JP3711564B2 - 種子用発現プラスミド - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、種子用発現プラスミドに関する。
さらに詳細には、ダイズ種子貯蔵タンパク質グリシニン遺伝子（以下、ＧＹと略する。）プロモーターおよびＧＹターミネーターから構築された発現プラスミドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くの植物種において、種子での外来遺伝子の発現目的として、種子貯蔵タンパク質遺伝子プロモーターを用いた発現プラスミドの開発が進められている。
グリシニンはダイズの全種子タンパク質の20% 以上を占める主要な貯蔵タンパク質の１つであり、主に５種類のものが存在する。その遺伝子は各々ＧＹ１，ＧＹ２，ＧＹ３，ＧＹ３，ＧＹ４，ＧＹ５と命名されており、その性質についてはThe Plant Cell ,Vol.1,p313-328(1989)に記載されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、現状では、種子における外来遺伝子の発現量は充分ではなく、より高い発現量を示すための種子用発現プラスミド、プロモーターおよびターミネーターが必要であった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の状況を鑑み、より優れた種子用発現プラスミドを見出すべく鋭意検討を重ねた結果、ある種の種子貯蔵タンパク質遺伝子から得られるプロモーターおよびターミネーターから構築される発現プラスミドが従来のものと比べて高い発現量を示すことを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明はＧＹプロモーターおよびＧＹターミネーターを含有する発現プラスミドを提供するものである。
さらに、本発明者らは、プロモーターの下流に複数個のクローニングサイトを保持した種子用発現プラスミドの構築にも成功し、あらゆる外来遺伝子を容易に挿入することを可能にした。
【０００５】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
発現プラスミドには、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写を開始させるためのプロモーター配列が含まれる。
本発明の発現プラスミドは、プロモーターとしてＧＹプロモーターを含む。
ＧＹプロモーターとしては、例えばNucleic Acids Research,Vol.17,4386(1989)等に記載される式化４の塩基配列( 配列番号３) で表される６９０塩基対からなる公知な遺伝子
【化４】
配列番号３
または式化５の塩基配列( 配列番号１) で表される１１１６塩基対からなる新規な遺伝子
【化５】
配列番号１
等をあげることができる。
【０００６】
また、発現プラスミドには、３’末端に転写を終止させるためのターミネーター配列が含まれる。一般に有用な遺伝子の発現にはターミネーターよりもプロモーターの方が重要な働きをする。このため、植物に外来遺伝子を導入する場合、ターミネーターとしては、外来遺伝子またはプロモーターと同じ起源である遺伝子あるいは同じ分類上の起源（例えば、植物、動物、細菌、酵母、糸状菌、ウイルス等）である遺伝子に関係なく、通常、公知なターミネーター、たとえば、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）等が用いられる。
本発明の発現プラスミドは、ターミネーターとしてプロモーターと同じ起源である遺伝子、すなわち、ＧＹのターミネーターを含む。
ＧＹのターミネーターとしては、たとえば、式化６の塩基配列（配列番号２）により表される７４４塩基対からなる新規な遺伝子
【化６】
配列番号２
等をあげることができる。なお、該ターミネーターは、植物の種子内での発現において特に有用なものである。
【０００７】
さらに、本発明の発現プラスミドは、あらゆる外来遺伝子を容易に挿入するためにプロモーターの下流に１つ以上のクローニングサイトを保持させることができる。好ましくは、複数個のクローニングサイトである。ここでクローニングサイトとは、通常の遺伝子操作で用いられる制限酵素によって認識切断可能な部位のことである。たとえば、式化７の塩基配列（配列番号４）で表される遺伝子
【化７】
配列番号４
がクローニングサイトの配列としてあげられる（図２参照）。
【０００８】
このようなクローニングサイトを保持した発現プラスミドとして式化８で表されるプラスミドpSUM-GY1
【化８】
をあげることができる（図１参照）。
【０００９】
本発明の発現プラスミドにより、植物に導入する有用な遺伝子としては、例えば、ダイズのグリシニン遺伝子、βーコングリシニン遺伝子等の種子で発現させることにより種子における蛋白含量を改良させることができる（植物）貯蔵蛋白質遺伝子、ブラジルナッツの２Ｓ−アルブミン遺伝子、トウモロコシの１０ｋＤａまたは１５ｋＤａ蛋白質遺伝子、イネの１０ｋＤａ蛋白質遺伝子、ヒマワリの１０ｋＤａ蛋白質遺伝子等の種子で発現させることにより高メチオニン含量あるいは高リジン含量の種子に改良させることができる（植物）蛋白質遺伝子、大腸菌をはじめとする微生物のｂｉｏＡ、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＤ、ｂｉｏＦ、ｂｉｏＨ、酵素、転写制御因子ｂｉｒＡまたは植物の該ホモログ酵素等の種子で発現させることにより、高ビオチン含量の種子に改良させることができるビオチン生合成関連酵素遺伝子、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（Stearoyl-ACP desaurase) 、アシル-ACPチオエステラーゼ(acyl-ACP thioesterase) 、3-ホスフェイトアシルトランスフェラーゼ(3-phosphate acyl transferase)等の種子で発現させることにより種子における脂質の酸化安定性の増大、リン脂質の減少またはオレイン酸もしくはリノレン酸の増大等による種子脂質の改良を可能にする関連酵素遺伝子等をあげることができる。
【００１０】
上記のような有用な外来遺伝子を発現する本発明の発現プラスミドは、例えば、カナマイシンまたはハイグロマイシン等の薬剤耐性遺伝子等の選択マーカーを付加し、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと略する。）の存在下でプラスミドＤＮＡをプロトプラストに取り込ませるＰＥＧ法、電気パルスを与えてプラスミドＤＮＡをプロトプラストに取り込ませるエレクトロポーレーション法、微小針によりプラスミドＤＮＡを植物細胞に注入するマイクロインジェクション法等の通常の直接導入法を用いて、または、本発明の発現プラスミドをアグロバクテリウムのTiプラスミドもしくはRiプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域に一度組み込ませてから、植物ゲノムＤＮＡ中に導入する方法を用いて、ダイズ、タバコ、アラビドプシス、イネ、トウモロコシ、コムギ、ナタネ、アルファルファ等の双子葉および単子葉植物細胞に導入する。
【００１１】
本発明の発現プラスミドの植物細胞への導入量としては、例えば、パーティクルガン法では、例えば圧縮空気圧式銃パーティクルガン装置（レーボック商工社）を用いて、細胞あたり約１〜約１０ｎｇ、ＰＥＧ法では細胞当たり約１０〜約１００ｐｇ、エレクトロポーレーション法では、約０．５〜約１ＫＶ／ｃｍの電気パルスを与えて細胞当たり約１０〜約１００ｐｇ、マイクロインジェクション法では、細胞当たり約１ｐｇ程度が好ましい。
【００１２】
このようにして本発明の発現プラスミドを導入した植物細胞を、該発現プラスミドの選択マーカーである薬剤およびオーキシン等の植物ホルモンを含む培地で約１〜２ヵ月間培養し、さらに固体再生用の培地で約２〜３ヵ月培養し、植物体に再生する。
このときの培地として、例えば、ＭＳ培地、Ｗｈｉｔｅ培地、Ｂ５培地、Ｎ６培地、ＮＮ培地等の通常の植物培養に用いる公知の培地を用いることが可能である。
前述のように、本発明の発現プラスミドにより、外来遺伝子を導入・発現させた形質転換植物の育成により種子内において有用成分の含量を向上、あるいはその組成の改良、植物種子の形質の改良、あるいは植物種子における有用物質の生産等が可能となる。
【００１３】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は本実施例にのみ限定されないことは言うまでもない。
実施例１ 発現プラスミドpSUM-GY1の構築
ＧＹ１より単離したプロモーター領域、ターミネーター領域を、プラスミドpUC19 のクローニングサイトの両側に接続した発現プラスミドpSUM-GY1を以下のように構築した。
まずNucleic Acids Research,Vol. 17 No.11,p4386 (1989)に記載されるＧＹ１の塩基配列をもとに約700bp のプロモーター領域の遺伝子断片をＰＣＲ法を用いて増幅・単離した。この遺伝子断片をプローブとしてダイズゲノミックライブラリー（CLONTECH社）をスクリーニングし、完全なＧＹ１を含むと考えられる約4.4kb の遺伝子断片GY1-#4をサブクローン化し、プラスミドpGY1-#4 と命名した。次にプラスミドpGY1-#4 よりプロモーター領域、ターミネーター領域を単離し、プラスミドpUC19 のクローニングサイトの両側に接続して発現プラスミドpSUM-GY1を構築した（図３から図５参照）。
【００１４】
以下に、３つのステップに分け、その構築方法を述べる。
ステップ１：ＧＹ１ターミネーターを含むプラスミドpSUM-GY1-Bの構築
1 μg のプラスミドpGY1-#4 に10ユニットの制限酵素HindIII およびSphIを加えた反応液を37℃１時間反応させた。次に反応液を0.1 μg/mlの臭化エチジウムを含む0.8%アガロースゲルに供し、電気泳動を行った。泳動後、紫外線照射下で、1.2kb のHindIII ーSphIDNA 断片に相当するゲル部分を切り出し、DNA 回収用フィルター付き遠心チューブ（宝酒造）を用いてDNA 断片を精製した。一方、1 μg のプラスミドpUC19 に10ユニットの制限酵素HindIII およびSphIを加えた反応液を37℃で１時間反応させた。プラスミドpUC19 のHindIII ーSphIDNA 断片およびプラスミドpGY1-#4 の1.2kb のHindIII ーSphIDNA 断片をそれぞれ0.2 μg ずつ混合し、5 ユニットのT4DNA リガーゼを加えた反応液を16℃で２時間反応させ、ライゲーションを行った。その後、Cohen らの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 69,p2110-2114 ）に従い、反応液で大腸菌HB101 株（宝酒造）を形質転換し、100 μg/mlのアンピシリンを含むLBプレートに形質転換体を広げ、耐性コロニーを単離した。次に、Birnboimらの方法（Nucl.Acids.Res. 7 p1513-1523 ）に従い、コロニーよりプラスミドを調製し、1 μg のプラスミドに対し5 ユニットの制限酵素NheIを加えた反応液を37℃で１時間反応させた。アガロースゲル電気泳動し、制限酵素NheIで１カ所切断を受けたプラスミドを選択し、プラスミドpSUM-GY1-Aと命名した。1 μg のプラスミドpSUM-GY1-Aに10ユニットの制限酵素SphIおよびNheIを加えた反応液を37℃で１時間反応させた。DNA をエタノール沈澱により精製後、約0.1 μg の該DNA についてT4DNA ポリメラーゼを用いて末端を平滑化し、T4リガーゼを用いてライゲーションを行った（DNA Blunting Kit (宝酒造) を使用）。Cohen らの方法に従い、反応液で大腸菌HB101 株を形質転換してアンピシリン耐性コロニーを単離し、Birnboimらの方法に従い、コロニーよりプラスミドを調製した。1 μg のプラスミドDNA に対し5 ユニットの制限酵素SphIあるいはNheIを加えた反応液を37℃で１時間反応させた。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素NheIで１カ所切断を受け、かつ制限酵素SphIにより切断を受けないプラスミドを選択し、プラスミドpSUM-GY1-Bと命名した。プラスミドpSUM-GY1-BはプラスミドpUC19 由来のクローニングサイトおよび約0.7kb のＧＹ１ターミネーターを有していた（図３参照）。
【００１５】
ステップ２：ＧＹ１プロモーターを含むDNA 断片の調製
1 μg のプラスミドpGY1-#4 に10ユニットの制限酵素NcoIおよびSmaIを加えた反応液を37℃で１時間反応させた。DNA をエタノール沈澱により精製後、約0.1 μg の該DNA についてT4DNA ポリメラーゼを用いて末端を平滑化し、T4リガーゼを用いてライゲーションを行った。Cohen らの方法に従い、反応液で大腸菌HB101 株を形質転換してアンピシリン耐性コロニーを単離し、Birnboimらの方法に従い、コロニーよりプラスミドを調製した。1 μg のプラスミドに対し5 ユニットの制限酵素NcoIあるいはSmaIを加えた反応液を37℃で１時間反応させた。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素NcoIで１カ所切断を受け、かつ制限酵素SmaIにより切断を受けないプラスミドを選択し、プラスミドpSUM-GY1-Cと命名した。さらに1 μg のプラスミドpGpSUM-GY1-Cに10ユニットの制限酵素EcoRI およびKpnIを加えた反応液を37℃で１時間反応させ、反応液を電気泳動後、1.1kb のEcoRI ーKpnIDNA 断片に相当するゲル部分を切り出し、DNA 回収用フィルター付き遠心チューブ（宝酒造）を用いてDNA 断片を精製した（図４参照）。
【００１６】
ステップ３：プラスミドpSUM-GY1の構築
ステップ１で得られたプラスミドpSUM-GY1-Bに10ユニットの制限酵素EcoRI およびKpnIを加えた反応液を37℃で１時間反応させた。プラスミドpSUM-GY1-BのEcoRI ーKpnIDNA 断片およびＧＹ１プロモーターを含む約1.1kb のEcoRI ーKpnIDNA 断片をそれぞれ0.2 μg ずつ混合し、5 ユニットのT4DNA リガーゼを加えた反応液を16℃２時間反応させ、ライゲーションを行った。Cohen らの方法に従い、反応液で大腸菌HB101 株を形質転換してアンピシリン耐性コロニーを単離し、Birnboimらの方法に従い、コロニーよりプラスミドを調製した。1 μg のプラスミドに対し5 ユニットの制限酵素EcoRI およびHindIII を加えた反応液を37℃で１時間反応させた。アガロースゲル電気泳動により、約1.8kb および約2.7kb の２つのDNA断片が検出されるプラスミドを選択し、プラスミドpSUM-GY1と命名した（図５参照）。
構築した発現プラスミドpSUM-GY1は、Escherichia coli HB101/pSUM-GY1 として平成4 年3 月26日に書留引受番号161 38 785294 で工業技術院微生物工業技術研究所、特許微生物寄託センターに送付された。現在、ブダペスト条約に従って微工研条寄第4131号として同所に寄託・保管されている。
【００１７】
実施例２ 構築した発現プラスミドpSUM-GY1のプロモーター／ターミネーター活性の測定
構築した発現プラスミドpSUM-GY1のクローニングサイトにレポーター遺伝子であるＧＵＳ遺伝子を挿入し、ダイズ未熟種子における発現を調べ、ＧＹ１プロモーター／ターミネーター活性を確認した。以下にその詳細な方法を述べる。
プラスミドpSUM-GY1のマルチクローニングサイト内のNcoIとNheIの間にプラスミドpRAJ225 （CLONTECH社）由来の1.87kbのＧＵＳ遺伝子断片を挿入し、ＧＵＳ発現プラスミドpSUM-GY1-001を構築した。
プラスミドpSUM-GY1-001を、対照としてのカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35S プロモーター下流にホタルのルシフェラーゼ(LUC) 遺伝子を接続した内部標準プラスミドpDO432（Science , 234 ,856-859 ,1986）と共に、パーティクルガン法（植物細胞工学， 2，631-637 ，1990）により開花１〜２カ月後のダイズ未熟種子に導入した。また、プラスミドpSUM-GY1-001のＧＹ１ターミネーターをノパリン合成酵素遺伝子(NOS) ターミネーターに置き換えたＧＵＳ発現プラスミドpGY1100 を上述と同様に導入した。プラスミドを導入して２４〜４８時間後に、Morikawaらの方法（Appl. Microbiol. Biotechnol. 31, p320-322 ,1989 ）に従いＧＵＳ／ＬＵＣ活性を測定した。結果を表１に示す。
【００１８】
【表１】
【００１９】
プラスミドpSUM-GY1-001を導入した場合、プラスミドpGY1100 を導入した場合の約３倍のＧＵＳ／ＬＵＣ活性が認められた。以上のことから、ＧＹ１プロモーター／ターミネーターが未熟種子組織内で活性を持つこと、また組織において新規なＧＹ１ターミネーターは、従来植物で広く用いられている公知のNOS ターミネーターよりも高い発現量を与えることが確認された。
【００２０】
【発明の効果】
本発明の発現プラスミドは、種子においての植物遺伝子発現の解明に役立ち、有用植物遺伝子の導入、発現による植物育種および有用物質生産といった産業技術の発展を可能とする。
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１１１６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の特徴
特徴を表す記号：promoter
存在位置：１．．１１１６
特徴を決定した方法：Ｅ
配列
GAATTCTCTC TTATAAAACA CAAACACAAT TTTTAGATTT TATTTAAATA ATCATCAATC 60
GATTATAATT ATTTATATAT TTTTCTATTT TCAAAGAAGT AAATCATGAG CTTTTCCAAC 120
TCAACATCTA TTTTTTTTCT CTCAACCTTT TTCACATCTT AAGTAGTCTC ACCCTTTATA 180
TATATAACTT ATTTCTTACC TTTTACATTA TGTAACTTTT ATCACCAAAA CCAACAACTT 240
TAAAATTTTA TTAAATAGAC TCCACAAGTA ACTTGACACT CTTACATTCA TCGACATTAA 300
CTTTTATCTG TTTTATAAAT ATTATTGTGA TATAATTTAA TCAAAATAAC CACAAACTTT 360
CATAAAAGGT TCTTATTAAG CATGGCATTT AATAAGCAAA AACAACTCAA TCACTTTCAT 420
ATAGGAGGTA GCCTAAGTAC GTACTCAAAA TGCCAACAAA TAAAAAAAAA GTTGCTTTAA 480
TAATGCCAAA ACAAATTAAT AAAACACTTA CAACACCGGA TTTTTTTTAA TTAAAATGTG 540
CCATTTAGGA TAAATAGTTA ATATTTTTAA TAATTATTTA AAAAGCCGTA TCTACTAAAA 600
TGATTTTTAT TTGGTTGAAA ATATTAATAT GTTTAAATCA ACACAATCTA TCAAAATTAA 660
ACTAAAAAAA AAATAAGTGT ACGTGGTTAA CATTAGTACA GTAATATAAG AGGAAAATGA 720
GAAATTAAGA AATTGAAAGC GAGTCTAATT TTTAAATTAT GAACCTGCAT ATATAAAAGG 780
AAAGAAAGAA TCCAGGAAGA AAAGAAATGA AACCATGCAT GGTCCCCTCG TCATCACGAG 840
TTTCTGCCAT TTGCAATAGA AACACTGAAA CACCTTTCTC TTTGTCACTT AATTGAGATG 900
CCGAAGCCAC CTCACACCAT GAACTTCATG AGGTGTAGCA CCCAAGGCTT CCATAGCCAT 960
GCATACTGAA GAATGTCTCA AGCTCAGCAC CCTACTTCTG TGACGTGTCC CTCATTCACC 1020
TTCCTCTCTT CCCTATAAAT AACCACGCCT CAGGTTCTCC GCTTCACAAC TCAAACATTC 1080
TCTCCATTGG TCCTTAAACA CTCATCAGTC ATCACC 1116
配列番号：２
配列の長さ：７４４
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の特徴
特徴を表す記号：terminator
存在位置：１．．７４４
特徴を決定した方法：Ｅ
配列
CTAGCAACCA ATAAATAATA ATAATAATAA TGAATAAGAA AACAAAGGCT TTAGCTTGCC 60
TTTTGTTCAC TGTAAAATAA TAATGTAAGT ACTCTCTATA ATGAGTCACG AAACTTTTGC 120
GGGAATAAAA GGAGAAATTC CAATGAGTTT TCTGTCAAAT CTTCTTTTGT CTCTCTCTCT 180
CTCTCTTTTT TTTTTCTTTC TTCTGAGCTT CTTGCAAAAC AAAAGGCAAA CAATAACGAT 240
TGGTCCAATG ATAGTTAGCT TGATCGATGA TATCTTTAGG AAGTGTTGGC AGGACAGGAC 300
ATGATGTAGA AGACTAAAAT TGAAAGTATT GCAGACCCAA TAGTTGAAGA TTAACTTTAA 360
GAATGAAGAC GTCTTATCAG GTTCTTCATG ACTTGGAGCT CAACCCAACT TGGAAAGTTC 420
GAGAGTATTT GGACCATTGT GCTTTGTGTC TTCAAACATA AAACATCGCT CCAAATTTAA 480
CATGGGAGCT AAAAAATGTG TTTTTCTGGG ATTTTAATTT TCAACAGAGT CAAGGATGGT 540
GTTGCATATG ATGTCTTGAT GTCCATTGTC CACACTAAAT AGATATTGGT TTCAAGAAAT 600
ATTAATTTCA TTTTCATGAC TTTCAATTCA TAAACCTTAA ACGAATATTA ATTTAAAATC 660
TATCCTCAAA TGATAAATTT TAAAAAAAAT TACCCCCAAT CGGTAATTTG ACTCACAAGT 720
TAGTTAGTTG ATATTTTGAA GCTT 744
配列番号：３
配列の長さ：６９０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の特徴
特徴を表す記号：promoter
存在位置：１．．６９０
特徴を決定した方法：Ｅ
配列
TAGCCTAAGT ACGTACTCAA AATGCCAACA AATAAAAAAA AAGTTGCTTT AATAATGCCA 60
AAACAAATTA ATAAAACACT TACAACACCG GATTTTTTTT AATTAAAATG TGCCATTTAG 120
GATAAATAGT TAATATTTTT AATAATTATT TAAAAAGCCG TATCTACTAA AATGATTTTT 180
ATTTGGTTGA AAATATTAAT ATGTTTAAAT CAACACAATC TATCAAAATT AAACTAAAAA 240
AAAAATAAGT GTACGTGGTT AACATTAGTA CAGTAATATA AGAGGAAAAT GAGAAATTAA 300
GAAATTGAAA GCGAGTCTAA TTTTTAAATT ATGAACCTGC ATATATAAAA GGAAAGAAAG 360
AATCCAGGAA GAAAAGAAAT GAAACCATGC ATGGTCCCCT CGTCATCACG AGTTTCTGCC 420
ATTTGCAATA GAAACACTGA AACACCTTTC TCTTTGTCAC TTAATTGAGA TGCCGAAGCC 480
ACCTCACACC ATGAACTTCA TGAGGTGTAG CACCCAAGGC TTCCATAGCC ATGCATACTG 540
AAGAATGTCT CAAGCTCAGC ACCCTACTTC TGTGACGTTG TCCCTCATTC ACCTTCCTCT 600
CTTCCCTATA AATAACCACG CCTCAGGTTC TCCGCTTCAC AACTCAAACA TTCTCCTCCA 660
TTGGTCCTTA AACACTCATC AGTCATCACC 690
配列番号：４
配列の長さ：３５
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
CCATGGGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CTAGC 35
【図面の簡単な説明】
【図１】発現プラスミドpSUM-GY1の制限酵素地図を示す。斜線部分はダイズ種子貯蔵タンパク質グリシニン遺伝子プロモーター、鉛直線部分はダイズ種子貯蔵タンパク質グリシニン遺伝子ターミネーターを示す。
【図２】プラスミドpSUM-GY1に含まれるマルチクローニングサイトの塩基配列を示す。
【図３】プラスミドpSUM-GY1構築のステップ１を示す。
【図４】プラスミドpSUM-GY1構築のステップ２を示す。
【図５】プラスミドpSUM-GY1構築のステップ３を示す。
【産業上の利用分野】
本発明は、種子用発現プラスミドに関する。
さらに詳細には、ダイズ種子貯蔵タンパク質グリシニン遺伝子（以下、ＧＹと略する。）プロモーターおよびＧＹターミネーターから構築された発現プラスミドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
多くの植物種において、種子での外来遺伝子の発現目的として、種子貯蔵タンパク質遺伝子プロモーターを用いた発現プラスミドの開発が進められている。
グリシニンはダイズの全種子タンパク質の20% 以上を占める主要な貯蔵タンパク質の１つであり、主に５種類のものが存在する。その遺伝子は各々ＧＹ１，ＧＹ２，ＧＹ３，ＧＹ３，ＧＹ４，ＧＹ５と命名されており、その性質についてはThe Plant Cell ,Vol.1,p313-328(1989)に記載されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、現状では、種子における外来遺伝子の発現量は充分ではなく、より高い発現量を示すための種子用発現プラスミド、プロモーターおよびターミネーターが必要であった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の状況を鑑み、より優れた種子用発現プラスミドを見出すべく鋭意検討を重ねた結果、ある種の種子貯蔵タンパク質遺伝子から得られるプロモーターおよびターミネーターから構築される発現プラスミドが従来のものと比べて高い発現量を示すことを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明はＧＹプロモーターおよびＧＹターミネーターを含有する発現プラスミドを提供するものである。
さらに、本発明者らは、プロモーターの下流に複数個のクローニングサイトを保持した種子用発現プラスミドの構築にも成功し、あらゆる外来遺伝子を容易に挿入することを可能にした。
【０００５】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
発現プラスミドには、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写を開始させるためのプロモーター配列が含まれる。
本発明の発現プラスミドは、プロモーターとしてＧＹプロモーターを含む。
ＧＹプロモーターとしては、例えばNucleic Acids Research,Vol.17,4386(1989)等に記載される式化４の塩基配列( 配列番号３) で表される６９０塩基対からなる公知な遺伝子
【化４】
配列番号３
または式化５の塩基配列( 配列番号１) で表される１１１６塩基対からなる新規な遺伝子
【化５】
配列番号１
等をあげることができる。
【０００６】
また、発現プラスミドには、３’末端に転写を終止させるためのターミネーター配列が含まれる。一般に有用な遺伝子の発現にはターミネーターよりもプロモーターの方が重要な働きをする。このため、植物に外来遺伝子を導入する場合、ターミネーターとしては、外来遺伝子またはプロモーターと同じ起源である遺伝子あるいは同じ分類上の起源（例えば、植物、動物、細菌、酵母、糸状菌、ウイルス等）である遺伝子に関係なく、通常、公知なターミネーター、たとえば、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）等が用いられる。
本発明の発現プラスミドは、ターミネーターとしてプロモーターと同じ起源である遺伝子、すなわち、ＧＹのターミネーターを含む。
ＧＹのターミネーターとしては、たとえば、式化６の塩基配列（配列番号２）により表される７４４塩基対からなる新規な遺伝子
【化６】
配列番号２
等をあげることができる。なお、該ターミネーターは、植物の種子内での発現において特に有用なものである。
【０００７】
さらに、本発明の発現プラスミドは、あらゆる外来遺伝子を容易に挿入するためにプロモーターの下流に１つ以上のクローニングサイトを保持させることができる。好ましくは、複数個のクローニングサイトである。ここでクローニングサイトとは、通常の遺伝子操作で用いられる制限酵素によって認識切断可能な部位のことである。たとえば、式化７の塩基配列（配列番号４）で表される遺伝子
【化７】
配列番号４
がクローニングサイトの配列としてあげられる（図２参照）。
【０００８】
このようなクローニングサイトを保持した発現プラスミドとして式化８で表されるプラスミドpSUM-GY1
【化８】
【０００９】
本発明の発現プラスミドにより、植物に導入する有用な遺伝子としては、例えば、ダイズのグリシニン遺伝子、βーコングリシニン遺伝子等の種子で発現させることにより種子における蛋白含量を改良させることができる（植物）貯蔵蛋白質遺伝子、ブラジルナッツの２Ｓ−アルブミン遺伝子、トウモロコシの１０ｋＤａまたは１５ｋＤａ蛋白質遺伝子、イネの１０ｋＤａ蛋白質遺伝子、ヒマワリの１０ｋＤａ蛋白質遺伝子等の種子で発現させることにより高メチオニン含量あるいは高リジン含量の種子に改良させることができる（植物）蛋白質遺伝子、大腸菌をはじめとする微生物のｂｉｏＡ、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＤ、ｂｉｏＦ、ｂｉｏＨ、酵素、転写制御因子ｂｉｒＡまたは植物の該ホモログ酵素等の種子で発現させることにより、高ビオチン含量の種子に改良させることができるビオチン生合成関連酵素遺伝子、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（Stearoyl-ACP desaurase) 、アシル-ACPチオエステラーゼ(acyl-ACP thioesterase) 、3-ホスフェイトアシルトランスフェラーゼ(3-phosphate acyl transferase)等の種子で発現させることにより種子における脂質の酸化安定性の増大、リン脂質の減少またはオレイン酸もしくはリノレン酸の増大等による種子脂質の改良を可能にする関連酵素遺伝子等をあげることができる。
【００１０】
上記のような有用な外来遺伝子を発現する本発明の発現プラスミドは、例えば、カナマイシンまたはハイグロマイシン等の薬剤耐性遺伝子等の選択マーカーを付加し、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと略する。）の存在下でプラスミドＤＮＡをプロトプラストに取り込ませるＰＥＧ法、電気パルスを与えてプラスミドＤＮＡをプロトプラストに取り込ませるエレクトロポーレーション法、微小針によりプラスミドＤＮＡを植物細胞に注入するマイクロインジェクション法等の通常の直接導入法を用いて、または、本発明の発現プラスミドをアグロバクテリウムのTiプラスミドもしくはRiプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域に一度組み込ませてから、植物ゲノムＤＮＡ中に導入する方法を用いて、ダイズ、タバコ、アラビドプシス、イネ、トウモロコシ、コムギ、ナタネ、アルファルファ等の双子葉および単子葉植物細胞に導入する。
【００１１】
本発明の発現プラスミドの植物細胞への導入量としては、例えば、パーティクルガン法では、例えば圧縮空気圧式銃パーティクルガン装置（レーボック商工社）を用いて、細胞あたり約１〜約１０ｎｇ、ＰＥＧ法では細胞当たり約１０〜約１００ｐｇ、エレクトロポーレーション法では、約０．５〜約１ＫＶ／ｃｍの電気パルスを与えて細胞当たり約１０〜約１００ｐｇ、マイクロインジェクション法では、細胞当たり約１ｐｇ程度が好ましい。
【００１２】
このようにして本発明の発現プラスミドを導入した植物細胞を、該発現プラスミドの選択マーカーである薬剤およびオーキシン等の植物ホルモンを含む培地で約１〜２ヵ月間培養し、さらに固体再生用の培地で約２〜３ヵ月培養し、植物体に再生する。
このときの培地として、例えば、ＭＳ培地、Ｗｈｉｔｅ培地、Ｂ５培地、Ｎ６培地、ＮＮ培地等の通常の植物培養に用いる公知の培地を用いることが可能である。
前述のように、本発明の発現プラスミドにより、外来遺伝子を導入・発現させた形質転換植物の育成により種子内において有用成分の含量を向上、あるいはその組成の改良、植物種子の形質の改良、あるいは植物種子における有用物質の生産等が可能となる。
【００１３】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は本実施例にのみ限定されないことは言うまでもない。
実施例１ 発現プラスミドpSUM-GY1の構築
ＧＹ１より単離したプロモーター領域、ターミネーター領域を、プラスミドpUC19 のクローニングサイトの両側に接続した発現プラスミドpSUM-GY1を以下のように構築した。
まずNucleic Acids Research,Vol. 17 No.11,p4386 (1989)に記載されるＧＹ１の塩基配列をもとに約700bp のプロモーター領域の遺伝子断片をＰＣＲ法を用いて増幅・単離した。この遺伝子断片をプローブとしてダイズゲノミックライブラリー（CLONTECH社）をスクリーニングし、完全なＧＹ１を含むと考えられる約4.4kb の遺伝子断片GY1-#4をサブクローン化し、プラスミドpGY1-#4 と命名した。次にプラスミドpGY1-#4 よりプロモーター領域、ターミネーター領域を単離し、プラスミドpUC19 のクローニングサイトの両側に接続して発現プラスミドpSUM-GY1を構築した（図３から図５参照）。
【００１４】
以下に、３つのステップに分け、その構築方法を述べる。
ステップ１：ＧＹ１ターミネーターを含むプラスミドpSUM-GY1-Bの構築
1 μg のプラスミドpGY1-#4 に10ユニットの制限酵素HindIII およびSphIを加えた反応液を37℃１時間反応させた。次に反応液を0.1 μg/mlの臭化エチジウムを含む0.8%アガロースゲルに供し、電気泳動を行った。泳動後、紫外線照射下で、1.2kb のHindIII ーSphIDNA 断片に相当するゲル部分を切り出し、DNA 回収用フィルター付き遠心チューブ（宝酒造）を用いてDNA 断片を精製した。一方、1 μg のプラスミドpUC19 に10ユニットの制限酵素HindIII およびSphIを加えた反応液を37℃で１時間反応させた。プラスミドpUC19 のHindIII ーSphIDNA 断片およびプラスミドpGY1-#4 の1.2kb のHindIII ーSphIDNA 断片をそれぞれ0.2 μg ずつ混合し、5 ユニットのT4DNA リガーゼを加えた反応液を16℃で２時間反応させ、ライゲーションを行った。その後、Cohen らの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 69,p2110-2114 ）に従い、反応液で大腸菌HB101 株（宝酒造）を形質転換し、100 μg/mlのアンピシリンを含むLBプレートに形質転換体を広げ、耐性コロニーを単離した。次に、Birnboimらの方法（Nucl.Acids.Res. 7 p1513-1523 ）に従い、コロニーよりプラスミドを調製し、1 μg のプラスミドに対し5 ユニットの制限酵素NheIを加えた反応液を37℃で１時間反応させた。アガロースゲル電気泳動し、制限酵素NheIで１カ所切断を受けたプラスミドを選択し、プラスミドpSUM-GY1-Aと命名した。1 μg のプラスミドpSUM-GY1-Aに10ユニットの制限酵素SphIおよびNheIを加えた反応液を37℃で１時間反応させた。DNA をエタノール沈澱により精製後、約0.1 μg の該DNA についてT4DNA ポリメラーゼを用いて末端を平滑化し、T4リガーゼを用いてライゲーションを行った（DNA Blunting Kit (宝酒造) を使用）。Cohen らの方法に従い、反応液で大腸菌HB101 株を形質転換してアンピシリン耐性コロニーを単離し、Birnboimらの方法に従い、コロニーよりプラスミドを調製した。1 μg のプラスミドDNA に対し5 ユニットの制限酵素SphIあるいはNheIを加えた反応液を37℃で１時間反応させた。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素NheIで１カ所切断を受け、かつ制限酵素SphIにより切断を受けないプラスミドを選択し、プラスミドpSUM-GY1-Bと命名した。プラスミドpSUM-GY1-BはプラスミドpUC19 由来のクローニングサイトおよび約0.7kb のＧＹ１ターミネーターを有していた（図３参照）。
【００１５】
ステップ２：ＧＹ１プロモーターを含むDNA 断片の調製
1 μg のプラスミドpGY1-#4 に10ユニットの制限酵素NcoIおよびSmaIを加えた反応液を37℃で１時間反応させた。DNA をエタノール沈澱により精製後、約0.1 μg の該DNA についてT4DNA ポリメラーゼを用いて末端を平滑化し、T4リガーゼを用いてライゲーションを行った。Cohen らの方法に従い、反応液で大腸菌HB101 株を形質転換してアンピシリン耐性コロニーを単離し、Birnboimらの方法に従い、コロニーよりプラスミドを調製した。1 μg のプラスミドに対し5 ユニットの制限酵素NcoIあるいはSmaIを加えた反応液を37℃で１時間反応させた。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素NcoIで１カ所切断を受け、かつ制限酵素SmaIにより切断を受けないプラスミドを選択し、プラスミドpSUM-GY1-Cと命名した。さらに1 μg のプラスミドpGpSUM-GY1-Cに10ユニットの制限酵素EcoRI およびKpnIを加えた反応液を37℃で１時間反応させ、反応液を電気泳動後、1.1kb のEcoRI ーKpnIDNA 断片に相当するゲル部分を切り出し、DNA 回収用フィルター付き遠心チューブ（宝酒造）を用いてDNA 断片を精製した（図４参照）。
【００１６】
ステップ３：プラスミドpSUM-GY1の構築
ステップ１で得られたプラスミドpSUM-GY1-Bに10ユニットの制限酵素EcoRI およびKpnIを加えた反応液を37℃で１時間反応させた。プラスミドpSUM-GY1-BのEcoRI ーKpnIDNA 断片およびＧＹ１プロモーターを含む約1.1kb のEcoRI ーKpnIDNA 断片をそれぞれ0.2 μg ずつ混合し、5 ユニットのT4DNA リガーゼを加えた反応液を16℃２時間反応させ、ライゲーションを行った。Cohen らの方法に従い、反応液で大腸菌HB101 株を形質転換してアンピシリン耐性コロニーを単離し、Birnboimらの方法に従い、コロニーよりプラスミドを調製した。1 μg のプラスミドに対し5 ユニットの制限酵素EcoRI およびHindIII を加えた反応液を37℃で１時間反応させた。アガロースゲル電気泳動により、約1.8kb および約2.7kb の２つのDNA断片が検出されるプラスミドを選択し、プラスミドpSUM-GY1と命名した（図５参照）。
構築した発現プラスミドpSUM-GY1は、Escherichia coli HB101/pSUM-GY1 として平成4 年3 月26日に書留引受番号161 38 785294 で工業技術院微生物工業技術研究所、特許微生物寄託センターに送付された。現在、ブダペスト条約に従って微工研条寄第4131号として同所に寄託・保管されている。
【００１７】
実施例２ 構築した発現プラスミドpSUM-GY1のプロモーター／ターミネーター活性の測定
構築した発現プラスミドpSUM-GY1のクローニングサイトにレポーター遺伝子であるＧＵＳ遺伝子を挿入し、ダイズ未熟種子における発現を調べ、ＧＹ１プロモーター／ターミネーター活性を確認した。以下にその詳細な方法を述べる。
プラスミドpSUM-GY1のマルチクローニングサイト内のNcoIとNheIの間にプラスミドpRAJ225 （CLONTECH社）由来の1.87kbのＧＵＳ遺伝子断片を挿入し、ＧＵＳ発現プラスミドpSUM-GY1-001を構築した。
プラスミドpSUM-GY1-001を、対照としてのカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35S プロモーター下流にホタルのルシフェラーゼ(LUC) 遺伝子を接続した内部標準プラスミドpDO432（Science , 234 ,856-859 ,1986）と共に、パーティクルガン法（植物細胞工学， 2，631-637 ，1990）により開花１〜２カ月後のダイズ未熟種子に導入した。また、プラスミドpSUM-GY1-001のＧＹ１ターミネーターをノパリン合成酵素遺伝子(NOS) ターミネーターに置き換えたＧＵＳ発現プラスミドpGY1100 を上述と同様に導入した。プラスミドを導入して２４〜４８時間後に、Morikawaらの方法（Appl. Microbiol. Biotechnol. 31, p320-322 ,1989 ）に従いＧＵＳ／ＬＵＣ活性を測定した。結果を表１に示す。
【００１８】
【表１】
プラスミドpSUM-GY1-001を導入した場合、プラスミドpGY1100 を導入した場合の約３倍のＧＵＳ／ＬＵＣ活性が認められた。以上のことから、ＧＹ１プロモーター／ターミネーターが未熟種子組織内で活性を持つこと、また組織において新規なＧＹ１ターミネーターは、従来植物で広く用いられている公知のNOS ターミネーターよりも高い発現量を与えることが確認された。
【００２０】
【発明の効果】
本発明の発現プラスミドは、種子においての植物遺伝子発現の解明に役立ち、有用植物遺伝子の導入、発現による植物育種および有用物質生産といった産業技術の発展を可能とする。
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１１１６
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の特徴
特徴を表す記号：promoter
存在位置：１．．１１１６
特徴を決定した方法：Ｅ
配列
GAATTCTCTC TTATAAAACA CAAACACAAT TTTTAGATTT TATTTAAATA ATCATCAATC 60
GATTATAATT ATTTATATAT TTTTCTATTT TCAAAGAAGT AAATCATGAG CTTTTCCAAC 120
TCAACATCTA TTTTTTTTCT CTCAACCTTT TTCACATCTT AAGTAGTCTC ACCCTTTATA 180
TATATAACTT ATTTCTTACC TTTTACATTA TGTAACTTTT ATCACCAAAA CCAACAACTT 240
TAAAATTTTA TTAAATAGAC TCCACAAGTA ACTTGACACT CTTACATTCA TCGACATTAA 300
CTTTTATCTG TTTTATAAAT ATTATTGTGA TATAATTTAA TCAAAATAAC CACAAACTTT 360
CATAAAAGGT TCTTATTAAG CATGGCATTT AATAAGCAAA AACAACTCAA TCACTTTCAT 420
ATAGGAGGTA GCCTAAGTAC GTACTCAAAA TGCCAACAAA TAAAAAAAAA GTTGCTTTAA 480
TAATGCCAAA ACAAATTAAT AAAACACTTA CAACACCGGA TTTTTTTTAA TTAAAATGTG 540
CCATTTAGGA TAAATAGTTA ATATTTTTAA TAATTATTTA AAAAGCCGTA TCTACTAAAA 600
TGATTTTTAT TTGGTTGAAA ATATTAATAT GTTTAAATCA ACACAATCTA TCAAAATTAA 660
ACTAAAAAAA AAATAAGTGT ACGTGGTTAA CATTAGTACA GTAATATAAG AGGAAAATGA 720
GAAATTAAGA AATTGAAAGC GAGTCTAATT TTTAAATTAT GAACCTGCAT ATATAAAAGG 780
AAAGAAAGAA TCCAGGAAGA AAAGAAATGA AACCATGCAT GGTCCCCTCG TCATCACGAG 840
TTTCTGCCAT TTGCAATAGA AACACTGAAA CACCTTTCTC TTTGTCACTT AATTGAGATG 900
CCGAAGCCAC CTCACACCAT GAACTTCATG AGGTGTAGCA CCCAAGGCTT CCATAGCCAT 960
GCATACTGAA GAATGTCTCA AGCTCAGCAC CCTACTTCTG TGACGTGTCC CTCATTCACC 1020
TTCCTCTCTT CCCTATAAAT AACCACGCCT CAGGTTCTCC GCTTCACAAC TCAAACATTC 1080
TCTCCATTGG TCCTTAAACA CTCATCAGTC ATCACC 1116
配列番号：２
配列の長さ：７４４
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の特徴
特徴を表す記号：terminator
存在位置：１．．７４４
特徴を決定した方法：Ｅ
配列
CTAGCAACCA ATAAATAATA ATAATAATAA TGAATAAGAA AACAAAGGCT TTAGCTTGCC 60
TTTTGTTCAC TGTAAAATAA TAATGTAAGT ACTCTCTATA ATGAGTCACG AAACTTTTGC 120
GGGAATAAAA GGAGAAATTC CAATGAGTTT TCTGTCAAAT CTTCTTTTGT CTCTCTCTCT 180
CTCTCTTTTT TTTTTCTTTC TTCTGAGCTT CTTGCAAAAC AAAAGGCAAA CAATAACGAT 240
TGGTCCAATG ATAGTTAGCT TGATCGATGA TATCTTTAGG AAGTGTTGGC AGGACAGGAC 300
ATGATGTAGA AGACTAAAAT TGAAAGTATT GCAGACCCAA TAGTTGAAGA TTAACTTTAA 360
GAATGAAGAC GTCTTATCAG GTTCTTCATG ACTTGGAGCT CAACCCAACT TGGAAAGTTC 420
GAGAGTATTT GGACCATTGT GCTTTGTGTC TTCAAACATA AAACATCGCT CCAAATTTAA 480
CATGGGAGCT AAAAAATGTG TTTTTCTGGG ATTTTAATTT TCAACAGAGT CAAGGATGGT 540
GTTGCATATG ATGTCTTGAT GTCCATTGTC CACACTAAAT AGATATTGGT TTCAAGAAAT 600
ATTAATTTCA TTTTCATGAC TTTCAATTCA TAAACCTTAA ACGAATATTA ATTTAAAATC 660
TATCCTCAAA TGATAAATTT TAAAAAAAAT TACCCCCAAT CGGTAATTTG ACTCACAAGT 720
TAGTTAGTTG ATATTTTGAA GCTT 744
配列番号：３
配列の長さ：６９０
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の特徴
特徴を表す記号：promoter
存在位置：１．．６９０
特徴を決定した方法：Ｅ
配列
TAGCCTAAGT ACGTACTCAA AATGCCAACA AATAAAAAAA AAGTTGCTTT AATAATGCCA 60
AAACAAATTA ATAAAACACT TACAACACCG GATTTTTTTT AATTAAAATG TGCCATTTAG 120
GATAAATAGT TAATATTTTT AATAATTATT TAAAAAGCCG TATCTACTAA AATGATTTTT 180
ATTTGGTTGA AAATATTAAT ATGTTTAAAT CAACACAATC TATCAAAATT AAACTAAAAA 240
AAAAATAAGT GTACGTGGTT AACATTAGTA CAGTAATATA AGAGGAAAAT GAGAAATTAA 300
GAAATTGAAA GCGAGTCTAA TTTTTAAATT ATGAACCTGC ATATATAAAA GGAAAGAAAG 360
AATCCAGGAA GAAAAGAAAT GAAACCATGC ATGGTCCCCT CGTCATCACG AGTTTCTGCC 420
ATTTGCAATA GAAACACTGA AACACCTTTC TCTTTGTCAC TTAATTGAGA TGCCGAAGCC 480
ACCTCACACC ATGAACTTCA TGAGGTGTAG CACCCAAGGC TTCCATAGCC ATGCATACTG 540
AAGAATGTCT CAAGCTCAGC ACCCTACTTC TGTGACGTTG TCCCTCATTC ACCTTCCTCT 600
CTTCCCTATA AATAACCACG CCTCAGGTTC TCCGCTTCAC AACTCAAACA TTCTCCTCCA 660
TTGGTCCTTA AACACTCATC AGTCATCACC 690
配列番号：４
配列の長さ：３５
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列
CCATGGGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CTAGC 35
【図面の簡単な説明】
【図１】発現プラスミドpSUM-GY1の制限酵素地図を示す。斜線部分はダイズ種子貯蔵タンパク質グリシニン遺伝子プロモーター、鉛直線部分はダイズ種子貯蔵タンパク質グリシニン遺伝子ターミネーターを示す。
【図２】プラスミドpSUM-GY1に含まれるマルチクローニングサイトの塩基配列を示す。
【図３】プラスミドpSUM-GY1構築のステップ１を示す。
【図４】プラスミドpSUM-GY1構築のステップ２を示す。
【図５】プラスミドpSUM-GY1構築のステップ３を示す。
Claims (8)
- 配列番号１で示される塩基配列により表されるダイズ種子貯蔵タンパク質グリシニン遺伝子プロモーターと配列番号２で示される塩基配列により表されるダイズ種子貯蔵タンパク質グリシニン遺伝子ターミネーターとを含有することを特徴とする発現プラスミド。
- 微工研条寄第４１３１号としてブタペスト条約に従って寄託・保管されているEscherichia coli HB101/pSUM-GY1が保有する請求項１記載の発現プラスミド。
- 請求項１又は２記載の発現プラスミドを含有することを特徴とする植物細胞。
- 請求項３記載の植物細胞を、植物ホルモンを含む培地で約１〜２ヶ月培養し、さらに個体再生用の培地で約２〜３ヶ月培養して再生された、双子葉植物体、イネの植物体又はトウモロコシの植物体。
- 請求項１又は２記載の発現プラスミドを含有することを特徴とする、双子葉植物細胞、イネの植物細胞若しくはトウモロコシの植物細胞、又は、双子葉植物体、イネの植物体若しくはトウモロコシの植物体。
- 請求項１又は２記載の発現プラスミドを含有することを特徴とするダイズ、タバコ、アラビドプシス、イネ、トウモロコシ、ナタネ、アルファルファの植物細胞又は植物体。
- 有用な遺伝子の発現方法であって、請求項１又は２記載の発現プラスミドにより有用な遺伝子を導入し、当該遺伝子を種子において特異的に発現させることを特徴とする方法。
- 配列番号１で示される塩基配列により表されるダイズ種子貯蔵タンパク質グリシニン遺伝子プロモーター。
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| JP7064792 | 1992-03-27 | ||
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