DK159282B

DK159282B - Fremgangsmaade til stabilisering af extra-kromosomale elementer i en vaekstbakterie under dyrkning, transformerede bakterier samt en fremgangsmaade til fremstilling af et oensket produkt i saadanne transformerede bakterier

Info

Publication number: DK159282B
Application number: DK571985A
Authority: DK
Inventors: Boerge Krag Diderichsen
Original assignee: Novo Industri As
Priority date: 1984-12-12
Filing date: 1985-12-11
Publication date: 1990-09-24
Also published as: DK571985A; DK571985D0; DK159282C

Description

DK 159282 B

Denne opfindelse angår en fremgangsmåde til stabilisering af extra-kromosomale elementer i en værtsbakterie under dyrkning, transformerede bakterier samt en fremgangsmåde til fremstilling af et ønsket produkt i sådanne transformerede bakte-5 rier.

Mikroorganismer, der indeholder extra-kromosomale genetiske elementer, her eksemplificeret ved plasmider, er i almindelighed ustabile forstået på den måde, at plasmidet ofte kan tabes irreversibelt. Denne ustabilitet er særlig udpræget, hvis plas-10 midet ikke hidrører fra værtsorganismen, fordi det f.eks. indeholder gener fra andre organismer eller er konstrueret ved gensplejsning.

For at forøge plasmidstabilitet er antibiotika eller andre bioaktive forbindelser, overfor hvilke plasmidet, men ikke 15 kromosomet udviser resistens, sædvanligvis sat til mediet anvendt til dyrkning af mikroorganismen. I sådan et medium vil kun de celler, der bevarer plasmidet med genet for antibiotisk resistens, formere sig. Den væsentlige ulempe ved denne metode, er at den kræver dyrkning i stor skala af antibiotisk resistente mikro-20 organismer, tilsætning af dyre antibiotika til vækstmediet med eventuel uheldig effekt på omgivelserne og efterfølgende ekstensiv oprensning for at fjerne antibiotikaet fra det ønskede produkt.

Komplementering af en auxotropisk mutation af værts-25 kromosomet er en anden kendt metode til stabilisering af plasmider. Denne metode lægger imidlertid alvorlige restriktioner på sammensætningen af dyrkningsmediet og kræver dyrkning i et vækstmedium, som ikke indeholder det næringsstof, som værtsorganismen kræver, hvorved mulighederne for at forbedre produktiviteten 30 begrænses.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en fremgangsmåde til stabilisering af extra-kromosomale elementer i transformerede bakterier uden nødvendigheden af at bruge antibiotika og uden at lægge alvorlige begrænsninger på 35 sammensætningen af vækstmediet.

2 DK 159282 B

Det er et yderligere formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe transformerede bakterier, der indeholder sådanne stabiliserede extra-kromosomale elementer, samt en fremgangsmåde til at fremstille ønskede produkter i transformerede 5 bakterier uden nødvendigheden af at bruge antibiotika eller at lægge specielle restriktioner på sammensætningen af vækstmediet.

Opfindelsen beror på den erkendelse, at extra-kromosomale elementer kan bevares i værtsbakterier under dyrkningen i sædvanlige medier, hvis de extra-kromosomale elementer indeholder 10 en bestemt funktion, der under de givne betingelser er et krav for normal vækst af værten.

Når en værtsbakterie med en mutation, en deletion eller en anden defekt i et gen, der koder for en funktion, der under de givne betingelser er nødvendig for normal vækst af værten, trans-15 formeres med f.eks. et plasmid, der indeholder et gen, der koder for denne funktion, vil kun sådanne celler, der er transformeret med og bevarer plasmidet, overleve, fordi værtskravet kun i sådanne celler suppleres af plasmidet. Permanent plasmidbevaring sikres imidlertid kun, hvis overførsel af genetisk information 20 fra plasmid til kromosom ikke kan finde sted, og hvis graden af spontan mutation af værtsbakterien til en mutant uden et sådant krav, er uden betydning.

Ifølge et første aspekt af den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en fremgangsmåde til stabilisering af extra-25 kromosomale elementer i en værtsbakterie under dyrkning, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der i det extra-kromosomale element indføres en DNA-sekvens, der koder for D,L-alaninrace-mase, og at det extra-kromosomale element, der indeholder nævnte DNA-sekvens, transformeres i værtsbakterien, idet der anvendes en 30 værtsbakterie med en defekt i det kromosomale dal gen for D,L-alaninracemase. Kravet forårsaget af den kromosomale gendefekt i værtsbakterien undertrykkes herved af det extra-kromosomale element og tab af det extra-kromosomale element under dyrkningen er uden betydning.

35 Som anvendt her betyder udtrykket "extra-kromosomale elementer" plasmider, bakteriophager eller ethvert genetisk materiale, der ikke normalt findes i værtsbakterien enten som selv 3

DK 159282 B

stændige molekyler eller integreret i kromosomet. Foretrukne extra-kromosomale elementer er plasmider, men der kan også anvendes bakteriophager eller andre vektorsystemer.

Ifølge et yderligere aspekt af den foreliggende opfin-5 delse tilvejebringes der en transformeret bakterie, der er ejendommelig ved, at den er afledt fra en værtsbakterie, der har en defekt i det kromosomale dal gen for D,L-alaninracemase, samt at den indeholder et extra-kromosomalt element, der indeholder en DNA-sekvens, der koder for D,L-alaninracemase.

10 Den foreliggende opfindelse tilvejebringer desuden en fremgangsmåde til fremstilling af ønskede produkter (f.eks. DNA, RNA, peptider eller proteiner) i transformerede bakterier, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en bakterie, der har en defekt i det kromosomale dal gen og indeholder et extra-kromo-15 somalt element, der indeholder en DNA-sekvens, der koder for D,L-alaninracemase, samt en DNA-sekvens, der koder for det ønskede produkt, dyrkes i et egnet dyrkningsmedium, hvorpå det ønskede produkt udvindes fra dyrkningsmediet.

Egnede værtsbakterier hører til Bacillus- eller 20 Enterobacteriaceae-arter, f.eks. Bacillus subtilis og Escherichia coli, skønt andre egnede bakterier vil være indlysende for fagmanden.

I beskrivelsen anvendes følgende udtryk: dal gen: genet for D,L-alaninracemase 25 dal+ gen: et funktionelt gen (vildtype) for D,L- alaninracemase dal-1 gen: et gen med en mutation i D,L-alaninracemasegenet, der normalt bevirker krav for eksternt D-alanin dal vært: en vært med en mutation i dal genet (der normalt 30 kræver ekstern tilførsel af D-alanin for vækst dal+ vært: en vært med et vildtype dal gen “j**

Dal vært: en vært uden krav for eksternt D-alanin

Dal vært: en vært med krav for eksternt D-alanin

R

Cam : chloramphenicolresistens 35 Kan : kanamycinresistens

AmpR; ampicillinresistens

o R

bla: gen for beta-lactamase, der forårsager Amp 4

DK 159282 B

cat: gen for chloramphenicolacetyltransferase, der forårsager Cam amyM: gen for en maltogen amylase 5 For de fleste bakterier afhænger evnen til at vokse og dele sig af en velbevaret celleafgrænsning (d.v.s. cellemembraner, cellevægge og beslægtede strukturer). Sprængning eller nedbrydning af celleafgrænsningen fører sædvanligvis til opløsning eller ophøring af vækst.

10 En af de komponenter, der er nødvendige for en stabil celleafgrænsning i Bacillus subtilis og i de fleste andre bakterier, er D-alanin. D-alanin er en essentiel del af cellevæggen, i hvilken den tjener til at tværbinde polysaccharidkæder og således giver cellen den nødvendige stivhed. D-alanin findes ikke i de 15 fleste sædvanlige vækstmedier, og mange bakterier omfattende B. subtilis og E. coli syntetiserer denne aminosyre ud fra L-alanin ved hjælp af enzymet D,L-alaninracemase og kræver ikke en ekstern kilde for D-alanin for vækst. Nogle mutanter behøver en ekstern tilførsel af D-alanin for vækst, f.eks. dal-1 mutanter af B.

20 subtilis, i hvilke D,L-alaninracemasegenet er blevet beskadiget på grund af mutationen (Freese et al., Proc.Natl.Acad.Sci.

51:1164 - 72, 1964 og Dul et al., J.Bacteriol. 15: 1212-14, 1973).

Ifølge den foreliggende opfindelse er det blevet vist, 25 at plasmider, der indeholder et funktionelt gen for D,L-alanin-racemase sikrer deres bevarelse i en dal vært, hvis dal+ genet ikke kan overføres fra plasmid til kromosom, og hvis hyppigheden af spontan mutation af værten til en Dal+ phenotype er uden betydning, samt hvis eksternt D-alanin ikke er tilgængeligt for 30 cellen.

Ved indsætning af et gen for et ønsket produkt i et passende dal+ plasmid og dyrkning af plasmidet i en passende dal-vært, vil således dal+ plasmidet bevares i cellepopulationen under vækst, hvorved der sikres høje udbytter af det ønskede pro-35 dukt, der udtrykkes under den autonome replikation af plasmidet.

Da D-alanin ikke findes i mange sædvanlige vækstmedier, lægges der ingen restriktioner på dyrkningsmediet.

5

DK 159282 B

Den foreliggende opfindelsen tilvejebringer således en bekvem metode til stabilisering af extra-kromosomale elementer, der bærer gener for ønskede produkter, under dyrkningen.

For at sikre at graden af spontan mutation af 5 værtsorganismen til en Dal+ phenotype er insignifikant, kan det være nødvendigt at fjerne en del af dal genet. Ved kombination af en sådan vært, der indeholder en deletion af en del af dal genet + + nødvendigt for udtrykkelse af Dal phenotypen, med et dal plasmid, der indeholder hele dal+ genet og segmenter, der er homologe 10 til det DNA, der flankerer begge sider af deletionen på kromosomet, kan overførsel af dal+ allelet fra plasmid til kromosom finde sted ved homolog overkrydsning. For at undgå en sådan homolog overkrydsning blev der konstrueret en vært, i hvilken dal deletionen fortsatte ind i segmenter, der flankerer dal genet på 15 kromosomet. Der blev også konstrueret et plasmid, der indeholdt et funktionelt dal+ gen, men ikke DNA homologt til det DNA, der flankerer begge sider af deletionen på kromosomet. Kombinationen af dette plasmid med den førnævnte dal vært udgør det foretrukne vært-vektor-p ar.

20 Som et alternativ kan dal* allel overførsel undgås ved anvendelse af en rekombinantdeficient vært eller ved at anvende et extra-kromosomalt dal+ gen,.der har ingen eller ringe DNA-homologi med værtsbakteriens kromosom, dal genet fas fortrinsvis fra en B. subtilis stamme som forklaret i yderligere detaljer i 25 det følgende.. Foruden dal+ genet bør plasmidet også indeholde en sekvens for plasmidreplikation, f.eks. replikationsfunktioner fra højkopiplasmidet pUBllO for replikation i Bacillae eller andre grampositive bakterier eller replikationsfunktionen fra pBR322 for replikation i Enterobacteriaceae eller andre gram-negative 30 bakterier.

Produktion af et ønsket produkt ifølge den foreliggende opfindelse vil blive illustreret ved produktion af en maltogen amylase fra en Bacillus stamme (NCIB 11837) udtrykt ved dens egen promoter. Andre eksempler på ønskede produkter, der kan fremstil-35 les ifølge den foreliggende opfindelse, er andre amylaser, amylo-glycosidaser, pullulanaser, proteaser, lipaser, hormoner og andre slags enzymer eller'eukaryote proteiner og peptider.

6

DK 159282 B

Opfindelsen vil blive forklaret yderligere under henvisning til tegningen, på hvilken fig. 1 viser konstruktion af plasmiderne pDN691, pDN770, pDN820 og pDNl050, 5 fig. 2 viser konstruktionen af pDN1122, fig. 3 viser konstruktionen af plasmiderne pDN1090, pDNll20, pDNl222 og pDNl277 og et kort for restriktionsenzymsites på pDNlOOO, fig. 4 viser konstruktionen af plasmiderne pDNll30 og 10 pDNl290, fig. 5 viser konstruktionen af plasmid pDNl274, og fig. 6 viser konstruktionen af plasmid pDNl800.

dal+ genet blev opnået fra DN497, der er et derivat af 15 Bacillus subtilis 168 (Spizizen, Proc.Natl.Acad.Sci. 44, 1072 -78, 1958). Kromosomal DNA blev fuldstændig fordøjet med passende restriktionsenzymer og splejset med et plasmid pDN691, der udviser resistens overfor chloramphenicol og kanamycin og er i stand til at replikere i B. subtilis. Det splejsede DNA blev overført i 20 en D-alaninkrævende B. subtilis dal-1, idet der selekteres for komplementeringen af D-alaninkravet. En Dal+ transformant, der

O

samtidig er blevet Cam (chloramphenicolresistent) indeholdt et rekombinant plasmid afledt fra pDN691, på hvilket Dal+- og CamR-pheriotyperne er forbundet. Sandsynligvis på grund af homolog 25 rekombination mellem kromosom og plasmid kunne kun ubetydelige mængder af plasmidet påvises i transformanten.

Den foreliggende opfindelse tillader dyrkning af transformerede bakterier.i antibiotikafri medier. Det er imidlertid underforstået, at dette ikke er en betingelse for opfindelsens 30 gennemførlighed kun en konsekvens deraf. Hvis det skulle blive nyttigt eller foretrukket at dyrke de transformerede bakterier ifølge opfindelsen i nærvær af antibiotika, kan dette naturligvis gøres.

For at undgå rekombination og efterfølgende integration 35 af plasmidet i kromosomet blev plasmid fremstillet fra denne Dal+ R — og Cam transformant og transformeret ind i en stamme DN733 dal recE , der kræver D-alanin og ikke har tilbøjelighed til rekom- 7

DK 159282 B

bination, idet der selekteredes for Dal+. Transformanterne blev “I* R R

samtidig Dal Cam og Kan (kanamycinresistente). recE-genet er et gen, der .er til stede i normale B. subtilis stammer. Det udtrykker et enzym, der tillader genetisk rekombination mellem 5 homologe (dvs. ens eller næsten ens) DNA-sekvenser. (Dubnau D. et al., J.Bacteriol. 117 (1974), 488 - 493).

Transformanterne in.deholdt en lille mængde af et plasmid på ca. 16 kb. Fra dette plasmid blev et 2,0 kb Clal-Sphl-fragment, der udviser en Dal+ phenotype klonet på et 2,6 kb 10 fragment på plasmid pDN820: Cam i stamme DN608: dal , idet der selekteres for Cam Dal , hvorved der blev opnået et rekombinant plasmid pDNlOOO på 4,6 kb. Dette plasmid kunne imidlertid erstat-te dal-1 mutationen på kromosomet af .rekombinationsdygtige stammer (f.eks. DN608) med dal+ allelet ved homolog rekombination, 15 hvorpå selekteringen af en Dal phenotype uden samtidig Cam selektering ikke mere vil sikre bevarelsen af plasmidet.

For at forebygge overførsel af dal+ allelet til kromosomet ved homolog rekombination og efterfølgende tab af plasmid og for at formindske frekvensen af mutationer, der forårsager en 20 Dal+ phenotype, blev der udført en deletion i både dal genet i værten og i et nabostillet segment i værtskromosomet: det klonede dal gen blev skåret med restriktionsenzymer EcoRl og EcoR5 og derpå fordøjet med exonuclease Bal31. Den fordøjede blanding blev

splejset og transformeret ind i DN608 dal , idet der blev selek-R

25 teret for Cam . Transformanter, der indeholdt plasmider med dele- _ tioner i dal genet, blev identificeret som Dal Cam . For at konstruere en værtsstamme med den passende deletion i dal genet, blev en dal+ vært transformeret med en af deletionsplasmiderne, R _ p pDN1274 Cam dal . Idet der selekteredes for Cam , var ca. 0,1% 30 af transformanterne Dal- antagelig på grund af erstatningen af det kromosomale dal+ gen med dal deletionen fra pDNl274 ved homolog rekombination. Efter spontant tab af pDNl274 under dyrkningen i nærværelse af D-alanin og i fravær af chloramphenicol forblev den plasmidfrie stamme DN1280 Dal-. Southern blotting 35 analyse af chromosomal DNA fra DN1280 viste, at den faktisk indeholdt den forventede dal deletion. Denne dal- deletionsvært, stamme DN1280, blev transformeret med et dal+ plasmid (f.eks.

8

DK 159282 B

pDNl090), der indeholder både hele dal+.genet og segmenter homologe til det DNA, der flankerer begge sider af deletionen på kromosomet. Overførsel af dal+ genet fra plasmid til kromosom ved homolog rekombination kunne derfor finde sted, og værten kunne *Φ* o 5 omdannes i dal . Bevarelse af plasmidet var saledes ikke længere en betingelse for en Dal+ phenotype, og plasmidet blev hyppigt tabt. Et dal plasmid pDN1277, indeholdende hele det funktionelle dal+ gen, men ikke DNA homologt til det DNA, der flankerer deletionen i værtskromosomet som forklaret ovenfor, blev derpå kon-10 strueret. Overførsel af dal+ fra plasmid til kromosom ved homolog rekombination kunne følgelig ikke finde sted efter transformation af dal deletionsværten ved pDNl277. DN1280 er således en velegnet dal vært i D-alaninfrie medier for dal plasmider, der ikke indeholder DNA omfattende EcoR5 sitet, der normalt flankerer dal 15 genet på kromosomet, men som er blevet fjernet i DN1280.

For at sikre, at klonede gener af videnskabelig eller kommerciel interesse, virkelig kan bevares på plasmider i D-alaninfrie medier ved hjælp af det ovennævnte værtsvektorsystem, blev genet for den maltogene amylase fra Bacillus C599 (NCIB 20 11837) overført til et dal+ plasmid. To plasmider pDNH30 og pDNl290 blev konstrueret. Begge plasmider indeholder replika-tionsfunktionerne fra plasmid pUBlllO og funktionelle dal og amyM gener. Ingen af plasmiderne udviser resistens mod nogen antibiotika. Plasmiderne pDNH30 og pDNl290 blev transformeret i den 25 ovennævnte B. subtilis stamme DN1280. Stamme DN1280 indeholder som nævnt ovenfor en kromosomal deletion, der omfatter både en del af dal genet nødvendig for udtrykkelse af Dal+ phenotypen og et tilstødende segment, der ikke kræves for Dal+ phenotypen, hvad enten det er en del af dal genet senso strictu eller ej. Denne 30 sidste del af deletionen er ikke indeholdt i pDN1290. Følgelig kan dal genet ikke overføres fra pDN1290 til kromosomet ved dobbelhomolog rekombination. Plasmid pDNH30 indeholder på den anden side både hele segmentet, der er fjernet på kromosomet, og tilstødende segmenter. Følgelig kan overførsel af dal+ genet fra 35 plasmid til kromosom og efterfølgende plasmidtab finde sted.

9 DK 159282 B

De opnåede transformerede stammer DN1297 (=DN1280 pDNll30) og DN1300 (=DN1280 pDNl290) blev testet for plasmidsta-bilitet under dyrkningen (jfr. eksempel 7). Under dyrkning af DN1297 skete der homolog overkrydsning, der gendannede dal'1' genet 5 på kromosomet, og både plasmidet og Amy+ phenotypen blev hyppigt tabt.

Ved dyrkning af DN1300 blev der ikke observeret noget tab af plasmid- Amy+ phenotype under dyrkningen i et medium uden D-alanin. Hvis der blev sat D-alanin til mediet, tabte cellerne 10 imidlertid ofte plasmidet og blev Amy Dal”. Stabil bevarelse af et plasmid, der indeholder et gen, der ikke hidrører fra værtsorganismen, af kommerciel interesse i antibiotikafrit medium blev således demonstreret.

For at demonstrere at plasmider også kan bevares i 15 gram-negative organismer ved undertrykkelse af et D-alaninkrav, blev dal genet fra B. subtilis klonet på et plasmid i en D-alaninkrævende Escherichia coli mutant og vist at kunne komplementere kravet.

Opfindelsen skal forklares yderligere ved hjælp af de 20 efterfølgende eksempler.

Fremstilling af plasmider og kromosomalt DNA og transformering af Bacillus subtilis og E. coli skete ifølge de følgende generelle procedurer. Fordøjelse med restriktionsenzymerne, Bal31 nucleasebehandling, oligo-DNA-linker indføring og splejs-25 ning med T4-ligase af DNA blev udført med enzymer fra New England Biolabs under de af forhandlerne anbefalede betingelser.

Stammer

Alle stammer var derivater af Bacillus subtilis 168 30 (Spizizen, Proc.Natl.Acad.Sci., 44: 1072-78, 1958) RUB200: aroI906, amyE07, amyR2 blev opnået fra Dr. Frank Young,

University of Rochester, New York. SL438:trpC2 (sporulerings- og protease-deficient) blev opnået fra Dr. Kim Hardy, Biogen, 4"

Geneve. DN497: amyE07, amyR2 er en aro transformant af RUB200 35 med kromosomal DNA fra SL438, QB1133: aroI906, metB5, sacA321, amyE var fra Dr. Georges Rapoport, IRBM, Paris. QB1130: dal, metB5, sacA331, amyE' blev opnået fra Bacillus Genetic Stock 10

DK 159282 B

Centret, Columbus, Ohio. DN608: dal-1, metB, sacA, amyE var en aro+, dal-1 transformant af QB1133 med kromosomal DNA fra QB1130.

MT120: leuB6, recE4 r m blev opnået fra Dr. Teruo Tanaka, - -----— mm

Mitsubishi-Kasei Institute of Life Sciences, Tokyo. DN773: dal-1, 5 amyE, recE, sacA var en met+ recE transformant af DN608 med kromosomal DNA fra MT120. DN606 er DN608 transformeret med plasmid pUBllO.

Escherichia coli stamme TKL10: thr-1 leuB6 codAl trp64 pyrFlOl his-108 thyA6 argG66 ilvA634 thi-1 alr-1 deoCl lacYl 10 tonA21 tsx95 supE44 (Wijsman, Genet.Res., Camb. 20: 269-77, 1972) blev opnået fra Dr. Barbara Bachmann E. coli Genetic Stock Center Connecticut, U.S.A. (CGSC 5466).

Plasmider 15 pUC9 på 2,7 kb udviser resistens mod ampicillin og blev _ opnået fra pBR322 (Vieira et al., Gene 19: 259 - 68, 1982) pBR322 på 4,4 kb udviser resistens mod ampicillin og tetracyclin (Bolivar et al., Gene 2: 95 - 113, 1977).

Plasmider pUBllO og pBD64 (Gryczan et al., J.

20 Bacteriol. 134: 318 - 329, 1978, og Gryczan et al., J. Bacteriol. 141: 246 - 53, 1980) blev henholdsvis isoleret fra B. subtilis stamme BD366 og BD624. pUBllO og pBD64-udviser begge resistens mod kanamycin og pBD64 også mod chloramphenicol. B. subtilis stammer BD366 og BD624 kan fås fra Bacillus Genetic Stock Center, 25 Columbus, Ohio, USA (stamme nr. BGSC 1E6 og 1E22). Plasmid pDN452 på 7,6 kb udvoser resistens mod chloramphenicol og kanamycin og indeholder det strukturelle gen for en maltogen amylase fra Bacillus subtilis NCIB 11837. Konstruktionen af pDN452 er beskrevet i publiceret EP patent ansøgning nr. 120.693.

30 I._Transformering af B. subtilis

Kompetente Bacillus subtilis celler blev fremstillet ifølge Yasbin et al (J. Bacteriol. 21: 296 - 304, 1975). Cellerne blev derpå høstet ved centrifugering(7000 rpm, 3 min.), resuspen-35 deret i 1/10 rumfang af supernatanten indeholdende 20% glycerol, frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -70°C. Til transformering blev frosne celler optøet ved 42°C og blandet med 1 rum- 11

DK 159282 B

fang puffer (Spizizen's minimal medium (Spizizen, Proc.Natl.Acad. Sci. USA 44: 1072 - 78, 1958)) med 0,4% glucose, 0,04 M MgCl2 og 0,002 m EGTA). DNA blev tilsat, og blandingen blev inkuberet under omrystning ved 37°C i 20 minutter. Cellerne blev derpå 5 udspredt på egnede selekteringsmedier.

II. _Transformering af E. coli

En kultur af E. coli K-12 stamme nr. 802, der var opbevaret natten over i LB (10 g Bactotrypton, 5 g Bacto gærekstrakt 10 og 10 g NaCl per liter vand, pH 7,0) blev fortyndet 100 gange i 5 00 ml LB og dyrket ved 3 7°C til OD^q = 0,4. Kulturen blev afkølet, anbragt 15 minutter på is, centrifugeret i 15 minutter ved 3000 rpm (i en Sorvall GS3 rotor), resuspenderet i 200 ml kold 0,1 M CaCl2, anbragt på is i 20 minutter, centrifugeret i 10 15 minutter ved 3000 rpm, resuspenderet i 5 ml kold 0,1 M CaCl2 °9 anbragt på is i 20 timer. Derpå blev der tilsat kold glycerol til et indhold på 10%, og prøver blev frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -70°C. Frosne celler blev optøet på is, DNA blev tilsat, blandingen blev inkuberet i 45 minutter på is, i 2 minut-20 ter ved 37°C og blev derpå udspredt på et egnet selektionsmedium.

III. _Fremstilling af plasmider fra E. coli E. coli blev dyrket natten Over i 250 ml LB, 0,4% glucose og et passende antibiotikum. Cellerne blev høstet ved 25 centrifugering og resuspenderet i 4 ml puffer 1 (0,025 M Tris-HCl, pH = 8,0, 0,01 M EDTA, 0,05 M glucose, 2 mg/ml lysozym). Suspensionen blev inkuberet ved 0°C i 15 minutter og derpå blandet med 8 ml puffer 2 (0,2 M NaOH, 1% SDS). Derpå blev der tilsat 6 ml puffer 3 (3M NaAcetat, pH = 4,8), og blandingen blev holdt 30 ved 0°C i 60 minutter efterfulgt af centrifugering i 20 minutter ved 19000 rpm (ca. 45000 g i Sorvall SS34 rotor). Supernatanten blev udfældet med 0,6 rumfang kold isopropanol og resuspenderet i 1,2 ml 5TE (0,05 M Tris-HCl, pH = 8,0, 0,005 M EDTA), plus 20 μΐ kogt RNase A (Boehringer) (2 mg/ml). 30 minutter senere blev 35 opløsningen udspredt på toppen af 4,0 ml puffer 4 (80 g CsCl plus 56 ml 5TE) og 0,1 ml EtBr (10 mg/ml ethidium bromid) i et VTi65

DK 159282 B

12 rør. Blandingen blev derpå centrifugeret ved 45000 rpm i 20 timer. Plasmid blev derpå fjernet fra røret, dialyseret og ekstraheret som beskrevet i sektion VI.

5 IV._Fremstilling af plasmider fra B. subtilis

Plasmiderne blev fremstillet som beskrevet for E. coli stammer (se sektion III), men med følgende modifikationer. Dyrkning blev foretaget i LB indholdende 0,01 M kaliumphosphat, pH = 7,0 og et passende antibiotikum (f.eks. 6 μg/ml chloramphenicol) 10 og hvis krævet 100 μg/ml D-alanin. Efter høst blev cellerne inkuberet ved 37°C med lysozym. Puffer 2 blev erstattet af en blanding af et rumfang puffer 2 og tre rumfang puffer 5 (0,2 M glycin, 0,2 M NaCl og 1% SDS). De følgende trin var de samme som i III.

15 V. _Fremstilling i lille skala af plasmider fra B. subtilis

Plasmid fra 5 ml B. subtilis i LB (indeholdende 0,01 M phosphat pH = 7,0 og passende antibiotika og D-alanin hvis krævet) blev fremstillet som beskrevet i sektion IV med undtagelse 20 af, at 1: puffernes rumfang blev reduceret fire gange, 2: 0,5 ml phenol og 0,5 ml chloroform blev tilsat efter puffer 3, 3: efter centrifugering ved 19000 rpm, blev supernatanten udfældet med ethanol, resuspenderet i 400 μΐ puffer 6 (0,05 M Tris-HCl pH = 8,0, 0,1 M NaAcetat), plasmidet blev igen udfældet, resuspenderet 25 i 400 μΐ puffer 6, udfældet, vasket og resuspenderet i 100 μΐ TE (0,01 M Tris- HCl, pH = 8,0, 0,001 M EDTA) med 1 μg/ml kogt RNase A (Boehringer).

VI. Fremstilling af kromosomalt DNA fra B. subtilis 30 En pille af frosne celler fra ca. 50 ml kultur blev

resuspenderet i 1,1 ml puffer (0,05 M Tris-HCl, pH = 7,4, 0,1 M NaCl, 25% sucrose). 100 μΐ lyzosym (25 mg/ml) og 150 μΐ EDTA (0,5 M, pH = 8,0) blev tilsat. Blandingen blev inkuberet ved 37°C i 30 minutter, og 2 ml 0,2% SDS blev tilsat efterfulgt af inkubering i 35 30 minutter ved 37°C. 1 g CsCl og 0,05 ml EtBr (10 mg/ml) blev tilsat per 0,95 ml blanding, og blandingen blev centrifugeret ved 45000 rpm ved 15°C i 20 timer i en VTi65 rotor (Beckman). DNA

DK 159282 B

13 blev lokaliseret under en langbølge UV lampe og fjernet ved punktering af røret med en nål. EtBr blev ekstraheret med isopro-panol, og opløsningen blev dialyseret i 2 timer mod TEE (0,01 M Tris-HCl, pH = 8,0, 0,01 M EDTA). Opløsningen blev derpå indstil-5 let til 8 ml med TEE og ekstraheret to gange med phenol og en gang chloroform. DNA blev udfældet med 0,1 M NaCl og kold ethanol og opløst i 1 ml TE (0,01 M Tris-HCl, pH = 8,0, 0.001 M EDTA). Opløsningen af kromosomalt DNA blev opbevaret ved 4°C.

10 Eksempel 1

Konstruktion af plasmid pDNl050 (fig. 1)

Plasmid pBD64 blev skåret med restriktionsenzymer EcoRl og Sphl, og et 3,6 kb fragment blev splejset til et 0,56 kb EcoRl-Sphl fragment fra E. coli plasmid pBR322. Det fremkomne 15 plasmid pDN691 på 4,2 kb udviste chloramphenicol- og kanamycin-resistens. Et 0,4 kb Hind3-BamHl fragment af pDN691 blev erstattet med et 0,02 kb Hind3-BamHl fragment fra E. coli plasmid pUC9. Det fremkomne plasmid pDN720 på 3,8 kb udviste chloramphenicol-og kanamycinresistens.

20 Et 2,8 kb Ncol-Ncol-fragment af pDN720 blev erstattet med et 1,8 kb Ncol-Ncol-fragment fra pDN770.'pDN770 på 3,6 kb var en spontant deletion af pBD64 og udviste chloramphenicolresi-stens. Det fremkomne plasmid pDN820 på 2,8 kb udviser chlor-amphenicolresistens. pDN820 blev åbnet ved det enkelte HgiAl site 25 og fordøjet med Bal31 i 30 sekunder ved 30°C, hvorved der blev fjernet et fragment på 0,1 kb. De opnåede lineære fragmenter blev splejset med en Bgl2 oligonucleotidlinker fra New England Nuclear (nr. 1001). Plasmid pDNl050 på 2,7 kb indeholdende en Bgl2 linker og udvisende chloramphenicolresistens blev isoleret 30 fra ligeringsblandingen.

Eksempel 2

Konstruktion af plasmid pDN1122 (fig. 2)

Plasmid pDN452 på 7,6 kb og udvisende chloramphenicol-35 og kanamycinresistens og indeholdende det strukturelle gen amyM for en maltogen amylase fra Bacillus C599 blev fordøjet med Aval, behandlet med exonuclease Bal31, splejset med EcoRl oligonucleo- 14

DK 159282 B

tidlinker (Biolab nr. 1004), fordøjet med EcoRl, splejset med T4-ligase og transformeret i B. subtilis DN497;amyE, idet der R + blev selekteret for Cam . En Amy transformant indeholdt plasmid p520-20 på 6,6 kb. Amylaseudbyttet fra p520-20 var ikke mindre 5 end udbyttet fra pDN452.

Et 2,7 kb Ncol-Ncol fragment fra p520-20 blev derpå erstattet med et 1,7 kb Ncol-Ncol fragment fra pDN770 (fremstil- ; let som i eksempel 1). Det opnåede plasmid pDN808 på 5,6 kb indeholdt amyM og udviste resistens mod chloramphenicol.

10 Et 2,6 kb EcoRl-Sphl-fragment fra pDN808 blev erstattet med et 2,4 EcoRl-Sphl-fragment fra pDN1050 (fremstillet som beskrevet i eksempel 1). Det fremkomne plasmid pDNH22 på 5,4 kb indeholdt amyM og udviste resistens mod chloramphenicol.

15 Eksempel 3

Kloning af dal genet

Ca. 3 μg kromosomal DNA fra B. subtilis stamme DN497 og R R

1 μΘ plasmid pDN691 Cam Kan blev fuldstændig fordøjet med restriktionsenzymer BamHl og Sphl. Kromosomal og plasmid DNA blev 20 blandet og splejset med T4-ligase og transformeret i stamme “ R + DN606;dal pUB110:Kan . Blandt ca. 200 Dal transformanter var en R + samtidig blevet Cam som en indikation af, at Dal phenotypen var forbundet til et rekombinant plasmid afledt fra pDN691. Plasmider T5 blev fremstillet fra denne Dal Cam transformant og transforme-25 ret ind i stammen DN773 dal recE-, idet der blev selekteret for Dal . Dal transformanter blev samtidig Cam og Kan . Resistensen mod kanamycin er indbygget i kloningsvektoren pDN691. Denne påvirkes ikke af kloningen af dal genet, således at rekombinant-plasmidet, der transformeres ind i DN733 er Dal Cam Kan .

30 Transformanterne indeholdt kun en meget lille mængde af et plasmid på ca. 16 kb.

Fra dette plasmid blev et 2,0 kb Clal-Sphl-fragment, der udviste en Dal+ phenotype, klonet i Clal og Sphl sitet i plasmid pDN820 i stamme DN608;dal til dannelse af et rekombinant 35 plasmid, pDNlOOO på 4,6 kb.

15

DK 159282 B

Et kort for restriktionsenzymsites på pDNlOOO er vist i fig. 3. Den transformerede stamme DN1000=DN608 pDNlOOO er blevet deponeret ved The National Collection of Industrial Bacteria (NCIB), Torry Research Station, Aberdeen, Scotland, d. 7. decem-5 ber 1984 og fik referencenummeret NCIB 12029.

NCIB, der er et internationalt deponeringsinstitut anerkendt af Budapest traktaten af 1977, sikrer permanensen af depotet og offentlighedens adgang dertil ifølge regel 9 og 11 i denne traktat.

10 De følgende iagttagelser beviser, at det klonede kromo somale fragment virkelig indeholdt dal genet (som defineret ved dal-1 mutationen) og ikke et andet gen, der er i stand til at undertrykke D-alaninkravet: 1: Lineariseret (ikke-replikativ) plasmid overførte 15 en dal modtager til Dal , men ikke til Cam som en indikation af homolog rekombination mellem dal genet på kromosomet og det klonede kromosomale fragment.

2: Ca. 0,2% af plasmider fremstillet fra en værtsbak- 20 terie, der er dal-1 på kromosomet, var dal (dog med et restriktionsenzymmønster, der ikke kunne skelnes fra det oprindelige dal+ plasmid). Disse dal plasmider kunne ikke komplementere den kromosomale dal-1 mutation som en indikation af, at den kromosomale mutation var blevet overført til dal plasmider ved homolog 25 rekombination.

3: Ved Southern blotting analyse af kromosomalt B.

subtilis DNA blev det demonstreret, at et kromosomalt Clal-Sphl-fragment hybridiserede med et fragment af samme størrelse fra 30 pDNlOOO. Der skete således ikke nogen væsentlig omarrangering af dal genet før dets kloning på pDNlOOO.

16

DK 159282 B

Eksempel 4

Konstruktion af plasmid pDNll30 (fig. 3 og 4) pDNlOOO (fra eksempel 3) indeholdende dal+ genet blev åbnet ved Clal-sitet, fordøjet med exonuclease Bal31 og splejset 5 med en BamHl oligonucleotidlinker (nr. 1017 fra Biolabs). Det fremkomne plasmid pDN1090 indeholdt dal+ genet og udviste chlor-•amphenicolresistens.

pDN1122 (fra eksempel 2) blev skåret med Sphl og Bgl2, og et 4,4 kb fragment blev splejset med et 2,0 kb Sphl-BamHl 10 fragment fra pDN1090.

• + +

Det fremkomne plasmid pDNll30 indeholdt amyM og dal genet, men udviste ikke resistens mod chloramphenicol.

Eksempel 5 15 Konstruktion af plasmid pDNl290 (fig. 3 og 4) " " “..... ' ' + £

Plasmid pDNlllO dal Cam på 4,5 kb blev konstrueret ved exonuclease Bal31 fordøjelse af pDNlOOO fordøjet med Sphl og indføring af både en Bgl2 og en Sacl oligonucleotidlinker (henholdsvis nr. 1001 og nr. 1005 fra Biolabs).

20 pDNlllO blev åbnet ved det enkelte EcoR5 site, exo nuclease fordøjet med Bal31 og splejset med to Bgl2 oligonu-cleotidlinkere (nr. 1001 fra Biolabs). Fusionen af linker med en plasmidende dannede et Bell site. Det fremkomne plasmid pDNl222 indeholdt dal+ genet og udviste chloramphenicolresistens.

25 Et 0,7 kb Bcll-Bcll-fragment fra pDNl222 blev splejset med et 3,5 kb BamHl-Bcll fragment fra pDNl090 (fra eksempel 4).

Det fremkomne plasmid pDNl277 på 4,2 kb indeholdt dal+ genet og udviste chlormaphenicolresistens. Plasmid pDNl277 blev transformeret ind i stamme DN1280 (se eksempel 6) og den fremkomne stamme 30 DN1517 (=DN1280 pDNl277) blev deponeret ved National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen,

Scotland, d. 7. december 1984 og fik referencenummeret NCIB 12030.

pDNl090 blev yderligere omdannet til plasmid pDN1120 35 dal Cam på 4,5 kb ved erstatning af et 2,6 kb Sphl-BamHl-frag-ment med et 2,5 kb Sphl-BamHl-fragment fra pDN1050 (fremstillet som beskrevet i eksempel 1).

17

DK 159282 B

+ R

PDN1265 amyM Cam blev konstrueret ved Bal31 exo-nucleasefordøjelse af pDNll20 fordøjet med EcoR5 og efterfølgende fordøjelse med Sphl. Et fragment på 2,9 kb blev derpå splejset med Sacl oligonucleotidlinker (Biolabs nr. 1005) og et 2,9 kb 5 fragment fra pDNll30 opnået ved fordøjelse med EcoRl og Bal31 exonucleasebehandling og påfølgende fordøjelse med Sphl.

Det fremkomne plasmid pDN1265 på 5,8 kb indeholdt amyM+ genet og udviste chloramphenicolresistens.

pDN1265 blev derpå skåret med Sphl-Bgl2, og et 4,7 kb 10 fragment blev splejset med et 1,6 kb Sphl-Bgl2 fragment fra PDN1277.

Det fremkomne plasmid pDNl290 på ca. 6,3 kb indeholdt amyM'1' og dal+ genet, men ikke nogen antibiotisk resistensmarkør.

15 Eksempel 6

Konstruktion af en vært med en deletion i dal genet (fig. 5)

Ved skæring af 5 μg af pDNl090 i det klonede dal+ gen med restriktionsenzymer EcoRl og EcoR5 og påfølgende fordøjelse af fragmenterne med exonuclease Bal31 i 60 sekunder, splejsning 20 og transformering i DN608:dal-l, blev der iagttaget deletioner, 4· der ødelagde Dal phenotypen af plasmidet. Transformering af

R

stammen DN497 med et af disse deletionsplasmider pDNl274 Cam _ R

dal og selektering for Cam gav ca. 0,1% transformanter, der var

Dal , antagelig på grund af erstatning af det kromosomale dal+ 25 gen med dal deletionen fra pDNl274. Efter spontant at have tabt R — pDNl274 blev transformanten Cam , men forblev Dal . Southern blotting analyse af kromosomal DNA af denne stamme DN1280 viste, at den virkelig indeholdt den forventede dal deletion. Frekvensen af mutationer, der kunne forårsage tilbageførsel af denne dal 30 deletionmutant til en Dal phenotype var mindre end 10 . DN1280 indeholdende plasmid pDNl277 = DN1517 (se eksempel 5) blev deponeret.

18

DK 159282 B

Eksempel 7

Stabilitet af dal+ amyM+ plasmider i en dal" vært

For at demonstrere både stabilitet af vært - plasmid kombinationen DN1300 (=DN1280 pDN1290) og betydningen af fravær 5 af overlappende kromosomale og plasmid DNA segmenter, der flankerer den kromosomale deletion, blev følgende eksperiment foretaget:

Enkelte kolonier af stammerne DN1297 (=DN1280 pDNll30) og DN1300 (=DN1280 pDNl290) blev resuspenderet i LB-medium sup-10 pieret med 10 mM kaliumphosphatpuffer pH = 7,0 og 0,2% glucose. Halvdelen af hver resuspension blev podet i det ovennævnte medium, den anden halvdel i identiske medier suppleret med 200 μg/ml D-alanin. Ved fortynding af kulturerne enten 100 eller 1000 gange blev stammerne dyrket et antal generationer ved 37°C under god 15 beluftning enten i nærvær eller fravær af D-alanin i mediet. For . 7 hver fortynding blev ikke mindre end 10 celler overført. Med et interval på 1 dag blev frekvensen af Amy+ kolonier (et total på ca. 100) testet på LB-medieplader med eller uden D-alanin ifølge vækstbetingelserne. Resultaterne er vist i tabel 1. 10 tilfældigt 20 valgte Amy kolonier viste sig ikke at indeholde noget plasmid.

19

DK 159282 B

Tabel 1

Frekvens af Amy celler efter vækst i LB medium med og uden D-alanin.

Generationer 5 Stammer Plasmid 51 68 85 __% Amy~ DN1297 PDN1130 2% 20% DN1297 + D-ala1 pDN1130 60% DN1300 PDN1290 0% 0% 0% 10 DN1300 + D-ala1 pDN1290 60% 90% 1 Første 20 generationer i fravær af D-alanin 15 De i tabel 1 viste resultater demonstrerer, at et plas mid pDNl290 er meget ustabilt under ikke-selektive betingelser {tilsætning af D-alanin til vækstmediet), men bliver stabil under vækst i et selektivt medium (uden tilsætning af D-alanin). Det er yderligere blevet demonstreret, at homolog dobbeloverkrydsning, 20 der gendanner dal+ genet på værtskromosomet, og efterfølgende plasmidtab ikke fandt sted i DN1300 (ingen Amy celler efter dyrkning i 85 generationer), hvorimod frekvensen af Amy~ celler var 20% efter 68 generationer af DN1297 dyrket i et D-alaninfrit medium, antagelig på grund af overførsel af dal+ genet fra plas-25 mid til kromosom og efterfølgende plasmidtab.

Eksempel 8

Konstruktion af plasmid pDN1800 (fig. 6) 30 pDNl284 blev konstrueret ved kombination af det 1,4 kb store Bgl2-Bgl2 fragment fra pDN1222 (se fig. 3) med det 1,5 kb store BamHl-Bgl2 fragment fra pDNl050 (se fig. 3).

Fra pDNl284 blev dal+ genet overført på et 1,4 kb Bgl2-Sall fragment til den klassiske E. coli plasmidvektor 35 pBR322, der blev skåret med BamHl og Sall. Rekombinantplasmidet pDNl800:Amp (ampicillinresistent) blev transformeret i E. coli stamme TKL10, idet der blev selekteret for AmpR, til opnåelse af 20

DK 159282 B

stamme DN1800:pDNl800. Stamme DN1800 blev deponeret ved NCIB d.

22. november 1985 og fik referencenummeret NCIB 12181. Permanen-cen af depotet og offentlighedens adgang hertil er således sikret (se ovenfor). TKL10 udviser en D-alaninkrævende phenotype ved 5 42°C, men kravet undertrykkes i DN1800. pDNl800, der indeholder dal genet fra B. subtilis, er således i stand til at komplementere D-alaninkravet i en E. coli stamme, der har en defekt i alaninracemaseaktiviteten (Wild et al., Molec.Gen.Genet. 198:315-22, 1985).

10

Claims

21 DK 159282 B 5

1. Fremgangsmåde til stabilisering af extra-kromoso-male elementer i en værtsbakterie under dyrkning kendetegnet ved, at der i det extra-kromosomale element indføres en DNA-sekvens, 10 der koder for D,L-alaninracemase, og at det extra-kromosomale element, der indeholder nævnte DNA-sekvens, transformeres i værtsbakterien, idet der anvendes en værtsbakterie med en defekt i det kromosomale dal gen for D,L-alaninracemase. - 15

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at værtsbakterien har en mutation i det kromosomale dal gen for D,L-alaninracemase, eller en deletion omfattende i det mindste en del af dal genet.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at mutationen er en deletion af både en del af dal genet, der er nødvendig for udtrykkelse af Dal+ phenotypen og en del af direkte flankerende DNA, der er unødvendig for udtrykkeisen af Dal+ phenotypen, hvad enten det er en del af dal genet eller ej. 25

4. Transformeret bakterie, kendetegnet ved, at den er afledt fra en værtsbakterie, der har en defekt i det kromosomale dal gen for D,L-alaninracemase, og at den indeholder et extra-kromosomalt element, der indeholder en DNA-sekvens, der koder for

30 D,L-alaninracemase.

5 Dal+ phenotypen, hvad enten det er en del af dal genet eller ej, og at den indeholder et extra-kromosomalt element indeholdende en DNA-sekvens, der koder for D,L-alaninracemase.

5. Transformeret bakterie ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den indeholder en mutation i det kromosomale dal gen for D,L-alaninracemase eller en deletion, der omfatter i det mindste 35 en del af dal genet. 22 DK 159282 B

6. Transformeret bakterie ifølge krav 5, kendetegnet ved, at den har en deletion af både en del af dal genet, der er nødvendig for udtrykkelse af Dal+ phenotypen, og af en del af direkte flankerende DNA, der er unødvendig for udtrykkelse af

7. Fremgangsmåde til fremstilling af et ønsket pro-10 dukt i transformerede bakterier, kendetegnet ved, at en bakterie, der har en defekt i det kromosomale dal gen for D,L-alaninrace-mase og indeholder et extra-kromosomalt element, der indeholder en DNA-sekvens, der koder for D,L-alaninracemase, samt en DNA-sekvens, der koder for det ønskede produkt, dyrkes i et egnet 15 dyrkningsmedium, hvorpå det ønskede produkt udvindes fra dyrkningsmediet .

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at værtsbakterien indeholder en mutation i det kromosomale dal gen 20 for D,L-alaninracemase eller en deletion, der omfatter i det mindste en del af dal genet.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at værtsbakterien har en deletion af både en del af dal genet, der 25 er nødvendig for udtrykkelse af Dal+ phenotype, og af en del af direkte flankerende DNA, der er unødvendig for udtrykkelse af Dal+ phenotype, hvad enten det er en del af dal genet eller ej, og at det extra-kromosomale element indeholder en DNA-sekvens, der koder for D,L-alaninracemase.