JPH06189777A - 種子用発現プラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ダイズ種子貯蔵タンパク質グリシニン遺伝子
プロモーターおよびダイズ種子貯蔵タンパク質グリシニ
ン遺伝子ターミネーターから構築された発現プラスミド 【効果】 本発明の発現プラスミドは、種子においての
植物遺伝子発現の解明に役立ち、有用植物遺伝子の導
入、発現による植物育種および有用物質生産といった産
業技術の発展を可能とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、種子用発現プラスミド
に関する。さらに詳細には、ダイズ種子貯蔵タンパク質
グリシニン遺伝子（以下、ＧＹと略する。）プロモータ
ーおよびＧＹターミネーターから構築された発現プラス
ミドに関する。

【０００２】

【従来の技術】多くの植物種において、種子での外来遺
伝子の発現目的として、種子貯蔵タンパク質遺伝子プロ
モーターを用いた発現プラスミドの開発が進められてい
る。グリシニンはダイズの全種子タンパク質の20% 以上
を占める主要な貯蔵タンパク質の１つであり、主に５種
類のものが存在する。その遺伝子は各々ＧＹ１，ＧＹ
２，ＧＹ３，ＧＹ３，ＧＹ４，ＧＹ５と命名されてお
り、その性質についてはThe Plant Cell ,Vol.1,p313-3
28(1989)に記載されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、現状で
は、種子における外来遺伝子の発現量は充分ではなく、
より高い発現量を示すための種子用発現プラスミド、プ
ロモーターおよびターミネーターが必要であった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の状
況を鑑み、より優れた種子用発現プラスミドを見出すべ
く鋭意検討を重ねた結果、ある種の種子貯蔵タンパク質
遺伝子から得られるプロモーターおよびターミネーター
から構築される発現プラスミドが従来のものと比べて高
い発現量を示すことを見出し、本発明を完成した。すな
わち、本発明はＧＹプロモーターおよびＧＹターミネー
ターを含有する発現プラスミドを提供するものである。
さらに、本発明者らは、プロモーターの下流に複数個の
クローニングサイトを保持した種子用発現プラスミドの
構築にも成功し、あらゆる外来遺伝子を容易に挿入する
ことを可能にした。

【０００５】以下、本発明をさらに詳細に説明する。発
現プラスミドには、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写
を開始させるためのプロモーター配列が含まれる。本発
明の発現プラスミドは、プロモーターとしてＧＹプロモ
ーターを含む。ＧＹプロモーターとしては、例えばNucl
eic Acids Research,Vol.17,4386(1989)等に記載される
式化４の塩基配列( 配列番号３) で表される６９０塩基
対からなる公知な遺伝子

【化４】配列番号３ または式化５の塩基配列( 配列番号１) で表される１１
１６塩基対からなる新規な遺伝子

【化５】配列番号１ 等をあげることができる。

【０００６】また、発現プラスミドには、３’末端に転
写を終止させるためのターミネーター配列が含まれる。
一般に有用な遺伝子の発現にはターミネーターよりもプ
ロモーターの方が重要な働きをする。このため、植物に
外来遺伝子を導入する場合、ターミネーターとしては、
外来遺伝子またはプロモーターと同じ起源である遺伝子
あるいは同じ分類上の起源（例えば、植物、動物、細
菌、酵母、糸状菌、ウイルス等）である遺伝子に関係な
く、通常、公知なターミネーター、たとえば、ノパリン
シンターゼ（ＮＯＳ）等が用いられる。本発明の発現プ
ラスミドは、ターミネーターとしてプロモーターと同じ
起源である遺伝子、すなわち、ＧＹのターミネーターを
含む。ＧＹのターミネーターとしては、たとえば、式化
６の塩基配列（配列番号２）により表される７４４塩基
対からなる新規な遺伝子

【化６】配列番号２ 等をあげることができる。なお、該ターミネーターは、
植物の種子内での発現において特に有用なものである。

【０００７】さらに、本発明の発現プラスミドは、あら
ゆる外来遺伝子を容易に挿入するためにプロモーターの
下流に１つ以上のクローニングサイトを保持させること
ができる。好ましくは、複数個のクローニングサイトで
ある。ここでクローニングサイトとは、通常の遺伝子操
作で用いられる制限酵素によって認識切断可能な部位の
ことである。たとえば、式化７の塩基配列（配列番号
４）で表される遺伝子

【化７】配列番号４ がクローニングサイトの配列としてあげられる（図２参
照）。

【０００８】このようなクローニングサイトを保持した
発現プラスミドとして式化８で表されるプラスミドpSUM
-GY1

【化８】 をあげることができる（図１参照）。

【０００９】本発明の発現プラスミドにより、植物に導
入する有用な遺伝子としては、例えば、ダイズのグリシ
ニン遺伝子、βーコングリシニン遺伝子等の種子で発現
させることにより種子における蛋白含量を改良させるこ
とができる（植物）貯蔵蛋白質遺伝子、ブラジルナッツ
の２Ｓ−アルブミン遺伝子、トウモロコシの１０ｋＤａ
または１５ｋＤａ蛋白質遺伝子、イネの１０ｋＤａ蛋白
質遺伝子、ヒマワリの１０ｋＤａ蛋白質遺伝子等の種子
で発現させることにより高メチオニン含量あるいは高リ
ジン含量の種子に改良させることができる（植物）蛋白
質遺伝子、大腸菌をはじめとする微生物のｂｉｏＡ、ｂ
ｉｏＢ、ｂｉｏＣ、ｂｉｏＤ、ｂｉｏＦ、ｂｉｏＨ、酵
素、転写制御因子ｂｉｒＡまたは植物の該ホモログ酵素
等の種子で発現させることにより、高ビオチン含量の種
子に改良させることができるビオチン生合成関連酵素遺
伝子、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ（Stearoyl
-ACP desaurase) 、アシル-ACPチオエステラーゼ(acyl-
ACP thioesterase) 、3-ホスフェイトアシルトランスフ
ェラーゼ(3-phosphate acyl transferase)等の種子で発
現させることにより種子における脂質の酸化安定性の増
大、リン脂質の減少またはオレイン酸もしくはリノレン
酸の増大等による種子脂質の改良を可能にする関連酵素
遺伝子等をあげることができる。

【００１０】上記のような有用な外来遺伝子を発現する
本発明の発現プラスミドは、例えば、カナマイシンまた
はハイグロマイシン等の薬剤耐性遺伝子等の選択マーカ
ーを付加し、パーティクルガン法、ポリエチレングリコ
ール（以下、ＰＥＧと略する。）の存在下でプラスミド
ＤＮＡをプロトプラストに取り込ませるＰＥＧ法、電気
パルスを与えてプラスミドＤＮＡをプロトプラストに取
り込ませるエレクトロポーレーション法、微小針により
プラスミドＤＮＡを植物細胞に注入するマイクロインジ
ェクション法等の通常の直接導入法を用いて、または、
本発明の発現プラスミドをアグロバクテリウムのTiプラ
スミドもしくはRiプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域に一度組
み込ませてから、植物ゲノムＤＮＡ中に導入する方法を
用いて、ダイズ、タバコ、アラビドプシス、イネ、トウ
モロコシ、コムギ、ナタネ、アルファルファ等の双子葉
および単子葉植物細胞に導入する。

【００１１】本発明の発現プラスミドの植物細胞への導
入量としては、例えば、パーティクルガン法では、例え
ば圧縮空気圧式銃パーティクルガン装置（レーボック商
工社）を用いて、細胞あたり約１〜約１０ｎｇ、ＰＥＧ
法では細胞当たり約１０〜約１００ｐｇ、エレクトロポ
ーレーション法では、約０．５〜約１ＫＶ／ｃｍの電気
パルスを与えて細胞当たり約１０〜約１００ｐｇ、マイ
クロインジェクション法では、細胞当たり約１ｐｇ程度
が好ましい。

【００１２】このようにして本発明の発現プラスミドを
導入した植物細胞を、該発現プラスミドの選択マーカー
である薬剤およびオーキシン等の植物ホルモンを含む培
地で約１〜２ヵ月間培養し、さらに固体再生用の培地で
約２〜３ヵ月培養し、植物体に再生する。このときの培
地として、例えば、ＭＳ培地、Ｗｈｉｔｅ培地、Ｂ５培
地、Ｎ６培地、ＮＮ培地等の通常の植物培養に用いる公
知の培地を用いることが可能である。前述のように、本
発明の発現プラスミドにより、外来遺伝子を導入・発現
させた形質転換植物の育成により種子内において有用成
分の含量を向上、あるいはその組成の改良、植物種子の
形質の改良、あるいは植物種子における有用物質の生産
等が可能となる。

【００１３】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、
本発明は本実施例にのみ限定されないことは言うまでも
ない。 実施例１ 発現プラスミドpSUM-GY1の構築 ＧＹ１より単離したプロモーター領域、ターミネーター
領域を、プラスミドpUC19 のクローニングサイトの両側
に接続した発現プラスミドpSUM-GY1を以下のように構築
した。まずNucleic Acids Research,Vol. 17 No.11,p4
386 (1989)に記載されるＧＹ１の塩基配列をもとに約70
0bp のプロモーター領域の遺伝子断片をＰＣＲ法を用い
て増幅・単離した。この遺伝子断片をプローブとしてダ
イズゲノミックライブラリー（CLONTECH社）をスクリー
ニングし、完全なＧＹ１を含むと考えられる約4.4kb の
遺伝子断片GY1-#4をサブクローン化し、プラスミドpGY1
-#4 と命名した。次にプラスミドpGY1-#4 よりプロモー
ター領域、ターミネーター領域を単離し、プラスミドpU
C19 のクローニングサイトの両側に接続して発現プラス
ミドpSUM-GY1を構築した（図３から図５参照）。

【００１４】以下に、３つのステップに分け、その構築
方法を述べる。 ステップ１：ＧＹ１ターミネーターを含むプラスミドpS
UM-GY1-Bの構築 1 μg のプラスミドpGY1-#4 に10ユニットの制限酵素Hi
ndIII およびSphIを加えた反応液を37℃１時間反応させ
た。次に反応液を0.1 μg/mlの臭化エチジウムを含む0.
8%アガロースゲルに供し、電気泳動を行った。泳動後、
紫外線照射下で、1.2kb のHindIII ーSphIDNA 断片に相
当するゲル部分を切り出し、DNA 回収用フィルター付き
遠心チューブ（宝酒造）を用いてDNA 断片を精製した。
一方、1μg のプラスミドpUC19 に10ユニットの制限酵
素HindIII およびSphIを加えた反応液を37℃で１時間反
応させた。プラスミドpUC19 のHindIII ーSphIDNA 断片
およびプラスミドpGY1-#4 の1.2kb のHindIII ーSphIDN
A 断片をそれぞれ0.2 μgずつ混合し、5 ユニットのT4D
NA リガーゼを加えた反応液を16℃で２時間反応させ、
ライゲーションを行った。その後、Cohen らの方法（Pr
oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 69,p2110-2114 ）に従い、反
応液で大腸菌HB101 株（宝酒造）を形質転換し、100 μ
g/mlのアンピシリンを含むLBプレートに形質転換体を広
げ、耐性コロニーを単離した。次に、Birnboimらの方法
（Nucl.Acids.Res. 7 p1513-1523 ）に従い、コロニー
よりプラスミドを調製し、1 μg のプラスミドに対し5
ユニットの制限酵素NheIを加えた反応液を37℃で１時間
反応させた。アガロースゲル電気泳動し、制限酵素NheI
で１カ所切断を受けたプラスミドを選択し、プラスミド
pSUM-GY1-Aと命名した。1 μg のプラスミドpSUM-GY1-A
に10ユニットの制限酵素SphIおよびNheIを加えた反応液
を37℃で１時間反応させた。DNA をエタノール沈澱によ
り精製後、約0.1 μg の該DNA についてT4DNA ポリメラ
ーゼを用いて末端を平滑化し、T4リガーゼを用いてライ
ゲーションを行った（DNA Blunting Kit (宝酒造) を使
用）。Cohen らの方法に従い、反応液で大腸菌HB101 株
を形質転換してアンピシリン耐性コロニーを単離し、Bi
rnboimらの方法に従い、コロニーよりプラスミドを調製
した。1 μg のプラスミドDNA に対し5 ユニットの制限
酵素SphIあるいはNheIを加えた反応液を37℃で１時間反
応させた。アガロースゲル電気泳動により、制限酵素Nh
eIで１カ所切断を受け、かつ制限酵素SphIにより切断を
受けないプラスミドを選択し、プラスミドpSUM-GY1-Bと
命名した。プラスミドpSUM-GY1-BはプラスミドpUC19 由
来のクローニングサイトおよび約0.7kb のＧＹ１ターミ
ネーターを有していた（図３参照）。

【００１５】ステップ２：ＧＹ１プロモーターを含むDN
A 断片の調製 1 μg のプラスミドpGY1-#4 に10ユニットの制限酵素Nc
oIおよびSmaIを加えた反応液を37℃で１時間反応させ
た。DNA をエタノール沈澱により精製後、約0.1μg の
該DNA についてT4DNA ポリメラーゼを用いて末端を平滑
化し、T4リガーゼを用いてライゲーションを行った。Co
hen らの方法に従い、反応液で大腸菌HB101 株を形質転
換してアンピシリン耐性コロニーを単離し、Birnboimら
の方法に従い、コロニーよりプラスミドを調製した。1
μg のプラスミドに対し5 ユニットの制限酵素NcoIある
いはSmaIを加えた反応液を37℃で１時間反応させた。ア
ガロースゲル電気泳動により、制限酵素NcoIで１カ所切
断を受け、かつ制限酵素SmaIにより切断を受けないプラ
スミドを選択し、プラスミドpSUM-GY1-Cと命名した。さ
らに1 μg のプラスミドpGpSUM-GY1-Cに10ユニットの制
限酵素EcoRI およびKpnIを加えた反応液を37℃で１時間
反応させ、反応液を電気泳動後、1.1kb のEcoRI ーKpnI
DNA 断片に相当するゲル部分を切り出し、DNA 回収用フ
ィルター付き遠心チューブ（宝酒造）を用いてDNA 断片
を精製した（図４参照）。

【００１６】ステップ３：プラスミドpSUM-GY1の構築 ステップ１で得られたプラスミドpSUM-GY1-Bに10ユニッ
トの制限酵素EcoRI およびKpnIを加えた反応液を37℃で
１時間反応させた。プラスミドpSUM-GY1-BのEcoRI ーKp
nIDNA 断片およびＧＹ１プロモーターを含む約1.1kb の
EcoRI ーKpnIDNA 断片をそれぞれ0.2 μg ずつ混合し、
5 ユニットのT4DNA リガーゼを加えた反応液を16℃２時
間反応させ、ライゲーションを行った。Cohen らの方法
に従い、反応液で大腸菌HB101 株を形質転換してアンピ
シリン耐性コロニーを単離し、Birnboimらの方法に従
い、コロニーよりプラスミドを調製した。1 μg のプラ
スミドに対し5 ユニットの制限酵素EcoRI およびHindII
I を加えた反応液を37℃で１時間反応させた。アガロー
スゲル電気泳動により、約1.8kb および約2.7kb の２つ
のDNA断片が検出されるプラスミドを選択し、プラスミ
ドpSUM-GY1と命名した（図５参照）。構築した発現プラ
スミドpSUM-GY1は、Escherichia coli HB101/pSUM-GY1
として平成4 年3 月26日に書留引受番号161 38 785294
で工業技術院微生物工業技術研究所、特許微生物寄託セ
ンターに送付された。現在、ブダペスト条約に従って微
工研条寄第4131号として同所に寄託・保管されている。

【００１７】実施例２ 構築した発現プラスミドpSUM-G
Y1のプロモーター／ターミネーター活性の測定 構築した発現プラスミドpSUM-GY1のクローニングサイト
にレポーター遺伝子であるＧＵＳ遺伝子を挿入し、ダイ
ズ未熟種子における発現を調べ、ＧＹ１プロモーター／
ターミネーター活性を確認した。以下にその詳細な方法
を述べる。プラスミドpSUM-GY1のマルチクローニングサ
イト内のNcoIとNheIの間にプラスミドpRAJ225 （CLONTE
CH社）由来の1.87kbのＧＵＳ遺伝子断片を挿入し、ＧＵ
Ｓ発現プラスミドpSUM-GY1-001を構築した。プラスミド
pSUM-GY1-001を、対照としてのカリフラワーモザイクウ
イルス(CaMV)35S プロモーター下流にホタルのルシフェ
ラーゼ(LUC) 遺伝子を接続した内部標準プラスミドpDO4
32（Science , 234 ,856-859 ,1986）と共に、パーティ
クルガン法（植物細胞工学， 2，631-637 ，1990）によ
り開花１〜２カ月後のダイズ未熟種子に導入した。ま
た、プラスミドpSUM-GY1-001のＧＹ１ターミネーターを
ノパリン合成酵素遺伝子(NOS) ターミネーターに置き換
えたＧＵＳ発現プラスミドpGY1100 を上述と同様に導入
した。プラスミドを導入して２４〜４８時間後に、Mori
kawaらの方法（Appl. Microbiol. Biotechnol. 31, p
320-322 ,1989 ）に従いＧＵＳ／ＬＵＣ活性を測定し
た。結果を表１に示す。

【００１８】

【表１】

【００１９】プラスミドpSUM-GY1-001を導入した場合、
プラスミドpGY1100 を導入した場合の約３倍のＧＵＳ／
ＬＵＣ活性が認められた。以上のことから、ＧＹ１プロ
モーター／ターミネーターが未熟種子組織内で活性を持
つこと、また組織において新規なＧＹ１ターミネーター
は、従来植物で広く用いられている公知のNOS ターミネ
ーターよりも高い発現量を与えることが確認された。

【００２０】

【発明の効果】本発明の発現プラスミドは、種子におい
ての植物遺伝子発現の解明に役立ち、有用植物遺伝子の
導入、発現による植物育種および有用物質生産といった
産業技術の発展を可能とする。

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１１１６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 存在位置：１．．１１１６ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GAATTCTCTC TTATAAAACA CAAACACAAT TTTTAGATTT TATTTAAATA ATCATCAATC 60 GATTATAATT ATTTATATAT TTTTCTATTT TCAAAGAAGT AAATCATGAG CTTTTCCAAC 120 TCAACATCTA TTTTTTTTCT CTCAACCTTT TTCACATCTT AAGTAGTCTC ACCCTTTATA 180 TATATAACTT ATTTCTTACC TTTTACATTA TGTAACTTTT ATCACCAAAA CCAACAACTT 240 TAAAATTTTA TTAAATAGAC TCCACAAGTA ACTTGACACT CTTACATTCA TCGACATTAA 300 CTTTTATCTG TTTTATAAAT ATTATTGTGA TATAATTTAA TCAAAATAAC CACAAACTTT 360 CATAAAAGGT TCTTATTAAG CATGGCATTT AATAAGCAAA AACAACTCAA TCACTTTCAT 420 ATAGGAGGTA GCCTAAGTAC GTACTCAAAA TGCCAACAAA TAAAAAAAAA GTTGCTTTAA 480 TAATGCCAAA ACAAATTAAT AAAACACTTA CAACACCGGA TTTTTTTTAA TTAAAATGTG 540 CCATTTAGGA TAAATAGTTA ATATTTTTAA TAATTATTTA AAAAGCCGTA TCTACTAAAA 600 TGATTTTTAT TTGGTTGAAA ATATTAATAT GTTTAAATCA ACACAATCTA TCAAAATTAA 660 ACTAAAAAAA AAATAAGTGT ACGTGGTTAA CATTAGTACA GTAATATAAG AGGAAAATGA 720 GAAATTAAGA AATTGAAAGC GAGTCTAATT TTTAAATTAT GAACCTGCAT ATATAAAAGG 780 AAAGAAAGAA TCCAGGAAGA AAAGAAATGA AACCATGCAT GGTCCCCTCG TCATCACGAG 840 TTTCTGCCAT TTGCAATAGA AACACTGAAA CACCTTTCTC TTTGTCACTT AATTGAGATG 900 CCGAAGCCAC CTCACACCAT GAACTTCATG AGGTGTAGCA CCCAAGGCTT CCATAGCCAT 960 GCATACTGAA GAATGTCTCA AGCTCAGCAC CCTACTTCTG TGACGTGTCC CTCATTCACC 1020 TTCCTCTCTT CCCTATAAAT AACCACGCCT CAGGTTCTCC GCTTCACAAC TCAAACATTC 1080 TCTCCATTGG TCCTTAAACA CTCATCAGTC ATCACC 1116 配列番号：２ 配列の長さ：７４４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：terminator 存在位置：１．．７４４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CTAGCAACCA ATAAATAATA ATAATAATAA TGAATAAGAA AACAAAGGCT TTAGCTTGCC 60 TTTTGTTCAC TGTAAAATAA TAATGTAAGT ACTCTCTATA ATGAGTCACG AAACTTTTGC 120 GGGAATAAAA GGAGAAATTC CAATGAGTTT TCTGTCAAAT CTTCTTTTGT CTCTCTCTCT 180 CTCTCTTTTT TTTTTCTTTC TTCTGAGCTT CTTGCAAAAC AAAAGGCAAA CAATAACGAT 240 TGGTCCAATG ATAGTTAGCT TGATCGATGA TATCTTTAGG AAGTGTTGGC AGGACAGGAC 300 ATGATGTAGA AGACTAAAAT TGAAAGTATT GCAGACCCAA TAGTTGAAGA TTAACTTTAA 360 GAATGAAGAC GTCTTATCAG GTTCTTCATG ACTTGGAGCT CAACCCAACT TGGAAAGTTC 420 GAGAGTATTT GGACCATTGT GCTTTGTGTC TTCAAACATA AAACATCGCT CCAAATTTAA 480 CATGGGAGCT AAAAAATGTG TTTTTCTGGG ATTTTAATTT TCAACAGAGT CAAGGATGGT 540 GTTGCATATG ATGTCTTGAT GTCCATTGTC CACACTAAAT AGATATTGGT TTCAAGAAAT 600 ATTAATTTCA TTTTCATGAC TTTCAATTCA TAAACCTTAA ACGAATATTA ATTTAAAATC 660 TATCCTCAAA TGATAAATTT TAAAAAAAAT TACCCCCAAT CGGTAATTTG ACTCACAAGT 720 TAGTTAGTTG ATATTTTGAA GCTT 744 配列番号：３ 配列の長さ：６９０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 存在位置：１．．６９０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TAGCCTAAGT ACGTACTCAA AATGCCAACA AATAAAAAAA AAGTTGCTTT AATAATGCCA 60 AAACAAATTA ATAAAACACT TACAACACCG GATTTTTTTT AATTAAAATG TGCCATTTAG 120 GATAAATAGT TAATATTTTT AATAATTATT TAAAAAGCCG TATCTACTAA AATGATTTTT 180 ATTTGGTTGA AAATATTAAT ATGTTTAAAT CAACACAATC TATCAAAATT AAACTAAAAA 240 AAAAATAAGT GTACGTGGTT AACATTAGTA CAGTAATATA AGAGGAAAAT GAGAAATTAA 300 GAAATTGAAA GCGAGTCTAA TTTTTAAATT ATGAACCTGC ATATATAAAA GGAAAGAAAG 360 AATCCAGGAA GAAAAGAAAT GAAACCATGC ATGGTCCCCT CGTCATCACG AGTTTCTGCC 420 ATTTGCAATA GAAACACTGA AACACCTTTC TCTTTGTCAC TTAATTGAGA TGCCGAAGCC 480 ACCTCACACC ATGAACTTCA TGAGGTGTAG CACCCAAGGC TTCCATAGCC ATGCATACTG 540 AAGAATGTCT CAAGCTCAGC ACCCTACTTC TGTGACGTTG TCCCTCATTC ACCTTCCTCT 600 CTTCCCTATA AATAACCACG CCTCAGGTTC TCCGCTTCAC AACTCAAACA TTCTCCTCCA 660 TTGGTCCTTA AACACTCATC AGTCATCACC 690 配列番号：４ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CCATGGGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CTAGC 35

【図面の簡単な説明】

【図１】発現プラスミドpSUM-GY1の制限酵素地図を示
す。斜線部分はダイズ種子貯蔵タンパク質グリシニン遺
伝子プロモーター、鉛直線部分はダイズ種子貯蔵タンパ
ク質グリシニン遺伝子ターミネーターを示す。

【図２】プラスミドpSUM-GY1に含まれるマルチクローニ
ングサイトの塩基配列を示す。

【図３】プラスミドpSUM-GY1構築のステップ１を示す。

【図４】プラスミドpSUM-GY1構築のステップ２を示す。

【図５】プラスミドpSUM-GY1構築のステップ３を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/11

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ダイズ種子貯蔵タンパク質グリシニン遺伝
   子プロモーターおよびダイズ種子貯蔵タンパク質グリシ
   ニン遺伝子ターミネーターを含有する発現プラスミド
2. 【請求項２】式化１の塩基配列（配列番号１）により表
   されるダイズ種子貯蔵タンパク質グリシニン遺伝子プロ
   モーターと式化２の塩基配列（配列番号２）により表さ
   れるダイズ種子貯蔵タンパク質グリシニン遺伝子ターミ
   ネーターを含有する請求項１記載の発現プラスミド 【化１】配列番号１ 【化２】配列番号２
3. 【請求項３】式化３により表される請求項１記載の発現
   プラスミドpSUM-GY1 【化３】
4. 【請求項４】請求項１記載の発現プラスミドを含有する
   植物細胞または植物体
5. 【請求項５】請求項２記載の発現プラスミドを含有する
   植物細胞または植物体
6. 【請求項６】請求項３記載の発現プラスミドpSUM-GY1を
   含有する植物細胞または植物体
7. 【請求項７】請求項１記載の発現プラスミドにより有用
   な遺伝子を導入し、該遺伝子を種子において特異的に発
   現させる方法
8. 【請求項８】式化１の塩基配列（配列番号１）により表
   されるダイズ種子貯蔵タンパク質グリシニン遺伝子プロ
   モーター
9. 【請求項９】式化２の塩基配列（配列番号２）により表
   されるダイズ種子貯蔵タンパク質グリシニン遺伝子ター
   ミネーター