JPH02268686A - シャトルベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、大腸菌（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）
、グルコノバクタ−（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属
及びアセトバクター　（Ａｃｅ　ｔｏｂａｃ　ｔｅｒ）
属に属する微生物間のシャトルベクターとして有用であ
る新規組換えＤＮＡシャトルベクターに関するものであ
る。本発明は、また、該シャトルベクターＤＮＡまたは
その誘導体を有するグルコノバクタ−属またはアセトバ
クター属の接合伝達体に関するものである。さらに、本
発明は、該シャトルベクターＤＮＡを有するグルコノバ
クタ−属またはアセトバクター属の接合伝達体の製造方
法に関するものである。

従来の文献において、グルコノバクタ−オキシダンス（
Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｏｘｙｄａｎｓ）への遺
伝子導入系の報告は、２．３あるのみである。室間ら（
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。１４５．３５８−３６８［１
９８１］）は、ＲＰ４：：Ｍｕを有する大腸菌株とグル
コノバクタ−オキシダンス株の接合伝達を報告した。そ
の接合伝達体出現頻度は、受容菌当たり１０−　”であ
った。深谷ら（Ａｇｒｉｃ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　４９．２４０７−２４１１［
１９８５］）は、グルコノバクタ−オキシダンスの内在
性プラスミドと大腸菌のプラスミドから構築されたｍ換
えプラスミドでのグルコノバクタ−オキシダンスの形質
転換を報告した。その形質転換頻度は非常に低い（μｇ
ＤＮＡ当たり約１０２形質転換体、言い換えれば、受容
菌当たり約１０−９形質転換体）ものであった。

この様に、これらの系は、グルコノバクタ−オキシダン
スへの遺伝子導入に対して満足できる程効率的ではなか
った。

通常、実用的には、たとえば遺伝子ライブラリー構築の
ための一実験において、数十個の接合伝達体や形質転換
体の取得が要求される。

本発明によれば、新規で非常に有用なシャトルベクター
は、マーカー遺伝子、大腸菌内で機能できる複製起点、
グルコノバクタ−オキシダンス内で機能できる複製起点
及びＭｏｂ部位を徂み合せて得られる。

この様に本発明の一面は、大腸菌内で機能できる複製起
点、グルコノバクタ−オキシダンス内で機能できる複製
起点、一つもしくはそれ以上のマーカー遺伝子及びＭｏ
ｂ部位を含む新規組換えＤＮＡベクターに関するもので
ある。該ベクターは、さらにマルチクローニング部位を
有するＤＮＡ配列、発現制御配列、ｃｏｓ部位、ターミ
ネータ−配列、リボゾーム結合部位、シグナルペプチド
及び／または蛋白質をコードするＤＮＡ配列からなるグ
ループから選択される一つもしくはそれ以上の挿入断片
を含む。本発明の他の面は、該ベクターが導入されてい
るグルコノバクタ−属またはアセトバクター属の接合伝
達体に関する。本発明のさらに別の面は、接合伝達条件
下において、グルコノバクタ−属もしくはアセトバクタ
ー属の一株を該ベクターで形質転換された大腸菌の一株
と接触させることを含む、該接合伝達体の製造方法に関
する。

本発明のシャトルベクターは、大腸菌、グルコノバクタ
−属及びアセトバクター属に属するいずれの株の間でも
移動させることが可能であり、また、これらのいずれの
株の中でも複製可能である。

本発明のシャトルベクターの宿主として好適な大腸菌は
、組換えＤＮＡ技術で用いられる何れの大腸菌でもよく
、たとえば、大腸菌に−１２、大腸菌Ｃ６００、大腸菌
１（ＢＩＯＩ、　大腸菌ＥＤ８７６７または大腸菌５１
７−１などである。本発明のシャトルベクターの宿主と
して好適なグルコノバクタ−は、グルコノバクタ−属に
属する何れの株でもよい。最新の分類に従えば、グルコ
ノバクタ−属に属する株は、全てのグ）Ｉ＜コノバクタ
ーオキシダンス種に分類される（Ｂｅｒｇｙ’ｓ　Ｍａ
ｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌｏｇｙＶｏｌ、Ｉ、　２７５−２７８［１９８４
］；　Ｆ、　Ｇｏｓｓｅｌｅら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ　Ｊ、　Ｓｙｓｔｅｍ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

３３．６５−８１［１９８３］）、本発明のシャトルベ
クターの宿主よして好適なアセトバクターはアセトバク
ター属に属する何れの株でもよい。好ましいアセトバク
ター属の株は、アセトバクターアセチ（Ａｃｅｔｏｂａ
ｃｔｅｒ　ａｃｅｔｉ）、アセトパクターリクエファシ
エンス（Ａｃｅｔｏｂａｃ−ｔｅｒ　１ｉｑｕｅｆａｅ
ｉｅｎｓ）及びアセトバクターバストウリアヌス（Ａｃ
ｅｔｏｂａｃｔ、ｅｒ　ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）で
ある。

挿入ＤＮＡを含む本発明のベクターは、節略で経済的な
工業プロセスに有用で、抗生物質やその同等物での選択
圧非存在下でさえ上述の微生物、特にグルコノバクタ−
株の中で安定に維持され得る。

大腸菌内で機能できる複製起点及びグルコノバクタ−オ
キシダンス内で機能できる複製起点を有する本発明のベ
クターは、大腸菌、グルコノバクタ−およびアセトバク
ター株のいずれの内部でも機能できる点もまた非常に有
用である。大腸菌は、ベクターＤＮＡの増幅及び組換え
ＤＮＡ操作を簡便かつ迅速な方法で行なうための効率良
い宿主として知られている。他方、グルコノバクタ−は
、グルコノバクタ−遺伝子の発現用宿主として用いるこ
とができる。本発明の該ベクターは、この様な機能的構
築物であるため、グルコノバクタ−もしくはアセトバク
ターの特定遺伝子を大腸菌内でクローニングし、その後
、グルコノバクタ−やアセトバクター内で効果的に発現
させることが可能である。さらに、この様な機能的構築
物は、また、接合伝達に必須なりＮＡ領領域Ｍｏｂ部位
）を含むことが好ましい。それ故に、本発明のベクター
は、最初に大腸菌内で構築され、次いで大腸菌からプラ
スミドＤＮＡを単離することなく直接にグルコノバクタ
−やアセトバクターへ接合伝達により導入することがで
きる。

本発明のシャトルベクターに好適なマーカー遺伝子は、
大腸菌、グルコノバクタ−もしくはアセトバクター内で
発現する全ての抗生物質耐性遺伝子、例えば、カナマイ
シン耐性（Ｋｍ’）、ストレプトマイシン耐性（Ｓｍｒ
）、アンピシリン耐性（Ａｐ’）及びテトラサイクリン
耐性（Ｔｃ’）遺伝子などがある。

これらの抗生物質耐性遺伝子は、天然もしくは人工的に
構築されたプラスミド、トランスボゾン、染色体ＤＮＡ
及び合成りＮＡから単離してもよい。

該抗生物質耐性遺伝子の供給源としては、限定されるも
のではないが、プラスミドＲＰ４　（Ｄａｔｔａら、Ｊ
、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　■、　１２４４−１２４９
［１９７１］；　ＮＲＲＬ　Ｂ１８１４７）、　ＲＫ２
　（ＡＴＣＣ３７１２５）、　Ｒ５ＦＩＯＩＯ（長張お
よび板目、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１３３．１５
２７−１５２９（ｂ９７８］：　ＮＲＲＬＢ−１８１４
６）、　ｐＡｃＹｃ１７７　（ＡＴＣＣ３７０３１）、
　　Ｉ−ランスボゾンＴｎ３　（Ｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　７２．３６２８
−３６３２ｆ１９７５］）、　ＴｎｌＯ（Ｆｏｓ、ｔｅ
ｒら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１２４、１１５３−１１５８［１９７５］）及びそれら
の誘導体が含マレる。マーカー遺伝子としては、色素産
生遺伝子（たとえば、プラスミドｐｌＪ７０２上のｍｅ
ｌ遺伝子）もまた役立つであろう。

本発明のシャトルベクターに適する大腸菌内で機能でき
る復製起点は、たとえば、大腸菌の、もしくは、大腸菌
内で自律複製できる何れのプラスミドまたはファージの
複製起点を含むＤＮＡ断片である。この様な複製起点は
たとえば、プラスミドＲＰ４、Ｒ５Ｆ１０１０、ｐＢＲ
３２２、ｐＡｃＹｃ１７７、ｐＡｃＹｃ１８４、ｐｓｃ
ｌｏｌ、λファージ（たとえばファージλ）、Ｐ１ファ
ージなど（たとえばＰｉ）　　もしくはＴ−コリファー
ジ　（たとえばコリファージＴ４）　　などから単離し
てもよい。

本発明のシャトルベクターに適するグルコノバクタ−お
よびアセトバクター内で機能できる複製起点は、例えば
、グルコノバクタ−オキシダンスの、又はグルコノバク
タ−オキシダンス内で自律的に複製できる何れの内在性
プラスミドもしくはファージの複製起点を含むＤＮＡ断
片である。この様な？ｊｊ製起点は、例えば、グルコノ
バクタ−オキシダンスＩＦＯ３２９３（ＦＥＲ−Ｐ−８
３５６）、グルコノバクタ−オキシダンスＩＦＯ３２９
３の内在性プラスミド、もしくは、グルコノバクタ−オ
キシダンスの内在性ファージＤ　Ｎ　Ａ　（Ｓｃｈｏｃ
ｈｅｒら、八ｒｃｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

１２１、１９３−１９７［１９７９］）から分離しても
よい。

Ｍｏｂ部位は、移動起点（ｏｒｉ　Ｔ）を含み、ある種
の可動性プラスミドの移動機能の認識部位として作用す
ると考えられている　（Ｒ，Ｓｉｍｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ土、　７８４−７９１［１９８３］
）。このＭｏｂ部位は、結合プラスミド例えば、プラス
ミドＲＫ２、ＲＰ４、Ｒ３ＦＩＯＩＯまたはそれらの誘
導体から得られる。

Ｍｏｂ部位含有プラスミドは、二組間接合伝達又は二組
間接合伝達を用い、Ｔｒの遺伝子の助けにより、その本
来の宿主から、他の宿主へ移動可能である。

このＴｒの遺伝子は、ＲＰ４及び１ｌＫ２の様な、広宿
主域Ｉ　ｎ　ｃ、Ｐ型プラスミドの移動遺伝子としてよ
く知られている。二組間接合伝達においては、Ｍｏｂ部
位含有プラスミドを保持するＴｒｉＪ！伝子含有株、た
とえば、大腸菌５１７−１（Ｒ，Ｓｉｍｏｎら、前述文
献）を、受容菌と混合する。二組間接合伝達においては
、Ｍｏｂ部位含有ブラスミ［′を保持する供与株を、ｌ
？Ｐ４やＲＫ２の様なＴｒの遺伝子を含有するプラスミ
ドを保持する株及び受容株ど混合する。

本発明のシャトルベクターは、さらに所望の機能を付加
するために一つもしくはそれ以上の挿入断片、たとえば
、マルチクローニング部位を有するＤＮＡ配列、リボゾ
ーム結合部位、シグナルペプチド及び／もしくは蛋白質
をコードするＤＮＡ配列を含めてもよい。

さらに詳細には、本発明のシャトルベクターは、クロー
ニングに便利なようにｐＵｃ１８　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ社製）もしくはＭ１３ｍｐ８（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｃｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社裂）の様な種
々のプラスミドやファージまたは合成りＮＡ配列から得
られる一つもしくはそれ以上のフルチク１コーニング部
位（Ｍｅｓｓｉｎｇ　ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１０１．２０［１９８３］）を含
むＤＮＡ配列を含有１してもよい。さらに、該シャトル
ヘクターは、広範囲に渡る発現制御部位、たとえば、Ｍ
ａｎｉａｔｉｓらのテキスト（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃ
ｌｏｎｉｎｇＡ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ
、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｆｌａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓ
ｓＣｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、、
　１ＪｓＡｆ１９８２））で知られる様なｌａｃ、　ｔ
ｒｐ、　ｔａｃもしくはβ−ラクタマーゼ発現制御系、
ファージ起源の制御配列またはグルコノハククー株から
得られる発現制御配列を含有してもよい。さらに、該シ
ャトルヘクターは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏハンケージング用
のｃｏｓ部位を含んでもよい。さらに該シャｊ・ルー・
フタ−は、本発明の効率の良いグルコノバクタ−及びア
セトバクターの宿主ベクター系を構築するために用いる
効率的終結のためのターミネータ−配列、効率的翻訳の
ための天然もしくは合成リボゾーム結合部位、クローン
化した蛋白質の効率的局在化のだめのシグナルペプチド
をコードするＤＮＡ配列及びマーカー蛋白の構造遺伝子
を含んでもよい。

概略的には、本発明のシャトルベクターは、本記載に記
述されている通りの材料を用いた次の順番により、Ｍａ
ｎｉａｔｉｓら（上述）により述べられている紐換えＤ
ＮＡ技術を用いて取得できる；（ｂ）、マーカー遺伝子
を含むＤＮＡを調製し、（２）大腸菌内で機能できる複
製起点を含むＤＮＡを調製し、 （３）　　グルコノバクタ−内で機能できる複製起点を
含むＤＮＡを調製し、 （４）　　Ｍｏｂ部位を含むＤＮＡを調製し、（５）本
発明のシャトルベクターを得るために、（ｂ）から（４
）で述べられているＤ　Ｎ　Ａを適当な制限酵素で切断
し、それらをリガーゼで連結することにより結合する。

これらの手順により、マーカー遺伝子、大腸菌内で機能
できる複製起点、グルコノバクタ−由来の複製起点及び
機能的Ｍｏｂ部位を含むシャトルベクターを構築可能で
ある。

本発明のシャトルベクターは、大腸菌からグルコノバク
タ−もしくはアセトバクターへ、ベクタ−ＤＮＡの単離
精製することなく接合伝達により、非常に高頻度（受容
菌あたり約１ｏ−２からｉｏ−’の接合伝達体）で導入
することが可能である。これろのベクターを用いて、大
腸菌で構築した遺伝子ライブラリー（ｂ０’から１０５
クローン）は、−回の実験でグルコノバクタ−やアセト
バクターに導入できる。この様に、本発明のシャトルベ
クターはクローニング実験の単純化という観点から高度
に効率的である。

本発明のシャトルベクターの最も有利な特質は、選択圧
の非存在下においてさえ、大腸菌、グルコノバクタ−お
よびアセトバクター採肉で安定であることである。さら
に、該ベクターは宿主細胞の増殖や醗酵生産物の産生に
悪影響を及ぼさない。

まとめれば、本発明のシャトルベクターは、遺伝子クロ
ーニングのためのならびに所望の原核および真核生物の
ポリペプチドの生産のためのべりターとして工業プロセ
スで使用することが可能である。所望の原核および真核
生物のポリペプチドは、発現制御配列と効果的に連結さ
せた。該ポリペプチドを：ｌ−ドするＤＮＡ配列を含む
本発明のシャトルベクターを接合伝達により、グルコノ
バクタ−属もしくはアセトバクター属の株へ導入し、適
当な増殖条件下で、接合伝達体を培養し、その培養液か
ら所望のポリペプチドを単離することにより、取得でき
る。

図ＭｌｉＱ刈既略鳳−明。

第１図は、シャトルベクターｐＧＥ１の構築を示す。

第２図は、プラスミドｐＧＥ１への膜結合型１．−ソル
ボソン脱水素酵素遺伝子の挿入を示す。

第３図は、プラスミドｐＧＥＬとｐＧＥｌ−５ＮＢ２の
制限酵素地図を示す。

第４図は、プラスミドｐ７Ａ６Δ２、ｐ７Ａ６Δ３、ｐ
７Ａ６Δ４の制限酵素地図を示す。

第５図は、プラスミドｐ７Ａ６Δ４のＳＳＥ断片の制限
酵素地図を示す。

ｌ拒Ｊ！Ｉ土 シャ　ルベツ　−ＧＥＩの グルコノバクタ−オキシダンスＩＦＯ３２９３は、いか
なる選択圧の非存在下でも細胞中で安定に維持される２
種類のクリプテイックプラスミドを有している。ｐＧＯ
３２９３ｓと命名された小型プラスミドは、リラックス
型プラスミド（コピー数は１０以上）で、その分子サイ
ズは９．９ｋｂである。ｌ）Ｇ　Ｏ３２９３Ｌと命名さ
れた大型プラスミドは、ストリンジェントラスミド（コ
ピー数は１から２）で、その分子サイズは約６０ｋｂで
ある。該ベクターの適当なコピー数とＤＮＡサイズを考
慮してｐＧＯ３２９３ｓが、グルコノバクタ−オキシダ
ンス内で機能できる複製起点の供給源として選択された
。

プラスミドｐｓＵＰ３０１は、大腸菌内で機能できる複
製起点、抗生物質耐性遺伝子（Ｋｍ’とＡｐ′遺伝子）
及びＭｏｂ部位の供給源として用いられた。プラスミド
ｐ５１１Ｐ３０１は、ｐＡｃＹｃ１７７とｌ？に２由来
の門Ｏｂ部位を結合して構築された（Ｒ．　Ｓｉｍｏｎ
ら、上述）。それ故、プラスミドｐＡｃＹｃ１．７７と
ＲＫ２もしくはその同等物が、プラスミドｐｓＵＰ３０
１の替わりに使用できる。

Ａ）ブースミ　”　ＧＯ３２９３ＳおよびＳＵＰ３０１
のプラスミドｐｓＵＰ３０１は、ｐｓＵＰ３０１を保持
する大腸菌細胞からアルカリ法（Ｈ．　Ｃ．　Ｂｉｒｎ
ｂｏｉｍとＪ．　Ｄｏｌｙ。

ＮＩｌｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ．工
，　１５１３−１５２：０１９７９］）により８周製さ
れた。

プラスミドｐＧＯ３２９３ｓは、グルコノバクタ−オキ
シダンスＩＦＯ３２９３細胞からアルカリ法により以下
に述べるように調製されたニ ゲルコノバクターオキシダンス細胞は、２５ｇ／　ｅマ
ンニトール、５　ｇ／　（２酵母エキス（Ｄｉｒｃｏ）
及び３ｇ／４２ハクトペブトン（Ｄｉｒｃｏ）を含むマ
ンニトールブロス（ＭＢ）　５　ｄを含有する試験管内
で２４時間３０°Ｃで培養された。次に、その培養液４
ｍρが、新鮮ＭＢ培地５０ｍｌを含有する５００ｍｆｆ
容エーレンマイヤーフラスコに移植された。そのフラス
コは、１８０ｒｐｍで運転される回転振盪機上で、３０
″Ｃ１５時間培養された。得られた培養液は、５．００
Ｏｒｐｍ（３，０００ｇ）１５分間遠心分離した。細胞
は１０ｍ２の溶液Ｉ　（２ｍｇ　／　ｒｔｄｌリゾチー
ム、５ｍＭグルコース、１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む２５
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ　、ｐＨ７．９）に懸濁し、
その懸濁液を氷上３０分間静置した。次に、２０ｄの溶
液ＩＩ（ｂχＳＤＳを含む１８ｍＭ　ＮａＯＩＩ）を添
加し、その溶液を氷上１０分間静置し、ついで１５ｍ２
の３？酢酸ナトリウムｐＨ４。

８を添加した。得られた溶液を、氷上６０分間静置した
後、１３．０００ｒｐｍ（２１，０００ｇ）で１０分間
遠心分離した。この上清（４０ｄ）に４０ｍｐ．のイソ
プロパツールを添加した。この混合液を氷上６０分間静
置後、１５分間、１５，０００ｒｐｍ（２８，０００ｇ
）で遠心分離して得た沈澱物を乾燥後、２瀬の蒸溜水に
溶解した。プラスミドＤＮＡを、さらにエタノール沈澱
により精製し、最終プラスミドＤＮＡ溶液を得た。

１５０ｎｇのｐｓＵＰ３０１　ＤＮＡと２００ｎｇのｐ
ＧＯ３２９３ｓ　ＤＮＡを旧ｎｃＩＩで完全分解し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼで結合した。得られた結合混合物は、
Ｅ，ｃｏｌｉ　、Ｓ１７−１を形質転換するのに用いた
。

Ｋｍ’の形質転換体を、まずＬ　Ｋ　（５０μｇ，７ｍ
ｌのカナマイシンを含むルリアブロス；ルリアブロス（
ＬＢ）　：　１０ｇ／尼バクトベブトン、５　ｇ／　ｌ
酵母エキス、５ｇ／でＮａＣ１）寒天平板上で選択した
。次にＡＩ）ＳＫＴ１１’のクローンすなわち、Ａｐｒ
遺伝子内に挿入断片を有するプラスミドを保持する形質
転換体をＬＫ寒天平板及びＬＡ（５０ｐｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含むＬＢ培地）寒天平板の両者を用いて選択
した。

全Ｋｎ＋’Ａｐ’形質転換体から得られた組換えプラス
ミド混合物をグルコノバクタ−オキシダンスＮ４４１（
ヨーロッパ特許出願公開番号第２１３５９１号に記載さ
れている様に変異処理によりグルコノバクタ−オキシダ
ンスＩＦＯ３２９３より取得した２−ＫＧＡ高生産株）
へ、二組間接合伝達により導入した。二組間接合伝達は
、次の様に行なわれた： ＭＢ培地で増殖させた受容菌グルコノバクタ−オキシダ
ンスＮ４４−１の対数増殖期培養液２００μ尼を、５μ
ｇ／ｍｌのカナマイシンと１０ｐｇ／ｍｆｌのストレプ
トマイシンを含む１５Ｂ培地で増殖させた全Ｋｍｒ形質
転換体の対数増殖期培養液１００μ２と混合し、ＦＢ　
（５０ｇ／βフラクトース、１０ｇ／ρ酵母エキス、１
０ｇ／ｉポリペプトン）寒天平板上のニトロセルロース
表面にスポットした。この寒天平板を、３０゛Ｃで一晩
培養した。生じた混合コロニーを、適当に希釈した後、
１０ｐｇ７ｍｆｔのポリミキシンＢ及び５０ｐｇ／ｍｌ
のカナマイシンを含むＭＢ　（ＭＰＫ）寒天平板ならび
に１０ｐｇ７ｍｌのポリミキシンＢを含むＭＢ（ＭＰ）
寒天平板に塗布し、３０°Ｃで４日間培養した。

接合伝達頻度は、ＭＰ寒天平板上のコロニー故に対する
ＭＰＫ寒天平板上のコロニー数の比として計算した。

本実験の接合伝達頻度は、０．０６から０．１％（受容
菌当たりの接合伝達体）であった。ブラスミｌ５ＤＮＡ
を５つの接合伝達株からミニアルカリ法により調製し、
アガロースゲル電気泳動により分析した。結果として、
全てのプラスミドが、同じ構造を有していた。一つのプ
ラスミドをｐＧＥｌと命名した。

Ｄ）　　　　　ブースミドＧＥＩのノ ｐＧＥ１が、グルコノバクタ−オキシダンスと大腸菌間
のシャトルベクターであることを確証するために、ｐＧ
ＥＩ保持グルコノバクタ−オキシダンスＮ４４−１の細
胞から調製したプラスミドｐＧＥ　１を大腸菌Ｃ６００
株へ形質転換法で導入した。プラスミドｐＧＥＩは、大
腸菌Ｃ６００株をμ、ＤＮＡ当り１０６形質転換体とい
う頻度で形質転換した。このことからｐＧＥｌは、大腸
菌とグルコノバクタ−オキシダンス間のシャトルベクタ
ーとして働くことが示された。ｐＧＥ１構築の模式図を
第１図に示す。

ｐＧＥｌを保持するグルコノバクタ−オキシダンスＮ４
４〜１と大腸菌の細胞から調製したｐＧＥＩＤＮＡを八
ｖａ　ｌ　、旧ｎｃ　Ｕ　＋　Ｐｓｔ　Ｉ　、　Ｐｖｕ
　ＩもしくはＰｖｕ　ＩＩで切断し、アガロース電気泳
動で分析した。ＨｉｎｃＩＩ断片、Ｐｓｔｌ断片、及び
未切断ＤＮＡを３２Ｐ−ラベルｐｓＩＪＰ３０１とハイ
ブリダイズし、一方、Ｐｖｕ　Ｉ　、　Ｐｖｕ　ＩＩ及
びＡｖａ　Ｉ断片を３２ｐ−ラベルｐＧＯ３２９３ｓと
ハイブリダイズした。

オートラジオグラムは、ｐＧＥｌがｐｓＵＰ３０１とｐ
ＧＯ３２９３Ｓ両者から由来するＤＮＡ断片を含有する
こと、及びｐＧＥｌは、大腸菌ならびにグルコノバクタ
−オキシダンス両採肉で同構造で存在していることを明
らかに示した。修飾も欠失も観察されなかった。

プラスミドｐＧｎを特性つけるために、種々ヘクターの
接合伝達効率を比較した。

５つのプラスミドずなわちＲＰ４、ＲＳＦＩＯＩＯ１ｐ
ＶＫ１０２　（ＡＴＣＣ３７１５Ｂ）、ｐｓＵＰ３０１
及びｐＧＥｌを、接合伝達系下で大腸菌からり゛ルコノ
バクターオキシダンスへ導入した。各々のプラスミドの
最も良い接合伝達頻度を第１表に示す。プラスミドｐｓ
ＵＰ３０１は、このプラスミド内にグルコノバクタ−用
の複製起点がないため、グルコノバクタ−内に導入され
なかった。他方、プラスミドｐＧＥ１は、プラスミドＲ
Ｐ４、ＲＳＦＩＯＩＯ，ｐＶＫ１０２と同様に１０−２
から１０−’（受容菌当りの接合伝達体）という高頻度
で、グルコノバクタ−へ導入された。

（本頁以下余白） 第」二に 接合伝達頻度 影） 新規プラスミドρＧＥＩ及びプラスミドＲＰ４、ＲＳＦ
ＩＯＩＯならびにｐＶＫ１０２を実施例１−Ｃ）に述べ
た様にしてグルコノバクタ−オキシダンスＮ４４−１へ
導入した。得られた接合伝達体を、抗生物質を含むＭＢ
寒天平板から、抗生物質含有もしくは非含有の５　ｍｆ
ｌのＮｏ、　５培地（８０ｇ／ｊ２　Ｌ−ソルボース、
０．５ｇ／！グリセロール、１５ｇ／　ｌ酵母エキス、
２．５　ｇ／　ｌ硫酸マグネシウム、１５ｇ／　ｅ炭酸
カルシウム）を含む試験管へ移植した。この試験管を、
３０″Ｃで５日間振盪培養機上で培養した。Ｎ４４−１
　も又対照として同じ様に抗生物質非存在下Ｎｏ、　５
培地で培養した。

醗酵液の５５０ｎｍでの光学密度（００５５゜）および
２−ＫＧＡ量を決定することにより細胞増殖として２−
ＫＧＡ生産の分析を行なった。

第２表に示す様に、プラスミドｐＧＥ１は、増殖と２−
ＫＧＡ生産の維持に対して、試験に供したベクターの中
で、最良のベクターである。反対に、ＲＰ４の存在は、
細胞増殖の低下（２０％減）及び２−ＫＧＡ生産の低下
（４５％減）を引起こした。さらに、ＲＰ４には、他の
欠陥が見つかった；　Ｉ？Ｐ４がグルコノバクタ−中で
複製した時に、ＲＰ４の欠失が起った。

ＲＳＦＩＯＩＯ及びｐＶＫ１０２は、増殖には影響をお
よぼさなかったが、しばしばＮ４４−１の２−ＫＧＡ生
産を標準レベルの、各々、８０％及び９０％まで低下さ
せた。

（来夏以下余白） 第」し支 種々ヘクター存在の増殖及び２−ＫＧＡ生産への影響Ｏ
Ｄ３．。　　　　　　　　２ＫＧ八（ｇ／　１２．　）
宿主　　ベクター　　　　　抗生物質９＋　　　　　　
　　　　　　　＋ ２１．１ ＲＰ４　　　１４．１　　１５．９ ’４４４−Ｉ　　ＲＳＦＩＯＩＯ２０，４２，０，８ｐ
ＶＫ１０２　２０．１　　２０．５ ｐＧＥ１　　２０．２　　２０．８ ５２．１ ３１゜８ ４３．３ ４８．１ ５５．９ ２６．０ ４２．７ ４８．８ ５４．４ ＲＰ４、ｐＶＫ１０２及びｐＧＥ１ニ対する抗生物質は
、カナマイシン（５０μｇ／ｄりであり、ＲＳＦＩＯＩ
Ｏに対しては、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｄ）で
あった。

実施例３に記述のＮ４４−１接合伝達体を、Ｋｍ非存在
培地で培養し、希釈後ＭＢ寒天平板に塗沫した。

この寒天平板を３０゛Ｃで、５日間培養した。プラスミ
ドｐＧＥ１保持大腸菌５１７−１株を、Ｋｍ非存在ＬＢ
培地で培養し、希釈後ＬＢ寒天平板に塗沫した。この寒
天平板を３７°Ｃで１日培養した。

生じたコロニーを用いて、次の様にプラスミドの安定性
を決定したニ プラスミド安定性は、抗生物質非含有寒天平板上に成育
したコロニー数に対する、抗生物質含有寒天平板上に成
育したコロニー数の比と定義した。

培養の種々の段階で培養液から試験液体を抜きとり、適
当に希釈後、抗生物質非含有寒天平板に塗沫し、３７°
Ｃで１日　（大腸菌）、もしくは２８°Ｃで５日間（グ
ルコノバクタ−オキシダンス）培養した。これらの寒天
平板に成育した１００個のコロニーを、抗生物質含有及
び非含有寒天平板に移植し、上述と同様の培養条件で培
養後、プラスミド安定性を計算するためにコロニー数を
計１した。

第３表（ａ）は、ＲＰ４は２−ＫＧＡ高生産株Ｎ４４４
中では極めて不安定であるが、２−にＧＡ非生卒株Ｃ２
０（ヨーロッパ特許出願公開番号第２１３５９１号に記
述の変異処理により、グルコノバクタ−ＩＦＯ３２９３
から取得した変異株）中では安定であることを示す。他
のベクターは、両株中でかなり安定であった。

しかし、我々の以前の実験で、挿入断片を有するｌ’１
ｓＦ１０１０はしばしば脱落したり、欠失することが観
察されていた（データは示していない）、それ故、ｐＧ
ＥｌとｐＶＫ１０２を培養中の安定性に関してさらに検
討した。

プラスミドｐＶＫ１０２、ｐ７Ａ６Δ４（膜結合ソルボ
ソン脱水素酵素遺伝子を含むｐＶＫ１０２の誘導体；構
築法は実施例８参照）もしくはｐＧＥｌを保持するＮ、
１４−１細胞を５０μｇ／ｍｌのカナマイシン含有ＭＢ
液体培地で、試験管内で２日間培養し、種培養液を調製
した。この種培養液１　／　１０　ｍｆｔを試験管内の
５蛇のカナマイシン非含有ＭＢ培地に移植した。この試
験管を試験管培養機上において、３０″Ｃで１日培養し
た。

この移植及び培養をＭＢ培地において３回繰返した。

２−ＫＧＡ生産条件下でのプラスミド安定性を試験する
ために、１０分の１　ｍｌの同じ種培養液を試験管中の
５ｍＩ！、のカナマイシン非含有Ｎα５培地にも移植し
た。移植及び培養（３０’Ｃで２日から３日間）をＮｏ
、　５培地内で３回繰返した。用いたプラスミドの安定
性を決定するために、各培養後、培養液を適当に希釈し
、ＭＢ寒天平板に塗床した。

第３表（ｂ）は、プラスミドｐＧＥ１が検討した条件下
で極めて安定（ｂ００％）であり、一方ｐＶＫ１０２　
トｐ７Ａ６Δ４はかなり安定ではあったが、ｐＧＥｌよ
り不安定（７４−１００％）であったことを示している
。これらの結果は、２−ＫＧＡ　醗酵を、種培養が２−
３回繰返される実用工程においてもカナマイシン無添加
でｐＧＥ１保持２−ＫＧＡ高生産株により実施可能であ
ることを示している。プラスミドｐＧＥ１は、大腸菌内
においても、３回の抗生物質非存在培養中、非常に安定
（ｂ００％）であった。

（来夏以下余白） 第」Ｊし１（２） 培養中の種々ベクターの安定性 （来夏以下余白） 第」ｊｌ−（ロ）− 各プラスミド保持Ｎ４４−１をＭＢ培地で１日、Ｎ。

５培地で２−３日間培養後、培養液の２％を各新鮮培地
に移植した。

一宿主に２−ＫＧＡ　１ｌｆｆｌ酵関連遺伝子を導入す
るために、おそら（和合性を有する二つもしくはそれ以
上のヘクターを必要とするだろうから、プラスミドｐＧ
Ｅ１のプラスミドｐＶＫ１０２との和合性を検討した。

プラスミドｐＶＫ１０２を、二親間接合伝達により、大
腸菌５１７−１からプラスミドｐＧＥ１を保持するり゛
ルコノハクターオキシダンスＩＦＯ３２９３へ導入した
。

接合伝達体は、カナマイシンとテトラサイクＩＪンの両
耐性を示す細菌という基準で選択された。Ｋｍゝ及びＴ
Ｃｒの接合伝達体中の、両プラスミドの存在を確証する
ために両耐性を示す接合伝達体力・ら８川製したプラス
ミドＤＮＡを用いて、大腸菌５１７−１を形質転換した
。形質転換体の中には、期待通り、ｐＧＥｌ及びｐＶＫ
１０２を保持するものが存在した。この発見は、プラス
ミドｐＧＥ１が、ゲルコバ＼゛クター中で、プラスミド
ｐＶＫ１０２と和合性を有することを示している。

夫−力団」− プ立入主上郁旦勿消ユ潔 プラスミドｐＧＥ１を、実施例ＩＣ）４こ示１−二親間
接合伝達により、大腸菌５１７−１からグルコツノ〈フ
タ−属に属する種々の株、すなわち、グルコツノ〈フタ
−オキシダンスＩＦＯ３２９３、グルコノバクタ−オキ
シダンスＩＦＯ３４６２、グルコノバクタ−オキシダン
スＩＦ０３２６８、　グルコノバクタ−オキシダンスＩ
Ｆ０３２７１、グルコノバクタ−オキシダンスＩＦ０３
２８７、グルコノバクタ−オキシダンスＩＦＯ３１７２
及びグルコノバクタ−オキシダンスＡＴＣＣ９９３７な
らびにアセトバクターに属する種々の株、すなわち、ア
セトノマクターアセト−サス（八、　ａｃｅｔｏｓｕｓ
）ＩＦＯ３１２９、アセトバクターパスチュリアヌス（
Ａ、　ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）ＩＦ０３１７０、ア
セトバクターパスチュリアヌスＩＦＯ３２２３及びアセ
トバクターバスチュリアヌスＩＦＯ３２２５へ、接合伝
達した。

Ｋｍ’コロニーを全てのグルコノバクタ−株及びアセト
バクター株から取得した。次に得られたＫｍ’株のプラ
スミドＤＮＡを、元のプラスミドｐＧＥ１とその性状を
比較するために分析した。

プラスミドＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に供した。

この分析は、全てのプラスミドがプラスミドｐＧＥ１と
同し分子サイズを有していることを示した。このアガロ
ースゲル中のＤＮＡ／＼ンドをナイロンフィルターに移
し、サザンノ＼イブリダイゼーション分析に供した。全
ＤＮＡ／ベンドが、３ＺＰラー＼ルしたプラスミドｐＧ
ＥＩＤＮＡとノ曙ブリダイズした。この様に、グルコノ
バクタ−及びアセトバクター株から取得した全Ｋｍ’株
が、プラスミドｐＧＥ１を保持する接合伝達体であるこ
とが確証された。

各接合伝達体から単離したプラスミドＤＮＡを、大腸菌
Ｃ６００株を形質転換するのに用いた。得られたにｍｒ
の形質転換体をＬＫ液体培地で３７゛Ｃ−晩培養した。

プラスミドＤＮＡを各形質転換体から抽出し、Ｂｇｌｌ
Ｔで切断後、アガロースゲル電気泳動により分析した。

調べた全てのプラスミドＤＮＡは、プラスミドｐＧＥ１
と同等であると確証された。

ＤＮＡの欠失や挿入は観察されなかった。結果として、
プラスミドｐＧＥ１は、種々のグルコツノ〈フタ−及び
アセトバクター株に対してシャトルベクターとして機能
すると言える。

実Ｊ缶朋ニ ゲルコノバク　−　　びアセ　バク　−　にる　々の　
に　番るブースミドＧＥＬの２”実施例６で述べた、カ
ナマイシン（５０μｇ／ｍｆｆ）含有ＭＢ寒天平板上に
維持されている全接合伝達体を、試験管内の５０μｇ／
ｍｌのカナマイシンを含有するＭＢ液体培地へ移植し、
２日間培養し、種培養液を調製した。１　／　１０　ｒ
ｒｄｌの種培養液を、５瀬のカナマイシン非含有ＭＢ培
地に移植した。この試験管を、試験管振盪培養機上で、
３０°Ｃ１日培養した。

この移植及び培養をＭＢ培地内で３回繰返し行なった。

実施例４に示される様に、プラスミドｐＧＥ１の安定性
を決定するために種培養液、一番目及び三番目の培養液
を適当に希釈し、ＭＢ寒天培地上に塗抹した。

第４表は、プラスミドｐＧＥ１は、カナマイシン選択な
しで３回の移植後においても尚グルコノバクタ−オキシ
ダンスＩＦＯ３２９３、グルコノバクタ−オキシダンス
ＩＦＯ３２６８及びアセトバクターアセト−サスｒＦＯ
３１２９中で極めて安定（ｂ００％）であり、グルコノ
バククーオキシダンスＩＦＯ３４６２、グルコノバクタ
−オキシダンスＩＦＯ３２７１、グルコノバクタ−オキ
シダンスＩＦＯ３２８７、グルコノバクタ−オキシダン
スＩＦＯ３１７２、グルコノバクタ−オキシダンスＡＴ
ＣＣ９９３７、アセトハクターパスチュリアヌスＩＦ０
３］７０、　アセトバクターパスチュリアヌスＩＦＯ３
２２３及びアセトバクターバスチュリアヌスＩＦＯ３２
２５中でかなり安定（６８−９８％）であったことを示
している。

（来夏以下余白） 実−Ｌ１殊膓 使■ クローン化されたアセトパクターリクエファシエンスＩ
Ｆ０１２２５８の膜結合し一ソルボソン脱水素酵素遺伝
子を、プラスミドｐＧＥ１のクローニングベクターとし
ての有用性を示すために、プラスミドｐＧＥｌ中へ導入
した。

膜結合し一ソルボソン脱水素（ＳＮＤＩ＋）遺伝子を含
むＢｇ１１１断片（５，５ｋｂ）をプラスミドｐ７Ａ６
Δ４から単離し、Ｂｇｌ　Ｈで部分分解したプラスミド
ｐＧＥ１と結合した。得られたＤＮＡ混合液を大腸菌５
１７−１を形質転換するのに用いた。５００個の形質転
換体を拾い、Ｌ　Ｓ　Ｋ　（ｂ００μｇ／ｍｐ、のスト
レプトマイシン及び５０μｇ７ｍｌのカナマイシンを含
有するＬＢ培地）の表面に置いたニトロセルロースフィ
ルター上に移植し、３７°Ｃで一晩培養した。得たフィ
ルターを０、５　Ｍ　ＮａＯＨ−１，５Ｍ　ＮａＣ１溶
液で５分間処理し、３門酢酸ナトリウム（ｐＨ４，８）
で５分間中和した。

コロニーブロットシたフィルターヲ、ｐ７Ａ６Δ４がら
単離し、アセトパクターリクエファシェンスＩＦＯ１２
２５８のＤＮＡのみを含む、１．８　ｋｂ　Ｓａｌ　Ｉ
断片を３！Ｐでラベルしたものとのハイブリダイゼーシ
ョンに用いた。１５個のポジティブクローンを選択し、
そのプラスミドをＢｇｌｌｌもしくはＰνｕ　ＩＩｎ切
断より分析した。

第２図に示す様に３タイプのサブクローンが得られ、こ
れらを以後ｐＧＥ−５ＮＢＩ、　ｐＧＥ−５ＮＢ２及び
ｐＧＥＳＮＢ３と称する。これら全ては、５．５ｋｂの
Ｂｇｌｒｌ断片−木を含んでいた。しかし、それらは、
同時に、３本（７）ＢｇｌＩＩ断片（９，８ｋｂ、　　
１．７ｋｂ及び０．４ｋｂ）から成っているプラスミド
ｐＧＥ１の１．７ｋｂ及び／または０．４ｋｂのＢｇｌ
ｌｌ断片を失っていた。それ故、プラスミドρＧＥＬは
、Ｂｇｌ　ｎ切断により機能することが可能なベクター
として９．８ｋｂまで短縮することが可能である。ｐＧ
Ｅｌ及びｐＧＥｌ−５ＮＢ２の詳細な切断酵素地図を第
３図に示す。

Ｂ）サブクローンの　　　での２−ＫＧＡ　　　へのＮ
４４−１に保持されている５ＮＤＩＩ遺伝子を含むｐＧ
Ｅ１誘導体の２−にＧＡ生産に及ばず効果をＮ４４−１
に保持されているプラスミドｐＧＥ１．　ｐＶに１０２
．もしくはｐ７八６Δ４の効果と比較して検討した。対
照株として、効率良い膜結合Ｌ−ソルボソン脱水素を有
する二つの天然株、アセトパクターリクエファシェンス
（Ａ、　ｌ１ｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）（ＡＴＣＣ２３７
５０）及びシュードモナスプチダ（Ｐ、　ｐｕｔｉｄａ
）（ＡＴＣＣ２１８１２；マコーバーら、Ｂｉｏｔｃｅ
ｈｎｏｌ、　Ｂｉｏｅｎｇ、　　１７．　１４８５−１
５１４［１９７５］）を用いた。

Ｓ　Ｎ　Ｄ　Ｈ遺伝子を含むプラスミドｐＧＥ−５ＮＢ
Ｉ、　ｐＧＥ−５ＮＢ２及びｐＧＥ−５ＮＢ３の３つの
サブクローンを、プラスミドｐＧＥ１．　ｐＶＫ１０２
及びｐ７Ａ６Δ４と同様、二組間接合伝達により大腸菌
５１７−１からグルコノバクタ−オキシダンスＩＦＯ３
２９３へ導入した。接合伝達体、アセトバクターリクエ
ファシェンス（ＡＴＣＣ２３７５０）及びシュードモナ
スプチダ（ＡＴＣＣ２１８１２）をＭＢ中で一晩培養し
た。次に細胞をＯＤ５．。＝２に希釈し、その細胞液４
　ｄから集めた細胞を１８ｇ／ｆ　Ｌ−ソルボソン、１
０ｇ／　ｌ　ＣａＣＯｘ及び３　ｇ／　ｌ　ＮａＣ１を
含む反応混？Ｆｔ　４　ｒｄに再懸濁し、３０゛ｃで保
温した。第５表は、２．２０及び６３時間後の２−ＫＧ
Ａ生産量を示している。

５ＮＤ１１遺伝子を含むサブクｏ　−７ｐＧＥ−５ＮＢ
Ｉ、　ｐＧＥＳＮＢ２及びｐＧＥ−５ＮＢ３を保持する
接合伝達体の２−ＫＧＡ生産性は、アセトバクターリク
エファシェンス（ＡＴＣＣ２３７５０）及びシュードモ
ナスプチダ（ＡＴＣＣ２１８１２）の生産性より良好で
あった。さらに、これらのサブクローンによる２−ＫＧ
Ａ生産性はプラスミドｐ７へ６Δ４の２−ＫＧＡ生産性
とほぼ同等であった。

該サブクローンを、２−ＫＧＡ高生産株のＮ４４−１　
に導入した場合には、それらは、休止系においてＬソル
ボースもしくはＬ−ソルボソンいずれからも第６表に示
す様にＮ４４−１より良好な２−ＫＧＡ収量を示した。

５ＮＤＩ（遺伝子を含むプラスミドを有する株によるし
一ソルボソンからの２−ＫＧＡのモル収率は９０％であ
り、一方、ベクターブラスミドのみを有する株によるモ
ル収率は、２０％であった。Ｓ　Ｎ　Ｄ　Ｈ遺伝子を含
む株による］４−ソルボースからの２−ＫＧＡへのモル
収率は６０から７０％であり、一方５ＮＤＨ遺伝子を含
まない株のモル収率は約４０％であった。

（来夏以下余白） 実」１肘−川 グルコノバクタ−オキシダンスＩＦＯ１２２５８を２０
０ｍ１のマンニトールブロス（ＭＢ）　（２５ｇ／　Ｅ
マンニトール、３　ｇ／　ｅバクトベブトン５　ｇ／　
ｉ酵母エキス）中で４８時間３０″Ｃで培養した。細胞
を遠心分離により集菌し、１００　ｍｌのＴｒｉｓ（ｂ
０ｍＭ）−ＥＤＴＡ（ｂｍＭ）　ＩＩ衝液液ｐＨ７５，
で洗浄後、５０ｍｐ、のＴｒ　ｉｓ　（ｂ０ｍＭ）　−
ＥＤＴＡ　（２０ｍＭ）緩衝液ｐ）１７．５．に再懸濁
した。

この様に調製した細胞懸濁液を２ｄのリゾチーム溶液（
ｂ０ｍｇ／滅）で３７°Ｃ３０分間処理した後、プロナ
ーゼ（４０００ユニット）で３７°Ｃ３０分間、次いで
１０ｍ１の５％ＳＤＳで３７°Ｃ１時間処理した。この
時点で透明溶菌液を得た。ＤＮＡを中性フェノール：４
％オクタツール含有クロロホルム（ｂ：　１）の６０ｄ
で４°Ｃで３０分間ゆっくり回転させて抽出した。この
混合液を１５０００ｒｐｍ（２８，ＯＯＯｇ）で１５分
間遠心分離し、得られた上清を６０−のクロロホルム：
オクタソール（９６：　４）で４°ＣＩＯ分間ゆっくり
回転させて抽出した。

１５０００ｒｐｍ　（２８，ＯＯＯｇ）での１５分間の
遠心分離により取得した５０ｍ１の上澄に、３Ｍの酢酸
ナトリウム５　ｍｆｌ及び冷エタノール５５雁を添加し
た。粗精製ＤＮＡは、ガラス棒で巻きとって取得し、次
に再びＲＮａｓｅ　Ｔ、及びＡ（３７°Ｃ１３０分間）
及びプロナーゼ（３７’Ｃ１３０分間）で処理した。フ
ェノールとクロロホルム抽出を繰返して、純品染色体Ｄ
ＮＡを取得した。

グルコノバクタ−オキシダンスＩＦＯ１２２５８の該染
色体ＤＮＡをＳａｌ　ｌで部分分解した。生じた１５ｋ
ｂから３０ｋｂの断片を電気泳動によりアガロースゲル
から分離した。プラスミドｐＶＫ１０２（ＡＴＣＣ３７
１５８）　　ＤＮＡを５ａｌｌで完全分解し、牛小腸ア
ルカリフォスファターゼで脱リン酸化した。１５ｋｂか
ら３５ｋｂのＤＮＡ断片と直鎖状ＰＶＫ１０２　ＤＮＡ
をＴ４ＤＮＡＩＪガーゼで連結した。

連結断片をパッケージングキット（アマジャム社製）を
用いてインビトロパッケージングに用い、生じたファー
ジ粒子を大腸菌ＥＤ８７６７　（Ｍ肛ｒａｙ　ら、Ｍｏ
１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、↓５０．５３．１９７７
）　　と保０　し、感染させた。この細胞懸濁液を５０
μｇ７ｍ１．のカナマイシンを含有するＬ　Ｂ寒天平板
に塗抹した。

１０００個のｋｍ’コロニーを、かきとり、Ｍｉ換えプ
ラスミド混合物を調製するために用いた。このプラスミ
ドＤＮＡを用い、大腸菌ＳＳ１７−１（Ｓ’、Ｔｒａ”
）を形質転換した。１４００個の形質転換体を拾い上げ
１００μｇ／ｍβのストレプトマイシン及び５０μｇ／
ｍＱのカナマイシンを含有するＬＢ培地を含むマイクロ
タイタープレートへ移植し、−晩培養し、１５％グリセ
ロールを添加し、大腸菌（Ｓ１７−１）内でのグルコノ
バクタ−オキシダンス１ＦＯ１２２５８の遺伝子ライブ
ラリーとして一８０°Ｃで保存した。この挿入断片の平
均長は、２５ｋｂから３０ｋｂであった。

大腸内グルコノバクターオキシダンスＩＦＯ１２２５８
コスミド遺伝子ライブラリーを、グルコノバクタ−オキ
シダンス０Ｘ−４（ヨーロッパ特許出願公開番号第２１
３５９１号に記述の変異処理によりグルコノバクタ−オ
キシダンスＩＦＯ３２９３から取得した１、−ソルボソ
ン蓄積変異株）へ両株間での二組間接合伝達により導入
した。

マンニトールブロス内で増殖させた受容閑グルコノバク
ターオキシダンス０Ｘ−４の対数増殖期の培養液２００
ｕｆｆｉを、挿入ＤＮＡを有すルｐＶＫ１０２保持犬腸
菌５１７−１全ての対数増殖期培養液１００μＰに別々
に混合し、フラクトースブロス（５０ｇ／　Ｅフラクト
ース、５ｇ／Ｅ酵母エキス、５　ｇ／　ｐ、ポリペプト
ン）寒天平板表面上のニトロセルロースフィルター上に
スポットした。この寒天平板を一晩３０゛Ｃで培養した
。混合コロニーを、１０μｇ７ｍｌのポリミキシンＢ及
び５０μｇ／ｄのカナマイシンを含むＭＢ　　（ＭＰＫ
）寒天平板に広げ、４日間３０°Ｃで培養した。

生じた接合伝達体をＭＰＫ寒天平板に再び広げ純化した
。

スクリーニングは、ミニ休止系を用いて行なった。約１
４００株の挿入ＤＮＡを有するｐＶＫ１０２を保持する
グルコノバクタ−オキシダンス０Ｘ−４を別々に３ｇＮ
！のＮａＣ１、Ｌｏｇ／　ＥのＣａＣ０、及び３０ｇ／
　ｌのしソルボースまたはＬ−ソルボソンを含む反応混
液５０μｉに懸濁し、３０°Ｃで１から５日間保温した
。

２、、ＫＧＡ生卒の分析は、シリカゲルの薄層クロマト
グラフィーにより行ない、一つのポジティブクローン、
ｐ７Ａ６を取得した。

組換えプラスミドｐ７Ａ６をＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤ
ｏｌｙ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ工、　１５１３４５２３　［１９７９１）のアルカリ
法で調製し、次の制限酵素で切断した：ＥｃｏＲＩ　　
ＥｃｏＲＶ、　Ｈａｅｍ、　１ｌｉｎｃｌｌ、　Ｎｒｕ
Ｉ、　Ｓａｌ　ＩｔＳａ＋１３Ａ、　Ｘｈｏｌｌ、　Ｂ
ａｍＨＩ、　Ｂｇｌｒ［、ＤｒａＩ、　１（ｉｎｄｌｌ
ｌ及びＳｎ＋ａ　Ｉ　、　ＥｃｏＲＩ　、　Ｈｉｎｃ　
Ｔｌ　、　Ｎｒｕ　Ｉ及び５ａｌＩは、ｐ７Ａ６の挿入
Ｄ　Ｎ　Ａ　（２５ｋｂ）を８から１１断片に切断した
。Ｈａｅ　ＩＩＩ　、　５ａｕ３Ａ及びＸｈｏ　ＩＩで
は多数の断片が生じた。５ａｌＩをサブクローニングの
第一段階用に選択した。

ｐ７Ａ６をＳａｌ　Ｉで部分分解し、脱リン酸化した５
ａｌＩ切断ｐＶＫ１０２　ＤＮＡと結合した。、：：（
７）ＤＮＡ混合物を形質転換により大腸菌５１７−１へ
導入し、次に二組間結合伝達によりグルコノバクタ−オ
キシダンス０Ｘ−４へ導入した。２００ケの接合伝達体
をミニ休止系でスクリーニングして最小のサブクローン
、　ｐ７Ａ６Δ２を分離し、その挿入断片長は９．２ｋ
ｂであった（第４図−（ａ））、サブクローニング第二
段階は、ｐ７＾６Δ２のＥｌ−Ｅ２断片の欠失により行
なった。この様にして得たｐ７Ａ６Δ３（第４図−（ｂ
））をさらにＥｒ／ｚ−５ｍｙ断片の欠失により短縮化
した。生じたサブクローン、　ｐ７Ａ６Δ４（第４図−
（ｃ））は、ベクターｐＶＫ１０２内にＳＩｎｚ−３ｍ
３の小欠失の起ったベクターＤＮＡに３．１ｋｂを有し
ていた。３．　ｌｋｂのＳ＋−５ｚＥｌ／□（ＳＳＥ）
断片の詳細な制限酵素地図を第５図に示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、シャトルベクターｐＧＥ１の構築のスキーム
を示す図、 第２図は、プラスミドｐＧＥ１への膜結合型！、−ソル
ボソン脱水素酵素遺伝子の挿入を示す制限酵素地図、 第３図は、プラスミドｐＧＥ１およびｐＧＩＥ−５ＮＢ
２ノ制限酵素地図、 第４図は、プラスミドｐ７Ａ６Δ２、ｐ７Ａ６Δ３およ
びｐ７Ａ６Δ４の制限酵素地図、ならびに第５図は、プ
ラスミドｐ７Ａ６Δ４のＳＳＥ断片の制限酵素地図であ
る。 特許出願人　エフ・ホフマンーラ・ロシュ・アーゲー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、１つ以上のマーカー遺伝子、大腸菌内で機能できる
   複製起点、グルコノバクターオキシダンス内で機能でき
   る複製起点及びＭｏｂ部位を有するシャトルベクター。 ２、前記マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子である請
   求項１に記載のベクター。 ３、１つ以上の挿入断片を有する請求項１又は２に記載
   のベクター。 ４、前記挿入断片が、マルチクローニング部位を有する
   ＤＮＡ配列、発現制御配列、ｃｏｓ部位、ターミネータ
   ー配列、リボソーム結合部位、シグナルペプチド及び／
   又は蛋白質をコードするＤＮＡ配列から成る群より選択
   される請求項３に記載のベクター。 ５、請求項１ないし４に記載のベクターが導入されたグ
   ルコノバクター属又はアセトバクター属の接合伝達体。 ６、グルコノバクター属又はアセトバクター属に属する
   菌株を、接合伝達条件下において、請求項１ないし４の
   いずれかに定義されたベクターで形質転換された大腸菌
   の菌株と接触させることを特徴とする請求項５に記載の
   接合伝達体の製造方法。 ７、（ａ）マーカー遺伝子を含むＤＮＡを調製し；（ｂ
   ）大腸菌内で機能できる複製起点を含むＤＮＡを調製し
   ； （ｃ）グルコノバクター内で機能できる複製起点を含む
   ＤＮＡを調製し； （ｄ）Ｍｏｂ部位を含むＤＮＡを調製し；及び（ｅ）（
   ａ）から（ｄ）に記載のＤＮＡを適当な制限酵素により
   消化し、連結させることにより結 合させる ことを特徴とする請求項１ないし４に記載のシャトルベ
   クターの製造方法。 ８、グルコノバクター属又はアセトバクター属の菌株に
   、発現制御配列に作用的に連結された前記ポリペプチド
   をコードするＤＮＡ配列を含む請求項１ないし４に記載
   のシャトルベクターを接合伝達法により導入し、該接合
   伝達体を適当な成育条件下にて培養し、該培養液より所
   望のポリペプチドを単離することを特徴とする原核生ま
   たは真核性ポリペプチドの製造方法。