HUT50877A - Process for producing stable gene amplification in chromosomal dna of procaryote microorganisms - Google Patents

Process for producing stable gene amplification in chromosomal dna of procaryote microorganisms Download PDF

Info

Publication number
HUT50877A
HUT50877A HU881833A HU183388A HUT50877A HU T50877 A HUT50877 A HU T50877A HU 881833 A HU881833 A HU 881833A HU 183388 A HU183388 A HU 183388A HU T50877 A HUT50877 A HU T50877A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
host cell
dna
transformed
bacillus
strain
Prior art date
Application number
HU881833A
Other languages
English (en)
Inventor
Eekelen Christian A Van
Der Laan Johannes C Van
Leonardus J Mulleners
Original Assignee
Gist Brocades Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8197582&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HUT50877(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Gist Brocades Nv filed Critical Gist Brocades Nv
Publication of HUT50877A publication Critical patent/HUT50877A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

A találmány olyan prokarióta sejtekre vonatkozik, amelyekben stabil gén emplifikációt (sokszorozást) érünk el, ha egy meghatározott DNS szekvenciának legalább
• ·
- 2 két másolatát elszórtan non-tandem integráljuk az illető prokarióta sejt kromoszómájába.
Széles körbén alkalmaznak bacillusokat az iparilag fontos enzimek termelésére. Ilyen enzimek az alfa-amiláz, a neutrális proteáz és az alkalikus vagy szerin proteázok (lásd: Debabov: The Industrial Use of Bacilli” a The Molecular Biology of Bacilli cimtí kiadványban, Acad.Press, New York, 1982). A Bacillus eredetű enzimek termelésének a fokozása mind klasszikus genetikai módszerekkel - ilyen a mutáció, majd az ezt követő szelektálás - mind modern molekuláris biológiai módszerekkel érhető el. Ez utóbbi körülmény igen jól dokumentált, miszerint bizonyos prokarióta és eukarióta mikroorganizmusokban a homológ és heterológ gének magas-szintű kifejeződése érhető el géntechnológia segítségével.
Egyik megközelítésben egy gén magas szintű kifejezését úgy érhetjük el, hogy a gént hatékony szabályozó szekvenciákkal látjuk el. Egy másik megközelítés, amelyet az előzővel kombinálva gyakran alkalmaznak az, hogy a szóbanforgó gén másolatszámát megnövelik. A sokszorozás (amplifikáció) elsődlegesen úgy érhető el, ha a gént egy sokmásolatu extrakromoszómális DNS molekulába - mint amilyen egy plazmid - építjük be. Azonban a genetikus információ kifejezésére és sokszorozására a ♦ · ·· 9 · • · · · · 99 • · · · · ···· • · · 9 · 9 999 • 9 99 · 9999
- 3plazmidok vektorként való használatának az a jelentős hátránya, hogy ezek instabilak. Nagybani felhasználás esetén, a sokszorozott gén stabilitása az előfeltétele annak, hogy a sokszorozott gén által kódolt exprsszsziós termék magas-szintű termelése fennmaradjon, minthogy sok sejt-osztódásnak kell megtörténnie addig, mig elégséges biomassza nem keletkezik ahhoz, hogy bőséges legyen a termék képződése.
Az instabilitás két formában fordul elő: szegregációs instabilitás, amikor a tenyésztés folyamán fordul elő a plazmidvesztés és a strukturális instabilitás, amikor a plazmidok egy része deletált. Szegregációs instabilitás például akkor jöhet létre, ha a gazdasejt egy tulkifejeződő gént hordozó vektort tartalmaz. Általában ekkor szalektiv nyomás nyilvánul meg azokkal a sejtekkel szemben, amelyek elvesztették a gén overexpressziós képességét, minthogy az överexpresszió kedvezőtlen tulajdonság a transzformált gazdasejt számára. Nagymennyiségű mstabolikus energia fordítódik az overexpressziós géntermékre, s ez negatívan befolyásolja a sejt versenyképességét (növekedési sebességét) azokkal a gazdasejtekkel szemben, amelyek nem ilyen overexpresszivek.
A szegregációs instabilitás elhárítására használt módszer abban áll, hogy olyan sejteket keresünk, amelyek
- 4 sokmásolatu plazmidokat tartalmaznak, s e plazmidok olyan géneket hordoznak, amelyek előnyt jelentenek a plazmidot tartalmazó sejt számára, például, amelyek egy antibiotikummal szemben rezisztenciát adnak át, s az illető antibiotikumot hozzáadjuk a fermentációs táptalajhoz. Azonban az antibiotikumokat általában nem használják szelekciós eszközként a nagybani kereskedelmi termelési folyamatokban azoknak az előírásoknak megfelelően, amelyek a fermentációs eljárásnak vagy magának a terméknek az engedélyezésére vonatkoznak.
*
A szegregációs instabilitásból eredő plazmid vesztés minimalizálásának egy másik módszere, amikor egy olyan gént építünk be a vektor molekulába, amely funkcionális 'szempontból fontos a gazdasejt számára [Ferrari és mteai, Biotechnology, 3, 1003-1007 (11985)]. Azonban ez a módszer nem biztosítja a vektor strukturális stabilitását.
A plazmid strukturális instabilitási problémáinak megoldásához használt eljárások közé tartozik, ha elkerüljük a gén kife>ződését az exponenciális növekedési szakaszban, például olyan szabályozó szekvenciák használatával, mint a hőmérséklet érzékeny szabályozó szekvenciák és az exogén DNS-t a gazdasejt kromoszómájába integráljuk. Egy másik használatos módszer szerint nem ····
- 5 alkalmazunk autonóm replikálódó vektor molekulákat és ehelyett olyan technikákat használunk, amelyek elősegítik a bevitt DNS integrációját a gazdasejt kromoszómáj ába.
Idegen DNS-nek a gazdasejt kromoszómájába való integrációját (beépítését) megvalósító módszer többek között a homológ rekombináció és a szabálytalan (illegitim) rekombináció. Homológ rekombinációval kétféleképpen lehet DNS szekvenciákat beépíteni a kromoszóma speciális helyeire, a Campbell tipusu homológ rekombinációval és a kettős reciprok rekombinációval, melyeket az 1A, illetve 1B ábra mutat be.
Egy harmadik ut is nyílik arra,hogy DNS szekvenciákat vezessünk be a kromoszómába. Ezt a módszert az 1C. ábra mutatja be. A módszer egy kétlépéses helyettesítéses mechanizmust használ. Lényegében egy Campbell tipusu rekombinációról van szó, de a végső eredmény egy olyan kromoszómális elrendezettség, amely nem tartalmaz megduplázott szekvenciákat a kromoszóma rekombinált részében, s igy ez nem sokszorozható egység. Ennélfogva ez a módszer egy kettős reciprok rekombinációhoz hasonlít.
Idegen DNS-nek a kromoszómába való integrálásiéra a használt homológ rekombinációs módszer mellett szabálytalan rekombinációt is használhatunk a DNS integβ · ·· · ·· · • · ·· · ·· ·· ι
rálására. Az integrált vektor molekulákat olyan körülmények mellett szelektálhatjuk, amelyek meggátolják a nem integrált vektor molekulák autonóm replikációját. A szabálytalan rekombináció használatát az integrációhoz az 1D. bára mutatja be. A tandem duplikációk nélküli kromoszómális szekvencia elrendezéseket, amelyeket az 1B, C és D folyamatábrákon láthatunk, előnybe helyezzük a DNS szekvenciáknak a genomba való stabil bevezetése szempontjából. A kromoszómába integrált gének lehetnek homológ és heterológ gének, ugyanakkor a kromoszómálisan integrált DNS sokszorozása tandem rendszerű. Ezekről a kromoszómálisan sokszorozott szekvenciákról közölték, hogy nem stabilak, ámbár bizonyos esetek kapcsán a stabilitásukról is beszámoltak. Fentiek alapján olyan módszerek kifejlesztése kívánatos, amelyekkel a kromoszómába integrált DNS stabilan fenntartható.
Fontosabb szakirodalom.
Exogén DNS-nek a Bacillus subtilis kromoszómájába való integrálását (beépítését) homológ rekombinációval Duncan és mtsai [Proc.Natl.Acad.Sci., 75, 3664-3668 (1978)1 Írták le, az Anacystis nidulans-ról Williams és Szalay [Gene, 24, 37-51 (1983)1 Írták, vala/ mint ez a módszer szerepel a WO 84/00381 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben. Egy heterológ génnek homológ rekombinációval való beépítése szerepel az ···· ·· ···· ·· ·· • · 0 0 0 0 0 • · · ·· ···· ····· 000 · ·· ·· · ·· ··
- Ί ΕΡ-Α-0127328 számú európai közzétett szabadalmi bejelentésben. Az integrálás egy mikroorganizmus kromoszómájába történt, s a heterológ gént nem tudták a plazmid vektorba stabilan fenntartani.
A kromoszómába integrált homológ és heterológ gének sokszorozása jól dokumentált módszer. Lásd például: Saito és mtsai, Proceedings of the Fourth International Symposium on Genetics of Industrial MiQroorganisms, Kyoto , Dapán (1982)] ; D.Young, Gén. Microbiol. , 130, 1613-1621 (1984); Danniere és mtsai, Gene , 40, 47-55 (1985); Sargent és Bennett, □.Bacteriol. , 161, 589-595 (1985); Gutterson és Koshland, Proc.Natl. Acad.Sci. , 80, 4894-4898 (1983); Hashiguchi és mtsai, Agric.Bioi.Chem, , 49, 545-550 (1985); Wilson és Morgan, J.Bacteriol, 163, 445-453(1985); a 84.06701 számú franciaországi szabadalmi bejelentés és az EP-A-0134048 számú európai szabadalmi bejelentés. Prokarióta sejtekben történő spontán amplifikációról is jelentek meg közlemények. Lásd például Anderson és Roth [Ann. Rév. Microbiol., 31, 473-505 (1977) összefoglaló cikkét.
A fent hivatkozott esetek mindegyikében a kromoszómálisan integrált DNS amplifikációja tandem sorrendben ment végbe. Az ilyen tipusu kromoszómális sokszorozott szekvenciáról azt Írták, hogy nem stabil, mégis bizonyos esetekben meglehetősen jó stabilitást észleltek, ···· ·· ···· ·· ·« • · « · · · · «· · · · · · · · • · · · · · ·· · • · ·· · ·· · ·
- 8 ahogyan ezt Oanniere és mtsai [Gene, 40, 47-55 (1985)] kifejtették.
Beszámoltak arról, hogy a természetben előforduló sokszorozott prokarióta gének stabilitása annak tudható be, hogy más fontos gének vannak jelen ezen sokszorozott szekvenciák között. Például a Bacillus subtilis kromoszómájában előforduló riboszómális RNS gén-készletek 9-10 másolatából két tandem helyzetű készletet különítettek el tRNS gének egy csoportjával [Wawrousek és Hansen, O.Biol.Chem. , 258, 291-298 (1983)]. Más esetekben, természetesen előforduló tandem ismétlődő RNS operonok deletáltak voltak úgy E.coliban, mint B.subtilisban, s ez igen csekély hatással volt a mikroorganizmusok fenotipusos tulajdonságaira [Ellwood és Momura, O.Bacteriol. , 143, 1077-1080 (1980) és Loughnsy és mtsai, □ .Bacteriol. , 154, 529-532 (1983)].
Hofmsister és mtsai [Mól.Gén.Gsnet., 189, 58-68 (1983)] és Prorozov és mtsai [Gene, 34, 39-46 (1985)] arról számoltak be, hogy a pE194 vektort használva, szabálytalan rekombinációval plazmidokat integráltak a B.Subtilis kromoszómájába.
Eredményesen klónozták a bacillusok extracelluláris enzimeit meghatározó géneket. Ilyenek a B-amyloliquefaciens [Palva és mtsai, Gene, 15, 43-51 (1981)1, a B.licheniformis [Ortlepp, Gene, 23, 267 (1983)1, ··
- 9 B.stearotermophilus [Mielenz és mtsai, Proc. Natl.Acad. Sci. , 80, 5975-5979 (1983).· EP-A-0057976 számú szabadalmi bejelentés] és a B.subtilis [Yang és mtsai, Nucl.
Acids Rés,, 11, 237 (1983)] alfa-amiláz génjei; a B.subtilis leván-szukráz génje [Gay és mtsai, □.Bacteriol. , 153, 1424 (1983)]; a B.stearotermophilus [Fuji és mtsai, □.Bacteriol,, 156, 831 (1983)], B.amyloliquefaceins [Honjo és mtsai, □. Bitotechn. , 1, 165 (1984)]- és a B.subtilis [Yang és mtsai, □.Bacteriol. , 160, 115 (1984)] neutrális proteázt kódoló génjei; a B.subtilis [Wong és mtsai, Proc.Natl.Acad.Sci., 81,1184 (1984)], a B.licheniformis [Jacobs és mtsai, Nucl.Acids Rés., 13, 8913 (1985)] és B.amyloliquefaciens [Wells és mtsai, Nucl.Acids Rés., 11,7911 (1983)] szerin vagy alkalikus foszfatázt kódoló génjei.
Leírták számos Gram pozitív mikroorganizmus fajnál a protoplaszt transzformációt, Chang és Cohen [Mól.Gen.Genet. , 168, 111-115 (1979)] a B.subtilisnél a protoplaszt transzformációra olyanjeljárást közöltek, amelyet széles körben használnak. A B.megaterium prótoplasztok [Vorobjeva és mtsai, FEMS Microbiol. Letters, 7, 261-263 (1980)], a B.amyloliquefaciens protoplasztok [Smith és mtsai, Appl.Env.Microbiol., 51, 634 (1985)], a B,thuringiensis protoplasztok [Fisher és mtsai, Arch. Microbiol., 139, 213-217 (1981)], a B.sphaericus proto• · · · · · · • · · φ φ · φφφ • φ φ .φ φ · φφ · ·· ·· φ ·♦ φφ
- 10 plasztok [McDonald, □. Gen.Microbiol., 130, 203 (1984)] és a B.lárváé protoplasztok [Bakhiet és mtsai, Appl.
Env, Microbiol., 49,577 (1985)] transzformációjára hasanlóan eredményes el járás4_okat írtak le az említett serzők. Ez utóbbi közleményben sikertelen eredményekről számoltak be a B.popillae-val kapcsolatban. Az eljárás sikeres volt a B.polymya, B. licheniformis, B.macerans és B.latérosporus esetében, nem volt sikeres a B.coagulans, B.cereus és B.pumilus esetében, jóllehet jó protoplaszt képzés volt megfigyelhető [Mann és mtsai, Current Microbiol., 13, 131-135 (1986)].
A DNS-nek protoplasztokba való bevitelére szolgáló egyéb módszerek közé sorolható a DNS tartalmú liposzómákkal való fúzió [Holubova, Fólia Microbiol., 30,97 (1985)], vagy a protoplaszt fúziója könnyen transzformálható mikroorganizmussal, mint intermedier gazdasejttel (EP-A-0134048 számú szabadalmi bejelentés).
A találmány olyan prokarióta gazdasejtekre vonatkozik - valamint előállításuk módszereire amelyek egy kívánt polipeptidet kódoló DNS szekvenciának legalább két másolatát tartalmazzák, stabilan integrálva a gazdasejt kromoszómájába. Az exogén DNS szekvencia stabil fenntartása úgy érhető el, hogy a szekvenciából két vagy több másolatot építünk be a gazdasejt kromo···· ·· ···· ·· ·· • · · · · · · • · · · · · ··· ····· ···· ·· ·· · ·· ··
- 11 szómális DNS szekvenciák választják el egymástól.
Az alábbiakban az ábrák rövid magyaráza ta következik.
Az 1A-1D. ábrákon sematikusan ábrázoljuk az extrakromoszómális DNS-nek a prokarióta mikroorganiz-. mus kromoszómájába való integrálásának négy módját.
T a target (cél) szekvenciát jelenti, azaz a kromoszómán és plazmidon lévő azon DNS szekvenciákat, amelyek közt létrejön a homológ rekombináció.
S a kromoszómába integrálandó szekvenciának a jele.
M egy marker gén szekvenciát jelent, amelyet a rekombináns törzs szelekciójára használunk.
A 2A és 2B ábra vázlatosan mutat be két olyan módszert, amelyekkel stabil gén amplifikáció érhető el egy prokarióta kromoszómában.
fa 3. ábra a hisztidin/MOPS gélelektroforézis eredményét ábrázolja, amikoris a pUB1lO-et, illetve pM58-at tartalmazó B.subtilis DB104 sejtek tenyészetének felöluszóját - összehasonlítva számos szubtilizinnel elektrofőretizáltűk:
1. sáv : Carlsbsrg szubtilizin
2. sáv : Bacillus PB92 proteáz
3. sáv : Bacillus subtilis szubtilizin ···· ·· ···· ·· ·· • · · · · · · • · · · · ···· ····· ···· ·· ·· · ·· ··
4. sáv : Bacillus subtilis DB104 (pM58)
5. sáv : Bacillus subtilis DB104 (pUB110)
A 4. ábrán a pM58 plazmid restrikciós térképe látható. Ezenkívül az ábra felső részén bemutatjuk a szekvenálás stratégiáját. A nyíllal ellátott összefüggő vonalak az M13 mp10, mp11 és mp18 fág vektorokba klónozott fragmentumokat reprezentálják. Az ábra alsó része a proteáz génen szabályos távolságokra elhelyezkedő tiz oligonukleotid használtával végrehajtott szekvenálási stratégiát ábrázolja.
Az 5. ábrán a Bacillus PB92 szerin proteáz kódoló szálának nukleotid szekvenciáját és az ennek megfelelő aminosav szekvenciát látjuk. Az ábrán ugyancsak látható a DNS szekvencia P1 és Pg promotere, a riboszóma kötőhely (rbs = ribosome binding site) és a teránációs szakaszok (term). A megszámozott összefüggő vonalak a szekvenáláshoz használat tiz oligonukleotid helyzetét ábrázolják.
A 6A ábra a pE194-neo plazmid szerkesztését ábrázolja.
A 6B ábra a pMAX-4 plazmid szerkesztését ábrázolja.
A 7A ábrán egy autoradiogrammot látunk: a PB92, PBT109 és PBT108 törzs kromoszómális DNS-ét ···· 99 9999 99 99
9 9 9 9 9 9
999 999 999 • 9 9 9 9 · ·· · ·· 99 9 99 99
HindIII-al emésztettük, az emésztetteket 0,5 %-os agaróz gélben elektroforetizáltuk, nitrocellulózra vittük át a Southern által leirt módon és P-vel jelzett nick-transzlatált pM58 DNS-el hibridizáltunk.
A 7B és 70 ábra a pMAX-4 és a Bacillus
PB92 kromoszómája között végbemenő integrációs folyamatokat ábrázolja: (B) homológ rekombinációval és (C) szabálytalan rekombinációval.
A 8. ábra a pElatB integrációs vektor szerkesztését mutatja be.
A 9A. ábrán a pElatB plazmidnak a B.licheniformis T9 törzs kromoszómájába való beépülését látjuk. Eredmény: a B.licheniformis TB13 törzs.
A 9B. ábrán a B.licheniformis' TB13 és T5 törzs kromoszómális rekombinációja látható. A rekombináció a törzsek protoplaszt fúziója révén jön létre, mely a B.licheniformis T13F törzset eredményezi.
A 10, ábra a 11. példában leirt T13F törzs fermentációjából izolált kilenc különböző telep kromoszóma analízisét ábrázolja. Az izolált kromoszómális DNS-t EcoRI-el emésztettük, 0,8 %-os agaróz gélben elválasztást végeztünk, majd a frakciókat nitrocellulózra vittük. A foltok hibridizálását 32P-vel jelzett nick-transzlatált pElatB DNS-sel végeztük. Az ábrán az autoradiogramm látható. A felső nyíl azt a pozíciót mutatja, ahova egy kö' * • · • · rülbelül 15 kb hosszú EcoRI fragmentum vándorol. Ez a fragmentum tartalmazza a teljes pElatB szekvenciát, amelyet beépítettünk a kromoszómának egy olyan helyére, amely nincs az eredeti alfa-amiláz gén mellett, mint ahogy ezt a 9A ábrán lerajzoltuk a TB13 törzsnél. Az alsó nyíl azt a poziciót mutatja, ahova egy körülbelül 33 kb hosszú EcoRI DNS fragmentum vándorol, amely a B. licheniformis T5 törzsben eredetileg jelenlévő teljes alfa-amiláz gént tartalmazza (lásd a 9B. ábrát).
A következő DNS mintákat analizáltuk:
1. sáv : Bacillus licheniformis T5 DNS
2. sáv : Bacillus licheniformis TB13 DNS
3. sáv : Bacillus licheniformis T39O DNS
4. sáv : a Bacillus licheniformis T39O neomicin érzékeny származékának DNS-e, amelyet fermentáció után izoláltunk (lásd a 12. példát)
5. sáv : Bacillus licheniformis T13F DNS
5. sáv : a T13F törzs fermentációjából izo Iáit 9 különböző telep DNS-e (lásd a 12, példát).
Az alábbiakban a találmány speciális kiviteli módozatainak leírása következik.
• ···
- 15 A jelen találmány olyan prokarióta sejtekre és előállításuk módszereire vonatkozik, amelyekben egy DNS szekvenciának egy vagy több másolata a kromoszómába stabilan van integrálva. A kívánt polipeptidet kódoló DNS szekvenciát magába foglaló gazdasejtet egy olyan DNS szerkezettel transzformáljuk, amely az említett DNS szekvenci t tartalmazza. Azokat a transzformált sejteket, amelyekben az integrált DNS szekvenciákat endogén kromoszómális szekvenciák választják el a sokszorozandó géntől, szelektáljuk. Az endogén közbeeső szekvenciák általában vitálisak a gazdasejt szempontjából. A sokszorozott szekvenciák elvesztése - homológ rekombináció révén - a gazdasejtre nézve letális következménnyel jár. Tehát szelekciós nyomás lesz a sokszorozott szekvenciákat hordozó sejteken anélkül, hogy antibiotikumok vagy hasonló szelekciós eszközök használatára lenne szükség. Integrációt homológ rekombinációval vagy szabálytalan rekombinációval lehet elérni. Azokat a technikákat, amelyekkel a kívánt sejtek előállithatók, a 2A. , illetve 2B. ábrákon mutatjuk be.
Ha homológ rekombinációt használunk, akkor számos olyan DNS szekvencia szakasz lehet jelen a vektor molekulában, amelyek homológok a gazdasejt kromoszómájával, különösen, ha a sokszorozandó gén egy vagy több másolatát már bevezettük a gazdasejtbe. Tehát a vektor molekula tartalmazhatja a kívánt DNS szekvenciát, • · • · · · · · · • · · · · ···« * · · -Ο · · ·· « ·· ·· · ·· ·· egy target DNS szekvenciát és egy marker DNS szekvenciát.
Gondoskodni kell arról, hogy csak a kívánt rekombináns kromoszómális elrendezettség alakuljon ki. Ezt úgy érhetjük el, ha a rekombinációhoz lineáris DNS molekulákat használunk. A beépítendő cirkuláris vektor molekulát restrikciós enzimmel hasítjuk a target szekvenciával homológ szakaszban. Ilyen módon a rekombináció és integráció ezen a specifikus helyen történhet meg elsősorban. Azonkívül hogy a szóbanforgó DNS szekvencia jelen van a vektor molekulában, megtalálható a gazdasejt kromoszómájában is. A DNS szekvencia egy bármilyen olyan strukturális gént meghatározó DNS szekvencia lehet, amelynek a sokszorozása kívánatos. A DNS szekvencia a gazdaszervezet szempontjából lehet endogén vagy be lehet építve a gazda kromoszómájába egy előző transzformációs lépésben.
A non-tandem gén amplifikációhoz a target szekvenciákat előnyösen a nem esszenciális gének közül választjuk ki, például ha bacillusok a gazdaszervezetek, akkor az extracelluláris enzimeket kódoló gének közül választunk, vagy olyan géneket használhatunk target szekvenciákként, amelyek a sporulációban játszanak szerepet. A DNS szekvenciák beépülése ezekbe a génekbe általában inaktiválják a gént. így a gén-expresszió elvesztése ellenőrizhető és felhasználható, a kívánt rekombináns ···· ·· ···· ·· ·· • · · · · · · • · * · · ···· ··«·· ···· ·· ·· · ·· ··
- 17 törzsek szelekciójára.
Ha a szabálytalan rekombinációt használjuk a kromoszómális gén amplifikációjához, - amint ezt az 1D. és 2A. ábrákon bemutatjuk - az integráció és szelekció érdekében«iyan feltételeket helyezünk előnybe, amelyek mellett a homológ rekombináció nem érvényesülhet a szabálytalan rekombinációval szemben. A homológ rekombináció előnyösen úgy kerülhető el, ha az első és a második gazdasejteket, amelyekből hiányzik a kívánt strukturális gén, egy olyan vektorral transzformáljuk, amely a kívánt polipeptidet kódoló DNS szekvenciát és egy marker gént tartalmaz. Ezután az első és a második gazdasejtet, amelyekben a DNS szekvencia különböző helyeken van jelen, szelektálhatjuk és fúziós feltételek mellett kombinálhatjuk úgy,hogy egy olyan transzformált sejtet eredményezzen, amely a kívánt strukturális gént meghatározó DNS szekvenciából legalább két másolatot tartalmaz a második gazdasejt genomjában rendszertelen elhelyezkedéssel. A szelekció megkönnyítése érdekében az első gazdát el lehet ölni a fúzió előtt.
A szóbanforgó gén(ek) bármilyen prokarióta vagy eukarióta gén(ek) lehet(nek). Ezek a gének lehetnek bakteriális gének, egysejtű mikroorganizmusok génjei, emlős eredetű gének és ehhez hasonlók. A strukturális gének különböző módszerekkel állíthatók elő, például • *
- 18 szintézissel, gsnomiális DNS-ből való izolálással, cDNS-ből való elkülönítéssel vagy ezek kombinációjával. A különböző génmanipulációs tecnikák jól ismertek, ilyen például a restrikció, emésztés, kimetszés, ligálás, in vitro mutagenezis, primer repair, linkerek és adapterek használata és igy tovább. Tehát egy gazdasejtből kapott DNS szekvenciát különböző módon manipulálhatunk, a DNS szerkezetre vonatkozó kívánalmaktól függően. Lásd: Maniatis és mtsai, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. USA. (1982).
A strukturális gének különféle polipeptideket vagy proteineket fejezhetnek ki, úgy mint enzimeket, hormonokat, limfokineket, felületi proteineket, vérfehérjéket, szerkezeti fehérjéket, immunglobulinokat és igyftovább, s ezek lehetnek emlős eredetűek, egysejtű mikroorganizmus eredetűek, például ilyenek a baktériumok, gombák - mint az élesztő vagy fonalas gombák - algák, protozoák, stb. Lehetnek továbbá növényi eredetűek vagy más DNS eredetűek. Különösen fontosak az enzimek, főként a proteázok és amilázok. Ilyen enzimek például a következők: szerin és nem-szerin proteázok, beleértve az erősen alkalikus szerin proteázokat, az alfa- és béta-amiláz és ehhez hasonlók. A szerin proteáz előnyös fór···· ·· ·· • · · · · • · · · · ·«
- 19 rása a Bacillus novo PB92 faj és az alfa-amilázé a
B.licheniformis T5 törzs, valamint e törzsek mutánsai és variánsai.
A gént, amely a megfelelő vektor részét képezi, a szakterület általánosan ismert módszereivel állíthatjuk elő. Általánosságban ezek a módszerek magukba foglalják azt a lépést, hogy genom gyűjteményt hozunk létre egy erősen alkalikus foszfatázt kifejező mikroorganizmusból. A genom-gyüjtemény könnyen elkészíthető például úgy, hogy a donor törzs DNS fragmentumait egy megfelelő vektorba építjük be.
A megfelelő vektor kifejezés egy olyan
DNS szerkezetet jelent, amely a kívánt proteint vagy polipeptidet kódoló strukturális gént tartalmazza. A strukturális gén - megfelelő irányítottsággal - szabályozó szakaszokhoz csatlakozik, ilyen«egy promoter szekvencia, egy olyan szekvencia, amely a riboszóma kötőhelyet képezi és azok a szekvenciák, amelyek a strukturális gén transzkripcióját és transzlációját szabályozzák. Mindezen szabályozó szakaszok a gazdasejtben funkcionálnak. Amikor a gazdasejtnek a transzformációs és integrációs frequenciája túl alacsony ahhoz, hogy az integrációhoz direkt szelekciót biztosítson a plazmidokat tartalmazó sejtek - ilyenek az ipari Bacillus törzsek - közbeeső izolálása nélkül, a vektor kiegészítésül ···· ·· ···· ·· ·· • · · · · · · ·· · ·· · · · · ····· · · ♦ · ·* · · · · · ··
- 20 egy olyan replikációs origót tartalmazhat, amely autonóm módon képes replikálódni a gazdasejtben.
Amikor a gén egy olyan donor sejtből származik, amelyben transzkripciót és transzlációt indító és leállító szabályozó szignálok vannak, s ezeket a prokarióta gazdatörzs elismeri, akkor rendszerint az a célszerű, ha megtartjuk a strukturális gén eredeti szabályozó szekvenciáit. Ezenkívül a transzkripciót indító szakasz biztosíthatja a konstitutív vagy indukálható expressziót úgy,hogy alkalmas körülmények között, még mielőtt a fontos strukturális gének magas szintű expressziója bekövetkezne, a gazdasejt tenyészet sűrűsége megnövekedhet.
Amikor a strukturális gén egy olyan forrásból származik, amelynek a szabályozó szignáljait nem ismeri fel a gazdasejt, szükség van olyan szabályozó szekvenciák előállítására, amelyeket felismer a gazdasejt és a strukturális gént be kell építeni az indító és leállító szabályozó szignálok közé. Bizonyos esetekben az exogén strukturális gént saját stop kodonjával együtt építhetjük be a leolvasási keretbe, egy olyan endogén strukturális gén N-terminális kodonjai mögé, amely megtartja természetes szabályozó szignáljait.
• · · • « · · « · · • · « · · ····
- 21 Kívánatos, hogy az expressziós termék szekretálódjék. Amikor az expressziós termék természetesen szekretálódik és a vezérszekvenciákat és a processzor szignált (szignálokat) a gazdasejt felismeri, akkor nem merül fel nehézség. Azonban, amikor a termék nem szekretálódik, mivel a gazdasejt nem ismeri fel a szekretoros vezér szignálokat és/vagy a processzor szignált (szignálokat) vagy a szignálok nem működnek a gazdasejtben megfelelő szinten, akkor szükség lehet arra, hogy izoláljunk vagy szintetizáljunk olyan DNS szekvenciákat, amelyek a gazdasejt-polipeptid szekretoros vezér szignáljait és processzor szignálját (szignáljait) kódolják, s hogy ezeket hozzákapcsoljuk - megfelelő leolvasási sorrendben - a strukturális gén 5’ végéhez.
A vektor ezenfelül tartalmazhat marker gént, amely egy olyan antibiotikummal szembeni rezisztenciát ad át, amelyre a gazdasejt érzékeny, A marker génnek, ha a vektor kromoszómájába beépítve használjuk, ki kell elégítenie azt az igényt, hogy a túlélő szelekció még akkor is lehetséges, legyen, ha a marker génnek csak egy vagy kis számú másolata van jelen a gazda törzsben. Markerként olyan strukturális gén jöhet számításba, amely képes a gazdasejtben kifejeződni és amely lehetővé teszi a túlélő szelekciót. A túlélő szelekció alatt biocid vagy virus rezisztenciát értünk, s hogy egy auxotrof gazdasejt • · · ·
- 22 prototróffá változik. A prototrófia érdekében különböző géneket használhatunk, ilyenek a leu, his, trp vagy hasonlók. A biocid rezisztencia antibitotikumokkal szembeni rezisztencia lehet, például: noe, cam, tét, tun, kan vagy hasonlók. Más markerek nehéz fémekkel szembeni rezisztenciát, immunitást, stb. hordoznak, A különböző DNS szekvenciák különböző forrásokból származhatnak, s ezeket összekapcsolva olyan vektor jöhet létre, amely egy vagy több megfelelő, előnyösen egyedi restrikciós helyeket tartalmaz, hogy a strukturális géneket az ilyen helyekre be lehessen épiteni, vagy szubsztituálni az elvesztett fragmentumok helyére, hogy kialakíthassuk a plazmid szerkezetét.
A kromoszómális integráció érdekében a szelekciót egy olyan plazmid használatával lehet elősegíteni, amelynek az eredeti replikációja olyan mutáción ment keresztül, amelynek következtében a gazdasejtben hőmérséklet érzékeny módon működik. Lásd például: Ehrlich, Proc, Natl. Acad, Sci., 75, 1433 (1978).
Mihelyt a plazmid szerkezete elkészült, be lehet klónozni egy alkalmas gazdasejtbe. Bármilyen olyan gazdasejt használható, ami könnyen kezelhető, könnyen transzformálható, lehetővé teszi a plazmid szerkezet replikációját és a gazdasejtbe való átkerülését. Nagyszámú • · • ···
- 23 olyan törzs áll rendelkezésre, amelyeknél nagy a transzformációs készség, s szék rendszerint auxotrófok és/vagy antibiotikumra érzékenyek. Ahol a gazdasejt valamely ipari Bacillus törzs, úgy a plazmid szerkezet klónozásához ugyanezen mikroorganizmusnak, mint gazdasejtnsk a használata sok előnnyel jár, mivelhogy egyetlen replikációs rendszer alkalmazását, valamint ugyanazon marker használatát teszi lehetővé a túlélő szelekcióhoz úgy a klónozó gazdában, mint a gazdasejtben. Lásd például az EP-A-134048 számú európai szabadalmi bejelentést, amelynek az adatai ebben a találmányban referenciaként szerepelnek.
A plazmid szerkezetet hagyományos módszerekkel vezetjük be a klónozó gazdába, ilyen a transzformálás kalciummal precipitált DNS alkalmazásával, a konjugálás vagy más alkalmas technikák. A klónozó gazdát ezután megfelelő táptalajban tenyészthetjük szelektív feltételek mellett, hogy a plazmid szerkezetet tartalmazó gazdasejtet kiválaszthassuk. Az auxotróf gazdáknál a táptalaj a kívánt tápanyagra nézve deficiens, míg biocid rezisztencia esetén - a biocid anyag(ok) citotoxikus mennyiségét tartalmazza a táptalaj.
I
A gazdasejtek számos változatát használhatjuk, ilyenek a következők: E, coli, Bacillus törzsek, kulönöen a Bacillus subtilis, Pseudomonas és Streptomyces törzsek. A gazdasejt kiválasztásánál kö• ··· ···· ·· ···· ·· • · · · · • · · · · lönböző faktorokat kell figyelembe venni, például olyan faktorokat, amelyek a sokszorozandó gén expresszióját és a kívánt termék termelését befolyásolják. így tehát olyan gazdasejt használata a kívánatos, amelyben végbemegy a szabályozó szignálok felismerése, könnyen megy a szekréció és a kívánt termék degradációja csökkent mértékű, stb. Az az előnyös gazdasejt, amely már termeli a kívánt polipeptidet, s ez akár vad tipusu mikroorganizmus, vagy akár mutáns mikroorganizmus is lehet. A gazdasejt olyan mutáns mikroorganizmus is lehet, amely ugyan sajátmaga nem termeli a szóbanforgó polipeptidet, de a mutánsa igen. Ha a kívánt polipeptid egy proteáz vagy egy amiláz, akkor az előnyös törzsek a következők: Bacillus novo PB92 és Bacillus licheniformis T5, illetve e törzsek mutánsai és variánsai.
Ezenkívül iparilag olyan törzsek is használhatók, amelyek egy ipari törzstől megkívánt vonásokkal rendelkeznek. Az alkalmazható törzsek közé tartoznak az enzimek ipari termelésére alkalmas törzsek, ilyenek a B.licheniformis, B. amyloliquefaciens és az alkalofil Bacillusok. Az ipari törzseket olyan mikroorganizmusok közül választhatjuk ki, amelyek a talajból izolálhatók, vagy üledékekből vagy más forrásokból nyerhetők vagy amelyeket az ilyen törzsek módosítása révén kaphatunk. Az ipari törzsek nagyon erőteljesek és stabilak. Ezen···· ·· ···· ·· • · ·9 9 • · · 99
- 25felül az említett törzsek rezisztensek fág fertőzéssel szemben és genetikus változásokkal szemben, azaz a szokásos transzformációs eljárásokkal kivitelezhető DNS bevezetési eljárássel szemben, A hagyományos ipari törzsek prototrófok, mivel igy elkerüljük a költséges aminosavak hozzáadását a táptalajhoz. Az ipari törzsek egyéb jellemző tulajdonságai a következők: magas termelőképesség a fermentáció befejezéséig, ugyanis a fermentáció egy hétig is eltarthat, stabil sejtkoncentráció a tápleves kimerítése mellett és magas termelékenység, azaz literenként rendszerint legalább 5 g (0,5 % suly/térf) szekretált protein.
Olyan transzformált sejteket kaphatunk, ahol a kromoszómában a gének úgy tandem , mint elszórt helyzetűek lehetnek. Az említett kétféle tipusu transzformált sejtek keverékéből általában ki lehet választani a géneket elszórtan tartalmazó transzformált sejteket. Úgy járunk el, hogy mindkét individuális transzformált sejt kromoszómális DNS-ét izoláljuk, ezután analizáljuk az illető DNS-eket az említett gének viszonylagos elhelyezkedésére vonatkozóan, például Soutern módszerével £□.Mól.Bioi. , 98, 503-517 (1975)1 vagy más olyan módszerekkel, amelyeket azok, akik e szakterületen jártasak, ismernek. Ilyen módon azonosíthatjuk a szóbanforgó gének szórt integrációját.
- 26 A géneket szórtan tartalmazó transzformált sejteket, hogy a tandem integrációt elkerüljük, úgy állítjuk elő, hogy kettős reciprok integrációt alkalmazunk, amint ezt az 1B. és 2B. ábra'Vmutat ja, továbbá olyan linearizált DNS szerkezeteket használunk, amelyek a sokszorozandó DNS szekvenciát, egy marker gént és a rekombinációhoz szükséges cél szekvenciákat tartalmazzák.
Ezenkívül a géneket elszórtan tartalmazó transzformált sejtek előállításának speciális módszerei közé tartozik a szabálytalan rekombináció is. Ennek alkalmazását a 2A. ábra mutatja be. A tandem transzformált sejtek izolálását a szelektálásnál úgy kerülhetjük el, hogy egy marker gén differenciáló expresszióját használjuk fel. Például: antibiotikum rezisztenciát kódoló gént használunk akkor, amikor a gént tandem integráló törzsnek az illető antibiotikummal szembeni érzékenysége különbözik a non-tandem integráló törzs érzékenységétől. Általában a közbülső endogén DNS szekvenciák hossza 10 kbp-nál rövidebb (kbp = kilo bázis pár).
Ezenkívül általában a géneket elszórtan tartalmazó transzformált sejtek előállítási módszerei közt - a tandem duplikációt elkerülendő - szerepel a következő eljárás: egy olyan DNS szerkezetet tartalmazó homológ donor törzs elölt protoplasztjait használjuk, amely magába foglalja a strukturális gént és egy marker gént, s a struktu··
- 27 ralis gén ebben máshol van beépülve a kromoszómába, mint az akceptor törzsben.
Előnyös, ha a gazdasejtek transzformációjánál a gazdasejtből készített protoplasztokat használjuk. A protcplasztokát a sejtekből hagyományos módszerekkel állítjuk elő, például lizozim vagy zimoláz kezeléssel, majd a protoplasztokat óvatosan egy olyan alkalmas táptalajban szuszpendáljuk, amelyeknek az ozmolalitása megfelelő a protoplaszt integritásának a fenntartására. Az ipari Bacillus törzseket illetően a protoplasztok előállítási módszereit az EP-A-0134048 számú európai szabadalmi bejelentés tartalmazza és ezeket az adatokat ez a leírás referenciaként tartalmazza. Amikor a gazdatörzs egy alkalofil Bacillus törzs, a protoplasztok könnyen előállithatók lúgos pH mellett, előnyösen pH = 8,0 körül. Ezt az eljárást az EP-A-87200358.7 számú európai szabadalmi bejelentés leírja. Az eljárást a jelen találmány mint referenciát tartd-mazza.
A gazdasejt úgy transzformálható, hogy kombináljuk a plazmid szerekezetet vagy a klónozó gazda-protoplasztot a gazdasejt-protoplaszttal megfelelő fuzogén (fusogen) jelenlétében. Bármely olyan fuzogén használható, amely a hatékonyság kívánt fokát biztosítja. Leginkább & polietilénglikollal biztosíthatunk igen könnyen magas fúziós hatékonyságot. Rövid idő után, a fuzogén ···· ·· ···· ·· ··
- 28 keveréket megfelelő táptalajjal helyettesítjük és a sejtek szelektív táptalajban való regenerálása egyszerűen agar lemezve való szélesztéssel történik.
Azok a transzformált sejtek, amelyeket a gazdasejt és egy megfelelő DNS szerkezet kombinálása révén kapunk, tartalmazhatják az említett DNS szerekezetet vagy ennek egy részét, akár e sejtek kromoszómájába beépült rész gyanánt, akár mint szabad vektor molekulákat, ha a DNS szerkezet az említett gazdasejtben is működő replikációs kezdőpontot tartalmaz.
A kromoszómába integrált DNS szerkezetet tartalmazó transzformált sejtek szelektálása végett olyan plazmidot használunk, amely hőmérséklet érzékeny replikációs origót tartalmaz. A transzformált sejteket szelektív táptalajon tenyésztjük permissziv hőmérsékleten, majd áttérünk egy non-permissziv hőmérsékletre. A plazmid távollétét például úgy lehet megállapítani, hogy a telepekből izoláljuk az össz-DNS-t.majd agaróz gélben elektroforzéist végzünk, vagy úgy, hogy kimulatjuk, hogy a transzformált sejtből hiányzik a kompetens sejtek transzformálására való képesség. Hogy a kromoszómába való beépülés megtörtént-e, annak meghatározhása a kromoszómális DNS analízisével történik, például Southern módszerével E□.Mól.Bioi. , 98, 503-517 (1975)], vagy más olyan módszerekkel, amelyeket e szakterületen ismernek.
Ha a transzformált sejtek - amelyekben a marker gén több másolata tandem elrendezettségben van jelen - szelektív szerrel szembeni érzékenysége különbözik azoknak a sejteknek az érzékenységétől, amelyekben a marker gén a gazda genomjába elszórtan épült be, akkor a transzformált sejteket könnyen tenyészthetjük olyan táptalajban, amely megfelelő koncentrációban tartalmazza a szelektív anyagot a non-tandem integrációt tartalmazó transz- formált sejtek kiválasztása szempontjából,
A kívánt DNS szekvencia elszórtan integrálódott másolatait tartalmazó transzformált sejtek elkülönítésének egy másik módja szerint egy olyan homológ donor sejtből készített protoplasztot használunk, amely a szóbanforgó DNS szekvenciából legalább egy olyan másolatot tartalmaz kromoszómájában egy olyan helyen, amely különbözik a recipiens gazdasejtben lévő helytől. A homológ donor sejtet például úgy készíthetjük el, hogy a kívánt strukturális gént nem tartalmazó sejtet a strukturális gént tartalmazó vektorral transzformálunk. A DNS szekvencia bepülése a donor sejt kromoszómájába megkönnyíthető azáltal, hogy hőmérséklet érzékeny replikáclós origót tartalmazó plazmidot használunk és a transzformált sejteket szelektív körülmények között tenyésztjük, először permissziv hőmérsékleten, majd non-permissziv hőmérsékleten - mint fent leírtuk - ezután pedig izoláljuk a marker gént kifejező telepeket.
···· ·· ···· ·· ·· • · · · · · · • · · · · · ···
A plazmid DNS hiányának bizonyítása érdekében ezután izoláljuk a kromoszómális DNS-t, amelyet Southern módszere szerint (lásd fent) analizálunk úgy, hogy például egy P-vel jelzett, vagy biotinnel módosított nukleotid próba-anyaggal hibridizáljuk. Próba-anyag lehet a szóbanforgó DNS szekvenciát kódolócDNS vagy ennek fragmentuma, továbbá olyan DNS szerkezetek vagy ezek fragmentumai, amelyek a kívánt DNS szekvenciát tartalmazzák, például egy vektor. Azokat a transzformált sejteket lehet homológ donor sejtek gyanánt használni, amelyekben a kívánt gén helyzete más, mint a gént adó sejtben. A recipiens gazda törzs előnyösen ugyanaz a törzs, mint amit a kívánt DNS szekvencia forrásaként használtunk, vagy pedig egy olyan törzs, amelyben a kívánt DNS szekvencia a kromoszóma más szakaszán helyezkedik el, mint a transzformált donor sejtben.
A szelekció elősegítése érdekében előnyös, ha a donor sejtet egy citotoxikus szerrel elöljük a protoplaszt képződés előtt vagy ennek folyamán. Különböző anyagok alkalmazhatók a donor sejt elölésére, például az antibiotikumok, de igen alkalmasnak és hatékonynak bizonyult a jód-acetamid, amely nem zavarja az ezután következő fúziót. Ha nem élő klónozó gazda-protoplasztokat használunk, a nem élő protoplaszt és az akceptor gazdatörzs aránya előnyösen legalább körülbelül 1:1 és az elölt protoplasz• · · · · · · ·*·· * · * * ···
- 31 tokát túlsúlyban alkalmazhatjuk.
A nem élő donor sejt protoplaszt és a reciptiens gazdasejt protoplaszt fúziója után a transzformált sejtek a markor gén segítségével szelektálhatók. A DNS-t ezután izoláljuk és a fenti módon analizáljuk, hogy azonosítsuk azokat a transz formált sejteket, amelyeknél a kívánt génből egynél több másolat épült be a genomba és ahol e géneket endogén kromoszómális szekvenciák választják el egymástól.
Az elszórtan két gént tartalmazó transzformált sejteket ezután megfelelő eljárásokkal szűrjük, kimutatjuk, hogy hol növekedett a kívánt polipeptid expressziója. Itt különböző technikák alkalmazhatók, különösen, ha enzimekről van szó, amelyeknél jól kidolgozott meghatározási módszerek állnak rendelkezésre. Vagy ahol nem enzimek szerepelnek, vagy ahol nincs hozzáférhető kimutatási rendszer, bioassay-ket, antitesteket vagy DNS vagy RNS hibridizációt alkalmazhatunk a kiónok szűrésére a plazmid szerkezet jelenlétének és a szóbanforgó strukturális gén kifejeződésének meghatározása céljából.
A kromoszómába integrált plazmid szerkezeteket vagy ezek fragmentumait tartalmazó gazdasejtet ezután táptalajban tenyésztjük a szokásos fermentációs feltételek mellett. A fermentálást addig folytat-
hatjuk, amig a tápleves ki nem merői. Ahol a termék szekretálódott, ott a terméket a fermentléből a szokásos technikákkal izoláljuk, például extrakcióval, kromatográfiával, elektroforézissel, vagy ehhez hasonló módszerekkel. Ahol a termék a citoplazmában marad, a sejteket centrifugálással, szűréssel, stb. aratjuk le, mechanikai nyirást kifejtő detergenssel, lizozimmel vagy más módszerekkel lizáljuk a sejteket, majd a terméket az előbb leírtak szerint izoláljuk. A találmány tárgyát képező módszer alkalmazásával, azaz gén amplifikációval a DNS szekvencia legalább két másolatának a stabil integrálása érhető el.
A következő példákat magyarázatként adjuk közre, s ezek nem korlátozzák a találmány oltalmi körét.
1. példa
Genomiális DNS gyűjtemény készítése az alkalofil Bacillus novo PB92 fajból és a szerin proteáz gén izolálása
A Bacillus novo PB92-ből (OR-6O szám alatt Hollandiában, a Dslftí Műszaki Egyetem Mikrobiológiai Laboratóriumában helyeztük letétbe; lásd a Re. 30 602 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmat) kromoszómális DNS-t izolálunk Saito-Minwa módszerével [Biochim.Biophys. Acta 72, 619-632 (1963)]. A DNS-t részlegesen emésztjük
Sau3A restrikciós enzimmel, majd a pUBliO plazmid [Gryczan és mtsai, □ .Bacteriol, , 134, 318-329 (1978)1 BamHI helyére ligáljuk. A pUB110 plazmid DNS-t Bimbóim és Doly által leírtak szerint [Nucl. Acids Rés., 7, 1513-1523 (1979)1 állítottuk elő.
A ligázos keverékkel Bacillus subtilis 1A40 (Bacillus Genetic Stock Centre) sejteket transzformálunk Spizizen és mtsai módszere szerint [□. Bacteriol. , 81, 741-746 (1961)1, 0,6 - 1^ug DNS-t használva 1 ml kompetens sejthez, A transzformációs keverék sejt jeit minimál lemezre visszük, melynek öszetétele a követ kező: 2,8 % K2HP04, 1,2 % KH2P04, 0,4 % (NH4)2S04, 0,2 % trinátrium-citrát.2H20, 0,04 % MgS04«7H20, 0,00005 %
0,5 % glükóz, 0,02 %
MnS04.4H20, 0,4 % L-glutaminsav,
Casamino acid, 50/Ug/ml triptofán 20/ug/ml lizin, 20^ug/ml neomicin agar. Egy éjszakán át inkubáltuk a s 50 000 neomicin rezisztens telep
20/ug/ml metionin,
0,4 % kazein és 1,5% lemezeket 37 °C-on, közül egy mutatott emelt proteáz termelést, amit az agar lemezen lévő telep körüli kazein bomlás termékek precipitációs gyűrűje növekedéséből határoztunk meg. A plazmid DNS-t ebből a telepből izoláltuk Birnboim és Doly módszerével [Nucl.Acids
Rés., 7, 1513-1523 (1979)] és pM58-nek neveztük el • · ··
2, példa
A PB92 szerin proteáz gén expressziéja
A pM58-at tartalmazó Bacillus subtilis
1A40 sejtjeit minimál táptalajban [Spizizen és mtsai,
Proc.Natl. Acad.Aci. , 44, 1072-1078 (1958)1 tenyésztjük, amelyet a következő anyagokkal egészítettünk ki:
óra múlva a tenyészetet lecentrifugáljuk és a felüluszót proteáz aktivitásra vizsgáljuk, szubsztirátumként dimetil-kazeint használva [Lin és mtsai, □.Bioi.Chem. , 244, 789-793 (1969)1. Kontrollként a pUB110 plazmidot tartalmazó B.subtilis 1A40 tenyészetét használjuk, amelyben a proteáz aktivitás a pM58-al transzformált tenyészetben mért aktivitásnak 1/60-ada volt. A proteáz aktivitást tökéletesen gátolta az 1 mmólos fenil-szulfonil-kloriddal (PMSF) való kezelés, de a 20 mmólos EDTA_val való kezelés nem gátolt.
A fent leirt felüluszó alikvot mennyiségeit protein-gélben analizáljuk Laemmli módszerével [Natúré, 227, 680 (1970)1. A gélben való analizis céljára a mintákat úgy készítjük el, hogy a felüluszókat 5 %-os triklór-ecetsavval (TCA) kezeljük. A minta centrifugálása után a kicsapott protein üledéket kétszer mossuk acetonnal, majd 40zul minta-pufferben [0,5 mól trisz.HCl (pH = 7,5), 10 % (térf/térf) 2-merkapto-etanol, • · • · · ·
- 35 50 % (térf/térf) glicerin, 0,05 % brómfenolkék] oldjuk úgy, hogy 10 percig forraljuk. Elektroforézis után a géleket Coomassie Brilliant Blue-val festjük meg. A tenyészet-felüluszók mintáit ezután elektroforézissel vizsgáljuk. Három különböző B.subtilis 1A40 törzset használtunk: a pUB110-et és a pM58-at tartalmazó törzset vagy plazmidot nem tartalmazó törzset. Kontrollként a Bacillus PB92 proteázt használtuk. Elektroforézis után a géleket Coomassie Brilliant Blue-val festettük, majd mostuk. A‘pM58-at tartalmazó B.subtilis 1A40 törzs egy kd proteint tartalmazott, amely együtt vándorolt a Bacillus PB92 proteázzal. Ez a protein nem volt kimutatható a pUB1lO-et tartalmazó B.subtilis 1A40 törzs kontroll sávjában.
Minden szerin proteáz azonos molekulasulyu.
A Bacillus PB92 klónozott szerin proteáza tehát elkülönült az ismert szerin proteázoktól (B.subtilis szubtilizin, Carlsberg szubtilizin), mivelhogy a proteáz negatív B.subtilis DB104 törzset (R.Doi, □.Bacteriol. , 160 , 442- 444 (1984)1 transzformáltuk pM58-al és pUB110-el, és az extracellulárisan termelt proteázok analízisétől is eltér.
A kapott transzformált sejteket olyan minimál táptalajon tenyésztjük (Spizizen és mtsai, lásd fentebb), mely 0,02 % Casamino acid, 50/ug/ml hisztidin és 20/ug/ml neomicin tartalmú. Ezután 24 óra múlva mintákat veszünk, a • ··· · ···· ·· · · • · · · · · · • * · · · «··· ····· ···· • · · · · · · ··
- 36 mintákat centrifugáljuk és előkezelés nélkül hisztidin/MOPS gélben, mely 75 ipmól KOH-t, 40 mmól hisztidint, 100 mmól MOPS puffért és 5 % poliakrilamidot (pH = 7,5) tartalmaz, analizáljuk, [MOPS = 3-(N-morfolino)-propán-szulfonsav]. Az elektroforetizáló puffer 40 mmól hisztidint és 100 mmól MOPS puffért (pH = 6,6) tartalmaz. A minták a katód felé vándorolnak. A proteáz sávokat Agfa Pan 100 Professional filmekkel mutattuk ki [Zuidweg és mtsai, Biotechnoi. Bioengin. , 14, 685-714 (1972)]. Ezek az eredmények a 3. ábrán láthatók.
A 4. ábrából kitűnik, hogy a pM58 magába foglalja a Bacillus PB92 proteázt kódoló gént.
3. példa
A Bacillus PB92 szerin proteáz gén szekvenálása
A pM58 Ball-Hpal fragmentumának teljes szekvenciáját Sanger módszerével [Proc. Natl. Acad, Sci., 74, 6463 (1977)] határoztuk meg. A pM58 restrikciós fragmentumait (lásd a 4, ábrát) beklónoztuk az M13 fág mplO, mp11 és mp18 vektorokba (Messing és mtsai, Nucl.Acids Rés., 9, 309-321 (1981)]. A beépült pM58 fragmentumok szűrését plakk hibridizációval végeztük. Szekvenálás után tiz olyan oligonukleotidot készítet tünk, amelyek szabályos távolságokban helyezkedtek el a génen, majd a szekvenálást megismételve, igazoltuk az 5. ábrán látható szekvenciát.
4, példa
A szerin proteázt tartalmazó pMAX-4 plazmid szerkesztése
A pUCN710 plazmid szerkesztése (6A. ábra) céljára a pUB11O-et Taql-el és PvuII-vel emésztjük.
A neomicin rezisztenciát átadó gént tartalmazó fragmentumot alacsony olvadási hőmérsékletű agarózban tisztítjuk, majd tompa végűvé alakítjuk Klenow polimeráz és az NTP-k (nukleozid-trifoszfátok) segítségével (Maniatis: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982). A pUC7 plazmidot EVieira és mtsai, Gene, 19, 259-268 (1982)] Sall-el lineraizáljuk, majd tompa végűvé alakítjuk a fent leírtak szerint. A két fragmentumot T4 ligázzal ligáljuk (Maniatis), s ezzel E.coli □M103 sejteket transzformálunk. A szelekciót 2 x TY lemezeken (1 ,6 % suly/térf Bacto-Trypton, 1 % suly/térf élesztő kivonat, 0,5 % NaCl) végezzük, melyek 50/Ug/ml ampicillint és 10/Ug/ml neomicint tartá.maznak. A kapott pUCN710 elnevezésű plazmidot BamHI-el emésztjük, A pE194 plazmidot [Oordanescu, Plasmid, 1, 468-479 (1978)] BclI-sl emésztjük. A két emésztésnél kapott fragmentumokat T4 ligáz segítségével összekapcsoljuk és ezzel a B.subtilis 1A40 sejtjeit transzformáljuk. A szelekciót 20,ug/ml neomicint tartalmazó minimál lemezeken végezzük (lásd az 1. példát). A kapott pE194-neo
plazmid (6A. ábra) tartalmazza a neomicin gént és a hőmérséklet érzékeny replikációs kezdőpontot,
A proteáz gén szubklónozását a pE194-neo integrációs vektorba úgy végezzük, hogy a pM58-at (lásd az 1, példát) Hpal-el, Ball-el és BglII-vel emésztjük, A pE194-neo plazmidot Hpal-el emésztjük, A kapott fragmentumokat T4 ligáz segítségével kapcsoljuk össze, majd ezzel transzformáljuk a B,subtilis 1A40 sejteket. A transzformált sejtek szelekciója a neomicin rezisztencián és a megnövekedett proteáz termelésen alapszik, s ezt a kazein bomlástermékek precipitációjával igazoljuk (gyűrű képződés, lásd az 1. példát). így kapjuk a pMAX-4 plazmidot, amelynek a szerkezetét restrikciós enzimes analízissel igazoljuk (lásd a 6B. ábrát).
5. példa
A Bacillus PB92 törzs protoplasztjajnak transzformálása ρΜΑΧ-4-el
A Bacillus PB92 törzs sejtjeit egy éjszakán át tenyésztjük 100 ml NBSG-X táptalajban [Thorne és mtsai, □, Bacteriol. , 91, 1012-1020 (1966)]. A tenyészetet 10 percig centrifugáljuk 4.500 ford/perc mellett Sorvall féle GSA rotorban. A protoplasztokat úgy állíthatjuk elő,hogy a bacillusokat 1 órán át 37 °C-on steril vízben 0,5 mól
···· ·· szacharózt, 0,02 mól MgClg-t és 0,02 mól trisz/maleát-ot tartalmazó 10 ml alkalikus pufferben (AHM = Alkalic Holding Médium; pH = 0,8), melyhez 0,4 mg/ml lizozimet adtunk, in kubáljuk. A protoplasztokat ülepítjük (10 perc; 4.500, ford/perc), 5 ml AHM+ (pH = 8,0) pufferben [az AHM puffer hez 3,5 % suly/térf Penassay levest (Bacto) és 0,04 % albumint (Mérieux) adunk] reszuszpendáljuk, elkeverjük, majd újra ülepítjük, mint fent. Az üledéket 5,0 ml AHM pufferben reszuszpendáljuk, majd a protoplaszt szuszpenzió 0,5 mi ét 5/ug olyan ionmentes vízzel keverjük, amely 1/Ug plaz mid DNS-t tartalmaz. A keveréket 30 % suly/térf polietilén
-glikol (8.000; pH = 8,0) jelenlétében 2 percig inkubáljuk, ezután 1:3 arányban higitjuk AHM+ (pH = 8,0) pufferrel és lecentrifugáljuk. Azjüledéket egy kismennyiségü (1 ml) AHM+ pufferben szuszpendáljuk és 2-3 órán átinkubáljuk. Század mikroliter alikvot mennyiségeket viszünk fel frissen készített regeneráló lemezekre, amelyek 0,5 mól nátrium-szukcinát.HCl-t (pH = 8,0), 1,5 % suly/térf agart, 0,5 % suly/térf Casamino acid készítményt, 0,5 % suly/térf élesztő kivonatot, 0,031 mól foszfát puffért (pH = 8,0),
0,5 % suly/térf glükózt, 0,02 mól MgClg-t és 0,02 % suly/térf albumint (Mérieux) tartalmaznak. Ezek a lemezek
1,000 /Ug/ml neomicint is tartalmaznak a szelekció céljából. A lemezeket legalább 72 órán át inkubáljuk, 37 °C-on, • ·· · ···· majd a telepeket 20/,ug/ml neomicin tartalmú szivlével készített agarlemezekre visszük újból.
6. példa
A ρΜΑΧ-4 integrálása a Bacillus PB92 sejt kro moszómái ába
A Bacillus PB92 egy transzformált sejtjét, amely a pMAX-4 plazmidot tartalmazza, l^ug/ml vagy 20/Ug/ml neomicint tartalmazó Trypton Soya Broth (TSB) táplevesben inkubáljuk 24 órán át 37 °C-on. A sejt.szuszpenzióból ml-es adagokat 1/Ug/ml, illetve 20/Ug/ml neomicint tartalmazó 100 ml TSB-ben higitjuk fel, majd 24 órán át °C-on inkubáljuk a szuszpenziókat. Ezután 24 óra múlva a két tenyészetből 5-5 ml mintát újra felhígítunk úgy, mint fent leírtuk, 24 órán át 50 °C-on inkubáljuk újra
1/Ug/ml, illetve 20/ug/ml neomicin jelenlétében. Ez utóbbi eljárást mégegyszer ismételjük. Ezután a sejt szuszpen ziót százszorosára higitjuk és szivlével készített (HI = Heart Infusion) agarlemezekre szélesztjük. Az l^ug/ml neomicint tartalmazó edényekből vett mintákat 1/Ug/ml neomicint tartalmazó lemezekre, a 20/ug/ml neomicint tartalmazó edényekből vett mintákat 20/Ug/ml neomicin tartalmú lemezekre visszük. A lemezeket 16 órán át inkubáljuk 50 °C-on. Ekkor izoláljuk a neomicin rezisztens telepe két, s ezeket 1/Ug/ml neomicint tartalmazó TSB táptalajban
inkubáljuk 16 órán át 37 °C-on. Ezekből a természetekből izoláljuk az ossz DNS-t [Holmes és mtsai, Anal.Biochem. , 114, 193-197 (1981)]. A plazmid hiányt a DNS elektroforézisével - agaróz gélben - igazoljuk. A plazmid DNS hiányát azokban a mintákban, amelyekben nem volt kimutatható DNS, úgy bizonyítottuk, hogy B.subtilis 1A40 sejteket transzformáltunk ossz DNS_el. Azokat a mintákat, amelyek nem voltak képesek a B.subtilis 1A40 sejteket transzformálni, plazmid menteseknek tekintettük.
Annak vizsgálatára, hogy vájjon hogyan és milyen módon megy végbe a pMAX-4 integrálódása a kromoszómába, kromoszómális DNS-t izoláltunk, HindlII-al emésztettük, 0,5 %-os DNS-agaróz gélben megfuttattuk, nitrocellulózra vittük (Southern, O.Mol. Bioi. 98, 503-517 (1975)1, majd 32P-vel jelzett nick-transzlatált pM58-al hibridizáltunk (Maniatis, 1982). E vizsgálat eredményét a 7A. ábramutatja be.
Az
neomicinnel való szelekció olyan pro teáz géneket eredményezett, amelyek tandem helyzetben épül tek be a kromoszómába és amelyeket plazmid szekvenciák (PBT109) választottak el a homológ rekombináció (Campbell tipusu mechanizmus) eredményeként. Egy olyan csoportban, amely 30 függetlenül izolált integráns sejtből állt, szelekciót végeztünk
Egy olyan integránst )
izoláltunk, amely a pMAX-4 plazmidot a kromoszómájában tandem helyzetben tartalmazta egy szabálytalan rekombináció (PBT122 törzs) eredményeként. A 20/ug/ml neomicinnel végzett szelekció a pMAX-4 plazmid egy másolatának random helyzetű beépülését eredményezte a kromoszómába, amely egy szabálytalan tipusu rekombináció révén jött létre. Ez utóbbi törzset PBT108 névvel jelöltük. A PBT109 és 108 törzsek genetikai szerkezetét a 7B, illetve 7C ábra mutatja be. A kromoszóma analízis kimutatta, hogy a PBT122-ben és a PBTlO8-ban a kromoszómába való integráció különböző helyeken történt.
7. ábra
A megkettőzött proteáz gének stabilitása a PBT108 és PBT109 törzsben
A termelő táptalajból (összetétel: 1 % keményítő, 4 % laktóz, 0,87 % K2HP04’ 0,5 % élesztő kivonat, 0,5 % (NH4)2HP04, 0,2 % trinátrium-citrát.2H20, 0,05 % MgS04.7H20, 0,07 % CaCl2, 0.068 % FeS047H20 és 1 ml/1 habzásgátló)
100 ml-t - neomicin nélkül - beoltunk a PBT108 vagy a PBT109 törzs egy éjszakás (37 °C) TSB tenyészetével. E tenyészeteket 500 ml-es rázott edényekben készítjük. Az inkubálást 44 órán át 37 °C-on, állandó levegőztetés mellett végezzük, majd a tenyészetet neomicin rezisztens telepekre és proteáz aktivitás szempontjából teszteljük.
• ···
- 43 Mind a PBT108, miid a PBT109 törzset Eschweiler fermentorban - a fermentorok 10 liter fenti termelő táptalajt tartalmaztak - a 10 literre való térfogat növelés hatása szempontjából vizsgáltuk. A fermentációs kísérletek eredményét az 1, táblázatban foglaljuk össze.
1. táblázat
Törzs Relatív proteáz Neomicin rezisztens
termelés+ sejtek a fermentácic után százalékban
Kontroll (PB92) 100 %
PBT108 120 % 100 %
PBT109 115-120 % 75-97 %
+A proteáz aktivitás vizsgálatához dimetil-kazeint használtunk szubszt^rátum gyanánt, Lin és mtsai módszere szerint [3. Bioi. Chem., 244, 789-793 (1969)].
A PBT109 törzs Eschweiler fermentációjából származó telepek - 2 napon át tartó tenyésztés után - analízise azt mutatta .hogy törzs szinten a telepek 3-25 %-a csak egyetlen proteáz gént tartalmazott. Ugyanezek a telepek neomicin érzékenyeknek bizonyultak, ami a pMAX-4 szekvencia kihasadásának tudható be, a homológ rekombináció
- 44 következtében. A PBT108 törzzsel végzett fermentációs kísérletből származó telepek analízise azonban azt mutatta, hogy ezek a sejtek mind neomicin rezisztensek voltak.
Száz ilyen neomicin rezisztens telepet vettünk ki találomra, ezeket egyedileg teszteltük proteáz termelő képességükre, hogy meghatározzuk, vájjon egy vagy két produktív proteáz gént tartalmaznak. Mind a 100 egyedileg vizsgált telep törzs szinten két gént tartalmazott, ami azt jelenti, hogy a PBTlO8-ban a két találomra integrálódott proteáz gén stabilan fennmaradt az alkalmazott fermentációs feltételek mellett.
8. példa
A pElatB integrációs vektor szerkesztése
Az EP-A-0134048 számú európai szabadalmi bejelentésben szereplő pGB34 nevű plazmidot a Bell, BglI és BglII restrikciós enzimekkel emésztjük. A restrikciós fragmentumokat tompa végűvé alakítjuk Klenow polimerázzal, majd a pE194-neo plezmid Hpal helyére ligáljuk (lásd a 6. példát). A pE194-neo plazmid DNS-t Bimbóim és Doly módszere szerint [Nucl.Acids Rés., 7, 1513-1523 (1979)] izoláljuk.
A ligázos keverékkel B.subtilis 1A40 sejteket transzformálunk Spizizen módszere szerint [□. Bacteriol. , 81, 741-746 (1961)], 0,5 - 1/Ug DNS-t használva 1 ml kompetens sejthez. A transzformációs keverék sejtjeit minimál ···· • ···
lemezekre szélesztjük, A minimál lemezek össstétele a következő: 2,8 % K2HP04, 1,2 % KH2P04, 0,4 % (NH4)2S04, 0,2 % trinátrium-citrát. 2H20, 0,04 % MgS04.7H20,
0,00005 % MnS04.4H20, 0,4 % glutaminsav, 0,5 % glükóz,
metionin, 20/ug/ml lizin, 20/Ug/ml neomicin, 0,4 % kazein,
0,5 % keményítő és 1,5 % agar.
Az alfa-amiláz termelő telepek DNS-ét Bimbóim és Doly módszerével izoláljuk, s restrikciós enzimekkel vizsgáljuk. Ezen transzformált sejtek egyikéből izoláltuk a pElatB plazmidot (lásd a 8. ábrát).
9. példa
Az alfa-amiláz negatív Bacillus licheniformis .
T9 törzs transzformálása a pElatB-vel
A Bacillus licehniformis T9 törzs transzformálása az EP-A-0253455 számú európai szabadalmi bejelentésben közreadott módszer szerint történt, azzal a különbséggel, hogy az egész eljárást 37 °C helyett 30 °C-on végeztük. A transzformált neomicin tartalmú minimál törzsek szelekcióját 20/ug/ml lemezeken végeztük. Minden transz formált sejt termelt amilázt. A DNS restrikciós enzimes analízise - Bimbóim és Doly módszerével - azt mutatta, hogy minden transzformált sejt tartalmazta a pElatB plazmidot.
···· ·· ·· • · · · • · · ··· • ·
10. példa
A pElatB integrációja a B.licheniformis T9 kromo szómájába
A pElatB plazmidot tartalmazó Bacillus lichenifor-
Soya Broth (TSB) táptalajba és 16 órán át 30 °C-on inkubáljuk. A sejt szuszpenzióból kivett 5 ml-t 100 ml ugyanezen táptalajjal hígítjuk fel és 24 órán át 50 °C-on inkubáljuk.
Ezt az eljárást mégegyszer megismételjük. A sejt
neomicint tartalmazó szivlével készített agarlemezre szélesztjük. A lemezeket 50 °C-on 40 óra hcsszat inkubáljuk, a neomi cin rezisztens telepeket izoláljuk ép ezeket lO,ug/ml neo micint tartalmazó 10 ml TSB táptalajban tenyésztjük 16 órán át 30 °C-on. A tenyészetekből az össz-DNS-t izoláljuk EHolmes és mtsai, Anal. Biochem, , 114, 193-197 (1981 )1. A
DNS agaróz gél elektroforézisével igazoljuk, hogy a sejtekből hiányzik-e a plazmid. Azokban a mintákban, amelyekben láthatóan nincs alacsony molekulasulyu DNS, azokat újra vizsgáljuk plazmid DNS jelenlétére oly módon, hogy a DNS-el B.subtilis 1A40 sejteket transzformálunk (Spizizen és mtsai, 1961). Azok a minták, amelyek nem voltak képesek a B.subtilis 1A40 sejteket neomicin rezisztens sejtekké transzformálni, azokat plazmid-hiányosnak tekintettük.
• · ·· • · ··
- 47 Annak vizsgálatára, hogy vájjon a pElatB integrációja végbemegy-e és hogyan, a transzformált sejtekből izoláljuk a kromoszómális DNS-t [Saito-Minwa, Biochem. Biophys.Acta, 72, 619-632 (1963)1, a DNS-t EcoRi-el emésztjük, 0,5 %-os agaróz gélben frakcionáljuk , majd nitrocellulózra visszük [Southern, □.Mól.Bioi., 98, 503-517 (1975)] és ^^P-vel jelzett nicktranszlatált pGB33-al (lásd az EP-A-0134048 számú szabadalmi bejelentést) hibridizáljuk. Az analízis eredménye a 9A. ábrán látható. Az adatok azt mutatják, hogy a pElatB szabálytalan rekombinációja ment végbe, melynek eredményeképpen a kapott törzs egyetlen amiláz gén tartalmaz a genom különböző helyén, hasonlóan, az eredeti Bacillus licheniformis T5 amiláz törzshöz. A kapott pElatB plazmidot tartalmazó törzset TB13-nal< neveztük el.
11. példa
Az endogén kromoszómális szekvenciák által elválasztott két amiláz gént tartalmazó T13F törzs szerkesztése
Abból a célból, hogy kifejlesszünk két olyan amiláz gént tartalmazó törzset, amelyeket endogén kromoszómális DNS szekvenciák választanak el egymástól, fúziós kísérletet végeztünk a Bacillus licheniformis T5 (az eredeti amiláz gént tartalmazó amiláz törzs; lásd az EP-A-0134048 számú európai szabadalmi bejelentést) és a TB13 törzzsel (random integráció révén amiláz gént tartalmazó törzs). A protoplaszt fúziót az EP-A-0134048 számú európai szabadalmi bejelentésben leírtak (e bejelentést a jelen találmány referenciaként tartalmazza) szerint végeztük.
A TB13 sejteket a protoplaszt képződés előtt jód-acetamiddal elöltük. A T5 sejteket (neomicin érzékeny) nem öltük el.
A fuzionált sejtek szelekciója lO^ug/ml neomicint tartalmazó regeneráló lemezeken történt.
A fuzionált sejtek vizsgálata és azonosítása céljából a kromoszómális DNS-t izoláltuk, EcoRI-el emésztettük, majd a frakcionálást 0,5 %-os agaróz gélben végezzük. A frakciókat nitrocellulóz szörőlemezre cseppentjük [Southern,
4. Mól.Bioi., 98, 503-517 (1975)] és 32P-vel jelzett nick-transzlatált pGB33-al (lásd az EP-A-0134048 számú szabadalmi bejelentést) hibridizáljuk. Az analízis eredménye a 9B. ábrán látható. Az egyik fuzionált sejt, a T13F, két olyan amiláz gént tartalmazott, amelyeket endogén kromoszómális szekvenciák választottak el egymástól,
12. példa
A kettős amiláz gén stabilitása a T390 és T13F törzsben
A T13F törzs - ez a törzs két kromoszómális amiláz gént tartalmaz, amelyeket esszenciális kromoszómális szekvenciák választanak el egymástól - stabilitást összehasonlítottuk a T390 törzs - ebben a törzsben a két kromoszómális amiláz gén tandem elhelyezkedésű - stabilitásával.
• · · · · · · • · · · · ···· ····· · · · · •· · · «8 ·· ··
- 49 A Τ390 törzs előállítását az Ep-A-0134048 számú európai szabadalmi bejelentést tartalmazza (17. oldal, I. tábz lázat), melyben, mint Bacillus licheniformis T5 (pGB33) szerepelt. A T13F és T390 törzset fermentációs körülmények között vizsgáltuk, azaz egy éjszakán TSB tenyészetből (37 °C) 0,2 ml-t oltottunk be 500 ml-es rázott lombikokba, amelyek 100 ml termelő táptalajt tartalmaztak (lásd a 7. példát; sterilizálás után a pH-t 6,9-re állítottuk be NaOH-val) neomicin nélkül. A lombikokat 6 napon át 40 °C-on inkubáltuk állandó levegőztetés mellett, majd a tenyészeteket neomicin rezisztens telepekre és amiláz aktivitásra teszteltük. A fermentációs kísérlet eredményét a 2. táblázatban foglaljuk össze.
2. táblázat
Tö rzs Relatív amiláz Neomicin rezisztens sejtek mennyisége fermentáció után %-ban+
T5 100 %
TB13 20 % 100 %
T13F 120 % 100 %
T390 200 % 88 %
Törzsenként több mint ezer telepet vizsgáltunk • · · · · «··· • · · · · · ·· · ·· ·· · ·· ··
- 50 Hogy kizárjuk azt a lehetőséget.miszerint a
T13F törzsből egy amiláz gén úgy hasadna ki, hogy ezzel nem jár együtt a neomicin gén elvesztése, a T13F fermentációból 20 telepet analizáltunk. A 20 találomra kiválasztott telepből izoláltuk a kromoszómális DNS-t, melyet a fent leirt hibridizációs kísérletekkel analizáltunk. A 10. ábrán kilenc ilyen analízis eredményét mutatjuk be. Mindegyik vizsgált törzs két amiláz gént tartalmazott, minthogy kromoszómális DNS-ükben két alfaamiláz gént tartalmazó EcoRI fragmentum jelenléte volt kimutatha tó.
A T13F törzs genetikai stabilitásával ellentétben a T390 törzset fermentálásnál instabilnak találtuk, ami 12 % neomicin szenzitiv telepben nyilvánult meg. Egy ilyen telepet megvizsgáltunk és azt találtuk, hogy csak egy alfa-amiláz gént tartalmazott (10. ábra, 4. sáv). Ez azt jelenti, hogy fermentációs viszonyok között a random integrálódott amiláz gének sokkal stabilabbak, mint a tandem integrálódott gének.
Fenti eredményekből nyilvánvaló, hogy hozzá tudunk jutni olyan prokarióta sejtekhez, amelyekben stabil gén amplifikáció érhető el olyan transzformált sejtek kiválasztása révén, amelyekben a sokszorozandó strukturális gén legalább két másolatának non-tandem integrációja fordul elő. Az integráció homológ rekombinációval vagy szabálytalan rekombinációval meghet végbe.
Minden közelmény és szabadalmi bejelentés, amelyet ez a leirás emlit, figyelembe veszi az ezen találmánnyal kapcsolatos szakterületen jártasak szakértelmét. Minden közlemény és szabadalmi bejelentés itt olyan mértékben szerepel referenciaként, mintha minden egyes közleményt és szabadalmi bejelentést speciálisan és egyedileg volna szükséges referenciaként szerepeltetni.
A már teljes terjedelemben leirt találmányból az átlag szakember számára is kitűnik, hogy számos változtatást és módosítást eszközölhet anélkül, hogy a csatolt igénypontok szellemétől és oltalmi körétől eltérne.

Claims (31)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Transzformált prokarióta gazdasejt azzal jellemezve , hogy kromoszómájában egy DNS szekvenciából legalább két másolatot tartalmaz, hogy ez a DNS szekvencia egy kívánt polipeptidet kódol és az említett másolatokat endogén kromoszómális szekvenciák választják el egymástól.
  2. 2. Transzformált prokarióta gazdasejt, amely egy kívánt polipeptidet kódoló DNS szekvenciából legalább két olyan másolatot tartalmaz, amelyeket az említett gazdasejt genomjában endogén kromoszómális DNS szekvenciák választanak el egymástól azzal jellemezve, hogy a következő módszerrel állítjuk elő;
    egy recipiens gazdasejtet, amely a szóbanforgó
    DNS szekvencia legalább egy másolatát kromoszómájába integrálva tartalmazza, transzformációs feltételek mellett kombinálunk (a) egy olyan DNS szerkezettel, amely az említett DNS szekvencia legalább egy másolatát, legalább egy marker gént és egy hőmérséklet érzékeny replikációs origót tartalmaz, vagy (b) egy olyan donor gazdasejttel, amely tartalmazza az említett DNS szerkezetet;
    kiválasztunk egy olyan transzformált sejtet, amelyben a szóbanforgó DNS szerkezet ezen transzformált sejt kromoszómájába van integrálva;
    izoláljuk a transzformált sejtek közöl azokat a transzformált prokarióta gazdasejteket, amelyek a szóbanforgó DNS szekvencia legalább két másolatát tartalmazzák úgy, hogy ezeket endogén DNS szekvenciák választják el egymástól.
  3. 3. Az 1. vagy 2.igénypont szerinti transzformált prokarióta gazdasejt azzal jellemezve, hogy a prokarióta sejt egy Bacillus törzs.
  4. 4. A 3.igénypont szerinti transzformált prokarióta gazdasejt azzal jellemezve, hogy az említett Bacillus törzs vagy egy alkalofil Bacillus törzs vagy egy Bacillus licheniformis gazda törzs.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti transzformált prokarióta gazdasejt azzal jellemezve, hogy az említett alkalofil Bacillus törzs a Bacillus novo species PB92 vagy ennek egy mutánsa vagy variánsa.
  6. 6. A 4. igénypont szerinti transzformált prokarióta gazdasejt azzal jellemezve, hogy az említett Bacillus licheniformis gazdasejt a Bacillus licheniformis T5 törzs vagy ennek egy mutánsa vagy variánsa.
  7. 7. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti transzformált prokarióta gazdasejt azzaJ^jellemezve, hogy benne a kívánt polipeptid egy enzim.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti transzformált prokarióta gazdasejt azzal jellemezve, hogy az enzim egy proteolitikus
    - 54 enzim vagy egy amilolitikus enzim.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti transzformált prokarióta gazdasejt azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó proteolitikus enzim egy szerin proteáz.
  10. 10. A 9, igénypont szerinti transzformált prokari- óta gazdasejt azzal jellemezve, hogy az illető szerin proteáz aminosav szekvenciája lényegében a következő:
    H2 N-A- Q-S- V- P-W- G-1- S- R- V- Q-A- Ρ-A-A- Η- N- R- G- L-T- G-S- G- V- l<- V-AV-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-NG-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-VK-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-Ls-l-g-s-p-s-p-s-a-t-l-e-o-a-v-n-s-a-t-s-r-g-v-l-v-v-a-a-s-g-nS-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-r-y-a-n-a-m-a-v-g-a-t-d-o-n-n-n-r-a-s-f-sq_.Y_G-A-G-L.-D-I-V-A-P-G-V-N-V-O-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-SM-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-NT-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH.
  11. 11. A 8. igénypont szerinti transzformált prokarióta gazdasejt azzáLjellemezve, hogy az amilolitikus enzim az alfa-amiláz.
  12. 12. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti transzformált prokarióta gazdasejt azzal jellemezve, hogy a Bacillus novo PB92 fajnak vagy mutánsának vagy variánsának a genomja az említett DNS szekvenciát tartalmazza.
    ···· ·· ···· ·· ·· • · · · · · · • · · · · ···· ····· ···· ·· ·· · ·· ··
  13. 13. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti transzformált prokarióta gazdasejt azzal jellemezve, hogy a Bacillus licheniformis T5 törzsnek vagy mutánsának vagy variánsának a genomja az említett DNS szekvenciát tartalmazza.
  14. 14. Módszer transzformált prokarióta gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy e gazdasejt a kívánt polipeptidet kódoló DNS szekvenciának legalább két másolatát tartalmazza, amelyeket az említett gazdasejt genomjában endogén kromoszómális szekvenciák választanak el egymástól, s hogy a módszer a következő lépésekből áll:
    egy recipiens gazdasejt, amely a szóbanforgó DNS szekvencia legalább egy másolatát kromoszómájába integrálva tartalmazza, transzformációs feltételek mellett kombinálunk (a) egy olyan DNS szerkezettel, amely az említett DNS szekvencia legalább egy másolatát, legalább egy marker gént és egy hőmérséklet érzékeny replikációs origót tartalmaz vagy (b) egy olyan donor gazdasejttel, amely az említett DNS szerkezetet tartalmazza;
    kiválasztunk égy olyan transzformált sejtet, amelyben a szóbanforgó DNS szerkezet ezen transzformált sejt kromoszómájába van integrálva;
    izoláljuk a transzformált sejtek közül azokat a transzformált prokarióta gazdasejteket, amelyek az illető
    DNS szekvencia legalább két másolatát tartalmazzák úgy, hogy • · ····· ···· ·· ·· · ·· ··
    - 56 ezeket endogén DNS szekvenciák választják el egymástól.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a kiválasztás a következő lépésekből áll:
    az említett, egy biocid jelenlétében markor gént tartalmazó - a markor gén biztosítja e biociddal szembeni rezisztenciát - DNS szerkezetet magábafoglaló említett transzformált sejtet tenyésztjük és e transzformált sejtek közül azonosítjuk és izoláljuk a plazmid mentes transzformált sejteket.
  16. 16. A 14. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a szelekció a következőkből áll:
    az emlitett transzformált sejtet, amely egy markor gént és egy hőmérséklet érzékeny replikációs kezdőpontot tartalmazó DNS szerkezetet foglal magába, biocid jelenlétében, non-permissziv hőmérsékleten tenyésztjük; és e transzformált sejtek közül szelektáljuk a plazmidmentes transzformált sejteket.
  17. 17. A 14. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy az izolálás a következőkből áll:
    az emlitett transzformált sejtekből izoláljuk a kromoszómális DNS-t; és a szóbanforgó kromoszómális DNS-t egy olyan próba-anyaggal hibridizáljuk, amely az emlitett DNS szerkezetet • ···
    - 57 vagy ennek egy fragmentumát foglalja magába, s a transzformált prokarióta gazdasejt kiválasztása az illető jelzés kimutatásával történik.
  18. 18. A 14. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy ez illető donor gazdasejtet az alábbi módszer szerint állítjuk elő:
    a kívánt polipeptidet kódoló DNS szekvenciát nem tartalmazó DNS szekvenciát fúziós feltételek mellett kombináljuk a szóbanforgó DNS szerkezettel;
    izoláljuk a transzformált sejteket;
    a transzformált sejteket non-permissziv hőmérsékleten tenyésztjük; és azonosítjuk és izoláljuk azokat a transzformált sejteket, amelyekben a DNS szerkezet a kromoszóma egy olyan helyén van beépülve, amely eltér attól a helytőlj ahová a recipiens gazdasejtben van integrálva.
  19. 19. A 14-18. igénypont bármelyike szerinti módszer azzal jellemezve, hogy az említett prokarióta sejt egy Bacillus.
  20. 20. A 19. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a Bacillus egy alkalofil Bacillus törzs vagy egy B. 1icheniformis törzs.
    ··
  21. 21. A 20. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve,hogy az említett alkalofil Bacillus törzs a Bacillus novo species PB92 és az említett B. licheniformis törzs a B. licheniformis T5 törzs.
  22. 22. A 14-21. igénypontok bármelyike szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a kívánt polipeptid egy enzim.
  23. 23. A 22. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy az enzim egy szerin proteáz vagy egy amiláz.
  24. 24. A 23. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy a szerin proteáz nukleotid szekvenciája legalább 70 %-ban homológ egy a Bacillus novo species PB92 törzsből származó proteolitikus enzimet kódoló gén szekvenciával.
  25. 25. A 23. vagy 24. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy az említett szerin proteáz aminosav szekvenciája lényegében a következő:
    HgN-A -Q -S -V-P-W-G-I -S -R-V-Q-A-P-A -A-H-N -R-G-L -T-G-S -G-V-K-V-A v-l-d-t-g-i-s-t-h-p-d-l-n-i-r-g-g-a-s-f-v-p-g-e-p-s-t-q-d-g-nG-H-G-T-H-V-A-G-T~I-A-A-L-N-N-S-I-G-V~L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-Vk-v-l-g-a-s-g-s-g-s-v-s-s-i-a-q-g-l-e-w-a-g-n-n-g-m-h-v-a-n-lS-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-NS-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-Sq-Y_G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-SM-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-NT-A-T-S -L -G-S -T-N~L _Y_G“S “G-L- V -N-A - E -A -A -T -R-COOH.
  26. 26. A 14-25. igénypontok bármelyike szerinti módszer azzal jellemezve, hogy az említett DNS szerkezet a pMAX-4 vagy a pElatB.
  27. 27. A 14-26. igénypontok bármelyike szerinti módszer azzal jellemezve, hogy az említett DNS szekvencia szabálytalan rekombinációval integrálódott.
  28. 28. A 14-26. igénypontok bármelyike szerinti módszer azzal jellemezve,hogy az említett DNS szekvencia homológ rekombinációval integrálódott.
  29. 29. A 14-26. igénypontok bármelyike szerinti módszer azzal jellemezve, hogy az említett DNS szerkezet egy hőmérséklet érzékeny replikációs origót tartalmaz.
  30. 30. A 29. igénypont szerinti módszer azzal jellemezve, hogy az említett hőmérséklet érzékeny plazmid a pEl94 plazmidból származik.
  31. 31. A Bacillus PBT108, PBT122 vagy T13F.
HU881833A 1987-02-27 1988-02-26 Process for producing stable gene amplification in chromosomal dna of procaryote microorganisms HUT50877A (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP87200356 1987-02-27
PCT/NL1988/000006 WO1988006623A1 (en) 1987-02-27 1988-02-26 Stable gene amplification in chromosomal dna of prokaryotic microorganisms

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUT50877A true HUT50877A (en) 1990-03-28

Family

ID=8197582

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU881833A HUT50877A (en) 1987-02-27 1988-02-26 Process for producing stable gene amplification in chromosomal dna of procaryote microorganisms

Country Status (20)

Country Link
US (2) US5733723A (hu)
EP (1) EP0284126B1 (hu)
JP (1) JP2637532B2 (hu)
KR (1) KR970000188B1 (hu)
CN (1) CN1049247C (hu)
AU (1) AU620326B2 (hu)
BG (1) BG60920B2 (hu)
BR (1) BR8805646A (hu)
CA (1) CA1327175C (hu)
DE (1) DE3883041T2 (hu)
ES (1) ES2045081T3 (hu)
FI (1) FI104326B1 (hu)
HU (1) HUT50877A (hu)
IE (1) IE61743B1 (hu)
LT (1) LT4001B (hu)
LV (1) LV10791B (hu)
NO (1) NO300382B1 (hu)
PT (1) PT86863B (hu)
RU (1) RU2091487C1 (hu)
WO (1) WO1988006623A1 (hu)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU620326B2 (en) * 1987-02-27 1992-02-20 Dsm Ip Assets B.V. Stable gene amplification in chromosomal dna of prokaryotic microorganisms
ES2135386T3 (es) * 1987-02-27 1999-11-01 Genencor Int Transformacion de cepas de bacillus alcalofilas.
US4914031A (en) * 1987-04-10 1990-04-03 Amgen, Inc. Subtilisin analogs
US6287841B1 (en) 1988-02-11 2001-09-11 Genencor International, Inc. High alkaline serine protease
DE69028890T2 (de) * 1989-08-11 1997-02-27 Gist Brocades Nv Ergiebige Herstellung von Protease-Mutanten
US5695976A (en) * 1989-12-18 1997-12-09 Novo Nordisk A/S Stable integration of DNA in bacterial genomes
JP3046344B2 (ja) * 1990-10-24 2000-05-29 塩野義製薬株式会社 新規プロテアーゼ
EP0672154A1 (en) * 1991-11-14 1995-09-20 Novo Nordisk A/S A PROCESS FOR EXPRESSING GENES IN $i(BACILLUS LICHENIFORMIS)
DE4216246A1 (de) * 1992-05-16 1993-11-18 Solvay Enzymes Gmbh & Co Kg Einfaches Verfahren zur stabilen chromosomalen Genamplifikation
US5395763A (en) * 1992-06-24 1995-03-07 Monsanto Company Chromosomal expression vector
DK153992D0 (da) * 1992-12-22 1992-12-22 Novo Nordisk As Metode
US5861273A (en) * 1993-12-21 1999-01-19 Celtrix Phamraceuticals, Inc. Chromosomal expression of heterologous genes in bacterial cells
US6723550B1 (en) 1997-07-15 2004-04-20 Genencor International, Inc. Proteases from gram-positive organisms
GB9724627D0 (en) 1997-11-20 1998-01-21 Genencor Int Bv Gram positive microorganism formate pathway
US6528255B1 (en) 1997-12-30 2003-03-04 Genencor International, Inc. Proteases from gram positive organisms
US6599731B1 (en) 1997-12-30 2003-07-29 Genencor International, Inc. Proteases from gram positive organisms
GB9727470D0 (en) 1997-12-30 1998-02-25 Genencor Int Bv Proteases from gram positive organisms
US6465186B1 (en) 1997-12-30 2002-10-15 Genecor International, Inc. Proteases from gram positive organisms
US6100063A (en) * 1998-02-12 2000-08-08 Novo Nordisk A/S Procaryotic cell comprising at least two copies of a gene
AU2610399A (en) * 1998-02-12 1999-08-30 Novo Nordisk A/S A prokaryotic cell comprising two copies of a gene transcribed in different directions
US6156514A (en) * 1998-12-03 2000-12-05 Sunol Molecular Corporation Methods for making recombinant cells
US6544792B1 (en) 1999-12-21 2003-04-08 Genencor International, Inc. Production of secreted polypeptides
WO2002000907A1 (en) * 2000-06-23 2002-01-03 Novozymes A/S Method for stable chromosomal multi-copy integration of genes
CA2546451A1 (en) 2003-11-19 2005-06-09 Genencor International, Inc. Serine proteases, nucleic acids encoding serine enzymes and vectors and host cells incorporating same
US7985569B2 (en) 2003-11-19 2011-07-26 Danisco Us Inc. Cellulomonas 69B4 serine protease variants
US20050227356A1 (en) * 2004-04-07 2005-10-13 Lessard Philip A Novel compositions and methods for genetic manipulation of Rhodococcus bacteria
US7842479B2 (en) * 2004-05-21 2010-11-30 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Methods for altering acetic acid production and enhancing cell death in bacteria
US20080044853A1 (en) * 2004-06-21 2008-02-21 Novozymes A/S Stably Maintained Multiple Copies of at Least Two Orf in the Same Orientation
US20080085535A1 (en) 2004-10-22 2008-04-10 Novozymes A/S Stable Genomic Integration of Multiple Polynucleotide Copies
DE102007021001A1 (de) 2007-05-04 2008-11-06 Ab Enzymes Gmbh Expressionssystem zur antibiotikafreien Produktion von Polypeptiden
CN103290048B (zh) * 2013-06-27 2015-07-15 天津科技大学 一种适用于芽孢杆菌属同源重组的质粒及工程菌
JP6828038B2 (ja) 2015-12-11 2021-02-10 ワッカー ケミー アクチエンゲゼルシャフトＷａｃｋｅｒ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ 低分子量物質およびタンパク質の抗生物質を含まない発酵製造のための微生物株および方法
CN114032189B (zh) * 2021-05-10 2024-02-06 盐城师范学院 一种降解木质素的融合子菌株r3及其应用

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US30602A (en) * 1860-11-06 Improvement in revolver fire-arms
GB1519148A (en) * 1974-11-19 1978-07-26 Gist Brocades Nv Compositions of matter
NO159863C (no) * 1980-01-07 1989-02-15 Univ Rochester Fremgangsm te for fremstilling og seleksjon av en rant bakteriofag som inneholder et genetisk fragment og koder for alfa-amylase, egnet for bruk i heterolog transformering av en bacillus-verts-mikroorganisme.
IL61982A (en) * 1980-02-15 1984-01-31 Cpc International Inc Genetically engineered microorganisms for massive production of amyloytic enzymes and process for preparing same using the corresponding recombinant dnas containing amylase coding genes
EP0074553A3 (en) * 1981-09-11 1985-01-09 The University Of Rochester Method of increasing the yield of a product by altering a microorganism
US4617266A (en) * 1983-04-28 1986-10-14 Genex Corporation Production of Protein A
JPS59205983A (ja) * 1983-04-28 1984-11-21 ジエネツクス・コ−ポレイシヨン 異種遺伝子を原核微生物で発現させる方法
NZ208612A (en) * 1983-06-24 1991-09-25 Genentech Inc Method of producing "procaryotic carbonyl hydrolases" containing predetermined, site specific mutations
GR82200B (hu) * 1983-07-06 1984-12-13 Gist Brocades Nv
FR2563533B1 (fr) * 1984-04-27 1986-08-22 Centre Nat Rech Scient Procede d'amplification de l'expression d'un gene determine chez bacillus subtilis et souches obtenues
US4828994A (en) * 1984-09-21 1989-05-09 Genex Corporation Bacillus strains with reduced extracellular protease levels
FR2582316B1 (fr) * 1985-05-22 1988-12-02 Centre Nat Rech Scient Vecteurs d'expression de l'a-amylase dans bacillus subtilis, souches obtenues et procede de preparation d'a-amylase
EP0254735B2 (en) * 1986-01-15 1998-06-17 Amgen Inc. METHOD FOR PRODUCTION OF THERMALLY STABLE AND pH STABLE SUBTILISIN ANALOGS
AU620326B2 (en) * 1987-02-27 1992-02-20 Dsm Ip Assets B.V. Stable gene amplification in chromosomal dna of prokaryotic microorganisms

Also Published As

Publication number Publication date
PT86863A (pt) 1988-03-01
CN1030787A (zh) 1989-02-01
FI104326B (fi) 1999-12-31
LTIP1826A (en) 1995-08-25
AU1398188A (en) 1988-09-26
NO884422D0 (no) 1988-10-05
LV10791B (en) 1995-12-20
RU2091487C1 (ru) 1997-09-27
US6124097A (en) 2000-09-26
DE3883041D1 (de) 1993-09-16
KR970000188B1 (en) 1997-01-06
FI884903A0 (fi) 1988-10-24
AU620326B2 (en) 1992-02-20
FI104326B1 (fi) 1999-12-31
US5733723A (en) 1998-03-31
KR890700664A (ko) 1989-04-26
JP2637532B2 (ja) 1997-08-06
EP0284126B1 (en) 1993-08-11
PT86863B (pt) 1992-05-29
IE880558L (en) 1988-08-27
IE61743B1 (en) 1994-11-30
CA1327175C (en) 1994-02-22
EP0284126A1 (en) 1988-09-28
BR8805646A (pt) 1989-10-17
DE3883041T2 (de) 1994-01-20
WO1988006623A1 (en) 1988-09-07
ES2045081T3 (es) 1994-01-16
BG60920B2 (bg) 1996-06-28
FI884903A (fi) 1988-10-24
CN1049247C (zh) 2000-02-09
NO884422L (no) 1988-10-05
JPH01502398A (ja) 1989-08-24
NO300382B1 (no) 1997-05-20
LT4001B (en) 1996-06-25
LV10791A (lv) 1995-08-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT50877A (en) Process for producing stable gene amplification in chromosomal dna of procaryote microorganisms
US5217878A (en) Molecular cloning and expression of genes encoding proteolytic enzymes
EP0479396B1 (en) Transformation of alkalophilic bacillus strains
FI85287C (fi) Molekulaer kloning och expression i industriella mikro-organismarter.
US5843720A (en) Introduction of DNA into bacillus strains by conjugation
US5716807A (en) Transformed industrial bacillus strains and methods for making and using them
US5238833A (en) Molecular cloning and expression in industrial Bacillus species
RU2060276C1 (ru) Способ получения алкалофильного штамма бацилл с пониженным уровнем внеклеточной щелочной протеазы, способ получения высокощелочной протеазы и мутантная форма высокощелочной протеазы
US5387521A (en) Gene expression in bacilli
JPH11514527A (ja) バキルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）用の陽性選択ベクター
EP0900271B1 (en) Bacterial donor cell useful in conjugation
US5763187A (en) Bacterial donor cell useful in conjugation

Legal Events

Date Code Title Description
DFA9 Temporary protection cancelled due to abandonment