CN111363714A - 一种食品级嗜热链球菌表达载体的构建方法 - Google Patents

一种食品级嗜热链球菌表达载体的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种食品级嗜热链球菌表达载体的构建方法，所述食品级嗜热链球菌表达系统包含食品级宿主嗜热链球菌CH3080、食品级表达载体pST4040；所述食品级宿主嗜热链球菌CH3080是采用同源重组技术敲除嗜热链球菌基因组上的β‑半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因而获得，丧失利用乳糖的能力；食品级表达载体pST4040包含来自于嗜热链球菌的β‑半乳糖苷酶N端第1个至第53个氨基酸编码基因作为互补筛选标记；所述表达系统为食品级表达系统，其DNA元件来自于公认安全的微生物，不含抗生素抗性筛选标记，可以直接应用于食品医药等行业中。

Description

一种食品级嗜热链球菌表达载体的构建方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种食品级嗜热链球菌表达载体的构建方法。
背景技术
乳酸菌是能够发酵糖类产生大量乳酸的革兰氏阳性菌的通称，广泛存在于乳制品，泡菜以及肠道环境中。作为公认的安全级微生物，许多性状优良的菌株已被用于食品发酵行业中。近年来，乳酸菌的基因工程操作在食品安全以及改良食品的开发和健康方面具有广阔的应用前景。其中，食品级表达载体是一种常用的基因工程操作工具。食品级表达载体应具有稳定的、显性的、易于识别的选择标记。对于正在开发的食品级选择标记有显性标记和互补标记两大类。显性标记通常是利用宿主菌的特性，例如细菌素抗性、镉抗性、热敏等以取代抗生素抗性标记，以达到筛选的目的。而互补标记需要开发具有特定缺陷的宿主菌株，再其由标志物补充以恢复原始表型，例如无义抑制基因supD、胸苷酸合成酶基因thyA和丙氨酸消旋酶alr基因。互补系统在培养基中不需要任何其他补充。与显性标记相比，它们不受培养条件的限制。
目前已报道的嗜热链球菌食品级载体选择标记是胸苷酸合成酶基因thyA。胸苷酸合成酶在DNA的合成中起关键作用，缺失胸苷酸合成酶基因的菌株在基本培养基中不能生长。Sasaki等构建了以thyA基因为选择标记的食品级表达载体，用外源的α-淀粉酶(amyA)基因在营养缺陷型的嗜热链球菌自发突变体TM1-1中测试了其表达能力，开发了一种用于嗜热链球菌的安全食品级表达系统。但是这种系统的应用需要配制包含胸苷酸的特定培养基，增加了使用成本。
中国文献《β-半乳糖苷酶基因及其在基因学中的应用》(汪川，《预防医学情报杂志》，2002年第18卷第3期)公开了通过众多学者的努力，β-半乳糖苷酶基因库已基本建立并将日趋完善。中国文献《β-半乳糖苷酶的研究现状与进展》(董艺凝，陈海琴，张灏等，《食品与生物技术学报，2018年第37卷第4期》)公开了对于β-半乳糖苷酶的家族分布及其催化机制的形成特点目前尚无系统的分析与总结。
不同来源的β-半乳糖苷酶在酶学特征上存在较大的差异，目前，关于利用大肠杆菌中的β-半乳糖苷酶基因构建载体的研究报道较多，但是，关于利用其他细菌中的β-半乳糖苷酶基因构建表达载体的研究报道较少，尤其是构建食品级表达系统的研究报道更少。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种食品级嗜热链球菌表达载体的构建方法，该套嗜热链球菌食品级表达系统表达效果好，系统中所有的DNA原件来自于公认的安全的微生物，不含有抗生素筛选标记。
本发明的技术方案如下：
一株食品级宿主嗜热链球菌CH3080的构建，包括如下步骤：
(1)提取嗜热链球菌JIM8232(Streptococcus thermophilus JIM8232)的基因组DNA；
(2)以步骤(1)的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2的引物对扩增β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因的上游同源臂，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的引物对扩增β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因的下游同源臂；然后利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因敲除连接臂；
N-up-F:ggtaccgggccccccctcgagGATAAATTCAACCGTAAACG SEQ ID NO.1
N-up-R:TTTTTCAGTCATGTTCATAG SEQ ID NO.2
N-down-F:CTATGAACATGACTGAAAAATTTTCTGAAGGGGAGATG SEQ ID NO.3
N-down-R:agtggatcccccgggctgcagGTTTCATCACTTTGATATC SEQ ID NO.4
(3)使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤(2)中制得的β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因敲除连接臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，挑取验证正确的转化子，提取重组质粒；
(4)将步骤(3)得到的重组质粒转化入嗜热链球菌JIM8232中，通过转化子培养发生第一次同源交换，利用红霉素进行筛选，然后进行连续传代发生第二次同源交换，筛选红霉素标记丢失的菌株，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4的引物对对红霉素标记丢失的菌株进行检测，扩增出2000bp目的产物的菌体即为β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因敲除菌株，命名为嗜热链球菌CH3080；
所得菌株在LM17培养基中失去生长能力；
所用的红霉素标记会在后续连续传代中丢失，最终获得的宿主菌不具有红霉素抗性。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因上游同源臂PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物N-up-F 2μL，引物N-up-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因下游同源臂PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物N-down-F 2μL，引物N-down-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因上游同源臂和下游同源臂连接PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物N-up-F 2μL，引物N-down-R 2μL，上游同源臂1μL，下游同源臂1μL，Ex taq 1μL,双蒸水12μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
根据本发明优选的，所述步骤(3)验证转化子的方法：将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，涂布于含有250μg/mL红霉素的LB平板，30℃静置培养48小时后，挑取转化子接入新鲜的含有250μg/mL红霉素的LB液体培养基中，30℃摇动培养24小时后，提取质粒，使用PstI和XhoI进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中包含一条2000bp的条带，即为正确的转化子。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中转化子的培养条件，转化子在含有2.5μg/mL红霉素的SM17平板上进行培养，温度为30℃。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中利用红霉素的筛选条件：重组质粒转化入嗜热链球菌JIM8232中，涂布于含有2.5μg/mL红霉素的SM17平板，30℃静置培养72小时后，挑取转化子于新鲜的含有2.5μg/mL红霉素的SM17液体培养基中，30℃静置培养至OD600为1.0，将培养温度调节成42℃培养，促使质粒与基因组发生第一次同源交换，42℃培养2小时后，涂布于含有2.5μg/mL红霉素的SM17平板，继续在42℃培养，长出的即为发生第一次同源交换菌株。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中连续传代的培养条件为将第一次同源交换成功的菌株接种于不含有抗生素的SM17液体培养基中，在30℃下静置培养，12小时后转接至新鲜的不含有抗生素的SM17液体培养基中，重复此步骤20次，使菌株发生第二次同源交换。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中红霉素标记丢失的菌株筛选为将连续传代后的菌液涂布于不含有抗生素的SM17平板，30℃培养12小时后，挑取长出的单菌落，分别点接于添加和不添加2.5μg/mL红霉素的SM17平板，继续30℃培养，选择在无红霉素下生长，而有红霉素下不生长的菌株即为红霉素标记丢失的菌株。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中SM17培养基每升组分如下：动物蛋白胨2.5g，胰蛋白胨2.5g，大豆蛋白胨5g，牛肉提取物5g，酵母提取物2.5g，抗坏血酸0.5g，硫酸镁0.25g，beta-甘油磷酸钠五水合物19g，蔗糖20g，余量水。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，PCR检测体系为：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物N-up-F 2μL，引物N-down-R 2μL，基因组DNA1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR检测反应条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，45℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
食品级表达载体pST4040，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
所述食品级表达载体pST4040包含以下元件：来自于质粒pMG36e的复制元件，来源于嗜热链球菌JIM8232菌株的Pldh启动子和Tldh终止子，以及来源于嗜热链球菌JIM8232的β-半乳糖苷酶N端第1个至第53个氨基酸编码基因；将合成的表达载体pST4040转化入嗜热链球菌CH3070后，其在LM17培养基中的生长情况可以得到恢复。
根据本发明优选的，食品级表达载体pST4040的序列由上海生工生物工程有限公司进行合成。
一种食品级嗜热链球菌表达系统，包含上述食品级宿主嗜热链球菌CH3080和上述食品级表达载体pST4040。
上述食品级嗜热链球菌表达系统在生产异源物中的应用。
根据本发明优选的，上述食品级嗜热链球菌表达系统在生产绿色荧光蛋白中的应用。
上述食品级嗜热链球菌表达系统中，嗜热链球菌JIM8232的β-半乳糖苷酶N端第1个至第53个氨基酸编码基因是食品级宿主嗜热链球菌CH3080和食品级表达载体pST4040完成互补筛选的食品级标记；食品级宿主嗜热链球菌CH3080是采用同源重组技术敲除嗜热链球菌JIM8232基因组上的β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因而获得，丧失乳糖利用的能力。
本发明的有益效果：
本发明涉及一种食品级嗜热链球菌表达系统，该系统具备食品级宿主嗜热链球菌CH3080和食品级表达载体pST4040，且嗜热链球菌β-半乳糖苷酶N端第1个至第53个氨基酸编码基因是宿主和载体可以完成互补筛选的食品级标记，该基因标记仅有159个核苷酸构成，基因标记分子量小，利于载体容纳较大的外源基因片段，筛选压力只需将培养基中的碳源蔗糖替换为乳糖，在质粒的复制和外源基因的表达过程中无需添加抗生素。
附图说明
图1：嗜热链球菌β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因敲除菌株琼脂糖凝胶电泳照片
M为Marker，大小从上到下依次为5000、3000、2000、1500、1000、750、500、250、100bp；1为野生型菌株；2为基因敲除菌株；
图2：不同菌株在LM17培养基中的24小时生长OD
JIM8232代表野生型菌株，CH3080代表β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因敲除菌株，CH3080+pST4040代表菌株CH3080转化质粒pST4040；
图3：载体pST4040结构示意图
repA和repC为复制元件，Pldh为启动子和Terminator为终止子，MCS为多克隆位点，以及筛选标记。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细介绍，但保护范围不限于此。
实施例中未详加说明的均按本领域现有技术。
本发明实验中使用和涉及到的细菌菌株、质粒、主要材料及试剂：
大肠杆菌XL-Blue1感受态细胞:购自北京全式金生物技术有限公司，普通市售已知菌株；
嗜热链球菌JIM8232：购自广东环凯微生物科技有限公司，普通市售已知菌株；
质粒pGhost9：购自BioVector NTCC质粒载体菌种细胞蛋白抗体基因保藏中心，普通市售产品；
质粒pTVP1GFP：包含绿色荧光蛋白基因，购自BioVector NTCC质粒载体菌种细胞蛋白抗体基因保藏中心，普通市售产品；
质粒pSLb1：长度为4.0kb，含有胸腺嘧啶合成酶thyA基因，嗜热链球菌食品级表达载体；
质粒pSLb1在文献Sasaki,Y.，Ito,Y.，Sasaki,T.thyA as a Selection Markerin Construction of Food-Grade Host-Vector and Integration Systems forStreptococcus thermophilus[J].Applied and Environment Microbiology，2004，70(3)：1858－1864；已经公开。
细菌基因组提取试剂盒：购自北京天根生物科技有限公司；
柱式质粒DNA小量抽提试剂盒：购自南京诺韦赞生物科技有限公司；
蛋白酶活性分析试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；
红霉素、胸腺嘧啶、琼脂糖、核酸染料等购自上海生工生物工程有限公司；
Ex taq及rtaq等聚合酶、限制性内切酶(PstI、XhoI)、T4DNA连接酶，DNA Marker，DNA凝胶回收试剂盒均购自北京宝日医生物技术有限公司提供；
实施例中所述的SM17培养基，每升组分如下：
动物蛋白胨2.5g，胰蛋白胨2.5g，大豆蛋白胨5g，牛肉提取物5g，酵母提取物2.5g，抗坏血酸0.5g，硫酸镁0.25g，beta-甘油磷酸钠五水合物19g，蔗糖20g，余量水。
实施例中所述的SM17平板，每升组分如下：
动物蛋白胨2.5g，胰蛋白胨2.5g，大豆蛋白胨5g，牛肉提取物5g，酵母提取物2.5g，抗坏血酸0.5g，硫酸镁0.25g，beta-甘油磷酸钠五水合物19g，蔗糖20g，琼脂粉20g，余量水。
LM17液体培养基，每升组分如下：
动物蛋白胨2.5g，胰蛋白胨2.5g，大豆蛋白胨5g，牛肉提取物5g，酵母提取物2.5g，抗坏血酸0.5g，硫酸镁0.25g，beta-甘油磷酸钠五水合物19g，乳糖20g，余量水。
实施例1
食品级宿主嗜热链球菌CH3080的构建，包括如下步骤：
(1)将嗜热链球菌JIM8232接种于LM17液体培养基中，42℃静止培养过夜后收集菌体，使用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA；LM17培养基成分每升含有：动物蛋白胨2.5g，胰蛋白胨2.5g，大豆蛋白胨5g，牛肉提取物5g，酵母提取物2.5g，抗坏血酸0.5g，硫酸镁0.25g，beta-甘油磷酸钠五水合物19g，乳糖20g，余量水。
(2)以步骤(1)的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2的引物对N-up-F和N-up-R进行PCR扩增β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因的上游同源臂，
N-up-F:ggtaccgggccccccctcgagGATAAATTCAACCGTAAACG SEQ ID NO.1
N-up-R:TTTTTCAGTCATGTTCATAG SEQ ID NO.2
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物N-up-F 2μL，引物N-up-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
利用核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的引物对N-down-F和N-down-R进行PCR扩增β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因的下游同源臂，
N-down-F:CTATGAACATGACTGAAAAATTTTCTGAAGGGGAGATG SEQ ID NO.3
N-down-R:agtggatcccccgggctgcagGTTTCATCACTTTGATATC SEQ ID NO.4
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物N-down-F 2μL，引物N-down-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
然后，利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因敲除连接臂；
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物N-up-F 2μL，引物N-down-R2μL，上游同源臂1μL，下游同源臂1μL，Ex taq 1μL,双蒸水12μL。
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
(3)使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤(2)中，制得的β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因敲除连接臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，涂布于含有250μg/mL红霉素的LB平板，30℃静置培养48小时后，挑取转化子接入新鲜的含有250μg/mL红霉素的LB液体管，30℃摇动培养24小时后，提取质粒，使用PstI和XhoI进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中包含一条2000bp的条带，即为正确的转化子，提取验证正确的转化子的质粒；
(4)将步骤(3)得到的重组质粒转化入嗜热链球菌JIM8232中，涂布于含有2.5μg/mL红霉素的SM17平板，30℃静置培养72小时后，挑取转化子于新鲜的含有2.5μg/mL红霉素的SM17液体培养基中，30℃静置培养至OD600为1.0，将培养温度调节成42℃培养，促使质粒与基因组发生第一次同源交换，42℃培养2小时后，涂布于含有2.5μg/mL红霉素的SM17平板，继续在42℃培养，长出的即为发生第一次同源交换菌株。
(5)将步骤(4)中第一次同源交换成功的菌株接种于不含有抗生素的SM17液体培养基中，在30℃下静置培养，12小时后转接至新鲜的不含有抗生素的SM17液体培养基中，重复此步骤20次，使菌株发生第二次同源交换。将菌液涂布于不含有抗生素的SM17平板，30℃培养12小时后，挑取长出的单菌落，分别点接于添加和不添加2.5μg/mL红霉素的SM17平板，继续30℃培养。将在无红霉素下生长，而有红霉素下不生长的菌株挑取至新鲜的培养基。30℃培养12小时后提取基因组DNA。利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4的引物对对第二次同源交换成功并且红霉素标记丢失的菌株进行PCR检测，扩增出2000bp的目的产物即为β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因敲除菌株如图1所示，命名为嗜热链球菌CH3080。敲除β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因后，菌株在LM17培养基中失去生长能力，如图2所示。
PCR检测体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物N-up-F 2μL，引物N-down-R2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。
PCR检测反应条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，45℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
实施例2
食品级表达载体pST4040
食品级表达载体pST4040包含以下元件：来自于质粒pMG36e的复制元件，来源于嗜热链球菌JIM8232菌株的Pldh启动子和Tldh终止子，以及来源于嗜热链球菌JIM8232的β-半乳糖苷酶N端第1个至第53个氨基酸编码基因。其图谱如图3所示，序列由上海生工生物工程有限公司进行合成，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。将合成的表达载体pST4040转化入嗜热链球菌CH3080后，其在LM17培养基中的生长情况能够得到恢复，如图2所示。
实施例3
利用本发明涉及食品级表达系统表达绿色荧光蛋白
利用核苷酸序列为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7的引物对gfp-F和gfp-R进行PCR扩增，扩增产物使用NdeI和BamHI双酶切，并将载体pST4040使用NdeI和BamHI双酶切，酶切的产物使用T4 DNA聚合酶就进行连接，连接产物转化嗜热链球菌CH3080，转化子在LM17培养基上筛选，筛选的转化子提取质粒进行验证，验证正确的转化子转接于新鲜的液体LM17培养基，42℃培养12小时后，利用荧光酶标仪检测绿色荧光蛋白在嗜热链球菌中的表达量，相对荧光值RFU为15920，而转化入空载体的菌株RFU值为450。
gfp-F:ATACATATGAGCAAAGGAGAAGAAC SEQ ID NO.6
gfp-R:ATAGGATCCTTAGTATAGCTCATCCATG SEQ ID NO.7
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物gfp-F 2μL，引物gfp-R 2μL，质粒pTVP1GFP 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
对比例1
食品级表达载体pST4050包含以下元件：来自于质粒pMG36e的复制元件，来源于嗜热链球菌JIM8232菌株的Pldh启动子和Tldh终止子，以及来源于嗜热链球菌JIM8232的β-半乳糖苷酶N端第1个至第36个氨基酸编码基因，序列由上海生工生物工程有限公司进行合成，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。将合成的表达载体pST4050转化入嗜热链球菌CH3080后，菌株依然不能在LM17培养基中生长。这表明作为互补的选择标记具有一定的特异性。
对比例2
食品级表达载体pST4060包含以下元件：来自于质粒pMG36e的复制元件，来源于嗜热链球菌JIM8232菌株的Pldh启动子和Tldh终止子，以及来源于大肠杆菌的β-半乳糖苷酶N端第1个至第53个氨基酸编码基因，序列由上海生工生物工程有限公司进行合成，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。将合成的表达载体pST4060转化入嗜热链球菌CH3080后，菌株依然不能在LM17培养基中生长。这表明作为互补的选择标记具有一定的特异性。
对比例3
缺失thyA基因的嗜热链球菌CH3090的构建，包括如下步骤：
(1)将嗜热链球菌JIM8232接种于LM17液体培养基中，42℃静止培养过夜后收集菌体，使用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA；LM17培养基成分每升含有：动物蛋白胨2.5g，胰蛋白胨2.5g，大豆蛋白胨5g，牛肉提取物5g，酵母提取物2.5g，抗坏血酸0.5g，硫酸镁0.25g，beta-甘油磷酸钠五水合物19g，乳糖20g，余量水。
(2)以步骤(1)的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.11的引物对T-up-F和T-up-R进行PCR扩增胸腺嘧啶合成酶基因thyA的上游同源臂，
T-up-F:ggtaccgggccccccctcgagGACATTGTCATCAGCAAGCTC SEQ ID NO.10
T-up-R:AATTATCCTCTTTATTCTATTT SEQ ID NO.11
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物T-up-F 2μL，引物T-up-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
利用核苷酸序列为SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13的引物对T-down-F和T-down-R进行PCR扩增胸腺嘧啶合成酶基因thyA的下游同源臂，
T-down-F:AAATAGAATAAAGAGGATAATTTAAATGCTTATGATTTAAGC SEQ ID NO.12
T-down-R:agtggatcccccgggctgcagGTTCTTTTGGCTTTGGTGTT SEQ ID NO.13
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物T-down-F 2μL，引物T-down-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
然后，利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得胸腺嘧啶合成酶基因thyA敲除连接臂；
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物T-up-F 2μL，引物T-down-R2μL，上游同源臂1μL，下游同源臂1μL，Ex taq 1μL,双蒸水12μL。
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
(3)使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤(2)中，制得的胸腺嘧啶合成酶基因thyA敲除连接臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，涂布于含有250μg/mL红霉素的LB平板，30℃静置培养48小时后，挑取转化子接入新鲜的含有250μg/mL红霉素的LB液体管，30℃摇动培养24小时后，提取质粒，使用PstI和XhoI进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中包含一条2000bp的条带，即为正确的转化子，提取验证正确的转化子的质粒；
(4)将步骤(3)得到的重组质粒转化入嗜热链球菌JIM8232中，涂布于含有2.5μg/mL红霉素和20μg/mL胸腺嘧啶的LM17平板，30℃静置培养72小时后，挑取转化子于新鲜的含有2.5μg/mL红霉素和20μg/mL胸腺嘧啶的LM17液体培养基中，30℃静置培养至OD600为1.0，将培养温度调节成42℃培养，促使质粒与基因组发生第一次同源交换，42℃培养2小时后，涂布于含有2.5μg/mL红霉素和20μg/mL胸腺嘧啶的LM17平板，继续在42℃培养，长出的即为发生第一次同源交换菌株。
(5)将步骤(4)中第一次同源交换成功的菌株接种于不含有抗生素但添加20μg/mL胸腺嘧啶的LM17液体培养基中，在30℃下静置培养，12小时后转接至新鲜的不含有抗生素但添加20μg/mL胸腺嘧啶的LM17液体培养基中，重复此步骤20次，使菌株发生第二次同源交换。将菌液涂布于不含有抗生素但添加20μg/mL胸腺嘧啶的LM17平板，30℃培养12小时后，挑取长出的单菌落，分别点接于含有和不含有2.5μg/mL红霉素但添加20μg/mL胸腺嘧啶的LM17平板，继续30℃培养。将在无红霉素下生长，而有红霉素下不生长的菌株挑取至新鲜的培养基。30℃培养12小时后提取基因组DNA。利用核苷酸序列为SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.13的引物对对第二次同源交换成功并且红霉素标记丢失的菌株进行PCR检测，扩增出2000bp的目的产物即为胸腺嘧啶合成酶编码基因敲除菌株，命名为嗜热链球菌CH3090。敲除胸腺嘧啶合成酶编码基因后，菌株在LM17培养基中失去生长能力，为保持生长必须在培养基中添加20μg/mL胸腺嘧啶。
PCR检测体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物T-up-F 2μL，引物T-down-R2μL，基因组DNA1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL。
PCR检测反应条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，45℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
将质粒pSLb1转化入嗜热链球菌CH3090中，重组菌株在LM17培养基中恢复生长能力。
对比例4
利用核苷酸序列为SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15的引物对prt-F和prt-R进行PCR扩增长度为4857bp的蛋白酶PrtS编码基因，扩增产物使用NdeI和BamHI双酶切，并将载体pST4040使用NdeI和BamHI双酶切，酶切的产物使用T4 DNA聚合酶进行连接，连接产物预期长度为7.0kb，转化嗜热链球菌CH3080，转化子在LM17培养基上筛选；同时，扩增产物使用BbiII酶切，并将载体pSLb1使用BbiII酶切，酶切的产物使用T4 DNA聚合酶进行连接，连接产物预期长度为9.0kb，转化嗜热链球菌CH3090，转化子在LM17培养基上筛选。结果显示，转化嗜热链球菌CH3080成果获得转化子，将转化子转接于新鲜的液体LM17培养基，42℃培养12小时后，使用蛋白酶活性分析试剂盒测定蛋白酶活性，结果显示嗜热链球菌CH3080转化子的蛋白酶活性提高了2.1倍；而转化嗜热链球菌CH3090的未筛选到转化子。
prt-F:ATACATATGGACGTCATGAAAAAGAAAGAAACTTTC SEQ ID NO.14
prt-R:ATAGGATCCGACGTCTTAGACTTCTTCTTTGTGACG SEQ ID NO.15
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物prt-F 2μL，引物prt-R 2μL，嗜热链球菌JIM8232基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸5min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
综上，本发明涉及一种食品级嗜热链球菌表达系统，涉及的食品级互补筛选标记为嗜热链球菌β-半乳糖苷酶N端第1个至第53个氨基酸编码基因，该基因标记仅有159个核苷酸构成，基因标记分子量小，利于载体容纳较大的外源基因片段，筛选压力只需将培养基中的碳源蔗糖替换为乳糖，在质粒的复制和外源基因的表达过程中无需添加抗生素；由对比例1和对比例2可以得出，本发明涉及的食品级互补筛选标记对于嗜热链球菌具有特异性；由实施例3可以得出，本发明涉及的食品级嗜热链球菌表达系统对异源物的表达效果显著。
SEQUENCE LISTING
<110> 齐鲁工业大学
<120> 一种食品级嗜热链球菌表达载体的构建方法
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggtaccgggc cccccctcga ggataaattc aaccgtaaac g 41
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tttttcagtc atgttcatag 20
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctatgaacat gactgaaaaa ttttctgaag gggagatg 38
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agtggatccc ccgggctgca ggtttcatca ctttgatatc 40
<210> 5
<211> 2223
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
taagggaggc ctttgtcaat tggcaggact ttttctgtat taaaggaggt aaattcatat 60
gagatatctg cagggatcca tgcattctta ctttagttaa ataaaagcct ccagttggag 120
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attgcttgca attttgccga gcggtagcgc tggaaaattt ttgaaaaaaa tttggaattt 480
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ttgattggag ttttttaaat ggtgatttca gaatcgaaaa aaagagttat gatttctctg 780
acaaaagagc aagataaaaa attaacagat atggcgaaac aaaaagattt ttcaaaatct 840
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tatatcatgg ctattaaaaa tactaaagct agaaattttg gatttttatt atatcctgac 1020
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tct 2223
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atacatatga gcaaaggaga agaac 25
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
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<210> 8
<211> 2172
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
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<211> 2223
<212> DNA
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<400> 9
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<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ataggatccg acgtcttaga cttcttcttt gtgacg 36

Claims (10)

1.一种食品级嗜热链球菌表达系统的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)一株食品级宿主嗜热链球菌CH3080的构建方法，包括如下步骤：
①提取嗜热链球菌JIM8232(Streptococcus thermophilus JIM8232)的基因组DNA；
②以步骤①的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物对扩增β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因的上游同源臂，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的引物对扩增β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因的下游同源臂；然后利用重叠拼接PCR的方法，对上游同源臂和下游同源臂进行连接，制得β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因敲除连接臂；
③使用PstI和XhoI对质粒pGhost9进行双酶切，然后利用同源重组酶将步骤②中制得β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因敲除连接臂连接到pGhost9上，将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，挑取验证正确的转化子，提取重组质粒；
④将步骤③得到的重组质粒转化嗜热链球菌JIM8232中，通过转化子培养发生第一次同源交换，利用红霉素进行筛选，然后进行连续传代发生第二次同源交换，筛选红霉素标记丢失的菌株，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4的引物对对红霉素标记丢失的菌株进行检测，扩增出2000bp目的产物的菌体即为β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因敲除菌株；命名为嗜热链球菌CH3080；
(2)合成食品级表达载体pST4040，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.如权利要求1所述食品级嗜热链球菌表达系统的构建方法，其特征在于，所述步骤②中，β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因上游同源臂PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物N-up-F 2μL，引物N-up-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存；
所述步骤②中，β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因下游同源臂PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物N-down-F 2μL，引物N-down-R 2μL，基因组DNA1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存；
所述步骤②中，β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因上游同源臂和下游同源臂连接PCR扩增体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物N-up-F 2μL，引物N-down-R 2μL，上游同源臂1μL，下游同源臂1μL，Ex taq 1μL,双蒸水12μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
3.如权利要求1所述食品级嗜热链球菌表达系统的构建方法，其特征在于，所述步骤③验证转化子的方法：将连接产物转化入感受态大肠杆菌XL-Blue1，涂布于含有250μg/mL红霉素的LB平板，30℃静置培养48小时后，挑取转化子接入新鲜的含有250μg/mL红霉素的LB液体培养基中，30℃摇动培养24小时后，提取质粒，使用PstI和XhoI进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，其中包含一条2000bp的条带，即为正确的转化子。
4.如权利要求1所述食品级嗜热链球菌表达系统的构建方法，其特征在于，所述步骤④中转化子的培养条件，转化子在含有2.5μg/mL红霉素的SM17平板上进行培养，温度为30℃。
5.如权利要求1所述食品级嗜热链球菌表达系统的构建方法，其特征在于，所述步骤④中利用红霉素的筛选条件：重组质粒转化入嗜热链球菌JIM8232中，涂布于含有2.5μg/mL红霉素的SM17平板，30℃静置培养72小时后，挑取转化子于新鲜的含有2.5μg/mL红霉素的SM17液体培养基中，30℃静置培养至OD600为1.0，将培养温度调节成42℃培养，促使质粒与基因组发生第一次同源交换，42℃培养2小时后，涂布于含有2.5μg/mL红霉素的SM17平板，继续在42℃培养，长出的即为发生第一次同源交换菌株。
6.如权利要求1所述食品级嗜热链球菌表达系统的构建方法，其特征在于，所述步骤④中连续传代的培养条件为将第一次同源交换成功的菌株接种于不含有抗生素的SM17液体培养基中，在30℃下静置培养，12小时后转接至新鲜的不含有抗生素的SM17液体培养基中，重复此步骤20次，使菌株发生第二次同源交换。
7.如权利要求6所述食品级嗜热链球菌表达系统的构建方法，其特征在于，所述步骤④中红霉素标记丢失的菌株筛选为将连续传代后的菌液涂布于不含有抗生素的SM17平板，30℃培养12小时后，挑取长出的单菌落，分别点接于添加和不添加2.5μg/mL红霉素的SM17平板，继续30℃培养，选择在无红霉素下生长，而有红霉素下不生长的菌株即为红霉素标记丢失的菌株；
优选的，所述步骤④中SM17培养基每升组分如下：动物蛋白胨2.5g，胰蛋白胨2.5g，大豆蛋白胨5g，牛肉提取物5g，酵母提取物2.5g，抗坏血酸0.5g，硫酸镁0.25g，beta-甘油磷酸钠五水合物19g，蔗糖20g，余量水；
优选的，所述步骤④中，PCR检测体系为：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物N-up-F 2μL，引物N-down-R 2μL，基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
PCR检测反应条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，45℃退火30s，72℃延伸2min，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
8.权利要求1构建的一种食品级嗜热链球菌表达系统，其特征在于，包含食品级宿主嗜热链球菌宿主CH3080和食品级表达载体pST4040，所述食品级表达载体pST4040转化入食品级宿主嗜热链球菌宿主CH3080。
9.权利要求8所述食品级嗜热链球菌表达系统在生产异源物中的应用。
10.权利要求9所述食品级嗜热链球菌表达系统在生产绿色荧光蛋白中的应用。
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