JPH0523187A - カスガマイシンアセチル化酵素遺伝子とそれを含有するｄｎａ断片 - Google Patents
カスガマイシンアセチル化酵素遺伝子とそれを含有するｄｎａ断片Info
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- JPH0523187A JPH0523187A JP2150091A JP2150091A JPH0523187A JP H0523187 A JPH0523187 A JP H0523187A JP 2150091 A JP2150091 A JP 2150091A JP 2150091 A JP2150091 A JP 2150091A JP H0523187 A JPH0523187 A JP H0523187A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】 放線菌（カスガマイシン生産菌、ストレプト
ミセス・カスガエンシス）のＤＮＡに由来して分子量が
約１４ｋｂのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片を制限
酵素ＢａｍＨＩで切断して得られ且つカスガマイシンア
セチル化酵素をコードする遺伝子を内部に含有し、制限
酵素ＳｐｌＩ及びＳａｌＩによる酵素切断点を有する分
子量が約０．７ｋｂのＤＮＡ断片又はこれと等価である
ＤＮＡ断片、並びに宿主細胞にカスガマイシンをアセチ
ル化する酵素を産生させる能力を付与し、これにより、
宿主細胞にカスガマイシンを不活性化する能力を付与し
て宿主細胞をカスガマイシン耐性とする、カスガマイシ
ンアセチル化酵素をコードする遺伝子。 【効果】 組換えＤＮＡ技術の活用に必要な遺伝子導入
用ベクターの選択マーカーとして有用であり、さらにカ
スガマイシンの新規誘導体の創製などを目的として行わ
れるカスガマイシンの生産機構の解析に利用される材料
としても有用である。
ミセス・カスガエンシス）のＤＮＡに由来して分子量が
約１４ｋｂのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片を制限
酵素ＢａｍＨＩで切断して得られ且つカスガマイシンア
セチル化酵素をコードする遺伝子を内部に含有し、制限
酵素ＳｐｌＩ及びＳａｌＩによる酵素切断点を有する分
子量が約０．７ｋｂのＤＮＡ断片又はこれと等価である
ＤＮＡ断片、並びに宿主細胞にカスガマイシンをアセチ
ル化する酵素を産生させる能力を付与し、これにより、
宿主細胞にカスガマイシンを不活性化する能力を付与し
て宿主細胞をカスガマイシン耐性とする、カスガマイシ
ンアセチル化酵素をコードする遺伝子。 【効果】 組換えＤＮＡ技術の活用に必要な遺伝子導入
用ベクターの選択マーカーとして有用であり、さらにカ
スガマイシンの新規誘導体の創製などを目的として行わ
れるカスガマイシンの生産機構の解析に利用される材料
としても有用である。
Description
【０００１】
【０００２】本発明は、ストレプトミセス属の放線菌に
由来して放線菌または細菌のカスガマイシン耐性に関与
するカスガマイシンアセチル化酵素をコードする遺伝子
に関し、また該遺伝子を含有するＤＮＡ断片並びにそれ
の単離とその利用に関する。より詳しくは、本発明よる
カスガマイシンアセチル化酵素をコードする遺伝子、ま
たは該遺伝子を含有するＤＮＡ断片は組換えＤＮＡ技術
の活用に必要な遺伝子導入用ベクターの選択マーカーと
して有用であり、さらにカスガマイシンの新規誘導体の
創製などを目的として行われるカスガマイシンの生産機
構の解析に利用される材料としても有用である。
由来して放線菌または細菌のカスガマイシン耐性に関与
するカスガマイシンアセチル化酵素をコードする遺伝子
に関し、また該遺伝子を含有するＤＮＡ断片並びにそれ
の単離とその利用に関する。より詳しくは、本発明よる
カスガマイシンアセチル化酵素をコードする遺伝子、ま
たは該遺伝子を含有するＤＮＡ断片は組換えＤＮＡ技術
の活用に必要な遺伝子導入用ベクターの選択マーカーと
して有用であり、さらにカスガマイシンの新規誘導体の
創製などを目的として行われるカスガマイシンの生産機
構の解析に利用される材料としても有用である。
【０００３】
【０００４】現在、ＤＮＡ組換え技術のめざましい発展
により、大腸菌、枯草菌、放線菌や酵母など数多くの微
生物について、宿主−ベクター系が開発され、有用ペプ
チドの生産などに利用されている。その際、プラスミド
ベクターのための選択マーカーとしては、選択の容易性
や適用範囲の広さなどから、薬剤耐性マーカーが多く用
いられ、例えば、アンピシリン耐性マーカーやテトラサ
イクリン耐性マーカーが用いられ、またその他に、カナ
マイシン、ネオマイシンやストレプトマイシンなどのア
ミノグリコシド系抗生物質の耐性マーカーなどが挙げら
れる。そしてこれらの耐性マーカーの利用例としては枯
草菌のベクターｐＵＣ１１０上のカナマイシン耐性マー
カー、放線菌のベクターｐＩＪ６１上のネオマイシン耐
性マーカー及びコリネバクテリウムのベクターｐＣＧ４
上のストレプトマイシン耐性マーカーなどがある。
により、大腸菌、枯草菌、放線菌や酵母など数多くの微
生物について、宿主−ベクター系が開発され、有用ペプ
チドの生産などに利用されている。その際、プラスミド
ベクターのための選択マーカーとしては、選択の容易性
や適用範囲の広さなどから、薬剤耐性マーカーが多く用
いられ、例えば、アンピシリン耐性マーカーやテトラサ
イクリン耐性マーカーが用いられ、またその他に、カナ
マイシン、ネオマイシンやストレプトマイシンなどのア
ミノグリコシド系抗生物質の耐性マーカーなどが挙げら
れる。そしてこれらの耐性マーカーの利用例としては枯
草菌のベクターｐＵＣ１１０上のカナマイシン耐性マー
カー、放線菌のベクターｐＩＪ６１上のネオマイシン耐
性マーカー及びコリネバクテリウムのベクターｐＣＧ４
上のストレプトマイシン耐性マーカーなどがある。
【０００５】しかしながら、従来、カスガマイシン耐性
マーカーは知られていない。
マーカーは知られていない。
【０００６】一方、抗生物質の誘導体の創製によって大
きな発展を遂げた例としては、β−ラククム系抗生物質
であるペニシリンやセファロスポリンがある。これらの
抗生物質では、それぞれの基本骨格である６−アミノペ
ニシラン酸や７−アミノセファロスポラン酸に各種の側
鎖を導入することにより、抗菌スペクトルが拡大された
及び（又は）分解酵素に対する安定性が増大された有益
な誘導体が数多く開発されている。
きな発展を遂げた例としては、β−ラククム系抗生物質
であるペニシリンやセファロスポリンがある。これらの
抗生物質では、それぞれの基本骨格である６−アミノペ
ニシラン酸や７−アミノセファロスポラン酸に各種の側
鎖を導入することにより、抗菌スペクトルが拡大された
及び（又は）分解酵素に対する安定性が増大された有益
な誘導体が数多く開発されている。
【０００７】カスガマイシンは、アミノグリコシド系抗
生物質のうちでも特異な構造を有し、その構成成分であ
るα−イノシトール及びカスガミン部分、並びにこれに
結合されるカルボキシホルムイミドイル基側鎖は、いず
れも天然物として非常に希な特異な構造体である。
生物質のうちでも特異な構造を有し、その構成成分であ
るα−イノシトール及びカスガミン部分、並びにこれに
結合されるカルボキシホルムイミドイル基側鎖は、いず
れも天然物として非常に希な特異な構造体である。
【０００８】このようにカスガマイシンは、特異な構造
を有する故にそれの生合成経路についても種々調べられ
ている（「ジャーナル・オブ・アンチビオチックス」第
２１巻、第１８５頁（１９６８年）；同誌第２１巻第１
８２頁（１９６８年）；同誌第２１巻第３５８頁（１９
６８年）］。
を有する故にそれの生合成経路についても種々調べられ
ている（「ジャーナル・オブ・アンチビオチックス」第
２１巻、第１８５頁（１９６８年）；同誌第２１巻第１
８２頁（１９６８年）；同誌第２１巻第３５８頁（１９
６８年）］。
【０００９】しかしながら、カスガマイシンの生合成経
路中で生ずる中間体等に関する従来の知見はカスガマイ
シンの新規誘導体を創製するための知識を充足する上に
必ずしも満足すベきものではない。
路中で生ずる中間体等に関する従来の知見はカスガマイ
シンの新規誘導体を創製するための知識を充足する上に
必ずしも満足すベきものではない。
【００１０】前述の如く、各種の微生物への組換えＤＮ
Ａ技術の実用的な応用の拡大を目的として、種々の選択
マーカーが利用された宿主−ベクター系が開発されてい
るものの、今後さらに宿主細胞として用いられる微生物
種が増加しつつあり、それぞれの微生物種に適合したベ
クターの構築が必要とされている。そのため、ベクター
の選択マーカーとして使用でき、より優れたベクターの
開発につながる新規なマーカーが要望されている。
Ａ技術の実用的な応用の拡大を目的として、種々の選択
マーカーが利用された宿主−ベクター系が開発されてい
るものの、今後さらに宿主細胞として用いられる微生物
種が増加しつつあり、それぞれの微生物種に適合したベ
クターの構築が必要とされている。そのため、ベクター
の選択マーカーとして使用でき、より優れたベクターの
開発につながる新規なマーカーが要望されている。
【００１１】また、前述のごとく、カスガマイシンの特
異な化学構造を利用して、さらに有益な生理活性を有す
るカスガマイシン誘導体の創製などに役立つ知見を得る
ために、カスガマイシンの生合成経路を解析する材料と
して、カスガマイシンの生産に関連する各種の遺伝子を
含むＤＮＡ断片を単離することも有用である。
異な化学構造を利用して、さらに有益な生理活性を有す
るカスガマイシン誘導体の創製などに役立つ知見を得る
ために、カスガマイシンの生合成経路を解析する材料と
して、カスガマイシンの生産に関連する各種の遺伝子を
含むＤＮＡ断片を単離することも有用である。
【００１２】本発明者らは、前記の課題を解決するため
に鋭意検討した。その結果、ストレプトミセス・カスガ
エンシスＭＢ２７３はカスガマイシンに耐性であるが、
このようにカスガマイシン耐性である理由の一つは自己
の生産するカスガマイシンの２´−位のアミノ基をアセ
チル化する酵素を本菌が産生すること及びそれによりカ
スガマイシンを不活性化する能力を有することに由るこ
とを初めて知見した。そして、本菌からそのアセチル化
酵素の産生に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片を分離し
て、目的とする新規な選択マーカーを取得することに成
功した。さらに、これを利用することによりカスガマイ
シンの生産機構に関する知見を得る材料を提供できるも
のと推測し、研究を進めていた。
に鋭意検討した。その結果、ストレプトミセス・カスガ
エンシスＭＢ２７３はカスガマイシンに耐性であるが、
このようにカスガマイシン耐性である理由の一つは自己
の生産するカスガマイシンの２´−位のアミノ基をアセ
チル化する酵素を本菌が産生すること及びそれによりカ
スガマイシンを不活性化する能力を有することに由るこ
とを初めて知見した。そして、本菌からそのアセチル化
酵素の産生に関与する遺伝子を含むＤＮＡ断片を分離し
て、目的とする新規な選択マーカーを取得することに成
功した。さらに、これを利用することによりカスガマイ
シンの生産機構に関する知見を得る材料を提供できるも
のと推測し、研究を進めていた。
【００１３】そして今回その研究の結果として、ストレ
プトミセス・カスガエンシスＭＢ２７３菌株の細胞中の
総ＤＮＡ（但しプラスミドｐＳＫ１およびｐＳＫ２以外
のプラスミドおよび染色体ＤＮＡを含めて）を制限酵素
ＰｓｔＩで切断して得られた各種のＤＮＡ断片のうちか
ら、カスガマイシンをアセチル化して不活性にする酵素
をを産生する遺伝子を内部に保有する約１４ｋｂのＤＮ
Ａ断片をプラスミドに組み込み、かつクローニングする
ことに成功した。
プトミセス・カスガエンシスＭＢ２７３菌株の細胞中の
総ＤＮＡ（但しプラスミドｐＳＫ１およびｐＳＫ２以外
のプラスミドおよび染色体ＤＮＡを含めて）を制限酵素
ＰｓｔＩで切断して得られた各種のＤＮＡ断片のうちか
ら、カスガマイシンをアセチル化して不活性にする酵素
をを産生する遺伝子を内部に保有する約１４ｋｂのＤＮ
Ａ断片をプラスミドに組み込み、かつクローニングする
ことに成功した。
【００１４】したがって本発明によれば、カスガマイシ
ンの２´−位のアミノ基をアセチル化する酵素活性を有
するアセチル化酵素をコードする遺伝子が提供され、さ
らにまた当該遺伝子を含むＤＮＡ断片、及び該ＤＮＡ断
片を含有する組換えプラスミドが提供される。
ンの２´−位のアミノ基をアセチル化する酵素活性を有
するアセチル化酵素をコードする遺伝子が提供され、さ
らにまた当該遺伝子を含むＤＮＡ断片、及び該ＤＮＡ断
片を含有する組換えプラスミドが提供される。
【００１５】更に詳しくは、第１の本発明の要旨とする
ところは、宿主細胞にカスガマイシンをアセチル化する
酵素を産生させる能力を付与し、これにより、宿主細胞
にカスガマイシンを不活性化する能力を付与して宿主細
胞をカスガマイシン耐性とすることを特徴とする、カス
ガマイシンアセチル化酵素をコードする遺伝子にある。
ところは、宿主細胞にカスガマイシンをアセチル化する
酵素を産生させる能力を付与し、これにより、宿主細胞
にカスガマイシンを不活性化する能力を付与して宿主細
胞をカスガマイシン耐性とすることを特徴とする、カス
ガマイシンアセチル化酵素をコードする遺伝子にある。
【００１６】本発明のカスガマイシンアセチル化酵素を
コードする遺伝子（以下では、単にカスガマイシンアセ
チル化酵素遺伝子という）を含有するＤＮＡ断片は、カ
スガマイシンを生産し、且つカスガマイシンをアセチル
化する酵素活性を有する菌の総ＤＮＡに由来するもので
あればよい。そのような菌の例としてストレプトミセス
・カスガエンシスＭＢ２７３（「Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ
ｉｃｓ」第３６巻、９９頁（１９８３））が挙げられ
る。より具体的には、ストレプトミセス・カスガエンシ
スＭＢ２７３より、２度にわたるプロトプラストの再生
を経過させる処理を加えることによって本菌が元来持つ
２種のプラスミドｐＳＫ１とｐＳＫ２を除いたプラスミ
ド除去株が使用される。ストレプトミセス・カスガエン
シスＭＢ２７３由来の、このプラスミド除去株は、スト
レプトミセス・カスガエンシスＭＢ２７３−Ｒ１０８と
命名し、通産省工業技術院微生物技術研究所に微工研菌
寄第１１８７５号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１８７５）として
寄託してある。
コードする遺伝子（以下では、単にカスガマイシンアセ
チル化酵素遺伝子という）を含有するＤＮＡ断片は、カ
スガマイシンを生産し、且つカスガマイシンをアセチル
化する酵素活性を有する菌の総ＤＮＡに由来するもので
あればよい。そのような菌の例としてストレプトミセス
・カスガエンシスＭＢ２７３（「Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ
ｉｃｓ」第３６巻、９９頁（１９８３））が挙げられ
る。より具体的には、ストレプトミセス・カスガエンシ
スＭＢ２７３より、２度にわたるプロトプラストの再生
を経過させる処理を加えることによって本菌が元来持つ
２種のプラスミドｐＳＫ１とｐＳＫ２を除いたプラスミ
ド除去株が使用される。ストレプトミセス・カスガエン
シスＭＢ２７３由来の、このプラスミド除去株は、スト
レプトミセス・カスガエンシスＭＢ２７３−Ｒ１０８と
命名し、通産省工業技術院微生物技術研究所に微工研菌
寄第１１８７５号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１８７５）として
寄託してある。
【００１７】本発明で提供するカスガマイシンアセチル
化酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片のクローニングに用いる
宿主としては、プラスミドベクターによる遺伝子導入系
が確立しており且つ当初はカスガマイシンに感受性を示
すが形質転換によってカスガマイシンに対する耐性を獲
得した菌株を容易に選別することが可能とする種類の菌
が好適である。そのような代表例として大腸菌が挙げら
れる。
化酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片のクローニングに用いる
宿主としては、プラスミドベクターによる遺伝子導入系
が確立しており且つ当初はカスガマイシンに感受性を示
すが形質転換によってカスガマイシンに対する耐性を獲
得した菌株を容易に選別することが可能とする種類の菌
が好適である。そのような代表例として大腸菌が挙げら
れる。
【００１８】他方、ベクタープラスミドとしては、宿主
に用いる菌内にあって安定に増殖可能であって、クロー
ニングサイトを多く持ち、且つそれらクローニングサイ
ト近傍に異種遺伝子を発現させるために必要なプロモー
ターを有する発現べクターが好ましい。そのようなプラ
スミドベクターの具体的な例として、大腸菌を宿主とす
る場合には、市販のプラスミドベクターｐＵＣ１８など
が挙げられる。プラスミドベクターｐＵＣ１８は、内部
にアンピシリン耐性遺伝子とｌａｃＺ遺伝子の２つの選
択マーカーを持ち、さらにマルチプルクローニングサイ
トと呼ばれる外来ＤＮＡの挿入部位がｌａｃＺ遺伝子の
プロモーターに近接して存在し、その部位に挿入された
異種遺伝子をｌａｃＺのプロモーターにより発現させる
ことが可能である。またｌａｃＺ遺伝子のプロモーター
は、イソプロピル−β−１−チオガラクトシド（ＩＰＴ
Ｇ）などの存在下で誘導的に働くという特徴を持つ。
に用いる菌内にあって安定に増殖可能であって、クロー
ニングサイトを多く持ち、且つそれらクローニングサイ
ト近傍に異種遺伝子を発現させるために必要なプロモー
ターを有する発現べクターが好ましい。そのようなプラ
スミドベクターの具体的な例として、大腸菌を宿主とす
る場合には、市販のプラスミドベクターｐＵＣ１８など
が挙げられる。プラスミドベクターｐＵＣ１８は、内部
にアンピシリン耐性遺伝子とｌａｃＺ遺伝子の２つの選
択マーカーを持ち、さらにマルチプルクローニングサイ
トと呼ばれる外来ＤＮＡの挿入部位がｌａｃＺ遺伝子の
プロモーターに近接して存在し、その部位に挿入された
異種遺伝子をｌａｃＺのプロモーターにより発現させる
ことが可能である。またｌａｃＺ遺伝子のプロモーター
は、イソプロピル−β−１−チオガラクトシド（ＩＰＴ
Ｇ）などの存在下で誘導的に働くという特徴を持つ。
【００１９】ここに本発明者らは、宿主として大腸菌Ｊ
Ｍ１０９を用い且つベクターとしてｐＵＣ１８を用いる
系を利用して、ストレプトミセス・カスガエンシスＭＢ
２７３−Ｒ１０８の総ＤＮＡからカスガマイシンアセチ
ル化酵素遺伝子をショットガン法によりクローニングす
ることを試みた。その結果、カスガマイシン耐性を獲得
した大腸菌ＪＭ１０９の形質転換株を得ることに成功
し、またこの形質転換株から、本発明のカスガマイシン
アセチル化酵素遺伝子を含有する添付図面の図１に記載
の制限酵素地図をもつ分子量約１４ｋｂのＰｓｔＩ−Ｐ
ｓｔＩ切断ＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドｐＵＣ１
８−ＫＰ１を分離することに成功した。このプラスミド
ｐＵＣ１８−ＫＰ１の制限酵素地図は添付図面の図２に
示す。宿主にカスガマイシン耐性を付与する遺伝子すな
わちカスガマイシン耐性遺伝子は、分子量約１４ｋｂの
前記ＰｓｔＩ−Ｐｓｔ切断ＤＮＡ断片内に存在し後述す
る如く、嘱望されたカスガマイシンアセチル化酵素遺伝
子であることが見出された。本組換えプラスミドを保持
する大腸菌ＪＭ１０９は大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＣ１８
−ＫＰ１）と命名し、通産省工業技術院微生物技術研究
所に微工研菌寄第１１８７６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１８
７６）として寄託してある。
Ｍ１０９を用い且つベクターとしてｐＵＣ１８を用いる
系を利用して、ストレプトミセス・カスガエンシスＭＢ
２７３−Ｒ１０８の総ＤＮＡからカスガマイシンアセチ
ル化酵素遺伝子をショットガン法によりクローニングす
ることを試みた。その結果、カスガマイシン耐性を獲得
した大腸菌ＪＭ１０９の形質転換株を得ることに成功
し、またこの形質転換株から、本発明のカスガマイシン
アセチル化酵素遺伝子を含有する添付図面の図１に記載
の制限酵素地図をもつ分子量約１４ｋｂのＰｓｔＩ−Ｐ
ｓｔＩ切断ＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドｐＵＣ１
８−ＫＰ１を分離することに成功した。このプラスミド
ｐＵＣ１８−ＫＰ１の制限酵素地図は添付図面の図２に
示す。宿主にカスガマイシン耐性を付与する遺伝子すな
わちカスガマイシン耐性遺伝子は、分子量約１４ｋｂの
前記ＰｓｔＩ−Ｐｓｔ切断ＤＮＡ断片内に存在し後述す
る如く、嘱望されたカスガマイシンアセチル化酵素遺伝
子であることが見出された。本組換えプラスミドを保持
する大腸菌ＪＭ１０９は大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＣ１８
−ＫＰ１）と命名し、通産省工業技術院微生物技術研究
所に微工研菌寄第１１８７６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１８
７６）として寄託してある。
【００２０】以下にこの分子量約１４ｋｂのＰｓｔＩ−
ＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片及びその内部に存在する本発明
のカスガマイシンアセチル化酵素遺伝子すなわちカスガ
マイシン耐性遺伝子について若干の説明を加える。
ＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片及びその内部に存在する本発明
のカスガマイシンアセチル化酵素遺伝子すなわちカスガ
マイシン耐性遺伝子について若干の説明を加える。
【００２１】このＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片
は、添付図面の図１に示した制限酵素切断地図を有す
る。このＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片内部において、カスガ
マイシン耐性遺伝子が黒く塗りつぶした分子量約０．７
ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ切断ＤＮＡ断片内に存在
することは、この約０．７ｋｂのＢａｍＨＩ切断ＤＮＡ
断片をプラスミドｐＵＣ１８上にサブクローニングして
得られた添付図面の図３に記載の組換えプラスミドｐＵ
Ｃ１８−ＫＢ１を持つ大腸菌ＪＭ１０９がカスガマイシ
ンに耐性となることにより明らかとなる。プラスミドｐ
ＵＣ１８−ＫＰ１をもつ大腸菌ＪＭ１０９のカスガマイ
シン耐性は微弱であるが、他方、プラスミドｐＵＣ１８
−ＫＢ１を持つ大腸菌ＪＭ１０９のカスガマイシン耐性
は大幅に高まった。さらにプラスミドｐＵＣ１８−ＫＰ
１またはｐＵＣ１８−ＫＢ１を持つ大腸菌ＪＭ１０９の
カスガマイシン耐性は、どちらもＩＰＴＧ添加条件下で
はカスガマイシン耐性の増強が認められたことより、カ
スガマイシン耐性遺伝子は両組換えプラスミド上でｌａ
ｃＺ遺伝子のプロモーターより発現されていることが示
され、遺伝子の転写方向は添付図面の図１の矢印の方向
であることが判明した。
は、添付図面の図１に示した制限酵素切断地図を有す
る。このＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片内部において、カスガ
マイシン耐性遺伝子が黒く塗りつぶした分子量約０．７
ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ切断ＤＮＡ断片内に存在
することは、この約０．７ｋｂのＢａｍＨＩ切断ＤＮＡ
断片をプラスミドｐＵＣ１８上にサブクローニングして
得られた添付図面の図３に記載の組換えプラスミドｐＵ
Ｃ１８−ＫＢ１を持つ大腸菌ＪＭ１０９がカスガマイシ
ンに耐性となることにより明らかとなる。プラスミドｐ
ＵＣ１８−ＫＰ１をもつ大腸菌ＪＭ１０９のカスガマイ
シン耐性は微弱であるが、他方、プラスミドｐＵＣ１８
−ＫＢ１を持つ大腸菌ＪＭ１０９のカスガマイシン耐性
は大幅に高まった。さらにプラスミドｐＵＣ１８−ＫＰ
１またはｐＵＣ１８−ＫＢ１を持つ大腸菌ＪＭ１０９の
カスガマイシン耐性は、どちらもＩＰＴＧ添加条件下で
はカスガマイシン耐性の増強が認められたことより、カ
スガマイシン耐性遺伝子は両組換えプラスミド上でｌａ
ｃＺ遺伝子のプロモーターより発現されていることが示
され、遺伝子の転写方向は添付図面の図１の矢印の方向
であることが判明した。
【００２２】本発明のカスガマイシン耐性遺伝子が、カ
スガマイシンをアセチル化する酵素をコードして産生す
ることは、次のことから理解される。即ち、ＩＰＴＧ存
在下で培養したプラスミドｐＵＣ１８−ＫＢ１を持つ大
腸菌ＪＭ１０９の菌体より調製した粗酵素液とカスガマ
イシンとをアセチルＣｏＡの存在下で反応させると、シ
ュードモナス・フルオレッセンスに対して示すカスガマ
イシンの抗菌活性が完全に消失することから、上記の粗
酵素液中には、プラスミドｐＵＣ１８−ＫＢ１上にある
カスガマイシン耐性遺伝子より産生されたカスガマイシ
ンアセチル化酵どに対しては耐性とならなかった。この
ことは、カスガマイシンの構造からも予想されるよう
に、本発明の遺伝子より産生されるカスガマイシンアセ
チル化酵素の基質特異性の高さを示すものであり、本発
明の遺伝子を新規な選択マーカーとして含むプラスミド
ベクターを作製すれば、そのベクターを組込まれた形質
転換株はカスガマイシン耐性であることから排他的に選
択することができ、極めて有利である。
スガマイシンをアセチル化する酵素をコードして産生す
ることは、次のことから理解される。即ち、ＩＰＴＧ存
在下で培養したプラスミドｐＵＣ１８−ＫＢ１を持つ大
腸菌ＪＭ１０９の菌体より調製した粗酵素液とカスガマ
イシンとをアセチルＣｏＡの存在下で反応させると、シ
ュードモナス・フルオレッセンスに対して示すカスガマ
イシンの抗菌活性が完全に消失することから、上記の粗
酵素液中には、プラスミドｐＵＣ１８−ＫＢ１上にある
カスガマイシン耐性遺伝子より産生されたカスガマイシ
ンアセチル化酵どに対しては耐性とならなかった。この
ことは、カスガマイシンの構造からも予想されるよう
に、本発明の遺伝子より産生されるカスガマイシンアセ
チル化酵素の基質特異性の高さを示すものであり、本発
明の遺伝子を新規な選択マーカーとして含むプラスミド
ベクターを作製すれば、そのベクターを組込まれた形質
転換株はカスガマイシン耐性であることから排他的に選
択することができ、極めて有利である。
【００２３】これによって、添付図面の図１のＰｓｔＩ
−ＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片内に存在して、宿主である大
腸菌にカスガマイシン耐性を付与する遺伝子は、下式で
示されるカスガマイシンの２´−位のアミノ基のアセチ
ル化を司るカスガマイシンアセチル化酵素の遺伝子と確
認された。
−ＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片内に存在して、宿主である大
腸菌にカスガマイシン耐性を付与する遺伝子は、下式で
示されるカスガマイシンの２´−位のアミノ基のアセチ
ル化を司るカスガマイシンアセチル化酵素の遺伝子と確
認された。
【００２４】従って、第２の本発明によると、放線菌の
ＤＮＡに由来する分子量が約１４ｋｂのＤＮＡ断片であ
って、添付図面の図１に示される制限酵素切断地図を有
し、且つ第１の本発明のカスガマイシンアセチル化酵素
をコードする遺伝子を内部に含有するＤＮＡ断片が提供
される。
ＤＮＡに由来する分子量が約１４ｋｂのＤＮＡ断片であ
って、添付図面の図１に示される制限酵素切断地図を有
し、且つ第１の本発明のカスガマイシンアセチル化酵素
をコードする遺伝子を内部に含有するＤＮＡ断片が提供
される。
【００２５】また、第３の本発明によると、放線菌のＤ
ＮＡに由来して且つ添付図面の図１に示される制限酵素
切断地図を有する分子量が約１４ｋｂのＰｓｔＩ−Ｐｓ
ｔＩ切断ＤＮＡ断片を、制限酵素ＢａｍＨＩで切断して
得られ且つカスガマイシンアセチル化酵素をコードする
遺伝子を内部に含有し、しかも添付図面の図４に示した
塩基配列を有し且つ制限酵素ＳｐｌＩ及びＳａｌＩによ
る酵素切断点を有する分子量が約０．７ｋｂのＤＮＡ断
片又はこれと等価であるＤＮＡ断片が提供される。
ＮＡに由来して且つ添付図面の図１に示される制限酵素
切断地図を有する分子量が約１４ｋｂのＰｓｔＩ−Ｐｓ
ｔＩ切断ＤＮＡ断片を、制限酵素ＢａｍＨＩで切断して
得られ且つカスガマイシンアセチル化酵素をコードする
遺伝子を内部に含有し、しかも添付図面の図４に示した
塩基配列を有し且つ制限酵素ＳｐｌＩ及びＳａｌＩによ
る酵素切断点を有する分子量が約０．７ｋｂのＤＮＡ断
片又はこれと等価であるＤＮＡ断片が提供される。
【００２６】第３の本発明の分子量約０．７ｋｂのＤＮ
Ａ断片は図４の配列表の配列に示された７３４塩基対よ
りなる。ここで「ＤＮＡ断片と等価である」ＤＮＡ断片
とは、該ＤＮＡ断片の有する塩基配列の中でＤＮＡコド
ンの縮重により該ＤＮＡ断片自体のそれと異った塩基配
列をもつに至ったが、ジエノタイプでは同一と認められ
るＤＮＡ断片を含有していることを意味し、特に本発明
ではカスガマイシンをアセチル化する酵素をコードする
塩基配列を内部に含むＤＮＡ断片である点で本発明の約
０．７ｋｂのＤＮＡ断片と均等であるものを意味する。
Ａ断片は図４の配列表の配列に示された７３４塩基対よ
りなる。ここで「ＤＮＡ断片と等価である」ＤＮＡ断片
とは、該ＤＮＡ断片の有する塩基配列の中でＤＮＡコド
ンの縮重により該ＤＮＡ断片自体のそれと異った塩基配
列をもつに至ったが、ジエノタイプでは同一と認められ
るＤＮＡ断片を含有していることを意味し、特に本発明
ではカスガマイシンをアセチル化する酵素をコードする
塩基配列を内部に含むＤＮＡ断片である点で本発明の約
０．７ｋｂのＤＮＡ断片と均等であるものを意味する。
【００２７】本発明がもたらす効果としては、以下のよ
うな効果が期待される。本発明のカスガマイシンアセチ
ル化酵素遺伝子を含有する組換えプラスミドｐＵＣ１８
−ＫＢ１による大腸菌ＪＭ１０９の形質転換株は、カス
ガマイシンに対して高度に耐性となったが、プラスミド
マーカーの選択薬剤として従来より用いられているアミ
ノグリコシド系抗生物質であるカナマイシン、ネオマイ
シン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンなどに対し
ては耐性とならなかった。このことは、カスガマイシン
の構造からも予想されるように、本発明の遺伝子より産
生されるカスガマイシンアセチル化酵素の基質特異性の
高さを示すものであり、本発明の遺伝子を新規な選択マ
ーカーとして含むプラスミドベクターを作製すれば、そ
のベクターを組込まれた形質転換株はカスガマイシン耐
性であることの指標から排他的に選択することができ、
極めて有利である。
うな効果が期待される。本発明のカスガマイシンアセチ
ル化酵素遺伝子を含有する組換えプラスミドｐＵＣ１８
−ＫＢ１による大腸菌ＪＭ１０９の形質転換株は、カス
ガマイシンに対して高度に耐性となったが、プラスミド
マーカーの選択薬剤として従来より用いられているアミ
ノグリコシド系抗生物質であるカナマイシン、ネオマイ
シン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンなどに対し
ては耐性とならなかった。このことは、カスガマイシン
の構造からも予想されるように、本発明の遺伝子より産
生されるカスガマイシンアセチル化酵素の基質特異性の
高さを示すものであり、本発明の遺伝子を新規な選択マ
ーカーとして含むプラスミドベクターを作製すれば、そ
のベクターを組込まれた形質転換株はカスガマイシン耐
性であることの指標から排他的に選択することができ、
極めて有利である。
【００２８】また、本発明の遺伝子より産生される酵素
はカスガマイシンに特異的なアセチル化酵素であること
から、本発明の遺伝子はカスガマイシンの生産に関連し
た遺伝子のひとつ、おそらくは自己耐性に関与した遺伝
子であると推測される。
はカスガマイシンに特異的なアセチル化酵素であること
から、本発明の遺伝子はカスガマイシンの生産に関連し
た遺伝子のひとつ、おそらくは自己耐性に関与した遺伝
子であると推測される。
【００２９】抗生物質の生産には多数の遺伝子の関与が
必要であるが、それらの遺伝子は生産菌の染色体上でク
ラスターを形成し連なって存在していることが、ストレ
プトマイシン〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）第１６４巻、８５頁
（１９８５）〕、ビアラホス〔「モレキュラー・アンド
・ゼネラル・ゼネチックス」（Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇ
ｅｎｅｔ．）第２０５巻、４２頁（１９８６）〕やエリ
スロマイシン〔「バイオテクノロジー」（Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ）第４巻、２２９頁（１９８６）〕など
のいくつかの抗生物質で明らかとなっている。カスガマ
イシンの場合も同様であるものと推測される。第２の本
発明により単離された、カスガマイシンアセチル化酵素
遺伝子を含む約１４ｋｂのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ切断ＤＮ
Ａ断片中には、アセチル化酵素の産生以外にもカスガマ
イシンの生産または生合成経路に関与する各種の遺伝子
が含有されることは十分に考えられる。従って、第２の
本発明のＤＮＡ断片を用いてＤＮＡ組換え技術を駆使す
れば、本発明のＤＮＡ断片内に存在する他のカスガマイ
シン生産関連遺伝子の同定やカスガマイシン生合成閉鎖
変異株の分離及びその変異株の蓄積する生合成中間体の
単離を実現できる可能性がある。その場合に応用できる
ＤＮＡ組換え技術の手法の一つとしては、遺伝子置換法
がある。すなわちｉｎ ｖｉｔｒｏで作成した変異を含
むＤＮＡ断片を組込んだプラスミドをそのＤＮＡ断片の
供与菌に導入し、その菌が持つＤＮＡ組換え能を利用し
て、染色体上の相同領域にその変異を置き換えることに
よって変異株を作成するという手法である。この手法を
用いた具体例としては、ビアラホスの生合成遺伝子に関
する研究〔「ジャーナル・オブ・アンチビオチックス」
（Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）第４１巻、２２６頁
（１９８８）〕がある。
必要であるが、それらの遺伝子は生産菌の染色体上でク
ラスターを形成し連なって存在していることが、ストレ
プトマイシン〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）第１６４巻、８５頁
（１９８５）〕、ビアラホス〔「モレキュラー・アンド
・ゼネラル・ゼネチックス」（Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇ
ｅｎｅｔ．）第２０５巻、４２頁（１９８６）〕やエリ
スロマイシン〔「バイオテクノロジー」（Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ）第４巻、２２９頁（１９８６）〕など
のいくつかの抗生物質で明らかとなっている。カスガマ
イシンの場合も同様であるものと推測される。第２の本
発明により単離された、カスガマイシンアセチル化酵素
遺伝子を含む約１４ｋｂのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ切断ＤＮ
Ａ断片中には、アセチル化酵素の産生以外にもカスガマ
イシンの生産または生合成経路に関与する各種の遺伝子
が含有されることは十分に考えられる。従って、第２の
本発明のＤＮＡ断片を用いてＤＮＡ組換え技術を駆使す
れば、本発明のＤＮＡ断片内に存在する他のカスガマイ
シン生産関連遺伝子の同定やカスガマイシン生合成閉鎖
変異株の分離及びその変異株の蓄積する生合成中間体の
単離を実現できる可能性がある。その場合に応用できる
ＤＮＡ組換え技術の手法の一つとしては、遺伝子置換法
がある。すなわちｉｎ ｖｉｔｒｏで作成した変異を含
むＤＮＡ断片を組込んだプラスミドをそのＤＮＡ断片の
供与菌に導入し、その菌が持つＤＮＡ組換え能を利用し
て、染色体上の相同領域にその変異を置き換えることに
よって変異株を作成するという手法である。この手法を
用いた具体例としては、ビアラホスの生合成遺伝子に関
する研究〔「ジャーナル・オブ・アンチビオチックス」
（Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）第４１巻、２２６頁
（１９８８）〕がある。
【００３０】従って第２の本発明の約１４ｋｂのＤＮＡ
断片は、これまでほとんどなされていないカスガマイシ
ンの生産に関する解析を行うのに利用できる材料とし
て、またカスガマイシンの新規誘導体を創作するのに利
用しうる新しい材料としても極めて有用である。
断片は、これまでほとんどなされていないカスガマイシ
ンの生産に関する解析を行うのに利用できる材料とし
て、またカスガマイシンの新規誘導体を創作するのに利
用しうる新しい材料としても極めて有用である。
【００３１】実施例 １ 組換えプラスミドの調製法
ストレプトミセス・カスガエンシスＭＢ２７３−Ｒ１０
８を、１％グルコース、０．４％ポリペプトン、０．４
％酵母エキス、０．０５％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．
１％Ｋ2 ＨＰＯ4 、０．０５％グリシンよりなる組成の
培地２５ｍｌを分注した１００ｍｌ容量の坂口フラスコ
に接種し、２７℃で２日間振盪培養した。この培養物を
種として、５００ｍｌ容量の坂口フラスコに分注した
０．４％グリセロール、０．２％ポリペプトン、０．４
％酵母エキス、０．０５％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．
２％ＫＨ2 ＰＯ4 、０．８％Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2
Ｏ、０．３％グリシンよりなる組成の培地１００ｍｌに
２％量で接種し、２７℃で２４時間振盪培養した。この
培養液から低速遠心で菌体を集め、この菌体から岡西ら
の方法〔「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー」
（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）第１０４巻、第１０８６
頁（１９７０）〕に準じて全ＤＮＡを抽出・精製した後
に供与体ＤＮＡとした。
８を、１％グルコース、０．４％ポリペプトン、０．４
％酵母エキス、０．０５％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．
１％Ｋ2 ＨＰＯ4 、０．０５％グリシンよりなる組成の
培地２５ｍｌを分注した１００ｍｌ容量の坂口フラスコ
に接種し、２７℃で２日間振盪培養した。この培養物を
種として、５００ｍｌ容量の坂口フラスコに分注した
０．４％グリセロール、０．２％ポリペプトン、０．４
％酵母エキス、０．０５％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．
２％ＫＨ2 ＰＯ4 、０．８％Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2
Ｏ、０．３％グリシンよりなる組成の培地１００ｍｌに
２％量で接種し、２７℃で２４時間振盪培養した。この
培養液から低速遠心で菌体を集め、この菌体から岡西ら
の方法〔「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー」
（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．）第１０４巻、第１０８６
頁（１９７０）〕に準じて全ＤＮＡを抽出・精製した後
に供与体ＤＮＡとした。
【００３２】このようにして得られた供与体ＤＮＡ２．
５μｇ及び市販のベクタープラスミドｐＵＣ１８
（〔株〕ニッポンジーン製）１μｇをそれぞれ３０単位
と１５単位の制限酵素ＰｓｔＩ（〔株〕ニッポンジーン
社製）と３７℃で２時間反応させて切断した。これらの
反応液にフェノールを添加して酵素ＰｓｔＩを失活さ
せ、反応を終了させた。
５μｇ及び市販のベクタープラスミドｐＵＣ１８
（〔株〕ニッポンジーン製）１μｇをそれぞれ３０単位
と１５単位の制限酵素ＰｓｔＩ（〔株〕ニッポンジーン
社製）と３７℃で２時間反応させて切断した。これらの
反応液にフェノールを添加して酵素ＰｓｔＩを失活さ
せ、反応を終了させた。
【００３３】この両反応液を混合し、３モル酢酸ナトリ
ウム溶液（酢酸でｐＨ５．２に調整）を１／１０量加
え、さらに冷エタノールを２倍量加えて、−２０℃で一
夜保置した後、１０，０００回転で１０分間遠心分離
し、ＤＮＡ断片を沈殿物として回収した。
ウム溶液（酢酸でｐＨ５．２に調整）を１／１０量加
え、さらに冷エタノールを２倍量加えて、−２０℃で一
夜保置した後、１０，０００回転で１０分間遠心分離
し、ＤＮＡ断片を沈殿物として回収した。
【００３４】回収したＤＮＡ断片をＤＮＡ溶解用ＤＳＢ
緩衝液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、
１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ］４５
μｌに溶解した。このＤＮＡ溶液に１０倍濃度のリガー
ゼ反応用緩衝液［６６０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．６）、６６ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１００ｍＭジチオス
レイトール、５ｍＭ ＡＴＰ］の５μｌと、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼの１μｌ（３７５単位）を加え、１０℃で２０
時間反応させ、ＤＮＡ断片の連結を行った。このように
してプラスミドｐＵＣ１８のＰｓｔＩ切断片に、ストレ
プトミセス・カスガエンシスＭＢ２７３−Ｒ１０８の全
ＤＮＡのＰｓｔＩ切断片を組込んで組換えプラスミドの
混合物を調製した。
緩衝液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、
１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ］４５
μｌに溶解した。このＤＮＡ溶液に１０倍濃度のリガー
ゼ反応用緩衝液［６６０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．６）、６６ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１００ｍＭジチオス
レイトール、５ｍＭ ＡＴＰ］の５μｌと、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼの１μｌ（３７５単位）を加え、１０℃で２０
時間反応させ、ＤＮＡ断片の連結を行った。このように
してプラスミドｐＵＣ１８のＰｓｔＩ切断片に、ストレ
プトミセス・カスガエンシスＭＢ２７３−Ｒ１０８の全
ＤＮＡのＰｓｔＩ切断片を組込んで組換えプラスミドの
混合物を調製した。
【００３５】実施例 ２ 形質転換と形質転換株の選別
上記の実施例１で得た組換えプラスミドの混合物から目
的の組換えプラスミドを取得するために、大腸菌ＪＭ１
０９のコンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌ
ｌ）にこの組換えプラスミドの混合物を導入した。以下
にその操作手順の詳細を記す。
的の組換えプラスミドを取得するために、大腸菌ＪＭ１
０９のコンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｃｅｌ
ｌ）にこの組換えプラスミドの混合物を導入した。以下
にその操作手順の詳細を記す。
【００３６】大腸菌ＪＭ１０９を、Ｌ字管に分注したＹ
Ｔ培地（０．５％酵母エキス，０．８％バクトトリプト
ン，０．５％ＮａＣｌ）５ｍｌに接種し、３７℃で一夜
振盪培養した。この培養液０．５ｍｌを、新鮮なＹＴ培
地を５０ｍｌ分注した５００ｍｌ容三角フラスコ加え
て、３７℃で２時間１０分振盪培養した。この培養液２
０ｍｌから遠心分離で集めた菌体よりコンピテントセル
を調製するために１０ｍｌの５０ｍＭ ＣａＣｌ2 溶液
に懸濁し、１５分間氷水中に静置した。この懸濁液を遠
心分離し、集めた菌体を２ｍｌの５０ｍＭ ＣａＣｌ2
溶液に懸濁し氷水中に静置した。
Ｔ培地（０．５％酵母エキス，０．８％バクトトリプト
ン，０．５％ＮａＣｌ）５ｍｌに接種し、３７℃で一夜
振盪培養した。この培養液０．５ｍｌを、新鮮なＹＴ培
地を５０ｍｌ分注した５００ｍｌ容三角フラスコ加え
て、３７℃で２時間１０分振盪培養した。この培養液２
０ｍｌから遠心分離で集めた菌体よりコンピテントセル
を調製するために１０ｍｌの５０ｍＭ ＣａＣｌ2 溶液
に懸濁し、１５分間氷水中に静置した。この懸濁液を遠
心分離し、集めた菌体を２ｍｌの５０ｍＭ ＣａＣｌ2
溶液に懸濁し氷水中に静置した。
【００３７】このコンピテントセルの懸濁液４００μｌ
に実施例１で得た組換えプラスミド混合物の溶液２０μ
ｌを加え、氷水中に３０分静置し形質転換を行った。次
いで３７℃で３分間加温した後、再度、１０分間氷水中
に静置した。これにＹＴ培地を１．６ｍｌ加えて３７℃
で３０分間静置した。
に実施例１で得た組換えプラスミド混合物の溶液２０μ
ｌを加え、氷水中に３０分静置し形質転換を行った。次
いで３７℃で３分間加温した後、再度、１０分間氷水中
に静置した。これにＹＴ培地を１．６ｍｌ加えて３７℃
で３０分間静置した。
【００３８】カスガマイシンに耐性となった形質転換株
の選別は以下のように行った。選択培地として５０μｇ
／ｍｌのアンピシリン・Ｎａと３００μｇ／ｍｌのカス
ガマイシン・ＨＣｌを含有するＹＴ寒天培地を９ｃｍ経
のシャーレに２０枚用意し、この寒天培地１枚につき、
上記の形質転換した菌の懸濁液１００μｌと２００ｍＭ
ＩＰＴＧ溶液５０μｌを同時に塗布した。塗布後、該
寒天培地を３７℃で４２時間培養して、カスガマイシン
耐性形質転換株を選別した。
の選別は以下のように行った。選択培地として５０μｇ
／ｍｌのアンピシリン・Ｎａと３００μｇ／ｍｌのカス
ガマイシン・ＨＣｌを含有するＹＴ寒天培地を９ｃｍ経
のシャーレに２０枚用意し、この寒天培地１枚につき、
上記の形質転換した菌の懸濁液１００μｌと２００ｍＭ
ＩＰＴＧ溶液５０μｌを同時に塗布した。塗布後、該
寒天培地を３７℃で４２時間培養して、カスガマイシン
耐性形質転換株を選別した。
【００３９】実施例 ３ 形質転換株の持つプラスミド
の抽出と解析 実施例２に記載した如く選択培地上でカスガマイシン耐
性となった形質転換株を選別した結果、４株のカスガマ
イシン耐性株の出現が認められた。これらの耐性株の持
つプラスミドの大きさなどを調べるために、以下のよう
にして耐性株からプラスミドを抽出した。
の抽出と解析 実施例２に記載した如く選択培地上でカスガマイシン耐
性となった形質転換株を選別した結果、４株のカスガマ
イシン耐性株の出現が認められた。これらの耐性株の持
つプラスミドの大きさなどを調べるために、以下のよう
にして耐性株からプラスミドを抽出した。
【００４０】４株の耐性株のそれぞれをＬ字管に分注し
た５ｍｌのＹＴ培地（５０μｇ／ｍｌのアンピシリンＮ
ａを含有）に接種し、３７℃で一夜振盪培養した。遠心
分離によって集めた菌体をＴＥＳ緩衝液（２５ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），２５ｍＭ ＮａＣｌ，
２５ｍＭ ＥＤＴＡ・３Ｎａ）２ｍｌに懸濁・洗浄し
て、再度、遠心分離で菌体を集め２倍濃度のＴＥＳ緩衝
液０．４５ｍｌによって懸濁した。この懸濁液に４０ｍ
ｇ／ｍｌの卵白リゾチーム溶液２５μｌと５ｍｇ／ｍｌ
のリボヌクレアーゼ溶液１０μｌを加えて室温で３０分
静置したのちに、溶菌用溶液（２％ドデシル硫酸ナトリ
ウム，０．１Ｍ ＥＤＴＡ・３Ｎａ，０．５Ｎ ＮａＯ
Ｈ）の０．２５ｍｌを加えて撹拌・混合して溶菌した。
次いでこれに３Ｍ酢酸を６２．５μｌ加えて中和し、さ
らにフェノール−クロロホルム溶液（０．２Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で飽和したフェノールとイソ
アミルアルコールを４％含むクロロホルムを１：１で混
合した溶液）の０．８ｍｌを加えて撹拌・混合したのち
遠心分離を行い、その上層を分取し、ＤＳＢ緩衝液中で
透析して、プラスミド抽出液を得た。
た５ｍｌのＹＴ培地（５０μｇ／ｍｌのアンピシリンＮ
ａを含有）に接種し、３７℃で一夜振盪培養した。遠心
分離によって集めた菌体をＴＥＳ緩衝液（２５ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），２５ｍＭ ＮａＣｌ，
２５ｍＭ ＥＤＴＡ・３Ｎａ）２ｍｌに懸濁・洗浄し
て、再度、遠心分離で菌体を集め２倍濃度のＴＥＳ緩衝
液０．４５ｍｌによって懸濁した。この懸濁液に４０ｍ
ｇ／ｍｌの卵白リゾチーム溶液２５μｌと５ｍｇ／ｍｌ
のリボヌクレアーゼ溶液１０μｌを加えて室温で３０分
静置したのちに、溶菌用溶液（２％ドデシル硫酸ナトリ
ウム，０．１Ｍ ＥＤＴＡ・３Ｎａ，０．５Ｎ ＮａＯ
Ｈ）の０．２５ｍｌを加えて撹拌・混合して溶菌した。
次いでこれに３Ｍ酢酸を６２．５μｌ加えて中和し、さ
らにフェノール−クロロホルム溶液（０．２Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で飽和したフェノールとイソ
アミルアルコールを４％含むクロロホルムを１：１で混
合した溶液）の０．８ｍｌを加えて撹拌・混合したのち
遠心分離を行い、その上層を分取し、ＤＳＢ緩衝液中で
透析して、プラスミド抽出液を得た。
【００４１】４株のカスガマイシン耐性株より抽出した
プラスミドをアガロースゲル電気泳動によって調査した
結果、４株のうちの２株より抽出した２つの組換えプラ
スミドは、ベクターに用いたプラスミドｐＵＣ１８より
明らかに大きな組換えプラスミドであった。
プラスミドをアガロースゲル電気泳動によって調査した
結果、４株のうちの２株より抽出した２つの組換えプラ
スミドは、ベクターに用いたプラスミドｐＵＣ１８より
明らかに大きな組換えプラスミドであった。
【００４２】この２つの組換えプラスミドをＰｓｔＩや
ＢａｍＨＩなどの各種の制限酵素の単独もしくは複数で
切断した際に生じる種々のＤＮＡ断片の大きさを測定し
制限酵素切断点の位置を解析した結果、上記の両方の組
換えプラスミドは添付図面図１に記載の分子量約１４ｋ
ｂのＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片を共通に含有し且つ同じ方
向に組込でいる添付図面図２に記載の制限酵素地図をも
っ同一の組換えプラスミド（ｐＵＣ１８−ＫＰ１と命
名）であった。
ＢａｍＨＩなどの各種の制限酵素の単独もしくは複数で
切断した際に生じる種々のＤＮＡ断片の大きさを測定し
制限酵素切断点の位置を解析した結果、上記の両方の組
換えプラスミドは添付図面図１に記載の分子量約１４ｋ
ｂのＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片を共通に含有し且つ同じ方
向に組込でいる添付図面図２に記載の制限酵素地図をも
っ同一の組換えプラスミド（ｐＵＣ１８−ＫＰ１と命
名）であった。
【００４３】この約１４ｋｂのＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片
の内部にカスガマイシン耐性遺伝子が存在することは、
プラスミドｐＵＣ１８−ＫＰ１による再形質転換によっ
て得られた大腸菌ＪＭ１０９アンピシリン耐性形質転換
株がすべてカスガマイシン耐性になったことから確認さ
れた。さらに、１４ｋｂのＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片をＢ
ａｍＨＩで切断して得られた０．７ｋｂのＢａｍＨＩ切
断ＤＮＡ断片（添付図面第１図の黒塗りの部分）を後述
の如くサブクローニングして添付図面図の図３記載の組
換えプラスミドｐＵＣ１８−ＫＢ１を得たが、このｐＵ
Ｃ１８−ＫＢ１が大腸菌ＪＭ１０９に強いカスガマイシ
ン耐性を付与することからも確認された。
の内部にカスガマイシン耐性遺伝子が存在することは、
プラスミドｐＵＣ１８−ＫＰ１による再形質転換によっ
て得られた大腸菌ＪＭ１０９アンピシリン耐性形質転換
株がすべてカスガマイシン耐性になったことから確認さ
れた。さらに、１４ｋｂのＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片をＢ
ａｍＨＩで切断して得られた０．７ｋｂのＢａｍＨＩ切
断ＤＮＡ断片（添付図面第１図の黒塗りの部分）を後述
の如くサブクローニングして添付図面図の図３記載の組
換えプラスミドｐＵＣ１８−ＫＢ１を得たが、このｐＵ
Ｃ１８−ＫＢ１が大腸菌ＪＭ１０９に強いカスガマイシ
ン耐性を付与することからも確認された。
【００４４】実施例 ４ 組換えプラスミドｐＵＣ１８
−ＫＢ１の調製 組換えプラスミドｐＵＣ１８−ＫＰ１とプラスミドベク
ターｐＵＣ１８をそれぞれ別々に制限酵素ＢａｍＨＩで
完全切断したのちに、混合してエタノール沈澱を行っ
た。遠心分離により回収したＤＮＡ断片をＤＳＢ緩衝液
に溶解し、１０倍濃度のリガーゼ反応用緩衝液とＴ４リ
ガーゼを加えて反応させた。この反応によって、実施例
２に記した方法により大腸菌ＪＭ１０９のコンピテント
セルを形質転換した。
−ＫＢ１の調製 組換えプラスミドｐＵＣ１８−ＫＰ１とプラスミドベク
ターｐＵＣ１８をそれぞれ別々に制限酵素ＢａｍＨＩで
完全切断したのちに、混合してエタノール沈澱を行っ
た。遠心分離により回収したＤＮＡ断片をＤＳＢ緩衝液
に溶解し、１０倍濃度のリガーゼ反応用緩衝液とＴ４リ
ガーゼを加えて反応させた。この反応によって、実施例
２に記した方法により大腸菌ＪＭ１０９のコンピテント
セルを形質転換した。
【００４５】９ｃｍ径のシャーレに作製した５０μｇ／
ｍｌのアンピシリン・Ｎａを含有するＹＴ寒天培地１枚
につき、上記の形質転換された菌懸濁液１００μｌ，２
００ｍＭ ＩＰＴＧ溶液１０μｌ及び５％Ｘ−Ｇａｌ溶
液１０μｌを同時に塗布し、３７℃で１８時間培養し
た。この培養後に出現したアンピシリン耐性株のなかか
ら、白色のコロニーを形成するものを選別し、カスガマ
イシン耐性を調査した。カスガマイシンに耐性を示した
形質転換株について実施例３に記した方法でプラスミド
を抽出し、アガロースゲル電気泳動によってその大きさ
を調べた。
ｍｌのアンピシリン・Ｎａを含有するＹＴ寒天培地１枚
につき、上記の形質転換された菌懸濁液１００μｌ，２
００ｍＭ ＩＰＴＧ溶液１０μｌ及び５％Ｘ−Ｇａｌ溶
液１０μｌを同時に塗布し、３７℃で１８時間培養し
た。この培養後に出現したアンピシリン耐性株のなかか
ら、白色のコロニーを形成するものを選別し、カスガマ
イシン耐性を調査した。カスガマイシンに耐性を示した
形質転換株について実施例３に記した方法でプラスミド
を抽出し、アガロースゲル電気泳動によってその大きさ
を調べた。
【００４６】検出されたプラスミドのうち最も小さいプ
ラスミドについてＢａｍＨＩなどの制限酵素で切断して
解析した結果、該プラスミドはｐＵＣ１８に先の１４ｋ
ｂのＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片内の０．７ｋｂのＢａｍＨ
Ｉ切断ＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミド（ｐＵ
Ｃ１８−ＫＢ１と命名、添付図面の図３に記載）であっ
た。プラスミドｐＵＣ１８−ＫＢ１を持つ大腸菌ＪＭ１
０９は、極めて強カスガマイシン耐性を示した。たとえ
ば、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換株に対するＭ９最少寒
天培地上でのカスガマイシンの最少阻止濃度（ＭＩＣ）
をＩＰＴＧ存在下で測定すると、ｐＵＣ１８による形質
転換株に対するカスガマイシンのＭＩＣは２０μｇ／ｍ
ｌであるのに対して、ｐＵＣ１８−ＫＢ１による形質転
換株に対するカスガマイシンのＭＩＣは、２ｍｇ／ｍｌ
以上であった。
ラスミドについてＢａｍＨＩなどの制限酵素で切断して
解析した結果、該プラスミドはｐＵＣ１８に先の１４ｋ
ｂのＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片内の０．７ｋｂのＢａｍＨ
Ｉ切断ＤＮＡ断片が挿入された組換えプラスミド（ｐＵ
Ｃ１８−ＫＢ１と命名、添付図面の図３に記載）であっ
た。プラスミドｐＵＣ１８−ＫＢ１を持つ大腸菌ＪＭ１
０９は、極めて強カスガマイシン耐性を示した。たとえ
ば、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換株に対するＭ９最少寒
天培地上でのカスガマイシンの最少阻止濃度（ＭＩＣ）
をＩＰＴＧ存在下で測定すると、ｐＵＣ１８による形質
転換株に対するカスガマイシンのＭＩＣは２０μｇ／ｍ
ｌであるのに対して、ｐＵＣ１８−ＫＢ１による形質転
換株に対するカスガマイシンのＭＩＣは、２ｍｇ／ｍｌ
以上であった。
【００４７】実施例 ５ 本発明のカスガマイシン耐性
遺伝子による耐性機構 大腸菌ＪＭ１０９の形質転換株より調製した酵素抽出液
を用いて、本発明のカスガマイシン耐性遺伝子による耐
性機構の解析を以下のように行った。プラスミドベクタ
ーｐＵＣ１８及び組換えプラスミドｐＵＣ１８−ＫＢ１
をそれぞれ持つ大腸菌ＪＭ１０９を、５０μｇ／ｍｌの
アンピシリンＮａを含むＹＴ培地５ｍｌを分注したＬ字
管に接種し、３７℃で一夜振盪培養した。この培養液
０．５ｍｌを５００ｍｌ容量の三角フラスコに分注した
５０ｍｌの新鮮なＹＴ培地に加え、３７℃で振盪培養し
た。１時間後にＩＰＴＧを２ｍＭになるように添加し、
さらに３時間培養を継続した。６，０００回転１０分間
遠心分離して菌体を集め、０．３ｍｇ／ｍｌのジチオス
レイトールを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で洗浄後、同緩衝液２ｍｌに懸濁し、氷冷下超
音波にて菌体を破砕した。この菌体破砕液を１２，００
０回転で１０分間遠心分離して得られた上清を、２０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で透析して、無
細胞酵素抽出液とした。
遺伝子による耐性機構 大腸菌ＪＭ１０９の形質転換株より調製した酵素抽出液
を用いて、本発明のカスガマイシン耐性遺伝子による耐
性機構の解析を以下のように行った。プラスミドベクタ
ーｐＵＣ１８及び組換えプラスミドｐＵＣ１８−ＫＢ１
をそれぞれ持つ大腸菌ＪＭ１０９を、５０μｇ／ｍｌの
アンピシリンＮａを含むＹＴ培地５ｍｌを分注したＬ字
管に接種し、３７℃で一夜振盪培養した。この培養液
０．５ｍｌを５００ｍｌ容量の三角フラスコに分注した
５０ｍｌの新鮮なＹＴ培地に加え、３７℃で振盪培養し
た。１時間後にＩＰＴＧを２ｍＭになるように添加し、
さらに３時間培養を継続した。６，０００回転１０分間
遠心分離して菌体を集め、０．３ｍｇ／ｍｌのジチオス
レイトールを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で洗浄後、同緩衝液２ｍｌに懸濁し、氷冷下超
音波にて菌体を破砕した。この菌体破砕液を１２，００
０回転で１０分間遠心分離して得られた上清を、２０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で透析して、無
細胞酵素抽出液とした。
【００４８】このように調製した２種の酵素抽出液のそ
れぞれ１６０μｌに、２００μｇ／ｍｌのカスガマイシ
ン塩酸塩溶液を２０μｌ加え、さらに５ｍｇ／ｍｌのア
セチルＣｏＡ溶液を２０μｌ加えて、３０℃２時間反応
させた。対照としてアセチルＣｏＡ溶液の代りに蒸留水
を加えたものを用意した。この反応結果をシュードモナ
ス・フルオレッセンスの生育阻止を指標としたペーパー
ディスク検定によるバイオアッセイで調ベた。
れぞれ１６０μｌに、２００μｇ／ｍｌのカスガマイシ
ン塩酸塩溶液を２０μｌ加え、さらに５ｍｇ／ｍｌのア
セチルＣｏＡ溶液を２０μｌ加えて、３０℃２時間反応
させた。対照としてアセチルＣｏＡ溶液の代りに蒸留水
を加えたものを用意した。この反応結果をシュードモナ
ス・フルオレッセンスの生育阻止を指標としたペーパー
ディスク検定によるバイオアッセイで調ベた。
【００４９】すなわち検定菌であるシュードモナス・フ
ルオレッセンスを含んだ０．１％グルコース，０．５％
ポリペプトン，０．２％酵母エキス，１．２％バクトア
ガーよりなる組成の寒天培地の上に、前記の反応液５０
μｌをしみこませた径８ｍｍのペーパーディスクをの
せ、２７℃で一夜培養して、シュードモナス・フルオレ
ッセンスの生育阻止を観察した。
ルオレッセンスを含んだ０．１％グルコース，０．５％
ポリペプトン，０．２％酵母エキス，１．２％バクトア
ガーよりなる組成の寒天培地の上に、前記の反応液５０
μｌをしみこませた径８ｍｍのペーパーディスクをの
せ、２７℃で一夜培養して、シュードモナス・フルオレ
ッセンスの生育阻止を観察した。
【００５０】その結果、プラスミドｐＵＣ１８を持つ大
腸菌ＪＭ１０９より調製した酵素抽出液の場合には、ア
セチルＣｏＡの有無にかかわらず、反応後のカスガマイ
シンによる検定菌の生育阻止にほとんど変化は認められ
なかった。一方、組換プラスミドｐＵＣ１８−ＫＢ１を
持つ大腸菌ＪＭ１０９より調製した酵素抽出液の場合に
は、アセチルＣｏＡの添加条件下においてカスガマイシ
ンによる検定菌の生育阻止の消失が明確に認められた。
腸菌ＪＭ１０９より調製した酵素抽出液の場合には、ア
セチルＣｏＡの有無にかかわらず、反応後のカスガマイ
シンによる検定菌の生育阻止にほとんど変化は認められ
なかった。一方、組換プラスミドｐＵＣ１８−ＫＢ１を
持つ大腸菌ＪＭ１０９より調製した酵素抽出液の場合に
は、アセチルＣｏＡの添加条件下においてカスガマイシ
ンによる検定菌の生育阻止の消失が明確に認められた。
【００５１】この事実は、組換えプラスミドｐＵＣ１８
−ＫＢ１の導入によって大腸菌ＪＭ１０９が、カスガマ
イシンをアセチル化することによって不活性化する酵素
を産生する能力を獲得したことを意味し、本発明の約１
４ｋｂのＤＮＡ断片または約０．７ｋｂのＤＮＡ断片中
に存在するカスガマイシン耐性遺伝子は、カスガマイシ
ンアセチル化酵素をコードしていることを示すものであ
る。
−ＫＢ１の導入によって大腸菌ＪＭ１０９が、カスガマ
イシンをアセチル化することによって不活性化する酵素
を産生する能力を獲得したことを意味し、本発明の約１
４ｋｂのＤＮＡ断片または約０．７ｋｂのＤＮＡ断片中
に存在するカスガマイシン耐性遺伝子は、カスガマイシ
ンアセチル化酵素をコードしていることを示すものであ
る。
【図１】図１は、本発明のカスガマイシンアセチル化酵
素遺伝子を内部に含有する分子量約１４ｋｂのＰｓｔＩ
−ＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片の詳細な制限酵素切断地図で
ある。黒塗りの部分は、カスガマイシンアセチル化酵素
遺伝子の存在領域を表わしている。なお、この黒塗りの
領域内には、図３で示したような位置にＳａｌＩ切断点
とＳｐｌＩ切断点が存在する。
素遺伝子を内部に含有する分子量約１４ｋｂのＰｓｔＩ
−ＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片の詳細な制限酵素切断地図で
ある。黒塗りの部分は、カスガマイシンアセチル化酵素
遺伝子の存在領域を表わしている。なお、この黒塗りの
領域内には、図３で示したような位置にＳａｌＩ切断点
とＳｐｌＩ切断点が存在する。
【図２】図２は、図１のＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ切断ＤＮＡ
断片を組込んだ組換えプラスミドｐＵＣ１８−ＫＰ１の
制限酵素切断地図である。一部の制限酵素切断点の記載
は省略した。黒塗りの部分は、カスガマイシンアセチル
化酵素遺伝子の存在領域を表わしている。
断片を組込んだ組換えプラスミドｐＵＣ１８−ＫＰ１の
制限酵素切断地図である。一部の制限酵素切断点の記載
は省略した。黒塗りの部分は、カスガマイシンアセチル
化酵素遺伝子の存在領域を表わしている。
【図３】図３は、図１の黒塗りの領域の分子量約０．７
ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ切断ＤＮＡ断片をサブク
ローニングして得た組換えプラスミドｐＵＣ１８−ＫＢ
１の制限酵素切断地図である。
ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ切断ＤＮＡ断片をサブク
ローニングして得た組換えプラスミドｐＵＣ１８−ＫＢ
１の制限酵素切断地図である。
【図４】図４は、本発明のカスガマイシンアセチル化酵
素遺伝子のコード領域、即ち図１で矢印を付した黒塗り
の領域の塩基配列である。この図４の塩基配列の左上端
から右下端への配列が図１〜図３の黒塗りの領域に記し
た矢印の方向に相当する。図４中に制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ、ＳｐｌＩ、ＳａｌＩによる切断点又は部位をアンダ
ーラインを付して表わし、また、開始コドンと終止コド
ンを二重のアンダーラインを付して表わした。
素遺伝子のコード領域、即ち図１で矢印を付した黒塗り
の領域の塩基配列である。この図４の塩基配列の左上端
から右下端への配列が図１〜図３の黒塗りの領域に記し
た矢印の方向に相当する。図４中に制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ、ＳｐｌＩ、ＳａｌＩによる切断点又は部位をアンダ
ーラインを付して表わし、また、開始コドンと終止コド
ンを二重のアンダーラインを付して表わした。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成３年１０月８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００６】一方、抗生物質の誘導体の創製によって大
きな発展を遂げた例としては、β−ラクタム系抗生物質
であるペニシリンやセファロスポリンがある。これらの
抗生物質では、それぞれの基本骨格である６−アミノペ
ニシラン酸や７−アミノセファロスポラン酸に各種の側
鎖を導入することにより、抗菌スペクトルが拡大された
及び（又は）分解酵素に対する安定性が増大された有益
な誘導体が数多く開発されている。
きな発展を遂げた例としては、β−ラクタム系抗生物質
であるペニシリンやセファロスポリンがある。これらの
抗生物質では、それぞれの基本骨格である６−アミノペ
ニシラン酸や７−アミノセファロスポラン酸に各種の側
鎖を導入することにより、抗菌スペクトルが拡大された
及び（又は）分解酵素に対する安定性が増大された有益
な誘導体が数多く開発されている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００７】カスガマイシンは、アミノグリコシド系抗
生物質のうちでも特異な構造を有し、その構成成分であ
るｄ−イノシトール及びカスガミン部分、並びにこれに
結合されるカルボキシホルムイミドイル基側鎖は、いず
れも天然物として非常に希な特異な構造体である。
生物質のうちでも特異な構造を有し、その構成成分であ
るｄ−イノシトール及びカスガミン部分、並びにこれに
結合されるカルボキシホルムイミドイル基側鎖は、いず
れも天然物として非常に希な特異な構造体である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１３】そして今回その研究の結果として、ストレ
プトミセス・カスガエンシスＭＢ２７３菌株の細胞中の
総ＤＮＡ（但しプラスミドｐＳＫ１およびｐＳＫ２以外
のプラスミドおよび染色体ＤＮＡを含めて）を制限酵素
ＰｓｔＩで切断して得られた各種のＤＮＡ断片のうちか
ら、カスガマイシンをアセチル化して不活性にする酵素
を産生する遺伝子を内部に保有する約１４ｋｂのＤＮＡ
断片をプラスミドに組み込み、かつクローニングするこ
とに成功した。
プトミセス・カスガエンシスＭＢ２７３菌株の細胞中の
総ＤＮＡ（但しプラスミドｐＳＫ１およびｐＳＫ２以外
のプラスミドおよび染色体ＤＮＡを含めて）を制限酵素
ＰｓｔＩで切断して得られた各種のＤＮＡ断片のうちか
ら、カスガマイシンをアセチル化して不活性にする酵素
を産生する遺伝子を内部に保有する約１４ｋｂのＤＮＡ
断片をプラスミドに組み込み、かつクローニングするこ
とに成功した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１７】本発明で提供するカスガマイシンアセチル
化酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片のクローニングに用いる
宿主としては、プラスミドベクターによる遺伝子導入系
が確立しており且つ当初はカスガマイシンに感受性を示
すが形質転換によってカスガマイシンに対する耐性を獲
得した菌株を容易に選別することを可能とする種類の菌
が好適である。そのような代表例として大腸菌が挙げら
れる。
化酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片のクローニングに用いる
宿主としては、プラスミドベクターによる遺伝子導入系
が確立しており且つ当初はカスガマイシンに感受性を示
すが形質転換によってカスガマイシンに対する耐性を獲
得した菌株を容易に選別することを可能とする種類の菌
が好適である。そのような代表例として大腸菌が挙げら
れる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１９】ここに本発明者らは、宿主として大腸菌Ｊ
Ｍ１０９を用い且つベクターとしてｐＵＣ１８を用いる
系を利用して、ストレプトミセス・カスガエンシスＭＢ
２７３−Ｒ１０８の総ＤＮＡからカスガマイシンアセチ
ル化酵素遺伝子をショットガン法によりクローニングす
ることを試みた。その結果、カスガマイシン耐性を獲得
した大腸菌ＪＭ１０９の形質転換株を得ることに成功
し、またこの形質転換株から、本発明のカスガマイシン
アセチル化酵素遺伝子を含有する添付図面の図１に記載
の制限酵素地図をもつ分子量約１４ｋｂのＰｓｔＩ−Ｐ
ｓｔＩ切断ＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドｐＵＣ１
８−ＫＰ１を分離することに成功した。このプラスミド
ｐＵＣ１８−ＫＰ１の制限酵素地図は添付図面の図２に
示す。宿主にカスガマイシン耐性を付与する遺伝子すな
わちカスガマイシン耐性遺伝子は、分子量約１４ｋｂの
前記ＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片内に存在し、後
述する如く、嘱望されたカスガマイシンアセチル化酵素
遺伝子であることが見出された。本組換えプラスミドを
保持する大腸菌ＪＭ１０９は大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＣ
１８−ＫＰ１）と命名し、通産省工業技術院微生物技術
研究所に微工研菌寄第１１８７６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１
１８７６）として寄託してある。
Ｍ１０９を用い且つベクターとしてｐＵＣ１８を用いる
系を利用して、ストレプトミセス・カスガエンシスＭＢ
２７３−Ｒ１０８の総ＤＮＡからカスガマイシンアセチ
ル化酵素遺伝子をショットガン法によりクローニングす
ることを試みた。その結果、カスガマイシン耐性を獲得
した大腸菌ＪＭ１０９の形質転換株を得ることに成功
し、またこの形質転換株から、本発明のカスガマイシン
アセチル化酵素遺伝子を含有する添付図面の図１に記載
の制限酵素地図をもつ分子量約１４ｋｂのＰｓｔＩ−Ｐ
ｓｔＩ切断ＤＮＡ断片を含む組換えプラスミドｐＵＣ１
８−ＫＰ１を分離することに成功した。このプラスミド
ｐＵＣ１８−ＫＰ１の制限酵素地図は添付図面の図２に
示す。宿主にカスガマイシン耐性を付与する遺伝子すな
わちカスガマイシン耐性遺伝子は、分子量約１４ｋｂの
前記ＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片内に存在し、後
述する如く、嘱望されたカスガマイシンアセチル化酵素
遺伝子であることが見出された。本組換えプラスミドを
保持する大腸菌ＪＭ１０９は大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＣ
１８−ＫＰ１）と命名し、通産省工業技術院微生物技術
研究所に微工研菌寄第１１８７６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１
１８７６）として寄託してある。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２２】本発明のカスガマイシン耐性遺伝子が、カ
スガマイシンをアセチル化する酵素をコードして産生す
ることは、次のことから理解される。即ち、ＩＰＴＧ存
在下で培養したプラスミドｐＵＣ１８−ＫＢ１を持つ大
腸菌ＪＭ１０９の菌体より調製した粗酵素液とカスガマ
イシンとをアセチルＣｏＡの存在下で反応させると、シ
ュードモナス・フルオレッセンスに対して示すカスガマ
イシンの抗菌活性が完全に消失することから、上記の粗
酵素液中には、プラスミドｐＵＣ１８−ＫＢ１上にある
カスガマイシン耐性遺伝子より産生されたカスガマイシ
ンアセチル化酵素が含まれているものと理解される。な
お、アセチル基が付与される位置については、カスガマ
イシンの２´位のアミノ基であることが、酵素反応によ
って生成したカスガマイシンのアセチル体を単離してそ
れの構造解析をすることにより確認された。
スガマイシンをアセチル化する酵素をコードして産生す
ることは、次のことから理解される。即ち、ＩＰＴＧ存
在下で培養したプラスミドｐＵＣ１８−ＫＢ１を持つ大
腸菌ＪＭ１０９の菌体より調製した粗酵素液とカスガマ
イシンとをアセチルＣｏＡの存在下で反応させると、シ
ュードモナス・フルオレッセンスに対して示すカスガマ
イシンの抗菌活性が完全に消失することから、上記の粗
酵素液中には、プラスミドｐＵＣ１８−ＫＢ１上にある
カスガマイシン耐性遺伝子より産生されたカスガマイシ
ンアセチル化酵素が含まれているものと理解される。な
お、アセチル基が付与される位置については、カスガマ
イシンの２´位のアミノ基であることが、酵素反応によ
って生成したカスガマイシンのアセチル体を単離してそ
れの構造解析をすることにより確認された。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３８】カスガマイシンに耐性となった形質転換株
の選別は以下のように行った。選択培地として５０μｇ
／ｍｌのアンピシリン・Ｎａと３００μｇ／ｍｌのカス
ガマイシン・ＨＣｌを含有するＹＴ寒天培地を９ｃｍ径
のシャーレに２０枚用意し、この寒天培地１枚につき、
上記の形質転換した菌の懸濁液１００μｌと２００ｍＭ
ＩＰＴＧ溶液５０μｌを同時に塗布した。塗布後、該
寒天培地を３７℃で４２時間培養して、カスガマイシン
耐性形質転換株を選別した。
の選別は以下のように行った。選択培地として５０μｇ
／ｍｌのアンピシリン・Ｎａと３００μｇ／ｍｌのカス
ガマイシン・ＨＣｌを含有するＹＴ寒天培地を９ｃｍ径
のシャーレに２０枚用意し、この寒天培地１枚につき、
上記の形質転換した菌の懸濁液１００μｌと２００ｍＭ
ＩＰＴＧ溶液５０μｌを同時に塗布した。塗布後、該
寒天培地を３７℃で４２時間培養して、カスガマイシン
耐性形質転換株を選別した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４３】この約１４ｋｂのＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片
の内部にカスガマイシン耐性遺伝子が存在することは、
プラスミドｐＵＣ１８−ＫＰ１による再形質転換によっ
て得られた大腸菌ＪＭ１０９アンピシリン耐性形質転換
株がすべてカスガマイシン耐性になったことから確認さ
れた。さらに、１４ｋｂのＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片をＢ
ａｍＨＩで切断して得られた０．７ｋｂのＢａｍＨＩ切
断ＤＮＡ断片（添付図面図１の黒塗りの部分）を後述の
如くサブクローニングして添付図面図３記載の組換えプ
ラスミドｐＵＣ１８−ＫＢ１を得たが、このｐＵＣ１８
−ＫＢ１が大腸菌ＪＭ１０９に強いカスガマイシン耐性
を付与することからも確認された。
の内部にカスガマイシン耐性遺伝子が存在することは、
プラスミドｐＵＣ１８−ＫＰ１による再形質転換によっ
て得られた大腸菌ＪＭ１０９アンピシリン耐性形質転換
株がすべてカスガマイシン耐性になったことから確認さ
れた。さらに、１４ｋｂのＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片をＢ
ａｍＨＩで切断して得られた０．７ｋｂのＢａｍＨＩ切
断ＤＮＡ断片（添付図面図１の黒塗りの部分）を後述の
如くサブクローニングして添付図面図３記載の組換えプ
ラスミドｐＵＣ１８−ＫＢ１を得たが、このｐＵＣ１８
−ＫＢ１が大腸菌ＪＭ１０９に強いカスガマイシン耐性
を付与することからも確認された。
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 竹内 富雄
東京都品川区東五反田５丁目１番11号 ニ
ユーフジマンシヨン701
(72)発明者 濱田 雅
東京都新宿区内藤町１番地26 秀和レジデ
ンス405号
Claims (4)
- 【請求項１】 宿主細胞にカスガマイシンをアセチル化
する酵素を産生させる能力を付与し、これにより、宿主
細胞にカスガマイシンを不活性化する能力を付与して宿
主細胞をカスガマイシン耐性とする、カスガマイシンア
セチル化酵素をコードする遺伝子。 - 【請求項２】 放線菌のＤＮＡに由来する分子量が約１
４ｋｂのＤＮＡ断片であって、添付図面の図１に示され
る制限酵素切断地図を有し、且つ請求項第１項に記載の
カスガマイシンアセチル化酵素をコードする遺伝子を内
部に含有するＤＮＡ断片。 - 【請求項３】 放線菌が、カスガマイシン生産菌、スト
レプトミセス・カスガエンシスである請求項第２項に記
載のＤＮＡ断片。 - 【請求項４】 放線菌のＤＮＡに由来して且つ添付図面
の図１に示される制限酵素切断地図を有する分子量が約
１４ｋｂのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ切断ＤＮＡ断片を制限酵
素ＢａｍＨＩで切断して得られ且つカスガマイシンアセ
チル化酵素をコードする遺伝子を内部に含有し、しかも
添付図面の図４に示した塩基配列を有し且つ制限酵素Ｓ
ｐｌＩ及びＳａｌＩによる酵素切断点を有する分子量が
約０．７ｋｂのＤＮＡ断片又はこれと等価であるＤＮＡ
断片。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2150091A JP3038246B2 (ja) | 1991-01-23 | 1991-01-23 | カスガマイシンアセチル化酵素遺伝子とそれを含有するｄｎａ断片 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2150091A JP3038246B2 (ja) | 1991-01-23 | 1991-01-23 | カスガマイシンアセチル化酵素遺伝子とそれを含有するｄｎａ断片 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0523187A true JPH0523187A (ja) | 1993-02-02 |
| JP3038246B2 JP3038246B2 (ja) | 2000-05-08 |
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ID=12056692
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2150091A Expired - Fee Related JP3038246B2 (ja) | 1991-01-23 | 1991-01-23 | カスガマイシンアセチル化酵素遺伝子とそれを含有するｄｎａ断片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3038246B2 (ja) |
-
1991
- 1991-01-23 JP JP2150091A patent/JP3038246B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| JP3038246B2 (ja) | 2000-05-08 |
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