BG60920B2 - Метод за стабилна ген амплификация на хромозомна днк на прокариотични микроорганизми - Google Patents
Метод за стабилна ген амплификация на хромозомна днк на прокариотични микроорганизми Download PDFInfo
- Publication number
- BG60920B2 BG60920B2 BG085832A BG8583288A BG60920B2 BG 60920 B2 BG60920 B2 BG 60920B2 BG 085832 A BG085832 A BG 085832A BG 8583288 A BG8583288 A BG 8583288A BG 60920 B2 BG60920 B2 BG 60920B2
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- dna
- strain
- gene
- host cell
- plasmid
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 64
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 title claims description 39
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 90
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 86
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 54
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 25
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 21
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 20
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 20
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 20
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims description 17
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 16
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 15
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 15
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 claims description 12
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 12
- 102220572479 Protein tyrosine phosphatase type IVA 1_T13F_mutation Human genes 0.000 claims description 11
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 claims description 10
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 7
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims description 2
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 2
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 claims 1
- 230000003625 amylolytic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 abstract description 26
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 14
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 38
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 38
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 19
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 18
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 15
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 13
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 6
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 5
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 4
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 3
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 3
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 3
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 3
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- -1 lymphokinins Proteins 0.000 description 3
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 3
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 3
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 235000019263 trisodium citrate Nutrition 0.000 description 3
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 2
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010049190 N,N-dimethylcasein Proteins 0.000 description 2
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 2
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000011147 magnesium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241001479434 Agfa Species 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- JJDDPDHSLLONIF-UHFFFAOYSA-N C=C.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O Chemical compound C=C.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O JJDDPDHSLLONIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001660259 Cereus <cactus> Species 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010076804 DNA Restriction Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000005696 Diammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 239000005569 Iron sulphate Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108010036940 Levansucrase Proteins 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004353 Polyethylene glycol 8000 Substances 0.000 description 1
- 241000132152 Polymyxa Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000635201 Pumilus Species 0.000 description 1
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000192707 Synechococcus Species 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- IDIPWEYIBKUDNY-UHFFFAOYSA-N benzenesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 IDIPWEYIBKUDNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000388 diammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019838 diammonium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000030414 genetic transfer Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229940085678 polyethylene glycol 8000 Drugs 0.000 description 1
- 235000019446 polyethylene glycol 8000 Nutrition 0.000 description 1
- SMKRKQBMYOFFMU-UHFFFAOYSA-N prallethrin Chemical compound CC1(C)C(C=C(C)C)C1C(=O)OC1C(C)=C(CC#C)C(=O)C1 SMKRKQBMYOFFMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940074404 sodium succinate Drugs 0.000 description 1
- ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L sodium succinate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Методът намира приложение в рекомбинантната днк технология за получаване на промишлено значими ензими. Постигната е устойчива интеграция най-малко на две копия днк структури като начин на генна амплификация чрез използване на комбинация от известни методики. Методът се осъществява чрез комбиниране на клетка гостоприемник, кодираща представляващия интерес полипептид с донорна клетка, която съдържа най-малко едно копие от днк последователност, кодираща същия полипептид при условия на трансформация на клетката гостоприемник, с последваща селекция на трансформираните клетки. 17 претенции, 10 фигури
Description
(54) МЕТОД ЗА СТАБИЛНА ГЕН АМПЛИФИКАЦИЯ НА ХРОМОЗОМНА ДНК НА ПРОКАРИОТИЧНИ МИКРООРГАНИЗМИ (57) Методът намира приложение в рекомбинантната ДНК технология за получаване на промишлено значими ензими. Постигната е устойчива интеграция най-малко на две копия ДНК структури като начин на ген амплификация чрез използване на комбинация от известни методики. Методът се осъществява чрез комбиниране на клетка гостоприемник, кодираща представляващия интерес полипептид с донорна клетка, която съдържа най-малко едно копие от ДНК последователност, кодираща същия полипептид при условия на трансформация на клетката гостоприемник, с последваща селекция на трансформираните клетки.
претенции, 10 фигури (54) МЕТОД ЗА СТАБИЛНА ГЕН АМПЛИФИКАЦИЯ НА ХРОМОЗОМНА ДНК ОТ ПРОКАРИОТИЧНИ МИКРООРГАНИЗМИ
Изобретението се отнася до метод за стабилна ген амплификация на хромозомна ДНК прокариотични микроорганизми, приложим в рекомбинантната ДНК-технология за получаване на промишлено значимии ензими.
Известни са няколко пътя за получаване на ензими, такива като алфа амилаза, неутрална пратеаза и алкална или серин протеаза от микроорганизми от род Bacillus с помощта на методите на класическата генетика - мутация и следващ подбор, а така също и чрез съвременните методи на молекулярната биология. В последния случай са описани няколко начина за получаване на големи количества ензими при експресия на хомоложни и хетероложни гени в проокариотни или еукариотни микроорганизми (1-4).
Един от начините за постигане на високо ниво на експресия на гена е да се осигури гена с ефективни регулаторни елементи. Друг начин, често използван в комбинация с първия е да се увеличи броя на копията на гена, който е от значение. Първоначално амплификацията се постига посредством инсерция на гена в мултикопийна екстрахромозомна ДНК молекула, например плазмид. Използването на плазмидите като вектори за експресия и амплификация на генетичната информация обаче има този недостатък, че са нестабилни. За производство в голям мащаб устойчивостта на амплифицирания ген е предпоставка за поддържане на продукция с висок добив от експресирания продукт, закодиран в амплифицирания ген. Нестабилността се изразява в две форми: сегрегационна неустойчивост, при която се появява загуба на плазмид по време на култивирането и структурна неустойчивост, при която част от плазмида се заличава.
Сегрегационната неустойчивост може да се прояви например, когато клетката-гостоприемник приютява вектор, носещ ген. който се свръхекспресира. Обикновено има селективен натиск към клетки, които са загубили способността да свръхекспресират гена, тъй като свръхекспресията влияе неблагоприятно на трансформираната клеткагостоприемник. Голямо количество метаболитна енергия се изразходва за свръхексп ресирания генен продукт,което влияе неблагоприятно върху конкурентоспособността на клетката в сравнение с клетките-гостоприемници, които не свръхекспресират по подобен начин.
Методът,използван за отчитане на сегрегационната неустойчивост, се състои в подбор на клетки, свързващи многокопийни плазмиди, които носят гени, придаващи им предимство спрямо съдържащата плазмид клетка, например - придаващи устойчивост спрямо антибиотик и след това към ферментационната среда се прибавя съответния антибиотик. Обаче при методите за продуцране в промишлен мащаб, антибиотиците не са подходящи за подбор.
Друг метод, използван за намаляване до минимум загубата на плазмид, дължаща се на сегрегационната неустойчивост, се състои в инсерция на гена, който е от функционална значимост за клетката-гостоприемник във векторна молекула /2/.
Този метод обаче не осигурява структурна устойчивост на вектора. Методиките, използвани за разрешаване на проблема за структурната неустойчивост на плазмидите, включват избягване на експресия на гена по време на фазата на експоненциален растеж, например чрез използване на регулиращи последователности, такива като чувствителни на температура е интеграция на екзогена ДНК в хромозомата на клетката-гостоприемник. Други методики пък включват избягване на употребата на автономно реплициращи се векторни молекули и вместо тях използват начини, благоприятстващи интегрирането на въведена в хромозомата на клетката-гостоприемник ДНК.
Методиките за постигане на интеграция на чужда ДНК в хромозомата на клеткатагостоприемник следва да включат хомоложна рекомбинация и нелегитимна рекомбинация. Съществуват два пътя за инсерция на ДНК последователности на специфични места върху хромозомата посредством хомоложна рекомбинация: Campbell — тип хомоложна рекомбинация и двойна реципрочна рекомбинация. илюстрирани на Фиг. 1А и 1В съответно. Трети път за въвеждане на ДНК последователности и хромозома е използването на механизма на двуетапно заместване, илюстриран на Фиг. 10. По принцип се използва Campbell - тип рекомбинация, но крайният резултат е хромозомна конструкция, която не съдържа дублирани последователности и по този начин няма единица, която да може да се амплифицира в рекомбинантната част на хромозомата. Поради това тя прилича на двойно реципрочна рекомбинация.
Освен използването на хомоложна рекомбинация за интеграция на чужда ДНК в хромозомата, възможно е също така ДНК да се интегрира чрез нелегитимна рекомбинация, илюстрирано на Фиг. 1Д. Липсата на тандемни дубликати в получената хромозомна последователност прави пътищата, показани на Фиг. 1А, IB, 1С и 1Д предпочитани за устойчиво въвеждане на ДНК-последователности в генома. Хромозомно интегрираните гени включват както хомоложни, така и хетероложни гени, при което увеличението на хромозомно интегрираната ДНК е в тандемен порядък. Тези хромозомно амплифицирани последователности са описани като нестабилни, въпреки че в някои случаи има съобщения, че са устойчиви.
Известно е интегрирането на екзогенна ДНК в хромозома на Bacillus subtilis /3/, a също така и на Anacystis nigulans /4/ и /5/. Известно е интегрирането посредством хомоложна рекомбинация на хетероложен ген, която е неустойчива когато е върху плазмиден вектор в хромозома на микроорганизъм /6/.
Амплификация на хромозомно интегрирани гени, както хомоложни, така и хетероложни също е описано в литературата /7/, /8/, /9/, /10/, /11/, /12/, /13/, /14/ и /15/ . Спонтанна амплификация в прокариотни клетки също е известно /16/.
Във всички изброени случаи амплификацията на хромозомно интегрирана ДНК е от порядъка на тандемно свързване. В литературата е описано обаче, че този тип хромозомна амплификация е неустойчива /17/.
Стабилизация на природно срещащи се амплифицирани гени, дължащо се на присъствието на други важни гени между тези амплифицирани последователности също е известно. Например от 9 до 10 копия на рибозомния РНК ген, срещащ се в Вас. subtilis, две тандемно разположени вериги са разделени от снопче тРНК гени /18/. В други случаи, природно срещащи се тандемно повтарящи се РНК оперони са заличени, както в Е. coli, така и в Вас. subtilis с малък ефект върху фенотипичните качества на организма /19/ и /20/.
Интегриране на плазмиди върху хромозома на Вас. subtilis посредством нелегитимирана рекомбинация при използването на вектора рЕ194 е известно от /21/ и /22/.
Известно е успешно клониране на някои гени за екзогенни ензими,такива като алфаамилазни гени на Вас. amyloliquefaciens /23/, В. Licheniformis /24/, В. stearothermophilus /25/ и /26/ и Вас. subtilis /27/; леванзахарозният ген на В. subtilis /28/, гените, кодиращи неутрални протеази на Вас. stearothermophilus /29/, Вас. amyloliquefaciens /30/ и Вас. subtilis /31/; гените, кодиращи серии или алкална протеаза на Вас. subtilis /32/, Вас. licheniformis 13Ъ1 и Вас. amyloliquefaciens /34/.
Известно е също за протопластна трансформация на някои видове грам положителни микроорганизми, напр. Вас. subtilis /35/. Подобни успешни опити са описани за трансформацията на протопласти от Вас. megaterium /36/, Вас. amyloliquefaciens /37/, Вас. thuringiensis /38/, Вас. sphaericus /39/ и Вас. larvae /40/. /В същата публикация се съобщава ии за неуспешни опити с Вас. popillae./ Успешни са опитите с Вас. polymyxa, Вас. licheniformis. Вас. macerans и Вас. laterosporus. но не и с Вас. coagulaus. Вас. cereus и Вас. pumilus, макар че е наблюдавано образуването на добри протопласти /41/.
Други методи за интродукция на ДНК в протопласти включва фузия с ДНК-съдържащи липозоми /42/ иили фузия с лесно трансформируем организъм като междинна клетка-гостоприемник /43/.
Недостатък на всички изброени методи е, че не осигуряват стабилна експресия на гена за получаване на желания продукт.
Задача на изобретението е да се създаде метод за устойчива амплификация на гени в хромозомна ДНК на прокариотични клеткигостоприемници, който да осигурява стабилна експресия на гена за получаване на желания продукт.
Задачата се решава чрез метод, съгласно който най-малко две копия на ДНК последователност, кодираща представляващия интерес полипептид, са устойчиво интегрирани в хромозомата на клетка-гостоприемник. Устойчивото съхранение на екзогенната ДНК-последователност се постига посредством интегриране на две или повече копия на последователността в хромозомата на клетка-гостоприемник, при което копията са разделени с помощта на ендогенни хромозомни ДНК-последователности.
На Фиг. 1А до 1Д са представени схематично четири пътя за интегриране на екстрахромозомни ДНК последователности в хромозома на прокариотични микроорганизми.
Т представлява планова последователност, т. е. последователности от ДНК, налични в хромозомата и плазмида. между които може да се осъществи хомоложна рекомбинация.
S заема място за ДНК последователноста, която трябва да бъде интегрирана в хромозомата.
М заема място за маркерна генна последователност, използвана за селекция на рекомбинантния вид.
Фиг. 2А и 2В представляват схематична илюстрация на два пътя за получаване на устойчива ген амплификация в прокариотична хромозома.
Фиг. 3 илюстрира резултатите от хистидин /MOPS гел електрофореза, осъществена на супернатанта от култури на Вас. subtilis ДВ104, съдържаща съответно pUBl 10 и рМ58, сравнени с няколко субтилизини:
Линия I: Carlsbeig субтилизин
Линия 2: Bacillus РВ92 протеаза
Линия 3: Bacillus subtilis субтилизин Линия 4: Вас. subtilis ДВ104 /рМ58/ Линия 5: Вас. subtilis ДВ104 /pLfBl 10/ Фиг. 4 илюстрира рестрикционната карта на плазмда рМ58, като на горната част е показана стратегията за определяне на последователността. Непрекъснатите линии със стрелки сочат клонирани фрагменти във фага М13 с векторите мрЮ, мр!1 и мр18. Долната част на фигурата илюстрира стратегията за определяне на последователността при използване на десет олигонуклеотида, разположени на равни разстояния върху протеазния ген.
Фиг. 5 илюстрира нуклеотидна последователност на кодиращата нишка, която се намира в корелация с аминокиселинната последователност на Вас. РВ92 серин протеазата. Показани са също промотори /Р и Р2/, рибозома-свързващия сайт /rbs/ и терминалните региони /term/ на ДНК последователността. Номерираните непрекъснати линии илюстрират разположението на десетте олигонуклеотида, използвани за определяне на последователността.
Фиг. 6А илюстрира строежа на плазмид рЕ194-пео.
Фиг. 6В илюстрира строежа на плазмид рМАХ-4.
Фиг. 7А: дайджести, приготвени с рестрикционната ендонуклеаза Hind III от хромозомна ДНК на щама РВ92, РВТ109 и РВТ108, които са подложени на електрофореза върху 0,5% агарозен гел, прехвърлен върху нитроцелулоза по описан от Southern начин и хибридизиран с белязана с i2P и преведена в рМ58 ДНК. Фигурата илюстрира една авторадиография.
Фигурите 7В и 7С илюстрират случаите на интегриране, проявяващи се при хомолоожна /В/ рекомбинация и при нелегитимирана /С/ рекомбинация между рМАХ-4 и Bacillus РВ92 хромозома.
Фиг. 8 илюстрира строежа на интегрирания вектор pElatB
Фиг. 9А показва интегрирането на плазмида pElatB в хромозома на Вас. licheniformis щам T9, резултиращ в Вас. licheniformis щам ТВ13.
Фиг. 9В илюстрира хромозомната рекомбинация на В. licheniformis щам ТВ 13 и Т5 при протопластна фузия на тези щамове, резултиращи в Вас. licheniformis щам ТВ 13.
Фиг. 10 показва хромозомен анализ на девет различни колонии, изолирани чрез ферментация на щамовете T13F. Изолираната хромозомна ДНК под въздействие на EcoRI се сепарира върху 0,8% агарозн телове и нитроцелулоза. Хибридизацията се осъществява с белязана с 32Р и преведена /транслирана/ в pElatB ДНК. Фигурата показва една автодиаграма. Горната стрелка показва мястото, където един фрагмент от ДНК, срязан с EcoRI с големина от порядъка на 15 кб, който съдържа цялата ElatB последователност. интегрирана в хромозомата, мигрира към мястото, което не е съседно на първоначалния алфа-амилазен ген, както е описано за щам ТВ13 на Фиг. 9А. Долната стрелка сочи мястото, където EcoRI фрагмента с около 33 кб дължина, който съдържа целия алфа-амилазен ген, присъстващ първоначално в Вас. licheniformis щам Т5 /виж също Фиг. В/ е мигрирал. Анализирани са следните ДНК проби:
Линия 1: Вас. licheniformis Т5 ДНК
Линия 2: Вас. licheniformis ТВ 13 ДНК Линия 3: Вас. licheniformis Т390 ДНК Линия 4: ДНК от чувствително на неомицин производно на Вас. licheniformis 390.
изолирано чрез ферментация.
Линия 1: Вас. licheniformis T13F ДНК
Линия 6-14: ДНК от девет различни колонии, изолирани при ферментация на щам T13F.
Съгласно изобретението са създадени прокариотични клетки, които съдържат две или повече копия на ДНК последователности, интегрирани устойчиво в техния хромозомен апарат. Клетката-гостоприемник, която кодира представляващия интерес полипептид, се трансформира с ДНК структура, включваща споменатата ДНК последователност. Трансформираните клетки, в които интегрираните ДНК последователности са сепарирани от ендогенните хромозомни последователности на гена с оглед амплификация са селекционирани с тази цел. Споменатите ендогенни последователности са жизнено необходими за клетката-гостоприемник. Загубата на амплифицираните последователности посредством хомоложна рекомбинация би била летална за гостоприемника. Така, селекцията на клетки, носещи амплифицирани последователности става независима от използването на антибиотици или други средства за подбор. Интегрирането може да бъде осъществено или посредством хомоложна рекомбинация или чрез нелегитимирана рекомбнация. Методиките,по които могат да се получат желаните клетки са илюстрирани на Фиг. 2А и 2В съответно.
Когато се използва хомоложна рекомбинация във векторната молекула могат да присъстват няколко удължения на ДНК последователностите, които са хомоложни на хромозомата на клетката-гостоприемник, поспециално, когато един или повече от амплифицирания ген вече са въведени в клетката. Така векторната молекула може да включва желаната ДНК-последователност, мишенната ДНК последователност и маркерна ДНК-последовател ност.
Желателно е да се обръща особено внимание на това да се подбират камо желаните хромозомни гарнитури. То може да се постигне чрез използване на линейни ДНК молекули за рекомбинация. За да бъде интегрирана пръстеновидна ДНК молекула, тя трябва да бъде срязана с рестрикционна ендонуклеаза в областта, хомоложна на мишенната последователност. По този начин може с предпочитание да се осъществи рекомбинация и интегриране на това специ фично място. Допълнително, за да присъства във векторната молекула желаната ДНК последователност тя може също да е налице в хромозомата на клетката-гостоприемник. ДНК последователността може да бъде ДНК последователност, кодираща който и да е структурен ген, който да бъде амплифициран. Тя може да бъде ендогенна за гостоприемника или може да бъде инсертирана в хромозомата на този гостоприемник, както и да бъде инсертирана в хромозомата на гостоприемника на предишен етап на трансформацията.
Мишенни последователности за нетандемна ген амплификация за предпочитане е да бъдат избрани измежду неесенциални гени, например в случая Bacillus, използван като гостоприемник. Гените, кодиращи екстрацелуларни ензими или гените, включени в спорулацията, могат да бъдат използвани като мишенни последователности. Интегрирането на ДНК последователности в тези гени обикновено инактивира тези гени. Тогава може да се наблюдава загуба на експресия на гена и да се използва за селекция на желаните рекомбинантни щамове.
Когато за ген амплификация се използва нелигитимирана рекомбинация, както е посочено на Фиг. 10 и на Фиг. 2А, предпочитани са тези условия за интеграция и подбор, при които хомоложната рекомбинация няма да преобладава над нелигитимираната рекомбинация. Предпочитан начин за избягване на хомоложната рекомбинация е да се трансформират първата и втора клетка-гостоприемник, на които липсва желания структурен ген, с вектор, съдържащ ДНК последователност, кодираща представляващия интерес полипептид и маркерен ген. Първата и втора клетка гостоприемници, в които ДНК последователност присъства на различни нива, могат след това да бъдат селекционирани и комбинирани при условията на фузия до получаване на трансформирана клетка, която притежава най-малко две копия на ДНК последователността, кодираща желания структурен ген на различни места от генома на втория гостоприемник. За улеснение на селекцията, първия гостоприемник може да бъде умъртвен преди фузията.
Представляващите интерес гени могат да бъдат които и да са прокариотични или еукариотични ген. Те могат да включват бактериални гени, гени на едноклетъчни мик5 роорганизми, гени на бозайници или други подобни. Структурните гени могат да бъдат получени по различни начини, вкл. синтез, изолиране на геномна ДНК, получаване от сДНК или комбинация от тях. Методите за манипулация с гените са добре известни и включват рестрикция, усвояване, резекция, лигатиране, in vitro мутагенеза, възстановяване на праймера, използване на линкери и адаптери и др. Така ДНК последователности, получени от гостоприемник, могат да бъдат обработени по различен начин в зависимост от ДНК-конструкцията /44/.
Структурните гени могат да експресират различни полипептиди или проетини, такива като ензими, хормони, лимфокинини, имуноглобулини или друг подобни от бозайници, едноклетъчни микроорганизми, растения или други източнинии на ДНК. От особен интерес са ензимите, по-специално амилазите и протеазите. Примери за такива ензими са серинови или несеринови протеази, вкл. няколко вида алкални протеази, алфа и бета амилази и др. Предпочитан източник на серин протеази е Вас. novo sp. РВ92 и за алфа амилазата - Вас. licheniformis щам Т5, както и мутантите и вариантите на тези щамове.
Генът, който формира част от вектора, може да бъде получен по методи, които са познати в тази област Hii техниката. Найобщо, методите предвиждат получаване на геномна енциклопедия от организма, експресиращ силно алкална протеза. Геномната енциклопедия се приготвя удобно например посредством лигатиране на ДНК фрагменти от донорния щам в подходящ вектор.
С термина подходящ вектор се обозначава ДНК структура, включваща структурен ген, който кодира протеин или полипептид, представляващ интерес. Структурният ген се свързва при правилна ориентация към контролиращи области, като промоторна последователност, рибозомасвързващото място, области, контролиращи завършването /терминацията/ на транскрибцията и транслацията на структурния ген, които области са функционални в клетката на гостоприемника. Векторът може да съдържа допълнително източник на репликация, когато клеткатагостоприемник има трансформационни и интеграционни честоти,твърде ниски, за да позволят директен подбор за интегриране без междинно изолиране на плазмидосъдържащи клетки, такива като промишлените видове Bacillus.
Когато генът е получен от донорна клетка, която има регулаторни сигнали за иницииране на транскрибция и транслация и за терминация, които се разпознават от прокариотичния клетъчен щам-гостоприемник, удобно е да се съхрани оригиналната регулаторна последователност на структурния ген. В допълнение, областта, инициираща транскрибциията маже да осигури конститутивна или индукативна експресия, така че при подходяща ситуация, гостоприемникът да бъде култивиран до висока плътност, преди да бъде получено високо ниво на експресия на желания стурктурен ген.
Когато структурният ген е от източник, чиито регулаторни сигнали не са разпознати от клетката -гостопиремник, явява се необходимост от получаване на регулаторни области, разпознаваеми от клетката-гостоприемник и инсерцията им между иницииращия и терминаторен сигнали. В някои случаи може да бъде вмъкнат екзогенен структурен ген с неговия собствен стоп-кодон в рамката за четене зад П-терминиращите колони на ендогенен структурен ген, който запазва естествените си регулаторни сигнали.
Желателно е секретираният продукт да може да бъде секретиран. Когато експресионният продукт се секретира по естествен начин и водещите и обработващи сигнали са разпознаваеми от клетката-гостоприемник. това не представлява трудност. Когато обаче продуктът не се секретира, т. к. клетката не разпознава сигналите или тези сигнали не са функционални в задоволителна степен в клетката, тогава се налага да се изолират или секретират ДНК-последователности, кодиращи секреторни водещи сигнали или обработващи сигнали, които да се свържат в правилна четяща рамка към 5' - края на структурния ген.
Векторът допълнително може да включва генен маркер, придаващ устойчивост срещу антибиотик, спрямо който клетката е чувствителна. Маркерният ген трябва да задоволи изискването селекцията да е възможна дори ако само едно или няколко копия на този ген да са налице в щамагостоприемник. Под маркерен ген се разбира структурен ген, способен на експресия в гостоприемник, който осигурява селекцията. Различните ДНК-последователности мо6 гат да имат различен произход и, свързани заедно, да осигуряват вектор, който включва едно или повече подходящи, за предпочитане единствени, рестрикционни места, позволяващи инсерция или субституция на структурните гени на тези места или на мястото на загубени фрагменти с оглед осигуряване на плазмидната конструкция.
Подборът на хромозомна интеграция може да бъде насочван посредством използване на плазмид с източник на репликация, който притежава мутация, която осигурява функцията „чувствителност спрямо температура“ на клетката-гостоприемник.
След като веднъж е изготвена, конструкцията на плазмида трябва да бъде клонирана в клетка-гостоприемник. Може да бъде използван всеки гостоприемник, който е подходящ за трансформиране и позволява репликация на плазмидната конструкция и трансфер в клетката на гостоприемника. Налице са голям брой щамове с висока ефектвност на трансформация и които обикновено са ауксотрофни и/или чувствителни към антибиотици. Когато клетката-гостоприемник е промишлен вид Bacillus, използването на същия организъм като гостоприемник за клониране на плазмида има редица предимства в това, че позволява използването на единствена репликационна система, както и на същия маркер за селекция както в клониращия гостоприемник, така и в щама-гостоприемник.
Плазмидната структура може да бъде въведена в клониращия гостоприемник в съответствие с обичайните методики, след което последният се развива върху подходяща култивационна среда. Като гостоприемници могат да бъдат използвани Е. coli, щамове от род Bacillus, по-специално Вас. subtilis, Pseudomonas и Streptomyces. При избора на клетките-гостоприемници се взимат под внимание фактори като: влияние върху експресията на гена,продукция на желания препарат и др. Така, желателно е да се използват клетки, които да разпознават регулаторни сигнали, които да секретират лесно, при които има понижено разграждане на желания продукт и др. Предпочитана клеткагостоприемник е тази, която продуцира желания полипептид, независимо дали е див тип или е мутантен организъм. Когато се касае до продуциране на протеаза или амилаза, предпочитани са щамове на Вас. novo sp. РВ92 и Вас. licheniformis Т5, както мутантите и вариантите на тези щамове. Могат да бъдат използвани и промишлени щамове, които притежават желаните характеристики на промишлен щам. Примери за такива са микроорганизмите, като Вас. licheniformis. Вас. amyloliquefaciens и алкалофилни бацилуси.
Промишлените щамове се подбират от организми, които могат да бъдат от почвата или се намират на съхранение в съответни депозитни организации, а така също и да бъдат получени чрез модификация на такива щамове. Промишлените щамове са твърде устойчиви и жизнени - те са устойчиви на фагови инфекции и на генетичен обмен, те са фототрофни. което позволява да се оскъпяват култивационните среди със скъпи аминокиселини. Освен това промишлените щамове са високопродуктивни до края на ферментационния период, което може да продължи до около една седмица.
Трансформанти могат да бъдат получени при наличие на гени, които да са тандемно свързани или да са разпръснати в хромозомата. Възможно е подбора да се осъществи от двата типа трансформанти посредством изолиране на хромозомна ДНК от всеки от отделните трансформанти, последващо анализиране на споменатите ДНК по отношение на местата на съответните гени по метода на Southern /47/ например, или с други средства, известни на специалистите, последвано от интегриране на идентифицираните споменати гени.
Като начин за получаване на трансформанти с разпръснати гени /т. е. нетандемно свързани/ е например използването на двойна реципрочна рекомбинация, както е посочено на Фиг. 1В и 2В, използване на линеализирани ДНК-структури, включващи ДНКпоследователността, която трябва да бъде амплифицирана, маркерен ген и мишенни последователности за рекомбинация.
По-нататък получените трансформанти се подлагат на нелегитимирана рекомбинация, както е посочено на Фиг. 2А, при което изолирането на тандемни трансформанти се избягва чрез селекция, посредством диференциална експресия на маркерен ген, например - кодиращ устойчивост спрямо антибиотик, при което чувствителността спрямо антибиотика е различна в щамовете с тендемно интегриране от щамовете с нетандем но интегриране. Общо, дължината на въвежданите ендогенно ДНК последователности ще бъде по-малка от 10 квр.
В допълнение средствата за получаване на трансформанти с разпръснати гени при избягване на тандемна дубликация включват: използване на умъртвени протопласти на хомоложен донорен щам, носещ ДНК структура, която включва структурния ген и маркерния ген.
Трансформацията на клетките-гостоприемници се осъществява за предпочитане с използване на протопласти, изолирани от щам-гостоприемник. Те се изолират по обичайни методики, напр. третиране с лизозим или цимолиаза, суспендиране в подходяща среда с добра осмотичност за поддържане на протопласта. За промишлените щамове методиките за изолиране от Вас са описани в /48/ - когато щамът-гостоприемник е алкалофилен щам Bacillus, обикновено протопластите се получават при алкално pH за предпочитане около 8,0.
Друг начин за селекция на трансформанти е използването на плазмид, съдържащ чувствителен спрямо температура източник на репликация. Трансформантите се развиват в селективна среда при допустима температура, след което се поставят на недопустима температура, след което се поставят на недопустима температура. Колониите, експресиращи маркерния ген при недопустима температура се изолират и се култивират при недопустима температура. Отсъствието на плазмид може да се докаже например посредством изолиране на общата ДНК от колониите и да се анализира върху агарозен гел чрез електрофореза или посредством демонстриране липсата на способност за трансформация на конкурентни клетки. Определянето на пътя, по който се е извършило интегрирането в хромозомата, може да се осъществи посредством анализиране на хромозомната ДНК с помощта на известни методики /47/.
Друг начин за получаване на трансформанти с разпръснато интегриране на копия от ДНК последователността, която представлява интерес, е използването на протопласт, получен от хомоложна донорна клетка, съдържащ поне едно копие на ДНК последователността в място от хромозомата, различно от това в реципииращата клеткагостоприемник. Хомоложната донорна клет ка може да бъде получена например посредством трансформиране на клетка, която не съдържа интересуващия ни структурен ген с вектор, включващ структурния ген. Интегрирането на ДНК последователността в хромозомата на донорната клетка може да бъде улеснено посредством използване на плазмид, съдържащ чувствителен на температура източник на репликация и нарастване на трансформантите при селективни условия, първо при допустима, после при недопустима температура, както е описано по-горе, последвано от изолиране на колонии, експресиращи маркерния ген.
За последващото удостоверяване на отсъствието на плазмидна ДНК, хромозомната ДНК може да бъде изолирана и анализирана по известните методики /47/ посредством хибридизиране с белязана проба, напр. с !2Р или с биотинирани нуклеотиди. Пробата може да бъде сДНК, кодираща представляващия интерес полипептид или нейни фрагменти, както и ДНК структури и нейни фрагменти, напр. вектор. Трансформанти. съдържащи представляващия интерес ген на различно място спрямо това на донорния щам, могат да бъдат използвани като хомоложна донорна клетка. Щамът-реципиент е същият като този, използван като източник на ДНК-последователността, представляваща интерес или като щама, при който ДНК последователността е разположена в различна област на хромозомата в сравнение с тази на трансформираната донорна клетка.
За подпомагане на селекцията донорната клетка се умъртвява с цитоскопично средство преди или по време на образуването на протопластите. Като най-подходящо средство е установен йодацетамида, тъй като е ефективен и не влияе върху последващата фузия. Когато се използват умъртвени клонирани гостоприемници-протопласти, отношението на умъртвения протопласт към приемащия щам е за предпочитане най-малко 1:1, но може да бъде и в полза на излишък от умъртвения протопласт.
Следва фузия на умъртвените донорни протопласти и протопластите на реципиента, при което трансформантите могат да бъдат подбирани с помощта на маркерния ген. ДНК може след това да бъде изолирана и анализирана по описания по-горе начин за идентифициране на трансформантите, при които повече от едно копие от представлява щия интерес ген са включени в генома и са отделени с помощта на ендогенни хромозомни последователности. След това трансформантите се подбират за установяване на повишена експресия на представляващия интерес полипептид. То се осъществява с участието на ензими, антитела, ДНК и РНК хибридизация, чрез биоанализ и т. н.
Клетката-гостоприемник, съдържаща хромозомно интегрирани плазмидни структури или техни фрагменти, след това се култивира в хранителна среда при обичайните условия за ферментация. Ферментацията може да продължи до пълно изтощаване на хранителната среда. Продуктът се изолира от хранителната среда с обичайните методи, напр. екстракция, хроматография, електрофореза и др. Ако продуктът се съдържа в цитоплазмата, клетките могат да се лизират с помощта на механично разкъсващи средства, с лизозим или с помощта на други методики и да бъде изолиран по описания по-горе начин.
Предимствата на метода съгласно изобретението се състоят в това, че се постига устойчива интеграция на най-малко две копия на ДНК структури като начин за генна амплификация, което е осъществимо с използването на комбинация от известни методики.
Изобретението се илюстрира със следните примерни изпълнения:
Пример 1:
Изготвяне на геномна ДНК енциклопедия от алкалофилен Bacillus novo Sp. РВ92 и изолиране на серин протеазния ген.
Хромозомна ДНК, изолирана от Вас. novo sp. РВ92 /депозиран под N ОР-60 в Laboratorium voor Microbiologie, Technical University of Dely. Netherlands /50/ по описаната в литературата методика /51/, се обработва с рестрикционния ензим Sau ЗА и се лигатира в BamHI място на плазмид pUB 110 /52/. pUBllO плазмидна ДНК се получава по описан в литературата /5Ъ/ начин. Лигатираната смес се трансформира в В. subtilis 1А40 /Bacillus Genetic Stock Centre/ в съответствие c известния метод /54/ при използване на 0,6-1 мг ДНК на милилитър компетентни клетки. Клетките от трансформираната смес се посяват върху хранителна среда,съдържаща: 2,8% К2НРО4, 1,2% КН2РО4, 0,4% /NH4/2SO4, 0,2% три-натриев цитрат с две молекули вода, 0,04% MgSO4.7H2O,
0,00005% MnSO4.4H2O, 0,4%L-глутаминова киселина, 0,5% глюкоза, 0,02% квазиаминокиселини, 50цг/мл неомицин, 0,4% казеин и 1,5% агар. След инкубиране на посявките при температура 37С в продължение на една нощ, една от 5000 устойчиви на неомицин колонии показва повишена продукция на протеаза. Плазмидната ДНК се изолира от тази колония в съответствие с описан в литературата метод /55%/ и е наречен рМ58.
Експресия на серин протеазният ген: Bacillus subtilis 1А40, който съдържа рМ58, се култивира върху минимална хранителна среда /56/, към която са добавени 0,02% квазиаминокиселини, 50цг/мл триптофан, 20 цг/мл метионин, 20цг/мл лизин и 20цг/ мл неомицин. След 24 часа културата се центрофугира и супернатанта се анализира за протеазна активност при използване на диметилказеин като субстрат /57/. Културата от Вас. subtilis 1А40, съдържаща плазмида pUBl 10. използван като контрола показва по-ниска от 1/60 от протеазната активност на рМ58 трансформирана култура. Протеазната активност се инхибира напълно посредством обработка с 1 мМ фенилсулфонилфлуорид /PMSF/. но не при третиране с 20 мМ ЕТОК /етилен тетраоцетна киселина/.
Еднакви части от споменатата по-горе супернатанта се подлагат на анализи върху протеинов гел в съответствие с метода на Laemmli /58/. Проби за анализ върху такива гелове се приготвят посредством третиране с 5%-на трихлороцетна киселина /ТОК/. След центрофугиране на пробата, пелетата от утаен протеин се промива двукратно с ацетон, след това се се разтваря в 40 мл буфер /0.5 Tris /НС1 при рН 7,5, 10% обемни 2-меркаптоетанол. 50% обемни глицерин и 0,05% Bromophenol Blue при кипене в подължение на 10 мин. След електрофорезата теловете се оцветяват с участието на Coomassie Brilliant Blue. Пробите от културалната супернатанта след това се анализират чрез електрофореза. Използвани са три различни щама на Вас. subtilis: щам. съдържащ pUBllO,pM58 или без плазмид. както и Bacillus РВ92 протеаза като контрола. След електрофорезата теловете се оцветяват при използване на Coomassie Brilliant Blue и се обезцветяват. Пробата от щам Вас. subtilis 1А40, съдържащ рМ58 включва 31 кД протеин, който мигри ра заедно c P Bacillus B92 протеаза. Този протеин не е открит върху контролната линия на щама В. subtilis 1А40, съдържащ, pUBl 10.
Всички серин протеази имат подобни молекулни тегла. Затова клонираната серин протеаза на Bacillus РВ92 е диференцирана от известните серин протеази /Вас. subtilis субтилизин, Carlsberg субтилизин/ посредством трансформация на рМ58 и pUBllO спрямо протеазно негативния щам Вас. subtilis ДВ104 /59/ и анализ на продуцираните екстрацелуларни ензими. Получените трансформанти нарастват в минимална хранителна среда /54/, съдържаща 0,02% квазиаминокиселини, 50 рг/мл хистидин и 20 мг/мл неомицин. След 24 часа се вземат проби, които се центрофугират и без предварителна обработка се анализират върху хистидин /MOPS гелове,съдържащи 75мМ КОН, 40 мМ хистидин, ЮОмМ MOPS /3-/Nморфолино/-пропан сулфонова киселина, pH 7,5 и 5% полиакриламид. Буферът за електрофореза съдържа 40мМ хистидин, ЮОмМ MOPS при pH 6,6. Пробите се поставят в направление към електрода /катода/. Ивиците на протеазата се откриват с Agfa Рап 100 Professional films /60/. Тези резултати са отразени на Фиг. 3. Както е посочено на Фиг. 4, рМ58 приютява гена, кодиращ Вас. subtilis РВ92 протеаза.
Определяне последователността на Bacillus РВ92 серин протеазния ген.
Цялата последователност на Ball-Hpal протеазния фрагмент се определя по известен метод /61/. Рестрикционните фрагменти на рМ58 се клонират във фага М13 - вектори мрЮ, мр! 1 и мр18 /62/. Инсерцията на рМ58 фрагмента се скринира чрез плакова хибридизация. След определяне на последователността, десет олигонуклеотида, разположени на равни разстояния върху гена се приготвят и определянето на последователността се повтаря, потвърждавайки последователността, посочена на Фиг. 5.
Конструиране на плазмида рМАХ-4, съдържащ информация за серин протеаза:
За изграждане на плазмида pUCN710 /Фиг. 6А/, pUel 10 се третира с TagI и PvuII. Фрагментът, съдържащ гена за устойчивост спрямо неомицин се пречиства върху нискотопяща се агароза и се прави сляп с Klenow полимераза и NTP’s /62/. Плазмидът pUC7 /63/ се линеализира със Sall и се прави сляп, както е показано по-горе. Двата фрагмента се лигатират с Т4 лигаза /62/ и се трансформират в Е. coli JM103. Селекцията се осъществява върху 2хТУ блюда /1,6% тегло/ обем Bacto-триптон, 1 % тегло /обем клетъчен екстракт, 0,5% натриев хлорид/, съдържащи 50 цг/мл ампицилин и 10 мг/мл неомицин. Полученият в резултат плазмид, наречен pUCN710 се третира с BamHI. Плазмидът /64/ се третира с Bell. Фрагментите от двете третирания се лигатират с Т4 лигаза и се трансформират в Вас. subtilis 1А40. Подборът се осъществява върху минимална хранителна среда, съдържаща 20 рг/мл неомицин. Полученият плазмид, рЕ194-пео /Фиг. 6А/ съдържа гена за неомицин и чувствителен на температура източник на репликация.
Субклонирането на протеазния ген се осъществява по следния начин: рМ58 се третира с Hpal и Ball и Bglll. Плазмидът рЕ 194-пео се третира с Hpal. Тези фрагменти се лигатират с Т4 - лигаза и се трансформират в Вас. subtilis 1А40. Трансформантите се подбират на базата на устойчивост^рпрямо неомицин и на повишена протеазна активност, което се преценява с помощта на утаяване с казеин. Структурата на получения плазмид рМАХ-4 се потвърждава с рестрикционен ензимен анализ. /Фиг. 6В/.
Протопластна трансформация на Bacillus щам РВ92 с помощта на рМАХ-4:
Bacillus РВ92 се култивира в продължение на една нощ в 100 мл NBSC хранителна среда /65/. Културата се центрофугира в продължение на 10 мин при 4500 оборота в минута в ротор модел SorVal GSA. Протопластите се приготвят чрез инкубиране на Bacillus в продължение на I час при температура 37С в 10 мл алкална поддържаща среда /АНМ/. съдържаща 0.5 М захароза, 0,02М магнезиев хлорид и 0.02 М Tris /малеат. pH 8, в стерилна вода, към която е добавен лизозим в количество 0.4 цг/мл. Протопластите се пелетират в продължение на 10 мин при 4500 об/мин. суспендират се отново в 5 мл АНМ+ pH 8.0 буфер /АНМ буфер/, към който се добавя 3.5% тегло/ обем Bacto Penassay хранителна среда и 0,04% обем/тегло Albumine Merieux смесват се, след това се пелетират отново по описания по-горе начин. След като отново се суспендират в 0,5 мл алкална поддържаща среда 0,5 мл от тази суспензия на протоп ласти се смесват с 5 рг деминерализирана вода, съдържаща 1 рг плазмиднаДНК и се инкубират в продължение на 2 минути в присъствие на 30% тегло/обем полиетиленгликол 8000 при рН 8,0. След разреждане 1:3 с АНМ+, рН 8,0 и центрофугиране, пелетите се суспендират отново в малък обем /1 мл/ АНМ3 и се инкубират отново в продължение на 2-3 часа. Една стотна част от микролитъра се посява върху прясно приготвени блюда с регенеративна смес, съдържаща 0,5 М натриев сукцинат /HCI, рН 8,0, 1,5% тегло/ обем агар, 0,5% тегло/обем квазиаминокиселини, 0,5% тегло/обем дрожден екстракт, 0,031 М фосфатен буфер, рН 8,0, 0,5% тегло/обем глюкоза, 0,02 М магнезиев двухлорид и 0,02% тегло/обем Albumine Merienx. Тези блюда също съдържат 1000 рг/мл неомицин за подбор. След инкубиране при температура 37С в продължение най-малко на 72 часа, колониите се посяват повторно върху твърди инфузионни агарови блюда, съдържащи 20 рг/мл неомицин.
Трансформант на Bacillus РВ92, съдържащ плазмид рМАХ-4 се инкубира в триптон соева среда /TSB/, съдържаща или 1 рг/ мл или 20 мг/мл неомицин в продължение на 24 часа при температура 37С. Порции от по 2 мл клетъчна суспензия се разреждат в 100 мл TSB, съдържаща 1 рг/мл или 20 мг/ мл неомицин съответно, и се инкубират в продължение на 24 часа при температура 50С. След 24 часа проби от по 5 мл от културалната среда се разреждат отново по описания по-горе начин и се инкубират в продължение на 24 часа при температура 50С, отново в присъствие на 1 рг/мл или съответно 20 рг/мл неомицин. Последната процедура се повтаря още веднъж. След това клетъчната суспензия се разрежда стократно и се посява върху твърда инфузия /Н1/, съдържаща 1 мг/мл неомицин или 20 мг/мл съответно. Пробите се инкубират при температура 50С в продължение на 16 часа. Устойчивите на неомицин колонии се изолират и култивират в 10 мл TSB хранителна среда, съдържаща 1 рг/мл неомицин в продължение на 16 часа при 37С. От тези култури се изолира общата ДНК /66/. Отсъствието на плазмид се доказва посредством ДНК електрофореза върху агарозен гел. Отсъствието на ДНК от пробите, в които не се открива плазмидна ДНК, се потвърждава посредством трансформация на общата ДНК в Вас. subtilis 1А40. Пробите, които не притежават способността да трансформират Вас. subtilis 1А40 се считат за свободни от плазмид.
За да се порвери дали и по какъв начин се осъществява интегриране на рМАХ-4 в хромозома, хромозомната ДНК се изолира, усвоява се с Hind III, разлива се върху 0,5% ДНК агарозни гелове и се оцветява на нитроцелулоза /67/, хибридизира се с белязан с 32Р рМ58 /44/. Резултатите, получени от този анализ са отразени на Фиг. 7А.
Подборът, осъществен върху 1 рг/мл неомицин резултира в протеазен ген, тандемно локализиран в хромозомата и сепариран с плазмидни последователности като резултат от хомоложна рекомбинация. При натрупване на 30 независимо изолирани интегранта, селекцията се осъществява с I рг/мл неомицин. Изолиран е и един интегрант. който съдържа плазмида рМАХ-4, локализиран на случайно място в хромозомата като резултат от нелегитимирана рекомбинация /щам РВТ122/. Селекцията при 20 рг/мл неомицин води в резултат до копие на плазмид рМАХ-4, разположена случайно върху хромозомата след нелегитимирана рекомбинация. Последният щам се нарича РВ108. Генетичната организация на щамовете РВ109 и 108 е посочена на Фиг. 7В и 7С. Хромозомният анализ сочи, че интегрирането на РВТ122 и РВТ108 се явява на различни места в хромозомата.
Устойчивостта на гените за дубликатни протеази в щамовете РВТ108 и РВТ109 се изпитва по следния начин:
Сто мл продуцираща среда, съдържаща: 1% нишесте, 4% лактоза, 0,87 кисел калиев фосфат, 0,5% дрождев екстракт, 0.5% кисел диамониев фосфат, 0,2% тринатриев цитрат с две молекули вода, 0.05%, магнезиев сулфат със седем молекули вода, 0,07% калциев двухлорид, 0,068 железен сулфат със седем молекули вода и антипенител 1 мл/л без неомицин се инокулират с 0,2 мл от преседялата една нощ култура TSB /37С/ на щамовете РВ108 или РВ109 в 500 мл стъкла за клатене. След инкубиране в продължение на 44 часа при температура 37С при постоянно аериране, културата се изпитва за устойчиви на неомицин колонии и за протеазна активност.
Двата щама РТ108 и РВТ 109 също се изпитват в Eschweiler ферментатори, съдър11 жащи същата продуцираща среда, за да се щението до 101. Резултатите са сумирани на определи ефекта от увеличаване на съотно- Табл. 1.
Табл. 1
Щамове
Относителна продуктивност на протеаза % на устойчиви на неомицин клетки след ферментация
Контрола РВ92
РВТ108
РВТ109
100%
120%
100%
75-97%
Протеазната активност се изследва при използване на диметил казеин като субстрат по известни методи.
Анализирането на колониите, произвеждащи от Eschweiler ферментацията на РВТ109 след два дни култивиране показва, че 3 до 25% от тези колонии продуцират само при щамове, съдържащи само единичен протеазен ген. Установено е, че тези колонии са чувствителни на неомицин. което се дължи на отстраняване на рМАХ-4 последователността посредством хомоложна рекомбинация. Изследването на колониите, произхождащи от ферментацията на щама РВТ109 обаче показва, че всички клетки са устойчиви на неомицин. Сто от тези колонии се вземат без избор и всяка от тях се подлага на изпитване на възможността й да произвежда протеазна активност за определяне наличието на един или два продуциращи протеазни гена. Всичките сто отделно изследвани колони продуцират количества, характерни за щама, като по този начин се доказва, че двата интегрирани на случайно място гена са устойчиви на неомицин при използваните условия на ферментация.
Изграждане на интеграционен вектор pElatB:
Плазмидът pGB34 /69/ се обработва с рестрикционни ензими BG1I, Bgll и Bglll. Получените рестрикционни фрагменти се обработват с оглед получаване на слепи краища с Klenow - полимераза, след това се лигатират в Hpal място на рЕ194-пео и плазмидната рЕ194-пео ДНК се изолира по познат начин /70/.
Лигатираната смес се трасформира в Вас. subtilis 1А 40 по известен начин /71/ при използване на 0,5-1 рг/мл ДНК способни клетки. Клетките от трансформираната смес се посяват върху блюда с минимална хранителна среда, съдържаща 2,8% кисел дикалиев фосфат, 1,4% дикисел монокалиев фосфат, 0,4% диамониев сулфат. 0,2% тринатриев циитрат с две молекули вода, 0,04% 20 магнезиев сулфат със седем молекули вода.
0,00005% манганов сулфат с четири молекули вода, 0,4% глутаминова киселина, 0,5% глюкоза, 0,02% квазиаминокиселини, 50 рг/ мл триптофан, 20рг/мл метионин, 20 рг/мл 25 лизин, 20 рг/мл неомицин. 0,4% казеин.
0,5% нишесте и 1,5%агар.
ДНК на продуциращите алфа-амилаза колонии се изолира по известен метод /70/ и се проверява в рестрикционни ензими. От 30 един от тези трансформанти се изолира плазмид ElatB /виж фиг. 8/.
Последващата трансформация на щама Вас. licheniformis T9 се осъществява по познат начин /72/ с изключение на това, че 33 цялата процедура се осъществява върху посявки в минимална хранителна среда, съдържаща 20 рг/мл неомицин. Всички трансформанти продуцират алфа амилаза. Анализът с рестрикционен ензим на ДНК, из40 готвена по метода на Birnboim /70/ показва, че всички трансформанти съдържат pElatB.
Плазмидът pEtatB сее интегрира в хромозомата на Вас. licheniformis щам T9 по следния начин: Вас. Licheniformis щам T9. 45 съдържащ плазмида pElatB се инокулира в триптон-соя хранителна среда /TSB/, съдържаща 20 рг/мл неомицин и се инкубира в продължение на 16 часа при температура 30С. Петмилилитрова порция от клетъчната 50 суспензия се разрежда в 100 мл от същата хранителна среда и се инкубира в продължение на 24 часа при температура 50С. Тази процедура се повтаря, след което клетъчната суспензия се разрежда стократно и се пося ва върху блюда с твърд инфузионен агар, съдържащ 10 рг/мл неомицин. След инкубация в продължение на 40 часа при температура 50С, устойчивите на неомицин колонии се изолират и се култивират в 10 мл Т в 5 хранителна среда, съдържаща 10 рг/мл неомицин в продължение на 16 часа при температура 30С. Общата ДНК от тези култури се изолира по познат начин /73/. Отсъствието на плазмиди в тези клетки се доказва с Ю ДНК електрофореза върху агарови гелове. Проби, в които ДНК с ниско молекулно тегло отсъства, се проверяват отново за наличие на плазмидна ДНК чрез трансформациия на Вас. licheniformis 1А40 по познат 15 начин /71/. Проби, които нямат способността да трансформират Вас. licheniformis 1А40 в устойчиви на неомицин щамове, се счита, че не съдържат плазмиди.
За да се провери дали е осъществено 20 интегрирането на pElatB и по какъв начин е осъществено, от трансформантите се изолира хромозомната ДНК /74/, обработва се с EcoRI, фракциониран върху агарозни гелове /0,5%/, оцветява се върху нитроцелулоза 25 по познат начин /67/ и се хибридизира с белязан с 32Р pGB33 /75/. Резултатите от този анализ са отразени на Фиг. 9А. Данните сочат, че нелигитимираната рекомбинация на pElatB намира място в щам, съдържащ 30 единичен амилазен ген на място в генома, различно от това в сравнение с първоначалния амилазен щам Вас. licheniformis Т5. Полученият щам, съдържащ pElatB е наречен ТВ13. 35
Получаване на щам T13F, съдържащ два амилазни гена, отделени посредством хромозомни последователности
За получаване на щам, съдържащ два амилазни гена, разделени с ендогенни 40 хромозомни ДНК последователности, се осъществява фузия между Вас. licheniformis Т5 /първоначален амилазен щам, съдържащ ген за амилаза /75/ и щама ТВ13 /щам, който съдържа ген за амилаза, който е интегриран на случайно място в хромозомата/. Протопластната фузия се осъществява по познат начин /75/. Подборът се осъществява върху регенеративни блюда, съдържащи 10 мг/мл неомицин.
За да се проверят и идентифицират потенциалните продукти от фузията, хромзомната ДНК се изолира, обработва се с EcoPI, фракционира се върху 0,5% агарозни гелове, оцветява се върху нитроцелулозни филтри /67/ и се хибридизира с белязан с 32р рСВЗЗ /75/. Резултатите от този анализ са посочени на Фиг. 9В. Един от получените продукти от фузията, а именно T13F, съдържа два амилазни гена, разделени посредством ендогенни хромозомни последователности.
Устойчивостта на щама T13F, щам, който съдържа два амилазни гена, разделени посредством важни хромозомни последователности, се сравнява с тази на щам Т390, щам с два хромозомни амилазни гена, тандемно свързани един с друг. Изготвянето на Т390 е илюстрирано с Табл. I, където щама е отнесен към Вас. Licheniformis Т5 /рСВЗЗ/. Щамовете T13F и Т390 се изпитват във ферментационни условия, по-точно 0,2 милилтрова култура от една нощ /37“С/ в TSB инокулира 500 милилитрови колби, продуцираща среда без неомицин. След инкубиране в продължение на 6 дни при температура 40С и при непрестанно аериране, културата се изпитва за устойчиви на неомицин колонии и за амилазна активност. Резултатите са сумирани на Табл. 2.
Табл. 2
| Щам | Относителна амилазна активност | % устойчиви на неомицин клетки след ферментация |
| Т5 | юо% | - |
| ТВ13 | 20% | 100% |
| T13F | 120% | 100% |
| Т390 | 200% | 88% |
+ Изследвани са повече от хиляда колонии за щам
С оглед изключване възможността от изрязване на един амилазен ген без съответната загуба на неомициновия ген в щам T13F,анализират се 20 колонии, произхождащи от ферментация на щам T13F. Хромозомната ДНК от безразборно подбраните 20 колонии се изолира и охарактеризира с помощта на хибридизационни експерименти, както е описано по-горе. Получените резултати от 9 от тези анализа са илюстрирани с Фиг. 10. Всички изследвани щамове съдържат два амилазни гена, демонстрирано с наличието на два EcoRI фрагмента, които съдържат два алфа-амилазни гена /Фиг. 10, линия 4/. Това показва, че интегрираните на случайно място амилазни гени са поустойчиви, отколкото интегрираните тандемно гени при условията на ферментация.
Очевидно е от изложените по-горе резултати, че може да бъде получена прокариотна клетка, в която е постигнато устойчива амплификация на гена посредством подбиране на трансформирани клетки, в които има нетандемно интегриране най-малко на две копия на структурния ген, който подлежи на амплификация. Интегрирането може да се осъществи с помощта на нелегитимирана или на хомоложна рекомбинации.
Claims (17)
- ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ1. Метод за стабилна ген амплификация на хромозомна ДНК от прокариотични микроорганизми, характеризиращ се с това, че клетка-гостоприемник, съдържаща най-малко едно копие от ДНК последователност, кодираща представляващ интерес полипептид, интегрирано с нейната хромозома, както и най-малко един маркерен ген и чувствителен спрямо температура източник на репликация, се комбинира с донорна клетка, която съдържа най-малко едно копие от ДНК последователност за същия полипептид, при условия за трансформация на клетката-гостоприемник, след което се осъществява селекция на трансформираните клетки, които съдържат най-малко две копия на желаната ДНК последователност, разделени чрез ендогенни последователности.
- 2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че клетката-гостоприемник еалкалофилен микроорганизъм от рода Bacillus.
- 3. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че клетката-гостоприемник е щам Bacillus licheniformis.
- 4. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че клетката-гостоприемник е щам Вас. novo sp. РВ92, негов мутант или вариант.
- 5. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че клетката-гостоприемник е щам Вас. licheniformis Т5, негов мутант или вариант.
- 6. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че клетката-гостоприемник съдържа най-малко едно копие от ДНК последователност, кодираща протео.Ттичен или амилолитичен ензим.
- 7. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че протеолитичният ензим е серин протеаза.
- 8. Метод съгласно претенция 1, характеризираш се с това, че клетките-гостоприемници се подбират посредством култивиране на клетките, съдържащи ДНК структура, включваща генен маркер в присъствието на биоцид. към който генният маркер осигуря-Лг· ва устойчивост и идентифициране и изолиране на клетките, свободни от плазмид.
- 9. Метод съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че изолирането се осъществява посредством изолиране на хромозомна ДНК от подлежащите на подбор клетки, и хибридизиране на хромозомната ДНК с белязана проба, съдържаща ДНК структурата.
- 10. Метод съгласно претенция 2. характеризиращ се с това, че донорната клетка се получава посредством комбиниране на прокариотичен микроорганизъм, който не съдържа ДНК последователност, кодираща желания полипептид с ДНК структура съгласно претенция 8 при условията на фузия, изолиране на трансформираните клетки, култивиране на трансформираните клетки при недопустима температура, идентифициране и изолиране на трансформираните клетки, при които ДНК структурата е интегрирана на място, различно от това в споменатата клетка-гостоприемник.
- 11. Метод съгласно претенция 1 и 10. характеризиращ се с това, че донорната клетка е алкалофилен микроорганизъм от род Bacillus.
- 12. Метод съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че алкалофилният мик роорганизъм е щам Вас. licheniformis Т5 или щам Вас. novo sp. РВ92.
- 13. Метод съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че ДНК структурата е рМАХ4 или pElatB.
- 14. Метод съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че ДНК последователността е интегрирана чрез нелегитимна рекомбинация или чрез хомоложна рекомбинация.
- 15. Метод съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че ДНК структурата включва чувствителен спрямо температура източник на репликация.
- 16. Метод съгласно претенция 15, характеризиращ се с това, че чувствителният на температура източник на репликация е плазмид рЕ194.
- 17. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че трансформираните клетки, които съдържат най-малко две копия на желаната ДНК последователност, разпределени чрез ендогенни последователности, са щамове Bacillus РВТ108, РВТ122 или T13F.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP87200356 | 1987-02-27 | ||
| PCT/NL1988/000006 WO1988006623A1 (en) | 1987-02-27 | 1988-02-26 | Stable gene amplification in chromosomal dna of prokaryotic microorganisms |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG60920B2 true BG60920B2 (bg) | 1996-06-28 |
Family
ID=8197582
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG085832A BG60920B2 (bg) | 1987-02-27 | 1988-10-25 | Метод за стабилна ген амплификация на хромозомна днк на прокариотични микроорганизми |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5733723A (bg) |
| EP (1) | EP0284126B1 (bg) |
| JP (1) | JP2637532B2 (bg) |
| KR (1) | KR970000188B1 (bg) |
| CN (1) | CN1049247C (bg) |
| AU (1) | AU620326B2 (bg) |
| BG (1) | BG60920B2 (bg) |
| BR (1) | BR8805646A (bg) |
| CA (1) | CA1327175C (bg) |
| DE (1) | DE3883041T2 (bg) |
| ES (1) | ES2045081T3 (bg) |
| FI (1) | FI104326B (bg) |
| HU (1) | HUT50877A (bg) |
| IE (1) | IE61743B1 (bg) |
| LT (1) | LT4001B (bg) |
| LV (1) | LV10791B (bg) |
| NO (1) | NO300382B1 (bg) |
| PT (1) | PT86863B (bg) |
| RU (1) | RU2091487C1 (bg) |
| WO (1) | WO1988006623A1 (bg) |
Families Citing this family (34)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR8805646A (pt) * | 1987-02-27 | 1989-10-17 | Gist Brocades Nv | Processo para amplificacao de genes estaveis em adn cromossomico de microorganismos procarioticos |
| EP0479396B1 (en) * | 1987-02-27 | 1999-06-09 | Genencor International, Inc. | Transformation of alkalophilic bacillus strains |
| US4914031A (en) * | 1987-04-10 | 1990-04-03 | Amgen, Inc. | Subtilisin analogs |
| US6287841B1 (en) | 1988-02-11 | 2001-09-11 | Genencor International, Inc. | High alkaline serine protease |
| DK0414297T3 (da) * | 1989-08-11 | 1997-07-07 | Genencor Int | Effektiv fremstilling af mutantproteaser |
| US5695976A (en) * | 1989-12-18 | 1997-12-09 | Novo Nordisk A/S | Stable integration of DNA in bacterial genomes |
| JP3046344B2 (ja) * | 1990-10-24 | 2000-05-29 | 塩野義製薬株式会社 | 新規プロテアーゼ |
| JPH07503363A (ja) * | 1991-11-14 | 1995-04-13 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | バシラス・リヘニフォルミス中で遺伝子を発現させる方法 |
| DE4216246A1 (de) * | 1992-05-16 | 1993-11-18 | Solvay Enzymes Gmbh & Co Kg | Einfaches Verfahren zur stabilen chromosomalen Genamplifikation |
| US5395763A (en) * | 1992-06-24 | 1995-03-07 | Monsanto Company | Chromosomal expression vector |
| DK153992D0 (da) * | 1992-12-22 | 1992-12-22 | Novo Nordisk As | Metode |
| US5861273A (en) * | 1993-12-21 | 1999-01-19 | Celtrix Phamraceuticals, Inc. | Chromosomal expression of heterologous genes in bacterial cells |
| US6723550B1 (en) | 1997-07-15 | 2004-04-20 | Genencor International, Inc. | Proteases from gram-positive organisms |
| GB9724627D0 (en) | 1997-11-20 | 1998-01-21 | Genencor Int Bv | Gram positive microorganism formate pathway |
| US6528255B1 (en) | 1997-12-30 | 2003-03-04 | Genencor International, Inc. | Proteases from gram positive organisms |
| US6465186B1 (en) | 1997-12-30 | 2002-10-15 | Genecor International, Inc. | Proteases from gram positive organisms |
| US6599731B1 (en) | 1997-12-30 | 2003-07-29 | Genencor International, Inc. | Proteases from gram positive organisms |
| GB9727470D0 (en) | 1997-12-30 | 1998-02-25 | Genencor Int Bv | Proteases from gram positive organisms |
| US6100063A (en) * | 1998-02-12 | 2000-08-08 | Novo Nordisk A/S | Procaryotic cell comprising at least two copies of a gene |
| WO1999041358A1 (en) * | 1998-02-12 | 1999-08-19 | Novo Nordisk A/S | A prokaryotic cell comprising two copies of a gene transcribed in different directions |
| US6156514A (en) * | 1998-12-03 | 2000-12-05 | Sunol Molecular Corporation | Methods for making recombinant cells |
| US6544792B1 (en) | 1999-12-21 | 2003-04-08 | Genencor International, Inc. | Production of secreted polypeptides |
| AU2001265835A1 (en) * | 2000-06-23 | 2002-01-08 | Novozymes A/S | Method for stable chromosomal multi-copy integration of genes |
| BRPI0416797A (pt) | 2003-11-19 | 2007-04-17 | Genencor Int | serina proteases, ácidos nucléicos codificando enzimas de serina e vetores e células hospedeiras incorporando as mesmas |
| US7985569B2 (en) | 2003-11-19 | 2011-07-26 | Danisco Us Inc. | Cellulomonas 69B4 serine protease variants |
| US20050227356A1 (en) * | 2004-04-07 | 2005-10-13 | Lessard Philip A | Novel compositions and methods for genetic manipulation of Rhodococcus bacteria |
| US7842479B2 (en) * | 2004-05-21 | 2010-11-30 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Methods for altering acetic acid production and enhancing cell death in bacteria |
| US20080044853A1 (en) * | 2004-06-21 | 2008-02-21 | Novozymes A/S | Stably Maintained Multiple Copies of at Least Two Orf in the Same Orientation |
| ATE443128T1 (de) | 2004-10-22 | 2009-10-15 | Novozymes As | Stabile genomische integration mehrerer polynukleotidkopien |
| DE102007021001A1 (de) | 2007-05-04 | 2008-11-06 | Ab Enzymes Gmbh | Expressionssystem zur antibiotikafreien Produktion von Polypeptiden |
| CN103290048B (zh) * | 2013-06-27 | 2015-07-15 | 天津科技大学 | 一种适用于芽孢杆菌属同源重组的质粒及工程菌 |
| ES2855992T3 (es) | 2015-12-11 | 2021-09-27 | Wacker Chemie Ag | Cepa de microorganismos y procedimiento para la producción fermentativa exenta de antibióticos de sustancias y proteínas de bajo peso molecular |
| CN114032189B (zh) * | 2021-05-10 | 2024-02-06 | 盐城师范学院 | 一种降解木质素的融合子菌株r3及其应用 |
| GB202304540D0 (en) | 2023-03-28 | 2023-05-10 | Univ Tartu | Method of biosynthesis |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US30602A (en) * | 1860-11-06 | Improvement in revolver fire-arms | ||
| GB1519148A (en) * | 1974-11-19 | 1978-07-26 | Gist Brocades Nv | Compositions of matter |
| NO159863C (no) * | 1980-01-07 | 1989-02-15 | Univ Rochester | Fremgangsm te for fremstilling og seleksjon av en rant bakteriofag som inneholder et genetisk fragment og koder for alfa-amylase, egnet for bruk i heterolog transformering av en bacillus-verts-mikroorganisme. |
| IL61982A (en) * | 1980-02-15 | 1984-01-31 | Cpc International Inc | Genetically engineered microorganisms for massive production of amyloytic enzymes and process for preparing same using the corresponding recombinant dnas containing amylase coding genes |
| EP0074553A3 (en) * | 1981-09-11 | 1985-01-09 | The University Of Rochester | Method of increasing the yield of a product by altering a microorganism |
| JPS59205983A (ja) * | 1983-04-28 | 1984-11-21 | ジエネツクス・コ−ポレイシヨン | 異種遺伝子を原核微生物で発現させる方法 |
| US4617266A (en) * | 1983-04-28 | 1986-10-14 | Genex Corporation | Production of Protein A |
| IE81141B1 (en) * | 1983-06-24 | 2000-04-05 | Genencor Int | Procaryotic carbonyl hydrolases |
| NZ208806A (en) * | 1983-07-06 | 1988-07-28 | Gist Brocades Nv | Genetic engineering of industrial microorganism species: readily-transformable host used as intermediate in transfer of dna to the industrial species; plasmids |
| FR2563533B1 (fr) * | 1984-04-27 | 1986-08-22 | Centre Nat Rech Scient | Procede d'amplification de l'expression d'un gene determine chez bacillus subtilis et souches obtenues |
| US4828994A (en) * | 1984-09-21 | 1989-05-09 | Genex Corporation | Bacillus strains with reduced extracellular protease levels |
| FR2582316B1 (fr) * | 1985-05-22 | 1988-12-02 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs d'expression de l'a-amylase dans bacillus subtilis, souches obtenues et procede de preparation d'a-amylase |
| EP0254735B2 (en) * | 1986-01-15 | 1998-06-17 | Amgen Inc. | METHOD FOR PRODUCTION OF THERMALLY STABLE AND pH STABLE SUBTILISIN ANALOGS |
| BR8805646A (pt) * | 1987-02-27 | 1989-10-17 | Gist Brocades Nv | Processo para amplificacao de genes estaveis em adn cromossomico de microorganismos procarioticos |
-
1988
- 1988-02-26 BR BR888805646A patent/BR8805646A/pt not_active Application Discontinuation
- 1988-02-26 PT PT86863A patent/PT86863B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-02-26 RU SU884356795A patent/RU2091487C1/ru active
- 1988-02-26 JP JP63502471A patent/JP2637532B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-26 WO PCT/NL1988/000006 patent/WO1988006623A1/en active IP Right Grant
- 1988-02-26 HU HU881833A patent/HUT50877A/hu unknown
- 1988-02-26 AU AU13981/88A patent/AU620326B2/en not_active Expired
- 1988-02-27 CN CN88101680A patent/CN1049247C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-29 DE DE88200376T patent/DE3883041T2/de not_active Revoked
- 1988-02-29 CA CA000560122A patent/CA1327175C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-29 ES ES88200376T patent/ES2045081T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-02-29 IE IE55888A patent/IE61743B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-02-29 EP EP88200376A patent/EP0284126B1/en not_active Revoked
- 1988-10-05 NO NO884422A patent/NO300382B1/no unknown
- 1988-10-21 KR KR88701325A patent/KR970000188B1/ko active IP Right Grant
- 1988-10-24 FI FI884903A patent/FI104326B/fi active IP Right Grant
- 1988-10-25 BG BG085832A patent/BG60920B2/bg unknown
-
1993
- 1993-12-08 LV LVP-93-1313A patent/LV10791B/en unknown
-
1994
- 1994-01-28 LT LTIP1826A patent/LT4001B/lt not_active IP Right Cessation
- 1994-08-24 US US08/295,082 patent/US5733723A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-03-27 US US09/049,867 patent/US6124097A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| LV10791A (lv) | 1995-08-20 |
| NO884422L (no) | 1988-10-05 |
| PT86863B (pt) | 1992-05-29 |
| FI104326B1 (fi) | 1999-12-31 |
| JPH01502398A (ja) | 1989-08-24 |
| BR8805646A (pt) | 1989-10-17 |
| KR970000188B1 (en) | 1997-01-06 |
| LT4001B (en) | 1996-06-25 |
| HUT50877A (en) | 1990-03-28 |
| EP0284126B1 (en) | 1993-08-11 |
| KR890700664A (ko) | 1989-04-26 |
| AU620326B2 (en) | 1992-02-20 |
| JP2637532B2 (ja) | 1997-08-06 |
| PT86863A (pt) | 1988-03-01 |
| LV10791B (en) | 1995-12-20 |
| NO300382B1 (no) | 1997-05-20 |
| CN1049247C (zh) | 2000-02-09 |
| IE61743B1 (en) | 1994-11-30 |
| DE3883041T2 (de) | 1994-01-20 |
| US6124097A (en) | 2000-09-26 |
| AU1398188A (en) | 1988-09-26 |
| ES2045081T3 (es) | 1994-01-16 |
| EP0284126A1 (en) | 1988-09-28 |
| US5733723A (en) | 1998-03-31 |
| LTIP1826A (en) | 1995-08-25 |
| CN1030787A (zh) | 1989-02-01 |
| WO1988006623A1 (en) | 1988-09-07 |
| NO884422D0 (no) | 1988-10-05 |
| DE3883041D1 (de) | 1993-09-16 |
| IE880558L (en) | 1988-08-27 |
| CA1327175C (en) | 1994-02-22 |
| FI884903A0 (fi) | 1988-10-24 |
| FI884903A (fi) | 1988-10-24 |
| FI104326B (fi) | 1999-12-31 |
| RU2091487C1 (ru) | 1997-09-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BG60920B2 (bg) | Метод за стабилна ген амплификация на хромозомна днк на прокариотични микроорганизми | |
| FI119028B (fi) | Menetelmä alkalofiilisten Bacillus-kantojen transformoimiseksi | |
| FI85287B (fi) | Molekulaer kloning och expression i industriella mikro-organismarter. | |
| US5843720A (en) | Introduction of DNA into bacillus strains by conjugation | |
| EP0127328A2 (en) | The use of chromosomal integration to stabilize heterologous genes | |
| EP0479396A2 (en) | Transformation of alkalophilic bacillus strains | |
| US5624829A (en) | Transformed industrial bacillus strains and methods for making and using them | |
| EP0900271B1 (en) | Bacterial donor cell useful in conjugation | |
| US6770475B1 (en) | Promoters | |
| JP2002508669A (ja) | 所望の遺伝子の複数コピー、及び選択マーカーではなく、スクリーニング可能マーカーを含むタンパク質産生細胞 | |
| US5763187A (en) | Bacterial donor cell useful in conjugation | |
| WO1997026361A9 (en) | Bacterial donor cell useful in conjugation |