JPH09259A - β−ガラクトシダーゼ産生プラスミド及びβ−ガラクトシダーゼの製造法 - Google Patents
β−ガラクトシダーゼ産生プラスミド及びβ−ガラクトシダーゼの製造法Info
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- JPH09259A JPH09259A JP7175583A JP17558395A JPH09259A JP H09259 A JPH09259 A JP H09259A JP 7175583 A JP7175583 A JP 7175583A JP 17558395 A JP17558395 A JP 17558395A JP H09259 A JPH09259 A JP H09259A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ストレプトコッカス・サーモフィルス由来の
β−ガラクトシダーゼ遺伝子を枯草菌形質転換体株の細
胞内で効率よく発現し、ストレプトコッカス・サーモフ
ィルスのβ−ガラクトシダーゼを多量に生産させること
のできるβ−ガラクトシダーゼ産生プラスミドを得る。 【構成】 ストレプトコッカス・サーモフィルス由来の
β−ガラクトシダーゼ産生遺伝子を、枯草菌テンペレー
トファージＳＰ０２由来のプロモータの下流に連結した
β−ガラクトシダーゼ産生プラスミドを枯草菌に導入
し、その培地中で培養し、培養菌体中にβ−ガラクトシ
ダーゼを蓄積させて、β−ガラクトシダーゼを採取する
ものである。
β−ガラクトシダーゼ遺伝子を枯草菌形質転換体株の細
胞内で効率よく発現し、ストレプトコッカス・サーモフ
ィルスのβ−ガラクトシダーゼを多量に生産させること
のできるβ−ガラクトシダーゼ産生プラスミドを得る。 【構成】 ストレプトコッカス・サーモフィルス由来の
β−ガラクトシダーゼ産生遺伝子を、枯草菌テンペレー
トファージＳＰ０２由来のプロモータの下流に連結した
β−ガラクトシダーゼ産生プラスミドを枯草菌に導入
し、その培地中で培養し、培養菌体中にβ−ガラクトシ
ダーゼを蓄積させて、β−ガラクトシダーゼを採取する
ものである。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は枯草菌(Bacillus subtil
is) に導入されて効率よくβ−ガラクトシダーゼを産生
するプラスミドに関し、更に前記プラスミドを用いて枯
草菌中でβ−ガラクトシダーゼを産生する方法に関する
ものである。
is) に導入されて効率よくβ−ガラクトシダーゼを産生
するプラスミドに関し、更に前記プラスミドを用いて枯
草菌中でβ−ガラクトシダーゼを産生する方法に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】近年、組換えＤＮＡ実験技術を中心とす
る遺伝子操作技術は急速に発展してきた。この組換えＤ
ＮＡ実験技術を用い、バチルス・ステアロサーモフィル
ス(Bacillus stearothermophilus) 、サーマス・アクア
ティカス(Thermus quaticus)、ラクトバチルス・ブルガ
リカス(Lactobacillus bulgaricus)等のβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子がクローニングされている（特開昭６１−
８１７８８号、特開昭６２−２０８２８５号、特開平２
−５８７８号）。
る遺伝子操作技術は急速に発展してきた。この組換えＤ
ＮＡ実験技術を用い、バチルス・ステアロサーモフィル
ス(Bacillus stearothermophilus) 、サーマス・アクア
ティカス(Thermus quaticus)、ラクトバチルス・ブルガ
リカス(Lactobacillus bulgaricus)等のβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子がクローニングされている（特開昭６１−
８１７８８号、特開昭６２−２０８２８５号、特開平２
−５８７８号）。
【０００３】β−ガラクトシダーゼはラクトースの分解
並びにガラクトース転移反応等を行う酵素であるが、手
軽に活性を測定できるので、分子生物学では殆ど一般的
な手法の一つとなっている。即ち、タンパク質や遺伝子
融合の検定を行う上で、反応の進行状況をβ−ガラクト
シダーゼが生合成されるように仕組んだ実験を利用して
判断されている。これは、外来性ＤＮＡ断片をβ−ガラ
クトシダーゼの産生に寄与する遺伝子領域に挿入すると
β−ガラクトシダーゼの産生がなくなることを利用する
ものであり、培地中に５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（以下、Ｘ−ｇ
ａｌと記す）を添加しておけば、外来性ＤＮＡ断片が挿
入されていないものは、これを分解して５−ブロモ−４
−クロロ−３−インディゴを形成し、菌体を染めて青い
コロニーを作るのに対し、外来性ＤＮＡ断片を挿入した
組換え体を持つ菌では、酵素を産生できず、コロニーは
無色で容易に選別できるものである。
並びにガラクトース転移反応等を行う酵素であるが、手
軽に活性を測定できるので、分子生物学では殆ど一般的
な手法の一つとなっている。即ち、タンパク質や遺伝子
融合の検定を行う上で、反応の進行状況をβ−ガラクト
シダーゼが生合成されるように仕組んだ実験を利用して
判断されている。これは、外来性ＤＮＡ断片をβ−ガラ
クトシダーゼの産生に寄与する遺伝子領域に挿入すると
β−ガラクトシダーゼの産生がなくなることを利用する
ものであり、培地中に５−ブロモ−４−クロロ−３−イ
ンドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（以下、Ｘ−ｇ
ａｌと記す）を添加しておけば、外来性ＤＮＡ断片が挿
入されていないものは、これを分解して５−ブロモ−４
−クロロ−３−インディゴを形成し、菌体を染めて青い
コロニーを作るのに対し、外来性ＤＮＡ断片を挿入した
組換え体を持つ菌では、酵素を産生できず、コロニーは
無色で容易に選別できるものである。
【０００４】例えば、発酵乳の乳酸菌スターターの１つ
として用いられるストレプトコッカス・サーモフィルス
(Streptococcus thermophilus)のβ−ガラクトシダーゼ
についても遺伝子がクローニングされている（アール・
イー・ハーマン、等；アプライド エンヴァイロメンタ
ル ミクロバイオロジー 52巻 45−50頁（1986年）
(R.E.Herman,et al;Applied and Environmental Microb
iology,52,45-50(1986))：以下、単に「資料１」と記
す）。
として用いられるストレプトコッカス・サーモフィルス
(Streptococcus thermophilus)のβ−ガラクトシダーゼ
についても遺伝子がクローニングされている（アール・
イー・ハーマン、等；アプライド エンヴァイロメンタ
ル ミクロバイオロジー 52巻 45−50頁（1986年）
(R.E.Herman,et al;Applied and Environmental Microb
iology,52,45-50(1986))：以下、単に「資料１」と記
す）。
【０００５】しかしながら、ストレプトコッカス・サー
モフィルス菌の培養菌体中から得られるβ−ガラクトシ
ダーゼの量は少ないため、本酵素の分離精製操作も煩雑
となり、ストレプトコッカス・サーモフィルスを用いて
β−ガラクトシダーゼを生産することは困難である。
モフィルス菌の培養菌体中から得られるβ−ガラクトシ
ダーゼの量は少ないため、本酵素の分離精製操作も煩雑
となり、ストレプトコッカス・サーモフィルスを用いて
β−ガラクトシダーゼを生産することは困難である。
【０００６】そこで、本発明者らは、先に、組換えＤＮ
Ａ技術を利用して、ストレプトコッカス・サーモフィル
スのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を大腸菌で強力なプロ
モータ活性を有するｔａｃプロモータの下流に連結した
ことを特徴とするプラスミドｐＴＩ−ＳＴ−βを作製
し、これを導入した大腸菌組換え体を培養することによ
り、この大腸菌の菌体内にβ−ガラクトシダーゼを蓄積
させることに成功した。この遺伝子組換え大腸菌（E.co
li K12 JM109(pTI-ST-β) 微工研菌寄第１２４４７号）
の培養によるβ−ガラクトシダーゼの製造法を完成し、
提案した（特開平５−１０３６６８号：以下、単に「資
料２」と記す）。
Ａ技術を利用して、ストレプトコッカス・サーモフィル
スのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を大腸菌で強力なプロ
モータ活性を有するｔａｃプロモータの下流に連結した
ことを特徴とするプラスミドｐＴＩ−ＳＴ−βを作製
し、これを導入した大腸菌組換え体を培養することによ
り、この大腸菌の菌体内にβ−ガラクトシダーゼを蓄積
させることに成功した。この遺伝子組換え大腸菌（E.co
li K12 JM109(pTI-ST-β) 微工研菌寄第１２４４７号）
の培養によるβ−ガラクトシダーゼの製造法を完成し、
提案した（特開平５−１０３６６８号：以下、単に「資
料２」と記す）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】資料２の方法によれ
ば、ストレプトコッカス・サーモフィルス由来のβ−ガ
ラクトシダーゼを大腸菌組換え体の細胞内で効率よく生
産することができる。しかしながら、工業的には更に本
酵素の生産性の向上が望まれるため、本発明をするに至
った。
ば、ストレプトコッカス・サーモフィルス由来のβ−ガ
ラクトシダーゼを大腸菌組換え体の細胞内で効率よく生
産することができる。しかしながら、工業的には更に本
酵素の生産性の向上が望まれるため、本発明をするに至
った。
【０００８】本発明は、ストレプトコッカス・サーモフ
ィルス由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を枯草菌形質
転換体株の細胞内で効率よく発現し、ストレプトコッカ
ス・サーモフィルスのβ−ガラクトシダーゼを多量に生
産させることのできるβ−ガラクトシダーゼ産生プラス
ミドを得ることを目的とし、更に遺伝子組換え技術を応
用したβ−ガラクトシダーゼの経済的な製造方法を確立
することにある。
ィルス由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を枯草菌形質
転換体株の細胞内で効率よく発現し、ストレプトコッカ
ス・サーモフィルスのβ−ガラクトシダーゼを多量に生
産させることのできるβ−ガラクトシダーゼ産生プラス
ミドを得ることを目的とし、更に遺伝子組換え技術を応
用したβ−ガラクトシダーゼの経済的な製造方法を確立
することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本請求項１に記載された
発明に係るβ−ガラクトシダーゼ産生プラスミドは、ス
トレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus the
rmophilus)由来のβ−ガラクトシダーゼ産生遺伝子を、
枯草菌テンペレートファージＳＰ０２由来のプロモータ
の下流に連結したものである。
発明に係るβ−ガラクトシダーゼ産生プラスミドは、ス
トレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus the
rmophilus)由来のβ−ガラクトシダーゼ産生遺伝子を、
枯草菌テンペレートファージＳＰ０２由来のプロモータ
の下流に連結したものである。
【００１０】本請求項２に記載された発明に係るβ−ガ
ラクトシダーゼの製造法は、前記請求項１に記載のβ−
ガラクトシダーゼ産生プラスミドを導入した枯草菌(Bac
illus subtilis) を培地中で培養し、培養菌体中にβ−
ガラクトシダーゼを蓄積させて、β−ガラクトシダーゼ
を採取するものである。
ラクトシダーゼの製造法は、前記請求項１に記載のβ−
ガラクトシダーゼ産生プラスミドを導入した枯草菌(Bac
illus subtilis) を培地中で培養し、培養菌体中にβ−
ガラクトシダーゼを蓄積させて、β−ガラクトシダーゼ
を採取するものである。
【００１１】
【作用】本発明では、ストレプトコッカス・サーモフィ
ルス由来のβ−ガラクトシダーゼ産生遺伝子を、枯草菌
テンペレートファージＳＰ０２由来のプロモータの下流
に連結したβ−ガラクトシダーゼ産生プラスミドを枯草
菌に導入し、その培地中で培養し、培養菌体中にβ−ガ
ラクトシダーゼを蓄積させて、β−ガラクトシダーゼを
採取するため、β−ガラクトシダーゼを枯草菌形質転換
体株の細胞内で効率よく、大量に発現させることができ
る。
ルス由来のβ−ガラクトシダーゼ産生遺伝子を、枯草菌
テンペレートファージＳＰ０２由来のプロモータの下流
に連結したβ−ガラクトシダーゼ産生プラスミドを枯草
菌に導入し、その培地中で培養し、培養菌体中にβ−ガ
ラクトシダーゼを蓄積させて、β−ガラクトシダーゼを
採取するため、β−ガラクトシダーゼを枯草菌形質転換
体株の細胞内で効率よく、大量に発現させることができ
る。
【００１２】前記枯草菌テンペレートファージＳＰ０２
由来のプロモータとは、枯草菌にクローニングしたクロ
ラムフェニコール耐性遺伝子（クロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ）やジヒドロ葉酸還元酵素遺
伝子を発現した例が知られており、塩基配列が明らかに
されている（ロナルド・スコーナ、等；ジーン 22巻47
−57頁（1983年）(Ronald G.Schoner.et al.Gene,22,47
-57(1983))）。これらの実験に用いられたプロモータを
含むＤＮＡ断片は 0.3kbの EcoRI断片で、この領域内に
３個のプロモータ様配列が存在する。
由来のプロモータとは、枯草菌にクローニングしたクロ
ラムフェニコール耐性遺伝子（クロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼ）やジヒドロ葉酸還元酵素遺
伝子を発現した例が知られており、塩基配列が明らかに
されている（ロナルド・スコーナ、等；ジーン 22巻47
−57頁（1983年）(Ronald G.Schoner.et al.Gene,22,47
-57(1983))）。これらの実験に用いられたプロモータを
含むＤＮＡ断片は 0.3kbの EcoRI断片で、この領域内に
３個のプロモータ様配列が存在する。
【００１３】また、本発明に使用されるβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子の取得法は、前述の資料１の方法又は資料
２の方法が可能であるが、既に微工研に寄託済の大腸菌
組換え体（E.coli K12 JM109(pTI-ST-β) 微工研菌寄第
１２４４７号）のプラスミド(pTI-ST-β) より取得でき
る。
ダーゼ遺伝子の取得法は、前述の資料１の方法又は資料
２の方法が可能であるが、既に微工研に寄託済の大腸菌
組換え体（E.coli K12 JM109(pTI-ST-β) 微工研菌寄第
１２４４７号）のプラスミド(pTI-ST-β) より取得でき
る。
【００１４】枯草菌テンペレートファージＳＰ０２のプ
ロモータを含む 0.3kbのＤＮＡ断片の取得は、ファージ
ＳＰ０２から通常の方法でファージＤＮＡを分離し、こ
れをEcoRIで切断することで得ることが可能であるが、
このＤＮＡ断片を含むプラスミドpPL608（ディ・エム・
ウイリアムス、等；ジーン 16巻 199− 206頁（1981
年）（D.M.Williams,et al.Gene,16,199-206(1981)））
（ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション） No.３７１０８）より取得できる。
ロモータを含む 0.3kbのＤＮＡ断片の取得は、ファージ
ＳＰ０２から通常の方法でファージＤＮＡを分離し、こ
れをEcoRIで切断することで得ることが可能であるが、
このＤＮＡ断片を含むプラスミドpPL608（ディ・エム・
ウイリアムス、等；ジーン 16巻 199− 206頁（1981
年）（D.M.Williams,et al.Gene,16,199-206(1981)））
（ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション） No.３７１０８）より取得できる。
【００１５】取得したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含
むＤＮＡ断片及びプロモータを含むＤＮＡ断片は制限酵
素で消化した後又は末端へのリンカーの付加を行った
後、同じ制限酵素で切断したベクターＤＮＡにＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結することにより、β−ガラクト
シダーゼ遺伝子やプロモータを組込んだプラスミドが得
られる。このとき、ベクターとして大腸菌と枯草菌の何
れにおいても複製可能な、所謂シャトルベクターを用い
れば、大腸菌，枯草菌のどちらにもプラスミドを導入す
ることができるので、β−ガラクトシダーゼ遺伝子やプ
ロモータを連結したプラスミドを構築する過程は大腸菌
を宿主として行うことができる。
むＤＮＡ断片及びプロモータを含むＤＮＡ断片は制限酵
素で消化した後又は末端へのリンカーの付加を行った
後、同じ制限酵素で切断したベクターＤＮＡにＴ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結することにより、β−ガラクト
シダーゼ遺伝子やプロモータを組込んだプラスミドが得
られる。このとき、ベクターとして大腸菌と枯草菌の何
れにおいても複製可能な、所謂シャトルベクターを用い
れば、大腸菌，枯草菌のどちらにもプラスミドを導入す
ることができるので、β−ガラクトシダーゼ遺伝子やプ
ロモータを連結したプラスミドを構築する過程は大腸菌
を宿主として行うことができる。
【００１６】上記のようにして得た組換え体プラスミド
を、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の欠損した大腸菌に形
質転換する。ストレプトコッカス・サーモフィルスのβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の組み込ま
れたプラスミドを保持する大腸菌の形質転換体はＸ−ｇ
ａｌと形質転換体選択のための薬剤を添加した寒天平板
培地で培養した後、Ｘ−ｇａｌがβ−ガラクトシダーゼ
の分解によって青色を呈したコロニーを選択することに
より得られる。
を、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の欠損した大腸菌に形
質転換する。ストレプトコッカス・サーモフィルスのβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の組み込ま
れたプラスミドを保持する大腸菌の形質転換体はＸ−ｇ
ａｌと形質転換体選択のための薬剤を添加した寒天平板
培地で培養した後、Ｘ−ｇａｌがβ−ガラクトシダーゼ
の分解によって青色を呈したコロニーを選択することに
より得られる。
【００１７】また、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の組込
まれたプラスミドにプロモータを含むＤＮＡ断片を更に
組込む場合は、プラスミドのβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子の上流にある制限酵素サイトに更にプロモータを含む
ＤＮＡ断片を連結し、再び、上記と同様に大腸菌を形質
転換する。
まれたプラスミドにプロモータを含むＤＮＡ断片を更に
組込む場合は、プラスミドのβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子の上流にある制限酵素サイトに更にプロモータを含む
ＤＮＡ断片を連結し、再び、上記と同様に大腸菌を形質
転換する。
【００１８】ついで、得られた組換え体からのプラスミ
ドの分離は以下の方法で行なう。プラスミドを保持する
大腸菌を培養集菌する。菌体よりアルカリ法やクリアー
ドライゼート法、等によりプラスミドＤＮＡを得る。得
られたプラスミドＤＮＡは、枯草菌を形質転換できる。
またこのプラスミドＤＮＡから大腸菌由来のＤＮＡ部分
を制限酵素で切除することで枯草菌のみを形質転換でき
るプラスミドを得ることができる。上記のようにして得
たプラスミドを保持する枯草菌の形質転換体を液体培地
で培養し、超音波破砕器などで破砕することによって、
ストレプトコッカス・サーモフィルスのβ−ガラクトシ
ダーゼの粗酵素液を効率よく得ることができる。粗酵素
液からβ−ガラクトシダーゼは通常の手段で精製するこ
とができる。
ドの分離は以下の方法で行なう。プラスミドを保持する
大腸菌を培養集菌する。菌体よりアルカリ法やクリアー
ドライゼート法、等によりプラスミドＤＮＡを得る。得
られたプラスミドＤＮＡは、枯草菌を形質転換できる。
またこのプラスミドＤＮＡから大腸菌由来のＤＮＡ部分
を制限酵素で切除することで枯草菌のみを形質転換でき
るプラスミドを得ることができる。上記のようにして得
たプラスミドを保持する枯草菌の形質転換体を液体培地
で培養し、超音波破砕器などで破砕することによって、
ストレプトコッカス・サーモフィルスのβ−ガラクトシ
ダーゼの粗酵素液を効率よく得ることができる。粗酵素
液からβ−ガラクトシダーゼは通常の手段で精製するこ
とができる。
【００１９】尚、本発明に係るβ−ガラクトシダーゼ産
生プラスミドは、枯草菌の形質転換体（B.subtilis ISW
1214(pHYBP3)）として、平成０７年０６月０６日に付け
で寄託済である（微工研菌寄第１４９７５号）。
生プラスミドは、枯草菌の形質転換体（B.subtilis ISW
1214(pHYBP3)）として、平成０７年０６月０６日に付け
で寄託済である（微工研菌寄第１４９７５号）。
【００２０】
【実施例】以下に本発明を実施例により更に明確にす
る。図１は本発明の一実施例のプラスミドｐＨＹβＰ３
の作成過程を示した説明図である。１．プラスミドｐＴＩ−ＳＴ−βからのβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子の分離 １μｇのｐＴＩ−ＳＴ−β（特開平５−１０３６６８号
参照）を PstＩで消化した。これを0.7%アガロースゲル
で電気泳動し、ストレプトコッカス・サーモフィルスの
β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ ST-β-gal）を含む７ｋ
ｂのＤＮＡ断片をゲルから回収した。抽出したＤＮＡは
フェノール抽出、エタノール沈殿を行い、精製した。精
製した７ｋｂのＤＮＡ断片を１０μｌの滅菌水に溶解さ
せた。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、このＤＮＡ断
片の両端末を平滑末端にした後、ＤＮＡ断片の末端に８
塩基のBamHＩリンカーｄ（pCGGATCCG ）をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで連結させた。このＤＮＡをBamHＩと SalＩで消
化し、ＤＮＡ断片の末端に余分に連結したリンカーを切
除した。また同時にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の下流
側に SalＩサイトを露出させた。
る。図１は本発明の一実施例のプラスミドｐＨＹβＰ３
の作成過程を示した説明図である。１．プラスミドｐＴＩ−ＳＴ−βからのβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子の分離 １μｇのｐＴＩ−ＳＴ−β（特開平５−１０３６６８号
参照）を PstＩで消化した。これを0.7%アガロースゲル
で電気泳動し、ストレプトコッカス・サーモフィルスの
β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ ST-β-gal）を含む７ｋ
ｂのＤＮＡ断片をゲルから回収した。抽出したＤＮＡは
フェノール抽出、エタノール沈殿を行い、精製した。精
製した７ｋｂのＤＮＡ断片を１０μｌの滅菌水に溶解さ
せた。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、このＤＮＡ断
片の両端末を平滑末端にした後、ＤＮＡ断片の末端に８
塩基のBamHＩリンカーｄ（pCGGATCCG ）をＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで連結させた。このＤＮＡをBamHＩと SalＩで消
化し、ＤＮＡ断片の末端に余分に連結したリンカーを切
除した。また同時にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の下流
側に SalＩサイトを露出させた。
【００２１】２．プロモータ（Ｐ（ＳＰ０２））断片の
取得 １μｇのｐＰＬ６０８（アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクションより取得、Ｎｏ．３７１０８）を Eco
RIで処理し、これを1.4%アガロースゲルで電気泳動し
た。このゲルより約 0.3kbのＤＮＡバンドを切りだし、
ＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼで処理後、BamHＩリンカーｄ（pCGGATCCG ）
を加えて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ処理を施した。この操作
により末端にBamHＩサイトを有するプロモータ断片Ｐ
（ＳＰ０２）が得られた。
取得 １μｇのｐＰＬ６０８（アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクションより取得、Ｎｏ．３７１０８）を Eco
RIで処理し、これを1.4%アガロースゲルで電気泳動し
た。このゲルより約 0.3kbのＤＮＡバンドを切りだし、
ＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼで処理後、BamHＩリンカーｄ（pCGGATCCG ）
を加えて、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ処理を施した。この操作
により末端にBamHＩサイトを有するプロモータ断片Ｐ
（ＳＰ０２）が得られた。
【００２２】３．枯草菌と大腸菌間のシャトルベクター
pHY320PLK の脱リン酸化 ベクターｐＨＹ３２０ＰＬＫ（特開昭６３−０１６３１
１号）１μｇに対し、BamHＩと SalＩを各々10ユニット
加え、３７℃で３時間完全消化した。フェノール抽出、
エーテル抽出、エタノール沈殿によって回収したＤＮＡ
を真空下で乾燥させた。これを 100mM Tris-HCl （pH
8.0）溶液 100μｌに溶解し、５ユニットのアルカリホ
スファターゼを加え３７℃で１時間反応した後、フェノ
ール抽出、エーテル抽出、エタノール沈殿でＤＮＡを回
収した。回収したプラスミドは水に溶解した。
pHY320PLK の脱リン酸化 ベクターｐＨＹ３２０ＰＬＫ（特開昭６３−０１６３１
１号）１μｇに対し、BamHＩと SalＩを各々10ユニット
加え、３７℃で３時間完全消化した。フェノール抽出、
エーテル抽出、エタノール沈殿によって回収したＤＮＡ
を真空下で乾燥させた。これを 100mM Tris-HCl （pH
8.0）溶液 100μｌに溶解し、５ユニットのアルカリホ
スファターゼを加え３７℃で１時間反応した後、フェノ
ール抽出、エーテル抽出、エタノール沈殿でＤＮＡを回
収した。回収したプラスミドは水に溶解した。
【００２３】４．ベクターＤＮＡへのβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子の挿入 上記１．のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を担う 6.5kbの
ＤＮＡ断片と上記３．のベクターＤＮＡを混合し、66mM
Tris-HCl （pH 7.5）、 6.6mM MgCl2、１mMＤＴＴ、１
mM ＡＴＰ、５ユニットのＴ４−ＤＮＡリガーゼを加
え、16℃で16時間反応した。
ーゼ遺伝子の挿入 上記１．のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を担う 6.5kbの
ＤＮＡ断片と上記３．のベクターＤＮＡを混合し、66mM
Tris-HCl （pH 7.5）、 6.6mM MgCl2、１mMＤＴＴ、１
mM ＡＴＰ、５ユニットのＴ４−ＤＮＡリガーゼを加
え、16℃で16時間反応した。
【００２４】５．組換え体プラスミドによる大腸菌の形
質転換 上記４．の反応液を、大腸菌ＪＭ１０８株のコンピテン
トセルと混合し、氷中に、２０分間放置した後、４２℃
で２分間処理し、再び氷中に戻した。これを３ｍｌのＬ
Ｂ培地（塩化ナトリウム 0.5％、トリプトン １％、酵
母エキス 0.5％）に接種し、３７℃で１時間振盪培養し
た。遠心により菌を集め、これをアンピシリン（１００
μｇ／ｍｌ）、Ｘ−ｇａｌ（４０μｇ／ｍｌ）を含むＬ
Ｂ寒天培地に塗抹し、３７℃で一昼夜培養することによ
ってアンピシリン耐性の形質転換株を選択した。ここで
得られたアンピシリン耐性の大腸菌形質転換体の殆どは
β−ガラクトシダーゼを産生するようになったため、寒
天培地中のＸ−ｇａｌを分解し、青色を呈するよう形質
転換されていた。青色を呈する株の一つを以降に使用し
た。
質転換 上記４．の反応液を、大腸菌ＪＭ１０８株のコンピテン
トセルと混合し、氷中に、２０分間放置した後、４２℃
で２分間処理し、再び氷中に戻した。これを３ｍｌのＬ
Ｂ培地（塩化ナトリウム 0.5％、トリプトン １％、酵
母エキス 0.5％）に接種し、３７℃で１時間振盪培養し
た。遠心により菌を集め、これをアンピシリン（１００
μｇ／ｍｌ）、Ｘ−ｇａｌ（４０μｇ／ｍｌ）を含むＬ
Ｂ寒天培地に塗抹し、３７℃で一昼夜培養することによ
ってアンピシリン耐性の形質転換株を選択した。ここで
得られたアンピシリン耐性の大腸菌形質転換体の殆どは
β−ガラクトシダーゼを産生するようになったため、寒
天培地中のＸ−ｇａｌを分解し、青色を呈するよう形質
転換されていた。青色を呈する株の一つを以降に使用し
た。
【００２５】６．β−ガラクトシダーゼ遺伝子を担うプ
ラスミドの精製 上記５．によって選択した菌株を１００μｇ／ｍｌのア
ンピシリンを添加したＬＢ培地１００ｍｌに接種し、培
養集菌後アルカリ法によりプラスミドを精製した。即
ち、菌体を２ｍｌのＡ溶液（25mM Tris-HCl （pH８．
０），１０mM ＥＤＴＡ，１５％ ショ糖、２ｍｇ／ｍ
ｌ リゾチーム）に懸濁し、０℃で１０分間処理した
後、４ｍｌのＢ溶液（０．２Ｍ 水酸化ナトリウム、１
％ＳＤＳ）を加え０℃で１０分間処理した。これに２．
５ｍｌの３Ｍ 酢酸ナトリウムを加え、０℃で２０分間
処理した後、遠心により沈殿を除き、分取した上澄にリ
ボヌクレアーゼＡを５０μｇ／ｍｌになるように添加し
て、３７℃で３０分間処理した。
ラスミドの精製 上記５．によって選択した菌株を１００μｇ／ｍｌのア
ンピシリンを添加したＬＢ培地１００ｍｌに接種し、培
養集菌後アルカリ法によりプラスミドを精製した。即
ち、菌体を２ｍｌのＡ溶液（25mM Tris-HCl （pH８．
０），１０mM ＥＤＴＡ，１５％ ショ糖、２ｍｇ／ｍ
ｌ リゾチーム）に懸濁し、０℃で１０分間処理した
後、４ｍｌのＢ溶液（０．２Ｍ 水酸化ナトリウム、１
％ＳＤＳ）を加え０℃で１０分間処理した。これに２．
５ｍｌの３Ｍ 酢酸ナトリウムを加え、０℃で２０分間
処理した後、遠心により沈殿を除き、分取した上澄にリ
ボヌクレアーゼＡを５０μｇ／ｍｌになるように添加し
て、３７℃で３０分間処理した。
【００２６】フェノール抽出，フェノール／クロロホル
ム（１：１）抽出後、水層を分取した。水層に２倍量の
エタノールを加えて、エタノール沈殿を行なった。沈殿
を０．８ｍｌの水に溶解し、４Ｍの食塩０．２ｍｌ，１
３％のポリエチレングリコール６０００ １ｍｌをそれ
ぞれ加え混合して０℃に１時間放置した。１５０００×
ｇ １０分間の遠心によってＤＮＡの沈殿を集め、この
沈殿を８０％のエタノールで洗浄したのち真空下で乾燥
した。沈殿を水に溶解した。このプラスミドをｐＨＹβ
とした。
ム（１：１）抽出後、水層を分取した。水層に２倍量の
エタノールを加えて、エタノール沈殿を行なった。沈殿
を０．８ｍｌの水に溶解し、４Ｍの食塩０．２ｍｌ，１
３％のポリエチレングリコール６０００ １ｍｌをそれ
ぞれ加え混合して０℃に１時間放置した。１５０００×
ｇ １０分間の遠心によってＤＮＡの沈殿を集め、この
沈殿を８０％のエタノールで洗浄したのち真空下で乾燥
した。沈殿を水に溶解した。このプラスミドをｐＨＹβ
とした。
【００２７】７．ｐＨＹβのBamHＩによる切断と脱リン
酸化 ｐＨＹβ１μｇに対し、BamHＩを１０ユニット加え、３
７℃で３時間消化した。フェノール抽出、エーテル抽
出、エタノール沈殿によって回収したＤＮＡを真空化で
乾燥させた。これを１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）溶液１００μｌに溶解し、５ユニットのアルカ
リホスファターゼを加え、３７℃で１時間反応した後、
フェノール抽出、エーテル抽出、エタノール沈殿でＤＮ
Ａを回収した。回収したプラスミドは水に溶解した。
酸化 ｐＨＹβ１μｇに対し、BamHＩを１０ユニット加え、３
７℃で３時間消化した。フェノール抽出、エーテル抽
出、エタノール沈殿によって回収したＤＮＡを真空化で
乾燥させた。これを１００mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）溶液１００μｌに溶解し、５ユニットのアルカ
リホスファターゼを加え、３７℃で１時間反応した後、
フェノール抽出、エーテル抽出、エタノール沈殿でＤＮ
Ａを回収した。回収したプラスミドは水に溶解した。
【００２８】８．ｐＨＹβへのプロモータＰ（ＳＰ０
２）の挿入 上記２のプロモータＰ（ＳＰ０２）のＤＮＡ断片と、上
記７．のプラスミドを混合し、６６mM Tris-HCl （ｐＨ
７．５）、６．６mM ＭｇＣｌ2 ，１mM ＤＴＴ，１mM
ＡＴＰ，５ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、１
６℃で１６時間反応した。
２）の挿入 上記２のプロモータＰ（ＳＰ０２）のＤＮＡ断片と、上
記７．のプラスミドを混合し、６６mM Tris-HCl （ｐＨ
７．５）、６．６mM ＭｇＣｌ2 ，１mM ＤＴＴ，１mM
ＡＴＰ，５ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、１
６℃で１６時間反応した。
【００２９】９．組換え体プラスミドによる大腸菌の形
質転換 上記８．の反応液を、大腸菌ＪＭ１０８株のコンピテン
トセルに添加し、氷中に２０分間放置した後、４２℃で
２分間処理し、再び氷中に戻した。これを３ｍｌのＬＢ
培地（塩化ナトリウム０．５％，トリプトン１％，酵母
エキス ０．５％）に接種し、３７℃で１時間振盪培養
した。遠心により集めた菌を、アンピシリン（１００μ
ｇ／ｍｌ）、Ｘ−ｇａｌ（４０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ
寒天培地に塗抹し、３７℃で一昼夜培養することによっ
てアンピシリン耐性とβ−ガラクトシダーゼ活性の両方
を有する青色を呈するコロニーを選択した。
質転換 上記８．の反応液を、大腸菌ＪＭ１０８株のコンピテン
トセルに添加し、氷中に２０分間放置した後、４２℃で
２分間処理し、再び氷中に戻した。これを３ｍｌのＬＢ
培地（塩化ナトリウム０．５％，トリプトン１％，酵母
エキス ０．５％）に接種し、３７℃で１時間振盪培養
した。遠心により集めた菌を、アンピシリン（１００μ
ｇ／ｍｌ）、Ｘ−ｇａｌ（４０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ
寒天培地に塗抹し、３７℃で一昼夜培養することによっ
てアンピシリン耐性とβ−ガラクトシダーゼ活性の両方
を有する青色を呈するコロニーを選択した。
【００３０】ここで得た青色コロニーより４株を無作為
に選び、 No.１，２，３，４と名付けた。この４株とｐ
ＨＹβを保持するコントロール株とをアンピシリン（１
００μg/ml）を添加したＬＢ培地にそれぞれ接種して、
３７℃で一昼夜培養した。培養液より０．１ｍｌを試験
管に分取し、β−ガラクトシダーゼ活性測定用の合成基
質であるｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド
（ＯＮＰＧ）を用いる方法（エクスペリメンツ・イン・
モレキュラー・ジェネティクス(Experiments inMolecul
ar Genetics), J.H.Miller p403(1972)）に従って発色
反応を行った。 No.１の培養液では、反応液は濃黄色を
示したが、 No.２，３，４とコントロール株との培養液
では薄い黄色しか示さなかった。即ち、 No.１の培養菌
体は、 No.２，３，４やコントロールの株に比べてβ−
ガラクトシダーゼ活性が高いことが示された。 No.１
は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子に対しＰ（ＳＰ０２）
が正方向に連結されたプラスミドを保持する株であると
予想された。
に選び、 No.１，２，３，４と名付けた。この４株とｐ
ＨＹβを保持するコントロール株とをアンピシリン（１
００μg/ml）を添加したＬＢ培地にそれぞれ接種して、
３７℃で一昼夜培養した。培養液より０．１ｍｌを試験
管に分取し、β−ガラクトシダーゼ活性測定用の合成基
質であるｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド
（ＯＮＰＧ）を用いる方法（エクスペリメンツ・イン・
モレキュラー・ジェネティクス(Experiments inMolecul
ar Genetics), J.H.Miller p403(1972)）に従って発色
反応を行った。 No.１の培養液では、反応液は濃黄色を
示したが、 No.２，３，４とコントロール株との培養液
では薄い黄色しか示さなかった。即ち、 No.１の培養菌
体は、 No.２，３，４やコントロールの株に比べてβ−
ガラクトシダーゼ活性が高いことが示された。 No.１
は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子に対しＰ（ＳＰ０２）
が正方向に連結されたプラスミドを保持する株であると
予想された。
【００３１】続いて、Ｎｏ．１の株より、上記６．と同
様の方法にて、プラスミドＤＮＡを抽出した。
様の方法にて、プラスミドＤＮＡを抽出した。
【００３２】プラスミドＤＮＡは水に溶解し、制限酵素
BamHＩにより消化した後、アガロースゲル電気泳動を行
った。この結果、Ｐ（ＳＰ０２）の 0.3kbの挿入をもつ
ことが判った。抽出されたプラスミド即ちＰ（ＳＰ０
２）プロモータに対して順方向にβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子が連結されたプラスミドを、ｐＨＹβＰＲとし
た。
BamHＩにより消化した後、アガロースゲル電気泳動を行
った。この結果、Ｐ（ＳＰ０２）の 0.3kbの挿入をもつ
ことが判った。抽出されたプラスミド即ちＰ（ＳＰ０
２）プロモータに対して順方向にβ−ガラクトシダーゼ
遺伝子が連結されたプラスミドを、ｐＨＹβＰＲとし
た。
【００３３】１０．プラスミドの小型化 上記９．で得たプラスミドｐＨＹβＰＲのＤＮＡ １μ
ｇを１０ユニットの AflIIで２時間消化した。６５℃で
１０分間保温することで AflIIを失活させた後、１０ユ
ニットの SalＩで更に２時間消化した。フェノール抽
出、エーテル抽出、エタノール沈殿でＤＮＡを回収し
た。回収したＤＮＡはＴ４ＤＮＡポリメラーゼで末端を
平滑化した。フェノール抽出、エーテル抽出、エタノー
ル沈殿によりＤＮＡを回収し、６６mM Tris-HCl （ｐＨ
７．５），６．６mMＭｇＣｌ2 ，１mMＤＴＴ，１mM Ａ
ＴＰ，５ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃で
１６時間反応した。
ｇを１０ユニットの AflIIで２時間消化した。６５℃で
１０分間保温することで AflIIを失活させた後、１０ユ
ニットの SalＩで更に２時間消化した。フェノール抽
出、エーテル抽出、エタノール沈殿でＤＮＡを回収し
た。回収したＤＮＡはＴ４ＤＮＡポリメラーゼで末端を
平滑化した。フェノール抽出、エーテル抽出、エタノー
ル沈殿によりＤＮＡを回収し、６６mM Tris-HCl （ｐＨ
７．５），６．６mMＭｇＣｌ2 ，１mMＤＴＴ，１mM Ａ
ＴＰ，５ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼを加え、４℃で
１６時間反応した。
【００３４】１１．枯草菌の形質転換 枯草菌（Bacillus subtilis ISW1214 hsrM1,leuA8,metB
5,TcS ）（Ishiwa等,Jpn.J.Genet.,61,515-528(1986)）
を培地Ｉ（スピザイゼン ミネラル培地）（Spizizen m
ineral medium : K2HPO4 1.4%, KH2PO4 0.6%, (NH4)2SO
4 0.2%, クエン酸ナトリウム 0.1%, MgSO4・7H2O 0.02%,
グルコース 0.5% に対してカゼイン加水分解物 0.02
%，酵母エキス 0.1% ，Ｌ−ロイシン５０μｇ／ｍｌ，
Ｌ−メチオニン５０μｇ／ｍｌを加えたもの）に、１×
１０8 ／ｍｌ程度接種した。これを３７℃で振盪培養し
て、約４時間経過後、静止期に入った段階で培地II（培
地Ｉのカゼイン加水分解物を除き、酵母エキスを 0.02
%，Ｌ−ロイシンを５μｇ／ｍｌ，Ｌ−メチオニンを５
μｇ／ｍｌとし、５mM ＭｇＣｌを加えたもの）中で、
１０倍に薄めて培養を続行した。培養液中の菌は９０分
後に、コンピテント(Competent) 状態に達した。このコ
ンピテント細胞９０μｌに上記１０．の反応液１０μｌ
を加えて３７℃で、９０分間振盪培養しながら形質転換
を行った。
5,TcS ）（Ishiwa等,Jpn.J.Genet.,61,515-528(1986)）
を培地Ｉ（スピザイゼン ミネラル培地）（Spizizen m
ineral medium : K2HPO4 1.4%, KH2PO4 0.6%, (NH4)2SO
4 0.2%, クエン酸ナトリウム 0.1%, MgSO4・7H2O 0.02%,
グルコース 0.5% に対してカゼイン加水分解物 0.02
%，酵母エキス 0.1% ，Ｌ−ロイシン５０μｇ／ｍｌ，
Ｌ−メチオニン５０μｇ／ｍｌを加えたもの）に、１×
１０8 ／ｍｌ程度接種した。これを３７℃で振盪培養し
て、約４時間経過後、静止期に入った段階で培地II（培
地Ｉのカゼイン加水分解物を除き、酵母エキスを 0.02
%，Ｌ−ロイシンを５μｇ／ｍｌ，Ｌ−メチオニンを５
μｇ／ｍｌとし、５mM ＭｇＣｌを加えたもの）中で、
１０倍に薄めて培養を続行した。培養液中の菌は９０分
後に、コンピテント(Competent) 状態に達した。このコ
ンピテント細胞９０μｌに上記１０．の反応液１０μｌ
を加えて３７℃で、９０分間振盪培養しながら形質転換
を行った。
【００３５】１２．形質転換体の検出 ＤＮＡを取り込ませた形質転換体を２０μｇ／ｍｌのテ
トラサイクリンと４０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌを含むＬ
Ｂ−寒天平板上に塗布して、３７℃で２４時間培養し
た。この寒天培地上に生じた濃青色のコロニーを選択し
た。選択したコロニーを２０μｇ／ｍｌのテトラサイク
リンを含むＬＢ液体培地１０ｍｌに接種し、３７℃で一
昼夜振盪培養し、上記６．に示した方法でプラスミドＤ
ＮＡを回収した。但し、各反応に用いた薬剤は全て１０
分の１の体積で行った。得られたプラスミドの大きさを
０．７％のアガロースゲルで電気泳動し調べた。大きさ
は約１０ｋｂであったことから操作１０．により、ｐＨ
ＹβＰＲ（１２．１６ｋｂ）より、大腸菌中での複製・
選択に必要な AflII-SalＩ ＤＮＡ断片が除去されｐＨ
ＹβＰ３が得られたことを確認した。
トラサイクリンと４０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌを含むＬ
Ｂ−寒天平板上に塗布して、３７℃で２４時間培養し
た。この寒天培地上に生じた濃青色のコロニーを選択し
た。選択したコロニーを２０μｇ／ｍｌのテトラサイク
リンを含むＬＢ液体培地１０ｍｌに接種し、３７℃で一
昼夜振盪培養し、上記６．に示した方法でプラスミドＤ
ＮＡを回収した。但し、各反応に用いた薬剤は全て１０
分の１の体積で行った。得られたプラスミドの大きさを
０．７％のアガロースゲルで電気泳動し調べた。大きさ
は約１０ｋｂであったことから操作１０．により、ｐＨ
ＹβＰＲ（１２．１６ｋｂ）より、大腸菌中での複製・
選択に必要な AflII-SalＩ ＤＮＡ断片が除去されｐＨ
ＹβＰ３が得られたことを確認した。
【００３６】１３．枯草菌組換え体の培養 上記１２．で得た組換え体を１００μｇ／ｍｌのテトラ
サイクリンと０．５ｍｇ／ｍｌのＬ−メチオニンと0.5m
g/mlのＬ−ロイシンを加えたＡ培地(Journal of Bacter
iology, 165 ,796-804,1986)１００ｍｌに接種し、２４
時間又は４８時間，３７℃で強く振盪しながら培養し
た。また、対照としてｐＨＹ３２０ＰＬＫで形質転換さ
れた枯草菌B.subtilis（ｐＨＹ３２０ＰＬＫ）を同じ条
件で培養した。表１に培地１による結果を示した。
サイクリンと０．５ｍｇ／ｍｌのＬ−メチオニンと0.5m
g/mlのＬ−ロイシンを加えたＡ培地(Journal of Bacter
iology, 165 ,796-804,1986)１００ｍｌに接種し、２４
時間又は４８時間，３７℃で強く振盪しながら培養し
た。また、対照としてｐＨＹ３２０ＰＬＫで形質転換さ
れた枯草菌B.subtilis（ｐＨＹ３２０ＰＬＫ）を同じ条
件で培養した。表１に培地１による結果を示した。
【００３７】一方、上記１２．で得た組換え体を合成培
地でも培養した。即ち、Syntheticmedium (Biotechnol.
Bioeng.,28,204-209(1986))より、チアミン−ＨＣｌ，
Ｌ−スレオニン，Ｌ−トリプトファン，Ｌ−ヒスチジ
ン，アンピシリンを除いたものに５ｍｇ／ｍｌのポリペ
プトン，０．５ｍｇ／ｍｌのＬ−メチオニン，１００μ
ｇ／ｍｌのテトラサイクリンを加え、Ｌ−ロイシンの濃
度を０．５ｍｇ／ｍｌに変更した組成の培地１００ｍｌ
に１２．で得た組換え体を接種し、３７℃で強く振盪し
ながら２４時間又は４８時間培養した。また対照とし
て、ｐＨＹ３２０ＰＬＫで形質転換された枯草菌B.subt
ilis（ｐＨＹ３２０ＰＬＫ）を同じ条件で培養した。表
１に培地２の結果を示した。
地でも培養した。即ち、Syntheticmedium (Biotechnol.
Bioeng.,28,204-209(1986))より、チアミン−ＨＣｌ，
Ｌ−スレオニン，Ｌ−トリプトファン，Ｌ−ヒスチジ
ン，アンピシリンを除いたものに５ｍｇ／ｍｌのポリペ
プトン，０．５ｍｇ／ｍｌのＬ−メチオニン，１００μ
ｇ／ｍｌのテトラサイクリンを加え、Ｌ−ロイシンの濃
度を０．５ｍｇ／ｍｌに変更した組成の培地１００ｍｌ
に１２．で得た組換え体を接種し、３７℃で強く振盪し
ながら２４時間又は４８時間培養した。また対照とし
て、ｐＨＹ３２０ＰＬＫで形質転換された枯草菌B.subt
ilis（ｐＨＹ３２０ＰＬＫ）を同じ条件で培養した。表
１に培地２の結果を示した。
【００３８】
【表１】
【００３９】１４．ストレプトコッカス・サーモフィル
スの培養 １００ｍｌの変法Ｒｏｇｏｓａ培地（１％乳糖を含む）
にストレプトコッカス・サーモフィルス ATCC19258 を
接種して３７℃で２４時間もしくは４８時間静置培養し
た。培養液を６０００×ｇ １０分の遠心にかけ、菌体
を集めた。
スの培養 １００ｍｌの変法Ｒｏｇｏｓａ培地（１％乳糖を含む）
にストレプトコッカス・サーモフィルス ATCC19258 を
接種して３７℃で２４時間もしくは４８時間静置培養し
た。培養液を６０００×ｇ １０分の遠心にかけ、菌体
を集めた。
【００４０】１５．培養液のβ−ガラクトシダーゼ活性
の測定 上記１３．および１４．にて得た培養液のうち１部を超
音波破砕機にかけ菌体を破砕した。 100,000×ｇ，３０
分の遠心により沈殿を除き、上澄を用いてβ−ガラクト
シダーゼ活性を測定した。β−ガラクトシダーゼ活性は
合成基質であるＯ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクト
シド（ＯＮＰＧ）を用いる方法（エクスペリメンツ・イ
ン・モレキュラー・ジェネティクス（Experiments in M
olecular Genetics),J.H.Miller p403(1972)）に従って
測定した。
の測定 上記１３．および１４．にて得た培養液のうち１部を超
音波破砕機にかけ菌体を破砕した。 100,000×ｇ，３０
分の遠心により沈殿を除き、上澄を用いてβ−ガラクト
シダーゼ活性を測定した。β−ガラクトシダーゼ活性は
合成基質であるＯ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクト
シド（ＯＮＰＧ）を用いる方法（エクスペリメンツ・イ
ン・モレキュラー・ジェネティクス（Experiments in M
olecular Genetics),J.H.Miller p403(1972)）に従って
測定した。
【００４１】酵素活性はＯＮＰＧの加水分解により生じ
るニトロフェノール分子の吸光度を４２０ｎｍの波長で
検出し、３７℃、１分間に１μｍｏｌのニトロフェノー
ルを遊離する活性強度を１ユニットとした。表１に示し
た結果より、本発明の組換え体大腸菌を用いた場合の方
が、得られるβ−ガラクトシダーゼの活性が高いことが
明らかである（ストレプトコッカス・サーモフィルスの
数１０倍から１００倍）。
るニトロフェノール分子の吸光度を４２０ｎｍの波長で
検出し、３７℃、１分間に１μｍｏｌのニトロフェノー
ルを遊離する活性強度を１ユニットとした。表１に示し
た結果より、本発明の組換え体大腸菌を用いた場合の方
が、得られるβ−ガラクトシダーゼの活性が高いことが
明らかである（ストレプトコッカス・サーモフィルスの
数１０倍から１００倍）。
【００４２】１６．β−ガラクトシダーゼの精製 上記１３．で得られた菌体を破砕し、常法に従い処理を
行い。β−ガラクトシダーゼを得た。
行い。β−ガラクトシダーゼを得た。
【００４３】
【発明の効果】本発明は以上説明したとおり、ストレプ
トコッカス・サーモフィルス由来のβ−ガラクトシダー
ゼ産生遺伝子を、枯草菌のテンペレートファージＳＰ０
２由来のプロモータの下流に連結したβ−ガラクトシダ
ーゼ産生プラスミドを枯草菌に導入し、その枯草菌を培
地中で培養し、培養菌体中にβ−ガラクトシダーゼを蓄
積させて、β−ガラクトシダーゼを採取するため、スト
レプトコッカス・サーモフィルスの培養菌体を用いた場
合に比べ、β−ガラクトシダーゼを枯草菌形質転換体株
の細胞内で効率よく、大量に発現させることができると
いう効果がある。
トコッカス・サーモフィルス由来のβ−ガラクトシダー
ゼ産生遺伝子を、枯草菌のテンペレートファージＳＰ０
２由来のプロモータの下流に連結したβ−ガラクトシダ
ーゼ産生プラスミドを枯草菌に導入し、その枯草菌を培
地中で培養し、培養菌体中にβ−ガラクトシダーゼを蓄
積させて、β−ガラクトシダーゼを採取するため、スト
レプトコッカス・サーモフィルスの培養菌体を用いた場
合に比べ、β−ガラクトシダーゼを枯草菌形質転換体株
の細胞内で効率よく、大量に発現させることができると
いう効果がある。
【図１】プラスミドｐＨＹβＰ３の作成過程を示した説
明図である。
明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｎ 9/38 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125）
Claims (2)
- 【請求項１】 ストレプトコッカス・サーモフィルス(S
treptococcus thermophilus)由来のβ−ガラクトシダー
ゼ産生遺伝子を、枯草菌テンペレートファージＳＰ０２
由来のプロモータの下流に連結したことを特徴とするβ
−ガラクトシダーゼ産生プラスミド。 - 【請求項２】 前記請求項１に記載のβ−ガラクトシダ
ーゼ産生プラスミドを導入した枯草菌(Bacillus subtil
is) を培地中で培養し、培養菌体中にβ−ガラクトシダ
ーゼを蓄積させて、β−ガラクトシダーゼを採取するβ
−ガラクトシダーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7175583A JPH09259A (ja) | 1995-06-20 | 1995-06-20 | β−ガラクトシダーゼ産生プラスミド及びβ−ガラクトシダーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7175583A JPH09259A (ja) | 1995-06-20 | 1995-06-20 | β−ガラクトシダーゼ産生プラスミド及びβ−ガラクトシダーゼの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09259A true JPH09259A (ja) | 1997-01-07 |
Family
ID=15998629
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7175583A Pending JPH09259A (ja) | 1995-06-20 | 1995-06-20 | β−ガラクトシダーゼ産生プラスミド及びβ−ガラクトシダーゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09259A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9314041B2 (en) | 2005-03-03 | 2016-04-19 | Meiji Co., Ltd. | Immune function modulating agents |
| CN111363714A (zh) * | 2020-04-07 | 2020-07-03 | 齐鲁工业大学 | 一种食品级嗜热链球菌表达载体的构建方法 |
| JP2022535648A (ja) * | 2020-04-27 | 2022-08-10 | 江南大学 | ゲンチオオリゴ糖の製造における耐熱性β－グルコシダーゼの使用 |
-
1995
- 1995-06-20 JP JP7175583A patent/JPH09259A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9314041B2 (en) | 2005-03-03 | 2016-04-19 | Meiji Co., Ltd. | Immune function modulating agents |
| CN111363714A (zh) * | 2020-04-07 | 2020-07-03 | 齐鲁工业大学 | 一种食品级嗜热链球菌表达载体的构建方法 |
| CN111363714B (zh) * | 2020-04-07 | 2022-06-28 | 齐鲁工业大学 | 一种食品级嗜热链球菌表达载体的构建方法 |
| JP2022535648A (ja) * | 2020-04-27 | 2022-08-10 | 江南大学 | ゲンチオオリゴ糖の製造における耐熱性β－グルコシダーゼの使用 |
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