CN113817760B - 一种穿梭型食品级表达载体及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种穿梭型食品级表达载体及其构建方法与应用。本发明中的穿梭型食品级表达载体，包含大肠杆菌β‑半乳糖苷酶α‑肽的编码基因和嗜热链球菌β‑半乳糖苷酶α‑肽的编码基因，或者，包含大肠杆菌β‑半乳糖苷酶α‑肽的编码基因和植物乳杆菌β‑半乳糖苷酶的lacM基因。本发明构建的穿梭型食品级表达载体，利用双筛选机制，实现在大肠杆菌DH5α和食品级宿主菌中的双重筛选，提高转化效率和正确率。本发明的穿梭型食品级表达载体，可以先在β‑半乳糖苷酶N端缺失的大肠杆菌DH5α中筛选，从而可以使得在大肠杆菌DH5α中构建完成重组的食品级表达载体并富集，提取质粒转化食品级宿主菌，极大的提高转化效率。

Description

一种穿梭型食品级表达载体及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种穿梭型食品级表达载体及其构建方法与应用。
背景技术
乳酸菌是一类能够发酵碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性菌的通称，包括乳球菌、乳杆菌、双歧杆菌和链球菌等。他们被广泛应用于食品发酵行业，如牛奶中。此外，乳酸菌菌株是用作益生菌的最常见微生物。乳酸菌通常被认为是安全的，而基因工程技术在改善现有菌株或开发新菌株方面的应用是活跃的研究领域。基因技术允许通过引入新基因或修饰其代谢功能对菌株进行修饰。这些变化可以改善食品技术并促进人体健康。传统上，抗生素抗性基因通常被用作实验室研究中载体的选择标记。然而，出于安全考虑，基于抗生素抗性的基因的转移，在食品或临床应用中不能采取这种方法。
嗜热链球菌是公认安全的食品级微生物，它与德式乳杆菌保加利亚亚种一起生产酸奶已有数千年的历史。嗜热链球菌产酸速度快，极大缩短了发酵乳的凝乳时间，在食品行业具有很大的商业价值。此外，嗜热链球菌也被认为是一种益生菌，进入人体后可发挥积极作用。嗜热链球菌也是潜在的细胞工厂之一。虽然嗜热链球菌可以代谢许多碳水化合物(蔗糖，葡萄糖，果糖)，但乳糖仍然是其代谢底物的首选。通过使用嗜热链球菌的不同菌株及其基因组序列，已经广泛地研究了乳糖的运输、代谢和调节。在嗜热链球菌中，乳糖通过乳糖透过酶被转运到细胞内，胞内的β-半乳糖苷酶再将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖，葡萄糖经EMP途径最终转化为丙酮酸，通过乳酸脱氢酶将其转化为乳酸，而半乳糖通常被嗜热链球菌弱代谢，一般由乳糖透过酶将半乳糖释放到细胞外介质中。因此，β-半乳糖苷酶对嗜热链球菌的生长代谢至关重要。
植物乳杆菌是一种重要的益生菌，能在肠道环境中定植，在减轻腹泻、降低胆固醇、改善肠易激综合征等方面发挥重要作用。某些具有优良性状的植物乳杆菌菌种已被用于酸奶、奶酪和其他乳制品的生产。同时，由于其高耐氧性和健壮性，植物乳杆菌已成为生产高附加值化合物的潜在食品级底盘细胞。植物乳杆菌被广泛应用的原因之一是其代谢底物的多样性，如蔗糖、乳糖和低聚糖等。其中，乳糖的有效利用使植物乳杆菌具有发酵乳制品或利用工业乳清废物的能力。
β-半乳糖苷酶是一种重要的工业酶。迄今为止，已经在不同的微生物中鉴定出了许多β-半乳糖苷酶并对其进行了表征。β-半乳糖苷酶家族可以分为LacZ型和异源二聚体LacLM型。其中，嗜热链球菌来源的β-半乳糖苷酶属于LacZ型，而植物乳杆菌来源的β-半乳糖苷酶属于LacLM型。目前研究最深入的β-半乳糖苷酶来自大肠杆菌，其具有的特性之一是存在α-互补现象。α-互补是指lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。大肠杆菌的乳糖lac操纵子中的lacZ基因编码β-半乳糖苷酶，如果lacZ基因发生突变，则不能合成有活性的β-半乳糖苷酶。例如，lacZ△M15基因是缺失了编码β-半乳糖苷酶中第11-41个氨基酸的lacZ基因，无酶学活性。对于只编码N-端140个氨基酸的lacZ基因(称为lacZ')，其产物也没有酶学活性。但这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复β-半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。
中国专利文献CN111363714A(申请号202010266247.3)公开了一种食品级嗜热链球菌表达载体的构建方法，所述食品级嗜热链球菌表达系统包含食品级宿主嗜热链球菌CH3080、食品级表达载体pST4040；所述食品级宿主嗜热链球菌CH3080是采用同源重组技术敲除嗜热链球菌基因组上的β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因而获得，丧失利用乳糖的能力；食品级表达载体pST4040包含来自于嗜热链球菌的β-半乳糖苷酶N端第1个至第53个氨基酸编码基因作为互补筛选标记。使用此食品级表达系统，在表达外源蛋白时，需将外源基因片段与载体进行连接，然后将连接产物转化到嗜热链球菌CH3080中，但是嗜热链球菌的转化效率较低。中国专利文献CN110846268A(申请号201911223430.9)公开了一种食品级植物乳杆菌表达系统及其在酸奶制备中的应用，所述食品级植物乳杆菌表达系统包含食品级宿主植物乳杆菌NZ1210、食品级表达载体pLP4180；所述食品级宿主植物乳杆菌NZ1210是采用同源重组技术敲除植物乳杆菌WCFS1基因组上的lacA和lacM基因而获得，丧失利用乳糖的能力；所述食品级表达载体pLP4180包含以下元件：来自于质粒pNZ8149的复制元件，来源于植物乳杆菌WCFS1菌株的PldhL启动子和TldhL终止子，以及来源于植物乳杆菌WCFS1的lacM基因；将合成的表达载体pLP4180转化入植物乳杆菌NZ1210后，其在MRS-乳糖培养基中的生长情况可以得到恢复。但是使用此食品级表达系统时，植物乳杆菌的转化效率也较低。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种穿梭型食品级表达载体及其构建方法与应用，本发明构建的穿梭型食品级表达载体，可以在大肠杆菌DH5α和食品级宿主菌中进行复制与扩增，从而可以将插入目的基因的穿梭型食品级表达载体在大肠杆菌DH5α中构建好，再提取转化食品级宿主菌，既利用了食品级的筛选方式，又提高了转化效率。
本发明的技术方案如下：
一种穿梭型食品级表达载体，包含大肠杆菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因和嗜热链球菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因，或者，包含大肠杆菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因和植物乳杆菌β-半乳糖苷酶的lacM基因。
根据本发明优选的，所述包含大肠杆菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因和嗜热链球菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因的食品级表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
根据本发明优选的，所述包含大肠杆菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因和植物乳杆菌β-半乳糖苷酶的lacM基因的食品级表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
根据本发明优选的，所述大肠杆菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因是大肠杆菌β-半乳糖苷酶第1个至第60个氨基酸所对应的编码基因，所述嗜热链球菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因是嗜热链球菌β-半乳糖苷酶第1个至第53个氨基酸所对应的编码基因。
根据本发明优选的，所述包含大肠杆菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因和嗜热链球菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因的食品级表达载体中还包括来自于质粒pMG36e的复制元件和来源于嗜热链球菌的Pldh启动子和Tldh终止子。
根据本发明优选的，所述包含大肠杆菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因和植物乳杆菌β-半乳糖苷酶的lacM基因的食品级表达载体中还包括来自于质粒pNZ8149的复制元件和来源于植物乳杆菌的PldhL启动子和TldhL终止子。
穿梭质粒是指一类具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。本发明的穿梭型食品级表达载体可以在大肠杆菌和嗜热链球菌/植物乳杆菌中复制和表达。
上述一种穿梭型食品级表达载体的构建方法，包括如下步骤：
(1)以大肠杆菌Nissle1917基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物经PCR扩增获得PCR产物，所得PCR产物为β-半乳糖苷酶N端第1个至第60个氨基酸编码基因及其启动子Plac；
其中，引物序列如下：
Eα-F：5’-GCGCAACGCAATTAATGTG-3’，SEQ ID NO.1，
Eα-R：6’-TTAGCGCCATTCGCCATTCAG-3，SEQ ID NO.2；
(2)以食品级表达载体pST4040为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4的引物经PCR扩增线性化pST4040载体；将线性化pST4040载体与步骤(1)的PCR产物使用体外同源重组酶相互连接得到重组连接产物；
或者，以食品级表达载体pLP4180为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQID NO.6的引物经PCR扩增线性化pLP4180载体；将线性化pLP4180载体与步骤(1)的PCR产物使用体外同源重组酶相互连接得到重组连接产物；
其中，各引物序列如下：
pST4040-F：5’-GAATGGCGAATGGCGCTAACCATGTATTAGTAAAATTTTAG-3’，SEQ IDNO.3，
pST4040-R：5’-CACATTAATTGCGTTGCGCTCGACTTTCGTCAGGGG-3’，SEQ ID NO.4；
pLP4180-F：5’-GAATGGCGAATGGCGCTAAATAAGACCTTTAGAACAAG-3’，SEQ ID NO.5，
pLP4180-R：5’-CACATTAATTGCGTTGCGCTCGACTTTCGTCAGGGGG-3’，SEQ ID NO.6；
(3)将步骤(2)的重组连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，转化子经培养后获得阳性转化子，提取质粒获得穿梭型食品级表达载体。其中，嗜热链球菌穿梭型食品级表达载体记为pSEα，植物乳杆菌穿梭型食品级表达载体记为pLEα。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述PCR扩增反应体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物Eα-F 2μL，引物Eα-R 2μL，大肠杆菌Nissle1917基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
反应条件为：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述PCR扩增反应体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，上游引物2μL，下游引物2μL，表达载体1μL，Extaq 1μL,双蒸水13μL；
反应条件为：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min30s，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述食品级表达载体pST4040包含以下元件：来自于质粒pMG36e的复制元件，来源于嗜热链球菌JIM8232菌株的Pldh启动子和Tldh终止子，以及来源于嗜热链球菌JIM8232的β-半乳糖苷酶N端第1个至第53个氨基酸编码基因。可按照专利文献CN111363714A制备得到。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述食品级表达载体pLP4180包含以下元件：来自于质粒pNZ8149的复制元件，来源于植物乳杆菌WCFS1菌株的PldhL启动子和TldhL终止子，以及来源于植物乳杆菌WCFS1的lacM基因。可按照专利文献CN110846268A制备得到。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述大肠杆菌DH5α缺失β-半乳糖苷酶N端第11个至第41个氨基酸编码基因，无β-半乳糖苷酶活性。为现有市售菌株。
根据本发明优选的，步骤(3)中所述转化子先涂布于M9乳糖固体培养基中培养，培养出的菌落再转接至添加0.1％酪蛋白氨基酸的M9乳糖液体培养基中培养。
进一步优选的，所述M9乳糖液体培养基，每升组分如下：磷酸氢二钠6.8g，磷酸二氢钾3.0g，氯化钠0.5g，氯化铵1.0g，硫酸镁2mM，氯化钙0.1mM，乳糖10g，余量水；添加琼脂糖15g即为M9乳糖固体培养基。
一种食品级嗜热链球菌表达系统，包括上述穿梭型食品级表达载体、大肠杆菌DH5α和食品级宿主嗜热链球菌CH3080，所述穿梭型食品级表达载体为包含大肠杆菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因和嗜热链球菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因的食品级表达载体。
根据本发明优选的，所述食品级宿主嗜热链球菌CH3080为敲除β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因的嗜热链球菌JIM8232，可按照专利文献CN111363714A制备得到。
根据本发明优选的，所述大肠杆菌DH5α缺失β-半乳糖苷酶N端第11个至第41个氨基酸编码基因，无β-半乳糖苷酶活性。为现有市售菌株。
一种植物乳杆菌表达系统，包括上述穿梭型食品级表达载体、大肠杆菌DH5α和食品级宿主植物乳杆菌NZ1210，所述穿梭型食品级表达载体为包含大肠杆菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因和植物乳杆菌β-半乳糖苷酶的lacM基因的食品级表达载体。
根据本发明优选的，所述食品级宿主植物乳杆菌NZ1210是敲除β-半乳糖苷酶的lacA和lacM基因的植物乳杆菌WCFS1，可按照专利文献CN110846268A制备得到。
根据本发明优选的，所述大肠杆菌DH5α缺失β-半乳糖苷酶N端第11个至第41个氨基酸编码基因，无β-半乳糖苷酶活性。为现有市售菌株。
上述食品级嗜热链球菌表达系统/植物乳杆菌表达系统在生产异源物中的应用。
根据本发明优选的，所述应用是将异源物的编码基因插入到穿梭型食品级表达载体pSEα或pLEα中，再转化入大肠杆菌DH5α中，筛选并富集重组质粒，再转化入相应的食品级宿主菌中进行表达。
本发明的技术特点：
本发明的包含大肠杆菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因和嗜热链球菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因的穿梭型食品级表达载体中，嗜热链球菌JIM8232的α-肽，即β-半乳糖苷酶N端第1个至第53个氨基酸多肽，其编码基因是食品级宿主嗜热链球菌CH3080和穿梭型食品级表达载体pSEα完成互补筛选的标记；食品级宿主嗜热链球菌CH3080是采用同源重组技术敲除嗜热链球菌JIM8232基因组上的β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因而获得，丧失乳糖利用的能力，完成互补筛选后，嗜热链球菌CH3080重新获得利用乳糖的能力。大肠杆菌Nissle1917的β-半乳糖苷酶N端第1个至第60个氨基酸编码基因是大肠杆菌DH5α和食品级表达载体完成互补筛选的标记；大肠杆菌DH5α的基因组上缺失β-半乳糖苷酶N端第11个至第41个氨基酸编码基因，在M9乳糖培养基中丧失生长能力，完成互补筛选后，大肠杆菌DH5α重新获得在M9乳糖培养基中的生长能力。
本发明的包含大肠杆菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因和植物乳杆菌β-半乳糖苷酶的lacM基因的穿梭型食品级表达载体中，植物乳杆菌WCFS1的lacM基因是食品级宿主植物乳杆菌NZ1210和穿梭型食品级表达载体pLEα完成互补筛选的标记，食品级宿主植物乳杆菌NZ1210是采用同源重组技术敲除植物乳杆菌WCFS1基因组上的lacA和lacM基因而获得，丧失乳糖利用的能力，完成互补筛选后，植物乳杆菌NZ1210重新获得利用乳糖的能力；大肠杆菌Nissle1917的β-半乳糖苷酶N端第1个至第60个氨基酸编码基因是大肠杆菌DH5α和食品级表达载体完成互补筛选的标记，大肠杆菌DH5α的基因组上缺失β-半乳糖苷酶N端第11个至第41个氨基酸编码基因，在M9乳糖培养基中丧失生长能力，完成互补筛选后，大肠杆菌DH5α重新获得在M9乳糖培养基中的生长能力。
本发明的有益效果：
本发明构建了一种穿梭型食品级表达载体，利用双筛选机制，实现在大肠杆菌DH5α和食品级宿主菌中的双重筛选，提高转化效率和正确率。本发明的穿梭型食品级表达载体，可以先在β-半乳糖苷酶N端缺失的大肠杆菌DH5α中筛选，从而可以使得在大肠杆菌DH5α中构建完成重组的食品级表达载体并富集，提取质粒转化食品级宿主菌，极大的提高转化效率。另外，本发明还发现经过大肠杆菌DH5α第一重筛选后得到的阳性转化子，在筛选培养基M9乳糖培养基中的生长速度缓慢，不利于重组质粒的富集，将筛选出的大肠杆菌阳性转化子转接至添加0.1％酪蛋白氨基酸的M9乳糖液体培养基中培养，既能保持穿梭型食品级表达载体的双筛选功能，也能加快阳性转化子生物量的积累。
附图说明
图1为穿梭型食品级表达载体pSEα结构示意图，图中，repA和repC为复制元件，Pldh为启动子，Terminator为终止子，MCS为多克隆位点，以及双α-肽筛选标记。
图2为穿梭型食品级表达载体pLEα结构示意图，图中，repA和repC为复制元件，PldhL为启动子，Terminator为终止子，MCS为多克隆位点，以及筛选标记α肽和lacM。
图3为不同酪蛋白氨基酸浓度下大肠杆菌DH5α/pSEα和大肠杆菌DH5α生物量柱状图；图中无填充柱状图代表大肠杆菌DH5α/pSEα，斜线填充柱状图代表大肠杆菌DH5α。
图4为绿色荧光蛋白表达，图中，左为对照菌，右为转化绿色荧光蛋白的嗜热链球菌宿主菌。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细介绍，但保护范围不限于此。
实施例中未详加说明的均按本领域现有技术。
本发明实验中使用和涉及到的细菌菌株、质粒、主要材料及试剂：
大肠杆菌Nissle1917和DH5α菌株：购自北京全式金生物技术有限公司，普通市售已知菌株；其中大肠杆菌DH5α缺失β-半乳糖苷酶N端第11个至第41个氨基酸编码基因；
质粒pTVP1GFP：包含绿色荧光蛋白基因，购自BioVector NTCC质粒载体菌种细胞蛋白抗体基因保藏中心，普通市售产品；
食品级宿主嗜热链球菌CH3080和食品级表达载体pST4040，见专利CN111363714A；
食品级宿主植物乳杆菌NZ1210和食品级表达载体pLP4180，见专利CN110846268A；
细菌基因组提取试剂盒：购自北京天根生物科技有限公司；
柱式质粒DNA小量抽提试剂盒：购自南京诺韦赞生物科技有限公司；
蛋白酶活性分析试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；
琼脂糖、核酸染料等购自上海生工生物工程有限公司；
Ex taq及rtaq等聚合酶、体外重组酶、限制性内切酶(BamHI)、T4DNA连接酶，DNAMarker，DNA凝胶回收试剂盒均购自北京宝日医生物技术有限公司提供；
实施例中所述的LB液体培养基，每升组分如下：
胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，pH 7.0，余量水；添加琼脂粉20g，即为LB固体培养基；
实施例中所述的M9乳糖液体培养基，每升组分如下：
磷酸氢二钠6.8g，磷酸二氢钾3.0g，氯化钠0.5g，氯化铵1.0g，硫酸镁2mM，氯化钙0.1mM，葡萄糖10g，余量水；添加琼脂粉15g即为M9乳糖固体培养基。
添加1g/L酪蛋白氨基酸的M9乳糖液体培养基，每升组分如下：
磷酸氢二钠6.8g，磷酸二氢钾3.0g，氯化钠0.5g，氯化铵1.0g，硫酸镁2mM，氯化钙0.1mM，葡萄糖10g，酪蛋白氨基酸1g，余量水。
实施例中所述的LM17液体培养基，每升组分如下：
动物蛋白胨2.5g，胰蛋白胨2.5g，大豆蛋白胨5g，牛肉提取物5g，酵母提取物2.5g，抗坏血酸0.5g，硫酸镁0.25g，β-甘油磷酸钠五水合物19g，乳糖20g，余量水。
实施例中所述的MRS-乳糖液体培养基，每升组分如下：
蛋白胨10.0g，牛肉浸粉5.0g，酵母浸粉4.0g，乳糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸三铵2.0g，醋酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温80 1.0mL，余量水；添加琼脂粉20g，即为MRS-乳糖固体培养基。
实施例1：嗜热链球菌的穿梭型食品级表达载体pSEα的构建
(1)以大肠杆菌Nissle1917基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物经PCR扩增获得含有β-半乳糖苷酶N端第1个至第60个氨基酸编码基因及其启动子Plac的PCR产物；
其中，引物序列如下：
Eα-F：5’-GCGCAACGCAATTAATGTG-3’，SEQ ID NO.1，
Eα-R：5’-TTAGCGCCATTCGCCATTCAG-3’，SEQ ID NO.2，
PCR扩增反应体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物Eα-F 2μL，引物Eα-R 2μL，大肠杆菌Nissle1917基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
反应条件为：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存；
(2)以食品级表达载体pST4040为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4的引物经PCR扩增线性化pST4040载体；将性化pST4040载体和步骤(1)的PCR产物使用体外同源重组酶相互连接得到重组连接产物；
其中，引物序列如下：
pST4040-F：5’-GAATGGCGAATGGCGCTAACCATGTATTAGTAAAATTTTAG-3’，SEQ IDNO.3，
pST4040-R：5’-CACATTAATTGCGTTGCGCTCGACTTTCGTCAGGGG-3’，SEQ ID NO.4；
PCR扩增反应体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物pST4040-F 2μL，引物pST4040-R 2μL，pST4040载体1μL，Ex taq 1μL，双蒸水13μL；
反应条件为：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min30s，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存；
(3)将步骤(2)的重组连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，将转化子涂布于M9乳糖固体培养基中培养，培养后获得的活菌株即为阳性转化子，提取质粒得穿梭型食品级表达载体，命名为pSEα，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，表达载体的示意图如图1所示。
实施例2：植物乳杆菌的穿梭型食品级表达载体pLEα的构建
(1)以大肠杆菌Nissle1917基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物经PCR扩增获得含有β-半乳糖苷酶N端第1个至第60个氨基酸编码基因及其启动子Plac的PCR产物；
其中，引物序列如下：
Eα-F：5’-GCGCAACGCAATTAATGTG-3’，SEQ ID NO.1，
Eα-R：5’-TTAGCGCCATTCGCCATTCAG-3’，SEQ ID NO.2，
PCR扩增反应体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物Eα-F 2μL，引物Eα-R 2μL，大肠杆菌Nissle1917基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
反应条件为：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存；
(2)以合成的食品级表达载体pLP4180为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的引物经PCR扩增线性化pLP4180载体；将性化pLP4180载体与步骤(1)的PCR产物使用体外同源重组酶相互连接得到重组连接产物；
其中，引物序列如下：
pLP4180-F：5’-GAATGGCGAATGGCGCTAAATAAGACCTTTAGAACAAG-3’，SEQ ID NO.5，
pLP4180-R：5’-CACATTAATTGCGTTGCGCTCGACTTTCGTCAGGGGG-3’，SEQ ID NO.6；
PCR扩增反应体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物pLP4180-F 2μL，引物pLP4180-R 2μL，pLP4180载体1μL，Ex taq 1μL，双蒸水13μL；
反应条件为：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min30s，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存；
(3)将步骤(2)的重组连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，将转化子涂布于M9乳糖固体培养基中培养，培养后获得的活菌株即为阳性转化子，提取质粒得穿梭型食品级表达载体，命名为pLEα，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，表达载体的示意图如图2所示。
实施例3：重组大肠杆菌培养基的优化
在对实施例1和实施例2重组大肠杆菌阳性转化子培养时，发现转化子在M9乳糖培养基中的生物量较低，生长较慢，因此尝试向M9乳糖培养基中添加不同浓度的酪蛋白氨基酸，来提高菌体量，从而获得大量质粒。
将实施例1中得到的重组大肠杆菌阳性转化子和大肠杆菌DH5α分别转移到添加了不同浓度(0.25g/L,0.5g/L,1g/L,2g/L,4g/L,6g/L,8g/L)酪蛋白氨基酸的M9乳糖液体培养基中，培养12h后，使用分光光度计(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)通过600nm(OD600)的光密度表征菌株的生长。
结果如图3所示，随着酪蛋白氨基酸添加量的增多，阳性转化子和大肠杆菌DH5α的生物量都逐渐提高，但当其添加量为2g/L以上时，两者的OD600值相差不大，表明此时大肠杆菌阳性转化子回补的α肽不再发挥作用，阳性转化子不再以乳糖为底物进行菌体生长，而是以酪蛋白氨基酸为底物进行菌体生长，大肠杆菌α-肽失去其筛选作用，阳性转化子会停止复制表达该α-肽编码基因，甚至会将该α-肽编码基因丢失，不利于穿梭型食品级表达载体的构建与富集。因此，后续实验中在M9乳糖培养基中筛选出的大肠杆菌阳性转化子再转接至添加0.1％酪蛋白氨基酸的M9乳糖液体培养基中培养，既能保持穿梭型食品级表达载体的双筛选功能，也能加快阳性转化子生物量的积累。
实施例4：嗜热链球菌中绿色荧光蛋白的表达
利用核苷酸序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的引物对gfp-F和gfp-R对质粒pTVP1GFP进行PCR扩增，扩增产物使用NdeI和BamHI双酶切，并将实施例1构建的穿梭型食品级表达载体pSEα使用NdeI和BamHI双酶切，酶切的产物使用T4 DNA聚合酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，先涂布于M9乳糖固体培养基中培养，培养出的菌落再转接至添加0.1％酪蛋白氨基酸的M9乳糖液体培养基中培养，筛选的转化子提取质粒进行验证，验证正确的质粒转化嗜热链球菌CH3080，转化子在LM17培养基上筛选，筛选的转化子提取质粒进行验证，验证正确的转化子转接于新鲜的LM17液体培养基，42℃培养12小时后，观察绿色荧光蛋白在嗜热链球菌中的表达量如图4所示，绿色荧光蛋白在嗜热链球菌CH3080成功表达。此外，测定其转化效率为3.7×103CFU/μg DNA。
其中，引物序列如下：
gfp-F:5’-ATACATATGAGCAAAGGAGAAGAAC-3’，SEQ ID NO.9，
gfp-R:5’-ATAGGATCCTTAGTATAGCTCATCCATG-3’，SEQ ID NO.10，
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物gfp-F 2μL，引物gfp-R 2μL，质粒pTVP1GFP 1μL，Ex taq 1μL，双蒸水13μL；
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
实施例5：植物乳杆菌中绿色荧光蛋白的表达
利用核苷酸序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的引物对gfp-F和gfp-R对质粒pTVP1GFP进行PCR扩增，扩增产物使用NdeI和BamHI双酶切，并将实施例2构建的穿梭型食品级表达载体pLEα使用NdeI和BamHI双酶切，酶切的产物使用T4 DNA聚合酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，先涂布于M9乳糖固体培养基中培养，培养出的菌落再转接至添加0.1％酪蛋白氨基酸的M9乳糖液体培养基中培养，筛选的转化子提取质粒进行验证，验证正确的质粒转化植物乳杆菌NZ1210，转化子在MRS-乳糖培养基上筛选，筛选的转化子提取质粒进行验证，验证正确的转化子转接于新鲜的MRS-乳糖液体培养基，37℃培养24小时后，观察绿色荧光蛋白在植物乳杆菌中的表达量，绿色荧光蛋白在植物乳杆菌NZ1210成功表达。此外，测定其转化效率为2.1×104CFU/μg DNA。
其中，引物序列如下：
gfp-F:5’-ATACATATGAGCAAAGGAGAAGAAC-3’，SEQ ID NO.9，
gfp-R:5’-ATAGGATCCTTAGTATAGCTCATCCATG-3’，SEQ ID NO.10，
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物gfp-F 2μL，引物gfp-R 2μL，质粒pTVP1GFP 1μL，Ex taq 1μL，双蒸水13μL；
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
对比例1：采用专利CN111363714A表达绿色荧光蛋白
利用核苷酸序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的引物对gfp-F和gfp-R对质粒pTVP1GFP进行PCR扩增，扩增产物使用NdeI和BamHI双酶切，并将表达载体pST4040使用NdeI和BamHI双酶切，酶切的产物使用T4 DNA聚合酶进行连接，连接产物直接转化嗜热链球菌CH3080，转化子在LM17培养基上筛选，筛选的转化子提取质粒进行验证。测定其转化效率仅为25CFU/μg DNA。
其中，引物序列如下：
gfp-F:5’-ATACATATGAGCAAAGGAGAAGAAC-3’，SEQ ID NO.9，
gfp-R:5’-ATAGGATCCTTAGTATAGCTCATCCATG-3’，SEQ ID NO.10，
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物gfp-F 2μL，引物gfp-R 2μL，质粒pTVP1GFP 1μL，Ex taq 1μL，双蒸水13μL；
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
对比例2：采用专利CN110846268A表达绿色荧光蛋白
利用核苷酸序列为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的引物对gfp-F和gfp-R对质粒pTVP1GFP进行PCR扩增，扩增产物使用NdeI和BamHI双酶切，并将表达载体pLP4180使用NdeI和BamHI双酶切，酶切的产物使用T4 DNA聚合酶进行连接，连接产物直接转化植物乳杆菌NZ1210，转化子在MRS-乳糖培养基上筛选，筛选的转化子提取质粒进行验证。测定其转化效率仅为83CFU/μg DNA。
其中，引物序列如下：
gfp-F:5’-ATACATATGAGCAAAGGAGAAGAAC-3’，SEQ ID NO.9，
gfp-R:5’-ATAGGATCCTTAGTATAGCTCATCCATG-3’，SEQ ID NO.10，
PCR扩增体系为：Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物gfp-F 2μL，引物gfp-R 2μL，质粒pTVP1GFP 1μL，Ex taq 1μL，双蒸水13μL；
PCR扩增条件为：95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
SEQUENCE LISTING
<110> 齐鲁工业大学
<120> 一种穿梭型食品级表达载体及其构建方法与应用
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcgcaacgca attaatgtg 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttagcgccat tcgccattca g 21
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gaatggcgaa tggcgctaac catgtattag taaaatttta g 41
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cacattaatt gcgttgcgct cgactttcgt cagggg 36
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gaatggcgaa tggcgctaaa taagaccttt agaacaag 38
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cacattaatt gcgttgcgct cgactttcgt caggggg 37
<210> 7
<211> 2528
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
taagggaggc ctttgtcaat tggcaggact ttttctgtat taaaggaggt aaattcatat 60
gagatatctg cagggatcca tgcattctta ctttagttaa ataaaagcct ccagttggag 120
gtttttttag tattttaaaa agaaaaacag ctaattcata taactagctg tttaataaaa 180
tcgtttctga gacgttttag cgtttatttc gtttagttat cggcataatc gttaaaacag 240
gcgttatcgt agcgtaaaag cccttgagcg tagcgtggct ttgcagcgaa gatgttgtct 300
gttagattat gaaagccgat gactgaatga aataataagc gcagcgtcct tctatttcgg 360
ttggaggagg ctcaagggag tttgagggaa tgaaattccc tcatgggttt gattttaaaa 420
attgcttgca attttgccga gcggtagcgc tggaaaattt ttgaaaaaaa tttggaattt 480
ggaaaaaaat ggggggaaag gaagcgaatt ttgcttccgt actacgaccc cccattaagt 540
gccgagtgcc aatttttgtg ccaaaaacgc tctatcccaa ctggctcaag ggtttgaggg 600
gtttttcaat cgccaacgaa tcgccaacgt tttcgccaac gttttttata aatctatatt 660
taagtagctt tatttttgtt tttatgatta caaagtgata cactaatttt ataaaattat 720
ttgattggag ttttttaaat ggtgatttca gaatcgaaaa aaagagttat gatttctctg 780
acaaaagagc aagataaaaa attaacagat atggcgaaac aaaaagattt ttcaaaatct 840
gcggttgcgg cgttagctat agaagaatat gcaagaaagg aatcagaaca aaaaaaataa 900
gcgaaagctc gcgtttttag aaggatacga gttttcgcta cttgtttttg ataaggtaat 960
tatatcatgg ctattaaaaa tactaaagct agaaattttg gatttttatt atatcctgac 1020
tcaattccta atgattggaa agaaaaatta gagagtttgg gcgtatctat ggctgtcagt 1080
cctttacacg atatggacga aaaaaaagat aaagatacat ggaatagtag tgatgttata 1140
cgaaatggaa agcactataa aaaaccacac tatcacgtta tatatattgc acgaaatcct 1200
gtaacaatag aaagcgttag gaacaagatt aagcgaaaat tggggaatag ttcagttgct 1260
catgttgaga tacttgatta tatcaaaggt tcttatgaat atttgactca tgaatcaaag 1320
gacgctattg ctaagaataa acatatatac gacaaaaaag atattttgaa cattaatgat 1380
tttgatattg accgctatat aacacttgat gaaagccaaa aaagagaatt gaagaattta 1440
cttttagata tagtggatga ctataatttg gtaaatacaa aagatttaat ggcttttatt 1500
cgccttaggg gagcggagtt tggaatttta aatacgaatg atgtaaaaga tattgtttca 1560
acaaactcta gcgcctttag attatggttt gagggcaatt atcagtgtgg atatagagca 1620
agttatgcaa aggttcttga tgctgaaacg ggggaaataa aatgacaaac aaagaaaaag 1680
agttatttgc tgaaaatgag gaattaaaaa aagaaattaa ggacttaaaa gagcgtattg 1740
aaagatacag agaaatggaa gttgaattaa gtacaacaat agatttattg agaggaggga 1800
ttattgaata aataaaagcc cccctgacga aagtcgagcg caacgcaatt aatgtgagtt 1860
agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg 1920
aaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacggattca 1980
ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc 2040
cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc 2100
ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgct aaccatgtat tagtaaaatt 2160
ttagtaaaaa acactgaaat tattgactgc ataaaccaat tttcatataa tgtaaacgta 2220
ttcaaataat aggaggtttc cgaaatgaac atgactgaaa aaattcaaac ttatttaaac 2280
gatccaaaga ttgttagcgt taatactgtt gatgctcact cagatcataa gtattttgaa 2340
tctcttgaag aattttctga aggggagatg aagttaagac aatctcttaa tggaaaatgg 2400
aaataagtag ttattaagaa tctagttgta cattatttga taattataaa agagaagctt 2460
tggaggcttc tcttttcatg ttttaaagga gattaaatca ttagtgtgtt agtatcttcc 2520
aaaaatct 2528
<210> 8
<211> 3810
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aattcagcaa tttagccttg atttacaatc ataagcgtgt gtaataagaa tttactaaca 60
aaaattcaat tttttgaata atatctgttt acaaatcaga ttaggctata tataatattt 120
aaggattctc agtgatgggt gcgcgatttg gccttttcac taggatgtag tataatacta 180
actaaagaat tgttgagacc attttggcct cgacgttatt cttgcgaaaa tcacaggagg 240
tttcacatat gagatatctg cagggatcca tgcataccat cgatctcgag tgcatatttt 300
cggcaatctt ctcaatgaga tgctcttcag catgttcaat gatgtcgatt ttttattaaa 360
acgtctcaaa atcgtttctg agacgtttta gcgtttattt cgtttagtta tcggcataat 420
cgttaaaaca ggcgttatcg tagcgtaaaa gcccttgagc gtagcgtgct ttgcagcgaa 480
gatgttgtct gttagattat gaaagccgat gactgaatga aataataagc gcagcgtcct 540
tctatttcgg ttggaggagg ctcaagggag tttgagggaa taaatcgttt ctgagacgtt 600
ttagcgttta tttcgtttag ttatcggcat aatcgttaaa acaggcgtta tcgtagcgta 660
aaagcccttg agcgtagcgt ggctttgcag cgaagatgtt gtctgttaga ttatgaaagc 720
cgatgactga atgaaataat aagcgcagcg tccttctatt tcggttggag gaggctcaag 780
ggagtttgag ggaatgaaat tccctcatgg gtttgatttt aaaaattgct tgcaattttg 840
ccgagcggta gcgctggaaa atttttgaaa aaaatttgga atttggaaaa aaatgggggg 900
aaaggaagcg aattttgctt ccgtactacg accccccatt aagtgccgag tgccaatttt 960
tgtgccaaaa acgctctatc ccaactggct caagggtttg aggggttttt caatcgccaa 1020
cgaatcgcca acgttttcgc caacgttttt tataaatcta tatttaagta gctttatttt 1080
tgtttttatg attacaaagt gatacactaa ttttataaaa ttatttgatt ggagtttttt 1140
aaatggtgat ttcagaatcg aaaaaaagag ttatgatttc tctgacaaaa gagcaagata 1200
aaaaattaac agatatggcg aaacaaaaag atttttcaaa atctgcggtt gcggcgttag 1260
ctatagaaga atatgcaaga aaggaatcag aacaaaaaaa ataagcgaaa gctcgcgttt 1320
ttagaaggat acgagttttc gctacttgtt tttgataagg taattatatc atggctatta 1380
aaaatactaa agctagaaat tttggatttt tattatatcc tgactcaatt cctaatgatt 1440
ggaaagaaaa attagagagt ttgggcgtat ctatggctgt cagtccttta cacgatatgg 1500
acgaaaaaaa agataaagat acatggaata gtagtgatgt tatacgaaat ggaaagcact 1560
ataaaaaacc acactatcac gttatatata ttgcacgaaa tcctgtaaca atagaaagcg 1620
ttaggaacaa gattaagcga aaattgggga atagttcagt tgctcatgtt gagatacttg 1680
attatatcaa aggttcatat gaatatttga ctcatgaatc aaaggacgct attgctaaga 1740
ataaacatat atacgacaaa aaagatattt tgaacattaa tgattttgat attgaccgct 1800
atataacact tgatgaaagc caaaaaagag aattgaagaa tttactttta gatatagtgg 1860
atgactataa tttggtaaat acaaaagatt taatggcttt tattcgcctt aggggagcgg 1920
agtttggaat tttaaatacg aatgatgtaa aagatattgt ttcaacaaac tctagcgcct 1980
ttagattatg gtttgagggc aattatcagt gtggatatag agcaagttat gcaaaggttc 2040
ttgatgctga aacgggggaa ataaaatgac aaacaaagaa aaagagttat ttgctgaaaa 2100
tgaggaatta aaaaaagaaa ttaaggactt aaaagagcgt attgaaagat acagagaaat 2160
ggaagttgaa ttaagtacaa caatagattt attgagagga gggattattg aataaataaa 2220
agcccccctg acgaaagtcg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc 2280
accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtgaaattg tgagcggata 2340
acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgga ttcactggcc gtcgttttac 2400
aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc 2460
ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc 2520
gcagcctgaa tggcgaatgg cgctaaataa gacctttaga acaagatttg gtaacgcttt 2580
acaaatttat cacgttatcg attcaaattc ttcttatcgc ccgttgtcgt tgtcagtagt 2640
tgttgtcatt tagttaaagt ttaactaaaa cgacatatac aaatttaata ttttgtttta 2700
tgataattgt aagcgttttt atttatgtaa ctttgaaagg agcttcctca tggcttacac 2760
aaataatcaa ctacacgtta tttacggcga cgggagttta ggactacagg gggctaattt 2820
ccactacctc tttagctacg aacgtggcgg acttgaatca ctcgtcgtca acgataaaga 2880
gtggctctat cgtacaccca cgcccatctt ttggcgggcg acaaccgata atgatcacgg 2940
tagcggcttt tcagtcaaat ccgcacagtg gtacgcggcc gataagttct caacttgtca 3000
agatatcgaa ttgacggttg acgaccaacc agtcacaccg ttaccaatcg cgccactcaa 3060
taacaaatac acggatcacg aaatcgccac gaaagtctca ctggcttacc acttcgttac 3120
cacgaccgtt cctagtacca tcgtcacagt gacttatacg gtgacagcag acggtcagat 3180
caatatcgcc acccattata gcggtcagtc tgatttgcca gagctacccg catttggtct 3240
gcggtttatc ataccaacta ccgcgaccgg cttcgactat accggtttgt ccggtgagac 3300
ttatcctgac cggctggccg gcgcaacgca cgggcgattc cacgttgaca gtctgccagt 3360
cacaccatac ttggtcccac aagaatgcgg catgcacatg caaactgaac aagtgacagt 3420
aacgcgatca acaacacaaa ataacgctga ccacgacaac acaccgttca gtttgacatt 3480
tagccaagcc gatgcaccat tcgccttcag ctgccttccc tataccgccg ctgaactaga 3540
aaacgcaacg cacatggaag aattaccatt agcacggcga acggtcttat caatctacgg 3600
tgccgttcgt ggggtcggtg gcattgatag ttggggaaca gacgtagaat ccccatatca 3660
tatccccgct gatcaagaca ttgacttcag ctttaatatt catttctaaa agttattttg 3720
atttcaaaag aacgctccgg cgagttattt gccagagcgt tcttttagat taacgatgat 3780
taagttttaa tatgtttaat ggctgagctt 3810
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atacatatga gcaaaggaga agaac 25
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ataggatcct tagtatagct catccatg 28

Claims (20)

1.一种穿梭型食品级表达载体，其特征在于，包含大肠杆菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因和嗜热链球菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因，或者，包含大肠杆菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因和植物乳杆菌β-半乳糖苷酶的lacM基因；
其中，包含大肠杆菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因和嗜热链球菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因的食品级表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
包含大肠杆菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因和植物乳杆菌β-半乳糖苷酶的lacM基因的食品级表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
2.如权利要求1所述的穿梭型食品级表达载体，其特征在于，所述大肠杆菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因是大肠杆菌β-半乳糖苷酶第1个至第60个氨基酸所对应的编码基因，所述嗜热链球菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因是嗜热链球菌β-半乳糖苷酶第1个至第53个氨基酸所对应的编码基因。
3.如权利要求1所述的穿梭型食品级表达载体，其特征在于，所述包含大肠杆菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因和嗜热链球菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因的食品级表达载体中还包括来自于质粒pMG36e的复制元件和来源于嗜热链球菌的Pldh启动子和Tldh终止子。
4.如权利要求1所述的穿梭型食品级表达载体，其特征在于，所述包含大肠杆菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因和植物乳杆菌β-半乳糖苷酶的lacM基因的食品级表达载体中还包括来自于质粒pNZ8149的复制元件和来源于植物乳杆菌的PldhL启动子和TldhL终止子。
5.权利要求1所述的穿梭型食品级表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以大肠杆菌Nissle1917基因组DNA为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.1和SEQID NO.2的引物经PCR扩增获得PCR产物，所得PCR产物为β-半乳糖苷酶N端第1个至第60个氨基酸编码基因及其启动子Plac；
其中，引物序列如下：
Eα-F：5’-GCGCAACGCAATTAATGTG-3’，SEQ ID NO.1，
Eα-R：6’-TTAGCGCCATTCGCCATTCAG-3，SEQ ID NO.2；
(2)以食品级表达载体pST4040为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的引物经PCR扩增线性化pST4040载体；将线性化pST4040载体与步骤(1)的PCR产物使用体外同源重组酶相互连接得到重组连接产物；
或者，以食品级表达载体pLP4180为模板，利用核苷酸序列为SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6的引物经PCR扩增线性化pLP4180载体；将线性化pLP4180载体与步骤(1)的PCR产物使用体外同源重组酶相互连接得到重组连接产物；
其中，各引物序列如下：
pST4040-F：5’-GAATGGCGAATGGCGCTAACCATGTATTAGTAAAATTTTAG-3’，SEQ ID NO.3，
pST4040-R：5’-CACATTAATTGCGTTGCGCTCGACTTTCGTCAGGGG-3’，SEQ ID NO.4；
pLP4180-F：5’-GAATGGCGAATGGCGCTAAATAAGACCTTTAGAACAAG-3’，SEQ ID NO.5，
pLP4180-R：5’-CACATTAATTGCGTTGCGCTCGACTTTCGTCAGGGGG-3’，SEQ ID NO.6；
(3)将步骤(2)的重组连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，转化子经培养后获得阳性转化子，提取质粒获得穿梭型食品级表达载体。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述PCR扩增反应体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，引物Eα-F 2μL，引物Eα-R 2μL，大肠杆菌Nissle1917基因组DNA 1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
反应条件为：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
7.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述PCR扩增反应体系如下：
Ex taq buffer 25μL，dNTP 4μL，上游引物2μL，下游引物2μL，表达载体1μL，Ex taq 1μL,双蒸水13μL；
反应条件为：
95℃预变性3min；95℃解链30s，50℃退火30s，72℃延伸2min30s，重复30个循环；72℃维持10min；4℃保存。
8.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述食品级表达载体pST4040包含以下元件：来自于质粒pMG36e的复制元件，来源于嗜热链球菌JIM8232菌株的Pldh启动子和Tldh终止子，以及来源于嗜热链球菌JIM8232的β-半乳糖苷酶N端第1个至第53个氨基酸编码基因。
9.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述食品级表达载体pLP4180包含以下元件：来自于质粒pNZ8149的复制元件，来源于植物乳杆菌WCFS1菌株的PldhL启动子和TldhL终止子，以及来源于植物乳杆菌WCFS1的lacM基因。
10.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述大肠杆菌DH5α缺失β-半乳糖苷酶N端第11个至第41个氨基酸编码基因，无β-半乳糖苷酶活性。
11.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述转化子先涂布于M9乳糖固体培养基中培养，培养出的菌落再转接至添加0.1％酪蛋白氨基酸的M9乳糖液体培养基中培养。
12.如权利要求11所述的构建方法，其特征在于，所述M9乳糖液体培养基，每升组分如下：磷酸氢二钠6.8g，磷酸二氢钾3.0g，氯化钠0.5g，氯化铵1.0g，硫酸镁2mM，氯化钙0.1mM，乳糖10g，余量水；添加琼脂糖15g即为M9乳糖固体培养基。
13.一种食品级嗜热链球菌表达系统，其特征在于，包括权利要求1所述的穿梭型食品级表达载体、大肠杆菌DH5α和食品级宿主嗜热链球菌CH3080，所述穿梭型食品级表达载体为包含大肠杆菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因和嗜热链球菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因的食品级表达载体。
14.如权利要求13所述的食品级嗜热链球菌表达系统，其特征在于，所述食品级宿主嗜热链球菌CH3080为敲除β-半乳糖苷酶N端第7个至第36个氨基酸编码基因的嗜热链球菌JIM8232，按照专利文献CN111363714A制备得到。
15.如权利要求13所述的食品级嗜热链球菌表达系统，其特征在于，所述大肠杆菌DH5α缺失β-半乳糖苷酶N端第11个至第41个氨基酸编码基因，无β-半乳糖苷酶活性。
16.一种植物乳杆菌表达系统，其特征在于，包括权利要求1所述的穿梭型食品级表达载体、大肠杆菌DH5α和食品级宿主植物乳杆菌NZ1210，所述穿梭型食品级表达载体为包含大肠杆菌β-半乳糖苷酶α-肽的编码基因和植物乳杆菌β-半乳糖苷酶的lacM基因的食品级表达载体。
17.如权利要求16所述的植物乳杆菌表达系统，其特征在于，所述食品级宿主植物乳杆菌NZ1210是敲除β-半乳糖苷酶的lacA和lacM基因的植物乳杆菌WCFS1，按照专利文献CN110846268A制备得到。
18.如权利要求16所述的植物乳杆菌表达系统，其特征在于，所述大肠杆菌DH5α缺失β-半乳糖苷酶N端第11个至第41个氨基酸编码基因，无β-半乳糖苷酶活性。
19.权利要求13所述的食品级嗜热链球菌表达系统或权利要求16所述的植物乳杆菌表达系统在生产异源物中的应用。
20.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述应用是将异源物的编码基因插入到穿梭型食品级表达载体pSEα或pLEα中，再转化入大肠杆菌DH5α中，筛选并富集重组质粒，再转化入相应的食品级宿主菌中进行表达。
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