% 용액을 pH 11에서 100℃로 5분간 CaCl₂(0.4M 농도로 첨가)를 이용해 처리하였다. 펩톤 용액을 실온까지 냉각시키고, pH를 5.5로 조절한 다음 여과지와 포어-크기 0.4㎛ 막을 통해 여과하고 무-포스페이트 펩톤의 보존 용액으로 이용하였다. PEP 배지는 2% 무-포스페이트 펩톤과 5% 글루코스를 함유한다. 발효 조건은: 교반 - 300rpm, 통기 - 5ℓ/분, pH - 4M NaOH 첨가에 의해 5.5로 유지한다. 배양액 샘플을 적절한 간격으로 취한다. 600nm에서 흡수를 측정하여 세포 밀도의 결과를 얻는다. 원심분리에 의해 세포를 제거한 다음 Centriplus 막(Amicon)을 이용하여 약 500-배로 배지 샘플을 농축시켰으며 일회용 EconoPack 10 DG 미니-칼럼(BioRad)를 이용한겔 여과에 의해 발효 배지 중 저 분자량 성분들을 제거시킨 후 GLO 활성을 측정하였다. 약 60-70 시간의 발효 후 GLO 피크(약 2.4mU/ml)를 측정하였다. 형질전환되지 않은 수용체 균주의 대조군 발효에서는 어떠한 GLO 활성도 나타나지 않았다.

결국 이 실험 결과 플라스미드 pGLO 1.8 중 GLO 유전자의 cDNA 클론은 실제로 기능적이다. 에스.세레비지애(S.cerevisiae)는 이종 단백질의 분비에 대해 비교적 불충분한 숙주로 알려져 있다. 따라서 GLO 유전자를 보다 높은 분비력을 갖는 그밖의 진균류 종 - 섬유질 진균류 또는 그밖의 효모에 도입시 재조합 GLO의 발현 수준이 보다 높아질 것으로 예상된다.

실시예 9

메틸영양(methylotrophic) 효모 중 GLO 유전자의 발현

GLO 유전자의 코딩 영역을 올리고뉴클레오타이드 프라이머: CAAAGCTTCTAGAGCCTCAGACCACTCATATCACATC (SEQ ID NO:14)와 CCAACAATTGATGCTGAGCCCTAAGCCGGCTTTCCTGC (SEQ ID NO:16)를 이용한 PCR에 의해 증폭시켰다. 생성된 DNA 단편을 제한 엔도뉴클레아제 Xbal과 MfeI로 소화시키고 AvrII와 EcoRI로 소화된 플라스미드 pPIC3.5K (Multi-Copy Pichia Expression 키트, Invitrogen Corp.)와 결찰시켰다. 생성된 플라스미드 pPIC3.5K (GLO 51-3)은 피.파스토리스(P.pastoris) AOXI 프로모터 (도 5)의 조절하에 GLO 유전자의 완전한 코딩 영역을 포함한다.

Invitrogen이 추천하는 방법에 따라 피.파스토리스(P.pastoris) 균주 GS115를 pPIC3.5K (GLO 51-3)로 형질전환시켰다.

독립적으로 얻어진 여러개의 형질전환된 클론을 BMGY(효모 추출물 - 1% 펩톤 - 2% 포타슘 포스페이트 완충액, pH 6.0-100mM, 1% 글리세롤, 1.34% 효모 질소 기재(Difco), 0.4mg/l 바이오틴) 중 회전 세이커(30℃, 200rpm)에서 배양하였다. 초기 정지기에 도달한 후, 저속(4000rpm) 원심분리에 의해 세포를 수집하고, 재-현탁 시켰으며 0.5% 메탄올이 글리세롤을 대신한 것을 제외하고는 상기 BMGY와 동일한 같은 부피의 BMMY에서 하룻밤동안 배양하였다.

이 실험에서 배양 상등액 중 가장 높은 GLO 발현 수준은 약 0.4-0.5U/ml으로 측정되었다.

이 수치는 에스.세레비지애(S.cerevisiae)의 GLO 발현 수준보다 약 200배 높은 것이다.

실시예 10

재조합 GLO 생성 피.파스토리스( P.pastoris )의 정제

재조합 GLO의 예비 분리를 위해, (K.Sreckrishna 외, Biochemistry, 1989, 28, 4117-4125)에 필수적으로 기술된 급식-회분 방법을 이용하여 재조합 피.파스토리스(P.pastoris) 균주 GS115::pPIC3.5(GLO51-3)를 101 발효기에서 배양하였다.

배양 후, 원심분리에 의해 세포를 분리하고 맑아진 배양 배지의 pH를 6.5로 조절하였으며 500ml의 DEAE 세파로스 FF를 첨가시켰다. 현탁액을 4℃에서 하룻밤동안 교반시킨 다음 침강에 의해 DEAE 세파로스를 수집하였으며 칼럼에 충진시키고 1mM EDTA를 함유하는 10Mm 소듐 포스페이트 완충액 (pH 6.5)에서 0-0.2M의 NaCl 구배를 이용하여 용출시켰다.

가장 높은 GLO 활성을 갖는 분획을 혼주시키고 실시예 2에서 기술한 조건하에 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 수행하였다. 가장 높은 GLO 활성을 갖는 분획을 아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석한 결과 거의 균질한 GLO 제제를 포함하는 것을 발견하였다 (코마세 브릴리언트 블루 G250 염색 강도로 판단시 약 80-90%의 순도).

이 제제의 특이적인 활성은 약 24U/mg 단백질이며, 즉 이것은 피.시아네오-플부스(P.cyaneo-fulvus)에서 정제된 균질한 GLO의 특이적인 활성보다 약 4-배 높은 것이다.

실시예 11

재조합 GLO의 고정화

1ml의 N-히드록시숙신이미드-활성된 세파로스 4 FF(Pharmacia)를 실시예 10에 따라 정제된 GLO의 0.35mg/ml 용액 0.5ml와 함께 배양하고 pH를 8.0으로 조절하였다. 커플링 반응에 이어 수지 제조사의 지시에 따라 후속 처리하였다.

표준 분석(실시예 1)에 약간의 변형을 가해 고정화 GLO의 활성을 측정하였다. 1ml의 GLO-세파로스를 기질 용액 10ml(실시예 1)와 30분간 가볍게 교반시키고 침강에 의해 수지를 분리하였으며 2,6-디클로로페놀인도페놀과의 반응으로 형성된 에리소르빈산의 양을 측정하였다.

GLO, 고정화 GLO의 활성(약 2.5U/ml 수지) 및 결합하지 않고 남아있는 GLO의 활성(약 5.5U)은 반응에 이용된 효소의 양에 필적하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 N-히드록시숙신이미드-활성된 세파로스상에서 고정화 이후 GLO는 그 대부분의 효소적활성을 보존한다. 그러므로 글루코노락톤으로부터 에리소르빈산의 생산에 고정화 GLO를 이용하는 것이 가능하다.

실시예 12

글루코스에서 에리소르빈산으로의 효소적 전환

100mM 포타슘 포스페이트 완충액, pH 6.0 중 600U/ml 글루코스 옥시데이트, 1.2U/ml의 카타라제 및 1% 글루코스를 함유하는 120㎕의 반응 혼합물을 35℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이 시점에서, 120㎕의 포타슘 포스페이트 완충액 pH5.6과 약 0.8 활성 유닛(실시예 10)을 갖는 100㎕의 정제된 재조합 GLO 용액을 첨가하고 추가로 1시간 동안 반응시켰다. 냉동에 의해 반응을 종료시키고 2,6-디클로로페놀인도페놀의 감소를 측정함으로써 HPLC(L.W.Doner, K.Hicks,Anal.Biochem.115, 225-230(1981)에서 기술한 조건 하에)에 의해 에리소르빈산을 분석하였다. 반응 혼합물에서 약 40%의 수율에 해당하는 약 1.5mg/ml의 에리소르빈산을 발견하였다.

또다른 실험에서, 0.1M 포타슘 포스페이트 완충액 중 0.1mg/ml 글루코스, 0.06U/ml 글로(glo), 24U/ml 카타라제, 800U/ml 글루코스 옥시데이트를 함유하는 1ml의 반응 혼합물을 개방 실험 튜브에서 실온으로 배양하였다. 약 30%의 수율에 해당하는 약 0.3mg/ml의 에리소르빈산을 얻었다.

명백히, 전환 수율을 최적화하려는 어떠한 시도도 이들 실험에서는 이루어지지 않았다. 예를 들어, 자동 pH 조절이나 당해 분야에 잘 알려진 그밖의 프로토콜을 도입함으로써 에리소르빈산의 수율은 추가로 증가될 수 있다.

Claims

D-글루코노락톤 옥시다제를 코딩하는 분리된 핵산 분자
제 1 항에 있어서, 진균류에서 분리된 핵산 분자.
제 2 항에 있어서, 페니실리움(Penicillium) 속에서 분리된 핵산 분자.
제 3 항에 있어서, 페니실리움 그리세오로세움(Penicillium griseoroseum), 페니실리움 노타툼(Penicillium notatum), 페니실리움 시아네움(Penicillium cyaneum) 또는 페니실리움 디쿰벤스(Penicillium decumbens) 종에서 분리된 핵산 분자.
제 4 항에 있어서, 페니실리움 그리세오로세움(Penicillium griseoroseum) 종에서 분리된 핵산 분자.
SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3을 포함하는 분리된 핵산 분자.
SEQ ID NO:4의 아미노산 서열과 비교하여 약 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 분리된 핵산 분자.
엄격한 조건하에 제 6 항의 핵산 중 어느 한가지에 혼성화되는 분리된 핵산 분자.
제 1 항 내지 8 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
제 9 항의 발현 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주 세포.
제 6 항에 있어서, 추가로 한가지 이상의 첨가, 결실, 삽입 또는 변이를 포함하는 분리된 핵산 분자로서, 이 때 상기 핵산 분자는 효소적으로 활성인 D-글루코노락톤 옥시다제를 코딩하는 분리된 핵산 분자.
제 1 항 내지 8 항과 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자에 의해 코딩되는 D-글루코노락톤 옥시다제 단백질.
제 10 항의 세포를 배양하고 상기 배양액으로부터 D-글루코노락톤 옥시다제를 회수하는 것으로 이루어지는 D-글루코노락톤 옥시다제의 제조 방법.
SEQ ID NO:4를 갖는 D-글루코노락톤 옥시다제.
글루코스를 글루코스 옥시다제와 접촉시켜 D-글루코노락톤을 형성하고, 상기 D-글루코노락톤을 제 1 항 내지 8 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 핵산이 코딩하는 D-글루코노락톤 옥시데이트와, 에리소르빈산을 생성하기에 충분한 시간과 조건하에, 접촉시키는 것으로 이루어지는 글루코스를 에리소르빈산으로 전환시키는 방법.
D-글루코노락톤을 제 1 항 내지 8 항 및 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 D-글루코노락톤 옥시다제와, 에리소르빈산을 생성하기에 충분한 시간과 조건하에, 접촉시키는 것으로 이루어지는 D-글루코노락톤을 에리소르빈산으로 전환시키는 방법.
제 15 항에 있어서, 추가로 에리소르빈산의 회수를 포함하는 방법.
제 16 항에 있어서, 추가로 에리소르빈산의 회수를 포함하는 방법.
제 15 항의 방법으로 생성된 에리소르빈산.
제 16 항의 방법으로 생성된 에리소르빈산.
제 15 항에 있어서, 상기 글루코스는 카타라제의 존재하에 상기 글루코스 옥시다제와 접촉하는 방법.
제 10 항에 있어서, 글루코스 옥시다제를 발현시키는 유전자를 추가로 포함하는 형질전환된 숙주 세포.
제 20 항에 있어서, 카타라제를 발현시키는 유전자를 추가로 포함하는 형질전환된 숙주 세포.
제 10 항에 있어서, 숙주 세포는 효모인 형질전환된 숙주 세포.
제 10 항에 있어서, 숙주 세포는 섬유질 진균류인 형질전환된 숙주 세포.