NO301285B1 - DNA-sekvens som koder for det regulatoriske område for alkoholoksidase II hos Pichia pastoris - Google Patents
DNA-sekvens som koder for det regulatoriske område for alkoholoksidase II hos Pichia pastoris Download PDFInfo
- Publication number
- NO301285B1 NO301285B1 NO892634A NO892634A NO301285B1 NO 301285 B1 NO301285 B1 NO 301285B1 NO 892634 A NO892634 A NO 892634A NO 892634 A NO892634 A NO 892634A NO 301285 B1 NO301285 B1 NO 301285B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- regulatory region
- dna
- plasmid
- aox2
- cells
- Prior art date
Links
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims description 38
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 16
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 title claims description 10
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 title description 5
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 32
- 101150006240 AOX2 gene Proteins 0.000 claims description 28
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 5
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 claims 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 14
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 14
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 12
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 12
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 9
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 9
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 7
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Inorganic materials [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 2-nitrophenyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 4
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 4
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 4
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 4
- 108010082737 zymolyase Proteins 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 3
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241001288713 Escherichia coli MC1061 Species 0.000 description 2
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N dCTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethoxyphosphonamidous acid Chemical compound NP(O)OCCC#N KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241001315286 Damon Species 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 1
- 101150062179 II gene Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 101100285000 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) his-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WRTKMPONLHLBBL-KVQBGUIXSA-N dXTP Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 WRTKMPONLHLBBL-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 108010087005 glusulase Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 239000007362 sporulation medium Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000012808 vapor phase Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Oppfinnelsen angår området rekombinant-DNA-bioteknologi. En side ved oppfinnelsen angår DNA-sekvenser som styrer transkripsjonen av DNA.
Den foreliggende oppfinnelse angår generelt manipuleringen av genetisk materiale, særlig styringen av hyppigheten av transkripsjon av-RNA fra DNA. Oppfinnelsen angår spesielt et regulatorisk område av Pichia <p>astoris alkoholoksidase II-genet.
Etter hvert som rekombinant-DNA-bioteknologi har utviklet seg i
de senere år, er den styrte produksjon ved celler av en mengde forskjellige nyttige polypeptider blitt mulig. Mange er eukaryote polypeptider, for eksempel humant veksthormon, leukocyttinterferoner, humant insulin og humant proinsulin er blitt fremstilt ved forskjellige mikroorganismer. Den fortsatte anvendelse av teknikker som man allerede behersker, ventes i fremtiden å tillate rekombinant produksjon av en rekke forskjellige andre nyttige polypeptidprodukter.
De grunnleggende teknikker som anvendes innen området rekombinant-teknologi, er kjent av fagfolk. De elementer som fortrinnsvis foreligger for utførelse av rekombinant-DNA-bioteknologi, omfatter men er ikke begrenset til: (1) et gen som koder for ett eller flere ønskede polypeptider operabelt forbundet (operabelt forbundet betegner en sammen-stilling hvorved komponentene er anordnet slik at de utfører sin vanlige funksjon) med adekvate styringssekvenser som er nødvendige for ekspresjon i vertscellen; (2) en vektor, vanligvis et plasmid, inn i hvilken en nukleotidsekvens kan innsettes, en vektor er et hvilket som helst nukleotidsekvensholdig konstruert stykke, som kan transformere en vert; (3) en egnet vert inn i hvilken den ønskede nukleotidsekvens kan overføres, hvor verten også har det celleapparat som tillater ekspresjon av den informasjon som det er kodet for, ved den overførte nukleotidsekvens.
Et grunnleggende element som anvendes i rekombinant-teknologi, er plasmidet, som er et sirkelformet ekstrakromosomalt dobbelt-trådet DNA, som først ble funnet i mikroorganismer. Plasmider er blitt funnet å opptre i flere kopier pr. celle. Foruten naturlig forekommende plasmider, er en rekke forskjellige av mennesker fremstilte plasmider, blitt preparert. I plasmidet er der inkludert informasjon som er nødvendig for plasmid reproduksjon, dvs. en autonom replikasjonssekvens og/eller et opprinnelsessted for replikasjon. En eller flere metoder til fenotypisk seleksjon av plasmidet i transformerte celler, kan også være innlemmet i den informasjon som er kodet inn i plasmidet. De fenotypiske egenskaper, eller markørseleksjons-egenskaper, såsom resistens for antibiotika, tillater at kloner av vertscellen som inneholder det plasmid som er av interesse, kan gjenkjennes og selekteres for ved preferentiell dyrking av cellene i selektive media. Vektorer, eller plasmider kan kløyves spesifikt av ett eller flere restriksjonsendonukleaser eller restriksjonsenzymer, som hver gjenkjenner en spesiell nukleotidsekvens.. Deretter kan et regulatorisk område, operabelt forbundet med et heterologt gen, dvs. et gen som ikke forekommer naturlig i kombinasjon med det regulatoriske område, eller andre nukleotidsekvenser, innsettes ved å forbinde operabelt det ønskede genetiske materiale ved kløyvingssetet, eller ved rekonstruerte ender som grenser opp til kløyvingssetet.
Vektoren blir deretter innført i en vertscelle, hvor dens nukleotidsekvens kan beordre verten til å utføre forskjellige prosesser eller funksjoner. Noen eksempler omfatter ekspresjon av heterologe polypeptider, eller overekspresjon av homologe eller heterologe polypeptider. Prosessen hvor nukleotid innføres i vertcellen, blir generelt betegnet transformasjon. Store mengder av vektoren kan fås ved innføring av vektoren i en egnet vert for å øke dens kopitall. En vertscelle som det er vanlig å bruke for å øke kopitallet av vektoren, er E. coli. Vektorene blir deretter isolert fra den første vert, og innført i en annen vertscelle hvor de ønskede vektorbeordrede aktivi-teter vil finne sted f.eks. produksjonen av et polypeptid. Produksjonen av et endeprodukt fra DNA på denne måte, blir betegnet som ekspresjon. Når genet er riktig innsatt i vektoren med hensyn til de partier av vektoren som styrer transkripsjon og translasjon av den kodede nukleotidsekvens, kan den resulterende vektor benyttes til å beordre produksjonen av polypeptidsekvensen for hvilken det innsatte gen koder.
Ekspresjon styres av et regulatorisk område. Regulatoriske områder er heterogene nukleotidsekvenser, som reagerer på forskjellige stimuli og virker inn på hyppigheten av RNA-transkripsjon. Ekspresjon kan skrus på eller av som reaksjon på stimuli. Ekspresjon som skrus på som reaksjon på en stimulus, blir vanligvis betegnet som derepresjon eller induksjon. Noen eksempler på induserbare ekspresjonssystemer er AOXl-svsterner i Pichia <p>astoris, estrogensystemene i Xenopus laevis og metalltioneinsystemene hos aper, mennesker, hamstere, mus og rotter. Induserbare ekspresjonssystemer er vanligvis under mer stringent styring enn konstitutive systemer. Disse systemer er vel egnede for gentekniske formål.
I praksis kan bruken av rekombinant-DNA-bioteknologi danne celler som kan uttrykke heterologe nukleotidsekvenser. Heterologe nukleotidssekvenser er nukleotidsekvenser som ikke opptrer naturlig i verten. Eksempler på slike vil være nye kombinasjoner av regulatoriske områder som opptrer naturlig inne i verten med strukturelle gener som ikke er naturlig knyttet til dette regulatoriske område. Et annet eksempel vil være kombinasjonen av et regulatorisk område med et gen som ikke forekommer naturlig i verten. Det heterologe polypeptid kan produseres som et fusjonspolypeptid, dvs. et heterologt polypeptid, sammenføyet (fused) med et parti av aminosyre-sekvensen av et homologt eller heterologt polypeptid. Det opprinnelig oppnådde fusjonspolypeptidprodukt blir iblant produsert i en inaktiv form, inntil det sammenføyde polypeptid kløyves i en ekstracellulær omgivelse.
Slik det tidligere er angitt i Europapatentsøknad
nr. 86114700.7, koder Pichia pastoris-qenomet for to funksjonelle alkoholoksidasegener AOX1 og AOX2.
Det er nå funnet et 5' regulatorisk område som er knyttet til det AQX2 strukturelle gen. Dette regulatoriske område er induserbart ved metanol eller karbonkildehunger. Det maksimale ekspresjonsnivå fra det AOX2 regulatoriske område er imidlertid bare 5 - 11% i forhold til det fra det A0X1 regulatoriske område (AQXl-<g>enet er angitt i Europapatentsøknad nr. 85201235.0).
Det A0X2 regulatoriske område kan anvendes å uttrykke heterologe gener, og er særlig nyttig i de situasjoner hvor høye ekspresjonsnivåer av et protein er ufordelaktige.
I henhold til den foreliggende oppfinnelse, er det funnet, isolert og karakterisert en DNA-sekvens som styrer hyppigheten av transkripsjonen av DNA til RNA. De nye DNA-sekvenser ifølge oppfinnelsen er nyttige for produksjonen av polypeptid produkter ved metylotrofe gjærsorter såsom Pichia <p>astoris.
Kort beskrivelse av tegningen:
- Fig. 1 viser réstriksjonskartet av A0X1 (a) og
AOX2 (b) genene.
- Fig. 2 viser et restriksjonskart av pBR322.
- Fig. 3 viser et restriksjonskart av pYJ8.
- Fig. 4 viser et restriksjonskart av plasmid pYM5.
- Fig. 5 viser et restriksjonskart av plasmid pMR4.
- Fig. 6 viser et flytdiagram for konstruksjonen av pMR4.
- Fig. 7 viser et restriksjonskart av plasmid pBPfl.
- Fig. 8 viser et restriksjonskart av plasmid pYJ55.
- Fig. 9 viser et flytdiagram for konstruksjonen av plasmid pYJ55.
- Fig. 10 viser et restriksjonskart av plasmid pSAOH5.
I henhold til den foreliggende oppfinnelse, er der skaffet en ny DNA-sekvens inneholdende et regulatorisk område som reagerer på minst en av de følgende betingelser: nærværet av metanol i vertsomgivelsen eller karbonkildehunger når vertscellen dyrkes på substrater andre enn metanol. Det regulatoriske område ifølge oppfinnelsen kan styre transkripsjons-hyppigheten av RNA når det er operabelt forbundet ved 5<1->enden av en DNA-sekvens, som koder for produksjonen av mRNA.
Denne og andre hensikter med oppfinnelsen vil fremgå av beskrivelsen og de tilhørende krav.
I. Karakterisering av det alkoholoksidase regulatoriske
område.
Det fullstendige A0X2-gen inneholdes i det restriksjonskart som er vist på fig. l(b). Det A0X2 regulatoriske område inneholdes mellom det første Ec_oRI-sete fra 5'-enden, og startkodonet av det A0X2 strukturelle gen som vist ved restriksjonskartet på fig. 1 (b). Det parti av DNA-sekvensen som koder for alkoholoksidase II-proteinet, er vist ved det skraverte område under restriksjonskartet. Et restriksjonskart av alkoholoksidase I-genet, er vist for sammenligning av de to gener, fig. 1 (a). Ingen betydelig sekvenshomologi ble observert utenfor genenes proteinkodende parti.
Det A0X2 regulatoriske område er ved et lacZ-fusionskonstruert stykke, blitt karakterisert til å behøve ikke mer enn fra ca. basepar -1500 til ca. basepar -1, for regulatorisk aktivitet (som vist i tabell 1). Nukleotidsekvensen, for et DNA-fragment, inneholdende det AOX2 regulatoriske område, er vist i tabell 1. Det A0X2 regulatoriske område reagerer på minst en av de følgende betingelser: Nærværet av metanol som den eneste karbonkilde for metylotrofe gjærverter, såsom Pichia pastoris, eller karbonkildehunger i de nevnte vertsceller. Dessuten stimulerer det A0X2 regulatoriske område tilnærmet 5 - 11% av proteinproduksjonen av p-galaktosidase sammenlignet med det A0X1 regulatoriske område.
II. Isolasjon av alkoholoksidase II regulatorisk område fra
Pichia pastoris.
Det A0X2 regulatoriske område ble isolert ved transformasjon av Pic_hia-stamme MC100-3 ( arg4, his4, aoxlA: : SARG4 aox2A: : Phis4). Denne stamme inneholder en mutantkopi av Pichia HIS4-genet insatt i A0X2-genet. MC100-3 ble transformert med pYM5, et plasmid sammensatt av et 2,7 kb B<g>lII-fraament inneholdende Pichia HIS4-genet insatt ved BamHI-setet av pBR322. DNA fra flere MC100-3 (pYM5) His<+->transformanter, ble sortert ved Southern filter-hybridisering for transformanter som inneholdt pYM5 integrert med HIS_4-fragmentet anordnet i A0X2-lokuset av MC100-3. DNA fra en av disse stammer ble deretter digerert med Hindlll, som førte til frigjøring av et genomisk fragment på ca. 12 kb inneholdende 5,3 kb av sekvensen 5' av A0X2 K<p>nl-setet, 2,7 kb av Pichia HIS4-<g>enet og 4,0 kb av PBR322. Det Hindlll-kuttede DNA ble ligatisert og transformert inn i EL. coli. Transformanter ble selektert ved resistens for ampicillin. Et plasmid, pMR4, ble utvunnet og et restriksjonskart av dette plasmid er vist på fig. 5.
II. Egenskaper av det AOX2 regulatoriske område.
For å sammenligne ekspresjon av det AOX2 regulatoriske område med det for A0X1. ble en A0X2- lacZ-ékspresionsvektor konstruert som var så lik som mulig pSAOH5 (vist på fig. 10), en AOXl- lacZ-fusionsvektor. Flytdiagrammet for konstruksjon av AQX2- lacZ-vektoren, pYJ55, er vist på fig. 9. Preliminære DNA-sekvensdata fra 5'-enden av AOX2, viste at AOX2 inneholder to BajflHI-seter i posisjoner i det strukturelle gen identiske med dem man finner i AOX1 strukturelt gen. Følgelig var det første trinn i konstruksjonen av pYJ5 5 å innsette et Bglll- BamHI-fragment på 1,8 kb, som inneholder det A0X2 regulatoriske område, og 45 basepar av den aminoterminale proteinkodende sekvens inn i BamHI-setet av pBPfl for å danne pYJ38. Det annet trinn var å kutte pYJ38 med BamHI, og innsette det samme adaptor-oligonukleotid som var innsatt for konstruksjonen av AOXl- lacZ-vektoren (5'-GATCACCCGGGT-3'). Innsettingen av denne adaptor ødela BamHI-setet av pYJ3 8 og dannet et nytt Smal-sete ved punktet for innsettingen. Dette plasmid, pYJ45, ble digerert med Smal, og det 1,8 kb Smal-fraoment inneholdende den modifiserte A0X2-promotor ble innsatt i pBPfl for å danne plasmid pYJ46. Plasmid pYJ46 ble digerert med EcoRI for å fjerne et 0,3 kb fragment fra 5'-enden av AOX2-fragmentet i pYJ46. Plasmidet ble religatisert for å danne plasmid pYJ55. Et restriksjonskart av plasmid pYJ5 5 er vist på fig. 8.
Plasmid pYJ55 ble transformert inn i GS115 (his4), og His<+->transformanter ble sortert for en stabil His<+->fenotype som indikerte nærværet av et integrert plasmid. Genomisk DNA fra flere stabile His<+->stammer ble analysert ved Southern filter-hybridisering for å bekrefte nærværet og bestemme lokal-iseringen av plasmidet.
For å bedømme relative styrker av AOX1- og AOX2-promotorene ble produksjonen av (3-galaktosidase ved pYJ5 5 og pSAOH5 sammenlignet ved transformasjon av disse plasmider inn i GS115. De transformerte GS115-stammer ble betegnet henholdsvis GS115 (pYJ55) og GS115(pSA0H5). Hver stamme inneholder plasmid
integrert ved HIS4-lokuset. Celler av hver stamme ble dyrket i glyserolmedium, byttet over til et medium uten karbonkilde i 24 timer og deretter byttet over til et medium med metanol i ytterligere 50 timer. Prøver av hver kultur ble fjernet ved slutten av hver vekts fase og ekstrakter ble preparert og analysert for (3-galaktosidase. Resultatene av disse analyser er vist i tabell 2.
Betydelige mengder B-galaktosidase, ble ikke observert i glyseroldyrkede celler, av hverken AOXl- lacZ- eller A0X2- lacZ-stammer. I mediet uten karbonkilde, var aktivitetsnivået i A0X2- lacZ-stammen tilnærmet en tiendedel av den som ble obsevert for AOXl- lacZ-stammen. Tilsetningen av metanol til de A0X2- lacZ-holdiae celler, førte til nivåer av p-galaktosidase som nådde opp i ca. en niendedel av dem hos AOXl- lacZ-celler. Således er A0X1- og AQX2-genene regulert på lignende måte. Det ene trekk som skiller er en betydelige lavere reaksjon på metanol <p>g karbonkildehunger, av det A0X2 regulatoriske område.
Skjønt innføringen av det A0X2 regulatoriske område/p-galaktosidase gen-fusjon i en vertsgjærcelle er blitt beskrevet her, vil fagfolk innse at det ikke er nødvendig for utførelse av oppfinnelsen å benytte sirkelformede plasmider eller det p-galaktosidase strukturelle gen. Således kan andre vektorer som kan opprettholdes i gjær benyttes i anvendelsen av dette regulatoriske område sammen med andre heterologe gener. Alternativt kan dette regulatoriske område operabelt forbundet med andre heterologe gener integreres inn i kromosomet av vertsgjærcellen ved anvendelse av integrative vektorer. Dessuten kan funksjonelle mutanter av det A0X2 regulatoriske område som her er beskrevet, bestående av kortere DNA-sekvens fra 5'-enden, også anvendes til å regulere heterolog gen-ekspresjon.
Eksempler
Generell informasjon som angår eksemplene.
Medier. buffere og oppløsninger
Med mindre noe annet er angitt, representerer de ovenfor angitte oppløsninger den grunnleggende konsentrasjon (lx) som ble anvendt. Gjennom alle eksemplene der hvor forskjellige konsentrasjoner ånvendes er dette faktum angitt ved at oppløsningene er betegnet som et multippel av den grunnleggende (lx) konsentrasjon.
Reaenererinasaaar
1) Agar-KCl: 9 g Bacto-agar, 13,4 g kaliumklorid, 240 ml H20, autoklavering.
2) 10x glukose: 20 g dekstrose, 100 ml H2O, autoklavering.
3) 10x YNB: 6,7 5 g gjær-nitrogenbase uten aminosyrer, 10 0 ml H2O, autoklavering. (Tilsett eventuell aminosyre eller nukleinsyre inntil en konsentrasjon på 20 0 ug/ml før eller etter autoklavering). 4) Tilsett 30 ml 10x glukose og 30 ml 10x YNB til 240 ml av den smeltede Agar/KCl-oppløsning. Tilsett 0,6 ml av 0,2 mg/ml biotin, og eventuelt en hvilken som helst annen ønsket aminosyre eller nukleinsyre til en konsentrasjon av 20 ug/ml. Hold smeltet regenereringsagar på 55-60°C.
Dyrking av Pichia <p>astoris
P. <p>astoris ble dyrket i YPD (rikt) eller YNB (minimalt) medium. Etter behov ble YNB-medium supplert med karbonkilde (2% dekstrose, 1% glycerol, eller 0,5% metanol) og med 50 ug/ml aminosyre.
Sekvenserin<g>
DNA-sekvensering var ved dideoksynuklotid-kjedeavslutnings-metoden i henhold til Sanger et al., PNAS 74, 5463 (1977) .
De følgende forkortelser er benyttet i eksemplene:
EDTA etylendiamintetraeddiksyre
TEMED N,N,N',N'-tetrametylendiamin
DTT ditiotréitol
BSA bovineserumalbumin
EtBr etidiumbromid
Ci Curie
dATP deoksyadenosintrifosfat
dGTP deoksyguanosintrifosfat
TTP thymidintrifosfat
dCTP deoksycytidintrifosfat
dXTP "generisk" deoksytrifosfatnukleotid
oligo(dT)i2 is kilde: Collaborative Research, Inc.
Zymolyase 60.000 kilde: Miles Laboratories
Isolering av alkoholoksidase II regulatorisk område
Eksempel I
Paring av PPF1 X KM7121 og utvikling av MC1QQ- 3
Pichia <p>astoris PPF1 (arg_4 his4) (NRRL Y-18017) og KM7121 (arg4 his4 aoxlA: : SARG4 aox2A: : PHIS4) (NRRL Y-18019) ble hver kodet fra en ny YPD-plate inn i et rør med sterilt vann. Ca. 5 x 10<7 >celler av hver stamme ble blandet, behandlet med lyd (sonicated) i en kort periode for å bryte opp celleklumper, og spredt på en GNAP-agarplate (5% dekstrose, 2% pepton, 1% gjæreksrakt, 0,5% agar, 2,3% næringsagar). En ublandet sammenligningsprøve av hver stamme (ca. 1 x IO<8> celler) ble behandlet på samme måte. GNAP-platene ble inkubert ved 30°C i ca. 24 timer, og deretter replikaplatet på spordannelsemedium-agarplater (0,5% Na-acetat, 1% KC1, 2% agar). Disse plater ble inkubert i ca. 20 timer ved 30°C, og deretter replikaplatet på minimalmedium-agarplater uten noen karbonkilde. Metanol ble matet til cellene på minimalplatene i dampfasen.
Etter 5 dager kom ca. 200 kolonier til syne på minimalplaten, som mottok de blandede celler. Ingen kolonier ble noen gang utviklet på de ublandede sammenligningsplater, et resultat som antyder at Arg<+> His4" Mut<+->koloniene på den blandede plate var diploide, som et'resultat av paringer mellom PPF1- og KM7121-celler (Mut<+> = metanolutnyttelse). Den diploide karakter av disse Arg<+> His<+> Mut<+->stammer ble bekreftet ved undersøkelse av AOX-loci hos fire av disse stammer ved Southern filter-hybridisering. Spesifikke prober som ble benyttet var: pPG3.0 (NRRL B-18022), en AOX2 spesifikk probe; pYJ30 (NRRL B-15890), en HIS4 spesifikk probe og pPG4.0 (NRRL B-15868), en AOX1 spesifikk probe.
For å sporulere PPF1 x KM7121 diploidene, ble en koloni (MC100) først utvunnet fra metanolmediets diploide seleksjonsplate. Ca.
1 x 10<6> av disse celler ble spredt på GNAP-plater, og behandlet som beskrevet for paringsfremgangsmåten, bortsett fra at
spordannelseplaten ble inkubert i fire dager ved 30°C for å tillate cellene og fullføre sporedannelsen. Sporer ble utvunnet fra platene ved rensing av hver plate med 5 ml sterilt vann. Suspensjonen ble vasket 2 ganger med 3 ml fosfatbuffer (0,1M Na3P04, pH 7,5). En blanding av de gjær-lytiske ensymer Glusulase (Endo Laboratories, NY) og Zymolyase (60.000 enheter/g; Miles Laboratories) og |3-merkaptoetanol, ble satt til endelige konsentrasjoner på henholdsvis på 2% (v/v),
0,5 mg/ml og 0,1% for å ødelegge vegetative celler. Blandingen ble inkubert i 5 timer ved 30°C.
Sporepreparatet ble deretter vasket 2 ganger i sterilt vann inneholdene 0,2% Tween 80 (v/v) og resuspendert i fosfatbuffer. Preparatet ble deretter behandlet med tre 20-sekunders sykluser av lydbehandling, for å bryte opp klumper av sporer. En prøve av sporpreparatet ble deretter fortynnet og spredt på ikke-selektive masterplater av minimalt medium, med 2% glukose og 50 ug/ml hver av arginin og histidin. Disse ble inkubert i 48 timer ved 30°C. Hver masterplate ble deretter replikaplatet på den følgendes serie av minimale plater: 1) glukose, -arg, -his 2) glukose, -arg, +his 3) glukose, +arg, -his og 4) glukose, +arg, +his.
Etter inkubering i 24 timer ved 30°C, ble koloniene undersøkt for Arg- og His-fenotyper. Kolonier som var Arg<+> His-, ble deretter testet for vekst på metanol ved utstrykning på YNB-metanolagarplater. Etter ca. 1 uke ved værelsestemperatur ble platene undersøkt for Mut-fenotype. En Arg<+> His- Mut<->-stamme ble betegnet MC100-3.
Eksempel II
Transformasjon av Pichia pastoris
Gjærceller ble podet inn i ca. 10 ml YPD-medium og ristedyrket ved 30°C, i 12-20 timer. Cellene ble deretter fortynnet til en Agoo på 0,01 - 0,1, og opprettholdt i logaritmisk fase i YPD-medium ved 30°C i 6 - 8 timer. 100 ml YPD-medium ble podet med 0,5 ml av podekulturen ved en Aqqq på ca. 0,1, og ristedyrket ved 30°C i 12 - 20 timer. Kulturen ble deretter høstet når Aggo var 0,2 - 0,3 (etter tilnærmet 16 - 20 timer) ved sentrifugering ved anvendelse av en DAMON IEC DPR-60 00 sentrifuge ved 1500 g i 5 minutter.
For å fremstille sfæroplaster, ble cellene vasket en gang i
10 ml sterilt vann (sentrufugering ble utført etter vasking som det beskrevet ovenfor), en gang i 10 ml nylig fremstilt SED, en gang i 10 ml steril IM sorbitol, og resuspendert i 5 ml SCE-buffer. 5 ul av 4 mg/ml Zymolyase 60.000 (Miles Laboratories), ble tilsatt og cellen inkubert ved 30°C i ca. 30 minutter.
Sfæroplastdannelse ble overvåket som følger. 100 ul porsjoner av celler, ble satt til 900 ul av 5% SDS og 900 ul av IM sorbitol før eller like etter tilsetningen av Zymolayse, og på forskjellige tidspunkter i løpet av inkubasjonsperioden. Inkubasjonen ble stoppet ved det punkt hvor cellene lyserte i SDS, men ikke sorbitol. Straks de var dannet, ble sfæroplaster vasket en gang i 10 ml steril IM sorbitol ved sentrufugering ved 1.000 g i 5 - 10 minutter, og vasket en gang i 10 ml sterilt CaS ved sentrufugering, og resuspendert i 0,6 ml CaS.
For den egentlige transformasjon, ble DNA-prøver i vann eller TE-buffer tilsatt (inntil 20 ul samlet volum), til 12 x 75 mm sterile polypropylenrør. (For små mengder DNA, finner maksimal transformasjon sted ved anvendelse av ca. 1 ul 5 mg/ml lydbehandlet E. coli-DNA i hver prøve).100 ul sfæroplaster ble satt til hver DNA-prøve og inkubert ved værelsestemperatur i ca. 20 minutter. 1 ml PEG-oppløsning ble satt til hver prøve, og inkubert ved værelsestemperatur i ca. 15 minutter. Prøvene ble sentrifugert ved 1.000 g i 5 - 10 minutter, og supernantanten ble kassert. Pelletene ble resuspendert i 150 yl SOS og inkubert ved værelsestemperatur i 3 0 minutter. 850 yl steril IM sorbitol, ble satt til hver, og prøvene ble platet som beskrevet nedenfor. 10 ml regeneringsagar ble helt på hver plate minst 3 0 minutter før transformasjonsprøvene var ferdige. Porsjoner på 10 ml regeneringsagar ble også fordelt på rørene i et bad på 45 - 50°C, i løpet av den periode som transformasjonsprøvene var i SOS. Prøver ble deretter satt til rørene, helt på plater inneholdene det faste bunnagarlag, og inkubert ved 30°C i 3 - 5 dager.
Sfæroplastkvalitet på forskjellige punkter ble bestemt som følger. 10 yl prøve ble fjernet og fortynnet 10 0 x ved tilsetning til 990 ul IM sorbitol. 10 ul av fortynningen ble fjernet, og en ytterligere 990 pl porsjon av IM sorbitol ble tilsatt. 100 ul av begge fortynninger ble utstrykningsplatet på YPD-agarmedium for å bestemme konsentrasjonen av ikke-sfæreo-plastdannende hele celler som var tilbake i preparatet. 100 yl av hver fortynning ble satt til 10 ml regeneringsagar som var blitt supplert med 40 yg/ml av alle de aminosyrer som var nødvendige for verten for å bestemme de samlede regenererbare sfæroplaster. Gode verdier for transformasjonseksperimentet var 1 - 3 x IO<7>, samlede regenererbare sfæroplaster pr. ml og ca.
1 x IO<3> hele celler pr. ml.
Eksempel III
Konstruksjon av MC100- 3 ( pYM5)
Ca. 10 ug pBR322~ble digerert med BamHI og defosforylert. Ca. 50 ug pYJ8 (NRRL B-15889), som inneholder Pichia HIS4-genet, ble digerert med B<g>lll. Et 2,7 kb BgJLII-fragment ble isolert fra en 0,8% preparativ agarosegel. 30 0 ng av fragmentet og 300 ng av BamHI-digerert pBR322, ble ligatisert ved anvendelse av 0,5 enheter T4 DNA-ligase i 10 yl samlet volum, av 66 mM Tris-HCl, pH 7,4, 6,6 mM MgCl2, 10 mM DTT og 0,4 mM ATP, i 24 timer ved 4°C.
Ligasjonsreaksjonen ble anvendt til å transformere E. coli MC1061 ti ampicillinresistens som beskrevet i eksempel V. Tranformanter ble karakterisert ved restriksjonsdigereringer, og den riktige størrelse og orientering av det innskutte stykke ble bekreftet ved agarosegelelektroforese. Dette plasmid ble kalt pYM5, og ble utvunnet fra E. coli ved anvendelse av den alkaliske lyse-plasmidprepareringsteknikk beskrevet hos Maniatis et al (1982). (Maniatis, T.,
Fritsch, E. F., and Sambroox, J. (1982). Molecular Cloninq:
A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.)
Ca. 10 yg pYM5 ble digerert med Stul før transformasjon av MC100-3. Dette trinn beordret plasmidet til å integrere ved en av de HIS4-gehsekvenser som forelå i MC100-3, enten det native HIS4-lokus eller det modifiserte AOX2-lokus. Transformasjon ble utført i henhold til fremgangsmåter vist i eksempel II.
DNA fra en rekke MC100-3(pYM5) His<+->transformanter ble isolert i henhold til eksempel IV og sortert ved Southern filter-hybridisering, for transformanter som inneholdt pYM5 integrert ved HIS_4-fragmentet anordnet ved A0X2. Spesifikke prober som ble anvendt var: pPG 3.0 (NRRL B-18022), en AOX2 spesifikk probe; pYJ30 (NRRL B-15 890), en HIS4 spesifikk probe.
Egenskaper av det alkoholoksidase II regulatoriske område Eksempel IV
Gi ær- DNA- fremstiiling
Gjærceller ble dyrket i 100 ml YNB-medium + 2% dekstrose ved 30°C, inntil Aggg var lik 1 - 2 og deretter pelletert ved anvendelse av en Damon IEC DPR-6000, sentrifuge ved 2000 g i 5 minutter. Pelletten ble vasket en gang i dl^O, en gang i SED, en gang i IM sorbitol og deretter resuspendert i 5 ml av en oppløsning av 0,IM Tris-HCl, pH 7,0 og IM sorbitol. Cellene ble deretter blandet med 50 - 100 ul av en 4 mg/ml oppløsning av Zymolyase 60.000 (Miles Laboratories) og inkubert ved 30°C i 1 time. De resulterende sfæroplaster ble deretter sentrifugert ved 1 000 g i 5 - 10 minutter og suspendert i 5 ml lysebuffer [0,1% SDS, lOmM Tris-HCl (pH 7,4), 5mM EDTA og 50mM NaCl]. Proteinase K (Boehringer Mannheim) og RNase A (Sigma) ble hver satt til 100 ug/ml og oppløsningen inkubert ved 37°C i 30 minutter. DNA ble avproteinisert ved forsiktig omrøring av preparatet med et like stort volum kloroform inneholdende isoamylalkohol (24:1, v/v), og fasene ble separert ved sentrifugering ved 12 000 g i 20 minutter. Den øvre (vandige) fase ble overført til et nytt rør, og ekstrahert med et like stort volum fenol/kloroform/isoamylalkohol. Fasene ble separert som tidligere, og toppfasen anbragt i et rør inneholdende 2-3 volumer kald 100% etanol. Prøven ble forsiktig omrørt og DNA ble oppsamlet ved oppvikling på en plaststav. DNA ble øye-blikkelig oppløst i 1 ml TE-buffer, og dialysert over natten ved 4°C mot 100 volumer TE-buffer.
Eksempel V
Konstruksjon av pMR4
DNA ble isolert i henhold til fremgangsmåten i eksempel IV fra en MC100-3(pYM5) His<+->transformant generert som angitt i eksempel III. 10 ug av dette genomiske DNA ble digerert med Hind.HI og ligatisert. Ligasjonsreaksjonen ble utført ved 4°C i 24 timer i 66 mM Tris-HCl, pH 7,4, 6,6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,4 mM ATP, og 0", 5 enheter T4 DNA-ligase.
Ligasjonsblandingen ble transformert direkte inn i E. coli MC1061-celler, som var blitt gjort kompetente for transformasjon og transformert som beskrevet av Maniatis et al.
(1982) . Seleksjon for ampicillinresistens ble utført ved dyrking av cellene i enten LB-medium eller 2B-medium (0,2% NH4PO4, 1,2% Na2HP04, 0,013% MgS04'7H20, 0,074% CaCl2-2H20, 1 ug/ml tiamin, 0,4% dekstrose) supplert med 5 0 ug/ml ampicillin.
Et 12,0 kb plasmid betegnet pMR4 ble utvunnet i henhold til Maniatis et al. (1982). Dette plasmid inneholdt•5,3 kb DNA 5', i forhold til AOX2 Kpnl-setet, 2,7 kb av Pichia HIS4-genet, og 4,0 kb av pBR322.
Eksempel VI
Konstruksjon av <p>YJ55
For å bestemme reguleringen og ekspresjonen av AOX2-<p>romotoren, ble en vektor inneholdende A0X2 5'-sekvensen føyet til E. coli lacZ-genet konstruert. 50 ug av pMR4 (Eksempel V) ble digerert med Balli og BamHI i henhold til produsentens retningslinjer. Et Balli - BamHI-fragment på en 1,8 kb inneholdende A0X2-promotoren, ble isolert fra en 0,8% preparativ agarosegel. 10 ug pBPfl (NRRL B-15892) ble digerert med BamHI og defosforylert ved anvendelse av alkalisk fosfatase i et reaksjonsvolum på 50 ul (1 U enzym ved 37°C i 1 time i 50mM Tris-HCl, pH 9,0,
ImM MgCl2, 100 pM ZnCl2, ImM spermidin).
300 ng av 1,8 kb-fragmentet og 300 ng av pBPfl ble ligatisert med T4-ligase.som følger. Ligasjonsreaksjonen ble utført ved 23°C i 1 time i et 10 pl reaksjonsvolum inneholdende 66mM Tris-HCl, pH 7,6, 5mM MgCl2, 5mM ditiotreitol, ImM ATP og 1 Weiss-enhet T4-ligase. Den resulterende vektor ble betegnet PYJ38.
Et nytt Sjmal-restriksjonssete ble dannet i pYJ38 som følger. Et adaptoroligonukleotid ble syntetisert ved anvendelse av en Applied Biosystems DNA Synthesizer, Model 380 A, ved anvendelse av cyanoetylfosforamiditt-kjemi:
5' - GATCACCCGGGT - 3'
10 pg pYJ38 ble digerert med BamHI og behandlet med alkalisk fosfatase som angitt ovenfor. 1 pg av den ovenfor angitte adaptor og 0,1 pg av BamHI-digerert pYJ3 8 ble ligatisert ved anvendelse av T4-ligase som beskrevet ovenfor. Den modifiserte vektor ble betegnet pYJ45. Et 1,8 kb Smal-fragment inneholdende den modifiserte AOX2-<p>romotor ble oppnådd ved digerering av 50 pg pYJ45 med Smal. Fragmentet ble isolert fra en 0,8% preparativ agarosegel. 0,3 pg av fragmentet og 0,3 pg av Smal-digerert pBPfl, ble ligatisert som angitt ovenfor for å danne vektoren pYJ46. Et 0,3 kb Ec^RI-fragment ble slettet fra 5'-enden av AOX2-seomentet i pYJ46 som følger. 10 pg pYJ46 ble digerert med EcoRI og behandlet med alkalisk fosfatase som beskrevet ovenfor. En separat 5 0 pg porsjon av pYJ46 ble også digerert med EcoRI og et 1,5 kb-fragment ble isolert fra en 0,8% preparativ agarosegel. Ca. 0,3 pg hver av fosfatasert pYJ46 og det isolerte fragment ble ligatisert og transformert inn i E. coli som beskrevet ovenfor. Et plasmid som hadde den riktige struktur ble isolert og betegnet pYJ55.
Eksempel VII
Utvikling av stamme GS115 fpYJ5 5)
Pichia pastoris GS115, en histidin-auxotrof (NRRL Y-15851; his4) ble tranformert med plasmid pYJ5 5 (Eksempel VI) som beskrevet i eksempel II. Genomisk DNA fra stabile His<+->stammer, ble analysert ved Southern filter-hybridisering for å bestemme plasseringen av plasmidet. En transformant inneholdende pYJ5 5 integrert ved HIS4-lokuset, ble betegnet GS115 (pYJ55).
Eksempel VIII
Sammenligning mellom A0X1- og A0X2- promotorene
Regulering og ekspresjon av A0X1- og A0X2- promotorene, er blitt sammenlignet ved bestemmelse av (3-galaktosidaseaktiviten av stammer GS115(pSA0H5) og GS115(pYJ55). 100 ml kulturer av hver stamme ble dyrket i YNB pluss 1% glycerolmedium i 24 timer ved 30°C, byttet om til YNB-medium uten en karbonkilde i 24 timer ved 30°C, deretter byttet om til YNB-medium med 0,5% metanol i 5 0 timer ved 30°C. Prøver av hver kultur ble fjernet på de følgende tidspunkter:
1) etter 24 timer i glycerolmedium
2) etter 24 timer i ikke noe karbonmedium
3) etter 24 og 5 0 timer i metanolmedium.
Ekstrakter ble fremstilt og analysert for p-galaktosidase-aktivitet som beskrevet nedenfor. Resultatene av disse analyser er vist i tabell 2.
p- galaktosidaseanalvse
1) Nødvendig oppløsning:
fyll opp til 1 1; pH bør være 7
O- Nitrofenvl- B- D- aalaktosid ( ONPG):
Oppløs 400 mg ONPG (Sigma N-1127) i 100 ml destillert vann for å danne en 4 mg/ml ONPG-oppløsning.
2) Preparering av cellefritt proteinekstrakt:
Hver prøve ble vasket en gang i d^O, en gang i lysebuffer og resuspendert i lysebuffer ved en konsentrasjon på 150 Aggo/ml. 0,5 g glassperler ble satt til en 350 ul porsjon av prøve og blandingen ble svirret fire ganger i 60 sekunder hver med ett minutts mellomrom på is. Celleoppslemmingen ble fjernet fra glassperlene og suspensjonen ble sentrifugert i 5 minutter i en mikrosentrifuge. Supernantanten ble overført til et mikro-sentrifugerør av polypropelen for analyse. Mengden av samlet protein i hvert ekstrakt ble bestemt ved Bradfords analysemetode (Bio-Rad). BSA tjente som proteinstandarden.
3) Analysemetode:
1 - 50 ul cellefritt proteinekstrakt ble satt til 1 ml Z-buffer. Blandingen ble svirret og inkubert i 5 minutter ved 30°C. Reaksjonen ble startet ved tilsetning av 0,2 ml ONPG
(4 mg/ml). 0,5 ml av IM Na2C03~oppløsning ble tilsatt for å stanse reaksjonen på et passende tidspunkt ( A^ 20<^)■ Absorbansen ved 420 nm ble deretter avlest.
4) Beregning av (3-galaktosidase-aktivitetsenheter
1 U = 1 nmole ortonitrofenol (ONP) ble dannet hvert minutt ved 30°C og pH=7. 1 nmole ONP har en absorbans ved 420 nm (A42o) På 0,0045 med en banelengde på 1 cm. Følgelig representerer en absorbans på 1 ved 420 nm, 222 nmole ONP/ml eller 378 nmole ONP/1,7 ml (det samlede volum av supernantant som ble analysert var 1,7 ml). Enheter uttrykt i tabell 2 ble beregnet som følger:
Claims (2)
1. DNA-sekvens som koder for det regulatoriske område for alkoholoksidase II hos en metylotrof gjær, hvilket område reagerer på nærværet av metanol som den eneste karbonkilde for vertscellen,
karakterisert ved at sekvensen inneholdes mellom det første EsoRI-sete tja 5<!->enden og startkodonet av det AOX2 strukturelle gen som vist ved restriksjonskartet på fig. 1 (b), og funksjonelle mutanter derav med samme biologiske funksjon.
2. DNA-sekvens som beskrevet i krav 1,
karakterisert ved at sekvensen er operabelt forbundet med et heterologt gen.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NO19954360A NO315206B1 (no) | 1988-06-24 | 1995-10-31 | Nye celler inneholdende alkoholoksidase II regulatorisk område |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/211,007 US5032516A (en) | 1985-10-25 | 1988-06-24 | Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO892634D0 NO892634D0 (no) | 1989-06-23 |
| NO892634L NO892634L (no) | 1989-12-27 |
| NO301285B1 true NO301285B1 (no) | 1997-10-06 |
Family
ID=22785222
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO892634A NO301285B1 (no) | 1988-06-24 | 1989-06-23 | DNA-sekvens som koder for det regulatoriske område for alkoholoksidase II hos Pichia pastoris |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5032516A (no) |
| EP (1) | EP0347928A3 (no) |
| JP (1) | JPH0773501B2 (no) |
| KR (1) | KR960010590B1 (no) |
| CN (1) | CN1039616A (no) |
| AU (1) | AU615078B2 (no) |
| CA (1) | CA1306211C (no) |
| DD (1) | DD284047A5 (no) |
| DK (1) | DK175822B1 (no) |
| FI (1) | FI104497B (no) |
| HU (1) | HUT51673A (no) |
| IE (1) | IE67039B1 (no) |
| MX (1) | MX16518A (no) |
| NO (1) | NO301285B1 (no) |
| NZ (1) | NZ229534A (no) |
| PH (1) | PH27314A (no) |
| PT (1) | PT90970A (no) |
| YU (1) | YU128789A (no) |
| ZA (1) | ZA894495B (no) |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992013951A1 (en) * | 1991-02-04 | 1992-08-20 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells |
| JPH07106153B2 (ja) * | 1991-03-27 | 1995-11-15 | 株式会社ミドリ十字 | 変異型ａｏｘ２プロモーターを担持するプラスミド、形質転換体および異種蛋白質の製造方法 |
| CA2063890C (en) * | 1991-03-27 | 2007-03-13 | Masami Miura | Mutant aox2 promoter, microorganism carrying same, method of preparation thereof and production of heterologous protein using such microorganism |
| JPH0829102B2 (ja) * | 1991-03-27 | 1996-03-27 | 株式会社ミドリ十字 | 変異型ａｏｘ２プロモーター、当該プロモーターを担持する菌株、その取得方法およびその菌株を利用した異種蛋白質の製造方法 |
| JP3505743B2 (ja) * | 1993-07-27 | 2004-03-15 | 三菱ウェルファーマ株式会社 | 変異型ａｏｘ２プロモーター、それを担持するベクター、形質転換体および異種蛋白質の製造方法 |
| IT1270196B (it) * | 1994-06-09 | 1997-04-29 | Enichem Spa | Procedimento catalitico per la produzione di ossime |
| US5945275A (en) * | 1994-10-18 | 1999-08-31 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| US5872098A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-16 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| US5863894A (en) * | 1995-06-05 | 1999-01-26 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| US5866542A (en) * | 1994-10-18 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| HU225126B1 (en) * | 1994-10-18 | 2006-06-28 | Dendreon Corp | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins |
| CA2202351A1 (en) * | 1994-10-18 | 1996-04-25 | George Phillip Vlasuk | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins |
| US5866543A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
| EP0862640A2 (en) * | 1995-11-09 | 1998-09-09 | ZymoGenetics, Inc. | Production of gad65 in methylotrophic yeast |
| MX9605082A (es) | 1996-10-24 | 1998-04-30 | Univ Autonoma De Nuevo Leon | Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano. |
| US7625756B2 (en) * | 2000-06-28 | 2009-12-01 | GycoFi, Inc. | Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells |
| US8697394B2 (en) * | 2000-06-28 | 2014-04-15 | Glycofi, Inc. | Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures |
| US7029872B2 (en) | 2000-06-28 | 2006-04-18 | Glycofi, Inc | Methods for producing modified glycoproteins |
| US7449308B2 (en) * | 2000-06-28 | 2008-11-11 | Glycofi, Inc. | Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes |
| US7598055B2 (en) * | 2000-06-28 | 2009-10-06 | Glycofi, Inc. | N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes |
| US7863020B2 (en) | 2000-06-28 | 2011-01-04 | Glycofi, Inc. | Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes |
| MXPA03009059A (es) | 2001-04-05 | 2004-10-15 | Univ Nebraska | Secuencias de nucleotidos reguladoras de alcohol oxidasa 1 para expresion de genes heterologos en levadura. |
| DE60335602D1 (de) * | 2002-12-18 | 2011-02-17 | Roche Diagnostics Gmbh | Rekombinante Desoxyribonuclease I aus Rinder-Pankreas mit hoher spezifischer Aktivität |
| ATE387494T1 (de) * | 2002-12-20 | 2008-03-15 | Hoffmann La Roche | Hitzelabile desoxyribonuklease i-varianten |
| US7332299B2 (en) | 2003-02-20 | 2008-02-19 | Glycofi, Inc. | Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes |
| EP1460425A1 (en) * | 2003-03-17 | 2004-09-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | Deglycosylated enzymes for conjugates |
| DE602004025192D1 (de) * | 2003-12-05 | 2010-03-11 | Roche Diagnostics Gmbh | Rekombinante Carboxypeptidase B und ihre Aufreinigung |
| PT1926749E (pt) * | 2005-09-14 | 2011-09-29 | Sanofi Aventis Deutschland | Clivagem de precursores de insulinas por uma variante de tripsina |
| JP4216875B2 (ja) * | 2006-09-29 | 2009-01-28 | 株式会社東芝 | メタノール応答性プロモーター、プロモーターと外来遺伝子を発現可能な様式で連結した融合遺伝子、ベクター、形質転換体、およびタンパク質の生産方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0423890A3 (en) * | 1984-07-27 | 1991-07-03 | Unilever Nv | Use of oxidoreductases in bleaching and/or detergent compositions and their preparation by microorganisms engineered by recombinant dna technology |
| US4855231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-08-08 | Phillips Petroleum Company | Regulatory region for heterologous gene expression in yeast |
| US4882279A (en) * | 1985-10-25 | 1989-11-21 | Phillips Petroleum Company | Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia |
| US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
| IL82935A0 (en) * | 1986-08-12 | 1987-12-20 | Phillips Petroleum Co | Secretion of heterologous proteins from yeast |
| NZ228948A (en) * | 1988-05-13 | 1991-06-25 | Phillips Petroleum Co | Hbv particles containing s and pre-s 2 proteins and recombinant processes for their production in yeast cells |
-
1988
- 1988-06-24 US US07/211,007 patent/US5032516A/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-06-13 NZ NZ229534A patent/NZ229534A/en unknown
- 1989-06-13 ZA ZA894495A patent/ZA894495B/xx unknown
- 1989-06-14 CA CA000602769A patent/CA1306211C/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-19 MX MX1651889A patent/MX16518A/es unknown
- 1989-06-21 DD DD89329825A patent/DD284047A5/de unknown
- 1989-06-23 DK DK198903131A patent/DK175822B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-06-23 HU HU893208A patent/HUT51673A/hu unknown
- 1989-06-23 EP EP89111464A patent/EP0347928A3/en not_active Withdrawn
- 1989-06-23 NO NO892634A patent/NO301285B1/no not_active IP Right Cessation
- 1989-06-23 PT PT90970A patent/PT90970A/pt not_active Application Discontinuation
- 1989-06-23 AU AU37002/89A patent/AU615078B2/en not_active Expired
- 1989-06-23 CN CN89104253A patent/CN1039616A/zh active Pending
- 1989-06-23 JP JP1162492A patent/JPH0773501B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-23 IE IE205589A patent/IE67039B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-06-23 YU YU128789A patent/YU128789A/sh unknown
- 1989-06-23 KR KR1019890008823A patent/KR960010590B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-06-23 PH PH38829A patent/PH27314A/en unknown
- 1989-06-26 FI FI893109A patent/FI104497B/fi active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PH27314A (en) | 1993-05-28 |
| FI893109A (fi) | 1989-12-25 |
| AU3700289A (en) | 1990-01-04 |
| FI104497B (fi) | 2000-02-15 |
| JPH0253489A (ja) | 1990-02-22 |
| FI893109A0 (fi) | 1989-06-26 |
| EP0347928A2 (en) | 1989-12-27 |
| DK313189D0 (da) | 1989-06-23 |
| DK175822B1 (da) | 2005-03-14 |
| HUT51673A (en) | 1990-05-28 |
| AU615078B2 (en) | 1991-09-19 |
| DK313189A (da) | 1989-12-25 |
| CN1039616A (zh) | 1990-02-14 |
| NO892634L (no) | 1989-12-27 |
| DD284047A5 (de) | 1990-10-31 |
| MX16518A (es) | 1993-10-01 |
| JPH0773501B2 (ja) | 1995-08-09 |
| EP0347928A3 (en) | 1990-02-07 |
| YU128789A (sh) | 1992-07-20 |
| NO892634D0 (no) | 1989-06-23 |
| PT90970A (pt) | 1989-12-29 |
| US5032516A (en) | 1991-07-16 |
| IE892055L (en) | 1989-12-24 |
| KR960010590B1 (ko) | 1996-08-06 |
| IE67039B1 (en) | 1996-02-21 |
| NZ229534A (en) | 1991-04-26 |
| KR910001049A (ko) | 1991-01-30 |
| ZA894495B (en) | 1990-03-28 |
| CA1306211C (en) | 1992-08-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO301285B1 (no) | DNA-sekvens som koder for det regulatoriske område for alkoholoksidase II hos Pichia pastoris | |
| Greenleaf et al. | Yeast RPO41 gene product is required for transcription and maintenance of the mitochondrial genome. | |
| US4882279A (en) | Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia | |
| US4943529A (en) | Kluyveromyces as a host strain | |
| CA1318617C (en) | Enhanced secretion of heterologous proteins by hosts using substituted promoters | |
| US4797359A (en) | Heat shock regulated production of selected and fused proteins in yeast | |
| NO854333L (no) | Isolering av gener fra gjaerarter av slekten pichia. | |
| NO178076B (no) | Fremgangsmåte til å fremstille heterologe proteiner i Pichia pastoris ved bruk av ekspresjonsvektorer inneholdende sekvenser som induseres av metanol | |
| NO172397B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av en stamme av gjaeren kluyveromyces samt kloningssystem til bruk ved fremgangsmaaten | |
| NO172548B (no) | Saccharomyces cerevisiae hybride vektorer og anvendelse av disse ved fremstilling av polypeptider | |
| US5939287A (en) | Method for production of proteins in yeast | |
| US6444438B1 (en) | Method for the preparation of a protein by yeasts using an inducible system, vectors and correspondence transformed strains | |
| EP0128743A2 (en) | Expression of foreign genes in yeast | |
| Yellen et al. | Expression of Torpedo nicotinic acetylcholine receptor subunits in yeast is enhanced by use of yeast signal sequences | |
| NO315206B1 (no) | Nye celler inneholdende alkoholoksidase II regulatorisk område | |
| NO894916L (no) | Pichia pastoris glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenasegen. | |
| IE67053B1 (en) | Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region | |
| FI105825B (fi) | Pichia pastoris -kantoja | |
| NO871886L (no) | Produksjon av streptokinase ved hjelp av gjaer. | |
| NO891485L (no) | Fremgangsmaate til fremstilling av 22 kd sgh-protein og lineaer genevektor. | |
| EP0493926A1 (en) | A method for enhancing the structural stability of recombinant DNA expression vectors |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |