JPH0255036B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、グラム陽性菌のストレプトコツカ
ス・フエカリス（Streptococcus faecalis）のプ
ラスミドと、グラム陰性菌のエシエリシア・コリ
（Escherichia coli）のベクターから合成された
大腸菌又は枯草菌のクローニングベクターとして
有用な新規な複合プラスミドに関するものであ
る。 更に詳しくは、本発明は、ストレプトコツカ
ス・フエカリスのプラスミドpAMα1由来のテト
ラサイクリン耐性遺伝子Tcと、エシエリシア・
コリのベクターpACYC177由来のアンピシリン
耐性遺伝子領域Ampと、更に、上記プラスミド
pAMα1由来の複製開始領域OripAMα１及び上
記pACYC177由来の複製開始領域Ori１７７のう
ち少なくともいずれか一方を有し、上記テトラサ
イクリン耐性遺伝子領域には、制限酵素Balに
対する全領域中唯一の認識切断部位が位置し、更
に、上記アンピシリン耐性遺伝子領域には、制限
酵素Bal及びPstの各々に対する全領域中唯
一の認識切断部位が位置することを特徴とする新
規な複合プラスミドに関するものである。 一般に、In vitro遺伝子操作では、所望の外来
DNAを宿主細胞内に移入させて、その遺伝子情
報を発現させるためには、宿主細胞に適合したベ
クターを使用することが要請されている。遺伝子
操作におけるベクターに関しては、研究例の多い
大腸菌の宿主―ベクター系にて最もよく解明され
ているが、最近では、大腸関以外の微生物、例え
ば、工業的に有用な微生物である枯草菌、抗生物
質の生産菌である放線菌、醸造分野で広く利用さ
れている酵母などに関しても、宿主―ベクター系
の開発研究が活発に行われている。 ところで、ベクターとしての必須条件が、自己
複製に必要な遺伝子配列と、外来DNAを挿入す
るための制限酵素の認識切断部位の存在であるこ
とが知られているが、実用化のためには、例え
ば、遺伝子操作を可能にし、且つ、容易にするた
めの制限酵素の種類とその認識切断部位、形質発
現の効率、形質転換体の検出等に必要なマーカー
遺伝子の存在、宿主細胞との適合性と宿主域、宿
主細胞内での安定性、更には、仮想される生物災
害のリスクの逓減を企図した生物的封じ込めに対
する適応性など、種々の条件を満すような特性が
要請されることから、大腸菌、枯草菌の宿主―ベ
クター系に関しても実際上有用なベクターの開発
例が余り多くはないのが現状である。 かかる現状に鑑み、本発明者らは、これまで
に、大腸菌、及びアミラーゼなどの生産菌として
工業的に有用な枯草菌について、その宿主―ベク
ター系を確立すべく、有用なプラスミドベクター
の開発研究を積重ねて来た。その結果、ストレプ
トコツカス・フエカリスのプラスミドpAMα1と、
エシエリシア・コリのベクターpACYC177とか
ら合成した複合プラスミドが、大腸菌又は枯草菌
の遺伝子操作におけるベクターとして好適な種々
の特性を保有していることを見出して、本発明を
完成するに至つた。 本発明の複合プラスミドの構成は、ストレプト
コツカス・フエカリスDS5（ATCC14508）のプラ
スミドpAMα1と、エシエリシア・コリのベクタ
ーpACYC177とを、上記pAMα1由来のテトラサ
イクリン耐性遺伝子域Tcと、上記pACYC177由
来のアンピシリン耐性遺伝子領域Ampと、更に、
上記pAMα1由来の複製開始領域OripAMα１及
び上記pACYC177由来の複製開始領域Ori１７７
のうち少なくともいずれか一方を含むように、酵
素的に切断し、連結することにより、作製した複
合プラスミドであり、具体的には、その欠失領域
の相域に基づいて分子量の異なる６種類のプラス
ミド、すなわち、pHY780、pHY600、pHY460、
pHY330、pHY285、pHY225と命名される各複
合プラスミドを含むものである。 上記この発明に係わる複合プラスミドは、いず
れも、そのDNA上にテトラサイクリン及びアン
ピシリンに対する耐性遺伝子領域を有しているの
で、形質転換に際しては、宿主細胞に対して両薬
剤に関する耐性形質を付与する特性を備えてい
る。この特性は、所望の外来DNAを組込んだ組
換えプラスミド保有菌株、すなわち、形質転換体
を取得するに際して、その検出及び選択を行うた
めの選択マーカーの役割を果すものである。加え
て、上記この発明に係わる複合プラスミドのテト
ラサイクリン耐性遺伝子領域には、制限酵素Bal
に対する全領域中唯一の認識切断部位が位置す
ると共に、そのアンピシリン耐性遺伝子領域に
は、二種類の制限酵素Bgl及びPstの各々に
対する全領域中唯一の認識切断部位が位置してい
るので、かかる制限酵素により、この発明に係わ
る複合プラスミドのDNAを特異的に切断する限
り、該DNA中に不所望の多数の切断部位を生じ
てこれが断片化してしまうことはない。 しかして、上記全領域中唯一の切断部位のいず
れかを所望の外来の異種DNAの挿入箇所として
使用することができるものである。 そして、とりわけ、テトラサイクリン耐性遺伝
子領域の制限酵素Balの認識切断部位は、
DNAの６塩基の中央が切断されるいわゆるフラ
ツシユエンド（flush end）を形成して切断され
るので、同種の制限酵素により切断して作製され
たDNA断片はもとより、他のいかなるフラツシ
ユエンド型の制限酵素で切断されたDNA断片を
も、リンカーDNA等を用いることなく、直接的
に連結することが可能であり、更には、人工的に
フラツシユ エンドにしたDNA断片をもクロー
ニングできる特徴を有するものである。 本発明に係わる複合プラスミドのうち、特に、
pHY460に関しては、大腸菌の他に、枯草菌中で
も、前述の二つの複製開始領域、即ち、プラスミ
ドpAMα1由来の複製開始領域OripAMα１と、
ベクターpACYC177由来の複製開始領域Ori１７
７とが適切に作用して、安定に増殖し、そのテト
ラサイクリン耐性遺伝子が上記両菌種にて発現す
るので、大腸菌と枯草菌の間を往復できるシヤト
ルベクター（Shuttle vector）としての特質を備
えているものである。 付言するならば、現在、最も研究開発の進んだ
DNAクローニングシステムは、グラム陰性菌の
エシエリシア・コリＫとそのベクター系（EK系）
であつて、このシステムでは、グラム陰性菌に由
来する遺伝子、および、グラム陽性菌に由来する
ある種の遺伝子を形質発現させることができる。 ところで、一方、グラム陽性菌の系に関して
は、解明すべき問題点がより多く残されているの
で、今日、多大の関心が払われている。特に、グ
ラム陽性菌のうち、枯草菌（Bacillus subtilis）
に関しては、実用上種々の利点を持つ有用な微生
物である反面、その生物学的性状が大腸菌のそれ
とは全く異つているので、近年、その遺伝的解
析、更には、遺伝子のクローニングシステムの開
発が非常な関心事となつている。 しかして、かかる現状下で、枯草菌の宿主―ベ
クター系を確立することは切迫した産業上の要請
となつているから、本発明者らが、グラム陰性菌
の代表菌種である大腸菌と、グラム陽性菌の代表
菌種である枯草菌の間を往復できるシヤトルベク
ターを開発し得たことは、グラム陽性菌のDNA
クローニングシステムの確立への一つの段階を克
服するものとして意義深く、しかして、pHY460
を含むこの発明に係わる複合プラスミドは産業的
に有用なものである。 そればかりか、他のグラム陽性菌、例えば、ラ
クトバチルス属（Lactobacillus）、ビヒドバクテ
リウム属（Bifidobacterium）などに属する微生
物の遺伝子の解析や分子育種の面にも拡張的に活
用できる可能性を有している点で産業上有望なも
のである。 続いて、この発明に係わる複合プラスミドの構
成を詳細に説明すれば以下の通りである。 複合プラスミドpHY780の構成 (1) 複合プラスミドpHY780は、分子量約7.8メ
ガダルトンの環状デオキシリボ核酸（DNA）
である。 (2) pHY780は、ストレプトコツカス・フエカリ
スDS5（ATCC14508）のテトラサイクリン耐性
遺伝子領域Tcを含むプラスミドpAMα1を制限
酵素Hindで切断して得られるDNA断片と、
エシエリシア・コリのアンピシリン耐性遺伝子
領域AmP及びカナマイシン耐性遺伝子領域
Kmを含むプラスミドベクターpACYC177を制
限酵素Hindで切断して得られるDNA断片と
を、連結して合成した複合プラスミドである。 そして、かかる合成の原料として使用される
プラスミドpAMα1及びベクターpACYC177
は、いずれも公知のものである（pAMα1：
Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，72、1720−1724
（1975）、pACYC177：J.Bacteriol.，134、1141
−1156（1978））。 なお、合成された複合プラスミドの分子量の
決定に際しては、大腸菌のλフアージDNAを
Hindで消化して得られる分子量既知の断片
（J.Mol.Biol.，98，551−564（1975））が0.8％ア
ガロースゲル上に描く泳動距離の基準線との対
比により、各種制限酵素で消化されたプラスミ
ドpHY780の各断片の分子量を測定し、それら
の総和を算出した。 (3) pHY780は、そのアンピシリン耐性遺伝子領
域AmPに、制限酵素Bgl及びPstの各各に
対する全領域中唯一の認識切断部位を有し、更
に、そのテトラサイクリン耐性遺伝子領域Tc
に、制限酵素Balに対する全領域中唯一の認
識切断部位を有するので、これらの認識切断部
位を外来DNAの挿入部位とすることができる。 そして、pHY780の、各種制限酵素に対する
切断感受性（認識切断部位の数）は以下の通り
である。 制限酵素 切断部位数 Ava ２ Bal １ BamH ２ Bal １ EcoR ２ Hae ４ Hind ３ Hpa ２ Kpn ２ Pst １ Pvu ２ Sac １ Sal １ Xba １ Xho １ なお、上記切断部位数は、pHY780を過剰の
各種制限酵素の存在下で完全に消化して得られ
た消化物をアガロースゲル上にて電気泳動させ
た際の識別可能なバンドの数に従つて決定され
たものである。 (4) pHY780は、グラム陰性菌である大腸菌の生
態系内で自己複製可能であるばかりか、その自
己複製されたDNA上の特定の領域中に存在す
るアンピシリン（Amp）及びテトラサイクリ
ンTc耐性遺伝子に由来する耐性形質をその宿
主菌に付与するので、これを形質転換体に対す
る選択マーカーとして利用することができる。 複合プラスミドpHY600の構成 (1) 複合プラスミドpHY600は、分子量約6.0メ
ガダルトンの環状デオキシリボ核酸（DNA）
である。 (2) pHY600は上記pHY780を制限酵素BamH
で切断することにより、約1.8メガダルトンの
DNA断片を欠失させた後、得られたDNA断片
をT4リガーゼにより連結して合成した複合プ
ラスミドである。 (3) pHY600は、前記pHY780と同様にそのアン
ピシリン耐性遺伝子領域AmPに、制限酵素
Bgl及びPstの各々に対する全領域中唯一
の認識切断部位を有し、更に、そのテトラサイ
クリン耐性遺伝子領域Tcに、制限酵素Balに
対する全領域中唯一の認識切断部位を有するの
で、これらの認識切断部位を外来DNAの挿入
部位とすることができる。 そして、pHY600の、各種制限酵素に対する
切断感受性（認識切断部位の数）は以下の通り
である。 制限酵素 切断部位数 Ava ２ Bal １ BamH １ Bgl １ EcoR ２ 制限酵素 切断部位数 Hae ２ Hind １ Hpa ２ Pst １ Pvu ２ Sac １ Sal １ Xba １ Xho １ (4) pHY600は、pHY780と同様に、グラム陰性
菌である大腸菌の生態系内で自己複製可能であ
ると共に、宿主菌にテトラサイクリン及びアン
ピシリンに対する耐性形質を付与するので、少
なくとも大腸菌のクローニングベクターとして
成立する。 複合プラスミドpHY460の構成 (1) 複合プラスミドpHY460は、分子量約4.6メ
ガダルトンの環状デオキシリボ核酸（DNA）
である。 (2) pHY460は、上記pHY600を制限酵素Xho
及びSalで切断することにより、約1.4メガダ
ルトンのDNA断片を欠失させた後、得られた
DNA断片をT4リガーゼにより連結して合成し
た複合プラスミドである。 (3) pHY460は、そのアンピシリン耐性遺伝子領
域AmPに、制限酵素Bgl、Pst及びPvu
の各々に対する全領域中唯一の認識切断部位を
有し、更に、そのテトラサイクリン耐性遺伝子
領域Tcに、制限酵素Bal及びHpaの各々に
対する全領域中唯一の認識切断部位を有するの
で、これらの認識切断部位を外来DNAの挿入
部位とすることができる。 そして、pHY460の、各種制限酵素に対する
切断感受性（認識切断部位の数）は以下の通り
である。 制限酵素 切断部位数 Ava １ Bal １ BamH １ Bgl １ EcoR ２ Hae ２ Hpa １ Pst １ Pvu １ Sac １ Xba (4) pH460は、グラム陰性菌の代表である大腸菌
のみならず、グラム陽性菌の代表である枯草菌
の生態系内で自己複製可能であると共に、これ
らの宿主菌にテトラサイクリン耐性遺伝子に由
来する耐性形質を付与するので、少なくとも、
大腸菌と枯草菌に両立するクローニングベクタ
ー（シヤトル ベクター）として成立する。 複合プラスミドpHY330の構成 (1) 複合プラスミドpHY330は、分子量約3.3メ
ガダルトンの環状デオキシリボ核酸（DNA）
である。 (2) pHY330は、上記pHY460を制限酵素Xba
及びS1ヌクレアーゼでランダム切断すること
により、そのDNAをランダム縮小させた後、
得られたDNA断片をT4リガーゼにより連結し
て合成した複合プラスミドである。 (3) pHY330は、そのアンピシリン耐性遺伝子領
域AmPに、制限酵素Bgl、Pst及びPvu
の各々に対する全領域中唯一の認識切断部位を
有し、更に、そのテトラサイクリン耐性遺伝子
領域Tcに、制限酵素Bal及びHpaの各々に
対する全領域中唯一の認識切断部位を有するの
で、これらの認識切断部位を外来DNAの挿入
部位とすることができる。 そして、pHY330の、各種制限酵素に対する
切断感受性（認識切断部位の数）は以下の通り
である。 制限酵素 切断部位数 Bal １ Bgl １ EcoR １ Hae ２ Hpa １ Pst １ Pvu １ Sac １ (4) pHY330は、pHY780と同様に、グラム陰性
菌である大腸菌の生態系内で自己複製可能であ
ると共に、宿主菌に耐性形質を付与するので、
少なくとも、大腸菌のクローニングベクターと
して成立する。 付言するならば、この複合プラスミド
pHY330及び後述する複合プラスミド
pHY285、pHY225では、プラスミドpAMα1
由来の複製開始領域OripAMα１が欠失し、ベ
クターpACYC177由来の複製開始領域Ori１７
７のみが残存するので、枯草菌に代表されるグ
ラム陽性菌種の生態系内で自己複製することは
ない。 複合プラスミドpHY285の構成 (1) 複合プラスミドpHY285は、分子量約2.85メ
ガダルトンの環状デオキシリボ核酸（DNA）
である。 (2) pHY285は、上記pHY330を制限酵素Hae
で切断することにより、約0.45メガダルトンの
DNA断片を欠失させた後、得られたDNA断片
をT4リガーゼにより連結して合成した複合プ
ラスミドである。 (3) pHY285は、そのアンピシリン耐性遺伝子領
域AmPに、制限酵素Bal、Pst及びPvu
の各々に対する全領域中唯一の認識切断部位を
有し、更に、そのテトラサイクリン耐性遺伝子
領域Tcに、制限酵素Bal及びHpaの各々に
対する全領域中唯一の認識切断部位を有するの
で、これらの認識切断部位を外来DNAの挿入
部位とすることができる。 そして、pHY285の、各種制限酵素に対する
切断感受性（認識切断部位の数）は以下の通り
である。 制限酵素 切断部位数 Acc １ Bal １ Bgl １ BstE １ EcoR １ 制限酵素 切断部位数 EcoR ４ Hae １ Hpa １ Pst １ Pvu １ Sac １ (4) pHY285は、pHY780と同様に、グラム陰性
菌である大腸菌の生態系内で自己複製可能であ
ると共に、宿主菌に耐性形質を付与するので、
少なくとも、大腸菌のクローニングベクターと
して成立する。 複合プラスミドpHY225の構成 (1) 複合プラスミドpHY225は、分子量約2.25メ
ガダルトンの環状デオキシリボ核酸（DNA）
である。 (2) pHY225は、上記pHY285を制限酵素Sac
及びEcoRで切断し、更に、S1ヌクレアーゼ
で処理することにより、DNAを宿小させた後、
得られたDNA断片をT4リガーゼにより、連結
して合成した複合プラスミドである。 (3) pHY225は、そのアンピシリン耐性遺伝子領
域AmPに、制限酵素Bgl、Pst及びPvu
の各々に対する全領域中唯一の認識切断部位を
有し、更に、そののテトラサイクリン耐性遺伝
子領域Tcに、制限酵素Bal及びHpaの各々
に対する全領域中唯一の認識切断部位を有する
ので、これらの認識切断部位を外来DNAの挿
入部位とすることができる。 そしてpHY225の、各種制限酵素に対する切
断感受性（認識切断部位の数）は以下の通りで
ある。 制限酵素 切断部位数 Bal １ 制限酵素 切断部位数 Bgl １ BstE １ EcoR ２ Hinc ３ Hpa １ Pst １ Pvu １ (4) pH225は、pHY780と同様に、グラム陰性菌
である大腸菌の生態系内で自己複製可能である
と共に、宿主菌に耐性形質を付与するので、少
なくとも、大腸菌のクローニングベクターとし
て成立する。 以上のように構成された、この発明に係わる複
合プラスミドpHY780、pHY600、pHY460、
pHY330、pHY285、pHY225は、少なくとも、
大腸菌を宿主菌とするDNA組換え技術により任
意の遺伝子をクローン化する際に必要なベクター
としての条件を完全に具備しており、とりわけ、
pHY460は上記DNA組換え技術の適用に際して、
少なくとも、大腸菌と枯草菌との間を往復可能な
シヤトルベクターとしての条件をも完全に具備し
ているので、この発明に係わる複合プラスミドに
よれば、大腸菌、枯草菌等の宿主菌に対して、他
の微生物等から有用物質の生合成あるいはその調
節に関する特定の遺伝子をクローニングすること
により、該宿主菌の生態系内で有用物質の生産を
行わせたり、更には、上記特定の遺伝子に係わる
遺伝子情報の増幅作用を通じて生合成系を強化す
ることにより、有用物質の生産性を増大させたり
するための有効な手段を提供することができる。
そして、特にpHY460によれば、枯草菌に代表さ
れるグラム陽性菌種の生態系内で他の微生物由来
等の種々の遺伝子を発現させることができるの
で、グラム陽性菌種の遺伝子の解析や分子育種に
有効な手段をも提供することができる。 続いて、この発明の実施例を説明すれば以下の
通りである。 実施例 １ 複合プラスミドpHY780の合成 (1) pHY177の調製。 エシエリシア・コリK12 WA802r-m+
（pACYC177）（東京大学応用微生物研究所斎
藤研究室保有）を、Ｌ−ブロス（バクト―トリ
プトン（Bacto―trypton）１％、酵母エキス
0.5％、NaCl0.5％、グルコース0.1％をIN−
NaOHでPH7.0に調節したもの）中で、一夜培
養した後、遠心分離処理にて集菌し、これを、
100mlの20mM Tris−10mM EDTA（PH8.0）
で２回洗滌した。洗滌後の菌体を９mlの
100mM NaCl−20mM Tris−10mM EDTA
に溶解させた。次いで、リゾチームとRNase
をそれぞれ100μg／mlと、50μg／mlとになるよ
うに加え、０℃で、10分間反応させた後、２％
SDSを１ml加えて、37℃で５分間、上記反応
後の菌を更に溶解させた。この溶液を０℃で10
分間放置した後、36000rpmで30分間遠心分離
処理し、分離された上清をDNA粗標品として
採取した。これに等重量の塩化セシウムを加
え、５mg／mlのエチジウムブロマイド（EtBr）
を0.7ml加えた。これに36000rpm、40時間の遠
心分離処理をほどこしてDNA画分を集め、更
に36000rpm、40時間の遠心分離処理を行つた。
分離されたDNA画分を飽和塩化セシウム水で
飽和したイソプロパノールを用いて洗滌するこ
とにより、EtBrを除去した。次いで、10mM
Tris−0.1mM EDTA（PHを7.4）（以下緩衝液Ａ
という）に対して透析し、更に、DNAと等量
のフエノール（緩衝液Ａで飽和したもの）を加
えて、振とうした。そして、遠心分離処理によ
り得られた水層を緩衝液Ａに対して透析して、
第１図Ａの切断地図で表わされる
pACYC177DNAを調製した。 (2) pAMα1の調製。 ストレプトコツカス・フエカリス DS5
（ATCC14508）を500mlのロゴサ培地
（RogoSa medium：１中 グルコース20ｇ、
トリプチケース―ペプトン10ｇ、酵母エキス
5g、トリプトース３ｇ、K2HPO43ｇ、
KH2PO43ｇ、クエン酸アンモニウム２ｇ、酢
酸ナトリウム１ｇ、ツイーン80 １ｇ、
MgSO4・H2O0.575ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩
0.5ｇ、MnSO4・2H2O0.12ｇ、FeSO4・7H2O
84mgを含む：PH6.8）にて一夜培養した。 後述のDNA抽出処理は、(1)項記載の
pACYC−177の調整の場合と同様の方法によ
り、行つた。次いで、抽出されたDNA0.5ml
を、ニトロセルロース遠心管中の12mlの５％〜
30％庶糖グラデイエント上にのせた。緩衝液と
しては、50mM Tris−50mM EDTA−50mM
NaCl（PH8.0）を使用した。20000rpm、16時
間、10℃で遠心分離処理した後、上記ニトロセ
ルロース遠心管の底に穴を開けて、10滴づつ分
画した。各分画中のDNA10μを0.8％アガロ
ースゲル上で電気泳動させて、そのDNAの分
子量を確認した。そして、分子量６メガダルト
ンの８画分を緩衝液Ａで透析した。以上の処理
を経て、第１図Ｂの切断地図で表わされる
pAMα1をβ1、γ1の混合物から分離した。 (3) pACYC177及びpAMα1の制限酵素による切
断及びT4リガーゼによる連結（ligation）。 上記(1)項(2)項記載の処理により得られた10μ
の各DNA（0.1〜0.2μg DNA量）に、1μの
10倍濃度緩衝液（10mM Tris−HCl（PH7.6）、
7mM MgCl2、7mM β−メルカプトエタノー
ル、50mM NaCl）を加えた後、更に、4u／μ
のHindを添加し、これを37℃、60分間反
応させた。そして、60℃、10分間でこの反応を
停止させた後、1/50量の5M NaClを加え、更
に、全量の２倍量の−20℃の冷エタノールを加
え、これを−20℃、30分間冷却した。更に、こ
れを15000rpm、０℃、５分間、遠心分離処理
した後、上清を捨てて、沈殿物を再び−20℃エ
タノールで洗滌しした。これを15000rpm、０
℃、２分間、遠心分離処理した後、上清のエタ
ノールを捨てて、更に、エタノールを完全に蒸
発させた。 これにより得られたDNA断片に20μの滅
菌水を加えて溶解させ、10mM ATP3μ、
100mMジチオスレイトール3μ、660mM
Tris−HCl（PH7.6）−66mM MgCl2 3μを加
え、更に、400u／μのT4リガーゼを0.5μ
加えた。15℃で一夜反応を行わせた後、120μ
の滅菌水を加えて、全量を150μとした。 (4) プラスミドDNAによる大腸菌の形質転換。 エシエリシア・コリ K12 C600r-m-（東京
大学応用微生物研究所斎藤研究室保有）株を、
Ｌ―ブロス中で一夜培養した。この培養液0.05
mlを５mlのＬ−ブロスに加えて、37℃で２時間
10分の振とう培養を行つた。遠心分離処理にて
集菌した後、得られた菌を０℃の0.1M CaCl2
水で洗滌し、0.25mlの０℃、0.1M CaCl2水に
溶解することにより、コンピテント細胞を作製
した。そして、0.1mlのコンピテント細胞に対
して0.1mlの上記(3)項の処理で得たDNA（濃度
1μg／ml）を加え、０℃にて５分間放置した
後、0.8mlのＬ−ブロスを加えて、37℃で１時
間培養した。次いで、この培養液をＬ−ブロス
に1.5％寒天と、20μg／mlのテトラサイクリン
と、30μg／mlのアンピシリンとを添加して成
る選択培地の表面上に塗布して、37℃で一夜培
養した。その際、この選択培地上でコロニーを
形成した10株の形質転換体について、保有プラ
スミドの大きさを調べた。 (5) 形質転換体からのプラスミドDNAの抽出及
び分子量の測定。 形質転換体をＬ−ブロス中で一夜培養した培
養液５mlを分離処理にて集菌した。次いで、分
離された菌を0.5mlの100mM NaCl−50mM
Tris−10mM EDTA（PH7.4）に溶解させた。
この溶液に0.2mlの２mg／mlリゾチーム―0.5
mg／ml RNaseを加えて、37℃で５分間反応
させた。0.2mlの２％SDS溶液を加えて、30℃
で１〜２分間更に反応させ、０℃で10分間放置
後、この溶液を20000rpmで０℃、10分間、遠
心分離処理した。分離された上清0.5mlに緩衝
液Ａで飽和したフエノール0.5mlを加え、よく
混合した。更に、これを、15000rpmで３分間
室温で遠心分離処理し、水層を採取し、その
50μづつを0.8％アガロースゲル電気泳動させ
て、その分子量を測定した。上記処理により、
10株の形質転換体について、プラスミドの大き
さを調べたところ、分子量約7.8メガダルトン
であつた。 このようにして、第１図Ａ，Ｂの切断地図で
表わされるpACYC177、pAMα1から合成され
た複合プラスミドのうち、第１図Ｃの切断地図
で表わされるものをpHY780と命名し、他の一
つをpHY11と命名した。 これにより、少なくとも、第１図Ｃの切断地
図で表わされるpHY780が大腸菌の生態系内で
安定に増殖し、形質発現することが確認され
た。 なお、pHY780への連結に際しては、
pACYC177のDNA断片と、SpAMα1のそれと
の連結方向の異る同分子量の他の複合プラスミ
ドpHY11も同時的に生成されるが、両複合プ
ラスミドpHY780、pHY11は、BamHを用
いて、切断処理することにより、断片の大きさ
の異る二つのグループとして分離することがで
きる。そして、第１図Ｃの切断地図に基づい
て、二つの複製開始領域OripAMα１，Ori１
７７のうち、少なくとも、双方を共に欠失させ
ることなく、しかも、二つの遺伝子領域Tc，
Amp中に存在する全領域中唯一の制限酵素認
識切断部位の数を増大させるべく、両遺伝子領
域Tc，Amp中の制限酵素認識切断部位と同一
の切断部位を含む全領域中の部分を切断除去す
るために使用可能な制限酵素の存否の観点か
ら、両複合プラスミドpHY780、pHY11のう
ちpHY780が後続の縮小化処理に有望なものと
して選択された。 実施例 ２ 複合プラスミドpHY600の合成 (1) 実施例１で作製された形質転換体、エシエリ
シア・コリ C600r-m-（pHY780）から、実施
例１の場合と同様の方法により、プラスミド
DNAを抽出した。抽出されたDNA1μg／20μ
に2μの緩衝液（100mM Tris−HCl（PH−
7.6）、70mM MgCl2、70mM β―メルカプト
エタノール、500mM NaCl）を加え、さらに、
4uの制限酵素BamHを加えて、37℃で60分
間反応させた。60℃、10分間熱処理してこの反
応を停止させた後、80μの水を加え、2μの
5M NaClを加え、更に、−20℃のエタノール
200μを加えて、−20℃で30分間放置し、次い
で、０℃で５分間、10000rpmの遠心分離処理
によりDNAを集めた。これを、200μの−20
℃エタノールで洗滌した後、20μの水に溶解
させ、T4リガーゼを用いて実施例１と同様の
方法で連結処理を行つた。 (2) 次いで、このDNAを用いて、エシエリシ
ア・コリ K12 C600r-m-に対する形質転換を
行つた。形質転換体は、20μg／mlテトラサイ
クリン、30μg／mlアンピシリンに耐性を示し
た。この形質転換体のうち、10株について、実
施例１と同様の方法により、プラスミドの大き
さを調べたところ、全て、分子量約６メガダル
トンであつた。 このようにして、第１図Ｃの切断地図で表わ
されるpHY780から合成された、第１図Ｄの切
断地図で表わされる複合プラスミドをpHY600
と命名した。そして、上記処理により、この
pHY600も、少なくとも、大腸菌に対するクロ
ーニングベクターとして使用可能であることが
確認された。 実施例 ３ 複合プラスミドpHY460の合成 実施例２で作製されたpHY600を、制限酵素
Xho及びSalを用いて実施例１と同様の酵素
処理により、切断し、更に、そのDNA断片をT4
リガーゼを用いた酵素処理により連結して、大腸
菌に形質転換し、分子量約4.6メガダルトンのプ
ラスミド（pHY460）を作製した。これにより、
第１図Ｄの切断地図で表わされるpHY600から第
１図Ｅの切断地図で表わされるpHY460が生成さ
れた。 実施例 ４ 複合プラスミドpHY460の枯草菌（バチルス・
ズブチリス）に対する形質転換 (1) コンピテント（Competent）細胞の調製。 Ｌ―寒天平板上で一夜培養したバチリス・ズ
ブチルス（Bacillus subtilis）Marburg168株
（東京大学応用微生物研究所斎藤研究室保有）
を培地（スピザイセン ミネラル培地
（Spizizen mineral medium）：K2HPO41.4％、
KH2PO40.6％、（NH4）2SO40.2％、クエン酸ナ
トリウム0.1％、MgSO4・7H2O0.02％、グルコ
ース0.5％に対してカゼイン加水分解物0.02％、
Ｌ−トリプトフアン 50μg／mlを加えたもの）
に対して、１×108／ml程度接種した。これを
37％で振とう培養して、約４時間経過後、静止
期に入つた段階で、培地（培地のＬ―トリ
プトフアンを5μg／mlとし、更に、5mM
MgSO4を加えたもの）中で、10倍に薄めて培
養を続行した。培養液中の菌は90分後に、コン
ピテント（Competent）状態に達した。このコ
ンピテント細胞0.9mlに実施例３にて作製され
たpHY460複合プラスミドのDNA溶液0.1mlを
加えて37℃で、90分間振とう培養しながら形質
転換を行つた。 (2) 形質転換体の検出。 DNA（pHY460）をとり込ませた形質転換体
を20μg／mlのテトラサイクリンを含むＬ―寒
天平板上に塗布して、37℃で24時間培養した。
得られたコロニーにつき、実施例１と同様の方
法によりプラスミドの存在を確認した。複製さ
れたプラスミドpHY460は、分子量約4.6メガ
ダルトンのものであつた。 そして、実施例１、２と同様の方法により、
エシエリシア・コリK12 C600r-m-に対する形
質転換も確認された。これにより、複合プラス
ミドpHY460は、大腸菌と枯草菌の双方の宿主
―ベクター系におけるクローニングベクター、
即ち、シヤトルベクターであることが判明し
た。 なお、形質転換体としてのエシエリシア・コ
リK12 C600r-m-（pHY460）及びバチルス・
ズブチリス 168（pHY460）は、それぞれ、受
託番号 微工研条寄第438号及び微工研条寄第
439号として工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託済みである。 実施例 ５ 複合プラスミドpHY330の合成 実施例３で作製されたpHY460のXba切断部
位を切り開いて、更に、S1ヌクレアーゼを作用
させた後、T4リガーゼでのDNA断片を連結する
ことによりpHY330を合成した。すなわち、緩衝
液Ａ中に４℃にて４ケ月間保存しておいたDNA
（pHY460）0.5μg／50μを、4uのXba（緩衝
液：10mM Tris−HCl（PH7.6）、7mM MgCl2、
7mM β―メルカプトエタノール、50mM
NaCl）により切断した後、NaCl濃度が10mMに
なるようにNaClを加え、更に、２倍量の冷エタ
ノールを加え、−20℃に冷却した。４℃、
15000rpm、３分間の遠心分離処理により、DNA
断片を集め、これを冷エタノールで洗滌した。エ
タノールを蒸発させた後、50μのS1反応用緩衝
液（30mM 酢酸ナトリウム（PH4.6）、50mM
NaCl、1mM ZnSO4、５％グリセロール）に溶
かしてから、500u／μのS1ヌクレアーゼ0.5μ
を加えて、37℃、５分間反応させた。この反応液
に緩衝液Ａで飽和したフエノールを100μ加え
て、攪拌し、15000rpm、３分間、室温で遠心分
離処理し、DNA断片を含む水層を採取し、これ
のNaCl濃度を100mMに調製した。この水層に
200μの冷エタノールを加えて、−20℃、30〜60
分間冷却し、４℃で、15000rpm、３分間遠心分
離処理をほどこして、その上清を捨てて、沈殿物
を冷エタノールで洗滌した後、エタノールを蒸発
させた。 次いで、遠心管の底に沈殿したDNAを20μ
の水に溶かしてから、3μの10mM ATP、3μ
の100mMジチオスレイトール及び3μの660mM
Tris−HCl（PH7.6）−6.6mM MgCl2を加え、更
に、10uのT4リガーゼ1μを加えて、15℃にて、
一夜反応させることにより、DNAの連結処理を
行つた。 かかる連結処理により合成されたDNAに水
170μを加えて全量を200μとし、このうちの
100μのDNAを使つて実施例１と同様にしてエ
シエリシア・コリ K12 C600r-m-のCaCl2処理
菌100μに対して形質転換を行つた。実施例１
と同様の方法により、分子量約3.3メガダルトン
の複合プラスミドpHY330を形質転換体から抽出
することができた。これにより、第１図Ｅの切断
地図で表わされるpHY460から第１図Ｆの切断地
図で表わされるpHY330が生成され、しかも、そ
のpHY330は、少なくとも、大腸菌に有効なクロ
ーニングベクターであることが確認された。 実施例 ６ 複合プラスミドpHY285の合成 実施例５で作製されたpHY330を、更に制限酵
素Hae（緩衝液：10mM Tris−HCl（PH7.6）、
7mM MgCl2、、7mM β―メルカプトエタノー
ル）で実施例１と同様の方法により、切断・連結
して、大腸菌に形質転換し、分子量約2.85メガダ
ルトンのpHY285を作製した。すべての処理方法
は、実施例１のそれと同様である。これにより、
第１図Ｆの切断地図で表わされるpHY330から第
１図Ｇの切断地図で表わされるpHY285が生成さ
れ、これが、少なくとも、大腸菌に有効なクロー
ニングベクターであることが確認された。 実施例 ７ 複合プラスミドpHY225の合成 実施例６で作製されたpHY285を、更に、制限
酵素Sac及びEcoRで切断し、S1ヌクレアー
ゼで実施例５と同様に処理した後、T4リガーゼ
でDNA断片を連結することによりpHY225を合
成した。すなわち、pHY285DNA0.3μg／50μ
にSac（緩衝液：10mM Tris−HCl（PH7.6）、
7mM MgCl2、7mM β―メルカプトエタノー
ル）を4u加えて、37℃にて60分間反応させた後、
60℃、10分間加熱して、この反応を停止させた。
次いで、この反応液に50mMとなるようにNaCl
を加えてから、4uのEcoRを加え、更に、37
℃、60分間反応させ、60℃、10分加熱した後、
50μの水を加えた。 この混液に、緩衝液Ａで飽和したフエノールを
加え、振とうした後、室温で、15000rpm、30分
間の遠心分離処理を行つた。 分離された水層にNaClを加え、NaCl濃度を
100mMとした後、冷エタノール処理をほどこし
た。エタノールを蒸発させた後、S1ヌクレアー
ゼ処理を37℃、５分間行つて、生成されたDNA
断片を、実施例１と同様の方法により、連結し、
大腸菌に形質転換して、分子量約2.25メガダルト
ンのpHY225を合成した。形質転換体の作製及び
検出、DNAの抽出などの処理は実施例１のそれ
と同様である。これにより、第１図Ｇの切断地図
で表わされるpHY285から第１図Ｈの切断地図で
表わされるpHY225が生成され、これが少なくと
も、大腸菌に有効なクローニングベクターである
ことが確認された。
ス・フエカリス（Streptococcus faecalis）のプ
ラスミドと、グラム陰性菌のエシエリシア・コリ
（Escherichia coli）のベクターから合成された
大腸菌又は枯草菌のクローニングベクターとして
有用な新規な複合プラスミドに関するものであ
る。 更に詳しくは、本発明は、ストレプトコツカ
ス・フエカリスのプラスミドpAMα1由来のテト
ラサイクリン耐性遺伝子Tcと、エシエリシア・
コリのベクターpACYC177由来のアンピシリン
耐性遺伝子領域Ampと、更に、上記プラスミド
pAMα1由来の複製開始領域OripAMα１及び上
記pACYC177由来の複製開始領域Ori１７７のう
ち少なくともいずれか一方を有し、上記テトラサ
イクリン耐性遺伝子領域には、制限酵素Balに
対する全領域中唯一の認識切断部位が位置し、更
に、上記アンピシリン耐性遺伝子領域には、制限
酵素Bal及びPstの各々に対する全領域中唯
一の認識切断部位が位置することを特徴とする新
規な複合プラスミドに関するものである。 一般に、In vitro遺伝子操作では、所望の外来
DNAを宿主細胞内に移入させて、その遺伝子情
報を発現させるためには、宿主細胞に適合したベ
クターを使用することが要請されている。遺伝子
操作におけるベクターに関しては、研究例の多い
大腸菌の宿主―ベクター系にて最もよく解明され
ているが、最近では、大腸関以外の微生物、例え
ば、工業的に有用な微生物である枯草菌、抗生物
質の生産菌である放線菌、醸造分野で広く利用さ
れている酵母などに関しても、宿主―ベクター系
の開発研究が活発に行われている。 ところで、ベクターとしての必須条件が、自己
複製に必要な遺伝子配列と、外来DNAを挿入す
るための制限酵素の認識切断部位の存在であるこ
とが知られているが、実用化のためには、例え
ば、遺伝子操作を可能にし、且つ、容易にするた
めの制限酵素の種類とその認識切断部位、形質発
現の効率、形質転換体の検出等に必要なマーカー
遺伝子の存在、宿主細胞との適合性と宿主域、宿
主細胞内での安定性、更には、仮想される生物災
害のリスクの逓減を企図した生物的封じ込めに対
する適応性など、種々の条件を満すような特性が
要請されることから、大腸菌、枯草菌の宿主―ベ
クター系に関しても実際上有用なベクターの開発
例が余り多くはないのが現状である。 かかる現状に鑑み、本発明者らは、これまで
に、大腸菌、及びアミラーゼなどの生産菌として
工業的に有用な枯草菌について、その宿主―ベク
ター系を確立すべく、有用なプラスミドベクター
の開発研究を積重ねて来た。その結果、ストレプ
トコツカス・フエカリスのプラスミドpAMα1と、
エシエリシア・コリのベクターpACYC177とか
ら合成した複合プラスミドが、大腸菌又は枯草菌
の遺伝子操作におけるベクターとして好適な種々
の特性を保有していることを見出して、本発明を
完成するに至つた。 本発明の複合プラスミドの構成は、ストレプト
コツカス・フエカリスDS5（ATCC14508）のプラ
スミドpAMα1と、エシエリシア・コリのベクタ
ーpACYC177とを、上記pAMα1由来のテトラサ
イクリン耐性遺伝子域Tcと、上記pACYC177由
来のアンピシリン耐性遺伝子領域Ampと、更に、
上記pAMα1由来の複製開始領域OripAMα１及
び上記pACYC177由来の複製開始領域Ori１７７
のうち少なくともいずれか一方を含むように、酵
素的に切断し、連結することにより、作製した複
合プラスミドであり、具体的には、その欠失領域
の相域に基づいて分子量の異なる６種類のプラス
ミド、すなわち、pHY780、pHY600、pHY460、
pHY330、pHY285、pHY225と命名される各複
合プラスミドを含むものである。 上記この発明に係わる複合プラスミドは、いず
れも、そのDNA上にテトラサイクリン及びアン
ピシリンに対する耐性遺伝子領域を有しているの
で、形質転換に際しては、宿主細胞に対して両薬
剤に関する耐性形質を付与する特性を備えてい
る。この特性は、所望の外来DNAを組込んだ組
換えプラスミド保有菌株、すなわち、形質転換体
を取得するに際して、その検出及び選択を行うた
めの選択マーカーの役割を果すものである。加え
て、上記この発明に係わる複合プラスミドのテト
ラサイクリン耐性遺伝子領域には、制限酵素Bal
に対する全領域中唯一の認識切断部位が位置す
ると共に、そのアンピシリン耐性遺伝子領域に
は、二種類の制限酵素Bgl及びPstの各々に
対する全領域中唯一の認識切断部位が位置してい
るので、かかる制限酵素により、この発明に係わ
る複合プラスミドのDNAを特異的に切断する限
り、該DNA中に不所望の多数の切断部位を生じ
てこれが断片化してしまうことはない。 しかして、上記全領域中唯一の切断部位のいず
れかを所望の外来の異種DNAの挿入箇所として
使用することができるものである。 そして、とりわけ、テトラサイクリン耐性遺伝
子領域の制限酵素Balの認識切断部位は、
DNAの６塩基の中央が切断されるいわゆるフラ
ツシユエンド（flush end）を形成して切断され
るので、同種の制限酵素により切断して作製され
たDNA断片はもとより、他のいかなるフラツシ
ユエンド型の制限酵素で切断されたDNA断片を
も、リンカーDNA等を用いることなく、直接的
に連結することが可能であり、更には、人工的に
フラツシユ エンドにしたDNA断片をもクロー
ニングできる特徴を有するものである。 本発明に係わる複合プラスミドのうち、特に、
pHY460に関しては、大腸菌の他に、枯草菌中で
も、前述の二つの複製開始領域、即ち、プラスミ
ドpAMα1由来の複製開始領域OripAMα１と、
ベクターpACYC177由来の複製開始領域Ori１７
７とが適切に作用して、安定に増殖し、そのテト
ラサイクリン耐性遺伝子が上記両菌種にて発現す
るので、大腸菌と枯草菌の間を往復できるシヤト
ルベクター（Shuttle vector）としての特質を備
えているものである。 付言するならば、現在、最も研究開発の進んだ
DNAクローニングシステムは、グラム陰性菌の
エシエリシア・コリＫとそのベクター系（EK系）
であつて、このシステムでは、グラム陰性菌に由
来する遺伝子、および、グラム陽性菌に由来する
ある種の遺伝子を形質発現させることができる。 ところで、一方、グラム陽性菌の系に関して
は、解明すべき問題点がより多く残されているの
で、今日、多大の関心が払われている。特に、グ
ラム陽性菌のうち、枯草菌（Bacillus subtilis）
に関しては、実用上種々の利点を持つ有用な微生
物である反面、その生物学的性状が大腸菌のそれ
とは全く異つているので、近年、その遺伝的解
析、更には、遺伝子のクローニングシステムの開
発が非常な関心事となつている。 しかして、かかる現状下で、枯草菌の宿主―ベ
クター系を確立することは切迫した産業上の要請
となつているから、本発明者らが、グラム陰性菌
の代表菌種である大腸菌と、グラム陽性菌の代表
菌種である枯草菌の間を往復できるシヤトルベク
ターを開発し得たことは、グラム陽性菌のDNA
クローニングシステムの確立への一つの段階を克
服するものとして意義深く、しかして、pHY460
を含むこの発明に係わる複合プラスミドは産業的
に有用なものである。 そればかりか、他のグラム陽性菌、例えば、ラ
クトバチルス属（Lactobacillus）、ビヒドバクテ
リウム属（Bifidobacterium）などに属する微生
物の遺伝子の解析や分子育種の面にも拡張的に活
用できる可能性を有している点で産業上有望なも
のである。 続いて、この発明に係わる複合プラスミドの構
成を詳細に説明すれば以下の通りである。 複合プラスミドpHY780の構成 (1) 複合プラスミドpHY780は、分子量約7.8メ
ガダルトンの環状デオキシリボ核酸（DNA）
である。 (2) pHY780は、ストレプトコツカス・フエカリ
スDS5（ATCC14508）のテトラサイクリン耐性
遺伝子領域Tcを含むプラスミドpAMα1を制限
酵素Hindで切断して得られるDNA断片と、
エシエリシア・コリのアンピシリン耐性遺伝子
領域AmP及びカナマイシン耐性遺伝子領域
Kmを含むプラスミドベクターpACYC177を制
限酵素Hindで切断して得られるDNA断片と
を、連結して合成した複合プラスミドである。 そして、かかる合成の原料として使用される
プラスミドpAMα1及びベクターpACYC177
は、いずれも公知のものである（pAMα1：
Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，72、1720−1724
（1975）、pACYC177：J.Bacteriol.，134、1141
−1156（1978））。 なお、合成された複合プラスミドの分子量の
決定に際しては、大腸菌のλフアージDNAを
Hindで消化して得られる分子量既知の断片
（J.Mol.Biol.，98，551−564（1975））が0.8％ア
ガロースゲル上に描く泳動距離の基準線との対
比により、各種制限酵素で消化されたプラスミ
ドpHY780の各断片の分子量を測定し、それら
の総和を算出した。 (3) pHY780は、そのアンピシリン耐性遺伝子領
域AmPに、制限酵素Bgl及びPstの各各に
対する全領域中唯一の認識切断部位を有し、更
に、そのテトラサイクリン耐性遺伝子領域Tc
に、制限酵素Balに対する全領域中唯一の認
識切断部位を有するので、これらの認識切断部
位を外来DNAの挿入部位とすることができる。 そして、pHY780の、各種制限酵素に対する
切断感受性（認識切断部位の数）は以下の通り
である。 制限酵素 切断部位数 Ava ２ Bal １ BamH ２ Bal １ EcoR ２ Hae ４ Hind ３ Hpa ２ Kpn ２ Pst １ Pvu ２ Sac １ Sal １ Xba １ Xho １ なお、上記切断部位数は、pHY780を過剰の
各種制限酵素の存在下で完全に消化して得られ
た消化物をアガロースゲル上にて電気泳動させ
た際の識別可能なバンドの数に従つて決定され
たものである。 (4) pHY780は、グラム陰性菌である大腸菌の生
態系内で自己複製可能であるばかりか、その自
己複製されたDNA上の特定の領域中に存在す
るアンピシリン（Amp）及びテトラサイクリ
ンTc耐性遺伝子に由来する耐性形質をその宿
主菌に付与するので、これを形質転換体に対す
る選択マーカーとして利用することができる。 複合プラスミドpHY600の構成 (1) 複合プラスミドpHY600は、分子量約6.0メ
ガダルトンの環状デオキシリボ核酸（DNA）
である。 (2) pHY600は上記pHY780を制限酵素BamH
で切断することにより、約1.8メガダルトンの
DNA断片を欠失させた後、得られたDNA断片
をT4リガーゼにより連結して合成した複合プ
ラスミドである。 (3) pHY600は、前記pHY780と同様にそのアン
ピシリン耐性遺伝子領域AmPに、制限酵素
Bgl及びPstの各々に対する全領域中唯一
の認識切断部位を有し、更に、そのテトラサイ
クリン耐性遺伝子領域Tcに、制限酵素Balに
対する全領域中唯一の認識切断部位を有するの
で、これらの認識切断部位を外来DNAの挿入
部位とすることができる。 そして、pHY600の、各種制限酵素に対する
切断感受性（認識切断部位の数）は以下の通り
である。 制限酵素 切断部位数 Ava ２ Bal １ BamH １ Bgl １ EcoR ２ 制限酵素 切断部位数 Hae ２ Hind １ Hpa ２ Pst １ Pvu ２ Sac １ Sal １ Xba １ Xho １ (4) pHY600は、pHY780と同様に、グラム陰性
菌である大腸菌の生態系内で自己複製可能であ
ると共に、宿主菌にテトラサイクリン及びアン
ピシリンに対する耐性形質を付与するので、少
なくとも大腸菌のクローニングベクターとして
成立する。 複合プラスミドpHY460の構成 (1) 複合プラスミドpHY460は、分子量約4.6メ
ガダルトンの環状デオキシリボ核酸（DNA）
である。 (2) pHY460は、上記pHY600を制限酵素Xho
及びSalで切断することにより、約1.4メガダ
ルトンのDNA断片を欠失させた後、得られた
DNA断片をT4リガーゼにより連結して合成し
た複合プラスミドである。 (3) pHY460は、そのアンピシリン耐性遺伝子領
域AmPに、制限酵素Bgl、Pst及びPvu
の各々に対する全領域中唯一の認識切断部位を
有し、更に、そのテトラサイクリン耐性遺伝子
領域Tcに、制限酵素Bal及びHpaの各々に
対する全領域中唯一の認識切断部位を有するの
で、これらの認識切断部位を外来DNAの挿入
部位とすることができる。 そして、pHY460の、各種制限酵素に対する
切断感受性（認識切断部位の数）は以下の通り
である。 制限酵素 切断部位数 Ava １ Bal １ BamH １ Bgl １ EcoR ２ Hae ２ Hpa １ Pst １ Pvu １ Sac １ Xba (4) pH460は、グラム陰性菌の代表である大腸菌
のみならず、グラム陽性菌の代表である枯草菌
の生態系内で自己複製可能であると共に、これ
らの宿主菌にテトラサイクリン耐性遺伝子に由
来する耐性形質を付与するので、少なくとも、
大腸菌と枯草菌に両立するクローニングベクタ
ー（シヤトル ベクター）として成立する。 複合プラスミドpHY330の構成 (1) 複合プラスミドpHY330は、分子量約3.3メ
ガダルトンの環状デオキシリボ核酸（DNA）
である。 (2) pHY330は、上記pHY460を制限酵素Xba
及びS1ヌクレアーゼでランダム切断すること
により、そのDNAをランダム縮小させた後、
得られたDNA断片をT4リガーゼにより連結し
て合成した複合プラスミドである。 (3) pHY330は、そのアンピシリン耐性遺伝子領
域AmPに、制限酵素Bgl、Pst及びPvu
の各々に対する全領域中唯一の認識切断部位を
有し、更に、そのテトラサイクリン耐性遺伝子
領域Tcに、制限酵素Bal及びHpaの各々に
対する全領域中唯一の認識切断部位を有するの
で、これらの認識切断部位を外来DNAの挿入
部位とすることができる。 そして、pHY330の、各種制限酵素に対する
切断感受性（認識切断部位の数）は以下の通り
である。 制限酵素 切断部位数 Bal １ Bgl １ EcoR １ Hae ２ Hpa １ Pst １ Pvu １ Sac １ (4) pHY330は、pHY780と同様に、グラム陰性
菌である大腸菌の生態系内で自己複製可能であ
ると共に、宿主菌に耐性形質を付与するので、
少なくとも、大腸菌のクローニングベクターと
して成立する。 付言するならば、この複合プラスミド
pHY330及び後述する複合プラスミド
pHY285、pHY225では、プラスミドpAMα1
由来の複製開始領域OripAMα１が欠失し、ベ
クターpACYC177由来の複製開始領域Ori１７
７のみが残存するので、枯草菌に代表されるグ
ラム陽性菌種の生態系内で自己複製することは
ない。 複合プラスミドpHY285の構成 (1) 複合プラスミドpHY285は、分子量約2.85メ
ガダルトンの環状デオキシリボ核酸（DNA）
である。 (2) pHY285は、上記pHY330を制限酵素Hae
で切断することにより、約0.45メガダルトンの
DNA断片を欠失させた後、得られたDNA断片
をT4リガーゼにより連結して合成した複合プ
ラスミドである。 (3) pHY285は、そのアンピシリン耐性遺伝子領
域AmPに、制限酵素Bal、Pst及びPvu
の各々に対する全領域中唯一の認識切断部位を
有し、更に、そのテトラサイクリン耐性遺伝子
領域Tcに、制限酵素Bal及びHpaの各々に
対する全領域中唯一の認識切断部位を有するの
で、これらの認識切断部位を外来DNAの挿入
部位とすることができる。 そして、pHY285の、各種制限酵素に対する
切断感受性（認識切断部位の数）は以下の通り
である。 制限酵素 切断部位数 Acc １ Bal １ Bgl １ BstE １ EcoR １ 制限酵素 切断部位数 EcoR ４ Hae １ Hpa １ Pst １ Pvu １ Sac １ (4) pHY285は、pHY780と同様に、グラム陰性
菌である大腸菌の生態系内で自己複製可能であ
ると共に、宿主菌に耐性形質を付与するので、
少なくとも、大腸菌のクローニングベクターと
して成立する。 複合プラスミドpHY225の構成 (1) 複合プラスミドpHY225は、分子量約2.25メ
ガダルトンの環状デオキシリボ核酸（DNA）
である。 (2) pHY225は、上記pHY285を制限酵素Sac
及びEcoRで切断し、更に、S1ヌクレアーゼ
で処理することにより、DNAを宿小させた後、
得られたDNA断片をT4リガーゼにより、連結
して合成した複合プラスミドである。 (3) pHY225は、そのアンピシリン耐性遺伝子領
域AmPに、制限酵素Bgl、Pst及びPvu
の各々に対する全領域中唯一の認識切断部位を
有し、更に、そののテトラサイクリン耐性遺伝
子領域Tcに、制限酵素Bal及びHpaの各々
に対する全領域中唯一の認識切断部位を有する
ので、これらの認識切断部位を外来DNAの挿
入部位とすることができる。 そしてpHY225の、各種制限酵素に対する切
断感受性（認識切断部位の数）は以下の通りで
ある。 制限酵素 切断部位数 Bal １ 制限酵素 切断部位数 Bgl １ BstE １ EcoR ２ Hinc ３ Hpa １ Pst １ Pvu １ (4) pH225は、pHY780と同様に、グラム陰性菌
である大腸菌の生態系内で自己複製可能である
と共に、宿主菌に耐性形質を付与するので、少
なくとも、大腸菌のクローニングベクターとし
て成立する。 以上のように構成された、この発明に係わる複
合プラスミドpHY780、pHY600、pHY460、
pHY330、pHY285、pHY225は、少なくとも、
大腸菌を宿主菌とするDNA組換え技術により任
意の遺伝子をクローン化する際に必要なベクター
としての条件を完全に具備しており、とりわけ、
pHY460は上記DNA組換え技術の適用に際して、
少なくとも、大腸菌と枯草菌との間を往復可能な
シヤトルベクターとしての条件をも完全に具備し
ているので、この発明に係わる複合プラスミドに
よれば、大腸菌、枯草菌等の宿主菌に対して、他
の微生物等から有用物質の生合成あるいはその調
節に関する特定の遺伝子をクローニングすること
により、該宿主菌の生態系内で有用物質の生産を
行わせたり、更には、上記特定の遺伝子に係わる
遺伝子情報の増幅作用を通じて生合成系を強化す
ることにより、有用物質の生産性を増大させたり
するための有効な手段を提供することができる。
そして、特にpHY460によれば、枯草菌に代表さ
れるグラム陽性菌種の生態系内で他の微生物由来
等の種々の遺伝子を発現させることができるの
で、グラム陽性菌種の遺伝子の解析や分子育種に
有効な手段をも提供することができる。 続いて、この発明の実施例を説明すれば以下の
通りである。 実施例 １ 複合プラスミドpHY780の合成 (1) pHY177の調製。 エシエリシア・コリK12 WA802r-m+
（pACYC177）（東京大学応用微生物研究所斎
藤研究室保有）を、Ｌ−ブロス（バクト―トリ
プトン（Bacto―trypton）１％、酵母エキス
0.5％、NaCl0.5％、グルコース0.1％をIN−
NaOHでPH7.0に調節したもの）中で、一夜培
養した後、遠心分離処理にて集菌し、これを、
100mlの20mM Tris−10mM EDTA（PH8.0）
で２回洗滌した。洗滌後の菌体を９mlの
100mM NaCl−20mM Tris−10mM EDTA
に溶解させた。次いで、リゾチームとRNase
をそれぞれ100μg／mlと、50μg／mlとになるよ
うに加え、０℃で、10分間反応させた後、２％
SDSを１ml加えて、37℃で５分間、上記反応
後の菌を更に溶解させた。この溶液を０℃で10
分間放置した後、36000rpmで30分間遠心分離
処理し、分離された上清をDNA粗標品として
採取した。これに等重量の塩化セシウムを加
え、５mg／mlのエチジウムブロマイド（EtBr）
を0.7ml加えた。これに36000rpm、40時間の遠
心分離処理をほどこしてDNA画分を集め、更
に36000rpm、40時間の遠心分離処理を行つた。
分離されたDNA画分を飽和塩化セシウム水で
飽和したイソプロパノールを用いて洗滌するこ
とにより、EtBrを除去した。次いで、10mM
Tris−0.1mM EDTA（PHを7.4）（以下緩衝液Ａ
という）に対して透析し、更に、DNAと等量
のフエノール（緩衝液Ａで飽和したもの）を加
えて、振とうした。そして、遠心分離処理によ
り得られた水層を緩衝液Ａに対して透析して、
第１図Ａの切断地図で表わされる
pACYC177DNAを調製した。 (2) pAMα1の調製。 ストレプトコツカス・フエカリス DS5
（ATCC14508）を500mlのロゴサ培地
（RogoSa medium：１中 グルコース20ｇ、
トリプチケース―ペプトン10ｇ、酵母エキス
5g、トリプトース３ｇ、K2HPO43ｇ、
KH2PO43ｇ、クエン酸アンモニウム２ｇ、酢
酸ナトリウム１ｇ、ツイーン80 １ｇ、
MgSO4・H2O0.575ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩
0.5ｇ、MnSO4・2H2O0.12ｇ、FeSO4・7H2O
84mgを含む：PH6.8）にて一夜培養した。 後述のDNA抽出処理は、(1)項記載の
pACYC−177の調整の場合と同様の方法によ
り、行つた。次いで、抽出されたDNA0.5ml
を、ニトロセルロース遠心管中の12mlの５％〜
30％庶糖グラデイエント上にのせた。緩衝液と
しては、50mM Tris−50mM EDTA−50mM
NaCl（PH8.0）を使用した。20000rpm、16時
間、10℃で遠心分離処理した後、上記ニトロセ
ルロース遠心管の底に穴を開けて、10滴づつ分
画した。各分画中のDNA10μを0.8％アガロ
ースゲル上で電気泳動させて、そのDNAの分
子量を確認した。そして、分子量６メガダルト
ンの８画分を緩衝液Ａで透析した。以上の処理
を経て、第１図Ｂの切断地図で表わされる
pAMα1をβ1、γ1の混合物から分離した。 (3) pACYC177及びpAMα1の制限酵素による切
断及びT4リガーゼによる連結（ligation）。 上記(1)項(2)項記載の処理により得られた10μ
の各DNA（0.1〜0.2μg DNA量）に、1μの
10倍濃度緩衝液（10mM Tris−HCl（PH7.6）、
7mM MgCl2、7mM β−メルカプトエタノー
ル、50mM NaCl）を加えた後、更に、4u／μ
のHindを添加し、これを37℃、60分間反
応させた。そして、60℃、10分間でこの反応を
停止させた後、1/50量の5M NaClを加え、更
に、全量の２倍量の−20℃の冷エタノールを加
え、これを−20℃、30分間冷却した。更に、こ
れを15000rpm、０℃、５分間、遠心分離処理
した後、上清を捨てて、沈殿物を再び−20℃エ
タノールで洗滌しした。これを15000rpm、０
℃、２分間、遠心分離処理した後、上清のエタ
ノールを捨てて、更に、エタノールを完全に蒸
発させた。 これにより得られたDNA断片に20μの滅
菌水を加えて溶解させ、10mM ATP3μ、
100mMジチオスレイトール3μ、660mM
Tris−HCl（PH7.6）−66mM MgCl2 3μを加
え、更に、400u／μのT4リガーゼを0.5μ
加えた。15℃で一夜反応を行わせた後、120μ
の滅菌水を加えて、全量を150μとした。 (4) プラスミドDNAによる大腸菌の形質転換。 エシエリシア・コリ K12 C600r-m-（東京
大学応用微生物研究所斎藤研究室保有）株を、
Ｌ―ブロス中で一夜培養した。この培養液0.05
mlを５mlのＬ−ブロスに加えて、37℃で２時間
10分の振とう培養を行つた。遠心分離処理にて
集菌した後、得られた菌を０℃の0.1M CaCl2
水で洗滌し、0.25mlの０℃、0.1M CaCl2水に
溶解することにより、コンピテント細胞を作製
した。そして、0.1mlのコンピテント細胞に対
して0.1mlの上記(3)項の処理で得たDNA（濃度
1μg／ml）を加え、０℃にて５分間放置した
後、0.8mlのＬ−ブロスを加えて、37℃で１時
間培養した。次いで、この培養液をＬ−ブロス
に1.5％寒天と、20μg／mlのテトラサイクリン
と、30μg／mlのアンピシリンとを添加して成
る選択培地の表面上に塗布して、37℃で一夜培
養した。その際、この選択培地上でコロニーを
形成した10株の形質転換体について、保有プラ
スミドの大きさを調べた。 (5) 形質転換体からのプラスミドDNAの抽出及
び分子量の測定。 形質転換体をＬ−ブロス中で一夜培養した培
養液５mlを分離処理にて集菌した。次いで、分
離された菌を0.5mlの100mM NaCl−50mM
Tris−10mM EDTA（PH7.4）に溶解させた。
この溶液に0.2mlの２mg／mlリゾチーム―0.5
mg／ml RNaseを加えて、37℃で５分間反応
させた。0.2mlの２％SDS溶液を加えて、30℃
で１〜２分間更に反応させ、０℃で10分間放置
後、この溶液を20000rpmで０℃、10分間、遠
心分離処理した。分離された上清0.5mlに緩衝
液Ａで飽和したフエノール0.5mlを加え、よく
混合した。更に、これを、15000rpmで３分間
室温で遠心分離処理し、水層を採取し、その
50μづつを0.8％アガロースゲル電気泳動させ
て、その分子量を測定した。上記処理により、
10株の形質転換体について、プラスミドの大き
さを調べたところ、分子量約7.8メガダルトン
であつた。 このようにして、第１図Ａ，Ｂの切断地図で
表わされるpACYC177、pAMα1から合成され
た複合プラスミドのうち、第１図Ｃの切断地図
で表わされるものをpHY780と命名し、他の一
つをpHY11と命名した。 これにより、少なくとも、第１図Ｃの切断地
図で表わされるpHY780が大腸菌の生態系内で
安定に増殖し、形質発現することが確認され
た。 なお、pHY780への連結に際しては、
pACYC177のDNA断片と、SpAMα1のそれと
の連結方向の異る同分子量の他の複合プラスミ
ドpHY11も同時的に生成されるが、両複合プ
ラスミドpHY780、pHY11は、BamHを用
いて、切断処理することにより、断片の大きさ
の異る二つのグループとして分離することがで
きる。そして、第１図Ｃの切断地図に基づい
て、二つの複製開始領域OripAMα１，Ori１
７７のうち、少なくとも、双方を共に欠失させ
ることなく、しかも、二つの遺伝子領域Tc，
Amp中に存在する全領域中唯一の制限酵素認
識切断部位の数を増大させるべく、両遺伝子領
域Tc，Amp中の制限酵素認識切断部位と同一
の切断部位を含む全領域中の部分を切断除去す
るために使用可能な制限酵素の存否の観点か
ら、両複合プラスミドpHY780、pHY11のう
ちpHY780が後続の縮小化処理に有望なものと
して選択された。 実施例 ２ 複合プラスミドpHY600の合成 (1) 実施例１で作製された形質転換体、エシエリ
シア・コリ C600r-m-（pHY780）から、実施
例１の場合と同様の方法により、プラスミド
DNAを抽出した。抽出されたDNA1μg／20μ
に2μの緩衝液（100mM Tris−HCl（PH−
7.6）、70mM MgCl2、70mM β―メルカプト
エタノール、500mM NaCl）を加え、さらに、
4uの制限酵素BamHを加えて、37℃で60分
間反応させた。60℃、10分間熱処理してこの反
応を停止させた後、80μの水を加え、2μの
5M NaClを加え、更に、−20℃のエタノール
200μを加えて、−20℃で30分間放置し、次い
で、０℃で５分間、10000rpmの遠心分離処理
によりDNAを集めた。これを、200μの−20
℃エタノールで洗滌した後、20μの水に溶解
させ、T4リガーゼを用いて実施例１と同様の
方法で連結処理を行つた。 (2) 次いで、このDNAを用いて、エシエリシ
ア・コリ K12 C600r-m-に対する形質転換を
行つた。形質転換体は、20μg／mlテトラサイ
クリン、30μg／mlアンピシリンに耐性を示し
た。この形質転換体のうち、10株について、実
施例１と同様の方法により、プラスミドの大き
さを調べたところ、全て、分子量約６メガダル
トンであつた。 このようにして、第１図Ｃの切断地図で表わ
されるpHY780から合成された、第１図Ｄの切
断地図で表わされる複合プラスミドをpHY600
と命名した。そして、上記処理により、この
pHY600も、少なくとも、大腸菌に対するクロ
ーニングベクターとして使用可能であることが
確認された。 実施例 ３ 複合プラスミドpHY460の合成 実施例２で作製されたpHY600を、制限酵素
Xho及びSalを用いて実施例１と同様の酵素
処理により、切断し、更に、そのDNA断片をT4
リガーゼを用いた酵素処理により連結して、大腸
菌に形質転換し、分子量約4.6メガダルトンのプ
ラスミド（pHY460）を作製した。これにより、
第１図Ｄの切断地図で表わされるpHY600から第
１図Ｅの切断地図で表わされるpHY460が生成さ
れた。 実施例 ４ 複合プラスミドpHY460の枯草菌（バチルス・
ズブチリス）に対する形質転換 (1) コンピテント（Competent）細胞の調製。 Ｌ―寒天平板上で一夜培養したバチリス・ズ
ブチルス（Bacillus subtilis）Marburg168株
（東京大学応用微生物研究所斎藤研究室保有）
を培地（スピザイセン ミネラル培地
（Spizizen mineral medium）：K2HPO41.4％、
KH2PO40.6％、（NH4）2SO40.2％、クエン酸ナ
トリウム0.1％、MgSO4・7H2O0.02％、グルコ
ース0.5％に対してカゼイン加水分解物0.02％、
Ｌ−トリプトフアン 50μg／mlを加えたもの）
に対して、１×108／ml程度接種した。これを
37％で振とう培養して、約４時間経過後、静止
期に入つた段階で、培地（培地のＬ―トリ
プトフアンを5μg／mlとし、更に、5mM
MgSO4を加えたもの）中で、10倍に薄めて培
養を続行した。培養液中の菌は90分後に、コン
ピテント（Competent）状態に達した。このコ
ンピテント細胞0.9mlに実施例３にて作製され
たpHY460複合プラスミドのDNA溶液0.1mlを
加えて37℃で、90分間振とう培養しながら形質
転換を行つた。 (2) 形質転換体の検出。 DNA（pHY460）をとり込ませた形質転換体
を20μg／mlのテトラサイクリンを含むＬ―寒
天平板上に塗布して、37℃で24時間培養した。
得られたコロニーにつき、実施例１と同様の方
法によりプラスミドの存在を確認した。複製さ
れたプラスミドpHY460は、分子量約4.6メガ
ダルトンのものであつた。 そして、実施例１、２と同様の方法により、
エシエリシア・コリK12 C600r-m-に対する形
質転換も確認された。これにより、複合プラス
ミドpHY460は、大腸菌と枯草菌の双方の宿主
―ベクター系におけるクローニングベクター、
即ち、シヤトルベクターであることが判明し
た。 なお、形質転換体としてのエシエリシア・コ
リK12 C600r-m-（pHY460）及びバチルス・
ズブチリス 168（pHY460）は、それぞれ、受
託番号 微工研条寄第438号及び微工研条寄第
439号として工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託済みである。 実施例 ５ 複合プラスミドpHY330の合成 実施例３で作製されたpHY460のXba切断部
位を切り開いて、更に、S1ヌクレアーゼを作用
させた後、T4リガーゼでのDNA断片を連結する
ことによりpHY330を合成した。すなわち、緩衝
液Ａ中に４℃にて４ケ月間保存しておいたDNA
（pHY460）0.5μg／50μを、4uのXba（緩衝
液：10mM Tris−HCl（PH7.6）、7mM MgCl2、
7mM β―メルカプトエタノール、50mM
NaCl）により切断した後、NaCl濃度が10mMに
なるようにNaClを加え、更に、２倍量の冷エタ
ノールを加え、−20℃に冷却した。４℃、
15000rpm、３分間の遠心分離処理により、DNA
断片を集め、これを冷エタノールで洗滌した。エ
タノールを蒸発させた後、50μのS1反応用緩衝
液（30mM 酢酸ナトリウム（PH4.6）、50mM
NaCl、1mM ZnSO4、５％グリセロール）に溶
かしてから、500u／μのS1ヌクレアーゼ0.5μ
を加えて、37℃、５分間反応させた。この反応液
に緩衝液Ａで飽和したフエノールを100μ加え
て、攪拌し、15000rpm、３分間、室温で遠心分
離処理し、DNA断片を含む水層を採取し、これ
のNaCl濃度を100mMに調製した。この水層に
200μの冷エタノールを加えて、−20℃、30〜60
分間冷却し、４℃で、15000rpm、３分間遠心分
離処理をほどこして、その上清を捨てて、沈殿物
を冷エタノールで洗滌した後、エタノールを蒸発
させた。 次いで、遠心管の底に沈殿したDNAを20μ
の水に溶かしてから、3μの10mM ATP、3μ
の100mMジチオスレイトール及び3μの660mM
Tris−HCl（PH7.6）−6.6mM MgCl2を加え、更
に、10uのT4リガーゼ1μを加えて、15℃にて、
一夜反応させることにより、DNAの連結処理を
行つた。 かかる連結処理により合成されたDNAに水
170μを加えて全量を200μとし、このうちの
100μのDNAを使つて実施例１と同様にしてエ
シエリシア・コリ K12 C600r-m-のCaCl2処理
菌100μに対して形質転換を行つた。実施例１
と同様の方法により、分子量約3.3メガダルトン
の複合プラスミドpHY330を形質転換体から抽出
することができた。これにより、第１図Ｅの切断
地図で表わされるpHY460から第１図Ｆの切断地
図で表わされるpHY330が生成され、しかも、そ
のpHY330は、少なくとも、大腸菌に有効なクロ
ーニングベクターであることが確認された。 実施例 ６ 複合プラスミドpHY285の合成 実施例５で作製されたpHY330を、更に制限酵
素Hae（緩衝液：10mM Tris−HCl（PH7.6）、
7mM MgCl2、、7mM β―メルカプトエタノー
ル）で実施例１と同様の方法により、切断・連結
して、大腸菌に形質転換し、分子量約2.85メガダ
ルトンのpHY285を作製した。すべての処理方法
は、実施例１のそれと同様である。これにより、
第１図Ｆの切断地図で表わされるpHY330から第
１図Ｇの切断地図で表わされるpHY285が生成さ
れ、これが、少なくとも、大腸菌に有効なクロー
ニングベクターであることが確認された。 実施例 ７ 複合プラスミドpHY225の合成 実施例６で作製されたpHY285を、更に、制限
酵素Sac及びEcoRで切断し、S1ヌクレアー
ゼで実施例５と同様に処理した後、T4リガーゼ
でDNA断片を連結することによりpHY225を合
成した。すなわち、pHY285DNA0.3μg／50μ
にSac（緩衝液：10mM Tris−HCl（PH7.6）、
7mM MgCl2、7mM β―メルカプトエタノー
ル）を4u加えて、37℃にて60分間反応させた後、
60℃、10分間加熱して、この反応を停止させた。
次いで、この反応液に50mMとなるようにNaCl
を加えてから、4uのEcoRを加え、更に、37
℃、60分間反応させ、60℃、10分加熱した後、
50μの水を加えた。 この混液に、緩衝液Ａで飽和したフエノールを
加え、振とうした後、室温で、15000rpm、30分
間の遠心分離処理を行つた。 分離された水層にNaClを加え、NaCl濃度を
100mMとした後、冷エタノール処理をほどこし
た。エタノールを蒸発させた後、S1ヌクレアー
ゼ処理を37℃、５分間行つて、生成されたDNA
断片を、実施例１と同様の方法により、連結し、
大腸菌に形質転換して、分子量約2.25メガダルト
ンのpHY225を合成した。形質転換体の作製及び
検出、DNAの抽出などの処理は実施例１のそれ
と同様である。これにより、第１図Ｇの切断地図
で表わされるpHY285から第１図Ｈの切断地図で
表わされるpHY225が生成され、これが少なくと
も、大腸菌に有効なクローニングベクターである
ことが確認された。
第１図は複合プラスミドpHY780、pHY600、
pHY460、pHY330、pHY285、pHY225の合成
処理工程を示す説明図である。 Amp……アンピシリン耐性遺伝子領域、Tc…
…テトラサイクリン耐性遺伝子領域、Km……カ
ナマイシン耐性遺伝子領域、OripAMα１……プ
ラスミドpAMα1由来の複製開始領域、Ori１７
７……ベクターpACYC177由来の複製開始領域。
pHY460、pHY330、pHY285、pHY225の合成
処理工程を示す説明図である。 Amp……アンピシリン耐性遺伝子領域、Tc…
…テトラサイクリン耐性遺伝子領域、Km……カ
ナマイシン耐性遺伝子領域、OripAMα１……プ
ラスミドpAMα1由来の複製開始領域、Ori１７
７……ベクターpACYC177由来の複製開始領域。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ストレプトコツカス・フエカリス
（Streptococcus faecalis）のプラスミドpAMα1
由来のテトラサイクリン耐性遺伝子領域と、エシ
エリシア・コリ（Escherichia coli）のベクター
pACYC177由来のアンピシリン耐性遺伝子領域
と、上記プラスミドpAMα１由来の複製開始領域
及び上記ベクターpACYC177由来の複製開始領
域のうち、少なくとも、いずれか一方を有し、前
記テトラサイクリン耐性遺伝子領域には、制限酵
素Balに対する全領域中唯一の認識切断部位が
位置し、更に、前記アンピシリン耐性遺伝子領域
には、制限酵素Bgl及びPstの各々に対する
全領域中唯一の認識切断部位が位置することを特
徴とする複合プラスミド。 ２ 約7.8メガダルトンの分子量と、下記の制限
酵素認識切断部位の配列とにより特徴づけられる
特許請求の範囲第１項記載の複合プラスミド
pHY780。 ３ 約6.0メガダルトンの分子量と、下記の制限
酵素認識切断部位の配列とにより特徴づけられる
特許請求の範囲第１項記載の複合プラスミド
pHY600。 ４ 約4.6メガダルトンの分子量と、下記の制限
酵素認識切断部位の配列とにより特徴づけられる
特許請求の範囲第１項記載の複合プラスミド
pHY460。 ５ 約3.3メガダルトンの分子量と、下記の制限
酵素認識切断部位の配列とにより特徴づけられる
特許請求の範囲第１項記載の複合プラスミド
pHY330。 ６ 約2.85メガダルトンの分子量と、下記の制限
酵素認識切断部位の配列とにより特徴づけられる
特許請求の範囲第１項記載の複合プラスミド
pHY285。 ７ 約2.25メガダルトンの分子量と、下記の制限
酵素認識切断部位の配列とにより特徴づけられる
特許請求の範囲第１項記載の複合プラスミド
pHY225。
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58009740A JPS59135891A (ja) | 1983-01-24 | 1983-01-24 | 複合プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59135891A JPS59135891A (ja) | 1984-08-04 |
| JPH0255036B2 true JPH0255036B2 (ja) | 1990-11-26 |
Family
ID=11728704
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58009740A Granted JPS59135891A (ja) | 1983-01-24 | 1983-01-24 | 複合プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59135891A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05141730A (ja) * | 1991-11-22 | 1993-06-08 | Nippon Spindle Mfg Co Ltd | クリーンルーム |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0759189B2 (ja) * | 1985-03-23 | 1995-06-28 | 株式会社ヤクルト本社 | 枯草菌によるスタフイロキナ−ゼの製造方法 |
| JPS63291585A (ja) * | 1987-05-22 | 1988-11-29 | Fujitsu Ltd | 融合遺伝子発現ベクタ− |
-
1983
- 1983-01-24 JP JP58009740A patent/JPS59135891A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH05141730A (ja) * | 1991-11-22 | 1993-06-08 | Nippon Spindle Mfg Co Ltd | クリーンルーム |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59135891A (ja) | 1984-08-04 |
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