JPH0314434B2 - - Google Patents
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- JPH0314434B2 JPH0314434B2 JP58143438A JP14343883A JPH0314434B2 JP H0314434 B2 JPH0314434 B2 JP H0314434B2 JP 58143438 A JP58143438 A JP 58143438A JP 14343883 A JP14343883 A JP 14343883A JP H0314434 B2 JPH0314434 B2 JP H0314434B2
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Description
この発明はプラスミドベクターpUT32に関す
る。pUT32は、バチルス属細菌を宿主として増
殖できるものである。 従来、バチルス属細菌を宿主として増殖できる
ベクターとしては、pUB110をはじめ多数のスタ
フイロコツカス属菌由来のベクターが知られてい
るが、これらは、何れもバチルス、ズブチリスＭ
株及びその系統の株を宿主とするものが多く、工
業生産菌として知られるバチルス・ズブチリスＫ
株を宿主として増殖できるベクターの例は少な
い。例えば、pUB110はバチルス・ズブチリスＫ
株では全く発現せず、又、プラスミドpTP4はＫ
株を殆んど形質転換しなく、いずれも実用的なベ
クターといえなかつた。そこで、バチルス・ズブ
チリスＫ株を宿主として増殖できる実用的なベク
ターの開発を目指して種々検討した。 その結果、本発明者らは、バチルス属細菌を宿
主として増殖するプラスミドである、分子量4.5
メガダルトンであつて第１図に示す制限酵素地図
を有するプラスミドベクターpUT32を造成する
ことに成功した。このプラスミドベクターは、カ
ナマイシン及びクロラムフエニコール耐性の遺伝
情報を有し、コピー数が大きく、更に制限酵素
Aua、BamH、Pvu、EcoR、Bglでは
１箇所しか切断されない。更にバチルス・ズブチ
リスＫ株のみならず、多種のバチルス属細菌を宿
主として増殖でき、ベクターとして極めて勝れて
いる。 プラスミドベクターpUT32は実施例１に示す
方法により造成した。 本発明の宿主菌として利用しうる菌株は、バチ
ルス属細菌に属する菌株であり、例えば次のよう
なものがあげられる。 バチルス・ズブチリス ATCC6051（Ｍ株） バチルス・ズブチリス IAM1523（Ｋ株） バチルス・ブレビス ATCC8246 バチルス・セレウス ATCC14579 バチルス・ステアローサーモフイラス
ATCC12980 バチルス・リヘニホルミス ATCC14580 バチルス・メガテリウム ATCC14581 バチルス・ポリミキサ ATCC842 バチルス・プミルス ATCC7061 バチルス・アミロリクエフアーシエンス
ATCC23350 バチルス・チユーリンジエンシス ATCC10792 プラスミドpUT32の宿主として、制限酵素活
性が低められた変異を用いるのが好ましい。 本発明のプラスミドとして、pUT32に外来又
は異種の遺伝子が挿入されたようなものも含まれ
る。外来又は異種遺伝子のpUT32の挿入位置は、
前記制限酵素切断箇所が１である箇所が好まし
い。 本発明で示すプラスミドpUT32は、アミノ酸、
核酸、各種酵素、抗生物質等の工業生産菌を宿主
とすることができ、組換えDNA法による有用菌
株の育種に使用することができる。 実施例 １ (1) 材料プラスミドの調製 () プラスミドpUB110はスタフイロコツカ
ス・オーレウス由来の分子量3.0メガダルト
ンのプラスミドであり、バチルス・ズブチリ
スＭ株を宿主として増殖し、カナマイシン耐
性を発現する〔Keggins、K.M.、Louett、
P.S.and Duvall、E.J.、Proc.Natl.Acad.
Sci.、75、1423（1978）〕。プラスミド
pUB110DNAは次の様にして調製した。 バクト・ペナツセイブロス（Bacto−
Penassay Broth）（デイフコ社製）１中、
30℃にてバチルス・ズブチリスIE6（プラス
ミドpUB110保有菌株）を対数増殖期後期ま
で培養し、菌体を集めた。得られた菌体をリ
ゾチームとSDSにより溶菌せしめた後、菌体
を、20000rpmで30分間遠心分離し、90mlの
上澄液を得た。上澄液中のプラスミドDNA
を、上澄液に２容の冷エタノールを添加して
沈澱せしめて採取した。この沈澱を６mlの
TEN緩衝液に溶解した。 この試料3.5mlに0.25MEDTA1ml、エチジ
ウムブロマイド溶液（4.6mg／ml）0.5ml、塩
化セシウム５ｇを混合溶解し、屈折率を
1.390に調製した後、この溶液について15℃、
40000rpmにて20時間、平衡密度勾配遠心を
行つた。 遠心終了後、3650オングストロームの紫外
線照射下でDNAの蛍光バンドを検出し、プ
ラスミドDNA画分を分取し、精製し250μｇ
の純粋なプラスミドDNAを分離した。 () プラスミドpTP4はバチルス・ズブチリ
スIE12（プラスミドpTP4保有菌株）を使用
して、（）と同様の方法により200μｇの純
粋なプラスミドDNAを得た。 (2) 複合プラスミド液の調製 () pUB110のDNA（5μｇ）を制限酵素Xba
（BRL社製）10ユニツトを使用して37℃、
120分の反応により完全に切断した。 () pTP4のDNA（5μｇ）は、制限酵素Xda
（BRL社製）10ユニツトを使用して、37
℃、120分の反応により、完全に切断した。 () （）と（）で得たDNAを混合し制
限酵素を不活化するため65℃で10分間熱処理
した後、ATPとジチオスレイトール存在下
にて22℃で２時間0.01ユニツトのT4フアージ
DNAリガーゼを作用させた。T4フアージ
DNAリガーゼを65℃、10分間の処理で不活
化し、これに２倍量のエタノールを加えた
後、10000rpm、15分間の遠心分離により
DNAを回収した。このようにして得た複合
プラスミド溶液を次項で述べる形質転換に使
用した。 (3) 形質転換株の選択 バチルス・ズブチリスAJ11711（アルギニン、
ロイシン複要求性変異株）を「Pennassay
Btoth」（Difco）に接種して30℃にて一晩振盪
培養を行い、第培養培地（グルコース0.5
ｇ／dl、（NH4）2SO40.2ｇ／dl、KH2PO40.6
ｇ／dl、K2HPO41.4ｇ／dl、MgSO4・
7H2O0.02ｇ／dl、クエン酸ナトリウム0.1ｇ／
dl、酵母エキス0.2ｇ／dl、Ｌ−アルギニン25
mg／dl、Ｌ−ロイシン５mg／dlを含む）に接種
し、37℃にて４時間振盪培養を行つた後、さら
に第培養培地（グルコース0.5ｇ／dl、
（NH4）2SO40.2ｇ／dl、KH2PO40.6ｇ／dl、
K2HPO41.4ｇ／dl、MgSO4・7H2O0.12ｇ／
dl、クエン酸ナトリウム0.1ｇ／dl、酵母エキ
ス0.02ｇ／dl、Ｌ−アルギニン５mg／dl及びＬ
−ロイシン0.5mg／dlを含む）へ接種し、37℃
にて1.5時間振盪培養を行うことによつていわ
ゆるコンピテントな（DNA取り込み能を有す
る）細胞を調製した（参考文献：J.Bacteriol.、
81、741（1961））。このコンピテント細胞懸濁液
に(2)で得たDNAの溶液を加えて37℃でさらに
２時間振盪培養を行つて形質転換反応を完了さ
せた後、細胞懸濁液をカナマイシン5μｇ／ml、
クロラムフエニコール10μｇ／ml含有最少培地
プレート（グルコース0.5ｇ／dl、
（NH4）2SO40.2ｇ／dl、KH2PO40.6ｇ／dl、
K2HPO41.4ｇ／dl、MgSO4・7H2O0.02ｇ／
dl、クエン酸ナトリウム0.1ｇ／dl、Ｌ−アル
ギニン10mg／dl、Ｌ−ロイシン10mg／dl、寒天
２ｇ／dl、PH7.2）に塗沫し、37℃で培養した。
３日後に上記培地上に５個のコロニーが出現し
たので、これを釣菌し各クローンをそれぞれ純
粋に分離した。 得られた形質転換株の性質は、いずれもアル
ギニン、ロイシン複要求性、カナマイシン耐
性、クロラムフエニコール耐性を示した。 尚、pUB110、pTP4いずれか又は両方の
DNAを除いた区分ではコロニーは得られなか
つた。上で得られたコロニーの内、バチルス・
ズブチリスAJ12068を代表として選び、プラス
ミドの制現酵素切断地図を作製した。 (4) プラスミドの同定 バチルス・ズブチリスAJ12068を用いて
Kadoらの方法（Kado、C.I.、and Liu、S.T.、
Ｊ、Bacteriol.、145、1365（1981））によりプ
ラスミドの検出及び分子量の測定を行なつた。
分子量は、4.5メガダルトンであり、このプラ
スミドをpUT32と命名した。pUT32の構築過
程と、各種制限酵素による切断地図を第１図に
示した。 尚、pUT32を保有するバチルス・ズブチリ
スAJ12068はFERM−P7181として寄託されて
いる。 (5) pUT32による再形質転換 (1)と同様の方法により、複合プラスミド
pUT32を保有するバチルス・ズブチリス
AJ12068から、pUT32を調製し200μｇを得た。 次に複合プラスミドの形質発現を確認する目
的で、(3)と同様な方法により、バチリス・ズブ
チリスAJ11711（アルギニン、ロイシン複要求
性変異株）に複合プラスミドpUT32を導入し
た。その結果、1μｇのpUT32あたり５×104個
のカナマイシン耐性かつクロラムフエニコール
耐性のコロニーが出現した。このコロニーよ
り、24コロニーを釣菌し、(4)のKadoらの方法
によりプラスミドの検出をしたところ、何れの
コロニーもpUT32と同じく分子量（4.5メガダ
ルトン）であつた。 (6) バチルス・ズブチリスＫ株への形質転換頻度 バチルス・ズブチリスＫ株をプロトプラスト
化し、次にプラスミドを移入する方法
〔Chang、S.and Choen、S.N.、Molec.Gen.
Genet.、168、111（1979）〕により、プラスミド
をＫ株に形質転換し、その頻度を測定した。結
果を第１表に示す。
る。pUT32は、バチルス属細菌を宿主として増
殖できるものである。 従来、バチルス属細菌を宿主として増殖できる
ベクターとしては、pUB110をはじめ多数のスタ
フイロコツカス属菌由来のベクターが知られてい
るが、これらは、何れもバチルス、ズブチリスＭ
株及びその系統の株を宿主とするものが多く、工
業生産菌として知られるバチルス・ズブチリスＫ
株を宿主として増殖できるベクターの例は少な
い。例えば、pUB110はバチルス・ズブチリスＫ
株では全く発現せず、又、プラスミドpTP4はＫ
株を殆んど形質転換しなく、いずれも実用的なベ
クターといえなかつた。そこで、バチルス・ズブ
チリスＫ株を宿主として増殖できる実用的なベク
ターの開発を目指して種々検討した。 その結果、本発明者らは、バチルス属細菌を宿
主として増殖するプラスミドである、分子量4.5
メガダルトンであつて第１図に示す制限酵素地図
を有するプラスミドベクターpUT32を造成する
ことに成功した。このプラスミドベクターは、カ
ナマイシン及びクロラムフエニコール耐性の遺伝
情報を有し、コピー数が大きく、更に制限酵素
Aua、BamH、Pvu、EcoR、Bglでは
１箇所しか切断されない。更にバチルス・ズブチ
リスＫ株のみならず、多種のバチルス属細菌を宿
主として増殖でき、ベクターとして極めて勝れて
いる。 プラスミドベクターpUT32は実施例１に示す
方法により造成した。 本発明の宿主菌として利用しうる菌株は、バチ
ルス属細菌に属する菌株であり、例えば次のよう
なものがあげられる。 バチルス・ズブチリス ATCC6051（Ｍ株） バチルス・ズブチリス IAM1523（Ｋ株） バチルス・ブレビス ATCC8246 バチルス・セレウス ATCC14579 バチルス・ステアローサーモフイラス
ATCC12980 バチルス・リヘニホルミス ATCC14580 バチルス・メガテリウム ATCC14581 バチルス・ポリミキサ ATCC842 バチルス・プミルス ATCC7061 バチルス・アミロリクエフアーシエンス
ATCC23350 バチルス・チユーリンジエンシス ATCC10792 プラスミドpUT32の宿主として、制限酵素活
性が低められた変異を用いるのが好ましい。 本発明のプラスミドとして、pUT32に外来又
は異種の遺伝子が挿入されたようなものも含まれ
る。外来又は異種遺伝子のpUT32の挿入位置は、
前記制限酵素切断箇所が１である箇所が好まし
い。 本発明で示すプラスミドpUT32は、アミノ酸、
核酸、各種酵素、抗生物質等の工業生産菌を宿主
とすることができ、組換えDNA法による有用菌
株の育種に使用することができる。 実施例 １ (1) 材料プラスミドの調製 () プラスミドpUB110はスタフイロコツカ
ス・オーレウス由来の分子量3.0メガダルト
ンのプラスミドであり、バチルス・ズブチリ
スＭ株を宿主として増殖し、カナマイシン耐
性を発現する〔Keggins、K.M.、Louett、
P.S.and Duvall、E.J.、Proc.Natl.Acad.
Sci.、75、1423（1978）〕。プラスミド
pUB110DNAは次の様にして調製した。 バクト・ペナツセイブロス（Bacto−
Penassay Broth）（デイフコ社製）１中、
30℃にてバチルス・ズブチリスIE6（プラス
ミドpUB110保有菌株）を対数増殖期後期ま
で培養し、菌体を集めた。得られた菌体をリ
ゾチームとSDSにより溶菌せしめた後、菌体
を、20000rpmで30分間遠心分離し、90mlの
上澄液を得た。上澄液中のプラスミドDNA
を、上澄液に２容の冷エタノールを添加して
沈澱せしめて採取した。この沈澱を６mlの
TEN緩衝液に溶解した。 この試料3.5mlに0.25MEDTA1ml、エチジ
ウムブロマイド溶液（4.6mg／ml）0.5ml、塩
化セシウム５ｇを混合溶解し、屈折率を
1.390に調製した後、この溶液について15℃、
40000rpmにて20時間、平衡密度勾配遠心を
行つた。 遠心終了後、3650オングストロームの紫外
線照射下でDNAの蛍光バンドを検出し、プ
ラスミドDNA画分を分取し、精製し250μｇ
の純粋なプラスミドDNAを分離した。 () プラスミドpTP4はバチルス・ズブチリ
スIE12（プラスミドpTP4保有菌株）を使用
して、（）と同様の方法により200μｇの純
粋なプラスミドDNAを得た。 (2) 複合プラスミド液の調製 () pUB110のDNA（5μｇ）を制限酵素Xba
（BRL社製）10ユニツトを使用して37℃、
120分の反応により完全に切断した。 () pTP4のDNA（5μｇ）は、制限酵素Xda
（BRL社製）10ユニツトを使用して、37
℃、120分の反応により、完全に切断した。 () （）と（）で得たDNAを混合し制
限酵素を不活化するため65℃で10分間熱処理
した後、ATPとジチオスレイトール存在下
にて22℃で２時間0.01ユニツトのT4フアージ
DNAリガーゼを作用させた。T4フアージ
DNAリガーゼを65℃、10分間の処理で不活
化し、これに２倍量のエタノールを加えた
後、10000rpm、15分間の遠心分離により
DNAを回収した。このようにして得た複合
プラスミド溶液を次項で述べる形質転換に使
用した。 (3) 形質転換株の選択 バチルス・ズブチリスAJ11711（アルギニン、
ロイシン複要求性変異株）を「Pennassay
Btoth」（Difco）に接種して30℃にて一晩振盪
培養を行い、第培養培地（グルコース0.5
ｇ／dl、（NH4）2SO40.2ｇ／dl、KH2PO40.6
ｇ／dl、K2HPO41.4ｇ／dl、MgSO4・
7H2O0.02ｇ／dl、クエン酸ナトリウム0.1ｇ／
dl、酵母エキス0.2ｇ／dl、Ｌ−アルギニン25
mg／dl、Ｌ−ロイシン５mg／dlを含む）に接種
し、37℃にて４時間振盪培養を行つた後、さら
に第培養培地（グルコース0.5ｇ／dl、
（NH4）2SO40.2ｇ／dl、KH2PO40.6ｇ／dl、
K2HPO41.4ｇ／dl、MgSO4・7H2O0.12ｇ／
dl、クエン酸ナトリウム0.1ｇ／dl、酵母エキ
ス0.02ｇ／dl、Ｌ−アルギニン５mg／dl及びＬ
−ロイシン0.5mg／dlを含む）へ接種し、37℃
にて1.5時間振盪培養を行うことによつていわ
ゆるコンピテントな（DNA取り込み能を有す
る）細胞を調製した（参考文献：J.Bacteriol.、
81、741（1961））。このコンピテント細胞懸濁液
に(2)で得たDNAの溶液を加えて37℃でさらに
２時間振盪培養を行つて形質転換反応を完了さ
せた後、細胞懸濁液をカナマイシン5μｇ／ml、
クロラムフエニコール10μｇ／ml含有最少培地
プレート（グルコース0.5ｇ／dl、
（NH4）2SO40.2ｇ／dl、KH2PO40.6ｇ／dl、
K2HPO41.4ｇ／dl、MgSO4・7H2O0.02ｇ／
dl、クエン酸ナトリウム0.1ｇ／dl、Ｌ−アル
ギニン10mg／dl、Ｌ−ロイシン10mg／dl、寒天
２ｇ／dl、PH7.2）に塗沫し、37℃で培養した。
３日後に上記培地上に５個のコロニーが出現し
たので、これを釣菌し各クローンをそれぞれ純
粋に分離した。 得られた形質転換株の性質は、いずれもアル
ギニン、ロイシン複要求性、カナマイシン耐
性、クロラムフエニコール耐性を示した。 尚、pUB110、pTP4いずれか又は両方の
DNAを除いた区分ではコロニーは得られなか
つた。上で得られたコロニーの内、バチルス・
ズブチリスAJ12068を代表として選び、プラス
ミドの制現酵素切断地図を作製した。 (4) プラスミドの同定 バチルス・ズブチリスAJ12068を用いて
Kadoらの方法（Kado、C.I.、and Liu、S.T.、
Ｊ、Bacteriol.、145、1365（1981））によりプ
ラスミドの検出及び分子量の測定を行なつた。
分子量は、4.5メガダルトンであり、このプラ
スミドをpUT32と命名した。pUT32の構築過
程と、各種制限酵素による切断地図を第１図に
示した。 尚、pUT32を保有するバチルス・ズブチリ
スAJ12068はFERM−P7181として寄託されて
いる。 (5) pUT32による再形質転換 (1)と同様の方法により、複合プラスミド
pUT32を保有するバチルス・ズブチリス
AJ12068から、pUT32を調製し200μｇを得た。 次に複合プラスミドの形質発現を確認する目
的で、(3)と同様な方法により、バチリス・ズブ
チリスAJ11711（アルギニン、ロイシン複要求
性変異株）に複合プラスミドpUT32を導入し
た。その結果、1μｇのpUT32あたり５×104個
のカナマイシン耐性かつクロラムフエニコール
耐性のコロニーが出現した。このコロニーよ
り、24コロニーを釣菌し、(4)のKadoらの方法
によりプラスミドの検出をしたところ、何れの
コロニーもpUT32と同じく分子量（4.5メガダ
ルトン）であつた。 (6) バチルス・ズブチリスＫ株への形質転換頻度 バチルス・ズブチリスＫ株をプロトプラスト
化し、次にプラスミドを移入する方法
〔Chang、S.and Choen、S.N.、Molec.Gen.
Genet.、168、111（1979）〕により、プラスミド
をＫ株に形質転換し、その頻度を測定した。結
果を第１表に示す。
【表】
即ち、pUT32は、プラスミドpUB110、pTP4
と比較して極めて高い形質転換頻度を示した。
と比較して極めて高い形質転換頻度を示した。
第１図は、pTU32の制限酵素切断地図及びそ
の造成経過の説明図である。
の造成経過の説明図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 分子量4.5メガダルトンであつて下記に示す
制限酵素切断地図を有するプラスミドベクター
pUT32。 制限酵素地図：
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58143438A JPS6034183A (ja) | 1983-08-05 | 1983-08-05 | プラスミドｐＵＴ３２ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58143438A JPS6034183A (ja) | 1983-08-05 | 1983-08-05 | プラスミドｐＵＴ３２ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6034183A JPS6034183A (ja) | 1985-02-21 |
| JPH0314434B2 true JPH0314434B2 (ja) | 1991-02-26 |
Family
ID=15338703
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58143438A Granted JPS6034183A (ja) | 1983-08-05 | 1983-08-05 | プラスミドｐＵＴ３２ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6034183A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE58909762D1 (de) * | 1988-05-20 | 1997-02-20 | Ciba Geigy Ag | Bacillus thuringiensis Transformation |
| US4894337A (en) * | 1989-01-17 | 1990-01-16 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Process for the bioproduction of cyclic hydroxides |
-
1983
- 1983-08-05 JP JP58143438A patent/JPS6034183A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6034183A (ja) | 1985-02-21 |
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