FI85876B

FI85876B - Foerfarande foer stabilisering av plasmider i bakterier under kultivering.

Info

Publication number: FI85876B
Application number: FI854893A
Authority: FI
Inventors: Boerge Krag Diderichsen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1984-12-12
Filing date: 1985-12-11
Publication date: 1992-02-28
Also published as: NO172063B; FI854893A; ATE55413T1; EP0185512B1; DK594084A; CA1292197C; FI854893A0; EP0185512A1; JPS61139392A; JPH0686669A; AU5108185A; US4920048A; JP2576970B2; JP2571338B2; FI85876C; DE3579133D1; DK594084D0; NO854966L; AU592542B2; NO172063C

Description

1 85876

Menetelmä plasmidien stabiloimiseksi bakteereissa viljelyn aikana Tämä keksintö liittyy uuteen menetelmään plasmidien stabiloimiseksi bakteereissa viljelyn aikana ilman tarvetta lisätä antibiootteja tai muita ei-toivottuja komponentteja kasvualustaan tarkoituksena lisätä saantoa tai fermentaatiotuotteiden laatua.

Mikro-organismeja suojelevat kromosomien ulkopuoliset geneettiset elementit, esimerkiksi plasmidit, ovat, yleisesti puhuen, pysymättömiä siinä merkityksessä, että elementit saattavat usein hävitä palautumattomasti. Tämä palautumattomuus on erityisen ilmeinen, jos plamidi ei ole syntyjään isäntämikro-organismista, esimerkiksi, koska se sisältää muiden organismien geenejä tai se on rakennettu geenijatkostuksella.

Jotta plasmidin stabiilisuus lisääntyisi, antibioottia tai muuta bioaktiivista yhdistettä, johon plasmidi, mutta ei kromosomi, antaa vastustuskyvyn, lisätään tavallisesti elatusainee-seen, jota käytetään mikro-organismin viljelyssä. Tällaisessa elatusaineessa ainoastaan sellaiset solut lisääntyvät nopeasti, jotka pitävät sisällään plasmidin, jolla on antibioottiin vastustuskykyinen geeni. Tämän lähestymistavan suurimmat haitat ovat siinä, että se vaatii laajan kantakokoelman antibiooteille resistantteja mikro-organismeja, lisäksi kalliita antibiootteja kasvualustaan mahdollisine haitallisine vaikutuksineen ympäristöön ja edelleen laajana puhdistuksena poistamaan antibiootti halutusta tuotteesta.

Isäntäkromosomin auksotrofisen mutaation komplementointi on . ‘ toinen tunnettu menetelmä plasmidien stabilisoimiseksi. Tämä lähestyrnistäpä kuitenkin rajoittaa huomattavasti kasvu-alustan koostumusta, ja vaatii viljelyä kasvualustalla, joka ei sisällä isäntämikro-organismin tarvitsemaa ravintoainetta, ja täten rajoittaen optioita, jotka ovat käyttökelpoisia tuottavuuden parantamisessa.

2 85876 Tämän keksinnön tarkoituksena on antaa käyttöön menetelmä plasmidien stabiloimiseksi transformoiduissa bakteereissa ilman, että tarvitsee käyttää antibiootteja ja ilman huomattavia rajoituksia kasvualustan koostumuksessa.

Tämän keksinnön toisena tarkoituksena on antaa käyttöön plasmideja ja transformoituja bakteereita, jotka sisältävät tällaisia stabilisoituja plasmideja.

Edelleen tämän keksinnön tarkoituksena on antaa käyttöön menetelmä haluttujen tuotteiden tuottamiseksi transformoidulla bakteerilla ilman, että tarvitsee käyttää antibiootteja tai erityisiä rajoituksia kasvualustan koostumuksessa.

Keksinnön muut tarkoitukset selviävät alan asiantuntijoille. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa .

Keksintö pohjautuu havaintoon, jossa plasmideja voidaan pitää isäntäbakteerissa viljelyn aikana tavallisessa elatusai-neessa, jos plasmidit suojelevat tiettyä funktiota, joka määrätyissä olosuhteissa vaaditaan isännän normaaliin kasvuun.

Kun mutantin isäntäbakteeria transformoidaan, deleetio tai muu puute toimintaa koodaavassa geenissä, joka annetuissa olosuhteissa vaaditaan isännän normaaliin kasvuun, esim. plasmidin suojellessa tätä toimintaa koodaavaa geeniä, ainoastaan solut, jotka transformoituvat ja säilyttävät plasmidin, jäävät henkiin, koska ainoastaan tällaisissa soluissa isäntäsolujen vaatimus on lisätty plasmidilla. Kuitenkin plasmidin pysyvä säilyminen on ainoastaan varma, jos geneet-* tisen tiedon siirtymistä plasmidista kromosomiin ei voi ta pahtua, ja isäntäbakteereiden spontaani mutaationopeus mu-tantiksi, jolla ei ole sellaista vaatimusta, on mitätön.

Tämän keksinnön näkökohdan mukaan kyseessä on menetelmä 3 85876 plasmidien stabiloimiseksi bakteereissa viljelyn aikana, mainittu menetelmä sisältää: otetaan plasmidi, joka sisältää rakenteellista tai toiminnallista komponenttia koodaavan DNA-jakson, joka tarvitaan synteeseihin tai ylläpitämään solukuorta; ja transformoidaan isäntäbakteeri, jolta puuttuu kromosomaalisessa geenissä tämä rakenteellinen tai toiminnallinen komponentti, jolla on mainitun DNA-jakson sisältämä plasmidi; jonka avulla isäntäbakteerin kromosomin geenivajauksen aiheuttama tarve poistetaan plasmidille ja plasmidin menetys viljelyn aikana on merkityksetön.

Sen lisäksi menetelmä sisältää isäntäbakteerin rakenteen, josta spontaanin mutaation aiheuttama kromosomaalinen puutteellisuuden deleetio on mitätön, ja plasmidin rakenne, josta DNA-jaksoa lisättynä isäntäbakteerin kromosomivajaavai-suuteen ei voida siirtää isäntäkromosomiin erikseen lopusta plasmidia.

Plasmidin sijasta voidaan käyttää myös bakteriofageja tai muuta geneettistä materiaalia, joka ei ole normaalisti läsnä isäntäbakteerissa eikä itsenäisinä molekyyleinä tai yhdistettynä kromosomiin. Etusijalle asetettuja kromosomin ulkopuolisia elementtejä ovat plasmidit, vaikka bakteriofagien ja muiden vektorisysteemien käyttäminen tai DNA:n integroituminen kromosomiin saattaa kuvata tätä keksintöä alan asiantuntijoille.

Tämän keksinnön lisänäkökohdan mukaan kyseessä on transformoitu bakteeri, jolla on vajavaisuutta kromosomigeenissä, jota tarvitaan synteeseihin tai solukuoren säilymiseen ja plasmidien suojelemiseen, joka pystyy poistamaan tarpeen, jonka aiheuttaa isäntäbakteerin kromosomivajaus.

Lisäksi tämä keksintö käsittää menetelmän haluttujen tuotteiden (se on DNA, RNA, peptidit ja proteiinit) tuottamiseksi transformoidussa bakteerissa, joka sisältää: yhdistetyn plasmidin, joka sisältää i) rakenteellista tai toiminnallista komponenttia koodaavan DNA-jakson, jota tar- 4 85876 vitaan synteeseihin tai säilyttämään solukuorta ja ii) geenin mainitun halutun tuotteen koodaamiseksi; transformoitavan sopivan isäntäbakteerin, jolla on kromosomigeenissä vajausta mainitun rakenteellisen tai toiminnallisen komponentin suhteen mainitun yhdistetyn plasmidin kanssa; transformoidun bakteerin viljelemisen sopivalla ravintokas-vualustalla; ja halutun tuotteen talteenottaminen viljely-alustalta.

Tämä keksintö sisältää myös menetelmän halutun tuotteen valmistamiseksi transformoidussa bakteerissa, joka menetelmä sisältää: sopivassa ravintoalustassa viljeltävän bakteerin, jolla on vajausta kromosomigeenissä, jota tarvitaan synteeseissä tai solukuoren säilyttämisessä, mainittu bakteeri sisältää yhdistetyn plasmidin, joka pystyy poistamaan isän-täbakteerin kromosomivajauksen aiheuttaman tarpeen, mainittu yhdistetty plasmidi voi sisältää myös mainittua haluttua tuotetta koodaavan DNA-jakson; ja ottaa talteen halutun tuotteen viljelyalustalta.

Sopivia isäntäbakteereja ovat bakteerit, jotka kuuluvat Bacillus- tai Enterobacteriaceae-lajiin, esim. Bacillus subti-lis ja Escherichia coli, vaikka muiden sopivien bakteereiden käyttö saattaa olla ilmeinen alan asiantuntijoille.

Esityksessä käytetään seuraavia termejä: dal-geeni: geeni D,L-alaniinin rasemaatille.

dal*-geeni: toiminnallinen geeni (villi tyyppi) D,L- alaniinin rasemaatille.

dal-l-geeni: mutanttigeeni D,L-alaniinin rasemaatissa geeni aiheuttaa tavallisesti vaatimuksen ulkoisesta D-alaniinista: dal'-isäntä: mutantti-isäntä dal-geenissä (tässä vaadi taan normaalisti ulkoisen D-alaniinin lisäys kasvua varten).

dal*-isäntä: isäntä, jolla on villin tyyppinen dal-geeni.

Dal*-isäntä: isäntä, jolla ei ole vaatimusta ulkoiselle D-alaniinille.

Dal'-isäntä: isäntä, jolla on vaatimus ulkoiselle D- alaniinille.

5 85876

Cam : klooriamfenikoliresistanssi.

Kan : kanamysiiniresistanssi.

£

Amp : ampisilliiniresistanssi.

bla: geeni 3-laktamaasille, joka aiheuttaa Amp :n.

cat: geeni klooriamfenikoliasetyylitransferaasille aiheut taen Carn :n.

amyM: geeni maltogeeniselle amylaasille.

Useimmille bakteereille kyky kasvaa ja jakautua riippuu hyvin pysyvästä solukuoresta (se on solumembraanit, soluseinät ja vastaavat rakenteet). Kuoren rikkoontuminen tai hajoaminen johtaa tavallisesti solukuolemaan tai kasvun loppumiseen.

Yksi välttämättömän tarpeellisista komponenteista kestävälle solukuorelle Bacillus subtiliksella ja muilla bakteereilla on D-alaniini. D-alaniini on oleellinen osa soluseinämää, jolle se antaa ristisidoksellisia polysakkaridikotjuja täten antaen solulle tarvittavaa jäykkyyttä. D-alaniinia ei ole useimmissa tavanomaisissa kasvualustoissa, ja tavallisesti monet bakteerit, mukaan luettuna B. subtilis ja E. coli, syntetisoivat tätä aminohappoa L-alaniinista D,L-alaniinirasemaattientsyymillä ja eivätkä tarvitse ulkopuolista D-alaniinilähdettä kasvuun. Jotkut mutantit tarvitsevat ulkopuolisen D-alaniinilisäyksen kasvua varten, esimerkiksi B. subtiliksen dal-l-mutantit, joissa D,L-alaniini-"*: rasemaattigeeni on tuhoutunut mutaatiossa (Freese et ai., Proc.

• ' · Natl. Acad. Sei. 51:1164 - 72, 1964 , Dul et ai., J. Bacteriol.

15:1212-14, 1973). Toiset mutantit saattavat tarvita ulkopuolisen lisäyksen muita metaboliitteja solukuoren ylläpitämiseen, kuten esimerkiksi diaminopimeliinihappo, D-glutamiinihappo ja N-asetyyliglukoosiamiini.

Tämän keksinnön mukaan on osoitettu, että D,L-alaniinirasemaa-tin toiminnallista geeniä suojelevat plasmidit pysyvät varmas-. · ti dal -isännässä, jos dal+-geeniä ei voida siirtää plasmidista —: kromosomiin, ja isännän spontaani mutaatiofrekvenssi Dal+-feno- ... tyypiksi on merkityksetön, ja jos ulkopuolista D-alaniinia ei h ole saatavissa solussa.

6 85876 Täten liittämällä geeni haluttuun tuotteeseen sopivalla dal+-plasmidilla ja viljelemällä plasmidia sopivassa dal -isännässä, dal+-plasmidi säilyy suolukasvustossa varmistaen halutun tuotteen korkeita saantoja, jotka saadaan plasmidin itsenäisen rep-likaation aikana. Koska D-alaniinia ei esiinny monissa tavanomaisissa kasvualustoissa, ei tarvita enää lisärajoituksia tällä elatusaineella.

Sen mukaisesti tämä keksintö kuvaa tarkoituksenmukaista menetelmää plasmidien stabiloimiseksi, jotka sisältävät haluttuja tuotteita varten geenejä viljelyn aikana.

Jotta varmistetaan, että isännän spontaani mutaationopeus Dal+-fenotyypiksi on merkityksetön, saattaa olla tarpeellista poistaa osa dal-geenistä.

Kuitenkin, yhdistämällä sellainen isäntä, joka sisältää poistetun osan dal-geeniä, joka tarvitaan Dal+-fenotyypin ilmenemiseen dal+-plasmidin kanssa, joka suojaa kokonaista dal+-geeniä ja osia, jotka ovat homologisia DNA:n kanssa, jotka sivuavat poistetun kromosomin molempia sivuja, dal+-vastageenin siirtyminen plasmidista kromosomiin saattaa tapahtua homologisella risteytyksellä. Jotta vältettäisiin tällainen homologinen risteytys, isäntä rakennettiin siten, että dal-poisto laajennettiin ·_ ·' segmentteihin sivuten kromosomin dal-geeniä. Myös plasmidi raken-’·' ' nettiin siten, että se suojelee toiminnallista dal + -geeniä, mutta ei DNA:ta, joka on homologinen DNA:lle, joka sivuaa molem-miltä puolin poistettua kromosomia. Yhdistämällä tämä viimeksi j mainittu plasmidi edellä mainitun dal -isännän kanssa muodostuu : : : esitetty isäntä-vektoripari.

....: Vaihtoehtoisesti, dal + -vastageenin siirto voidaan estää joko käyttämällä rekombinoitua, heikennettyä isän- .· . tää tai käyttämällä kromosomien ulkopuolista dal + -geeniä joko » * · ** ei ollenkaan tai vähäisen isäntäbakteerin kromosomin DNA-ho- mologin kanssa.

7 85876

Ensisijaisesti dal+-geeni on johdettu B. subtilis-kannasta, kuten on selitetty jatkossa tarkemmassa yksityiskohdassa. dal+-geenin lisäksi plasmidin pitäisi myös sisältää osa plasmidin kopiointiin, esimerkiksi kopiointitoiminnat paljon kopioivasta plasmidi pUB110:sta kopiointiin Bacillaessa tai muissa gram-positiivisissa bakteereissa tai pBR322:n kopiotoiminta Entero-bacteriacaessa tai muissa gram-negatiivisissa bakteereissa kopiointiin .

Tämän keksinnön mukaan halutun tuotteen tuottaminen on esitetty tuottamalla maltogeenista amylaasia Bacillus-kannasta (NCIB 11837) nopeutettuna sen omalla promoottorilla. Muita esimerkkejä halutuista tuotteista, joita voidaan tuottaa tämän keksinnön mukaan, ovat toisentyyppiset amylaasit, amyloglykosidaasit, pul-lulanaasit, proceinaasit, lipaasit, hormonit ja muut ensyymit tai eukaroyyttiset proteiinit ja peptidit.

Keksintöä kuvataan edelleen oheisten, viitteenä olevien kuvioiden mukaan, joissa kuvio 1 esittää plasmidien pDN691, pDN770, pDN820 ja pDNl050 rakennetta, kuvio 2 esittää pDN1122:n rakennetta, kuvio 3 esittää plasmidien pDN1090, pDN1120, pDNl222 ja pDN1277 rakennetta rajoittavien entsyymiosien kartan pDN1000:ssa, * · : kuvio 4 esittää plasmidien pDNH30 ja pDNl290 rakennetta, : kuvio 5 esittää plasmidin pDN1274 rakennetta, ja kuvio 6 esittää plasmidin pDN1800 rakennetta.

- · Keksinnön menetelmä sallii transformoidun bakteerin viljelyn antiobiooteista vapaassa elatusaineessa. Olisi kuitenkin ymmär-' ‘ rettävä, että se ei ole ehto keksinnön toteuttamiselle, ainoastaan seuraus siitä. Jos on käytännöllistä tai hyödyllistä vil-jellä keksinnön mukaista transformoitua bakteeria antibiootin (antibioottien) kanssa, näin voidaan totta kai tehdä.

dal + -geeni saatiin DN497 :stä, Bacillus subtilis 168-kannan johdannaisesta (Spizizen, Proc. Natl. Acad. Sei. 44, 1072-78, 1958). Kromosomaalinen DNA eristettiin täysin sopivilla restrik- 8 85876 tioentsyymeillä ja sidottiin plasmidin pDN691 kanssa, joka antoi vastustuskyvyn klooriamfenikolia ja kanamysiiniä vastaan, ja kopiointikyvyn B. subtiliksessa: sidottu DNA siirrettiin D-alaniinia vaativaan B. subtilis dal-l:seen valikoiden D-ala- niinin vaatimuksen lisäystä. Dal+-transformantti, josta oli sa- manaikaisesti tullut Cam (klooriamfenikoliresistantti) sisälsi rekombinoidun plasmidin, joka oli johdettu pDN681:stä, jolla + . r

Dal - ja Cam -fenotyypit sidottiin. Mahdollisesti homologisesta rekombinaatiosta johtuen kromosomin ja plasmidin välillä, vain hyvin pieni määrä plasmidia voitiin havaita transformantissa.

Jotta vältettäisiin plasmidin rekombinaatio ja edelleen yhden-

+ R

tyminen kromosomiin, plasmidi valmistettiin tästä Dal Cam -transformantista ja siirrettiin D-alaniinia vaativaan ja re-kombinoituun, heikentyneeseen kantaan DN733 dal~ recE valkoi-

+ + R

vaan Dal :san. Transformanteista tuli samanaikaisesti Dal Cam ja Kan (kanamysiiniresistantti) .

Transformantit sisälsivät pieniä määriä plasmidia, noin 16 kb.

Tästä plasmidista, 2,0 kb Clal-Sphl-osan antava Dal+-fenotyyppi

R

kloonattiin 2,6 kb osan plasmidilla pDN820: Cam "kannassa — £ + DN608: dal -valikoivaan Cam Dal :saan antamaan 4,6 kb rekombi-nantti plasmidin pDNIOOO. Tämä plasmidi voi kuitenkin korvata rekombinoitujen, hyvien kantojen (esim. DN608) kromosomien dal-1-mutaation homologisen rekombinaation dal+-vastageenillä, jossa «j. p . .. Dal -fenotyypin valinta ilman siihen liittyvää Cam valintaa, ei voida enää varmistaa plasmidin säilymistä.

Jotta estettäisiin dal+-vastageenin siirtyminen kromosomiin homologisella rekombinaatiolla ja edelleen plasmidin häviäminen, ja jotta vähennettäisiin mutaatioiden esiintymistiheyttä ai-V." heuttaen Dal+-tyypin, isäntäkromosomista poistettiin sekä isännän dal-geeni sekä naapuriosan dal-geeni: kloonattu dal-geeni katkaistiin restriktioentsyymeillä EcoRl ja EcoR5, ja edelleen eristettiin eksonukleaasilla Bal31. Eristetty seos sidottiin

* — R

ja transformoitiin DN608 dal valikoiden Cam . Transformantit, joiden sisältämiltä plasmideilta puuttui dal-geeni, tunnistet-*...1 tiin Dal Cam :ksi. Isäntäkannan valmistamiseksi sopivalla dal- geenin poistolla dal+-isäntä siirrettiin yhden poistetun plasmi- * i.

» 9 85876

R — R

din, pDNl274 Cam dal :n kanssa. Valikoiden Cam , noin 0,1 % transformantista oli Dal ilmeisesti johtuen kromosomaalisesta dal+-geenin täydennyksestä yhdessä homologisella rekombinaatiol-la poistetun dal -osan pDN1274;n kanssa. Tätä seuranneessa spontaanissa pDNl274:n häviämisessä kasvun aikana D-alaniinin läsnäollessa ja klooriamfenikolin puuttuessa, plasmidivapaa kanta DN1280 säilyi Dal :na. Southern blotting-analyysit kromosomi-DNA:n DN1280:sta osoitti, että se todella suojeli oletettua dal-poistoa. Tämä dal”-poistettu isäntä, kanta DN1280, siirrettiin dal+-plasmidin kanssa (esim. pDNl090), joka suojeli sekä . lopullista dal+-geeniä että osia, jotka ovat homologisia DNA:n kanssa, jotka sivuavat molempia kromosomin poistetun osan sivuja. dal+-geenin siirto plasmidista kromosomiin homologisella rekombinaatiolla pystyi tämän vuoksi tapahtumaan, ja isäntä voitiin muuttaa dal+:ksi. Siten plasmidin säilyminen ei ollut enää ehtona Dal + -fenotyypille, ja plasnidi menetettiin usein. dal+-plasmidi, pDN1277, valmistettiin sitten suojelemaan lopullista toiminnallista dal+-geeniä, mutta ei DNA-homologeja DNA:lie, jotka sivuavat isäntäkromosomin poistettua osaa, mikä selitettiin edellä. Siksi dal+:n siirto plasmidista kromosomiin homologisella rekombinaatiolla ei pystynyt tapahtumaan dal -poistetun isännän transformaatiossa pDN1277:n kanssa. Siten DN1280 on sopiva dal -isäntä D-alaniinivapaalla elatusaineella dal+-plasmideille, jotka eivät suojele DNA:ta mukaanlukien EcoR5-osan, joka normaalisti sivuaa kromosomin dal-geeniä, mutta joka ·*· : on poistettu DN1280:sta.

Jotta varmistuttaisiin, että tieteellisesti tai kaupallisesti kiinnostavat kloonatut geenit todellakin säilyvät plasmideissa D-alaniinivapaassa alustassa edellä esitetyllä isäntä-vektori-systeemillä, Bacillus C599 (NCIB 11837) maltogeeninen amylaasi-geeni siirrettiin dal+-plasmidiin. Kaksi plasmidia pDNH30 ja pDN1290 valmistettiin. Molemmat plasmidit suojelevat plasmidin . - pUB110:n replikointitoimintoja ja toiminnallisia dal- ja amyM-geenejä. Kumpikaan plasmideista ei anna millekään antibiootille ____: vastustuskykyä. Plasmidit pDN1130 ja pDNl290 siirrettiin edellä mainittuun B. subtilis-kantaan DN1280. Kanta DN1280 suojelee edellä mainittua kromosomaalista poistettua osaa, joka sisältää : * sekä osan dal-geenistä, joka on välttämätön Dal+-fenotyypin 10 85876 syntymisille että viereisen osan, jota ei vaadita Dal+-feno-tyyppiin, se on osa dal-geeniä senso strictu tai ei. pDNl290 ei suojele tätä jälkimmäistä poistettua osaa. Niinpä dal+-geeniä ei voida siirtää pDNl290:stä kromosomiin kaksinkertaisella, homologisella rekombinaatiolla. Plasmidi pDNH30 toisaalta suojelee molempia kokonaisia osia, jotka on poistettu kromosomista ja viereisistä osista. Tästä syystä dal+-geenin siirtoa plasmidista kromosomiin ja edelleen plasmidin häviämistä saattaa tapahtua.

Saadut transformoidut kannat DN1297 (=DN1280 pDNH30) ja DN1300 (=DN1280 pDNl290) testattiin plasmidin säilymistä viljelyn aikana (katso esimerkki 7). Viljeltäessä DNl297:ää tapahtui homologinen risteytys, joka palauttaa dal+-geenin kromosomin, ja sekä plasmidi että Amy+-fenotyyppi menetettiin usein.

Viljeltäessä DNl30Q:aa ei havaittu plasmidin tuottaman Amy+-fenotyypin häviämistä kasvun aikana D-alaniinia sisältämättömässä elatusaineessa. Jos D-alaniinia lisättiin elatusaineeseen, solut kuitenkin menettivät usein plasmidin ja muuttuivat Amy- Dal :seksi. Näin todistettiin tärkeän ei-syntyperäistä geeniä suojelevan plasmidin pysyvä säilyminen antiobioottiva-paassa elatusaineessa.

Jotta osoitettaisiin, että plasmidit säilyvät myös gram-nega-': tiivisilla organismeilla D-alaniinin vaatimuksen lopettamisella - B. subtiliksen dal-geeni kloonattiin D-alaniinia vaativan

Escherichia coli-mutantin plasmidiin, ja osoitettiin täydentämällä vaatimus.

Tämän keksinnön lähemmät yksityiskohdat ilmenevät seuraavista " ’ esimerkeistä.

*· *- Plasmidien ja kromosomi-DNA: n valmistaminen ja Bacillus subti- · Uksen ja E. colin transformointi tehtiin seuraavien, yleisten menetelmien mukaan. Eristäminen restriktioentsyymeillä, Bal 31-.···. nukleaasikäsittely, oligo-DNA-sitojän liittäminen ja sitominen ·’ DNA:n T4-ligaasin kanssa suoritettiin New England Biolabs'in • « » 11 85876 entsyymeillä toimittajan esittämissä olosuhteissa.

Kannat

Kaikki Bacillus subtilis-kannat oli johdettu Bacillus subtilis 168:sta (Spizizen, Proc. Natl. Acad. Sei., 44: 1072-78, 1958).

RUB200: arol906 , amyE07, amyR2 saatiin tri. Frank Young'ilta,

Rochester'in Yliopistosta, New York. SL438: trpC2 (itiöiden muodostuminen ja proteaasin puuttuminen) saatiin tri. Kim

Hardy'lta, Biogen, Geneve. DN497: amyE07, amyR2 on RUB200:n aro+-transformantti SL438 kromosomi DNA:n kanssa, QB1133: aroI906, metB5, sacA321, amyE saatiin tri. Georges Rapoport'ilta, IRBM, Pariisi. QB1130: dal, metB5, sacA331, amyE saatiin

Bacillus Genetic Stock Centeristä, Columbus, Ohio. DN608:dal-l. metB, sacA, amyE oli aro+, QB1133:n dal-l-transformantti QB1130:n kromosomi-DNA:n kanssa. MT120: leuB6, recE4 r m saatiin tri.

m m

Teruo Tanaka'lta, Mitsubishi-Kasei Institute of Life Sciences, Tokio. DN773: dal-1, amyE, recE, sacA oli DN608:n met+ recE-transformantti MT120:n kromosomi-DNA:n kanssa. DN606 on DN608 transformoituna plasmidin pUBllO kanssa.

Escherichia coli-kanta TKL10: thr-1 leuB6 codAl trp-64 pyrFlOl his-108 thyA6 argG66 ilvA634 thi-1 alr-1 deoCl IacYl tonA21 tsx95 supE44 (Wijsman, Genet. Res., Camb. 20: 269-77, 1972) saatiin tri. Barbara Bachmann'ilta E. coli Genetic Stock Center Connecticut, U.S.A, (CGSC 5466) .

Plasmidit 2,7 kb:n pUC9 antaa vastustuskyvyn ampisilliinille ja johdettiin pBR322:sta (Vieira et ai., Gene 19: 259-68, 1982). 4,4 kb:n - pBR322 antaa vastustuskyvyn ampisilliinille ja tetrasykliinille '] (Bolivar et ai., Gene 2: 95-113, 1977) .

Plasmidit pUBllO ja pBD64 (Gryczan et ai., J. Bacteriol. 134: ·. " 318-329, 1978, ja Gryczan et ai., J. Bacteriol. 141: 246-53, V : 1980) eristettiin B. subtilis-kannolsta BD366 ja BD624, kukin ____: erikseen. pUBllO ja pBD64 molemmat antavat vastustuskyvyn kana- mysiiniin, ja pBD64 myös klooriamfenikoliin . B. subtilis-kannat BD366 ja BD624 voidaan saada Bacillus Genetic Stock Center'istä, i2 85876

Columbus, Ohio, USA (kantakokoelman numero BGSC1E6 ja 1E22).

7,6 kb:n plasmidi pDN452 antaa vastustuskyvyn klooriamfenikoliin ja kanamysiisiin ja suojaa rakenteellista geeniä Bacillus subtiliksen NCIB 11837 maltogeeniselle amylaasille. pDN452:n rakenne on kuvattu EP-patenttihakemuksessa n:o 84301994.4.

I. B. subtiliksen transformointi

Vaaditut Bacillus subtilis-solut valmistettiin Yasbinin et ai. mukaan (J. Bacteriol. 121: 296 - 304, 1975). Solut otettiin talteen sentrifugoimalla (7000 kierr/min, 3 min), suspendoitiin uudelleen yhteen kymmenenteen tilavuusosaan supernatanttia sisältäen 20 % glyserolia, jäähdytettiin nestemäisellä typellä ja varastoitiin -70°C:ssa. Transformointia varten, jäädytetyt solut sulatettiin 42°C:ssa ja sekoitettiin yhden tilavuusosan puskurin kanssa (Spizizen'in minimaalinen elatusaine (Spizizen,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 44: 1072 - 78, 1958)) 0,4 % glukoosin, 0,04 M MgCl:n ja 0,002 M EGTA:m kanssa). DNA lisättiin ja seos inkuboitiin ravistelemalla 37°C:ssa 20 minuutin ajan. Sitten solut valettiin maljalle sopivalla selektiivisellä elatusaineella.

II. E. colin transformaatio Yön yli viljelty E. coli K-12-kanta n:o 802 LB:ssa (10 g Bacton tryptonia, 5 g Bacton hiivauutetta ja 10 g NaCl:a per litra vettä, pH 7,0), laimennettiin 100-kertaisesti 500 ml LB:lla ja kasvatettiin 37°C:ssa arvoon OD^g = 0,4. Viljelmä jäähdytettiin, ; jätettiin jäiden päälle 15 minuutin ajaksi, pyöritettiin 15 min 3000 kierr/min:ssa (Sorvall'in GS3 roottorilla), suspendoitiin • ·*; uudestaan 200 ml:aan kylmää 0,1 M CaC^^a, pidettiin jäissä 20 ... min, pyöritettiin 10 min 300 kierr/min: ssa, suspendoitiin uudestaan 5 ml:aan kylmää 0,1 M CaCl2:a ja pidettiin jäissä 20 h.

Sitten lisättiin kylmää glyserolia 10 %:iin ja tasaosat jäädytettiin nestemäisellä typellä ja varastoitiin -70°C:ssa. Jäätyneet solut sulatettiin jäillä, DNA lisättiin, seosta inku-- " boitiin 45 min jätten päällä, kaksi min 37°C:ssa ja sitten valettiin sopivalle selektiiviselle kasvualustalle.

III. Plasmidien valmistus E. colista E. colia kasvatettiin yli yön 250 ml LB:ssa, 0,4 % glukoosissa i 13 85876 ja sopivassa antibiootissa. Solut otettiin talteen sentrifugoi-malla ja uudelleensuspendoitiin 4 ml puskuria 1 (0,025 M Tris»HCl, pH = 8,0, 0,01 M EDTA, 0,05 M glukoosia, 2 mg/ml lysotsyymiä). Suspensiota inkuboitiin 0°C:ssa 15 min ajan ja sitten sekoitettiin 8 ml puskurin 2 kanssa (0,2 M NaOH, 1 % SDS). Sitten 6 ml puskuria 3 (3 M natriumasetaattia, pH = 4,8) lisättiin, seosta pidettiin 0°C:ssa 60 min, jonka jälkeen sentri-fugoitiin 20 min ajan 19 000 kierr/minuutissa (noin 45 000 g Sorvall'in SS34 roottorilla). Supernatantti saostettiin 0,6 tilavuudella kylmällä isopropanolilla ja suspendoitiin uudelleen 1,2 ml 5TE:hen (0,05 M Tris*HCl, pH = 8,0, 0,005 M EDTA), ynnä 20 ^ul keitettyä RNaasia A (Boehringer) (2 mg/ml). 30 min myöhemmin liuos laitettiin kerrokseksi 4,0 ml puskurin 4 (80 g CsCl ynnä 56 ml 5TE) päälle ja 0,1 ml EtBr (10 mg/ml etidiumbro-midi) VTi65-puskurissa. Seosta sentrifugoitiin 45 000 kierr/minuutissa 20 h. Plasmidi poistettiin sitten putkesta, dialysoitiin ja uutettiin kuten kappaleessa VI.

IV. Plasmidin valmistus B. subtiliksesta

Plasmidi valmistettiin kuten kuvatut E. coli-kannat (katso kappale III), mutta seuraavin muutoksin. Kasvatus oli LB:ssa sisältäen 0,01 M kaliumfosfaattia, pH = 7,0 ja sopivaa antibioottia (esim. 6 ^ug/ml klooriamfenikolia) ja jos vaadittiin 100 ^ug/ml D-alaniinia. Talteenoton jälkeen solut inkuboitiin 37°C:ssa lysotsyymin kanssa. Puskuri 2 korvattiin seoksella jossa oli yksi tilavuus puskuria 2 ja kolme tilavuutta puskuria 5 (0,2 M gly-siini, 0,2 M NaCl ja 1 % SDS). Seuraavat kohdat olivat samoja kuin kappaleessa III.

V. Plasmidien pienen mittakaavan valmistus B. subtiliksesta 5 ml B. subtiliksen plasmidi LB:ssa (sisältäen 0,01 M fosfaattia ' pH = 7,0 ja sopivia antibiootteja ja D-alaniinia, jos tarvitaan) valmistettiin kuten kappaleessa IV, paitsi 1: puskureiden tila-vuutta vähennettiin nelinkertaisesti. 2: 0,5 ml fenolia ja 0,5 ml kloroformia lisättiin puskurin 3 jälkeen. 3: sentrifugoinnin jälkeen 19 000 kierr/minuutissa supernatantti saostettiin etanolilla, suspendoitiin uudelleen 400 ^ul puskuriin 6 (0,05 M Tris*HCl pH = 8,0, 0,1 M natriumasetaatti), plasmidi saostet-·**.. tiin taas, suspendoitiin uudelleen 400 ^ul puskuriin 6, saostet-

tiin, pestiin ja suspendoitiin uudelleen 100 ^ul TE:hen (0/01 M

tris, HC1, pH = 8,0, 0,001 M ED TA) 1 ^,ug/ml keitettyä RNaasia A (Boehringer) .

i4 85876 VI. Kromosomi-DNA:n valmistus B. subtiliksesta Jäätyneiden solujen pyörykkä noin 50 ml:n viljelmästä suspendoitiin uudelleen 1,1 nil puskuria (0,05 M Tris-Hcl, pH = 7,4, 0,1 M NaCl, 25 % sakkaroosi) . 100 ^,ul lysotsyymiä (25 mg/ml) ja 150 ^ul EDTA:ta (0,5 M, pH = 8,0) lisättiin. Seosta inkuboitiin 37°C:ssa 30 min. 2 ml 0,2 % SDS:ää lisättiin, jonka jälkeen inkuboitiin 30 min 37°C:ssa. 1 g CsCl:ää ja 0,05 ml EtBr:a (10 mg/ml) lisättiin per 0,95 ml seosta ja seosta sentrifugoi-tiin 45 000 kierr/minuutissa, 15°C, 20 h VTi65-roottorissa (Beckman).

DNA sijoitettiin pitkäaaltoisen UV-lampun alle, ja poistettiin puhkaisemalla putki ruiskulla. EtBr uutettiin isopropanolilla ja liuosta dialysoitiin kaksi tuntia TEE:tä (0,01 M Tris-HCl, pH = 8,0, 0 ,01 M EDTA) vastaan. Liuosta säädettiin sitten 8 mlraan TEE:llä ja uutettiin kahdesti fenolilla ja kerran kloroformilla.

DNA saostettiin 0,1 M NaCl:lla ja kylmällä etanolilla ja liuotettiin 1 ml TE:hen (0,01 M Tris-HCl, pH = 8,0, 0,001 M EDTA). Kro-mosomi-DNA-liuos pidettiin 4°C:ssa.

. . Esimerkki 1

Plasmidin pDN1050 valmistaminen (kuvio 1) ; Plasmidi pBD64 valmistettiin restriktioentsyymeillä EcoRl ja

Sphl, ja 3,6 kb:n pala sidottiin E. coli-plasmidin pBR322 0,56 kb EcoRl-Sphl-palalla. Saatu 4,2 kb:n plasmidi pDN691 an-: taa vastustuskyvyn klooriamfenikolille ja kanamysiinille.

: pDN691:n 0,4 kb Hind3-BamHl-pala korvattiin E. coli-plasmidin pUC9 0,02 kb Hind3-BamHl-palalla. Saatu plasmidi pDN720, 3,8 kb, '· · antaa vastustuskyvyn klooriamfenikolille ja kanamysiinille.

pDN720:n 2,8 kb Ncol-Ncol-pala korvattiin pDN770:n 1,8 kb Ncol-Ncol-palalla. 3,6 kb pDN770 oli pBD64:n spontaani poisto ja antaa klooriamfenikolille vastustyskyvyn. Saatu 2,8 kb:n plasmidi pDN820 midi pDN820 antaa vastustuskyvyn klooriamfenikolille. pDN820 avattiin yl • · · ti 15 85876 sinkertaisella HgiAl-osalla ja eristettiin Bal31:lla 30 sekunnin ajaksi 30°C:ssa, jonka avulla 0,1 kb:n pala siirrettiin. Saadut lineaariset palat sidottiin Bgl2-oligonukleotodiliittä-jällä New England Nuclearista (n:o 1001). 2,7 kb:n plasmidi sisältää yhden Bgl2-liittäjän ja antaa vastustuskyvyn kloori-amfenikolille, joka eristettiin tästä sidosseoksesta.

Esimerkki 2

Plasmidin pDN1122 valmistaminen (kuvio 2) 7.6 kb:n plasmidi pDN452 antaen vastustuskykyä klooriamfenikolil- le ja kanamysiinille ja suojellen Bacillus V599:n maltogeenisen amylaasin rakenteellista geeniä amyM eristettiin Aval'illa, käsiteltiin eksonukleaasilla Bal31, sidottiin EcoRl-oligonuk- leotidiliittäjällä (Biolabs n:o 1004), eristettiin EcoRl:llä, sidottiin T4-sitojalla ja transformoitiin B. subtilikseen R + DN497:amyE valiten Cam . Yksi Amy -transformantti sisälsi 6,6 kb plasmidin p520-20. p520-20:n amylaasisaanto ei ollut vähäisempi kuin pDN452:n saanto.

2.7 kb Ncol-pala p520-20:sta korvattiin sitten 1,7 kb Ncol-Ncol-palalla pDN770:stä (valmistettu esimerkissä 1). Saatu 5,6 kb plasmidi pDN808 suojelee amyM:ia ja antaa vastustuskyvyn kloori-fenikolille.

... pDN808:n 2,6 kb EcoRl-Sphl-pala korvattiin pDNl050:n 2,4 EcoRl- 1 . Sphi-palalla (valmistettu esimerkissä 1) . Saatu 5,4 kb plasmidi pDNH22 suojelee amyM:ia ja antaa vastustuskyvyn klooriamfeni- ;···; kolille.

• Esimerkki 3 dal-geenin kloonaus

Noin 3 ,ug kromosomi-DNA: ta B. subtilis-kannasta DN49 7 ja 1 ,ug / R R

· plasmidia pDN691 Cam Kan eristettiin täydellisesti restriktio- • . entsyymeillä BamHl ja Sphl. Kromosomi- ja plasmidi-DNA sekoitet- | tiin ja sidottiin T4-sitojalla ja transformoitiin kantaan • _ + DN606 :dal pUB110:Kan . Noin 200 Dal -transformantin joukosta

**" R

yhdestä oli samanaikaisesti tullut Cam kuin vihjeenä siitä, 16 85876 että Dal+-fenotyyppi sidottiin rekombinanttiplasmidiin, joka oli johdettu pDN691:sta. Plasmidit valmistettiin tästä Dal+ R _ _

Cam -transformantista ja siirrettiin kantaan DN773 dal recE

valikoiden Dal+. Dal+-transformantit tulivat samanaikaisesti R R

Cam :ksi ja Kan :ksi. Transformantit sisälsivät vain hyvin pieniä määriä plasmidia, noin 16 kb.

Tästä plasmidista 2,0 kb Clal-Sphl-pala antaen Dal+-fenotyypin kloonattiin Clal- ja Sphl-osiin kannan DN608 plasmidissa pDN820:dal antaa rekombinanttiplasmidin, 4,6 kb pDNlOOO.

Restriktioentsyymipaikkojen kartta pDNlOOO:11a on esitetty kuviossa 3. Transformoitu kanta DN1000=DN608 pDNlOOO talletettiin National Collection of Industrial Bacteria (Teollisten Bakteereiden Kansalliseen Kokoelmaan) (NCIB) , Torry Research Station, Aberdeen, Skotlanti, 7. joulukuuta 1984 ja annettiin referenssinumero NCIB 12029. NCIB, joka on kansainvälinen säilytyspaikka, joka valtuutettiin Budapestin sopimuksessa 1977, sallii talletuksen esittämisen ja yleisen käsiteltävyyden sinne edellä mainitun sopimuksen sääntöjen 9 ja 11 mukaisesti, kummankin erikseen.

Seuraavat havainnot varmistivat sen, että kloonattu kromosomi-osa todella sisältyi dal-geeniin (kuten määritettiin dal-l-mu-taatiolla) , ja mikään muu geeni ei pysty estämään D-alaniinin tarvetta: 1: Linearisoitunut (ei-kopioituva) plasmidi transformoi dal-- vastaanottajan Dal :ksi, mutta ei Cam :ksi merkkinä homologisesta rekombinaatiosta kromosomin dal-geenin ja kloonatun kro-mosomiosan kanssa.

2: Noin 0,2 % isäntäbakteerista, jolla on dal-1 kromosomissaan, “· valmistetuista plasmideista oli dal- (kuitenkin restriktio- . entsyymin rakenne on erottumaton alkuperäisestä dal+-plasmi- dista). Nämä dal~-plasmidit eivät voi täydentää kromosomaalista dal-l-mutaatiota merkkinä siitä, että kromosomimutaatio olisi ·.. siirtynyt dal--plasmideihin homologisella rekombinaatiolla.

l! 17 85876 3: Kromosomi-B. subtilis-DNA:n Southern blotting-analyyseillä osoitettiin, että kromosomin Clal-Sphl-pala risteytyi samaa kokoa olevan osan kanssa pDN1000:sta. Täten dal-geenin suurempia uudelleen järjestelyitä ei voinut esiintyä ennen sen kloonausta pDNIOOOrlla.

Esimerkki 4

Plasmidin pDNll30 valmistaminen (kuviot 3 ja 4) pDNIOOO (esimerkistä 3) suojellen dal+-geeniä avattiin Clal-osalla, eksonukleaasi eristettiin Bal31:lla ja sidottiin BamHl-oligonukletidisitojalla (n:o 1017 Biolabs1 ilta) . Saatu plasmidi pDNl090 suojelee dal+-geeniä ja antaa vastustuskyvyn kloori-amfenikolille.

pDNH22 (esimerkistä 2) leikattiin Sphlrllä ja Bgl2:lla, ja 4,4 kb:n osa sidottiin 2,0 kb pDNl090:n Sphl-BamHl-palalla.

Saatu plasmidi pDN1130 suojelee amyM+:aa ja dal+-geeniä, mutta ei anna vastustuskykyä klooriamfenikolilie.

Esimerkki 5

Plasmidin pDN1290 valmistaminen (kuviot 3 ja 4)

+ R

Plasmidin pDNlllO dal Cam , 4,5 kb, valmistettiin eksonukleaa-silla Bal31 eristeellä, joka oli eristetty pDNl000:sta Sphlrllä, ja liittämällä sekä Bgl2- ja sacl-oligonukleotidiliittäjällä (nro 1001 ja nro 1005 Biolabs’ilta, kumpikin erikseen).

pDNlllO avattiin yksinkertaisella EcoR5-osalla, eksonukleaasi eristettiin Bal31rllä ja sidottiin kahdella Bgl2-oligonukleoti-:.· : diliittäjällä (nro 1001 Biolabs ’ilta) . Liittäjän yhteensulami- nen yhden plasmidin päätteen kanssa sai aikaan Bcll-osan. Saatu plasmidi pDNl222 suojelee dal+-geeniä, ja antaa vastustuskyvyn :’· : klooriamfenikolille.

•. 0,7 kb pDN1222rn Bcll-Bcll-pala sidottiin 3,5 kb BamHI-Bcll-pa- lan pDN1090rstä kanssa (esimerkissä 4). Saatu plasmidi pDN1277, 4,2 kb, suojelee dal+-geeniä ja antaa vastustuskyvyn kloori-amfenikolille. Plasmidi pDNl277 siirrettiin kantaan DN1280 ie 85876 (katso esimerkki 6) ja saatu kanta DN1517 (=DN1280 pDNl277) tallennettiin National Collection of Industrial Bacterian kokoelmaan, Torry Research Station, Aberdeen, Skotlanti, 7. joulukuuta 1984 ja annettiin referenssinumero NCIB 12030.

pDNl090 edelleen siirrettiin 4,5 kb plasmidiin pDNll20 dal p

Cam korvaamalla 2,6 kb Sphl-BamHl-pala 2,5 kb Sphl-BamHl-pa-lalla pDN1050:stä (valmistettiin kuten kuvattiin esimerkissä 1).

pDN1265 amyM+ CamR valmistettiin pDNH20:lta eristetyltä Bal31-eksonukleaasilla eristetty EcoR5:llä ja edelleen eristettiin Sphl:llä. 2,9 kb:n pala sidottiin Sacl-oligonukleotidiliittä-jällä (Biolabs n:o 1005) ja 2,9 kb:n pDNH30-palan kanssa, joka oli saatu eristämällä EcoRl:llä ja Bal31-eksonukleaasikäsitte-lyllä, ja edelleen eristämällä Sphlillä.

Saatu plasmidi pDN1265, 5,8 kb, suojelee amyM+-geeniä ja antaa vastustuskyvyn klooriamfenikolille.

Sitten pDNl265 katkaistiin Sphl-Bgl2:11a ja 4,7 kb-pala sidottiin 1,6 kb pDNl277:n Sphl-Bgl2-palan kanssa.

+ j_

Noin 6,3 kb saatu plasmidi pDN1290 suojelee amyM :ia ja dal -geeniä, mutta ei antibiootin vastustuskyvyn merkitsijää.

Esimerkki 6

Isännän, jolla on vajausta dal-geenissä, valmistaminen (kuvio 5) Katkaisemalla 5 g kloonatun dal + -geenin pDNl090:stä restriktio-entsyymeillä EcoRl ja EcoR5, ja edelleen eristämällä palat ekso-nukleaasilla Bal31 60 sekunniksi yhdistäen ja siirtäen DN608:dal-l:aan, saatiin aikaan vajausta, joka tuhosi plasmidin Dal+-fenotyypin„ Kannan DN497 transformaatio yhden näiden va-·.*·: jaitten plasmidien pDN1274 Cam dal , ja Cam :n valinta antoi V : noin 0,1 % transformanteista, jotka olivat ilmeisesti Dal” joh- ____: tuen kromosomin dal+-geenin korvaamisesta dal -vajauksella .-·. pDNl274 :stä. Spontaanisti tapahtuneen menetyksen pDNl274 jälkeen, * R — " transformantista tuli Cam , mutta säilyi Dal . Tämän kannan, * * : ’** DN1280, kromosomi-DNA:n Southern blotting-analyysit osoittivat, • · 1; i9 85876 että se todellakin suojelee oletettua dal-vajetta. Mutaatioiden esiintymistiheys, mikä saattaisi aiheuttaa tämän dal-vajemutan-tin palautumisen DAL+-fenotyypiksi, oli vähemmän kuin 10 DN1280 suojeleva plasmidi pDNl277 = DN1517 (katso esimerkki 5) tallennettiin.

Esimerkki 7 dal+ amyM*-plasmidien stabiilisuus dal -isännässä Jotta osoitettaisiin sekä isäntä-plasmidi-yhdisteen DN1300(= DN1280 pDN1290) stabiilisuus että ristiinmenevän kromosomin puuttuminen ja kromosomin vajetta sivuavien plasmidi-DNA-osien tärkeys. seuraava koe suoritettiin:

Kantojen DN1297(=DN1280 pDN1130) ja DN1300(=DN1280 pDN1290) yksittäiset pesäkkeet suspendoitiin uudelleen L-lihaliemeen lisättynä 10 mM kaliumfosfaattipuskuria pH 7,0 ja 0,2 % glukoosia. Puolet jokaisesta suspensiosta ympättiin edellä esitettyyn elatusaineeseen, ja toinen puoli täysin samaan elastusaineeseen, johon oli lisätty 200 ^ug/ml D-alaniinia. Liuottamalla viljelmät joko 100- tai 1000-kertaisesti, kantoja kasvatettiin useiden sukupolvien ajan 37°C:ssa hyvällä ilmastuksella joko D-alaniinin läsnäollessa tai puuttuessa elatusaineesta. Jokaisessa laimen- 7 nuksessa, ei vähemmän kuin 10 soluja siirrettiin. Yhden päivän välein, Amy+-pesäkkeiden esiintymistiheys (kokonaisuudessaan . . noin 100) testattiin L-lihaliemimaljoilla joko D-alaniinin kanssa tai ilman riippuen kasvuolosuhteista. Tulokset on esitetty taulukossa 1. 10 satunnaisesti valittua Amy -pesäkettä eivät osoittaneet sisältävänsä yhtään plasmidia.

Taulukko 1

Amy ""-solujen esiintymistiheys kasvun jälkeen LB-elatusaineessa joko D-alaniinin kanssa tai ilman.

sukupolvet ·/-· Kannat plasmidi 51 68 _ 85 ____________% Amy_ DN1297 pDNll30 2 % 20 % DN 1297 + D-ala1 pDNH30 60 % - ·../ DN 1300 pDN1290 0 % 0 % 0 % :·! DN1300 + D-ala1 pDNl290 60 % 90 %

Ensimmäiset 20 sukupolvea ilman D-alaniinia 20 85876

Tulokset taulukossa 1 osoittavat, että plasmidi pDN1290 on hyvin pysymätön valikoimattomissa olosuhteissa (D-alaniinin lisäys kasvualustaan), mutta muuttuu pysyväksi kasvun aikana selektiivisessä elatusaineessa (ilman D-alaniinin lisäystä). Edelleen osoitettiin, että homologinen, kaksinkertainen risteytys palauttaa dal+-geenin isäntäkromosomiin ja edelleen plas-midin häviämistä ei tapahtunut DNl300:ssa (ei Amy~-soluja 85 sukupolven kasvatuksen jälkeen), kun taas Amy--solujen esiintymistiheys oli 20 %, DNl297:n 68 sukupolven jälkeen kasvaneena D-alaniinia sisältämättömässä elatusaineessa, ilmeisesti johtuen dal+-geenin siirtymisestä plasmidista kromosomiin ja edelleen plasmidin menetyksestä.

Esimerkki 8

Plasmidin pDNlSOO valmistaminen (kuvio 6) pDNl284 valmistettiin yhdistämällä 1,4 kb Bgl2-Bgl2-pala pDN1222:sta (katso kuvio 3) 1,5 kb BamHi-Bgl2-palan pDNl050:stä kanssa (katso kuviota 3).

pDN1284:stä dal+-geeni siirrettiin 1,4 kb Bgl2-Sall-palalla klassiseen E. colin plasmidivektoriin pBR322, joka on katkaistu BamHl:llä ja Sallzllä. Rekombinanttiplasmidi, pDNl800:Amp (ampisilliiniresistantti) siirrettiin E. coli-kantaan TKL10 valiten AmpR saamaan kannan DN1800:pDNl800. Kanta DN1800 tal-lennettiin NCIB:ssä 22. marraskuuta 1985 ja annettiin referens-sinumero NCIB 12181. Sen mukaisesti talletteen esittäminen ja yleinen luoksepäästävyys sinne on varmistettu (vide supra).

; TKL10 osoittaa D-alaniinia vaativan fenotyypin 42°C:ssa, mutta DNl800:ssa tämä vaatimus on hävinnyt. Siten, pDN1800 suojellen B. subtiliksen dal-geeniä pystyy täydentämään D-alaniinivaati-..· muksen E. coli-kannassa, joka on puutteellinen alaniinin rase-maattiaktiivisuudessa (Wild et ai., Molec. Gen. Genet. 198: 315-22, 1985) .

• · » · * * * >·!··

Claims

21 85876

1. Förfarande för stabilisering av plasmider i en värdbak-terie under odling, kännetecknat av att i plasmiden införs en DNA-sekvens, som kodar för D,L-alaninrasemas, ooh att värdbakterie transformeras med plasmiden som innehäller nämnda DNA-sekvens, och används en värdbakterie med en de-fekt i den kromosomala dal-gen för D,L-alaninrasemas.

1. Menetelmä plasmidien stabiloimiseksi isäntäbakteerissa viljelyn aikana, tunnettu siitä, että plasmidiin viedään DNA-jakso, joka koodaa D,L-alaniinirasemaattia, ja transformoidaan isäntäbakteeri plasmidilla, joka sisältää mainitun DNA-jakson, ja käytetään isäntäbakteeria, jolta puuttuu kro-mosomaalinen dal-geeni D,L-alaniinirasemaatille.

2. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat av att värdbakterien har en mutation i den kromosomala dal-genen för D,L-alaninrasemas, eller en deletion omfattande i det I-, minsta en del av dal-genen. 23 8 5 8 7 6

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäbakteerissa on mutaatio kromosomaalisessa dal-geenissä D,L-alaniinirasemaatille, tai deleetio sisältäen vähintään osan dal-geenistä.

3. Förfarande enligt patentkravet 2, kännetecknat av att mutationen är en deletion av bäda en del av dal-genen, som är nödvändig för uttryckelse av Dal+-fenotypen och en del av direkt flankerande DNA, som är onödvändig för otryckning av Dal*-fenotypen, var den en del av dal-genen eller inte.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mutaatio on deleetio, joka poistaa sekä osan dal-geenistä, joka on välttämätön Dal*-fenotyypin ilmaisulle, sekä osan suoraan sivuavaa DNA:ta, joka ei ole välttämätön DAL*-fenotyypin ilmaisulle, oli se osa dal-geeniä tai ei.

4. Transformerad bakterie, kännetecknad av att den är av-lett frän en värdbakterie, som har en defekt i den kromo-somala dal-genen för D,L-alaninrasemas, och att den innehäl-ler en plasmid som innehäller en DNA-sekvens som kodar för D,L-alaninrasemas.

4. Transformoitu bakteeri, tunnettu siitä, että se on johdettu isäntäbakteerista, jolla on puutteellisuutta kromosomaalisessa dal-geenissä D,L-alaniinirasemaatille, ja että se sisältää plasmidin, joka sisältää DNA-jakson, joka koodaa D,L-alaniinirasemaattia.

5. Transformerad bakterie enligt patentkravet 4, kännetecknad av att den innehäller en mutation i dal-genen för D,L-alaninrasemas eller en deletion, som omfattar minst en del av dal-genen.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen transformoitu bakteeri, tunnettu siitä, että se sisältää mutaation dal-geenissä D,L-alaniinirasemaatille tai deleetion sisältäen vähintään osan dal-geenistä.

6. Transformerad bakterie enligt patentkravet 5, kännetecknad av att den har en deletion av bäda en del av dal-genen, som är nödvändig för uttryckning av Dal*-fenotypen, och av en del av direkt flankerande DNA, som är onödvändig för uttryckning av Dal*-fenotypen, var den en del av dal-genen eller inte, och att den innehäller en plasmid innehäl-lande en del av dal-genen. som är tillräckligt tili uttryckning av Dal*-fenotypen, men inte innehäller segmenter, som är homologiska tili den DNA, som flankerar minst den ena sidan av deletionen pä kromosomet.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen transformoitu bakteeri, tunnettu siitä, että siinä on deleetio sekä osassa dal-oee-niä, joka on välttämätön Dal*-fenotyypin ilmaisulle, että osassa suoraan sivuavaa DNA:ta, joka ei ole välttämätön Dal*-fenotyypin ilmaisulle, oli se osa dal-geeniä tai ei, ja että se sisältää plasmidin, joka sisältää osan dal-geenistä, joka on riittävä Dal*-fenotyypin ilmaisulle, mutta joka ei sisällä 22 8 5 8 76 segmenttejä, jotka ovat sille DNA:lie homologisia osia, joka sivuaa vähintään toista puolta kromosomin deleetiosta.

7. Förfarande för framställning av en önskad produkt i en transformerad bakterie, kännetecknat av att bakterier som har en defekt i den kromosomala dal-genen och innehäller en plasmid innehällande en DNA-sekvens, som kodar för D,L-ala-ninrasemas, samt en DNA-sekvens, som kodar för den önskade produkten, odlas i ett lämpligt näringsmedium, och den önskade produkten utvinns frän näringsmediet.

7. Menetelmä halutun tuotteen valmistamiseksi transformoidulla bakteerilla, tunnettu siitä, että viljellään sopivalla ravintoalustalla bakteereita, joilla on deleetio kro-mosomaalisessa dal-geenissä ja jotka sisältävät plasmidin, joka sisältää DNA-jakson, joka koodaa D,L-alaniinirasemaat-tia, sekä DNA-jakson, joka koodaa mainittua haluttua tuotetta, ja otetaan talteen haluttu tuote viljelyalustalta.

8. Förfarande enligt patentkravet 7, kännetecknat av att värdbakterien Innehäller en mutation i dal-genen för D,L- 2* 85876 alaninrasemas eller en deletion, som omfattar minst en del av dal-qenen.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäbakteerissa on mutaatio dal-geenissä D,L-ala-niinirasemaatille tai deleetio, joka käsittää ainakin osan dal-geenistä.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäbakteerissa on deleetio sekä osassa dal-geeniä, joka on välttämätön Dal+-fenotyypin ilmaisulle, että osassa suoraan sivuavaa DNA:ta, joka ei ole välttämätön Dal*-fenotyypin ilmaisulle, oli se osa dal-geeniä tai ei, ja että plasmidi sisältää osan dal-geeniä, joka riittää Dal*-fenotyy-pin ilmaisulle, mutta ei sisällä segmenttejä, jotka ovat homologisia DNA:lie, joka sivuaa vähintään toista puolta kromosomin deleetiosta.

9. Förfarande enligt patentkravet 8, kännetecknat av att värdbakterien har en deletion av bäda en del av dal-qenen. som är nödvändig för uttryckning av Dal*-fenotypen, och av en del av direkt flankerande DNA, som är onödvändig för uttryckning av Dal*-fenotypen, var den en del av dal-qenen eller inte, och att plasmiden innehäller en del av dal-qenen som är tillräcklig tili uttryckning av Dal*-fenotypen, men inte innehäller segmenter, som är homologiska tili den DNA, som flankerar minst den ena sidan av deletionen pä kromoso-met.