JPH0686681A - Ｐｈａ菌体内分解酵素 - Google Patents
Ｐｈａ菌体内分解酵素Info
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- JPH0686681A JPH0686681A JP4279099A JP27909992A JPH0686681A JP H0686681 A JPH0686681 A JP H0686681A JP 4279099 A JP4279099 A JP 4279099A JP 27909992 A JP27909992 A JP 27909992A JP H0686681 A JPH0686681 A JP H0686681A
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- pha
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 生分解性プラスチックとして期待され、微生
物が蓄積する脂肪族ポリエステルであるポリヒドロキシ
アルカノエート（ＰＨＡ）利用のため、ＰＨＡ菌体内分
解酵素の遺伝子を解明するとともにその酵素を単離・精
製し、その性質等を調べ、ＰＨＡの分解経路をはじめ、
その有効な阻害剤を見出す助けとする。 【構成】 微生物の染色体ＤＮＡからＰＨＡ菌体内分解
酵素遺伝子を単離・クローニングし、次に得られたＰＨ
Ａ分解活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの
塩基配列を決定する。配列の決定したＤＮＡ又はその断
片から組換え体ＤＮＡ、形質転換体、及び酵素の製造法
が提供される。 【効果】 微生物のＰＨＡ分解遺伝子を含むＤＮＡの塩
基配列を解析し、ＰＨＡ分解酵素を大量に得ることが出
来、ＰＨＡ分解酵素の性質を検討することが可能にな
り、ＰＨＡの産生効率の向上に役立てることが出来る。
物が蓄積する脂肪族ポリエステルであるポリヒドロキシ
アルカノエート（ＰＨＡ）利用のため、ＰＨＡ菌体内分
解酵素の遺伝子を解明するとともにその酵素を単離・精
製し、その性質等を調べ、ＰＨＡの分解経路をはじめ、
その有効な阻害剤を見出す助けとする。 【構成】 微生物の染色体ＤＮＡからＰＨＡ菌体内分解
酵素遺伝子を単離・クローニングし、次に得られたＰＨ
Ａ分解活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの
塩基配列を決定する。配列の決定したＤＮＡ又はその断
片から組換え体ＤＮＡ、形質転換体、及び酵素の製造法
が提供される。 【効果】 微生物のＰＨＡ分解遺伝子を含むＤＮＡの塩
基配列を解析し、ＰＨＡ分解酵素を大量に得ることが出
来、ＰＨＡ分解酵素の性質を検討することが可能にな
り、ＰＨＡの産生効率の向上に役立てることが出来る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ポリヒドロキシアルカ
ノエート（以下、ＰＨＡと略す）分解活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡとベクターＤ
ＮＡとよりなる組換え体ＤＮＡ、その組換え体ＤＮＡで
形質転換せしめられた形質転換体、及び該形質転換体を
利用したＰＨＡ菌体内分解酵素の製造法に関する。ま
た、こうして得られた分解酵素の性質を検討し、その有
効な阻害剤を見出し、それを培養液中に添加することに
より、ＰＨＡ産生効率を高められることが期待される。
同時にＰＨＡ菌体内分解酵素をコードするＤＮＡを用い
て、その欠損株を取得することも容易に行うことができ
る。本発明は、特にポリヒドロキシアルカノエートのう
ちポリ−３−ヒドロキシブチレート（以下、ＰＨＢと略
す）分解活性を有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ、そのＤＮＡとベクターＤＮＡとよりなる組換え体Ｄ
ＮＡ、その組換え体ＤＮＡで形質転換せしめられた形質
転換体、及び該形質転換体を利用したＰＨＡ菌体内分解
酵素の製造法に関する。
ノエート（以下、ＰＨＡと略す）分解活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡとベクターＤ
ＮＡとよりなる組換え体ＤＮＡ、その組換え体ＤＮＡで
形質転換せしめられた形質転換体、及び該形質転換体を
利用したＰＨＡ菌体内分解酵素の製造法に関する。ま
た、こうして得られた分解酵素の性質を検討し、その有
効な阻害剤を見出し、それを培養液中に添加することに
より、ＰＨＡ産生効率を高められることが期待される。
同時にＰＨＡ菌体内分解酵素をコードするＤＮＡを用い
て、その欠損株を取得することも容易に行うことができ
る。本発明は、特にポリヒドロキシアルカノエートのう
ちポリ−３−ヒドロキシブチレート（以下、ＰＨＢと略
す）分解活性を有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ、そのＤＮＡとベクターＤＮＡとよりなる組換え体Ｄ
ＮＡ、その組換え体ＤＮＡで形質転換せしめられた形質
転換体、及び該形質転換体を利用したＰＨＡ菌体内分解
酵素の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】ＰＨＡ
は微生物が細胞内封入体（ｉｎｃｕｌｕｓｉｏｎ ｂｏ
ｄｙ）として蓄積する脂肪族ポリエステルであり、環境
中に存在する微生物により容易に分解されることから生
分解性プラスチックとして期待されている。このＰＨＡ
を産生する微生物については様々な研究が成され、特に
生合成経路は比較的よく調べられているが、分解経路に
ついては不明な点が多く、ＰＨＡ菌体内分解酵素を単離
・精製しその性質等を調べるには至っていない。また、
ＰＨＡを菌体内に蓄積させる際この分解活性を抑えるこ
とにより、その産生効率の向上が期待される。
は微生物が細胞内封入体（ｉｎｃｕｌｕｓｉｏｎ ｂｏ
ｄｙ）として蓄積する脂肪族ポリエステルであり、環境
中に存在する微生物により容易に分解されることから生
分解性プラスチックとして期待されている。このＰＨＡ
を産生する微生物については様々な研究が成され、特に
生合成経路は比較的よく調べられているが、分解経路に
ついては不明な点が多く、ＰＨＡ菌体内分解酵素を単離
・精製しその性質等を調べるには至っていない。また、
ＰＨＡを菌体内に蓄積させる際この分解活性を抑えるこ
とにより、その産生効率の向上が期待される。
【０００３】このような状況のもとで、本発明者らは、
鋭意研究を行ない、その結果ＰＨＡのうちの一つである
ＰＨＢ産生微生物の一種であるズーグロエア・ラミゲラ
よりＰＨＢ菌体内分解酵素を遺伝子組換えの手法で単離
するとともに、その遺伝子を用いた組換えＤＮＡで形質
転換せしめたＰＨＢ菌体内分解酵素高生産性の組換え微
生物を取得した。本発明者らは更に研究を進め、前記組
換え手法で得られたＰＨＡのうちの一つであるＰＨＢ菌
体内分解に関与する遺伝子の塩基配列の決定を試みそれ
に成功すると共に、ＰＨＢ菌体内分解に直接関与する遺
伝子部分を特定化した。さらに本発明者らは、このよう
にして育種した組換え微生物がＰＨＢ菌体内分解酵素を
著量生産することを見出した。こうして、本発明者ら
は、ＰＨＢはＰＨＡのうちの一つであることからＰＨＡ
産生微生物の一種である微生物よりＰＨＡ菌体内分解酵
素を遺伝子組換えの手法で単離することができることを
認識するとともに、その遺伝子を用いた組換えＤＮＡで
形質転換せしめたＰＨＡ菌体内分解酵素高生産性の組換
え微生物を取得し得るとの考えに到達した。そしてＰＨ
Ａ菌体内分解に関与する遺伝子の塩基配列の決定をする
と共に、ＰＨＡ菌体内分解に直接関与する遺伝子部分を
特定化することが出来ること、さらにこのようにして育
種した組換え微生物がＰＨＡ菌体内分解酵素を著量生産
しうるものであるとの考えのもとに本発明を完成した。
鋭意研究を行ない、その結果ＰＨＡのうちの一つである
ＰＨＢ産生微生物の一種であるズーグロエア・ラミゲラ
よりＰＨＢ菌体内分解酵素を遺伝子組換えの手法で単離
するとともに、その遺伝子を用いた組換えＤＮＡで形質
転換せしめたＰＨＢ菌体内分解酵素高生産性の組換え微
生物を取得した。本発明者らは更に研究を進め、前記組
換え手法で得られたＰＨＡのうちの一つであるＰＨＢ菌
体内分解に関与する遺伝子の塩基配列の決定を試みそれ
に成功すると共に、ＰＨＢ菌体内分解に直接関与する遺
伝子部分を特定化した。さらに本発明者らは、このよう
にして育種した組換え微生物がＰＨＢ菌体内分解酵素を
著量生産することを見出した。こうして、本発明者ら
は、ＰＨＢはＰＨＡのうちの一つであることからＰＨＡ
産生微生物の一種である微生物よりＰＨＡ菌体内分解酵
素を遺伝子組換えの手法で単離することができることを
認識するとともに、その遺伝子を用いた組換えＤＮＡで
形質転換せしめたＰＨＡ菌体内分解酵素高生産性の組換
え微生物を取得し得るとの考えに到達した。そしてＰＨ
Ａ菌体内分解に関与する遺伝子の塩基配列の決定をする
と共に、ＰＨＡ菌体内分解に直接関与する遺伝子部分を
特定化することが出来ること、さらにこのようにして育
種した組換え微生物がＰＨＡ菌体内分解酵素を著量生産
しうるものであるとの考えのもとに本発明を完成した。
【０００４】即ち、本発明は、（１） ポリヒドロキシ
アルカノエート（ＰＨＡ）分解活性を有するポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ、（２） 上記（１）のＤＮＡを
ベクターに組み込んでなる組換え体ＤＮＡ、（３） 上
記（２）の組換え体ＤＮＡで形質転換せしめられた形質
転換体、（４） 上記（３）の形質転換体を培養し、得
られた組換え体からＰＨＡ菌体内分解酵素を採取するこ
とを特徴とするＰＨＡ菌体内分解酵素の製造法に関す
る。特に、本発明は、（５） 配列表の配列番号１に示
した塩基配列の第３９５番目から第１１５１番目に対応
して示したアミノ酸配列またはそれと実質的に同等の機
能を有するポリペプチドあるいは配列番号１に示した塩
基配列の第３１７３番目から第３９５６番目に対応して
示したアミノ酸配列またはそれと実質的に同等の機能を
有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、あるいは配列
表の配列番号１に示した塩基配列の第３９５番目から第
１１５１番目または第３１７３番目から第３９５６番目
あるいはそれらと実質的に同等の機能を有する塩基配列
を有するＤＮＡ、（６） 上記（５）のＤＮＡをベクタ
ーに組み込んでなる組換え体ＤＮＡ、（７） 上記
（６）の組換え体ＤＮＡで形質転換せしめられた形質転
換体、（８） 上記（７）の形質転換体を培養し、得ら
れた組換え体からＰＨＡ菌体内分解酵素を採取すること
を特徴とするＰＨＢ菌体内分解酵素の製造法に関する。
ここでポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）とは、
代表的にはヒドロキシアルカノエートモノマーにおける
炭素数３〜１２程度のものであり、例えばポリヒドロキ
シアルカノエートあるいはエステルが挙げられるほか、
ポリヒドロキシアルカノエートのホモポリマーのみでな
く、広くその共重合体、例えば３−ヒドロキシブチレー
トと炭素数３〜１２程度のその他のヒドロキシアルカノ
エートとの共重合体などをいうことができる。しかし、
これらに限定すること無く、本発明の目的の範囲内であ
れば広く当業者に知られたものを含んでいてよく、例え
ば、ポリ−３−ヒドロキシプロピオネート、ポリ−３−
ヒドロキシブチレート、ポリ−３−ヒドロキシバリレー
トおよびポリ−３−ヒドロキシオクタノエートなど、ポ
リ−４−ヒドロキシブチレートなどが好ましく、特にポ
リ−３−ヒドロキシブチレートが好ましい。
アルカノエート（ＰＨＡ）分解活性を有するポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ、（２） 上記（１）のＤＮＡを
ベクターに組み込んでなる組換え体ＤＮＡ、（３） 上
記（２）の組換え体ＤＮＡで形質転換せしめられた形質
転換体、（４） 上記（３）の形質転換体を培養し、得
られた組換え体からＰＨＡ菌体内分解酵素を採取するこ
とを特徴とするＰＨＡ菌体内分解酵素の製造法に関す
る。特に、本発明は、（５） 配列表の配列番号１に示
した塩基配列の第３９５番目から第１１５１番目に対応
して示したアミノ酸配列またはそれと実質的に同等の機
能を有するポリペプチドあるいは配列番号１に示した塩
基配列の第３１７３番目から第３９５６番目に対応して
示したアミノ酸配列またはそれと実質的に同等の機能を
有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、あるいは配列
表の配列番号１に示した塩基配列の第３９５番目から第
１１５１番目または第３１７３番目から第３９５６番目
あるいはそれらと実質的に同等の機能を有する塩基配列
を有するＤＮＡ、（６） 上記（５）のＤＮＡをベクタ
ーに組み込んでなる組換え体ＤＮＡ、（７） 上記
（６）の組換え体ＤＮＡで形質転換せしめられた形質転
換体、（８） 上記（７）の形質転換体を培養し、得ら
れた組換え体からＰＨＡ菌体内分解酵素を採取すること
を特徴とするＰＨＢ菌体内分解酵素の製造法に関する。
ここでポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）とは、
代表的にはヒドロキシアルカノエートモノマーにおける
炭素数３〜１２程度のものであり、例えばポリヒドロキ
シアルカノエートあるいはエステルが挙げられるほか、
ポリヒドロキシアルカノエートのホモポリマーのみでな
く、広くその共重合体、例えば３−ヒドロキシブチレー
トと炭素数３〜１２程度のその他のヒドロキシアルカノ
エートとの共重合体などをいうことができる。しかし、
これらに限定すること無く、本発明の目的の範囲内であ
れば広く当業者に知られたものを含んでいてよく、例え
ば、ポリ−３−ヒドロキシプロピオネート、ポリ−３−
ヒドロキシブチレート、ポリ−３−ヒドロキシバリレー
トおよびポリ−３−ヒドロキシオクタノエートなど、ポ
リ−４−ヒドロキシブチレートなどが好ましく、特にポ
リ−３−ヒドロキシブチレートが好ましい。
【０００５】以下、本発明を更に詳細に説明する。 （１）ＰＨＡ菌体内分解酵素に関与する遺伝情報を担う
ＤＮＡの単離 本発明のＰＨＡ菌体内分解活性を有するポリペプチドを
コードするＤＮＡ（以下、単にＰＨＡ分解遺伝子ともい
う。）は、ＰＨＡの分解に関与する遺伝情報を担うＤＮ
Ａから製造することができる。このＰＨＡの分解に関与
する遺伝情報を担うＤＮＡとしては、例えばＰＨＡの分
解に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを有する微生物、具
体的にはズーグロエア属細菌から得られるものが挙げら
れる。このＰＨＡ菌体内分解遺伝子は、ＰＨＡの分解に
関与する遺伝情報を担うＤＮＡを有する微生物の染色体
ＤＮＡから、公知のＰＨＡ菌体内分解酵素に関与する遺
伝情報を担うＤＮＡの塩基配列のうちの一部をプローブ
として利用したハイブリダイゼーションの手法などによ
り単離取得することが出来る。また、このＤＮＡは、そ
れが一旦単離取得されたならば、慣用方法に従ってその
ＤＮＡ中の塩基配列の大部分あるいは一部分を利用し
て、それをプローブとして用いて、他の生物を検索し
て、その生物の保有する遺伝子のうちに、ＰＨＡの分解
に関与する遺伝情報を担うものを見つけ出し、次にその
ようにして同定された遺伝子を遺伝子組換え技術の手法
を応用して切り出して、それを大量に得、それをこの当
初のＰＨＡの分解に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを有
する微生物に由来するものと同様に用いることは、当業
者であれば容易に理解し得るところのものである。
ＤＮＡの単離 本発明のＰＨＡ菌体内分解活性を有するポリペプチドを
コードするＤＮＡ（以下、単にＰＨＡ分解遺伝子ともい
う。）は、ＰＨＡの分解に関与する遺伝情報を担うＤＮ
Ａから製造することができる。このＰＨＡの分解に関与
する遺伝情報を担うＤＮＡとしては、例えばＰＨＡの分
解に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを有する微生物、具
体的にはズーグロエア属細菌から得られるものが挙げら
れる。このＰＨＡ菌体内分解遺伝子は、ＰＨＡの分解に
関与する遺伝情報を担うＤＮＡを有する微生物の染色体
ＤＮＡから、公知のＰＨＡ菌体内分解酵素に関与する遺
伝情報を担うＤＮＡの塩基配列のうちの一部をプローブ
として利用したハイブリダイゼーションの手法などによ
り単離取得することが出来る。また、このＤＮＡは、そ
れが一旦単離取得されたならば、慣用方法に従ってその
ＤＮＡ中の塩基配列の大部分あるいは一部分を利用し
て、それをプローブとして用いて、他の生物を検索し
て、その生物の保有する遺伝子のうちに、ＰＨＡの分解
に関与する遺伝情報を担うものを見つけ出し、次にその
ようにして同定された遺伝子を遺伝子組換え技術の手法
を応用して切り出して、それを大量に得、それをこの当
初のＰＨＡの分解に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを有
する微生物に由来するものと同様に用いることは、当業
者であれば容易に理解し得るところのものである。
【０００６】また、本発明のＰＨＡの菌体内分解に関与
する遺伝情報を担うＤＮＡ源としては、上記したような
手法の適用できるグラム陰性あるいはグラム陽性細菌で
あってＰＨＡ菌体内分解酵素をコードする遺伝子を有す
るものがあげられる。この他にも、ＰＨＡ分解遺伝子を
有するものであれば、動物、植物、下等生物、高等生物
の区別なく利用することが可能である。ＰＨＡ分解遺伝
子源として使用しうる微生物としては、ズーグロエア
属、アルカリゲネス属、ロドバクター属、あるいは、ロ
ドスビリルム属に属するものが挙げられる。 （２）ＰＨＡ菌体内分解酵素をコードするＤＮＡの塩基
配列の決定 次に単離取得されたＰＨＡ菌体内分解活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む部分は、これを
当業者によく知られたベクターに結合し大腸菌などの宿
主細胞を用い、得られた組換え体コロニーをハイブリダ
イゼーションの手法など、例えば、コロニーハイブリダ
イゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、
ハイブリダイゼーション・トランスレーションアッセイ
法、プラス・マイナス法などによってにより同定して、
当該染色体由来のＰＨＡ菌体内分解活性を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡを大量に調製する。次にこう
して得られたＰＨＡ菌体内分解活性を有するポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ部分を再度当業者によく知られた
ベクターに結合し大腸菌などの宿主細胞に導入し、得ら
れた組換え体をＰＨＡ菌体内分解酵素活性測定系にか
け、得られたクローンを検定して、ＰＨＡ菌体内分解酵
素活性を有する形質転換体をうる。次にこの形質転換体
からＰＨＡ菌体内分解活性を有するポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ領域を含む部分を制限酵素を用いて切りだ
す。
する遺伝情報を担うＤＮＡ源としては、上記したような
手法の適用できるグラム陰性あるいはグラム陽性細菌で
あってＰＨＡ菌体内分解酵素をコードする遺伝子を有す
るものがあげられる。この他にも、ＰＨＡ分解遺伝子を
有するものであれば、動物、植物、下等生物、高等生物
の区別なく利用することが可能である。ＰＨＡ分解遺伝
子源として使用しうる微生物としては、ズーグロエア
属、アルカリゲネス属、ロドバクター属、あるいは、ロ
ドスビリルム属に属するものが挙げられる。 （２）ＰＨＡ菌体内分解酵素をコードするＤＮＡの塩基
配列の決定 次に単離取得されたＰＨＡ菌体内分解活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む部分は、これを
当業者によく知られたベクターに結合し大腸菌などの宿
主細胞を用い、得られた組換え体コロニーをハイブリダ
イゼーションの手法など、例えば、コロニーハイブリダ
イゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、
ハイブリダイゼーション・トランスレーションアッセイ
法、プラス・マイナス法などによってにより同定して、
当該染色体由来のＰＨＡ菌体内分解活性を有するポリペ
プチドをコードするＤＮＡを大量に調製する。次にこう
して得られたＰＨＡ菌体内分解活性を有するポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ部分を再度当業者によく知られた
ベクターに結合し大腸菌などの宿主細胞に導入し、得ら
れた組換え体をＰＨＡ菌体内分解酵素活性測定系にか
け、得られたクローンを検定して、ＰＨＡ菌体内分解酵
素活性を有する形質転換体をうる。次にこの形質転換体
からＰＨＡ菌体内分解活性を有するポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ領域を含む部分を制限酵素を用いて切りだ
す。
【０００７】上記形質転換体からの組換え体ＤＮＡおよ
び目的のＰＨＡ分解遺伝子を持つＤＮＡ断片の調製は通
常の方法を用いて行うことができる。例えば、培地中で
増殖させた該形質転換体を収穫し、細胞壁をリゾチーム
処理等の細胞破壊法として知られた方法により壊し、次
に核酸画分を分離した後、密度勾配遠心などの方法によ
り所望の画分に分ける。こうして得られたプラスミドを
含有する画分は、次に適当な制限酵素で処理することに
より、適度な断片にすることができると共にまた選択的
に所望のＰＨＡ菌体内分解活性を有するポリペプチドを
コードするＤＮＡ断片とすることができる。ＤＮＡの塩
基配列を決定するのに適した程度まで断片化されたＤＮ
Ａは、次に当該分野でよく知られた方法により処理され
てその塩基配列を決定することができる。ＤＮＡ断片の
ＤＮＡ塩基配列の決定法としては、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌ
ｂｅｒｔ法、ジデオキシ・シークエンス法、ジデオキシ
・チェイン・ターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２１４，１２０５（１９８１））等があげ
られる。このような方法の内には、適当な制限酵素を作
用させ、制限酵素地図を作製した上で、必要な断片をサ
ブクローン化する方法や、ショットガン・クローニング
法、ＰＣＲにより遺伝子を増幅する方法、核酸分解酵素
によりディリーションする方法などの様々な手法が含ま
れていることはもちろんである。次に、こうしてＤＮＡ
塩基配列の決定されたＤＮＡのうちからＰＨＡ菌体内分
解活性を有するポリペプチドをコードしているＤＮＡ領
域を決定する。決定したＤＮＡ塩基配列の中でオープン
・リーディング・フレームを検索する。その中でＰＨＡ
菌体内分解酵素をコードすると思われるＤＮＡ領域を制
限酵素で切り出し、再度これを用いて発現ベクターを構
築し、それを適当な宿主中で発現させ、こうして得られ
た発現物中の活性をＰＨＡ菌体内分解酵素活性測定系に
かけて検討し、最終的に確認される。
び目的のＰＨＡ分解遺伝子を持つＤＮＡ断片の調製は通
常の方法を用いて行うことができる。例えば、培地中で
増殖させた該形質転換体を収穫し、細胞壁をリゾチーム
処理等の細胞破壊法として知られた方法により壊し、次
に核酸画分を分離した後、密度勾配遠心などの方法によ
り所望の画分に分ける。こうして得られたプラスミドを
含有する画分は、次に適当な制限酵素で処理することに
より、適度な断片にすることができると共にまた選択的
に所望のＰＨＡ菌体内分解活性を有するポリペプチドを
コードするＤＮＡ断片とすることができる。ＤＮＡの塩
基配列を決定するのに適した程度まで断片化されたＤＮ
Ａは、次に当該分野でよく知られた方法により処理され
てその塩基配列を決定することができる。ＤＮＡ断片の
ＤＮＡ塩基配列の決定法としては、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌ
ｂｅｒｔ法、ジデオキシ・シークエンス法、ジデオキシ
・チェイン・ターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，２１４，１２０５（１９８１））等があげ
られる。このような方法の内には、適当な制限酵素を作
用させ、制限酵素地図を作製した上で、必要な断片をサ
ブクローン化する方法や、ショットガン・クローニング
法、ＰＣＲにより遺伝子を増幅する方法、核酸分解酵素
によりディリーションする方法などの様々な手法が含ま
れていることはもちろんである。次に、こうしてＤＮＡ
塩基配列の決定されたＤＮＡのうちからＰＨＡ菌体内分
解活性を有するポリペプチドをコードしているＤＮＡ領
域を決定する。決定したＤＮＡ塩基配列の中でオープン
・リーディング・フレームを検索する。その中でＰＨＡ
菌体内分解酵素をコードすると思われるＤＮＡ領域を制
限酵素で切り出し、再度これを用いて発現ベクターを構
築し、それを適当な宿主中で発現させ、こうして得られ
た発現物中の活性をＰＨＡ菌体内分解酵素活性測定系に
かけて検討し、最終的に確認される。
【０００８】上記のようにして構造解析されたＤＮＡか
ら、ＰＨＡ菌体内分解酵素をコードするＤＮＡ以外の領
域を除くには、様々な方法でＰＨＡの分解に不必要な領
域を欠失させることによってなすことができる。このよ
うな方法としては、ＢＡＬ３１ヌクレアーゼやエキソヌ
クレアーゼＩＩＩによる欠失法、制限酵素切断サイトを
利用した組換え法などがあげられる。この際、本発明に
従えば遺伝子の固有のプロモーターを他のものに変更し
たり、部位特異的変異を導入してプロモーターの強度を
変化させることが、現在の遺伝子操作技術を用いること
により、容易に行いうる。従って、そのように一部を変
更したＤＮＡ断片であっても、ＰＨＡ菌体内分解活性を
示すポリペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片
であれば、全て本発明に含まれることは明白である。ま
た、本発明のＰＨＡ菌体内分解活性を示すポリペプチド
をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片としては、ＰＨＡ
菌体内分解活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡ
に加えて、その遺伝子を生体内で発現させるのに重要な
役割を担う制御領域、例えば、遺伝子の転写プロモータ
ー、リボソーム結合部位、転写のターミネーターなどを
コードするＤＮＡをも含んだものがあげられる。
ら、ＰＨＡ菌体内分解酵素をコードするＤＮＡ以外の領
域を除くには、様々な方法でＰＨＡの分解に不必要な領
域を欠失させることによってなすことができる。このよ
うな方法としては、ＢＡＬ３１ヌクレアーゼやエキソヌ
クレアーゼＩＩＩによる欠失法、制限酵素切断サイトを
利用した組換え法などがあげられる。この際、本発明に
従えば遺伝子の固有のプロモーターを他のものに変更し
たり、部位特異的変異を導入してプロモーターの強度を
変化させることが、現在の遺伝子操作技術を用いること
により、容易に行いうる。従って、そのように一部を変
更したＤＮＡ断片であっても、ＰＨＡ菌体内分解活性を
示すポリペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片
であれば、全て本発明に含まれることは明白である。ま
た、本発明のＰＨＡ菌体内分解活性を示すポリペプチド
をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片としては、ＰＨＡ
菌体内分解活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡ
に加えて、その遺伝子を生体内で発現させるのに重要な
役割を担う制御領域、例えば、遺伝子の転写プロモータ
ー、リボソーム結合部位、転写のターミネーターなどを
コードするＤＮＡをも含んだものがあげられる。
【０００９】本発明に従えば、一旦そのＰＨＡ菌体内分
解活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基
配列が明らかにされることにより、その機能を損なわな
い範囲でその塩基の置換あるいは欠失を当該分野におい
てよく知られた方法を適用して容易に行なうことができ
る。例えば、相当するアミノ酸をコードする遺伝暗号の
縮重を利用したもの、生物の遺伝暗号の利用率を考慮し
た変換あるいはＰＨＡ分解の機能に悪影響を及ぼさない
ようなアミノ酸配列の変換のための塩基の置換、付加ま
たは欠失処理などがあげられる。更にまた、このような
改変のうちには、ＰＨＡ分解の活性中心のみを保存し、
その他の部分を大幅に変化させるようにそのＤＮＡの配
列及び長さを変えることも含まれる。従って、本発明の
ＰＨＡ菌体内分解酵素をコードするＤＮＡとしては、以
上のような改変を施したものすべてが含まれることは当
業者であれば容易に理解し得るところのものである。以
上のような事情に鑑み、本発明のＰＨＡ菌体内分解酵素
をコードするＤＮＡは、本発明の思想を実質的に利用し
て得られ、本発明のＤＮＡと実質的に同一の機能を有す
るものすべてを含有するものである。
解活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基
配列が明らかにされることにより、その機能を損なわな
い範囲でその塩基の置換あるいは欠失を当該分野におい
てよく知られた方法を適用して容易に行なうことができ
る。例えば、相当するアミノ酸をコードする遺伝暗号の
縮重を利用したもの、生物の遺伝暗号の利用率を考慮し
た変換あるいはＰＨＡ分解の機能に悪影響を及ぼさない
ようなアミノ酸配列の変換のための塩基の置換、付加ま
たは欠失処理などがあげられる。更にまた、このような
改変のうちには、ＰＨＡ分解の活性中心のみを保存し、
その他の部分を大幅に変化させるようにそのＤＮＡの配
列及び長さを変えることも含まれる。従って、本発明の
ＰＨＡ菌体内分解酵素をコードするＤＮＡとしては、以
上のような改変を施したものすべてが含まれることは当
業者であれば容易に理解し得るところのものである。以
上のような事情に鑑み、本発明のＰＨＡ菌体内分解酵素
をコードするＤＮＡは、本発明の思想を実質的に利用し
て得られ、本発明のＤＮＡと実質的に同一の機能を有す
るものすべてを含有するものである。
【００１０】（３）ＰＨＡ分解遺伝子を持つ組換え体Ｄ
ＮＡの作製 ＰＨＡの分解に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを含む断
片から、適当な手段を施してＤＮＡ合成に不必要な領域
を欠失させたＤＮＡは、それを適当なベクターＤＮＡに
再び組み込むことにより、宿主細胞に再び導入すること
が出来る。本発明の上記ＰＨＡ菌体内分解酵素をコード
するＤＮＡを宿主細胞に導入し、そしてそれをその導入
された宿主細胞内で発現させるために用いられるベクタ
ーＤＮＡとしては、適当な宿主細胞内で、ＰＨＡ分解遺
伝子を発現できるものであれば特に制限なく使用し得
る。このようなベクターＤＮＡとしては、上記ＰＨＡ菌
体内分解酵素をコードするＤＮＡを組み込むことの出来
るものであり、組換えたベクターＤＮＡで宿主細胞を形
質転換できるものであり、そして得られた形質転換体の
細胞内で導入されたＰＨＡ菌体内分解酵素をコードする
ＤＮＡの発現ができるものであれば特に限定されず、如
何なるものも使用することが出来る。このようなベクタ
ーＤＮＡとしては、宿主細胞中で自律複製可能であり、
さらに組換え宿主細胞のみを選別できるような適当な選
択マーカーなどが付与されたものがあげられる。さらに
また、このようなベクターＤＮＡは公知のベクターＤＮ
Ａ等から当業者が容易に製造し得るようなものであって
もよい。このようなベクターＤＮＡとしては、例えばプ
ラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクタ
ーから選ばれたものがあげられる。また、このようなベ
クターＤＮＡは他の宿主株との間で遺伝子交換が可能な
シャトルベクターであってもよいし、ランナウェイベク
ターやスリーパーベクターなど遺伝子産物の発現効率を
向上せしめるために特別に工夫されたものであってもよ
い。さらに、このようなベクターＤＮＡは、ｌａｃＵＶ
５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモー
ター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒ
ｅｃＡプロモーター、ＰＬプロモーター等の制御因子を
適宜付与されたものであってもよい。このような形質発
現などに係わる因子等を導入するためには、遺伝子組換
え技術の分野でよく知られた方法を適宜選択して適用す
ることにより行うことができる。上記ベクターＤＮＡ
に、上記ＰＨＡ菌体内分解酵素をコードするＤＮＡを組
み込むには、まず、上記ベクターＤＮＡに適当な制限酵
素を作用させ、得られたベクターＤＮＡ断片を、上記Ｐ
ＨＡ菌体内分解酵素をコードするＤＮＡ断片とを混合
し、これにＤＮＡリガーゼを作用させることによりなし
うる。この際、必要に応じ当該分野で知られたリンカー
付与、ブラントエンド化等の処理を加えることもでき
る。このようにして得られた組換え体ＤＮＡは次に適当
な宿主細胞の中に導入される。
ＮＡの作製 ＰＨＡの分解に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを含む断
片から、適当な手段を施してＤＮＡ合成に不必要な領域
を欠失させたＤＮＡは、それを適当なベクターＤＮＡに
再び組み込むことにより、宿主細胞に再び導入すること
が出来る。本発明の上記ＰＨＡ菌体内分解酵素をコード
するＤＮＡを宿主細胞に導入し、そしてそれをその導入
された宿主細胞内で発現させるために用いられるベクタ
ーＤＮＡとしては、適当な宿主細胞内で、ＰＨＡ分解遺
伝子を発現できるものであれば特に制限なく使用し得
る。このようなベクターＤＮＡとしては、上記ＰＨＡ菌
体内分解酵素をコードするＤＮＡを組み込むことの出来
るものであり、組換えたベクターＤＮＡで宿主細胞を形
質転換できるものであり、そして得られた形質転換体の
細胞内で導入されたＰＨＡ菌体内分解酵素をコードする
ＤＮＡの発現ができるものであれば特に限定されず、如
何なるものも使用することが出来る。このようなベクタ
ーＤＮＡとしては、宿主細胞中で自律複製可能であり、
さらに組換え宿主細胞のみを選別できるような適当な選
択マーカーなどが付与されたものがあげられる。さらに
また、このようなベクターＤＮＡは公知のベクターＤＮ
Ａ等から当業者が容易に製造し得るようなものであって
もよい。このようなベクターＤＮＡとしては、例えばプ
ラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクタ
ーから選ばれたものがあげられる。また、このようなベ
クターＤＮＡは他の宿主株との間で遺伝子交換が可能な
シャトルベクターであってもよいし、ランナウェイベク
ターやスリーパーベクターなど遺伝子産物の発現効率を
向上せしめるために特別に工夫されたものであってもよ
い。さらに、このようなベクターＤＮＡは、ｌａｃＵＶ
５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモー
ター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒ
ｅｃＡプロモーター、ＰＬプロモーター等の制御因子を
適宜付与されたものであってもよい。このような形質発
現などに係わる因子等を導入するためには、遺伝子組換
え技術の分野でよく知られた方法を適宜選択して適用す
ることにより行うことができる。上記ベクターＤＮＡ
に、上記ＰＨＡ菌体内分解酵素をコードするＤＮＡを組
み込むには、まず、上記ベクターＤＮＡに適当な制限酵
素を作用させ、得られたベクターＤＮＡ断片を、上記Ｐ
ＨＡ菌体内分解酵素をコードするＤＮＡ断片とを混合
し、これにＤＮＡリガーゼを作用させることによりなし
うる。この際、必要に応じ当該分野で知られたリンカー
付与、ブラントエンド化等の処理を加えることもでき
る。このようにして得られた組換え体ＤＮＡは次に適当
な宿主細胞の中に導入される。
【００１１】（４）複数のＰＨＡ分解遺伝子を持つ組換
え体ＤＮＡの作製 同一のプラスミド上に複数のＰＨＡ分解遺伝子を組み込
めば、より良好な結果が得られる。複数のＰＨＡ分解遺
伝子を組み込む際のその様式は、固有のプロモーターを
持つＰＨＡ分解遺伝子が複数個導入されていてもよい
し、複数のＰＨＡ分解遺伝子がポリシストロニックに転
写されるオペロンとして導入されていてもよいし、また
これらの組み合わせであってもよい。導入する遺伝子の
数に特に制限はなく、組換え体ＤＮＡ及びそれを含む形
質転換体の安定性を損なわない範囲であればよい。組換
え体ＤＮＡを作製する場合、このための技術としては制
限酵素による切断、リガーゼによる連結、化学合成ＤＮ
Ａの利用、ヌクレアーゼによる欠失、部位特異的変異に
よる塩基置換など、通常の遺伝子操作で用いられる技術
を適宜選択して適用することにより行なうことができる
が、この際に、プロモーターの変更やその他のＰＨＡ分
解遺伝子を発現させるための塩基配列の改変を行っても
よい。このようにして得られた組換え体ＤＮＡは次に適
当な宿主細胞の中に導入される。
え体ＤＮＡの作製 同一のプラスミド上に複数のＰＨＡ分解遺伝子を組み込
めば、より良好な結果が得られる。複数のＰＨＡ分解遺
伝子を組み込む際のその様式は、固有のプロモーターを
持つＰＨＡ分解遺伝子が複数個導入されていてもよい
し、複数のＰＨＡ分解遺伝子がポリシストロニックに転
写されるオペロンとして導入されていてもよいし、また
これらの組み合わせであってもよい。導入する遺伝子の
数に特に制限はなく、組換え体ＤＮＡ及びそれを含む形
質転換体の安定性を損なわない範囲であればよい。組換
え体ＤＮＡを作製する場合、このための技術としては制
限酵素による切断、リガーゼによる連結、化学合成ＤＮ
Ａの利用、ヌクレアーゼによる欠失、部位特異的変異に
よる塩基置換など、通常の遺伝子操作で用いられる技術
を適宜選択して適用することにより行なうことができる
が、この際に、プロモーターの変更やその他のＰＨＡ分
解遺伝子を発現させるための塩基配列の改変を行っても
よい。このようにして得られた組換え体ＤＮＡは次に適
当な宿主細胞の中に導入される。
【００１２】（５）組換え体ＤＮＡの宿主細胞への導入 上記のようにして作製した組換え体ＤＮＡを導入するた
めの宿主細胞としては、上記で得られた組換えベクター
でもって形質転換されて、ＰＨＡ分解遺伝子を発現させ
ることができるようなものであれば、特に制限なく使用
することが出来る。このような宿主細胞としては、本発
明の目的に沿ってＰＨＡ分解遺伝子の発現を達成し得る
限り、グラム陰性菌あるいはグラム陽性菌の区別なく、
さらには、下等細胞あるいは高等細胞の区別なく、動物
由来細胞であろうと植物由来細胞であろうと使用でき
る。組換え体ＤＮＡを導入するためには、組換え体ＤＮ
Ａをコンピテント細胞に接触せしめる、エレクトロポレ
ーション、インビトロパッケージング法などを用いて適
当な増殖期にある宿主に、組換えファージベクターを感
染させる方法等など当業者によく知られた方法から適宜
選択して用いることが出来る。
めの宿主細胞としては、上記で得られた組換えベクター
でもって形質転換されて、ＰＨＡ分解遺伝子を発現させ
ることができるようなものであれば、特に制限なく使用
することが出来る。このような宿主細胞としては、本発
明の目的に沿ってＰＨＡ分解遺伝子の発現を達成し得る
限り、グラム陰性菌あるいはグラム陽性菌の区別なく、
さらには、下等細胞あるいは高等細胞の区別なく、動物
由来細胞であろうと植物由来細胞であろうと使用でき
る。組換え体ＤＮＡを導入するためには、組換え体ＤＮ
Ａをコンピテント細胞に接触せしめる、エレクトロポレ
ーション、インビトロパッケージング法などを用いて適
当な増殖期にある宿主に、組換えファージベクターを感
染させる方法等など当業者によく知られた方法から適宜
選択して用いることが出来る。
【００１３】（６）形質転換体によるＰＨＡ菌体内分解
酵素の製造 本発明により得られたＰＨＡ菌体内分解酵素産生形質転
換体は、適当な栄養培地中で培養することにより、それ
を大量に得ることができる。培養に用いられる培地は微
生物の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物質等を含む
通常の培地である。更に、ビタミン、アミノ酸等の有機
微量栄養素を添加すると望ましい結果が得られる場合が
多い。培養は、好気的条件下でｐＨ４〜１０、温度２０
〜６０℃の任意の範囲に制御して１〜３日間培養を行え
ばよい。形質転換体を用いる場合、使用する菌株に応じ
てアンピシリン、クロラムフェニコール等の抗生物質を
培養液に添加してもよい。大量に培養して得たＰＨＡ菌
体内分解酵素産生形質転換体の細胞からＰＨＡ菌体内分
解酵素を単離精製するにあたっては、まず、生物体を機
械的方法、酵素処理方法、自己溶解法、超音波処理法な
どの方法によって破壊し、粗抽出液を得、ついでこれを
硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウムなどの塩析剤ある
いはアセトン又はエタノールなどの溶媒による蛋白質沈
澱法、電気泳動法、ゲル濾過法あるいは分子ふるいクロ
マトグラフィー法、限外濾過法、逆相クロマトグラフィ
ー法、高速液体クロマトグラフィー法、イオン交換クロ
マトグラフィー法、アフィニティクロマトグラフィー
法、吸着クロマトグラフィー法、などの方法を単独ある
いは適宜組み合わせて用いて適用することにより行うこ
とが出来る。
酵素の製造 本発明により得られたＰＨＡ菌体内分解酵素産生形質転
換体は、適当な栄養培地中で培養することにより、それ
を大量に得ることができる。培養に用いられる培地は微
生物の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物質等を含む
通常の培地である。更に、ビタミン、アミノ酸等の有機
微量栄養素を添加すると望ましい結果が得られる場合が
多い。培養は、好気的条件下でｐＨ４〜１０、温度２０
〜６０℃の任意の範囲に制御して１〜３日間培養を行え
ばよい。形質転換体を用いる場合、使用する菌株に応じ
てアンピシリン、クロラムフェニコール等の抗生物質を
培養液に添加してもよい。大量に培養して得たＰＨＡ菌
体内分解酵素産生形質転換体の細胞からＰＨＡ菌体内分
解酵素を単離精製するにあたっては、まず、生物体を機
械的方法、酵素処理方法、自己溶解法、超音波処理法な
どの方法によって破壊し、粗抽出液を得、ついでこれを
硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウムなどの塩析剤ある
いはアセトン又はエタノールなどの溶媒による蛋白質沈
澱法、電気泳動法、ゲル濾過法あるいは分子ふるいクロ
マトグラフィー法、限外濾過法、逆相クロマトグラフィ
ー法、高速液体クロマトグラフィー法、イオン交換クロ
マトグラフィー法、アフィニティクロマトグラフィー
法、吸着クロマトグラフィー法、などの方法を単独ある
いは適宜組み合わせて用いて適用することにより行うこ
とが出来る。
【００１４】以下、本発明のＰＨＡ菌体内分解酵素のう
ち特にＰＨＢ菌体内分解酵素を例に挙げて更に詳細に説
明する。 （Ａ）ＰＨＢ菌体内分解酵素に関与する遺伝情報を担う
ＤＮＡの単離 本発明のＰＨＢ分解活性を有するポリペプチドをコード
するＤＮＡ（以下、単にＰＨＢ分解遺伝子ともいう。）
としては、配列表の配列番号１に示した塩基配列の第３
９５番目から第１１５１番目に対応して示したアミノ酸
配列またはそれと実質的に同等の機能を有するポリペプ
チドあるいは配列番号１に示した塩基配列の第３１７３
番目から第３９５６番目に対応して示したアミノ酸配列
またはそれと実質的に同等の機能を有するポリペプチド
をコードするＤＮＡが挙げられる。また、好ましくは配
列表の配列番号１に示した塩基配列の第３９５番目から
第１１５１番目または第３１７３番目から第３９５６番
目あるいはそれらと実質的に同等の機能を有する塩基配
列をコードするＤＮＡを挙げることができる。特には、
配列表の配列番号１に示した塩基配列の第３９５番目か
ら第１１５１番目に対応して示したアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡあるいは配列表の配列番号１に示した塩基
配列の第３１７３番目から第３９５６番目に対応して示
したアミノ酸配列をコードするＤＮＡを挙げることがで
きる。また配列表の配列番号１に示した塩基配列の第３
９５番目から第１１５１番目をコードするＤＮＡあるい
は配列表の配列番号１に示した塩基配列の第３１７３番
目から第３９５６番目をコードするＤＮＡが好ましい。
これらのＤＮＡは、ＰＨＢの分解に関与する遺伝情報を
担うＤＮＡを、例えば染色体ＤＮＡとして有する微生
物、特には細菌から取り出して製造することができる。
このＰＨＢの分解に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ有す
る微生物としては、例えばズーグロエア属細菌から得ら
れたものが挙げられる。このズーグロエア属細菌として
はＰＨＢ産生ズーグロエア属細菌株であれば特に限定さ
れないが、特に好ましいものとしてはズーグロエア・ラ
ミゲラ（Ｚｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ）Ｉ−１
６−Ｍを挙げることができる。また、このＤＮＡは、そ
れが一旦単離取得されたならば、慣用方法に従ってその
ＤＮＡ中の塩基配列の大部分あるいは一部分を利用し
て、それをプローブとして用いて、他の生物を検索し
て、その生物の保有する遺伝子のうちに、ＰＨＢをはじ
めとしてＰＨＡの分解に関与する遺伝情報を担うものを
見つけ出し、次にそのようにして同定された遺伝子を遺
伝子組換え技術の手法を応用して切り出して、それを大
量に得、それをこのズーグロエア属細菌に由来するもの
と同様に用いることは、当業者であれば容易に理解し得
るところのものであることは上記したと同じである。
ち特にＰＨＢ菌体内分解酵素を例に挙げて更に詳細に説
明する。 （Ａ）ＰＨＢ菌体内分解酵素に関与する遺伝情報を担う
ＤＮＡの単離 本発明のＰＨＢ分解活性を有するポリペプチドをコード
するＤＮＡ（以下、単にＰＨＢ分解遺伝子ともいう。）
としては、配列表の配列番号１に示した塩基配列の第３
９５番目から第１１５１番目に対応して示したアミノ酸
配列またはそれと実質的に同等の機能を有するポリペプ
チドあるいは配列番号１に示した塩基配列の第３１７３
番目から第３９５６番目に対応して示したアミノ酸配列
またはそれと実質的に同等の機能を有するポリペプチド
をコードするＤＮＡが挙げられる。また、好ましくは配
列表の配列番号１に示した塩基配列の第３９５番目から
第１１５１番目または第３１７３番目から第３９５６番
目あるいはそれらと実質的に同等の機能を有する塩基配
列をコードするＤＮＡを挙げることができる。特には、
配列表の配列番号１に示した塩基配列の第３９５番目か
ら第１１５１番目に対応して示したアミノ酸配列をコー
ドするＤＮＡあるいは配列表の配列番号１に示した塩基
配列の第３１７３番目から第３９５６番目に対応して示
したアミノ酸配列をコードするＤＮＡを挙げることがで
きる。また配列表の配列番号１に示した塩基配列の第３
９５番目から第１１５１番目をコードするＤＮＡあるい
は配列表の配列番号１に示した塩基配列の第３１７３番
目から第３９５６番目をコードするＤＮＡが好ましい。
これらのＤＮＡは、ＰＨＢの分解に関与する遺伝情報を
担うＤＮＡを、例えば染色体ＤＮＡとして有する微生
物、特には細菌から取り出して製造することができる。
このＰＨＢの分解に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ有す
る微生物としては、例えばズーグロエア属細菌から得ら
れたものが挙げられる。このズーグロエア属細菌として
はＰＨＢ産生ズーグロエア属細菌株であれば特に限定さ
れないが、特に好ましいものとしてはズーグロエア・ラ
ミゲラ（Ｚｏｏｇｌｏｅａ ｒａｍｉｇｅｒａ）Ｉ−１
６−Ｍを挙げることができる。また、このＤＮＡは、そ
れが一旦単離取得されたならば、慣用方法に従ってその
ＤＮＡ中の塩基配列の大部分あるいは一部分を利用し
て、それをプローブとして用いて、他の生物を検索し
て、その生物の保有する遺伝子のうちに、ＰＨＢをはじ
めとしてＰＨＡの分解に関与する遺伝情報を担うものを
見つけ出し、次にそのようにして同定された遺伝子を遺
伝子組換え技術の手法を応用して切り出して、それを大
量に得、それをこのズーグロエア属細菌に由来するもの
と同様に用いることは、当業者であれば容易に理解し得
るところのものであることは上記したと同じである。
【００１５】従って、本発明のＰＨＢの菌体内分解に関
与する遺伝情報を担うＤＮＡ源としては、ズーグロエア
属細菌のみでなく、上記したような手法の適用できるグ
ラム陰性あるいはグラム陽性細菌であってＰＨＢ菌体内
分解酵素をコードする遺伝子を有するものがあげられ
る。このような細菌としては、アルカリゲネス属細菌、
ロドバクター属細菌、あるいは、ロドスビリルム属細菌
なども利用できよう。この他にも、ＰＨＢ分解遺伝子を
有するものであれば、動物、植物、下等生物、高等生物
の区別なく利用することが可能であることは上記したと
同じであるが、シュードモナス属細菌なども利用できよ
う。ＰＨＢ分解遺伝子源として好ましい微生物としては
上記したズーグロエア属、アルカリゲネス属、ロドバク
ター属、あるいは、ロドスビリルム属に属するものが挙
げられる。このようなものの代表的な例としてはズーグ
ロエア・ラミゲラＩ−１６−Ｍ、アルカリゲネス・ユー
トロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈ
ｕｓ）ＡＴＣＣ１７６９９、ロドバクター・スファエロ
イズＡＴＣＣ１７０２３、ロドスビリルム・ルブラムＨ
ａＤＳＭ１０７、及びロドスビリルム・ルブラムＳ１Ｄ
ＳＭ４６７などを挙げることができる。
与する遺伝情報を担うＤＮＡ源としては、ズーグロエア
属細菌のみでなく、上記したような手法の適用できるグ
ラム陰性あるいはグラム陽性細菌であってＰＨＢ菌体内
分解酵素をコードする遺伝子を有するものがあげられ
る。このような細菌としては、アルカリゲネス属細菌、
ロドバクター属細菌、あるいは、ロドスビリルム属細菌
なども利用できよう。この他にも、ＰＨＢ分解遺伝子を
有するものであれば、動物、植物、下等生物、高等生物
の区別なく利用することが可能であることは上記したと
同じであるが、シュードモナス属細菌なども利用できよ
う。ＰＨＢ分解遺伝子源として好ましい微生物としては
上記したズーグロエア属、アルカリゲネス属、ロドバク
ター属、あるいは、ロドスビリルム属に属するものが挙
げられる。このようなものの代表的な例としてはズーグ
ロエア・ラミゲラＩ−１６−Ｍ、アルカリゲネス・ユー
トロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈ
ｕｓ）ＡＴＣＣ１７６９９、ロドバクター・スファエロ
イズＡＴＣＣ１７０２３、ロドスビリルム・ルブラムＨ
ａＤＳＭ１０７、及びロドスビリルム・ルブラムＳ１Ｄ
ＳＭ４６７などを挙げることができる。
【００１６】（Ｂ）ＰＨＢ菌体内分解酵素をコードする
ＤＮＡの塩基配列の決定 次にズーグロエア属細菌由来のＰＨＢ菌体内分解に関与
する遺伝子を含むＤＮＡを例にあげて、ＰＨＢ菌体内分
解酵素をコードするＤＮＡの単離及びその塩基配列の決
定法について説明する。ここで使用しうるズーグロエア
属細菌由来のＰＨＢ菌体内分解に関与する遺伝子の供給
株としては、具体的にはズーグロエア・ラミゲラＩ−１
６−Ｍよりクローン化されたＰＨＢ分解遺伝子を含む約
９．３ＫｂのＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ断片を組み込んだ
プラスミドＤＮＡをもつ形質転換体大腸菌Ｃ６００のほ
か、約６．２ＫｂのＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ断片を組み込
んだプラスミドＤＮＡをもつ形質転換体大腸菌Ｃ６００
（ｐＺＤ０３４）があげられる。また、約３．４Ｋｂの
ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ断片を組み込んだプラスミドＤ
ＮＡをもつ形質転換体大腸菌Ｃ６００（ｐＺＤ０１０）
および約２．８ＫｂのＳｍａｌＩ／ＳａｌＩ断片を組み
込んだプラスミドＤＮＡをもつ形質転換体大腸菌Ｃ６０
０（ｐＺＤ０２０）もあげられる。この約６．２Ｋｂの
ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ断片を組み込んだプラスミドＤＮ
Ａをもつ形質転換体大腸菌Ｃ６００（ｐＺＤ０３４）株
は工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第１
３１３３号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３１３３）として寄託さ
れている。
ＤＮＡの塩基配列の決定 次にズーグロエア属細菌由来のＰＨＢ菌体内分解に関与
する遺伝子を含むＤＮＡを例にあげて、ＰＨＢ菌体内分
解酵素をコードするＤＮＡの単離及びその塩基配列の決
定法について説明する。ここで使用しうるズーグロエア
属細菌由来のＰＨＢ菌体内分解に関与する遺伝子の供給
株としては、具体的にはズーグロエア・ラミゲラＩ−１
６−Ｍよりクローン化されたＰＨＢ分解遺伝子を含む約
９．３ＫｂのＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ断片を組み込んだ
プラスミドＤＮＡをもつ形質転換体大腸菌Ｃ６００のほ
か、約６．２ＫｂのＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ断片を組み込
んだプラスミドＤＮＡをもつ形質転換体大腸菌Ｃ６００
（ｐＺＤ０３４）があげられる。また、約３．４Ｋｂの
ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ断片を組み込んだプラスミドＤ
ＮＡをもつ形質転換体大腸菌Ｃ６００（ｐＺＤ０１０）
および約２．８ＫｂのＳｍａｌＩ／ＳａｌＩ断片を組み
込んだプラスミドＤＮＡをもつ形質転換体大腸菌Ｃ６０
０（ｐＺＤ０２０）もあげられる。この約６．２Ｋｂの
ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ断片を組み込んだプラスミドＤＮ
Ａをもつ形質転換体大腸菌Ｃ６００（ｐＺＤ０３４）株
は工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第１
３１３３号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３１３３）として寄託さ
れている。
【００１７】上記形質転換体からの組換え体ＤＮＡおよ
び目的のＰＨＢ分解遺伝子を持つＤＮＡ断片の調製は上
記したように通常の方法を用いて行うことができる。上
記したようにＤＮＡの塩基配列を決定するのに適した程
度まで断片化されたＤＮＡは、次に当該分野でよく知ら
れた方法により処理されてその塩基配列を決定すること
ができる。ＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列の決定法として
は、上記した方法等があげられる。次に、こうしてＤＮ
Ａ塩基配列の決定されたＤＮＡのうちからＰＨＢ菌体内
分解活性を有するポリペプチドをコードしているＤＮＡ
領域を決定し、決定したＤＮＡ塩基配列の中でオープン
・リーデイング・フレームを検索する。その中でＰＨＢ
菌体内分解酵素をコードすると思われるＤＮＡ領域を制
限酵素で切り出し、再度これを用いて発現ベクターを構
築し、それを適当な宿主中で発現させ、こうして得られ
た発現物中の活性を検討して最終的に確認される。上記
のようにして構造解析されたＤＮＡから、ＰＨＢ菌体内
分解酵素をコードするＤＮＡ以外の領域を除くには、様
々な方法でＰＨＢの分解に不必要な領域を欠失させるこ
とによってなすことができる。このような方法として
は、上記した方法等があげられる。この際、本発明に従
えば遺伝子の固有のプロモーターを他のものに変更した
り、部位特異的変異を導入してプロモーターの強度を変
化させることが、現在の遺伝子操作技術を用いることに
より、容易に行いうる。従って、そのように一部を変更
したＤＮＡ断片であっても、ＰＨＢ菌体内分解活性を示
すポリペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片で
あれば、全て本発明に含まれることは明白である。
び目的のＰＨＢ分解遺伝子を持つＤＮＡ断片の調製は上
記したように通常の方法を用いて行うことができる。上
記したようにＤＮＡの塩基配列を決定するのに適した程
度まで断片化されたＤＮＡは、次に当該分野でよく知ら
れた方法により処理されてその塩基配列を決定すること
ができる。ＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列の決定法として
は、上記した方法等があげられる。次に、こうしてＤＮ
Ａ塩基配列の決定されたＤＮＡのうちからＰＨＢ菌体内
分解活性を有するポリペプチドをコードしているＤＮＡ
領域を決定し、決定したＤＮＡ塩基配列の中でオープン
・リーデイング・フレームを検索する。その中でＰＨＢ
菌体内分解酵素をコードすると思われるＤＮＡ領域を制
限酵素で切り出し、再度これを用いて発現ベクターを構
築し、それを適当な宿主中で発現させ、こうして得られ
た発現物中の活性を検討して最終的に確認される。上記
のようにして構造解析されたＤＮＡから、ＰＨＢ菌体内
分解酵素をコードするＤＮＡ以外の領域を除くには、様
々な方法でＰＨＢの分解に不必要な領域を欠失させるこ
とによってなすことができる。このような方法として
は、上記した方法等があげられる。この際、本発明に従
えば遺伝子の固有のプロモーターを他のものに変更した
り、部位特異的変異を導入してプロモーターの強度を変
化させることが、現在の遺伝子操作技術を用いることに
より、容易に行いうる。従って、そのように一部を変更
したＤＮＡ断片であっても、ＰＨＢ菌体内分解活性を示
すポリペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片で
あれば、全て本発明に含まれることは明白である。
【００１８】また、本発明のＰＨＢ菌体内分解活性を示
すポリペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片と
しては、ＰＨＢ菌体内分解活性を示すポリペプチドをコ
ードするＤＮＡに加えて、その遺伝子を生体内で発現さ
せるのに重要な役割を担う制御領域、例えば、遺伝子の
転写プロモーター、リボソーム結合部位、転写のターミ
ネーターなどをコードするＤＮＡをも含んだものがあげ
られる。本発明に従えば、一旦そのＰＨＢ菌体内分解活
性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列
が明らかにされることにより、その機能を損なわない範
囲でその塩基の置換あるいは欠失を当該分野においてよ
く知られた方法を適用して容易に行なうことができる。
また、このような改変のうちには、ＰＨＢ分解の活性中
心のみを保存し、その他の部分を大幅に変化させるよう
にそのＤＮＡの配列及び長さを変えることも含まれる。
従って、本発明のＰＨＢ菌体内分解酵素をコードするＤ
ＮＡとしては、以上のような改変を施したものすべてが
含まれることは当業者であれば容易に理解し得るところ
のものである。以上のような事情に鑑み、本発明のＰＨ
Ｂ菌体内分解酵素をコードするＤＮＡは、本発明の思想
を実質的に利用して得られ、本発明のＤＮＡと実質的に
同一の機能を有するものすべてを含有するものである。
すポリペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片と
しては、ＰＨＢ菌体内分解活性を示すポリペプチドをコ
ードするＤＮＡに加えて、その遺伝子を生体内で発現さ
せるのに重要な役割を担う制御領域、例えば、遺伝子の
転写プロモーター、リボソーム結合部位、転写のターミ
ネーターなどをコードするＤＮＡをも含んだものがあげ
られる。本発明に従えば、一旦そのＰＨＢ菌体内分解活
性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列
が明らかにされることにより、その機能を損なわない範
囲でその塩基の置換あるいは欠失を当該分野においてよ
く知られた方法を適用して容易に行なうことができる。
また、このような改変のうちには、ＰＨＢ分解の活性中
心のみを保存し、その他の部分を大幅に変化させるよう
にそのＤＮＡの配列及び長さを変えることも含まれる。
従って、本発明のＰＨＢ菌体内分解酵素をコードするＤ
ＮＡとしては、以上のような改変を施したものすべてが
含まれることは当業者であれば容易に理解し得るところ
のものである。以上のような事情に鑑み、本発明のＰＨ
Ｂ菌体内分解酵素をコードするＤＮＡは、本発明の思想
を実質的に利用して得られ、本発明のＤＮＡと実質的に
同一の機能を有するものすべてを含有するものである。
【００１９】（Ｃ）ＰＨＢ分解遺伝子を持つ組換え体Ｄ
ＮＡの作製ならびに形質転換体の作製 ＰＨＢ分解遺伝子を持つ組換え体ＤＮＡの作製並びに複
数のＰＨＢ分解遺伝子を持つ組換え体ＤＮＡの作製、更
には組換え体ＤＮＡの宿主細胞への導入は、上記したよ
うにして行うことが出来る。上記のようにして作製した
組換え体ＤＮＡを導入するための宿主細胞としては、上
記で得られた組換えベクターでもって形質転換されて、
ＰＨＢ分解遺伝子を発現させることができるようなもの
であれば、特に制限なく使用することが出来る。このよ
うな宿主細胞としては、本発明の目的に沿ってＰＨＢ分
解遺伝子の発現を達成し得る限り、グラム陰性菌あるい
はグラム陽性菌の区別なく、さらには、下等細胞あるい
は高等細胞の区別なく、動物由来細胞であろうと植物由
来細胞であろうと使用できる。ＰＨＢ分解遺伝子の発現
に適した宿主細胞としては大腸菌、ズーグロエア属細菌
などが挙げられる。
ＮＡの作製ならびに形質転換体の作製 ＰＨＢ分解遺伝子を持つ組換え体ＤＮＡの作製並びに複
数のＰＨＢ分解遺伝子を持つ組換え体ＤＮＡの作製、更
には組換え体ＤＮＡの宿主細胞への導入は、上記したよ
うにして行うことが出来る。上記のようにして作製した
組換え体ＤＮＡを導入するための宿主細胞としては、上
記で得られた組換えベクターでもって形質転換されて、
ＰＨＢ分解遺伝子を発現させることができるようなもの
であれば、特に制限なく使用することが出来る。このよ
うな宿主細胞としては、本発明の目的に沿ってＰＨＢ分
解遺伝子の発現を達成し得る限り、グラム陰性菌あるい
はグラム陽性菌の区別なく、さらには、下等細胞あるい
は高等細胞の区別なく、動物由来細胞であろうと植物由
来細胞であろうと使用できる。ＰＨＢ分解遺伝子の発現
に適した宿主細胞としては大腸菌、ズーグロエア属細菌
などが挙げられる。
【００２０】（Ｄ）形質転換体によるＰＨＢ菌体内分解
酵素の製造 本発明により得られたＰＨＢ菌体内分解酵素産生形質転
換体は、適当な栄養培地中で培養することにより、それ
を大量に得ることができる。培養に用いられる培地は微
生物の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物質等を含む
通常の培地である。更に、ビタミン、アミノ酸等の有機
微量栄養素を添加すると望ましい結果が得られる場合が
多い。培養は、好気的条件下でｐＨ４〜１０、温度２０
〜６０℃の任意の範囲に制御して１〜３日間培養を行え
ばよい。形質転換体を用いる場合、使用する菌株に応じ
てアンピシリン、クロラムフェニコール等の抗生物質を
培養液に添加してもよい。また、大量に培養して得たＰ
ＨＢ菌体内分解酵素産生形質転換体の細胞からＰＨＢ菌
体内分解酵素を単離精製するにあたっては、上記した方
法のいずれもが利用できる。
酵素の製造 本発明により得られたＰＨＢ菌体内分解酵素産生形質転
換体は、適当な栄養培地中で培養することにより、それ
を大量に得ることができる。培養に用いられる培地は微
生物の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物質等を含む
通常の培地である。更に、ビタミン、アミノ酸等の有機
微量栄養素を添加すると望ましい結果が得られる場合が
多い。培養は、好気的条件下でｐＨ４〜１０、温度２０
〜６０℃の任意の範囲に制御して１〜３日間培養を行え
ばよい。形質転換体を用いる場合、使用する菌株に応じ
てアンピシリン、クロラムフェニコール等の抗生物質を
培養液に添加してもよい。また、大量に培養して得たＰ
ＨＢ菌体内分解酵素産生形質転換体の細胞からＰＨＢ菌
体内分解酵素を単離精製するにあたっては、上記した方
法のいずれもが利用できる。
【００２１】
【実施例】以下にＰＨＡのうちの一つであるＰＨＡの分
解活性に関与したＰＨＢ菌体内分解遺伝子についてクロ
ーニングした例を具体的に示して本発明を説明する。 実施例１ （１）ＰＨＢ菌体内分解酵素をコードする遺伝子のクロ
ーニング 以下、ズーグロエア・ラミゲラＩ−１６−Ｍ株をＤＮＡ
供与体として用い、該菌体のＰＨＢ菌体内分解遺伝子を
大腸菌の宿主、ベクター系を利用してクローニングし
た。染色体ＤＮＡの調製はＤａｖｅｒｎ法（Ｃ．Ｉ．Ｄ
ａｖｅｒｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．，５５，７９２（１９６６）を改良して行
った。即ち、ＤＮＡ供与体であるズーグロエア・ラミゲ
ラＩ−１６−Ｍを１００ｍｌの完全培地（０．２％Ｋ２
ＨＰＯ４、０．１％ＫＨ２ＰＯ４、０．５％カザミノ
酸、０．５％酵母エキス；ｐＨ７．０）で約１８時間培
養し、培養液から菌体を集菌した後、ＴＥ緩衝液（１０
ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下ト
リスと略す）、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリ
ウム（以下ＥＤＴＡと略す）；ｐＨ８．０）で洗浄し
た。１０ｍｌのリゾチーム溶液（５０ｍＭグルコース、
２５ｍＭトリス、１０ｍＭＥＤＴＡ、４ｍｇ／ｍｌリゾ
チーム；ｐＨ８．０）に懸濁した後、３７℃で６０分間
反応させた。１０％のドデシル硫酸ナトリウム（以下Ｓ
ＤＳと略す）水溶液１ｍｌを添加して５５℃で１０分間
加温した。２０ｍｌのＴＥ緩衝液を加えた後、１．５ｍ
ｌのＲＮａｓｅ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を加え３７℃で１
５分間反応させた。更にプロテアーゼＫを１ｍｇ加え４
５分間反応させた。これからエチジウム・ブロマイド−
塩化セシウム密度勾配超遠心法により染色体ＤＮＡを精
製した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１９８２記載の方法に従い、染
色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、アガロース
ゲル電気泳動で分離した後、アルカリゲネス・フェカリ
スの菌体外ＰＨＢ分解酵素の遺伝子（例えば、約２Ｋ
ｂ、Ｔ，Ｓａｉｔｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｏｌ．，１７１，１８４（１９８９））をプローブとし
てサザンハイブリダイゼーションを行った結果、約９．
３ｋｂの位置にバンドが得られた。その位置からＤＮＡ
を切り出し、シャロミドベクター（例えば、シャロミド
９−３６）に連結し、大腸菌を用いてクローニング
し、更にコロニーハイブリダイゼーションにより目的の
ＤＮＡだけを得た。
解活性に関与したＰＨＢ菌体内分解遺伝子についてクロ
ーニングした例を具体的に示して本発明を説明する。 実施例１ （１）ＰＨＢ菌体内分解酵素をコードする遺伝子のクロ
ーニング 以下、ズーグロエア・ラミゲラＩ−１６−Ｍ株をＤＮＡ
供与体として用い、該菌体のＰＨＢ菌体内分解遺伝子を
大腸菌の宿主、ベクター系を利用してクローニングし
た。染色体ＤＮＡの調製はＤａｖｅｒｎ法（Ｃ．Ｉ．Ｄ
ａｖｅｒｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．，５５，７９２（１９６６）を改良して行
った。即ち、ＤＮＡ供与体であるズーグロエア・ラミゲ
ラＩ−１６−Ｍを１００ｍｌの完全培地（０．２％Ｋ２
ＨＰＯ４、０．１％ＫＨ２ＰＯ４、０．５％カザミノ
酸、０．５％酵母エキス；ｐＨ７．０）で約１８時間培
養し、培養液から菌体を集菌した後、ＴＥ緩衝液（１０
ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（以下ト
リスと略す）、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリ
ウム（以下ＥＤＴＡと略す）；ｐＨ８．０）で洗浄し
た。１０ｍｌのリゾチーム溶液（５０ｍＭグルコース、
２５ｍＭトリス、１０ｍＭＥＤＴＡ、４ｍｇ／ｍｌリゾ
チーム；ｐＨ８．０）に懸濁した後、３７℃で６０分間
反応させた。１０％のドデシル硫酸ナトリウム（以下Ｓ
ＤＳと略す）水溶液１ｍｌを添加して５５℃で１０分間
加温した。２０ｍｌのＴＥ緩衝液を加えた後、１．５ｍ
ｌのＲＮａｓｅ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を加え３７℃で１
５分間反応させた。更にプロテアーゼＫを１ｍｇ加え４
５分間反応させた。これからエチジウム・ブロマイド−
塩化セシウム密度勾配超遠心法により染色体ＤＮＡを精
製した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．１９８２記載の方法に従い、染
色体ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、アガロース
ゲル電気泳動で分離した後、アルカリゲネス・フェカリ
スの菌体外ＰＨＢ分解酵素の遺伝子（例えば、約２Ｋ
ｂ、Ｔ，Ｓａｉｔｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｏｌ．，１７１，１８４（１９８９））をプローブとし
てサザンハイブリダイゼーションを行った結果、約９．
３ｋｂの位置にバンドが得られた。その位置からＤＮＡ
を切り出し、シャロミドベクター（例えば、シャロミド
９−３６）に連結し、大腸菌を用いてクローニング
し、更にコロニーハイブリダイゼーションにより目的の
ＤＮＡだけを得た。
【００２２】（２）制限酵素地図の作製 ４つの代表的な制限酵素、即ちＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、
ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩを用いて（１）で得られた約
９．３ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素切断地図を作製し
た。これを図１に示す。 （３）サブクローニング （２）で得られた約９．３ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨ
ＩのＤＮＡ断片から約６．２ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｓａｌ
Ｉを得、次ぎにこれをｐＵＣ１９に連結した。ベクター
としてｐＵＣ１８を用いても行った。同様に（２）で得
られた約９．３ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩのＤＮＡ
断片から約３．４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩおよび
約３．０ｋｂのＳｍａＩ−ＳａｌＩを得、次ぎにこれを
それぞれｐＵＣ１９に連結した。 （４）遺伝子の発現及びＰＨＢ菌体内分解活性測定 （３）で得られたサブクローンを大腸菌ＪＭ１０９に導
入した後、これをＬＢ培地で培養し、超音波破砕法で菌
体を破砕し、遠心分離により菌の菌体内溶分を得た。次
にＰＨＢ菌体内分解活性測定は、アルカリゲネス・ユー
トロファスから得られたＰＨＢ顆粒をプロテアーゼ（例
えば、アルカラーゼ）処理したものを基質として用い
た。活性の値としては、ＰＨＢ顆粒から遊離した３−ヒ
ドロキシ酪酸の量で表わした。結果を表１に示した。な
お、約６．２ＫｂのＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ断片を組み込
んだプラスミドＤＮＡをもつ形質転換体大腸菌Ｃ６００
（ｐＺＤ０３４）株は工業技術院微生物工業技術研究所
に、微工研菌寄第１３１３３号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３１
３３）として寄託されている。
ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩを用いて（１）で得られた約
９．３ｋｂのＤＮＡ断片の制限酵素切断地図を作製し
た。これを図１に示す。 （３）サブクローニング （２）で得られた約９．３ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨ
ＩのＤＮＡ断片から約６．２ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｓａｌ
Ｉを得、次ぎにこれをｐＵＣ１９に連結した。ベクター
としてｐＵＣ１８を用いても行った。同様に（２）で得
られた約９．３ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩのＤＮＡ
断片から約３．４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩおよび
約３．０ｋｂのＳｍａＩ−ＳａｌＩを得、次ぎにこれを
それぞれｐＵＣ１９に連結した。 （４）遺伝子の発現及びＰＨＢ菌体内分解活性測定 （３）で得られたサブクローンを大腸菌ＪＭ１０９に導
入した後、これをＬＢ培地で培養し、超音波破砕法で菌
体を破砕し、遠心分離により菌の菌体内溶分を得た。次
にＰＨＢ菌体内分解活性測定は、アルカリゲネス・ユー
トロファスから得られたＰＨＢ顆粒をプロテアーゼ（例
えば、アルカラーゼ）処理したものを基質として用い
た。活性の値としては、ＰＨＢ顆粒から遊離した３−ヒ
ドロキシ酪酸の量で表わした。結果を表１に示した。な
お、約６．２ＫｂのＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ断片を組み込
んだプラスミドＤＮＡをもつ形質転換体大腸菌Ｃ６００
（ｐＺＤ０３４）株は工業技術院微生物工業技術研究所
に、微工研菌寄第１３１３３号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３１
３３）として寄託されている。
【００２３】実施例２ ＰＨＢ菌体内分解遺伝子の塩基配列の決定 実施例１で得られた約３．４ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ断片と約３．０ｋｂのＳｍａＩ−ＳａｌＩ断片域を
Ｍ１３ファージを用いたジデオキシ法により塩基配列を
決定した。この配列を配列表の配列番号１に示した。
その４０１８塩基対からなる塩基配列中には、第３９５
番目のＡＴＧから始り、第１１５１番目のＴＡＧで終わ
る塩基対のオープンリーディングフレームおよび第３１
７３番目のＡＴＴから始り、第３９５６番目のＴＡＧで
終わる塩基対のオープンリーディングフレームがそれぞ
れ存在した。このオープンリーディングフレームに対応
したアミノ酸配列を有するポリペプチドがＰＨＢ菌体内
分解酵素活性を示すことは、実施例１（３）において得
られた組換えベクターを用いての実施例１（４）におい
て行われた実験の結果からも支持されている。
ＲＩ断片と約３．０ｋｂのＳｍａＩ−ＳａｌＩ断片域を
Ｍ１３ファージを用いたジデオキシ法により塩基配列を
決定した。この配列を配列表の配列番号１に示した。
その４０１８塩基対からなる塩基配列中には、第３９５
番目のＡＴＧから始り、第１１５１番目のＴＡＧで終わ
る塩基対のオープンリーディングフレームおよび第３１
７３番目のＡＴＴから始り、第３９５６番目のＴＡＧで
終わる塩基対のオープンリーディングフレームがそれぞ
れ存在した。このオープンリーディングフレームに対応
したアミノ酸配列を有するポリペプチドがＰＨＢ菌体内
分解酵素活性を示すことは、実施例１（３）において得
られた組換えベクターを用いての実施例１（４）におい
て行われた実験の結果からも支持されている。
【００２４】実施例３ 形質転換体によるＰＨＢ菌体内分解酵素の製造 （３）で得られたサブクローン（例えば、約３．４ｋｂ
のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片および約３．０ｋｂのＳ
ｍａＩ−ＳａｌＩ断片を有する組換えベクター）を大腸
菌ＪＭ１０９に導入した後、ＬＢ培地で３７℃一晩前培
養する。次に５５０ｎｍの吸光度が０．１になるように
本培養液に植菌する。５５０ｎｍの吸光度が１．０付近
になったところでＩＰＴＧによるインダクションを行
い、その後２４時間培養を続ける。培養終了後集菌し、
ＴＥ緩衝液による洗浄後超音波破砕を行う。この時のＰ
ＨＢ菌体内分解活性を表１に示した。
のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片および約３．０ｋｂのＳ
ｍａＩ−ＳａｌＩ断片を有する組換えベクター）を大腸
菌ＪＭ１０９に導入した後、ＬＢ培地で３７℃一晩前培
養する。次に５５０ｎｍの吸光度が０．１になるように
本培養液に植菌する。５５０ｎｍの吸光度が１．０付近
になったところでＩＰＴＧによるインダクションを行
い、その後２４時間培養を続ける。培養終了後集菌し、
ＴＥ緩衝液による洗浄後超音波破砕を行う。この時のＰ
ＨＢ菌体内分解活性を表１に示した。
【表１】
【００２５】
【発明の効果】微生物より単離したＰＨＡ分解遺伝子を
含むＤＮＡの塩基配列を解析することによりＰＨＡ菌体
内分解酵素の必須領域をベクターＤＮＡに組み込みＰＨ
Ａ菌体内分解酵素大量に得ることが出来た。これによ
り、ＰＨＡ菌体内分解酵素の性質を検討することが可能
になり、ＰＨＡの産生効率の向上に役立てることが出来
る。
含むＤＮＡの塩基配列を解析することによりＰＨＡ菌体
内分解酵素の必須領域をベクターＤＮＡに組み込みＰＨ
Ａ菌体内分解酵素大量に得ることが出来た。これによ
り、ＰＨＡ菌体内分解酵素の性質を検討することが可能
になり、ＰＨＡの産生効率の向上に役立てることが出来
る。
【００２６】
【図１】実施例１（１）で得られた約９．３ｋｂのＤＮ
Ａ断片の制限酵素切断地図を示す。
Ａ断片の制限酵素切断地図を示す。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/55 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 三枝 治久 東京都港区西新橋２丁目８番11号 第７東 洋海事ビル８階
Claims (14)
- 【請求項１】 ポリヒドロキシアルカノエート分解活性
を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。 - 【請求項２】 ポリヒドロキシアルカノエートがポリ−
３−ヒドロキシブチレートまたはその共重合体である請
求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項３】 配列表の配列番号１に示した塩基配列の
第３９５番目から第１１５１番目に対応して示したアミ
ノ酸配列またはそれと実質的に同等の機能を有するポリ
ペプチドあるいは配列番号１に示した塩基配列の第３１
７３番目から第３９５６番目に対応して示したアミノ酸
配列またはそれと実質的に同等の機能を有するポリペプ
チドをコードする請求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項４】 配列表の配列番号１に示した塩基配列の
第３９５番目から第１１５１番目に対応して示したアミ
ノ酸配列をコードする請求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項５】 配列表の配列番号１に示した塩基配列の
第３１７３番目から第３９５６番目に対応して示したア
ミノ酸配列をコードする請求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項６】 配列表の配列番号１に示した塩基配列の
第３９５番目から第１１５１番目または第３１７３番目
から第３９５６番目あるいはそれらと実質的に同等の機
能を有する塩基配列をコードする請求項１記載のＤＮ
Ａ。 - 【請求項７】 配列表の配列番号１に示した塩基配列の
第３９５番目から第１１５１番目をコードする請求項１
記載のＤＮＡ。 - 【請求項８】 配列表の配列番号１に示した塩基配列の
第３１７３番目から第３９５６番目をコードする請求項
１記載のＤＮＡ。 - 【請求項９】 ポリヒドロキシアルカノエート分解活性
を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに
組み込んでなる組換え体ＤＮＡ。 - 【請求項１０】 請求項２〜８のいずれか一つに記載の
ＤＮＡをベクターに組み込んでなる請求項９記載の組換
え体ＤＮＡ。 - 【請求項１１】 ポリヒドロキシアルカノエート分解活
性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをベクター
に組み込んでなる組換え体ＤＮＡで形質転換せしめられ
た形質転換体。 - 【請求項１２】 該組換え体ＤＮＡが請求項１０に記載
のＤＮＡをベクターに組み込んでなるものである請求項
１１記載の形質転換体。 - 【請求項１３】 ポリヒドロキシアルカノエート分解活
性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをベクター
に組み込んでなる組換え体ＤＮＡで形質転換せしめられ
た形質転換体を培養し、次に得られたポリヒドロキシア
ルカノエート菌体内分解酵素を採取することを特徴とす
るポリヒドロキシアルカノエート菌体内分解酵素の製造
法。 - 【請求項１４】 形質転換体が請求項１２に記載のもの
である請求項１３記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4279099A JPH0686681A (ja) | 1992-09-07 | 1992-09-07 | Ｐｈａ菌体内分解酵素 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4279099A JPH0686681A (ja) | 1992-09-07 | 1992-09-07 | Ｐｈａ菌体内分解酵素 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0686681A true JPH0686681A (ja) | 1994-03-29 |
Family
ID=17606405
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4279099A Pending JPH0686681A (ja) | 1992-09-07 | 1992-09-07 | Ｐｈａ菌体内分解酵素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0686681A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0863209A3 (en) * | 1997-01-08 | 1999-12-01 | Taisei Corporation | Polyhydroxyalkanoate depolymerase and process for producing the same |
-
1992
- 1992-09-07 JP JP4279099A patent/JPH0686681A/ja active Pending
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| J.BACTERIOL.=1989US * |
| J.BIOL.CHEM.=1991US * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0863209A3 (en) * | 1997-01-08 | 1999-12-01 | Taisei Corporation | Polyhydroxyalkanoate depolymerase and process for producing the same |
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