NO871886L

NO871886L - Produksjon av streptokinase ved hjelp av gjaer.

Info

Publication number: NO871886L
Application number: NO871886A
Authority: NO
Inventors: Mary Jane Hagenson; David Womack Stroman
Original assignee: Phillips Petroleum Co
Priority date: 1986-05-08
Filing date: 1987-05-06
Publication date: 1987-11-09
Also published as: EP0248227A1; AU592862B2; DK233587D0; ZA872534B; FI872031A; BR8702337A; FI872031A0; DK233587A; NO871886D0; JPS62296881A; AU7139087A

Description

Oppfinnelsen angår bruken av rekombinant DNA-teknologi for produksjonen av streptokinase. En side ved oppfinnelsen angår ekspresjonen av streptokinase ved gjær. En annen side ved oppfinnelsen angår nye DNA-konstruksjoner (constructs)

som koder for streptokinase. Nok en side ved oppfinnelsen angår nye organismer transformert med de ovenfor beskrevne DNA-konstruksjoner.

Etter hvert som rekombinant DNA-teknologi har utviklet seg

i den senere tid, er den regulerte fremstilling ved hjelp av mikroorganismer av en rekke forskjellige nyttige polypeptider blitt mulig. Mange eukaryotiske polypeptider, f.eks. menneskelig veksthormon, 1eukocyttinterferoner, menneskelig insulin og menneskelig proinsulin er allerede blitt fremstilt ved forskjellige mikroorganismer. Det ventes at den fortsatte anvendelse av teknikker som allerede beherskes, i fremtiden vil tillate fremstilling ved hjelp av mikroorganismer av en rekke andre nyttige polypeptidprodukter. Ett slikt nyttig polypeptidprodukt er streptokinase.

Streptokinaser er en godt definert gruppe proteiner som av mange stammer hemolytiske streptokokker avgis til vekst-mediet. Det ble bragt på det rene for en tid siden at streptokinaser spiller en rolle i oppløsningen av blodpropper og særlig i eksudater som er rike på fibrinkomponenter. Avhengig av beskaffenheten og størrelsen av disse propper bevirker streptokinase i nærvær av humant plasminogen oppløsning av slike propper. Oppløsningen av blodpropper finner sted fordi streptokinasene reagerer støkiometrisk med det enzymatisk inerte plasma-plasminogen for å gi det aktive enzymp1asmin. Det plasmin som dannes på denne måte bryter deretter ned fibrin-nettverket ved begrenset proteolyse for dannelse av oppløselige produkter.

Før søkernes anvendelse av rekombinant DNA-teknologi på problemet med fremstilling av streptokinase i stor målestokk, ble streptokinase skaffet som et gjæringsprodukt av hemo lytiske streptokokker. Bruken av streptokinase er derfor blitt begrenset av det faktum at streptokinaseproduktet som isoleres fra streptokokker som produserer streptokinase på naturlig måte, er blitt forurenset ved uvedkommende strepto-kokkale protein-biprodukter som gav opphav til giftige reaksjoner hos mennesker. Disse reaksjoner melder seg i form av en økning i kroppstemperatur, en senkning av blodtrykket, skjelving, frysninger, oksygenmangel, cyanose og lignende. Således har der ikke vært tilgjengelig midler for oppnåelse og opprettholdelse av tilstrekkelige forsyninger av streptokinase med tilstrekkelig renhet til bruk i behandlingen av blodpropper. Følgelig vil en fremgangsmåte til fremstilling av streptokinase i betydelige mengder og fritt for strepto-kokkale protein-biprodukter ved rimelige omkostninger være av stor verdi.

En hensikt med oppfinnelsen er derfor å skaffe en fremgangsmåte til fremstilling av streptokinase i gjær.

En annen hensikt med oppfinnelsen er fremstillingen av nye konstruerte DNA-stykker (DNA constructs) som kan uttrykke streptokinase i gjær i store mengder.

Disse og andre hensikter med oppfinnelsen vil fremgå av beskrivelsen og kravene.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er det funnet at streptokinase kan fremstilles ved gjær med høyt utbytte ved dyrking av gjærceller transformert med konstruerte DNA-stykker omfattende streptokinase-kodende områder under styring av gjær-reguleringsområder, hvor de streptokinasekodende områder er frie for bakterielle signalsekvenser.

Kor t beskrivelse av figurene

Fig. 1 er et restr iksjonskart for området 5' av det primære dihydroksyacetonsyntase-gen fra Pichia (DAS1). Fig. 2 er et restriksjonskart for området 5' av det primære alkoholoksidase-gen fra Pichia (A0X1). Fig. 3 er et restriksjonskart for området 5' av p40-genet fra Pi chia. Fig. 4 er et restriksjonskart for den autonome replikasjonssekvens PARS1. Fig. 5 er et restriksjonskart for den autonome replikasjonssekvens PARS2. Fig. 6 er et restriksjonskart for plasmid PMF5 innbefattet detaljer for det streptokinasekodende område som anvendes for modifisering og innsetting i Pichia-ekspresjonsvektoren pTHBS3V.

Fig. 7 er et restriksjonskart for plasmidet pTHBS3V.

Fig. 8 er et restriksjonskart for plasmidet pHTskc25.

De følgende forkortelser er benyttet på figurene for restrik-s jonsenzymene:

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er der skaffet

et nytt DNA-fragment som omfatter et gjær-reguleringsområde og et polypeptidkodende område hvor det polypeptidkodende område koder for streptokinase eller partier derav, men hvor det kodende område for streptokinase er fritt for bakterielle signalsekvenser, og hvor gjær-regu1 eringsområdet kan styre transkripsjonen av messenger-RNA når det er anordnet ved 5'-enden av det område som koder for streptokinase. Valgfritt kan de nye DNA-fragmenter ifølge oppfinnelsen

også innbefatte en 3'-sekvens av DNA nedenfor det polypeptidkodende område, idet 3'-sekvensen av DNA kan styre polyadenyleringen og avslutningen av transkripsjonen av det messenger-RNA som er kodet for ved det polypeptidkodende område. Kombinasjonen av reguleringsområde, streptokinasegen og det transkripsjone 11e avslutningsfragment skal heretter betegnes som en ekspresjonskassett eller ekspresjonsenhet .

Videre er der i henhold til oppfinnelsen skaffet nye lineære og sirkelformede plasmider inneholdende de ovenfor beskrevne ekspresjonskassetter.

Også i henhold til oppfinnelsen er der skaffet stort sett rene kulturer av gjærstammer transformert med de ovenfor beskrevne lineære eller sirkelformede plasmider. I henhold til en annen utføre 1 sesform av oppfinnelsen er der beskrevet en fremgangsmåte til fremstilling av streptokinase som omfatter å dyrke en gjærstamme transformert med de ovenfor beskrevne plasmider under betingelser hvor ekspresjon av det ønskede proteinprodukt oppnås.

Streptokinaser produseres av forskjellige medlemmer av bak-teriefami1ien Streptococcus. Streptokinasegenet fra Streptococcus equisimilis er blitt klonet ogkarakterisertav Malke og Ferretti (PNAS USA 81, pp. 3557-3561 (1984) og Malke,

Roe og Ferretti (Gene, 34, pp. 357-362 (1985)). De ovenfor angitte henvisninger beskriver nukleotidsekvensen for det isolerte streptokinase-gen innbefattet bakterielle ikke-kodende sekvenser anordnet både 5' og 3' i forhold til det streptokinasekodende område.

Det streptokinase-gen som beskrives av Malke et al., ble modifisert ved kløyving med restriksjonsenzymet Aval I. Denne digestion fjernet de native 5'-signalsekvenser, de første ti nukleotider som koder for den modne form av streptokinase såvel som noen sekvenser 3' i forhold til det streptokinase-kodende område. Denne avkortede streptokinasekodende sekvens ble deretter ligatisert med den syntetiske Ava I I-BamHI-1inker vist nedenunder i sekvens A:

Når den syntetiske linker vist i sekvens A ble ligatisert

til det Aval I-behandlede streptokinasekodende fragment, ble de første ti nukleotider som var blitt slettet fra det streptokinasekodende område erstattet, hvilket gav fire kodoner som koder for de samme aminosyrer som de native sekvenser gjør, og dessuten ble der skaffet et ATG-initierende kodon. DNA ble deretter digestert med EcoRI for å skaffe forenlige vedheftende (sticky) ender for ligatisering inn i det unike EcoRI-sete av gjær-ekspresjonsvektoren pTHBS3V (se fig. 7). Den resulterende streptokinase-kodende sekvens har de 5'-endenukleotidsekvenser og aminoterminal-translaterte amino-syr esekvense-r som angitt nedenunder som sekvens B:

Nukleotidsekvensene (og trans later te aminosyresekvenser) som fås som et resultat av ligatisering av sekvens A (vist nedenunder med skråskrift) til 3'-enden av det avkortede streptokinasekodende fragment er vist nedenunder i sekvens C :

Det fullstendige streptokinasekodende område som anvendes

for det ekspresjonsårbeid som er beskrevet i nærmere detalj nedenunder, har ca. 1245 nukleotidér. Et restriksjonskart av dette er vist på fig. 6 (se Aval I-fragmentet som inkluderer mesteparten av det streptokinasestrukturelle gen og noen 3'-sekvenser og avsnitt fra posisjon 907 til 2274). Dette fragment på 1245 basepar er blitt fullstendig sekvensert,

og sekvensen er angitt nedenunder som sekvens D:

Et hvilket som helst gjær-reguleringsområde er egnet til

bruk ved utførelse av den foreliggende oppfinnelse. Uttrykket "reguleringsområde" slik det benyttes i denne beskrivelse,

er ment å innbefatte de forskjellige funksjoner som er nød-vendige for regulert genekspres jon, f.eks. promotorområder, aktivatorsekvenser på oversiden, katabo1 i11fø1 somme områder o.l. Fagfolk vil innse at der finns en rekke reguleringsområder som er blittkarakterisertog som kunne ha vært anvendt i forbindelse med det modifiserte streptokinase-kodende område fremstilt som beskrevet ovenfor.

Eksempler på gjær-reguleringsområder innbefatter det sure fosfatase, alfa-paringsfaktor og glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase-reguleringsområder isolert fra Saccharomyces cerevisiae; det primære alkoho1oksidase (A0X1) og dihydroksyacetonsyntase (DAS1) og p40-reguleringsområder isolert fra Pichia pastoris; Pichia HIS4-reguleringsområdet o.l.

For tiden foretrukne reguleringsområder som anvendes ved utførelse av den foreliggende oppfinnelse, er kjennetegnet ved deres evne til å reagere på medier inneholdende:

(1) metano1,

(2) ikke-katabo1 itt-undertrykkende karbonkilder som f.eks. glycerol, galaktose, acetat o.l. (3) katabo1 itt-undertrykkende karbonkilder som f.eks. glukose, etanol, fruktuse o.l., fulgt av karbon-k ilde-hunge r.

Eksempler på disse for tiden foretrukne reguleringsområder

er vist ved restriksjonskartene angitt på fig. 1, 2 og 3.

Det reguleringsområde som er vist på fig. 1, fås fra det primære dihydroksyacetonsyntase-gen (DAS1) av Pichia pastoris. Det reguleringsområde som er vist på fig. 2, fås fra det primære alkoholoksidase-gen (A0X1) av Pichia pastoris (Pichia har to alkoholoksidase-gener, heretter betegnet som A0X1 og A0X2). Det reguleringsområde som er vist på fig. 3, fås fra p40-genet av Pichia pastoris. Fagfolk vil innse at andre

reguleringsområder som har de ovenfor angitte egenskaper,

kan isoleres fra metylotrofe gjærsorter, som f.eks. Pichia pastoris. Slike ytterligere reguleringsområder som har regulerende egenskaper som ligner på egenskapene til de ovenfor beskrevne reguleringsområder, ligger også innenfor oppfin-nelsens omfang.

Ligati ser ingen av hvilke som helst av de ovenfor beskrevne reguleringsområder med det avkortede streptokinase-gen utføres lett av fagfolk ved anvendelse av kjente teknikker. Det skal bemerkes at kombinasjonen av reguleringsområde-1inker (f.eks. se sekvens A) -avkortet kodende sekvens skaffer for det resulterende konstruerte stykke det nødvendige ATG-start-kodon som kreves for proteinekspresjon, såvel som de ti nukleotider som ble fjernet når det "fullstendige" streptokinase-gen ble avkortet, som beskrevet ovenfor.

De konstruerte materialer av reguleringsområdet/strukturelt gen ifølge oppfinnelsen kan tilføres organismer for amplifi-kasjon, reproduksjon og ekspresjon på en rekke forskjellige måter. I henhold til oppfinnelsen er det funnet at det opprinnelige 1igasjonsprodukt kan transformeres direkte inn i en gjærvert for ampiifikasjon og seleksjon. Således, isteden-for å transformere den opprinnelige 1 i gasjonsblanding først inn i en E. coli-vert for amp1 ifikasjon og seleksjon, foretrekkes det å transformere direkte inn i en gjærvert.

Gjær-transformanter inneholdende de ønskede konstruerte stykker som koder for streptokinase, kan velges ved anvendelse av passende seleksjonstrykk på blandingen av gjærkulturer, hvilket fører til opprinnelig gjær-1ransformas jon. Plasmid DNA kan deretter utvinnes fra de valgte gjær-transformanter og benyttes til å transformere E. coli, på hvilke passende analyser utføres for å bekrefte nærværet av streptokinase-kodende sekvenser i de utvalgte transformanter. (De analyser som anvendes, er beskr.evet i eksempel X).

For autonom replikasjon av gen-stykkene i gjær er det nyttig å anvende et autonomt replikasjonssekvenselement (ARS) som en del av transformerende DNA. Eksempler innbefatter FARSI

og PARS2 som fås fra Pichia pastoris slik det er vist på henholdsvis fig. 4 og 5.

Der hvor man isteden ønsker integrativ transformasjon av verten, vil ikke noe ARS-e1ement bli anvendt. En foretrukket fremgangsmåte for oppnåelse av integrativ transformasjon omfatter å anvende en sete-rettet integrasjonsvektor som omfatter

et første innsettbart DNA-fragment,

et streptokinase-kodende område fritt for bakterielle

signalsekvenser slik det er beskrevet ovenfor,

et selekterbart markørgen, og

et andre innsettbart DNA-fragment.

De første og andre innsettbare DNA-fragmenter er hver minst ca. 200 nukleotider lange og har nukleotidesekvenser som er homologe med partier av det genomiske DNA av arter av slekten Pichia. De forskjellige komponenter av den integrative vektor er ordnet i serie, hvilket danner et lineært fragment av DNA, slik at ekspresjonskasset ten og det selekterbare markørgen er anordnet mellom 3'-enden av det første innsettbare DNA-fragment og 5'-enden av det andre innsettbare DNA-fragment. De første og andre innsettbare DNA-fragmenter er orientert i forhold til hverandre i det i rekkefølge ordnede lineære fragment på samme måte som de er orientert i genomet av Pichia.

Det er nødvendig å innlemme minst ett selekterbart markørgen i det DNA som anvendes til å transformere vertsstammen. Dette letter seleksjonen og isoleringen av de organismer

som har innlemmet det transformerende DNA. Markørgenet med-deler den transformerte organisme et fenotypisk trekk som verten ikke hadde, f.eks. gjenopprettelse av evnen til å

produsere en spesiell aminosyre hvor den ikke-transformerte vertsstamme har en defekt i den spesielle aminosyrebiosyn-tet i ske vei.

Fagfolk vil innse at ytterligere DNA-sekvenser også kan innlemmes i de vektorer som anvendes i utførelse av den foreliggende oppfinnelse såsom f.eks. bakterielt plasmid DNA, bakteriofag DNA og lignende. Slike sekvenser tillater ampiifikasjonen og opprettholdelsen av disse vektorer i bakter ieverter.

Ekspresjon i transformert gjær

De ovenfor beskrevne plasmider ifølge oppfinnelsen er nyttige

i gjærstammer som kan transformeres. Regulering av strepto-kinaseekspresjon i gjær ved de nye DNA-stykker ifølge oppfinnelsen kan oppnås ved dyrking av de transformerte stammer under passende induserende eller ikke-induserende betingelser. For eksempel kan gen-ekspresjon ved anvendelse av de for tiden foretrukne reguleringsområder vist på fig. 1, 2 og 3, oppnås ved at den transformerte organisme underkastes karbonkildehunger. KarbonkiIdehunger etter dyrking på en rekke forskjellige katabo1 ittundertrykkende såvel som ikke-katabo-1 ittundertrykkende karbonkilder induserer ekspresjon av genproduktet som holdes under styring av de for tiden foretrukne reguleringsområder i følge oppfinnelsen. En annen måte å oppnå ekspresjon av det ønskede genprodukt i egnede arter av transformert gjær på, er å dyrke transformerte gjærsorter på metanol. Nok en måte til å indusere ekspresjon av det ønskede genprodukt er å dyrke transformert gjær på medier inneholdende ikke-katabo1 ittundertrykkende karbonkilder .

De for tiden foretrukne reguleringsområder ifølge oppfinnelsen er nyttige til ekspresjon i alle gjærstammer, da det er blitt vist at disse reguleringsområder induseres under en rekke forskjellige betingelser. Således kan gjærsorter som 13

kan vokse på metanol eller ikke-katabolittundertrykkende karbonkilder, bringes til å produsere streptokinase direkte, mens gjærsorter som kan vokse på katabolittundertrykkende karbonkilder, kan bringes til å produsere streptokinase ved at gjærcellene som dyrkes på denne måte, underkastes betingelser av karbonkildehunger.

Transformerte gjærstammer som foretrekkes til bruk i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, som anvender forskjellige reguleringsområde/kodesekvens-stykker innbefatter medlemmer av slektene:

Candida,

Kloeckera,

Saccharomyces,

Schizosaccharomyces,

Rhodotorula,

Hansenula,

Torulopsis,

Pichia, and

Kluyveromyces.

Gjærsorter fra disse slekter foretrekkes fordi deres sikkerhet ved håndtering, vekstbetingelser og lignende er blitt etablert og er godt kjent blant fagfolk.

Særlig foretrukkede gjærstammer til bruk i fremstilling av streptokinase i én utføre1sesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er de gjærstammer som kan vokse på metanol som karbon- og energikilde, da slike verter er i stand til god utnyttelse av de for tiden foretrukne på metanol reagerende reguleringsområder som beskrevet ovenfor. Gjærsorter som er kjent for å kunne vokse på metanol, innbefatter medlemmer av s lektene: 14

Candida,

Kloeckera,

Saccharomyces,

Rhodotorula,

Hansenula,

Torulopsis, and

Pichia.

Da de for tiden foretrukkede reguleringsområder ifølge oppfinnelsen også induseres ved vekst på ikke-katabolittundertrykkende karbonkilder samt betingelser av karbonkildehunger, er gjærsorter som kan dyrkes på slike ikke-metano1 ske sub-strater såsom:

glukos e,

acetat,

glycerol,

etanol,

laktose,

galaktose,

f ruktose,

sukrose,

og lignende og blandinger av hvilke som helst to eller flere derav, også nyttige i utførelse av oppfinnelsen. Ved dyrking av vertsorganismen på en egnet ikke-katabolittundertrykkende, ikke-metanolsk karbonkilde som f.eks. glycerol eller galaktose, eller ved å dyrke vertsorganismen på en egnet katabo-1ittundertrykkende karbonkilde som f.eks. etanol, glukose og fruktose, og deretter underkaste vertsorganismen betingelser av karbonkildehunger kan ekspresjon av streptokinase under styring av de for tiden foretrukne reguleringsområder ifølge oppfinnelsen oppnås.

En særlig foretrukket vertsgjærstamme er mutanten Pichia pastoris GS115, som er en mutant som er defekt med hensyn til evnen til å produsere histidin. GS115 er blitt betegnet som en som har mutantgenotypen his4, som et resultat av at defekten i histidinvei en virker inn på det histidinol- dehydrogenasekodende gen. GS115 fås fra Pichia pastoris NRRL Y-11430 og er blitt deponert i the Northern Regional Research Center hos De forente staters landbruksdepartement i Peoria, Illinois, og er blitt gitt aksesjonsnr. NRRL Y-15851. Denne spesielle vert er nyttig fordi den er en auxotrof mutant som mangler histidinveien. Transformasjon av denne vert med en vektor som inneholder, blant andre DNA-sekvenser, sekvenser som koder for HIS4-genfunksjonen, tillater lett utvelgelse av transformerte verter.

En annen foretrukket gjærstamme til bruk i utførelse av den foreliggende oppfinnelse er mutanten Pichia pastoris GS190, som er en mutant som er defekt i argininvei en, hvilket virker inn på det gen som koder for argininosuccinatlyase. GS190

fås fra Pichia pastoris NRRL Y-11430, og er blitt deponert hos the Northern Regional Research Center hos De forente staters landbruksdepartement i Peoria, Illinois, og er blitt gitt aksesjonsnr. NRRL Y-18014.

Nok en foretrukket vertsgjærstamme er den dobbelt auxotrofe mutant PPF1, som er en mutant som er defekt både i histidin-og argininveien. PPF1 er defekt både i histidinveien som virker inn på det gen som koder for histidinoldehydrogenase og argininveien som virker inn på det gen som koder for argininosuccinatlyase-. PPF1 er blitt deponert i the Northern Regional Research Center hos De forente Staters landbruksdepartement i Peoria, Illinois, og er blitt gitt aksesjonsnr. NRRL Y-18017.

Escherichia coli er også en egnet vert for plasmidene ifølge oppfinnelsen. Fagfolk vet at mange stammer av E. coli er lett tilgjengelige og er egnede verter.

Pichia pastoris transformasjonsfremgangsmåte

De eksperimentelle fremgangsmåter for transformasjonen av Pichia pastoris er beskrevet tidligere og er angitt i nærmere detalj nedenunder (eksempel 1).

Pichia pastoris kan transformeres ved enzymatisk digestion av celleveggene for å gi sfæroplaster; sfæroplastene blandes deretter med det transformerende DNA og inkuberes i nærvær av kalsiumioner og polyetenglyko1, deretter regenereres de i selektivt dyrkningsmedium som mangler histidin. Det transformerende DNA innbefatter HIS4-genet som vertsstammen mangler, således overlever kun transformerte celler på det selektive dyrkningsmedium som anvendes.

Det ønskede produkt, streptokinase, fremstilles ved dyrking av transformerte celler under betingelser hvor reguleringsområdet induserer ekspresjon av det polypeptidkodende område som koder for streptokinase. Fagfolk kan lett bestemme slike passende dyrkingsbetinge 1 ser uten behov for å utføre unød-vendig eksperimentering.

Straks dyrkingen av celler og ekspresjon av streptokinase

er blitt utført til akseptable nivåer, kan produktet gjen-vinnes ved bruk av en rekke forskjellige proteingjenvinnings-måter som er kjent for fagfolk. Eksempler på slike metoder innbefatter oppbryting av celler, f.eks. ved kraftig miksing med glassperler, fulgt av sent r ifugering for å gi et oppløse-lig proteinekstrakt.

Den isolerte proteinhoIdige fraksjon kan analyseres på en rekke forskjellige måter, f.eks. ved plasminogenaktiverings-analyse, ved polyakrylamid-gelelektroforese av de cellulære proteiner og ved immunoreaksjon med streptokinaseantistoff. Disse analysemetoder er beskrevet i nærmere detalj i eksemp-1 ene .

Oppfinnelsen skal nå beskrives nærmere med henvisning til

de følgende ikke-begrensende eksempler.

EKSEMPLER

Generell informasjon som gjelder for alle eksemplene:

Stammer

Pichia pastoris GTS115 (his4) [NRRL Y-1585l] var den vertsgjærstamme som ble brukt i disse eksempler.

E. coli K-12 stammer 848 (F £-] met thi gal tonA hsdR hsdM)

og E. coli GM119 (dam dem) ble brukt for formeringen av plasmid DNA.

Plasmider

Plasmid pMF5 er vist på fig. 6. Malke og Ferretti (PNAS USA 81, pp. 3557-3561 (1984)) og Malke, Roe og Ferretti (Gene 34, pp. 357-362 (1985)).

Plasmid pTHBS3V er vist på fig. 7. Plasmid pTHBS3V inneholder Pichia HIS4, PARS1 og 5'-AOXl-sekvenser som kan fås fra plasmid pSA0H5 (hvilket er tilgjengelig i en E. coli-vert fra the Northern Regional Research Center hos De forente staters landbruksdepartement, Peoria, Illinois med aksesjonsnr. NRRL B-15862). 3'A0X1-sekvensene kan fås fra plasmid pPG4.0 (som er tilgjengelig i en E. coli-vert fra USDA med aksesjonsnr. NRRL B-15868). Alternativt kan pTHBS3V fremstilles fra pHTskc25 (tilgjengelig fra USDA i en E. coli-vert med aksesjonsnr. NRRL B-18069) ved EcoRI-di gestion, deretter re-1igati ser ing av den åpnede vektor minus streptokinase-sekvensene (som foreligger i pHTskc25 som et EcoRI-innskudd).

Plasmid- isoler inger

Plasmider ble isolert fra E. coli ved bruk av fremgangsmåten

i henhold til Birnboim og Dolby (Nucl. Acids Res. 7, pp. 1513-1523 (1979)). Plasmid DNA fra Pichia pastoris ble isolert som beskrevet tidligere av Cregg (Mol. Cell. Biol. 5, 3376 ( 1985) ) .

Enzymer og kjemikalier

Streptokinase innkjøpt fra Boehringer Mannheim Biochemicals ble brukt som en standard. Menneskelig serumplasminogen ble skaffet fra CalBiochem. Restriksjonsendonukleaser var fra New England Biolabs. Akrylamid, bisakrylamid, TEMED og ammo-niumpersulfat ble skaffet fra BioRad. T4 DNA-ligase var fra Promega, og polynukleotidkinase og kalvetarm-fosfatase ble innkjøpt fra Boehringer Mannheim Biochemicals.<125>j-protein A ble skaffet fra Amersham og agamma kalveserum var fra Gibco.

Ant i stoff til streptokinase

Kanin-anti sera mot renset S. equisimilis H46A streptokinase ble velvilligst stillet til disposisjon av Dr. J. J. Ferretti og Dr. M. L. Dau (University of Oklahoma).

Med ia

E. coli ble dyrket i LB-medium med 10 >Jg/ml tetracyklin

eller 50 jjg/ml ampicillin.

Pichia poastoris r i steflaske-kulturer ble dyrket i IM3-media med YTM4 spormineraler. Karbonkilder var 2,0% glukose, 1,0% glycerol eller 0,5% metanol.

Buffrene og oppløsningene som ble anvendt i de følgende eksempler, har de sammensetninger som er angitt nedenunder: IM tris-buffer 121,1 g Tris-base i 800 ml H 0; juster pH-verdien til den ønskede verdi ved tilsetning av konsentrert (35%) vandig HC1; tillat oppløsningen å kjølne til værelsetemperatur før endelig pH-jus ter ing, fortynn til et endelig volum på 11.

TE-buffer 1,0 mM EDTA

i 0,01 M (pH 7,4) Tris-buffer.

PBS (fosfat- 10 mM nat riumfosfat (pH 7,0) buffret saline) 0,15 M NaCl

SDS-gel lastebuffer 62,5 mM Tris-HCl (pH 6,8)

2% SDS

10% glycerol 100 mM ditiotreitol 0,0 01% bromfenol blått

YPD-medium 1% Bacto-gjærekstrakt

2% Bacto-pepton 2% dekstrose

SD-medium 6,75 g gjær-nitrogenbase uten aminosyrer (DIFCO)

2% dekstrose i 11 vann

SED 1 M_ sorbitol

25 mM EDTA

5 0 mM DTT

SCE-buffer 9,1 g sorbitol

1,47 g nat riumcitrat 0,168 g EDTA

50 ml H20

—pH til 5,8 med HC1

CaS 1 M sorbitol

10 mM CaCl

2

--f iltersteriliser

PEG-oppløsning 20% polyetenglykol-3350 10 mM CaCl - 2 10 mM Tris-HCl (pH 7,4)

--f iltersteriliser

SOS 1 M sorbitol 0,3x YPD-medium 10 mM CaCl

2

FM-21 saltmedium

H3P04(85%) 3,5 ml CaS04*2H20 0,15 g K2S042,38 g MgS04«7H20 1,95 g KOH 0,65 g FeS04<»>7H20 0,065 g CuS04<»>5H20 0,006 g ZnS04»7H20 0,020 g MnS04«H20 0,003 g Biotin 0,000041 g 1 1 vann ;IM3 saltmedium;KH2P0415,0 g K2HP041,0 g MgS04<»>7H20 0,50 g CaS04»2H20 0,04 g (NH4)2S043;00 g Biotin 0,00005 g pH til 5,4 11 vann ;YTM-4 spormmeralmedium;FeS04«7H20 65,0 g ;CuS04»5H20 6,0 g ;ZnS04»7H20 20,0 g ;MnS04»H20 3,0 g ;1 1 vann;Tilsett 250 ul pr. 1 medium;EKSEMPEL 1;Pichia pastori s-1 ransformas jonsf remgang småt e;A. Celle-dyrking;1. Inokuler en koloni av Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) inn i ca. 10 ml YPD-medium og rist kulturen ved 30°C i 12-20 h. 2. Etter ca. 12-20 h fortynn cellene til en OD 6 C „„0på ca. 0,01-0,1 og hold cellene i logaritmisk vekstfase i YPD-medium ved 30°C i 6-8 h. 3. Etter 6-8 h inokuler 10 ml av YPD-medium med 0,5 ml av s tar tkul tur en ved en ODg<g>oP®- ca- ^ > * (siler ekvivalent mengde). Rist ved SO^C i ca. 12-20 h. 4. Innhøst kulturen når ODgQQ er ca. 0,2-0,3 (etter ca. 16-20 h) ved sentr i fugering ved 1500 g i 5 min.

B. Fremstilling av sfæroplaster

1. Vask cellene en gang i 10 ml sterilt vann. (Alle sentri-fugeringer for trinn 1-5 er ved 1500 g i 5 min).

2. Vask cellene en gang i 10 ml nylig fremstilt SED.

3. Vask cellene to ganger i 10 ml steril 1 M sorbitol.

4. Resuspender cellene i 10 ml SCE-buffer.

5. Tilsett 10 ^1 av 3 mg/ml Zymolyase 60 000 (Miles Laboratories). Inkuber cellene ved 30°C i ca. 10 min. 6. Vask sfæroplas ter en gang i 10 ml steril 1 M sorbitol ved sent r i fugering ved 1000 g i 5-10 min. (Tiden og hastigheten for sent r i fugering kan variere; sentrifuger tilstrekkelig til å pelletere sfæroplaster, men ikke så meget at de revner på grunn av kraften).

7. Vask cellene en gang i 10 ml sterilt CaS.

8. Resuspender cellene i en samlet mengde på 3,5 ml CaS.

C. Transf ormas jon

1. Tilsett DNA-prøver (inntil 20jjl volum) til 12 X 75 mm sterile polypropenrør. (DNA bør foreligge i vann eller TE-buffer; for maksimale transformasjonshyppigheter

med små mengder DNA er det tilrådelig å tilsette ca.

1 jjl av 5 mg/ml lydbehandlet (sonicated) E. coli-DNA

til hver prøve).

2. Tilsett 100jjl sfæroplaster til hver DNA-prøve og inkuber ved værelsetemperatur i ca. 20 min. 3. Tilsett 1 ml PEG-opp1øsning til hver prøve og inkuber ved værelsetemperatur i ca. 15 min.

D. Regenerering av sfæroplaster

1. Resept for regenererings-agarmedium:

a Agar/KCl - 9 g Bacto-agar, 13,4 g KC1, 240 ml H20,

autoklav.

b. 10X glukose - 20 g dekstrose, 100 ml H 0, autoklav.

c. 10X SC - 6,75 g gjær-nitrogenbase uten aminosyrer,

100 ml H20, autoklav. (Tilsett en hvilken som helst ønsket aminosyre eller nukleinsyre inntil en konsentrasjon på 200 jug/ml før eller etter behandling i autoklav). d. Tilsett 30 ml 10X glukose og 30 ml 10X SC til 300 ml av den smeltede Agar/KCl-oppløsning. Tilsett 0,6 ml av 0,2 mg/ml biotin og en hvilken som helst annen ønsket aminosyre eller nukleinsyre til en konsentrasjon på 20 ^jg/ml. Hold smeltet regenerasjons-agar på 55-60°C.

2. Påføring av transformasjonsprøver på plater:

Hell bunnagarlag på 10 ml regenereringsagar pr. plate minst

30 min før transformasjonsprøvene er klare. Fordel 10 ml's porsjoner av regenereringsagar til rør i et bad på 45-50°C under den tid transformasjonsprøvene er i SOS. Tilsett 50,

250 eller 700 jol 's porsjoner av den transformerte prøve til 10 ml 's porsjoner smeltet regenereringsagar holdt på 45-

50°C og hell hver av disse på plater inneholdende et fast

10 ml's bunnagarlag av regenereringsagar.

3. Inkuber platene ved 30°C i 3-5 dager.

EKSEMPEL II

Transformasjon av E. coli

Fremgangsmåten ifølge Hanahan (J. Mol. Biol. 166, p. 557

(1983)) ble brukt til å transformere alle stammer av E. coli.

EKSEMPEL III

Syntetisk linker

En syntetisk linker ble konstruert for innsetting av et streptokinase-strukture1t gen minus dets signal-peptidsekvens inn i en rekke ekspresjonsvektorer. Linkeren ble syntetisert som to komplementære strenger hvis sekvenser er vist i sekvens A. De lyofiliserte oligomerer ble suspendert i steril 10 mM Tris, 1 mM EDTA. Ekvimolare volumer ble blandet og varmet

opp til 90aC, fulgt av langsom avkjøling til være1setemperatur for å sammenføye de komplementære tråder. Den dobbe 111rådede linker har et BamHI-sete ved sin 5'-ende og et Avall-sete ved sin 3'-ende.

EKSEMPEL IV

Innsetting av streptokinase-genet i eksp resjonsvektor pTHBS3V

De trinn som benyttes i innsettingen av det streptokinasestrukturelle gen minus det signal-peptidkodende område i EcoRI-setet av ekspresjonsvektoren pTHBS3V er beskrevet i dette eksempel. Plasmid pMF5 (se fig. 6) ble formert i E.

coli GM119 slik at det rensede plasmid-DNA kunne digesteres med Avall som er følsomt for metylering. Det 1370 bp Avall-fragment fra pMF5 ble utvunnet ved preparativ gel-elektroforese og elektroeluering i dialyserør. Dette Aval I-fragment inneholder den kodende sekvens for alle unntatt de fire første aminosyrer i det modne streptokinase-protein og signal-peptidet (26 aminosyrer). Et ATG-initieringskodon og den kodende sekvens for de slettede første fire aminosyrer i det modne protein ble erstattet med den syntetiske linker. Ava I I-fragmentet ble ligatisert med overskytende linker-DNA, ekstrahert med fenol/kloroform og etanolutfelt. Det ligatiserte DNA ble resuspendert i restriksjonsbuffer og digestert med EcoRI for etterfølgende innsetting i EcoRI-setet på pTHBS3V. Vektoren var tidligere blitt kløyvet ved dens unike EcoRI-sete for etterfølgende ligasjon med det EcoRI-kløyvde Aval I-linker-fragment (sekvens A). Etter at vektoren var blitt digestert med EcoRI, ble den behandlet med kalvetarm-fosfatase (CIP) for å redusere frekvensen av se1v-1igasjon. Den ligatiserte blanding av DNA ble brukt til å transformere Pichia pastoris-stammen GTS115 direkte.

EKSEMPEL V

Identifisering og karakterisering av den streptokinase-produserende klon

Pichia pastoris GTS115-celler transformert med streptokinase-pTHBS3V-ligasjonsb1and ingen fremstilt som beskrevet i eksempel IV ble sortert for hist idinprototrofi. Femti His+ -transformanter ble valgt tilfeldig for p1asmidi so1er ing. En av klonene inneholdt et plasmid av den ventede størrelse (9,6 kb) (fig.

8), mens en annen klone som inneholdt selvligati sert pTHBS3V-plasmid, ble tatt med som en kontroll i etterfølgende eksperi-menter. Denne klon, Pichia pastoris GTS115 (pHTskc25), er blitt deponert i the Northern Regional Research Center hos De forente staters landbruksdepartement i Peoria, Illinois

for å sikre tilgjengelighet for offentligheten ved utstedelse av den foreliggende søknad som et patent. Denne stamme er blitt gitt aksesjonsnr. NRRL Y-18070. For å bekrefte beskaffenheten av disse to kloner ble plasmid DNA fra de ovenfor beskrevne kloner brukt til å transformere E. coli 848.

Da heterologe gener under styring av AOXl-promotoren i noen grad uttrykkes i E. coli, ble E. coli 848-transformantene sortert for streptokinase-produksjon. E. coli 848-transformantene (pHTskc25) oppviste en klaringssone i kasein-over-dekningstesten (se eksempel X), hvilket tydet på produksjon av streptokinase ved disse celler, mens E. co 1 i-transformantene som inneholdt vektoren pTHBS3V, ikke oppviste klaringssoner i kasein-overdekningen. Det E. coli som bærer plasmidet pHTskc25, er blitt deponert i the Northern Regional Research Center hos De forente staters landbruksdepartement

i Peoria, Illinois for å sikre tilgjengelighet for offentligheten ved utstedelse av den foreliggende søknad som et patent. Denne stamme har laborator iebetegne 1 sen 848 (pHTskc25) og

er blitt gitt aksesjonsnr. NRRL B-18069.

Plasmid DNA fra E. coli 848 (pHTskc25) ble undersøkt ved restriksjonsendonuklease-digestioner med EcoRI, Pstl, Sali og Hindlll. Størrelsen av spaltede DNA-fragmenter bekreftet at pHTskc25 er det ønskede streptokinase-holdige konstruerte stykke med Aval I-fragmentet innbefattet de syntetiske linkere i den riktige orientering med hensyn til AOXl-promotoren.

EKSEMPEL VI

Ekspresjonen av streptokinase ved GTS115 (pHTskc25) ble undersøkt i 20 ml's ristekolber under dyrkingsbetinge 1 ser hvor streptokinase-genet var både undertrykket og de-undertrykket. GTS115 (pTHBS3V) ble innlemmet som en kontroll i disse undersøkelser. Når den dyrkes på glycerol eller glukose, er AOXl-promotoren undertrykket, mens under karbonbegrensning eller dyrking på metanol er alkoholoksidase-promotoren aktiv. Veksthastighetene for begge stammer var stort sett den samme for hver karbonkilde, hvilket indikerer at nærværet og ekspresjonen av streptokinase-genet ikke hadde noen påviselig skadelige eller inhiberende virkninger på cellevekst. Mengden av streptokinase som ble produsert ble bestemt ved BAEE-analysen (se eksempel X). Ikke noe streptokinase ble produsert ved dyrking på glycerol eller glukose, som ventet. Den metanol-dyrkede kultur gav betydelige nivåer av streptokinase som nådde 134 U/ml ved en O.D. på 8,9. Produksjon pr. celle synes å være konstant gjennom hele cellens vekst ved et nivå på ca. 16 U/O.D. celler.

EKSEMPEL VI I

Kont inuerli ge kulturunders øke1 ser

Produksjonen av streptokinase ble undersøkt i to kontinuerlige kulturforsøk. Hvert forsøk ble utført ved bruk av en 5 l's New Brunswick Scientific fermentor utstyrt med monitorer og styringsorganer for pH, oppløst oksygen (D.O.), agitator-hastighet, temperatur, luftstrøm og oksygenstrøm.

Hver kontinuerlige kultur ble holdt på pH 5,0 ved tilsetningen av NH-^gass inn i luftstrømmen. Temperaturen ble holdt på 30°C. Fermentormengden lå i området fra 2,4 til 1,8 1. Celle-utbyttet ble bestemt fra tørrvekt av vaskede celler.

Podestoff for fermentorfor søkene ble dyrket i 250 ml ' s Erlenmeyer-kolber inneholdende 100 ml IM-3-salter og 2% w/v glycerol som den eneste kilde til karbon og energi. Fermentor-kulturene ble dyrket satsvis med 2% w/v glycero1-IM-3-media inntil det tilgjengelige glycerol var utbrukt. Kontinuerlige kulturer ble opprettet ved bruk av 10% w/v glycero1—FM21— salter matet som næringskilden inntil 1 ikevektsti 1stand-betingelser ble oppnådd. Straks de grunnleggende kontroll-prøver var blitt tatt, ble næringsmidde1-matestrømmen byttet om fra glycerol til 15% v/v metano1/FM21-sa1 ter uten noen mellomliggende hungerperiode. Hver kontinuerlige kultur, uansett karbonkilde, ble drevet som en kjemostat hvor vekst-hastigheten av populasjonen var begrenset av tilgjengeligheten av karbonkiIden.

Det første fermentorforsøk ble utført i 15,5 h på begrenset metanol som den eneste kilde til karbon og energi. Fem prøver (A t.o.m. E) ble tatt fra ut 1øpsstrømmen fra kulturen under gjæringen for analyse.

Produksjonen av streptokinase når celleveksten i fermentoren ble opprettholdt på 19,4 g/l tørrvekt celler er vist i tabell 1 .

BAEE-analyser ble utført på celler lysert ved agitasjon i

2 min (ikke noe Triton X-100). Ved avslutningen av gjæringen etter 15,5 h på metanol forelå 6 420 U/ml (60,0 jjg/ml) streptokinase i kul turlysatet. Dette er ekvivalent med ca. 61 U/O.D. celler. I løpet av de siste 1,5 h med gjæring ble mengden av streptokinase pr. ml fordoblet, mens celle-tettheten forble konstant. Dette antyder at kulturen ikke var fullt indusert på dette punkt og at produksjonsnivåene ikke hadde nådd 1ikevektstilstand.

Plasmidstabi1itet ble bestemt på grunnlag av opprettholdelse av His<+->fenotypen. Celler fra prøver A t.o.m. E ble vasket med sterilt vann, fortynnet og platet på IM3-glukosep 1 ater , enten med eller uten histidin. Dessuten ble kolonier som vokste i nærvær av histidin, replikaplatet på His -plater. Mer enn 98% av koloniene var histidin-prototrofer som opprettholdt His4-genet og formodentlig streptokinase-genet også.

Det andre fermentorfor søk ble utført i 255 h på begrensende metanol som den eneste kilde til karbon og energi. Elleve prøver (A t.o.m. M) ble tatt fra tid til annen for analyse.

Under den andre gjæring av GTS115 (pHTskc25) ble kulturen bragt på 46 g/l tørrvekt og opprettholdt i 1 ikevektsti 1stand (konstant fortynningshastighet) i 10 dager. For BAEE-analyser på prøver A t.o.m. M ble cellene brutt opp ved to minutters agitasjon (ikke noe Triton X-100). Streptokinase-produksjonen i jjg/ml og U/ml-ekvivalenter i løpet av gjæringsperioden er oppsummert i tabell 2.

Streptokinase-utbyttet øket noe fra ca. 12 000 U/ml (112jjg/ml) til ca. 15 000 U/ml (140>>g/ml) som et resultat av den utvidede gjæringstid.

Undersøkelser ble deretter utført for å bestemme virkningen av lengre ag i tas jonstid og innlemmelsen av Triton X-100 i lysisemediet på streptokinase-utbyttet. Resultatene er angitt i tabe11 3. Utbyttet ble nesten fordoblet til ca. 29 300 U/ml (274Jjg/ml) når cellene ble brutt opp i nærvær av 0,005% Triton X-100 eller agitasjonen ble øket til tre minutter. Ytterligere økninger i ce11eagi tasjonstid og Tr iton-konsentrasjon redu-serte i virkeligheten streptokinase-utbyttet.

Plasmid-stabi1 i tet ble bestemt som tidligere beskrevet for prøve M. Mer enn 98% av cellene fra prøve M var histidin-prototrofer, hvilket indikerer en høy stab i 1 itetsgrad over den lange gjæring.

EKSEMPEL VIII

Lyse av Pichia-ce11er for streptokinase-analyser

Pichia-ce1 ler ble brutt opp ved agitasjon i nærvær av glassperler ved bruk av en Minibead-visp (Biospec Products, Bartlesvi1 le, Oklahoma). Pichia-celler ble vasket i sterilt vann og resuspendert i et like stort volum sterilt 0,2 M Tris-HCl, 0,1% BSA. Rør (1,5 ml) ble halvveis fylt med vaskede 0,5 mm diameter glassperler og 1,0 ml celler ble tilsatt. Rørene ble agitert i 2-4 min, og i noen tilfeller ble Triton X-100 (0,005, 0,01 eller 0,02%) tilsatt i oppbrytningsbuf-f eren.

EKSEMPEL IX

Karakterisering av det streptokinase-protein som produseres

i Pichia-gjær

Proteiner fra GTS115 (pHTskc25) fermentorforsøk prøver A og

M ble separert ved polyakrylamid-gelelektroforese. GTS115 (pTHBS3V) proteiner og autentisk streptokinase ble innlemmet som kontrollprøver. Resultatene er oppsummert som følger.

Fra ukonsentrert prøve M-lysat var der et nytt 47 kD protein-bånd som ikke ble observert i lysatet fra kontrol1-Pichia-kulturen, GTS115 (pTHBS3V), hvilket protein er av den riktige størrelse til å være streptokinase.

Proteiner separert ved polyakrylamid-gele lektroforese ble analysert for reaksjon med streptokinase-antistoff ved Western blot-analyse. Som observert ved radioaktiv avbildning er et enkelt radioaktivt bånd svarende til et 47 kD-protein synlig i GTS115 (pHTskc25) proteinbanen. Der er ingen reaksjon av antistoff med GTS115 (pTHBS3V)-proteiner. Pichia streptokinase ble gjenkjent ved antistoff fremstilt mot S. equisimilis streptokinase, hvilket antyder at de proteiner som fremstilles i disse forskjellige vertsorganismer, er antigenisk like. Dessuten er der ingen kryssreaksjon til andre Pichia-proteiner med antistoffet og ikke noe bevis for degraderte former av streptokinase.

EKSEMPEL X

A. Kasein-over1egg for påvisni ng av streptokinase

Den kaseinolyti ske aktivitet av plasmin fremstilt ved akti-vering av plasminogen ved streptokinase gjorde det mulig å teste enke 1tko1onier av E. coli for streptokinase-produksjon (6). Celler dyrket på kulturplater ble overdekket med ca. 10 mm 1,0% agarose i 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,02 g/ml tørrmelk og 0,05 U/ml menneskelig plasminogen. Platene ble inkubert ved 37°C og klaringssoner som resulterte fra kaseinlysen ble tydelige etter minst 2 h inkubasjon for s tr eptokinase-produser ende koloni e r.

For å vise at ikke noen annen protease digesterte kaseinet ble kaseinoverlegg av E. coli 848 (pHTskc25) utført uten plasminogen i overlegget. En aktiv protease vil gi klaringssoner i begge tilfeller, mens streptokinase kan forårsake kaseindi gestion bare i nærvær av plasminogen. Der ble ikke observert noen nedbrytning av kasein i fravær av plasminogen, hvilket bekrefter at de observerte klaringssoner var et resultat av virkningen av streptokinase på plasminogen.

B. Benzoyl-L-a rginin- etylester ( BAEE)

Analyse fo r streptokinase

En analyse for påvisning av nanogram-mengder av streptokinase ble utviklet, som innbefattet inkubasjon av prøvene som skulle analyseres for streptokinase-aktivitet med en på forhånd fastlagt mengde menneskelig plasminogen og deretter inkubasjon i 15 min ved værelsestemperatur. I løpet av denne inkubasjonsperiode assosierer streptokinase med plasminogen og aktiverer det til enzymet plasmin. En gitt mengde BAEE-substrat ble deretter tilsatt, hvilket hydrolyseres av plasmin og resulterer i en proporsjonal økning i absorbans ved 253 nm. Et dobbe1tstrå1e-spektrofotometer med et registrer-ingsapparat (Perkin-Elmer modell 559A) ble brukt til å plotte økningen i absorbans i forhold til blindprøven (prøve minus streptokinase). Forandringen i optisk tetthet pr. min i forhold til nanogram streptokinase (over et område på 0-

260 nanogram) ble plottet ved bruk av standard streptokinase. Plottingen var lineær over dette område. Ukjente prøver ble fortynnet etter behov for å gi OD/min-verdier som falt innenfor dette lineære område på standardkurven.

C. SDS-polyakrylamid-ge1elektroforese

Pichia-celler ble brutt opp som beskrevet ovenfor. Celle-lysater ble holdt på is inntil de ble klargjort for lasting. Separasjonsgeler (10% akrylamid) med stakke-geler (6% akrylamid) ble brukt til separasjon av proteiner i henhold til standard fremgangsmåter. Geler ble farget med Coomassie Brilliant Blue for synliggjøring av proteinbåndene.

D. Western Blots for påvisni ngen og kvantifiseringen

av s treptokinase- protein

Proteinekstrakter ble underkastet elektroforese som beskrevet tidligere og overført til nitroce1lulose ved bruk av et transb1ot-apparat (BioRad Laboratories) i henhold til firmaets spesifikasjoner. Western Blot-fremgangsmåten ble utført som følger: Blottet ble dynket i 2 h i blokkerende buffer (20%

agamma-kalveserum i buffer A, som består av 0,15 M NaCl,

50 mM Tris, pH 7,6). St reptokinase-antistoff ble fortynnet i 25 ml inkubasjonsbuffer (5% agamma-kalveserum i buffer A), plassert i en ubrukt forseglbar pose med nitrocellulose-blottet og inkubert ved 25°C i 2 h med forsiktig risting. Blottet ble deretter vasket i buffer A, to ganger i buffer

A med 0,05% Triton X-100 og atter en gang i buffer A, hver gang i 10 min ved bruk av 200 ml. Blottet ble plassert i en ny pose til hvilken 20 ml inkubasjonsbuffer med 20<p>Ci av 125 I-protein A var tilsatt. Den forseglede pose ble vugget i 1,5 h ved værelsetemperatur med flere snuinger av posen for å sikre jevn dekning, fulgt av vasking som beskrevet tidligere. Blottet ble tørket, pakket inn i saran-innpakning og eksponert på Kodak XAR-5-film med to forsterkningsskjermer ved -80 °C i minst 2 h. Deteksjonsgrensen var ca. 10 nanogram streptokinase-protein.

E. Spesifikk aktivitet for st reptokinase- protein

Den faktiske spesifikke aktivitet av streptokinase er en dårlig definert verdi, som delvis skyldes vanskeligheten med å standardisere et passende substrat for enzymaktivitet. Flere forskjellige måter er brukt for å definere aktivitets-enheten. Søkerne har valgt å bruke den høyeste spesifikke aktivitetsverdi som er angitt i litteraturen, hvilket er ca. 107 000 U/mg protein (Mol. Gen. Genet. 196, 360, 1984).

Eksemplene er gitt bare for å belyse utførelsen av oppfinnelsen og skal ikke anses å begrense omfanget av oppfinnelsen eller de tilhørende krav på noen som helst måte. Rimelige variasjoner og modifikasjoner som ikke avviker fra oppfin-nelsens kjerne og ånd, anses å ligge innenfor det område for patentbeskyttelse som ønskes og søkes.

Claims

1. DNA-fragment omfattende: (a) et gjær-reguleringsområde som kan styre transkripsjonen av messenger-RNA i gjær når det er anordnet ved 5'-enden av et polypeptidkodende område, og (b) et polypeptidkodende område hvor det nevnte kodende område koder for streptokinase eller partier derav, og hvor det nevnte område som koder for streptokinase er fritt for bakterielle signalsekvenser.

2. DNA-fragment som angitt i krav 1, karakterisert ved at det nevnte gjær-reguleringsområde er valgt f ra Pichia AOXl-reguleringsområdet, Pichia DAS 1-reguleringsområdet, Pichia glyce raldehyd-3-f osf at-dehydrogenase-reguler ings området , Saccharomyces syrefosf atase-reguler ingsområdet, Saccharomyces alfaparingsfaktor-reguleringsområdet, Saccharomyces glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase- reguleringsområdet, og Pichia p40-reguleringsområdet.

3. DNA-fragment som angitt i krav 1, karakterisert ved at det nevnte område som koder for streptokinase er tilnærmet 1250 basepar langt og er kjennetegnet som vist ved Ava I I-fragmentet inneholdende nukleotider 907 til 2274 i det restriksjonskart som er vist på fig. 6; særlig hvor det nevnte område som koder for streptokinase har nukleo-t idsekvensen:

særlig hvor det nevnte gjær-kromosomale DNA omfatter en autonomt replikerende DNA-sekvens og et markørgen.

4. DNA-fragment som angitt i krav 1, karakterisert ved at det ytterligere omfatter en 3'-sekvens av DNA på nedsiden av det polypeptidkodende område, idet 3'-sekvensen av DNA kan styre polyadenyleringen og avslutningen av transkripsjonen av messenger-RNA kodet for ved det nevnte polypeptidkodende område.

5. DNA-fragment som angitt i et av kravene 1-4, karakterisert ved at det nevnte DNA-f ragment videre omfatter én eller flere ytterligere DNA-sekvenser som fås fra bakterielt plasmid DNA bakteriofag DNA gjær-plasmid DNA, og gjær-kromosomalt DNA, særlig hvor det nevnte gjær-kromosomale DNA omfatter en autonomt replikerende DNA-sekvens og et markørgen.

6. DNA-fragment som angitt i krav 1, ytterligere omfattende i serie anordnet DNA som omfatter: et første innsettbart DNA-fragment, et selekterbart markørgen, og et andre innsettbart DNA-fragment; idet de første og andre innsettbare DNA-fragmenter er hver minst 200 nukleotider lange og har nukleotidsekvenser som er homologe med partier av det genomiske DNA av arter av slekten Pichia, idet det nevnte DNA-fragment, det nevnte markørgen og det nevnte DNA-fragment ifølge krav 1 er anordnet mellom 3'-enden og det nevnte første innsettbare DNA-fragment og 5'-enden av det nevnte andre innsettbare DNA-fragment, og hvor de første og andre innsettbare DNA-fragmenter er orientert i forhold til hverandre slik de er orientert i genomet i Pichia.

7. Plasmid som omfatter: DNA-fragmentet som angitt i krav 1, bakterielt plasmid DNA, et selekterbart gjær-markørgen, og en gjær autonom replikasjonssekvens, særlig hvor det nevnte plasmid er plasmidet pHTskc25.

8. Stort sett ren kultur av en stamme av slekten Pichia transformert med DNA-fragmentet som angitt i et av de fore-gående krav eller transformert med plasmidet pHTskc25.

9. Fremgangsmåte til fremstilling av streptokinase, karakterisert ved dyrking av en gjærstamme transformert med plasmidet som angitt i krav 7 under betingelser hvor reguleringsområdet induserer ekspresjon av det polypeptidkodende område som koder for streptokinase og, valgfritt, isolering og rensing av det nevnte strepto-k inase.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av konstruerte materialer av reguleringsområde/streptokinasekodende område som er nyttige til ekspresjon av streptokinase i gjær, karakterisert ved (a) fjerning av signalpeptidene fra det streptokinasekodende område som fås fra S.equisimi 1 is for fremstilling av en avkortet streptokinasekodende sekvens, (b) ligatisering av den avkortede streptokinasekodende sekvens med en syntetisk 1inkersekvens som inneholder et ATG-kodon og som gjenoppretter den fullstendige streptokinasekodende sekvens, og (c) ligatisering av det streptokinasekodende område fremstilt i henhold til trinn (b) med et gjær-reguleringsområde; særlig hvor de nevnte signalpeptider er fjernet fra det streptokinasekodende område som fås fra S. equisimilis ved digestering med Avall, særlig hvor ATG-start-setet for det streptokinasekodende område skaffes ved en syntetisk polylinker som har nukleotidsekvensen:

særlig hvor det nevnte gjær-reguleringsområde velges fra gruppen som angitt i krav 2.