BR112020009948A2 - bactérias do ácido láctico com propriedades adoçantes e usos das mesmas - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva lactose, negativa para galactose que libera glicose durante a fermentação do leite. Esta cepa de Streptococcus thermophilus traz uma mutação no gene glcK, no gene ccpA, no gene lacZ e/ou no gene ptsH, e opcionalmente em um ou mais genes, em particular um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose. A invenção também refere-se a uma composição que compreende pelo menos uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção e ao uso desta cepa ou composição para fabricar um produto lácteo fermentado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "BACTÉ-
RIAS DO ÁCIDO LÁCTICO COM PROPRIEDADES ADOÇANTES E USOS DAS MESMAS", CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção refere-se a uma cepa de Streptococcus thermophilus que libera glicose, positiva para galactose, que libera gli- cose durante a fermentação do leite. Esta cepa de Streptococcus ther- mophilus traz uma mutação no gene glcK que codifica uma glucoqui- nase cuja atividade de glucoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula, e opcionalmente em que a velocidade de avanço máxima (Vmax) de sua glucoquinase na cepa é significativa- mente reduzida, mas não nula, no gene ccpA, no gene lacZ e/ou no gene ptsH. Esta cepa também pode trazer, adicionalmente, uma mu- tação em um ou mais genes, em particular um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose. A invenção também refere-se a uma composição que compreende pelo menos uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para ga- lactose da invenção e o uso desta cepa ou composição para fabricar um produto lácteo fermentado.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0002] A indústria alimentícia usa bactérias para melhorar o sabor e a textura dos alimentos ou rações. No caso da indústria de laticínios, bactérias do ácido láctico são comumente usadas, por exemplo, para provocar a acidificação do leite (através de fermentação da lactose) e texturizar o produto no qual elas são incorporadas. Por exemplo, bacté- rias lácticas da espécie Streptococcus thermophilus (S. thermophilus) são amplamente usadas, isoladamente ou em combinação com outras bactérias, na fabricação de produtos lácteos fermentados frescos, tal como iogurte. O termo "iogurte" é definido de acordo com as regulamen-
tações Francesa e Europeias, isto é, produtos lácteos coagulados obti- dos por meio de fermentação de ácido láctico com Streptococcus ther- mophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Lb. bulgaricus).
[0003] Em virtude do gosto do consumidor, os produtos lácteos fer- mentados frescos são frequentemente adoçados com a adição de fru- tas, açúcar ou adoçantes. Assim, normalmente são adicionados ado- çantes artificiais ou naturais para melhorar as propriedades doces dos produtos lácteos fermentados frescos finais. No entanto, ao mesmo tempo, há uma demanda crescente por produtos mais saudáveis, onde nenhum aditivo é adicionado ao produto final.
[0004] Há, portanto, a necessidade de um processo de fabricação de produtos lácteos fermentados frescos e doces usando menos ou ne- nhum aditivo. Soluções — com base em cepas que produzem glicose naturalmente - foram recentemente discutidas ou propostas.
[0005] Pool et al. (2006. Metabolic Engineering 8 (5); 456-464) dis- cutem o adoçamento natural de produtos alimentícios através da mani- pulação de Lactococcus lactis (L. lactis) para a produção de glicose. As- sim, Pool et al. descrevem uma cepa de Lactococcus lactis na qual o metabolismo da glicose é completamente interrompido pela eliminação do gene glcK que codifica a glucoquinase (isto é, sem atividade de glu- coquinase), dos genes ptnABCD que codificam a manose/glicose-PTS e dos genes ptcB-ptcA que codificam o complexo proteico EIIBAº' da glicose-PTS Ellºº! Assim, a cepa obtida poderia fermentar apenas a por- ção galactose da lactose (como um resultado das cepas de L. /actis se- rem cepas fermentadoras da galactose), enquanto que a porção glicose se acumulava extracelularmente. No entanto, a espécie Lactococcus lactis não é necessariamente adequada para a fabricação de todos pro- dutos lácteos fermentados frescos e, em particular, iogurtes (os quais requerem cepas de Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbru- eckii subsp. bulgaricus).
[0006] Os documentos WO2013/160413, WO2017/103051 e Sgrensen et al. (2016; Appl Environ Microbiol 82 (12): 3683-3692) des- crevem cepas de Streptococcus thermophilus com propriedades apri- moradas para adoçamento natural de produtos alimentícios. Estas ce- pas de Streptococcus thermophilus são fermentadoras de galactose e trazem uma mutação em seu gene glcK que silencia a capacidade de fosforilar a glicose (isto é, estas cepas fermentadoras de galactose de S. thermophilus não mostram nenhuma atividade de GlcK detectá- vel). O fenótipo de fermentação de galactose é obtido por uma mutação na região promotora do óperon de galactose(a montante do gene galK) que é conhecida por codificar as enzimas GalK, GalT, GalE e GalM. Alterações de aminoácidos que levam a uma proteína GlcK sem nenhuma atividade de glucoquinase detectável são S72P, T141/ e G249R. Contudo, estas cepas têm um retardo significativo em sua ciné- tica de acidificação.
[0007] Van den Bogaard et al. (Journal of Bacteriology, 2000, 182: 5982-5989) descreve o silenciamento (ruptura total) do gene CCPA em Streptococcus thermophilus. No entanto, este mutante, embora |i- bere glicose (13 mM) durante crescimento em caldo M17 suplementado com lactose (20 mM), tem um retardo significativo em sua cinética de acidificação (tempo de latência prolongado e taxa de crescimento redu- zida), tornando-o inutilizável em uma escada industrial.
[0008] O documento WO 2015/0149940 (Tine SA) descreve um método para identificar bactérias do ácido láctico secretoras de glicose ao realizar mutagênese aleatória em grande escala e detectar a gli- cose através de meios enzimáticos em mutantes positivos para lactose. Contudo, Tine não fala sobre a natureza e o número de mutações e/ou genes afetados pelo método. Na parte de exemplos, os mutantes obti- dos são cepas positivas para lactose, negativas para galactose, como relatado no Exemplo 1 (seleção de cepas de S. thermophilus sobre placa de ágar com caldo M17 suplementado com galactose).
[0009] Há, portanto, uma necessidade remanescente de cepas ca- pazes de produzir glicose naturalmente e que possam ser usadas em escala industrial para fabricar produtos lácteos fermentados frescos, in- cluindo iogurtes.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0010] Figura 1: Alinhamento de sequência da proteína GlcK das cepas DGCC7710 (DSM28255), DSM32587 e ST1m-gicKO-gal+. As di- ferenças em relação à proteína GlcK de DGCC7710 (SEQ ID NO: 2) es- tão em caixas.
[0011] Figura 2: Curva de acidificação do leite (pH ao longo do tempo) obtida com as cepas DGCC7710, DSM32587 e ST1m-glcKo0- galt+.
[0012] Figura 3: Curva de acidificação do leite (pH ao longo do tempo) obtido com (A) a cepa ST1.1 e seu mutante E275K (ST1.1m- glcK) e (B) a cepa ST1.2 e seu mutante E275K (ST1.2m-glcK).
[0013] Figura 4: Proporção da atividade de beta-galactosidase como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase como avaliado por meio do Teste E, em várias cepas de Streptococcus thermophilus da invenção e suas cepas precursoras (controle).
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0014] A presente invenção colocou em evidência que, mais do que mutações que eliminam totalmente a função de proteínas envolvidas no metabolismo do açúcar (tais como ruptura de ccpA, proteína GIcK sem atividade de glucoquinase detectável), mutações que desregulam firme- mente o metabolismo do açúcar (e não o inibem) podem ser usadas para conceber cepas de Streptococcus thermophilus que liberam uma concentração significativa de glicose durante a fermentação lác- tea. Os inventores mostraram muito bem que estas cepas de Strepto- coccus thermophilus podem ser caracterizadas pela proporção de sua atividade de beta-galactosidase para a atividade de glucoquinase. Esta proporção traduz o comportamento das cepas de Streptococcus ther- mophilus positivas para lactose, negativas para galactose da invenção em relação ao uso de lactose e glicose durante seu crescimento, em particular quando usadas durante a fermentação do leite. Na verdade, a beta-galactosidase é responsável pela hidrólise da lactose em galactose e glicose, enquanto que a glucoquinase disponibiliza a glicose para uso através da via de glicólise. Assim, os inventores mostraram que um au- mento da atividade de beta-galactosidase sem qualquer alteração ao nível da atividade de glucoquinase [dentro da proporção mencionada no presente documento] leva a um aumento da glicose livre em virtude de uma hidrólise excessiva de lactose. Por outro lado, uma diminuição da atividade de glucoquinase sem qualquer alteração na atividade de beta- galactosidase [dentro da proporção mencionada no presente docu- mento] tem o mesmo impacto metabólico. De forma interessante, as ce- pas da presente invenção não precisam ser positivas para galactose (fenótipo que foi mostrado a ser instável em lactose).
[0015] Assim, a presente invenção é dirigida a uma cepa de Strep- tococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galac- tose, em que a proporção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoqui- nase da cepa, como avaliado por meio do Teste E, é pelo menos 4,10" 6, pelo menos 5,10, pelo menos 6,108, pelo menos 7,10 ou pelo me- nos 8,10.
[0016] A proporção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glu- coquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E
[0017] A cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção exibe (ou tem) uma proporção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase da cepa, como avaliado por meio do Teste E, que é pelo menos 4,10*. Em uma modalidade, a proporção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avali- ado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, é selecionada a partir do grupo que consiste em pelo menos 4,10, pelo menos 5,10, pelo menos 6,10%, pelo menos 7,10 ou pelo menos 8,10. Em uma modalidade, a propor- ção da atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, é de pelo menos 5,10%. Em uma modalidade, a proporção da atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a gluco- quinase, como avaliado por meio do Teste E, é de pelo menos 6,10. Em uma modalidade, a proporção da atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, é de pelo menos 7,108. Em uma modalidade, a proporção da atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, é de pelo menos 8,10.
[0018] Qualquer que seja o valor mínimo da proporção, como defi- nido no presente documento, a proporção da atividade de beta-galacto- sidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de gluco- quinase, como avaliado por meio do Teste E, é menor do que 8,10*?.
[0019] É digno de nota que a proporção da atividade de beta-galac- tosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glu- coquinase, como avaliado por meio do Teste E, como definido no pre- sente documento, não é mensurável em uma cepa de Streptococcus thermophilus cuja atividade de glucoquinase é nula ou não é detectável por meio do Teste Descrito no presente documento (tais como as cepas descritas na Tabela 1). Também é digno de nota que a proporção da atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D,
TINTA para a atividade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, como definido no presente documento é maior do que 8.10? em cepas de Streptococcus thermophilus, a atividade de glucoquinase das quais é drasticamente reduzida. Para evitar dúvidas, estas cepas de Strepto- coccus thermophilus não fazem parte da invenção.
[0020] De acordo com a invenção, a atividade de beta-galactosi- dase em uma cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é avali- ada por meio do Teste D [isto é, o Teste D é realizado usando a cepa de Streptococcus thermophilus da invenção]: Teste D:
[0021] É obtida uma cultura fresca noturna da cepa de Streptococ- cus thermophilus a ser analisada em caldo M17 que contém 30 g/L de lactose e usada para inocular a 1% (vol/vol) de 10 ml de caldo M17 fresco com 30 g/L de lactose. As células são coletadas por meio de cen- trifugação (6000 g, 10 min, 4ºC) após 3 horas de crescimento em caldo M17 + 30 g/L de lactose a 42ºC, lavadas em 1,5 ml de tampão de lise gelado (KPO. a 0,1 M) e ressuspensas em 300 ul de tampão de lise gelado. Inibidores de protease isentos de EDTA "cOmplete'!"Y" (Roche, referência de fornecedor 04693132001) são adicionados ao tampão de lise, como descrito pelo fornecedor. As células são rompidas mediante adição de 100 mg de esferas de vidro (150-212 mm, Sigma G1145) a 250 ul de células ressuspensas e oscilação em uma frequência de 30 ciclos/s durante 6 minutos em um moinho oscilante MM200 (Re- tsch, Haan, Alemanha). Os detritos celulares e as esferas de vidro são removidos por meio de centrifugação (14000 g, 15 min, 4ºC) e o sobre- nadante transferido para um tubo de centrífuga limpo de 1,5 mL mantido em gelo. O teor total de proteínas é determinado usando o FLUKA Pro- tein Quantification Kit-Rapid (ref. 51254). A atividade de beta-galactosi- dase nos extratos celulares é determinada espectrofotometrica-
mente através de monitoramento da hidrólise de O-nitro-Fenol-Beta-Ga- lactosídeo (ONPG) em galactose e O-nitro-fenol (ONP). 20 uL de ex- trato das bactérias são misturados com 135 ul de React Buffer (NaPO. a 0,1 M+ KCl a 0,01 M + MgSO.s a 0,001 M + ONPG a 3 mM + Beta mer- captoetanol a 60 mM, pH = 6). A produção de ONP leva a uma cor ama- rela no tubo. Quando esta cor aparece, a reação é bloqueada pela adi- ção de 250 uL de tampão de Término (Na2CO3za 1 M). A densidade óp- tica a 420 nm é medida usando um leitor de microplacas de detecção múltipla Synergy HT (BIO-TEK). Uma unidade de galactosidase corres- ponde à quantidade de enzima que catalisa a produção de 1 umole de ONP por minuto sob as condições do ensaio. A atividade de beta-galac- tosidase é calculada da seguinte forma: Atividade de beta-galactosidase (U/g de extrato proteico total) = dOD x V/[dtxlxex Qprot], em que: - dOD é a variação da densidade óptica (OD) a 420 nm entre o blank e a amostra testada -Vé o volume da reação na qual a densidade óptica é me- dida (aqui 250 uL) - dt = representa a duração em minutos entre a adição de 20 uL de extrato bacteriano e a adição de 250 ul de tampão de Término -| = comprimento do percurso óptico (aqui 0,73 cm) -£= coeficiente de atenuação molar de ONP (aqui 4500 cemº2/umol) - Qprot = quantidade de proteína na cubeta (em g)
[0022] As medições são pelo menos triplicadas para cada amostra e os valores da atividade específica de beta-galactosidase apresenta- dos no Teste D no presente documento são a média de três experimen- tos independentes.
[0023] De acordo com a invenção, para a determinar a proporção definida no presente documento, a atividade de glucoquinase em uma cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é avaliada por meio do Teste E, [isto é, o Teste E é realizado usando a cepa de Strep- tococcus thermophilus da invenção].
Teste E:
[0024] É obtida uma cultura noturna fresca da cepa de Streptococ- cus thermophilus a ser analisada em caldo M17 que contém 30 g/L de lactose e usada para inocular a 1% (vol/ívol) de 10 ml de caldo M17 fresco com 30 g/L de lactose. As células são coletadas por meio de cen- trifugação (6000 g, 10 min, 4ºC) após 3 horas de crescimento em caldo M17 + 30 g/L de lactose a 42ºC, lavadas em 1,5 ml de tampão GLCK gelado (5 mM de MgCl2, 10 MM de K2HPO4/KH2POa [pH de 7,2]) e res- suspenso em 300 ul de tampão GLCK gelado. Inibidores de protease isentos de EDTA "cOmplete'Y" (Roche, referência de fornece- dor 04693132001) são adicionados ao tampão GLCK, como descrito pelo fornecedor. As células são rompidas pela adição de 100 mg de es- feras de vidro (150-212 um, Sigma G1145) a 250 ul de células ressus- pensas e oscilação em uma frequência de 30 ciclos/s durante 6 min em um moinho oscilante MM200 (Retsch, Haan, Alemanha). Os detritos ce- lulares e as esferas de vidro são removidos por meio de centrifugação (14000 g, 15 min, 4ºC) e o sobrenadante transferido para um tubo de centrífuga limpo de 1,5 mL mantido em gelo. O teor total de proteínas é determinado usando o FLUKA Protein Quantification Kit-Rapid (ref. 51254). A atividade de glucoquinase nos extratos celulares é determi- nada espectrofotometricamente através de um ensaio acoplado de gli- cose-6-fosfato desidrogenase (G-6PDH, EC1.1.1.49):NADPH (Porter et al., 1982), essencialmente como descrito por Pool et a/. (2006). Cada amostra (5, 10 e 20 ul) é adicionada ao tampão de ensaio (KHPO4/KH2PO4 a 10 MM [pH de 7,2], MgCl2 a 5 MM, ATP a 1 MM, glicose a 20 mM, NADP a 1 mM, 1 U de G-6PDH) em um volume final de 250 uL e a mistura foi deixada em repouso durante 5 min a 30ºC. A densidade óptica a 340 nm é medida durante 5 minutos usando um leitor de microplacas de detecção múltipla Synergy HT (BIO-TEK). Uma uni- dade de glucoquinase corresponde à quantidade de enzima que cata- lisa a fosforilação de 1 umole de D-glicose em D-Glucose 6-fosfato por minuto sob as condições de ensaio. A atividade de glucoquinase é cal- culada da seguinte forma: Atividade de glucoquinase (U/g de extrato proteico total) = dOD x V / [dt x | x € x Qprot], em que: - dOD é a variação da densidade óptica (OD) a 340 nm -Vé o volume da reação (aqui 250 uL) dt = tempo de medição (em minutos) | = comprimento do percurso óptico (aqui 0,73 cm) e= coeficiente de atenuação molar de NADPH; H* (aqui 6220 cm?/umol) Qprot = quantidade de proteína na cubeta (em g)
[0025] As medições são em triplicata para cada amostra e os valo- res de atividade específica da glucoquinase apresentados no presente documento no Teste E são a média de três experimentos independen- tes.
[0026] Liberação de glicose pelas cepas de Streptococcus ther- mophilus positivas para lactose, negativas para galactose da invenção durante a fermentação do leite
[0027] Como descrito no presente documento, as cepas de Strep- tococcus thermophilus positivas para lactose, negativas para galac- tose da invenção podem ser ainda caracterizadas por sua capacidade de liberar glicose quando usadas para fermentar o leite. Esta capaci- dade é definida no presente documento pela concentração de glicose que é liberada no leite quando a cepa da invenção é usada para fermen- tar o leite. Em uma modalidade, as condições de fermentação são de acordo com, e a concentração de glicose liberada é determinada por, o
Teste B como definido abaixo: Teste B:
[0028] O leite semidesnatado UHT Le Petit Vendéen ("leite para io- gurte") que contém 3% (p/v) de leite em pó (BBA, Lactalis), previamente pasteurizado 10 min a 90ºC,é inoculado a 1% (v/v, cerca de 107 CFU/mI) com uma cultura da cepa de S. thermophilus a ser anali- sada (células ressuspensas em caldo M17 sem carboidratos da cultura noturna cultivada em caldo M17 suplementado com sacarose a 3%). Este leite contém lactose a cerca de 175 mM. Os frascos de leite inoculados são incubados estaticamente em banho-maria a 43ºC du- rante 24h para obtenção do leite fermentado. As amostras TO e amos- tras de leite fermentado (T24h) (5 g) são diluídas em 25 g de H2SOs a 0,025N antes de serem centrifugadas a 4600 rpm durante 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante é filtrado através de um filtro de náilon de 0,2 um (Phenomenex, Alemanha, Aschaffenburg) diretamente em um frasco de HPLC de 2 ml. As amostras são armazenadas a - 20ºC até posterior análise. Os carboidratos são quantificados por meio de cromatografia líquida de alta eficiência (Agilent 1200 HPLC) equipada com um detector de índice de refração usando uma coluna de troca aniônica Ami- nex HPX-87H (Bio-Rad Laboratories Inc.) a 35ºC com H2SOsa 12,5 mM como fluido de eluição e vazão de 0,6 m! min. A exploração dos resul- tados é feita com o software de reprocessamento Chemstation (Agi- lent).
[0029] Para evitar dúvidas, a espécie Streptococcus thermophi- lus deve ser entendida como uma cepa de Streptococcus salivarius subsp. thermophilus.
[0030] Pela expressão "positivo para lactose" entenda-se uma cepa de Streptococcus thermophilus que é capaz de crescer em lactose como única fonte de fonte de carboidratos, em particular em um caldo M17 suplementado com 2% de lactose. Em uma modalidade particular,
o fenótipo "positivo para lactose" é testado ao inocular - em um caldo M17 que contém 2% de lactose - uma cultura noturna da cepa de S. thermophilus a ser testada em uma taxa de 1% e incubar durante 20 horas a 37ºC e em que um pH de 5,5 ou menos ao final da incubação é indicativo de um fenótipo positivo para lactose.
[0031] Pela expressão "negativa para galactose" entenda-se uma cepa de Streptococcus thermophilus que não é capaz de crescer em galactose como única fonte de fonte de carboidratos, em particular em um caldo M17 suplementado com 2% de galactose. Em uma moda- lidade particular, o fenótipo "negativa para galactose" é testado ao ino- cular - em um caldo M17 que contém galactose a 2% - uma cultura no- turna da cepa de S. thermophilus a ser testada a 1% e incubar durante horas a 37ºC e em que um pH de 6 ou mais ao final da incubação é indicativo de um fenótipo negativo para galactose.
[0032] Pela expressão "derivada", em referência a uma cepa de ori- gem (por exemplo derivada de DGCC7710), entenda-se uma cepa ob- tida a partir de umacepa de origem (por exemplo, a partir da cepa DGCC7710) por meio de substituição de um dos seus genes (tais como glcK, CCPA, ...) por outro alelo (em particular um alelo mutante) do mesmo gene. Em uma modalidade, o derivado é obtido pela substi- tuição do gene completo (sequência codificadora e promotor) da cepa precursora por outro alelo (sequência codificadora e promotor) do mesmo gene. Em uma modalidade, o derivado é obtido ao substituir a sequência codificadora de um gene da cepa precursora por outro alelo (sequência codificadora) do mesmo gene.
[0033] A presente invenção é dirigida a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose que traz uma mutação em (um) ou mais gene(s) selecionado(s) a partir do grupo que consiste no gene glcK, no gene ccpA, no gene lacZ, no gene ptsH, e um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-
glicose, em que a proporção da atividade beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoqui- nase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, é pelo menos 4,10, é pelo menos 5,10, pelo menos 6,10, pelo menos 7,10º ou pelo menos 8,10%. Em uma modalidade, e qualquer que seja o valor mi- nimo da proporção definida no presente documento, a proporção da ati- vidade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, é menor do que 8,10*?.
[0034] Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophi- lus positiva para lactose, negativa para galactose traz (uma) muta- ção(ões) em um ou mais genes selecionados a partir do grupo que con- siste no gene glcK, no gene ccpA, no gene lacZ e no gene ptsH e, opci- onalmente, que traz uma mutação em um ou mais genes, em particular um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose- glicose. Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophi- lus positiva para lactose, negativa para galactose traz (uma) muta- ção(ões) em um ou mais genes selecionados a partir do grupo que con- siste no gene glcK, no gene ccpA, no gene lacZ e no gene ptsH e traz uma mutação em um ou mais genes, em particular um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose. Em uma modali- dade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, ne- gativa para galactose da invenção traz 1) uma mutação em um gene selecionado a partir do grupo que consiste no gene glcK, no gene ccpA, no gene lacZ e no gene ptsH ou uma mutação tanto no gene glceK como no gene ccpA e 2) uma mutação em um ou mais genes, em particular um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose- glicose. Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophi- lus positiva para lactose, negativa para galactose traz uma primeira mu- tação em um gene selecionado a partir do grupo que consiste no gene glcK, no gene ccpA, no gene lacZe no gene ptsHl e um se- gunda mutação em um gene que codifica uma proteína do PTS especí- fico para manose-glicose.
[0035] Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophi- lus positiva para lactose, negativa para galactose traz uma mutação em um ou mais genes selecionados a partir do grupo que consiste no gene glcK, no gene ccpA e em um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose. Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para ga- lactose da invenção traz uma mutação no gene glcK e/ou no gene ccpA e, opcionalmente, em um ou mais genes, em particular um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose.
[0036] Em qualquer uma das modalidades acima, o(um) ou mais gene(s) que codifica(m) uma proteína do PTS específico para manose- glicose é selecionado a partir do grupo que consiste no gene manL, o gene manM, o gene manL e o gene manO. Em qualquer das modalida- des acima, o(um) ou mais gene(s) que codifica(m) uma proteína PTS específico para manose-glicose é selecionado a partir do grupo que con- siste no gene manL, no gene manM e no gene manN. Em uma modali- dade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, ne- gativa para galactose da invenção traz (uma) mutação(ões) em um gene ou dois selecionados a partir do grupo que consiste no gene glcK e no gene ccpA e uma mutação em um ou mais genes, em particular um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose. Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção traz uma mutação no gene glcK e/ou no gene ccpA e opcionalmente no gene manL, no gene manM ou no gene manN.
[0037] Algumas modalidades de cepas de Streptococcus ther- mophilus positivas para lactose, negativas para galactose da invenção que exibem uma proporção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoqui- nase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, de pelo menos 4,10 são detalhadas abaixo: |. Uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção que traz uma mutação em seu gene glcK.
Il. Uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção que traz uma mutação em seu gene ccpA.
Ill. Uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção que traz uma mutação em seu gene glcK e uma mutação em seu gene ccpA.
IV. Uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção que traz uma mutação em seu gene /lacZ.
V. Uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção que traz uma mutação em seu gene písH.
Vl. Uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção, de acordo com qualquer uma das modalidades | a V, que traz ainda uma mutação em um ou mais genes, em particular um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose.
|. Uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose que traz uma mutação em seu gene glcK
[0038] A presente invenção colocou em evidência que as cepas de Streptococcus thermophilus, as quais são negativas para galactose e trazem uma mutação no gene glcK que codifica uma glucoquinase
(GIcK) cuja atividade de glucoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula, pode ser usada excretar glicose no leite fer- mentado.
[0039] A invenção é dirigida a uma cepa de Streptococcus ther- mophilus positiva para lactose, negativa para galactose que traz uma mutação no gene glcK que codifica uma glucoquinase cuja atividade de glucoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula. Em uma modalidade, a invenção é dirigida a uma cepa de Streptococ- cus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose que traz uma mutação no gene glcK que codifica uma glucoquinase cuja ativi- dade de glucoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula, em que a proporção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glu- coquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, é de pelo menos 4,10, como definido no presente documento.
[0040] A expressão "gene glcK que codifica uma glucoquinase" sig- nifica qualquer sequência de DNA de uma cepa de Streptococcus ther- mophilus que codifica a enzima glucoquinase que catalisa a conversão de glicose e ATP em glicose-6-fosfato (G6P) e ADP. Exemplos não |i- mitativos de sequências de glucoquinase de Streptococcus thermophi- lus são descritos como SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10 12, 14, 16, 18 e 20.
[0041] Dentro da invenção, a atividade de glucoquinase em uma cepa de Streptococcus thermophilus é significativamente reduzida, mas não nula, como uma consequência de uma mutação em seu gene glcK. Em outras palavras, o alelo do gene glcK transportado pela dita cepa é tal que a atividade de glucoquinase na dita cepa é significativamente re- duzida, mas não nula.
[0042] A expressão "atividade de glucoquinase na dita cepa é sig- nificativamente reduzida, mas não nula" refere-se a uma cepa cuja ati- vidade de glucoquinase é:
- significativamente reduzida na dita cepa, em particular comparado com a atividade de glucoquinase em uma cepa que traz um gene glcK não mutante; e - não nula, isto é, uma atividade que não é detectável por meio do Teste A, como definido no presente documento.
[0043] De acordo com a invenção, a característica "atividade de glu- coquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula" pode ser determinada por meio de métodos bem conhecidos na téc- nica. Assim, métodos para medir a atividade de glucoquinase em uma cepa de Streptococcus thermophilus são conhecidos e incluem ensaios enzimáticos e reagentes comercialmente disponíveis. no presente do- cumento, é feita referência ao parágrafo 2,4 de Pool et al. (2006. Meta- bolic Engineering 8 (5); 456-464) (incorporado no presente documento por referência). Em uma modalidade particular, para a determinação desta característica, a atividade de glucoquinase em uma cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é avaliada por meio do Teste A [isto é, o Teste A é realizado usando a cepa de Streptococcus ther- mophilus da invenção]. Teste A:
[0044] É obtida uma cultura noturna fresca da cepa de Streptococ- cus thermophilus a ser analisada em caldo M17 que contém 30 g/L de lactose e usada para inocular a 1% (vol/vol) de 10 ml de caldo M17 fresco com 30 g/L de lactose. As células são coletadas por meio de cen- trifugação (6000 g, 10 min, 4ºC) em uma densidade óptica de 600 nm (ODs00) de 0,8 +/- 0,2, lavadas em 5 ml de tampão GLCK gelado (MgCl2 a 5 MM, KHPO/KH2PO. a 10 mM [pH de 7,2]) e ressuspensas em 500 ul de tampão GLCK gelado. Inibidores de protease isentos de EDTA "complete!Y" (Roche, referência de fornecedor 04693132001) são adi- cionados ao tampão GLCK, como descrito pelo fornecedor. As células são rompidas pela adição de 100 mg de esferas de vidro (150-212 um,
Sigma G1145) a 200 ul de células ressuspensas e oscilação em uma frequência de 30 ciclos/s durante 6 min em um moinho oscilante MM200 (Retsch, Haan, Alemanha). Os detritos celulares e as esferas de vidro são removidos por meio de centrifugação (14000 g, 15 min, 4ºC)e o sobrenadante transferido para um tubo de centrífuga limpo de 1,5 mL mantido em gelo.
O teor total de proteínas é determinado usando o FLUKA Protein Quantification Kit-Rapid (ref. 51254). A atividade de glu- coquinase nos extratos celulares é determinada espectrofotometrica- mente através de um ensaio acoplado de glicose-6-fosfato desidroge- nase (G-6PDH, EC1.1.1.49):NADPH (Porter et al., 1982), essencial- mente como descrito por Pool et al. (2006). Cada amostra (5, 10 e 20 uL) é adicionada ao tampão de ensaio (KHPO4J/KH2PO. a 10 mM [pH de 7,2], MgCI2 a 5 mM, ATP a 1 mM, glicose a 20 mM, NADP a 1 mM, 1 U de G-6PDH) em um volume final de 250 uL e a mistura foi deixada em repouso durante 5 min a 30 ºC.
A densidade óptica a 340 nm é me- dida durante 5 minutos usando um leitor de microplacas de detecção múltipla Synergy HT (BIO-TEK). Uma unidade de glucoquinase corres- ponde à quantidade de enzima que catalisa a fosforilação de 1 umole de D-glicose em D-Glucose 6-fosfato por minuto sob as condições de ensaio.
A atividade de glucoquinase é calculada da seguinte forma: Atividade de glucoquinase (U/g do extrato proteico total) = dOD x V / [dt x | x € x Qprot], em que:
- dOD é a variação da densidade óptica (OD) a 340 nm
-Vé o volume da reação (aqui 250 yuL)
dt = tempo de medição (em minutos)
| = comprimento do percurso óptico (aqui 0,73 cm)
£= coeficiente de atenuação molar de NADPH; H* (aqui 6220 cm?/uymol)
Qprot = quantidade de proteína na cubeta (em g)
[0045] As medições são em triplicata para cada amostra e os valo- res de atividade específica da glucoquinase no presente documento apresentados no Teste A são a média de três experimentos indepen- dentes.
[0046] Em uma primeira modalidade particular da característica de "atividade de glucoquinase n a dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula", a atividade de glucoquinase da cepa de Streptococcus thermophilus da invenção está entre 200 e 1500 U/g de extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste A. Em uma modalidade particu- lar, a atividade de glucoquinase da cepa de Streptococcus thermophilus da invenção está entre 300 e 1200 U/g de extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste A. Em uma modalidade particular, a ativi- dade de glucoquinase da cepa de Streptococcus thermophilus da inven- ção está entre 400 e 1000 U/g de extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste A. Em uma modalidade particular, a atividade de glu- coquinase da cepa de Streptococcus thermophilus da invenção está en- tre um valor mínimo selecionado a partir do grupo que consiste em 200, 300 e 400 U/g de extrato proteico total e um valor máximo selecionado a partir do grupo que consiste em 1000, 1200 e 1500 U/g de extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste A. Vale ressaltar que, como mencionado no Teste A, os valores da atividade de glucoquinase descritos no presente documento são a média de três experimentos in- dependentes (triplicatas).
[0047] Em uma segunda modalidade particular da característica de "atividade de glucoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula", a atividade de glucoquinase da cepa de Streptococcus thermophilus da invenção está entre 5 e 60% da atividade de glucoqui- nase da cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014. Por "atividade de gluco- quinase da cepa DGCC7710" entenda-se a atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710 (isto é, com SEQ ID NO: 2), como avaliado por meio do Teste A, na cepa DGCC7710 [isto é, o Teste A é realizado usando a cepa DGCC7710]. O valor percentual é calculado com base na atividade de glucoquinase da cepa da invenção e a atividade de glu- coquinase da cepa DGCC7710, ambas ensaiadas por meio do Teste A. Em uma modalidade particular, a atividade de glucoquinase da cepa de Streptococcus thermophilus da invenção está entre 10 e 50% da ati- vidade de glucoquinase da cepa DGCC7710. Em uma modalidade par- ticular, a atividade de glucoquinase da cepa de Streptococcus ther- mophilus da invenção está entre 15 e 40% da atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710. Em uma modalidade particular, a atividade de glu- coquinase da cepa de Streptococcus thermophilus da invenção está en- tre uma porcentagem mínima selecionada a partir do grupo que consiste em 5, 10 e 15% da atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710 e uma porcentagem máxima selecionada a partir do grupo que consiste em 40, 50 e 60% da atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710. Em uma modalidade particular e qualquer que seja a faixa de porcentagens, a atividade da atividade de glucoquinase é avaliada por meio do Teste A, como descrito no presente documento. Vale ressaltar que os valores percentuais descritos no presente documento são calculados com base nos valores da atividade de glucoquinase os quais são a média de três experimentos independentes (triplicatas), como avaliado por meio do Teste A.
[0048] Nas primeira e segunda modalidades particulares, as se- guintes cepas podem ser usadas como controles no Teste A: - como um controle positivo (isto é, uma cepa de Streptococ- cus thermophilus que é representativa das cepas que trazem um gene glcK sem mutação): cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o nú- mero de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014;
- como um controle negativo (isto é, uma cepa de Strepto- coccus thermophilus que tem natividade de glucoquinase não detectá- vel): um gene glcK de Streptococcus thermophilus que sofreu silencia- mento (knocked-out) ou um gene glcK de Streptococcus thermophi- lusque trazuma das mutações descritas nos documentos WO?2013/160413, WO2017/103051 ou Sgrensen et al. (2016) e resumi- das na Tabela 1 abaixo: Mutação ao nível | Alteração no nível | Mutação descrita na Cepas descritas em do gene glcK de proteína GlcK cepa depositada documento T214C S72P DSM25851 documento Cc422T T141 DSM25850 WO2013/160413 Sgrensen (St1-GS-1) documento G745A G249R DSM28889 WO2017/103051 Sorensen (St2-GS-1) Tabela 1: Mutações de glcK que levam a uma cepa cuja atividade de glucoquinase não é detectável
[0049] Durante a fermentação do leite, a lactose contida no leite (como principal fonte de carboidratos no leite) é importada para as ce- pas de Streptococcus thermophilus. A lactose intracelular é, então, cli- vada em glicose e galactose pela enzima beta-galactosidase (de modo que 1 mole de lactose produza 1 mole de glicose e 1 mole de galactose).
[0050] A característica "atividade de glucoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula" também pode ser caracteri- zada pela velocidade de avanço máxima da glucoquinase (aqui deno- minada Vmax e definida como a velocidade da conversão de glicose + ATP em G6P + ADP) ou pelo inverso da afinidade da glucoquinase (de- nominada Km) por um ou dois de seus substratos, isto é, glicose e ATP. Em uma modalidade, a característica "atividade de glucoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula" para a cepa da in- venção é ainda caracterizada pela velocidade de avanço máxima
(Vmax) de sua glucoquinase na dita cepa.
[0051] Portanto, em combinação com as primeira ou segunda mo- dalidades particulares da característica "atividade de glucoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula" definida no pre- sente documento, a velocidade de avanço máxima (Vmax) da glucoqui- nase na cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, ne- gativa para galactose da invenção é significativamente reduzida, mas não nula. A característica "Vmax de glucoquinase na dita cepa é signifi- cativamente reduzida, mas não nula" pode ser definida por um ou dois destes parâmetros: - a Vmax está entre 200 e 1500 U/g de extrato proteico total, como testado no Teste C.
- a Vmax está entre 5e 60% da Vmax para a glucoqui- nase da cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014, ambos quando ensaiados por meio do Teste C.
[0052] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose que traz uma mutação no gene glcK que codifica uma glucoquinase, em que a atividade de glucoquinase na dita cepa é signi- ficativamente reduzida, mas não nula (como definido no presente docu- mento) e em que a velocidade de avanço máxima (Vmax) de sua gluco- quinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula, e de- finida por um ou dois destes parâmetros: - a Vmax está entre 200 e 1500 U/g de extrato proteico total, como testado no Teste C.
- a Vmax está entre 5 e 60% da Vmax para a glucoquinase da cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014, ambos quando ensaiados por meio do Teste C.
[0053] A velocidade de avanço máxima da glucoquinase (Vmax) em uma cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é avaliada por meio do Teste C [isto é, o Teste C é realizado usando a cepa de Strep- tococcus thermophilus da invenção]. Teste C:
[0054] A velocidade de avanço máxima (Vmax) é determinada usando várias concentrações de glicose (0, 5, 10, 15, 20 MM) no extrato bruto preparado como descrito no Teste A. As medidas são em triplicata para cada amostra e os valores de Vmax fornecidos no Teste C são a média de três experimentos independentes. A regressão linear que re- presenta o inverso da velocidade específica em função do inverso da concentração de glicose fornece o inverso da velocidade de avanço má- xima na interseção com o eixo Y do gráfico.
[0055] Em uma modalidade particular da velocidade de avanço má- xima da glucoquinase na cepa de Streptococcus thermophilus da in- venção, a Vmax está entre 200 e 1500 U/g de extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste C. Em uma modalidade particular, a Vmax está entre 300 e 1200 U/g de extrato proteico total, como avali- ado por meio do Teste C. Em uma modalidade particular, a Vmnax está entre 400 e 1000 U/g de extrato proteico total. Em uma modalidade par- ticular, a Vmax para a glucoquinase na cepa de Streptococcus ther- mophilus da invenção está entre um valor mínimo selecionado a partir do grupo que consiste em 200, 300 e 400 U/g de extrato proteico total e um valor máximo selecionado a partir do grupo que consiste em 1000, 1200 e 1500 U/g de extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste C.
[0056] Em uma modalidade particular da velocidade de avanço má- xima da glucoquinase na cepa de Streptococcus thermophilus da inven- ção, a Vmax está entre 5 e 60% da Vmax para a glucoquinase da cepa
DGCC7710. Por "Vmax para a glucoquinase da cepa DGCC7710", en- tenda-se a Vmax para a glucoquinase DGCC7710 (isto é, com SEQ ID NO: 2), como avaliado por meio do Teste C, na cepa DGCC 7710 [isto é, o Teste C é realizado usando a cepa DGCC7710]. O valor percentual é calculado com base na Vmax para a glucoquinase na cepa da inven- ção e na Vnnax da cepa DGCC7710, ambos avaliadas por meio do Teste C. Em uma modalidade particular, a Vnax para a glucoquinase na cepa de Streptococcus thermophilus da invenção está entre 10 e 50% da Vmax para a glucoquinase da cepa DGCC7710, ambas avaliadas por meio do Teste C. Em uma modalidade particular, a Vinax para a gluco- quinase na cepa de Streptococcus thermophilus da invenção está en- tre 15 e 40% da Vmax para a glucoquinase da cepa DGCC7710. Em uma modalidade particular, a Vnax para a glucoquinase na cepa de Streptococcus thermophilus da invenção está entre uma percentagem mínima selecionada a partir do grupo que consiste em 5, 10 e 15% da Vmax da atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710 e uma percen- tagem máxima selecionado a partir do grupo que consiste em 40, 50 e 60% da Vmax da atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710.
[0057] A cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção traz uma mutação no gene glcK que codifica uma glucoquinase cuja atividade de glucoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no pre- sente documento e opcionalmente, em que a velocidade de avanço má- xima da glucoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento.
[0058] Por "mutação no gene glck", dentro da presente invenção, entenda-se qualquer variação nucleotídica no gene glcK, em que a dita variação ao nível de nucleotídeos leva a uma atividade de glucoqui- nase em uma cepa que traz este gene glcK mutante (como o único gene glcK) que é significativamente reduzida, mas não nula, como defi- nido no presente documento e, opcionalmente, leva a uma velocidade de avanço máxima da glucoquinase na dita cepa que é significativa- mente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento. Em uma modalidade particular, por "mutação no gene glck", dentro da presente invenção, entenda-se qualquer variação de nucleotídeo dentro do quadro de leitura aberta do gene glcK, em que a dita variação ao nível de nucleotídeos leva a uma atividade de glucoquinase em uma cepa que traz este gene glcK mutante (como o único gene glcK) que é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento e, opcionalmente, leva a uma velocidade de avanço máxima da glucoquinase na dita cepa que é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento.
[0059] Assim, embora duas cepas de Streptococcus thermophilus possam diferir quanto à sequência de seu respectivo gene glcK, isto não significa necessariamente que um destes dois genes glcK seja mutante no sentido da invenção. Na verdade, não são consideradas mutações na presente invenção: - variações ao nível de nucleotídeos que não levam a ne- nhuma alteração no nível de proteína (variação silenciosa) e que não afetam a tradução do RNA de glcK; e - variações ao nível de nucleotídeos que levam a uma alte- ração no nível de proteína, mas em que esta alteração não afeta a ati- vidade de glucoquinase da proteína GlIcK resultante e, opcionalmente, a velocidade de avanço máxima da proteína GlcK resultante, como de- finido no presente documento. Na verdade, estas variações podem ser observadas ao nível do gene glcK da cepa de Streptococcus thermophi- lus da invenção sem afetar o escopo da proteção.
[0060] Exemplos não limitativos de genes glcK que não são consi- derados mutantes no sentido da invenção são:
- o polinucleotídeo que codifica a glucoquinase, como defi- nido em SEQ ID NO: 2 (GIcK tipo ST1), em particular o polinucleotídeo como definido em SEQ ID NO: 1; este tipo de GlcK é aquele de uma cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014;
- o polinucleotídeo que codifica a glucoquinase como defi- nido em SEQ ID NO: 4 (GlcK tipo ST2), em particular o polinucleotídeo como definido em SEQ ID NO: 3;
- o polinucleotídeo que codifica a glucoquinase, como defi- nido em SEQ ID NO: 6 (GIcK tipo ST3), em particular o polinucleotídeo como definido em SEQ ID NO: 5;
- o polinucleotídeo que codifica a glucoquinase, como defi- nido em SEQ ID NO: 8 (GlcK tipo ST4), em particular o polinucleotídeo como definido em SEQ ID NO: 7;
- o polinucleotídeo que codifica a glucoquinase como defi- nido em SEQ ID NO: 10 (GIcK tipo ST5), em particular o polinucleotídeo como definido em SEQ ID NO: 9;
- o polinucleotídeo que codifica a glucoquinase como defi- nido em SEQ ID NO: 1 2 (GlIcK tipo ST6), em particular o polinucleotídeo como definido em SEQ ID NO: 11;
- o polinucleotídeo que codifica a glucoquinase como defi- nido em SEQ ID NO: 1 4 (GlIcK tipo ST7), em particular o polinucleotídeo como definido em SEQ ID NO: 13;
- o polinucleotídeo que codifica a glucoquinase, como defi- nido em SEQ ID NO: 16 (GlcK tipo ST8), em particular o polinucleotídeo como definido em SEQ ID NO: 15;
- o polinucleotídeo que codifica a glucoquinase, como defi- nido em SEQ ID NO: 18 (GlIcK tipo ST9), em particular o polinucleotídeo como definido em SEQ ID NO: 17;
- o polinucleotídeo que codifica a glucoquinase como defi- nido em SEQ ID NO: 20 (GIcK tipo ST10), em particular o polinucleotí- deo como definido em SEQ ID NO: 19.
[0061] As diferenças de aminoácidos ao nível da glucoquinase jun- tamente com a porcentagem de identidade de cada tipo de GIcK para a SEQ ID NO: 2 estão resumidas na Tabela 3 (Exemplo 2). A atividade de glucoquinase em cepas dos tipos GlIcK ST2 a ST10 é resumida na Tabela 4 (Exemplo 3).
[0062] Além disso, algumas mutações de nucleotídeos dentro do gene glcK não são consideradas adequadas para a finalidade da inven- ção, uma vez que levam a uma glucoquinase cuja atividade é nula ou está abaixo do valor mínimo definido no presente documento, como ava- liado por meio do Teste A. Exemplos não limitativos de mutações ina- dequadas são descritos na Tabela 1. Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus da invenção não traz uma mutação seleci- onada a partir do grupo que consiste em uma mutação que leva ao si- lenciamento (knock-out) do gene glcK e grandes eliminações dentro do gene glcK.
[0063] Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophi- lus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção traz uma mutação no quadro de leitura aberta do gene glcK, que leva à substitui- ção de um aminoácido na proteína GlcK cuja atividade de glucoquinase na dita a cepa que traz o gene glcK mutante é significativamente redu- zida, mas não nula (como definido no presente documento) e opcional- mente em que a velocidade de avanço máxima da glucoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no pre- sente documento. Em uma modalidade particular, a cepa de Strepto- coccus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção traz uma mutação no gene glcK que leva à substituição de um aminoácido na proteína GlcK cuja atividade de glucoquinasena dita cepa que traz a mutação no gene glcK é significativamente redu- zida, mas não nula (como definido no presente documento) e, opcional- mente, em que a velocidade de avanço máxima da glucoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento. Em uma modalidade particular, a cepa de Strep- tococcus thermophilus da invenção traz uma mutação no gene glcK, de modo que a proteína GlcK tem 322 aminoácidos de comprimento e em que a atividade de glucoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento e opcio- nalmente, em que a velocidade de avanço máxima da glucoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento.
[0064] Como discutido acima, algumas modificações de DNA po- dem ser observadas ao nível do gene glcK da cepa de Streptococcus thermophilus da invenção que não afetam a atividade de glucoquinase da cepa. Com base no Teste A definido no presente documento, junta- mente com as cepas de controle definidas no presente documento, aqueles versados na técnica saberão identificar 1) um gene glcK que codifica uma glucoquinase cuja atividade de glucoquinase em uma cepa que traz este gene glcK é significativamente reduzida, mas não nula (como definido no presente documento) e opcionalmente em que a ve- locidade de avanço máxima da glucoquinase em uma cepa que traz este gene glcK mutante é significativamente reduzida, mas não nula (como definido no presente documento), 2) um gene glcK que traz uma modificação que não tem impacto sobre a atividade de glucoqui- nase em uma cepa que traz esta modificação ou 3) um gene glcK que codifica uma glucoquinase cuja atividade de glucoquinase em uma cepa que traz este gene glcK é nula (como definido no presente documento).
[0065] A cepa DGCC7710 pode ser usada como controle ao subs- tituir seu gene glcK pelo gene glcK a ser testado para obter um derivado de DGCC7710 e analisar o derivado de DGCC7710 por meio do Teste A (atividade de glucoquinase) ou Teste C (Vmax).
[0066]
[0067] Os inventores identificaram duas posições dentro da gluco- quinase para as quais foi demonstrado que a natureza dos aminoácidos tem um impacto sobre a atividade de glucoquinase, de modo que a ati- vidade de glucoquinase é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento, e em um impacto sobre a Vmax da glucoquinase, de modo que a Vmax seja significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento: posição 144 e po- sição 275 da glucoquinase (isto é, códons 144 e 275 do gene glcK). Vale ressaltar que, com base nos Testes A e C definidos no presente documento, juntamente com as cepas de controle, aqueles versados na técnica saberão como identificar outras posições e aminoácidos apro- priados na glucoquinase para obter uma atividade de glucoquinase sig- nificativamente reduzida, mas não nula (como definido no presente do- cumento) e opcionalmente uma velocidade de avanço máxima que é significativamente reduzida, mas não nula e, portanto, o gene glcK correspondente.
[0068] Em uma modalidade, o aminoácido na posição 275 da glu- coquinase (codificado pelo gene glcK da cepa de Streptococcus ther- mophilus da invenção) não é um ácido glutâmico (isto é, qualquer ami- noácido exceto um ácido glutâmico); assim, em uma modalidade, o có- don 275 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophi- lus da invenção não é GAA nem GAG. Em uma modalidade particular, o aminoácido na posição 275 da glucoquinase não é um aminoácido ácido (isto é, qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido); As- sim, em uma modalidade, o códon 275 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é um códon que codifica um aminoácido não ácido. Em uma modalidade particular, o aminoácido na posição 275 da glucoquinase é selecionado a partir do grupo que con- siste em lisina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos; as- sim, em uma modalidade, o códon 275 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é um códon que codifica um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em uma lisina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos. Em uma modalidade particular, o aminoácido na posição 275 da glucoquinase é uma |li- sina; Assim, em uma modalidade, o códon 275 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é qualquer um de AAA ou AAG. Em uma modalidade particular, os nucleotídeos 823- 825 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção são AAA ou AAG.
[0069] Em uma modalidade particular, a sequência da proteína GlcK da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, ne- gativa para galactose da invenção é selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma sequência como definido em SEQ ID NO: 25, em que o aminoácido na posição 275 é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular é qualquer aminoácido exceto um amino- ácido ácido, em particular é uma lisina; e b) uma sequência variante de GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 25, em que o aminoá- cido da glucoquinase que corresponde à posição 275 de SEQ ID NO: (ou o aminoácido na posição 275 da glucoquinase) é qualquer ami- noácido exceto um ácido glutâmico, em particular é qualquer aminoá- cido exceto um aminoácido ácido, em particular é uma lisina. Em uma modalidade, a sequência variante de GlcKtem 322 aminoácidos de comprimento.
[0070] Em outra modalidade, o aminoácido na posição 144 da glu-
coquinase (codificado pelo gene glcK da cepa de Streptococcus ther- mophilus da invenção) não é uma glicina (isto é, qualquer aminoácido exceto uma glicina); assim, em uma modalidade, o códon 144 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da inven- ção não é GGT, GGC, GGA ou GGG. Em uma modalidade particular, o aminoácido na posição 144 da glucoquinase não é um aminoácido ali- fático (isto é, qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático). Em uma modalidade particular, o aminoácido na posição 144 da glucoqui- nase é selecionado a partir do grupo que consiste em serina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos; assim, em uma modalidade, o códon 144 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus ther- mophilus da invenção é um códon que codifica um aminoácido selecio- nado a partir do grupo que consiste em uma serina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos. Em uma modalidade particular, o ami- noácido na posição 144 da glucoquinase é uma serina; assim, em uma modalidade, o códon 144 do gene glcK portado pela cepa de Strepto- coccus thermophilus da invenção é AGT, AGC, TCT, TCC, TCA ou TCG. Em uma modalidade particular, os nucleotídeos 430-432 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção são AGT, AGC, TCT, TCC, TCA ou TCG.
[0071] Em uma modalidade particular, a sequência da prote- ína GlcK da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção é selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma sequência como definido em SEQ ID NO: 46, em que o aminoácido na posição 144 é qualquer aminoácido exceto uma gli- cina, em particular é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifá- tico, em particular é uma serina; e b) uma sequência variante de GIcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 46, em que o aminoácido da glucoquinase que corresponde à posição 144 de SEQ ID NO: 46 (ou o aminoácido na posição 144 da glucoquinase) é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular é qualquer aminoácido exceto um ami- noácido alifático, em particular é uma serina. Em uma modalidade par- ticular, a sequência variante de GIcK tem 322 aminoácidos de compri- mento.
[0072] Para definição da variante de GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 25, a similaridade ou identidade é calculada no presente documento ao longo de todo o com- primento das 2 sequências após alinhamento ideal [isto é, número de resíduos de aminoácidos similares ou idênticos nas partes alinhadas das sequências]; a posição 275, como definido em SEQ ID NO: 25, não é considerada para o cálculo da similaridade ou da identidade. Em uma modalidade particular, a sequência variante de GIcK tem pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 25, em que o aminoácido que corresponde à posição 275 de SEQ ID NO: 25 (ou o aminoácido na posição 275 da glucoqui- nase) é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular é uma lisina. Em uma modalidade, a sequência variante de GlcK tem pelo menos 95% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 25, em que o aminoácido que corresponde à posição 275 de SEQ ID NO: 25 (ou o aminoácido na posição 275 da glucoquinase) é qualquer aminoácido ex- ceto um ácido glutâmico, em particular é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular é uma lisina. Em uma modalidade, a sequência variante de GlcK tem pelo menos 97% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 25, em que o aminoácido que corresponde à posição 275 de SEQ ID NO: 25 (ou o aminoácido na posição 275 da glucoquinase) é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em par- ticular é uma lisina.
[0073] Em uma modalidade particular, a sequência da variante de GlcK difere de SEQ ID NO: 25 por 1 a 30 substituições de aminoáci- dos, em que o aminoácido na posição 275 da dita variante de GlcK é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular é qual- quer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular é uma li- sina (a posição 275 não é considerada para o cálculo do número de substituições). Em uma modalidade particular, a sequência da variante de GlcK difere de SEQ ID NO: 25 por 1 a 20 substituições de aminoáci- dos, em que o aminoácido na posição 275 da dita variante de GlcK é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular é qual- quer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular é uma li- sina. Em uma modalidade particular, a sequência da variante de GlcK difere de SEQ ID NO: 25 por 1 a 15 substituições de aminoácidos, em que o aminoácido na posição 275 da dita variante de GlcK é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular é qualquer amino- ácido ácido exceto um aminoácido ácido, em particular é uma lisina. Em uma modalidade particular, a sequência da variante de GlcK difere de SEQ ID NO: 25 por 1 a 10 substituições de aminoácidos, em que o ami- noácido na posição 275 da dita variante de GlcK é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular é uma lisina. Em uma modalidade particular, a sequência da variante de GIcK difere de SEQ ID NO: 25 por 1,2,3,4,5,6,7, 8,9, 10, 11 ou 12 substituições de aminoácidos, em que o aminoácido na posição 275 da dita variante de GlIcK é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular é qualquer amino- ácido exceto um aminoácido ácido, em particular é uma lisina.
[0074] Para a definição da variante de GIcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 46, a similaridade ou identidade é calculada no presente documento ao longo de todo o comprimento das 2 sequências após alinhamento ideal [isto é, número de resíduos de aminoácidos similares ou idênticos nas partes alinhadas das sequências]; a posição 144, como definido em SEQ ID NO: 46, não é considerada para o cálculo da similaridade ou da identidade. Em uma modalidade particular, a sequência variante de GlIcK tem pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 46, em que o aminoácido que corresponde à posição 144 de SEQ ID NO: 46 (ou o aminoácido na posição 144 da glucoquinase) é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular é qualquer ami- noácido exceto um aminoácido alifático, em particular é uma serina. Em uma modalidade, a sequência variante de GIcK tem pelo menos 95% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 46, em que o aminoácido que corresponde à posição 144 de SEQ ID NO: 46 (ou o aminoácido na posição 144 da glucoquinase) é qualquer aminoácido exceto uma dgli- cina, em particular é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifá- tico, em particular é uma serina. Em uma modalidade, a sequência va- riante de GlcK tem pelo menos 97% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 46, em que o aminoácido que corresponde à posição 144 de SEQ ID NO: 46 (ou o aminoácido na posição 144 da glucoquinase) é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular é qualquer ami- noácido exceto um aminoácido alifático, em particular é uma serina.
[0075] Em uma modalidade particular, a sequência da variante de GlIcK difere de SEQ ID NO: 46 por 1 a 30 substituições de aminoácidos, em que o aminoácido na posição 144 da dita variante de GlcK é qual- quer aminoácido exceto uma glicina, em particular é qualquer aminoá- cido exceto um aminoácido alifático, em particular é uma serina (a posi- ção 144 não é considerada para o cálculo do número de substituições). Em uma modalidade particular, a sequência da variante de GIcK difere de SEQ ID NO: 46 por 1 a 20 substituições de aminoácidos, em que o aminoácido na posição 144 da dita variante de GIcK é qualquer amino- ácido exceto uma glicina, em particular é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular é uma serina. Em uma modali- dade particular, a sequência da variante de GlcK difere de SEQ ID NO: 46 por 1 a 15 substituições de aminoácidos, em que o aminoácido na posição 144 da dita variante de GlcK é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular é uma serina. Em uma modalidade particular, a sequência da variante de GlcK difere de SEQ ID NO: 46 por 1 a 10 substituições de aminoácidos, em que o aminoácido na posição 144 da dita variante de GlcK é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em par- ticular é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em parti- cular é uma serina. Em uma modalidade particular, a sequência da va- riante de GlcK difere de SEQ ID NO: 46 por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 substituições de aminoácidos, em que o aminoácido na posi- ção 144 da dita variante de GIcK é qualquer aminoácido exceto uma gli- cina, em particular é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifá- tico, em particular é uma serina.
[0076] Em uma modalidade, a sequência da proteína GlIcK da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para ga- lactose da invenção é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 e 34, em que o aminoá- cido na posição 275 da dita variante é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular é qualquer aminoácido exceto um amino- ácido ácido, em particular é uma lisina; assim, em uma modalidade, o gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da inven- ção codifica uma proteína GlcK cuja sequência é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 e 34, em que o aminoácido na posição 275 da glucoquinase não é um ácido glutâmico, em particular não é um aminoácido ácido, em particular é uma lisina, respectivamente.
[0077] Em uma modalidade particular, como a SEQ ID NO: 25 ou qualquer sequência variante de GIcK que tem pelo menos 90% de simi- laridade ou identidade com SEQ ID NO: 25, como definido no presente documento (em particular SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34), o aminoácido da glucoquinase que corresponde à posição 275 de SEQ ID NO: 25 (ou o aminoácido na posição 275 da glucoqui- nase) não é um ácido glutâmico; assim, em uma modalidade, o códon 275 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção não é GAA nem GAG; assim, em uma modalidade, o gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção co- difica uma proteína GlcK cuja sequência é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 25 e qualquer sequência variante de GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 25, como definido no presente documento (em particular SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34), em que o aminoácido da glu- coquinase que corresponde à posição 275 de SEQ ID NO: 25 (ou o ami- noácido na posição 275 da glucoquinase) não é um ácido glutâmico.
[0078] Em uma modalidade particular, como a SEQ ID NO: 25 ou qualquer sequência variante de GIcK que tem pelo menos 90% de simi- laridade ou identidade com SEQ ID NO: 25, como definido no presente documento (em particular SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34), o aminoácido da glucoquinase que corresponde à posição 275 de SEQ ID NO: 25 (ou o aminoácido na posição 275 da glucoqui- nase) não é um aminoácido ácido; assim, em uma modalidade, o có- don 275 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophi- lus da invenção é um códon que não codifica um aminoácido ácido; as- sim, em uma modalidade, o gene glcK portado pela cepa de Streptococ- cus thermophilus da invenção codifica uma proteína GIcK cuja sequên- cia é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:
e qualquer sequência variante de GlIcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 25, como definido no pre- sente documento (em particular SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34), em que o aminoácido da glucoquinase que corresponde à posição 275 de SEQ ID NO: 25 (ou o aminoácido na posição 275 da glu- coquinase) não é um aminoácido ácido.
[0079] Em uma modalidade particular, como a SEQ ID NO: 25 ou qualquer sequência variante de GIcK que tem pelo menos 90% de simi- laridade ou identidade com SEQ ID NO: 25, como definido no presente documento (em particular, SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34), o aminoácido da glucoquinase que corresponde à posição 275 de SEQ ID NO: 25 (ou o aminoácido na posição 275 da glucoqui- nase) é selecionado a partir do grupo que consiste em lisina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos; assim, em uma modalidade, o códon 275 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus ther- mophilus da invenção é um códon que codifica um aminoácido selecio- nado a partir do grupo que consiste em lisina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos; assim, em uma modalidade, o gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção codifica uma proteína GlcK cuja sequência é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 25 e qualquer sequência variante de GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 25, como definido no presente documento (em particular SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34), em que o aminoácido da glucoqui- nase que corresponde à posição 275 de SEQ ID NO: 25 (ou o aminoá- cido na posição 275 da glucoquinase) é uma lisina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos.
[0080] Em uma modalidade particular, como a SEQ ID NO: 25 ou qualquer sequência variante de GIcK que tem pelo menos 90% de simi- laridade ou identidade com SEQ ID NO: 25, como definido no presente documento (em particular, SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34), o aminoácido da glucoquinase que corresponde à posição 275 de SEQ ID NO: 25 (ou o aminoácido na posição 275 da glucoqui- nase) é uma lisina; assim, em uma modalidade, o códon 275 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é um códon que codifica uma lisina, respectivamente, em particu- lar é AMA ou AAG, respectivamente; assim, em uma modalidade parti- cular, a sequência da proteína GlIcK da cepa de Streptococcus ther- mophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 22, 35, 36, 37, 38 39, 40, 41,42 e 43; assim, em uma modalidade, o gene glcK por- tado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção codifica uma proteína GlcK cuja sequência é selecionada a partir do grupo que con- siste em SEQ ID NOs: 22, 35, 36, 37, 38, 39 40, 41, 42 e 43; em uma modalidade particular, o gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é como definido em SEQ ID NO: 21.
[0081] Em outra modalidade, a sequência da proteína GlcK da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para ga- lactose cepa da invenção é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 e 55, em que o ami- noácido na posição 144 da dita variante é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular é uma serina; assim, em uma modalidade, o gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção co- difica uma proteína GlcK cuja sequência é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 e 55, em que o aminoácido na posição 144 da glucoquinase não é uma gli- cina, em particular não é um aminoácido alifático, em particular é uma serina.
[0082] Em uma modalidade particular, como a SEQ ID NO: 46 ou qualquer sequência variante de GlcK que tem pelo menos 90% de simi- laridade ou identidade com SEQ ID NO: 46, como definido no presente documento (em particular SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55), o aminoácido da glucoquinase que corresponde à posição 144 de SEQ ID NO: 46 (ou o aminoácido na posição 144 da glucoquinase) não é uma glicina; assim, em uma modalidade, o códon 144 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção não é GGT, GGC, GGA ou GGG; assim, em uma modalidade, o gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção codifica uma proteína GlcK cuja sequência é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 46 e qualquer sequência variante de GIcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 46, como definido no presente documento (em particular SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55), em que o aminoácido da glucoquinase que corresponde à posição 144 de SEQ ID NO: 46 (ou o aminoácido na posição 144 das glucoquinase) não é uma glicina.
[0083] Em uma modalidade particular, como a SEQ ID NO: 46 ou qualquer sequência variante de GlcK que tem pelo menos 90% de simi- laridade ou identidade com SEQ ID NO: 46, como definido no presente documento (em particular SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55), o aminoácido da glucoquinase que corresponde à posição 144 de SEQ ID NO: 46 (ou o aminoácido na posição 144 da glucoquinase) não é um aminoácido alifático; assim, em uma modalidade, o códon 144 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da in- venção é um códon que não codifica um aminoácido alifático; assim, em uma modalidade, o gene glcK portado pela cepa de Streptococcus ther- mophilus da invenção codifica uma proteína GlcK cuja sequência é se- lecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 46 e qual- quer sequência variante de GlIcK que tem pelo menos 90% similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 46, como definido no presente docu- mento (em particular SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55), em que o aminoácido da glucoquinase que corresponde à posição 144 de SEQ ID NO: 46 (ou o aminoácido na posição 144 da glucoquinase) não é um aminoácido alifático.
[0084] Em uma modalidade particular, como a SEQ ID NO: 46 ou qualquer sequência variante de GlcK que tem pelo menos 90% de simi- laridade ou identidade com SEQ ID NO: 46, como definido no presente documento (em particular SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55), o aminoácido da glucoquinase que corresponde à posição 144 de SEQ ID NO: 46 (ou o aminoácido na posição 144 da glucoquinase) é selecionado a partir do grupo que consiste em serina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos; assim, em uma modalidade, o códon 144 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é um códon que codifica um aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em serina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos; assim, em uma modalidade, o gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção codifica uma proteína GlcK cuja sequência é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 46 e qualquer sequência variante de GlIcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 46, como definido no presente documento (em particular SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55), em que o aminoácido da glucoquinase que corresponde à posição 144 de SEQ ID NO: 46 (ou o aminoácido na po- sição 144 da glucoquinase) é uma serina e qualquer um de seus ami- noácidos conservativos.
[0085] Em uma modalidade particular, como a SEQ ID NO: 46 ou qualquer sequência variante de GlIcK que tem pelo menos 90% de simi- laridade ou identidade com SEQ ID NO: 46, como definido no presente documento (em particular a SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55), o aminoácido da glucoquinase que corresponde à posição 144 de SEQ ID NO: 46 (ou o aminoácido na posição 144 da glucoquinase) é uma serina; assim, em uma modalidade, o códon 144 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é um có- don que codifica uma serina, em particular é AAA ou AAG; assim, em uma modalidade particular, a sequência da proteína GlIcK da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galac- tose da invenção é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4 5, 56, 57, 58, 59 60, 61, 62, 63 e 64; assim, em uma modali- dade, o gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção codifica uma proteína GlcK cuja sequência é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 45, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 e 64; em uma modalidade particular, o gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é como definido em SEQ ID NO: 44.
[0086] Ao definir a sequência da proteína GlIcK da cepa de Strepto- coccus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção, está de acordo com o ensinamento do presente pedido que a atividade de glucoquinase da cepa que expressa esta proteína GlcK é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento, e opcionalmente que a Vmax para a glucoquinase na cepa é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento.
[0087] Além de ser caracterizada por uma atividade de glucoqui- nase significativamente reduzida, mas não nula, como definido no pre- sente documento e, opcionalmente, por uma velocidade de avanço má- xima (Vmax) significativamente reduzida, mas não nula, de sua gluco- quinase, como definido no presente documento, a cepa de Streptococ- cus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose pode ser caracterizada por seu comportamento (capacidade de liberar gli- cose) quando usada para fermentar o leite. Além de ser caracterizada por uma proporção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, que é de pelo menos 4,108, como definido no presente documento, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose pode ainda ser caracterizada por seu comportamento (capacidade de liberar gli- cose) quando usada para fermentar o leite. Além de ser caracterizada por uma proporção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, que é de pelo menos 4,10% como definido no presente documento e por uma atividade de glucoquinase significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento e, opcionalmente, por uma velocidade de avanço máxima (Vmax) significativamente reduzida, mas não nula, de sua glucoquinase, como definido no presente documento, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para ga- lactose pode ser ainda caracterizada por seu comportamento (capaci- dade de liberar glicose) quando usada para fermentar o leite.
[0088] Assim, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose que traz uma mutação no gene glcK da invenção é ainda caracterizada por pelo menos uma destas caracterís- ticas, quando usada para fermentar o leite, em particular por uma destas características ou pela combinação de 2 destas características: 1) quando a dita cepa é usada para fermentar o leite, como avaliado por meio do Teste B, a proporção entre a quantidade de glicose acumulada/liberada (mM) no dito leite fermentado para a quantidade de lactose consumida pela dita cepa (mM) é maior do que 20%; 2) quando a dita cepa é usada para fermentar o leite, como avaliado por meio do Teste B, a concentração de glicose no dito leite fermentado é de pelo menos 10 mM;
[0089] Cada uma destas características será descrita separada- mente daqui em diante embora, como mencionado acima, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para ga- lactose da invenção — que tem uma atividade de glucoquinase significa- tivamente reduzida, mas não nula, como definido no presente docu- mento e opcionalmente tem uma velocidade máxima de avanço signifi- cativamente reduzida (Vmax) de sua glucoquinase, como definido no presente documento - pode ser ainda caracterizada por uma destas ca- racterísticas ou pela combinação de duas destas características.
[0090] 1) Em uma modalidade particular, (individualmente ou em combinação com a característica 2), a cepa de Streptococcus ther- mophilus da invenção que traz uma mutação no gene glcK é ainda ca- racterizada pelo fato de que, quando a cepa é usada para fermentar o leite, como avaliado por meio do Teste B, a proporção entre a quanti- dade de glicose acumulada/liberada (MM) no dito leite fermentado para a quantidade de lactose consumida pela dita cepa (mM) é maior do que 20%.
[0091] Na verdade, como um resultado da atividade de glucoqui- nase "significativamente reduzida, mas não nula" em uma cepa da in- venção e, opcionalmente, como um resultado da Vmax "significativa- mente reduzida, mas não nula" para a glucoquinase na dita cepa, me- nos de 80% de moles de glicose provenientes da lactose consumida (dissacarídeo feito de glicose e galactose) são usados por esta cepa, de modo que pelo menos 20% de moles de glicose provenientes da lactose consumida são liberados no leite durante a fermentação. Após a fer- mentação do leite usando o Teste B descrito no presente documento, o número de moles de lactose consumida é determinado ao calcular o número de moles de lactose no leite antes da fermentação menos o nú- mero de moles de lactose restantes no leite fermentado após a fermen- tação.
Após a fermentação do leite usando o Teste B descrito no pre- sente documento, o número de moles de glicose encontrados no leite fermentado após a fermentação menos o número de moles de glicose que já possam estar presentes no leite antes da fermentação (se hou- ver) é determinado (glicose acumulada). Então, a proporção de glicose acumulada para a lactose consumida é calculada e representa a % da porção de glicose da lactose consumida que é liberada e acumulada no dito leite fermentado.
Em uma modalidade particular, quando uma cepa da invenção é usada para fermentar o leite, como avaliado por meio do Teste B, a proporção entre a quantidade de glicose acumulada/liberada (mM) no dito leite fermentado para a quantidade de lactose consumida pela dita cepa (mM) é maior do que 30%. Em uma modalidade particu- lar, quando uma cepa da invenção é usada para fermentar o leite, como avaliado por meio do Teste B, a proporção entre a quantidade de glicose acumulada/liberada (MM) no dito leite fermentado para a quantidade de lactose consumida pela dita cepa (mM) é maior do que 40%. Em uma modalidade particular, quando uma cepa da invenção é usada para fer- mentar o leite, como avaliado por meio do Teste B, a proporção entre a quantidade de glicose acumulada/liberada (mM) no dito leite fermentado para a quantidade de lactose consumida pela dita cepa (mM) é maior do que 50%. Em uma modalidade particular, quando uma cepa da in- venção é usada para fermentar o leite, como avaliado por meio do Teste B, a proporção entre a quantidade de glicose acumulada/liberada (mM) no dito leite fermentado para a quantidade de lactose consumida pela dita cepa (mM) é maior do que 60%. Em uma modalidade particular, quando uma cepa da invenção é usada para fermentar o leite, como avaliado por meio do Teste B, a proporção entre a quantidade de glicose acumulada/liberada (mM) no dito leite fermentado para a quantidade de lactose consumida pela dita cepa (mM) é selecionada a partir do grupo que consiste em uma proporção maior do que 30%, maior do que 40%, maior do que 50 e maior do que 60%.
[0092] 2) Em uma modalidade particular (individualmente ou em combinação com a característica 1), a cepa de Streptococcus ther- mophilus da invenção que traz uma mutação no gene glcK é ainda ca- racterizada pelo fato de que a concentração de glicose em um leite fer- mentado com a dita cepa de Streptococcus thermophilus, como avali- ado por meio do Teste B, é de pelo menos 10 mM. Em uma modalidade particular, a concentração de glicose em um leite fermentado com a dita cepa de Streptococcus thermophilus, como avaliado por meio do Teste B, é de pelo menos 15 mM. Em uma modalidade particular, a con- centração de glicose em um leite fermentado com a dita cepa de Strep- tococcus thermophilus, como avaliado por meio do Teste B, é de pelo menos 20 mM. Em uma modalidade particular, a concentração de gli- cose em um leite fermentado com a dita cepa de Streptococcus ther- mophilus, como avaliado por meio do Teste B, é de pelo menos 25 mM. Em uma modalidade particular, a concentração de glicose em um leite fermentado com a dita cepa de Streptococcus thermophilus, como ava- liado por meio do Teste B, é selecionada a partir do grupo que consiste em uma concentração com pelo menos 10 mM, pelo menos 15 mM, pelo menos 20 mM e em pelo menos 25 mM.
[0093] Assim, em uma modalidade particular, a cepa de Streptococ- cus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da in- venção — que tem atividade de glucoquinase significativamente redu- zida, mas não nula, como definido no presente documento e, opcional- mente, tem uma velocidade de avanço máxima (Vmax) significativa- mente reduzida, mas não nula, de sua glucoquinase, como definido no presente documento, é ainda caracterizada por 1 destas características ou pela combinação de 2 destas características:
1) quando a dita cepa é usada para fermentar o leite, como avaliado por meio do Teste B, a proporção entre a quantidade de glicose acumulada/liberada (mM) no dito leite fermentado para a quantidade de lactose consumida pela dita cepa (mM) é selecionada a partir do grupo que consiste em uma proporção maior do que 30%, 40%, 50 e 60%; 2) quando a dita cepa é usada para fermentar o leite, como avaliado por meio do Teste B, a concentração de glicose no dito leite fermentado é selecionada a partir do grupo que consiste em uma con- centração de pelo menos 10 mM, pelo menos 15 mM, pelo menos 20 mM e pelo menos 25 mM.
Il. Uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção que traz uma mutação em seu gene ccpA
[0094] A invenção é dirigida a uma cepa de Streptococcus ther- mophilus positiva para lactose, negativa para galactose que traz uma mutação no gene ccpA, em que a proporção da atividade de beta-ga- lactosidase na dita cepa testada por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase da cepa dita testada por meio do Teste E, é de pelo menos 4,10, como definido no presente documento.
[0095] Qualquer mutação pode ser introduzida no gene ccpA da cepa de Streptococcus thermophilus, contanto que seja obtida a propor- ção supracitada da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose que traz este gene ccpA mutante.
[0096] Em uma modalidade, a mutação no gene ccpA não é uma mutação que leva ao silenciamento (isto é, a ruptura completa) do gene.
[0097] Em uma modalidade, a mutação do gene ccpA é uma muta- ção na sequência codificadora do gene ccpA, em particular nos primei- ros 270 nucleotídeos da sequência codificadora do gene ccpA. Em uma modalidade, a mutação é uma mutação selecionada a partir do grupo que consiste em:
a) uma mutação sem sentido (non-sense) (isto é, que leva a um códon TERMINAL) localizada entre o nucleotídeo 1 e o nucleotídeo 270 da sequência codificadora do gene ccpA; e b) uma mutação localizada no primeiro quarto da sequência codificadora do gene ccpA (isto é, entre o nucleotídeo 1 e o nucleotídeo 250) que leva a um deslocamento (frameshift) de quadro do quadro de leitura aberta do gene ccpA.
[0098] Em uma modalidade, a mutação que leva a um desloca- mento (frameshift) de quadro do quadro de leitura aberta do gene CCpA está localizada entre o nucleotídeo 50 e o nucleotídeo 200 da se- quência codificadora do gene ccpA. Em uma modalidade, a mutação que leva a um deslocamento (frameshift) de quadro do quadro de leitura aberta do gene ccpA está localizada entre o nucleotídeo 100 e o nucle- otídeo 150 da sequência codificadora do gene ccpA. Qualquer que seja a localização da mutação que leva a um deslocamento de quadro, a mutação é selecionada a partir do grupo que consiste em uma elimina- ção, uma inserção ou uma eliminação/inserção (as quais nem todas são múltiplos de 3).
[0099] Embora duas cepas de Streptococcus thermophilus possam diferir quanto à sequência de seu respectivo gene ccpA, isto não signi- fica necessariamente que um destes dois genes ccpA seja mutante no sentido da invenção. Na verdade, não são consideradas como muta- ções do gene ccpA, dentro da presente invenção: - variações ao nível de nucleotídeos que levam a uma alte- ração no nível de proteína, mas em que esta alteração não permite obter uma proporção - da atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, na cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose que codifica esta proteína modificada - de pelo menos 4,10.
[0100] Exemplos não limitativos de genes ccpA que não são consi- derados mutantes no sentido da invenção são: - o polinucleotídeo como definido em SEQ ID NO: 65 (ccpA tipo ST1); este tipo de ccpA é aquele da cepa DGCC7710; - o polinucleotídeo como definido em SEQ ID NO: 66 (ccpA tipo ST2), que tem 99,8% de identidade com SEQ ID NO: 65; - o polinucleotídeo como definido em SEQ ID NO: 67 (ccpA tipo ST3), que tem 99,8% de identidade com SEQ ID NO: 65; - o polinucleotídeo como definido em SEQ ID NO: 68 (ccpA tipo ST4), que tem 99,7% de identidade com SEQ ID NO: 65; - o polinucleotídeo como definido em SEQ ID NO: 69 (ccpA tipo ST5), que tem 99,8% de identidade com SEQ ID NO: 65; e - o polinucleotídeo como definido em SEQ ID NO: 70 (ccpA tipo ST6), que tem 99,7% de identidade com SEQ ID NO: 65.
[0101] Os inventores identificaram pelo menos uma mutação que, quando presente no gene ccpA de uma cepa de Streptococcus ther- mophilus positiva para lactose, negativa para galactose, permite que esta cepa exiba uma proporção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glu- coquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, de pelo menos 4,10, como definido no presente documento. Assim, a invenção é dirigida a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lac- tose, negativa para galactose que tem uma mutação no gene ccpA se- lecionada a partir do grupo que consiste em uma mutação sem sentido (non-sense) localizada entre o nucleotídeo 1 e o nucleotídeo 270 da se- quência codificadora do gene ccpA e uma mutação localizada no pri- meiro quarto da sequência codificadora do gene ccpA que leva a um deslocamento (frameshift) de quadro do quadro de leitura aberta do gene ccpA, em que a proporção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, é pelo menos 4,10, como definido no presente documento.
[0102] Em uma modalidade, a mutação do gene ccpA é uma elimi- nação de um nucleotídeo A no trecho de 7 nucleotídeos A nas posições 114-120 (que leva a um deslocamento (frameshift) de quadro do quadro de leitura aberta do gene ccpA). Esta cepa de Streptococcus thermophi- lus com um gene ccpA mutante é denominada no presente documento como ccpAniaris-120. Em uma modalidade, a sequência do dito gene ccpA mutante é selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma sequência como definido em SEQ ID NO: 71; e b) uma sequência variante de ccpA que tem pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 71. A variante de ccpA, como defi- nido no presente documento, traz uma mutação como definido acima, isto é, é selecionada a partir do grupo que consiste em uma mutação sem sentido (non-sense) localizada entre o nucleotídeo 1 e o nucleotí- deo 270 da sequência codificadora do gene ccpA e uma mutação loca- lizada no primeiro quarto da sequência codificadora da ccpA que leva a um deslocamento (frameshift) de quadro do quadro de leitura aberta do gene ccpA.
[0103] Para a definição da variante ccpA que tem pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 71, a identidade é calculada no pre- sente documento ao longo de todo o comprimento das 2 sequências após alinhamento ideal [isto é, número de nucleotídeos idênticos nas partes alinhadas das sequências]. Em uma modalidade particular, a se- quência variante de ccpA tem pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com SEQ ID NO: 71. Em uma modalidade, a se- quência variante de ccpA difere de SEQ ID NO: 71 por 1 a 30 substitui- ções de nucleotídeos. Em uma modalidade particular, a sequência vari- ante de ccpA difere de SEQ ID NO: 71 por 1 a 20 substituições de nu- cleotídeos. Em uma modalidade particular, a sequência variante de ccpA difere de SEQ ID NO: 71 por 1 a 15 substituições de nucleotí- deos. Em uma modalidade particular, a sequência variante de ccpA di- fere de SEQ ID NO: 71 por 1 a 10 substituições de nucleotídeos. Em uma modalidade particular, a sequência da variante de ccpA difere de SEQ ID NO: 71 por 1,2, 3,4, 5,6, 7,8,9 ou 10 substituições de nucle- otídeos. Em uma modalidade, a sequência do gene ccpA da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para ga- lactose da invenção é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 71,72,73,74,75 e 76.
[0104] Além de ser caracterizada por uma proporção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, de pelo menos 4,10, como definido no presente do- cumento, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção que traz um gene ccpA mutante pode ainda ser caracterizada por sua capacidade de liberar glicose quando usada para fermentar o leite.
[0105] Assim, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose que traz uma mutação no gene ccpA da invenção é ainda caracterizada pelo fato de que a concentração de glicose em um leite fermentado com a dita cepa de Streptococcus ther- mophilus, como avaliado por meio do Teste B, é pelo menos 8 MM. Em uma modalidade particular, a concentração de glicose em um leite fer- mentado com a dita cepa de Streptococcus thermophilus, como avali- ado por meio do Teste B, é de pelo menos 9 mM. Em uma modalidade particular, a concentração de glicose em um leite fermentado com a dita cepa de Streptococcus thermophilus, como avaliado por meio do Teste B, é de pelo menos 10 mM. Em uma modalidade particular, a con- centração de glicose em um leite fermentado com a dita cepa de Strep- tococcus thermophilus, como avaliado por meio do Teste B, é de pelo menos 12 mM. Em uma modalidade particular, a concentração de gli- cose em um leite fermentado com a dita cepa de Streptococcus ther- mophilus, como avaliado por meio do Teste B, é selecionada a partir do grupo que consiste em uma concentração com pelo menos 8 mM, pelo menos 9 mM, pelo menos 10 mM e pelo menos 12 mM.
[0106] São fornecidas para aqueles versados na técnica, nesta parte do pedido, orientações sobre como obter e identificar mutações do gene ccpA que não aquelas especificamente descritas. Com base na proporção definida acima [atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E] juntamente com uma cepa de referência definida no presente documento, aqueles versados na técnica saberão como identificar um gene ccpA mutante de acordo com a invenção e obter uma cepa de Streptococcus thermophilus da in- venção.
[0107] Assim, aqueles versados na técnica podem proceder por meio do método a seguir: a) fornecer uma cepa de Streptococcus thermophilus, o gene ccpA da qual é como definido em SEQ ID NO: 65, tal como a cepa DGCC7710; b) realizar mutagênese no gene ccpA, por exemplo, mutagê- nese aleatória ou dirigida, para obter um gene ccpA cuja sequência é diferente da sequência do gene ccpA da cepa em a); c) inserir o gene ccpA obtido em b) em vez do gene ccpA da cepa DGCC7710 para obter um derivado de DGCC7710; d) determinar a proporção da atividade beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, do dito derivado de DGCC7710, em que uma proporção de pelo menos 4,10 significa que o gene ccpA in- serido é um gene ccpA mutante de acordo com a invenção. Em uma modalidade particular, um gene ccpA mutante é considerado como es- tando de acordo com a invenção quando a proporção da atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a ativi- dade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, do dito de- rivado de DGCC7710 é pelo menos 5,10, pelo menos 6,10%, pelo me- nos 7,10 ou pelo menos 8,10%. Em uma modalidade, a dita propor- ção é menor do que 8,10*?.
[0108] Além disso, aqueles versados na técnica para obter e identi- ficar um gene ccpA mutante de acordo com a invenção e obter uma cepa de Streptococcus thermophilus da invenção, também podem pro- ceder por meio do método a seguir: a) fornecer uma cepa de Streptococcus thermophilus cujo gene ccpA é como definido em SEQ ID NO: 65, tal como a cepa DGCC7710; b) realizar mutagênese no gene ccpA, por exemplo, mutagê- nese aleatória ou dirigida, para obter um gene ccpA cuja sequência é diferente da sequência do gene ccpA da cepa em a); c) inserir o gene ccpA obtido em b) em vez do gene ccpA da cepa DGCC7710 para obter um derivado de DGCC7710; d) determinar a proporção da atividade de beta-galactosi- dase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoqui- nase, como avaliado por meio do Teste E, do dito derivado de DGCC7710 e selecionar um derivado de DGCC7710 que exibe uma proporção de pelo menos 4,10, como definido no presente documento; e e) determinar, por meio do Teste B, a concentração de gli- cose em um leite fermentado com o dito derivado de DGCC7710 sele- cionado em d), em que uma concentração de glicose de pelo menos 8 mM significa que o gene ccpA inserido é um gene ccpA mutante de acordo com a invenção. Em uma modalidade particular, um gene ccpA mutante é considerado de acordo com a invenção quando a concentra- ção de glicose medida na etapa e) é de pelo menos 9 mM, pelo menos mM ou pelo menos 12 mM.
[0109] Alternativamente, aqueles versados na técnica podem pro- ceder por meio do método a seguir: a) fornecer a cepa DSM32587 (com mutação em seu gene glcK) depositada no DSMZ em 15 de agosto de 2017; b) realizar mutagênese no gene ccpA da cepa em a), por exemplo, mutagênese aleatória ou dirigida, para obter um gene ccpA cuja sequência é diferente da sequência do gene ccpA da DSM32587 para obter uma cepa DSM32587 com ccpA mutante; c) determinar a proporção da atividade de beta-galactosi- dase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoqui- nase, como avaliado por meio do Teste E, da cepa DSM32587 com ccpA mutante obtida em b) e selecionar uma cepa DSM32587 com ccpA mutante que exibe uma proporção de pelo menos 4,10; e d) determinar, por meio do Teste B, a concentração de gli- cose em um leite fermentado com a dita cepa DSM32587 com ccpA mu- tante selecionada em c), em que: d1) uma concentração de glicose de pelo menos 50 mM sig- nifica que o gene ccpA mutante está de acordo com a invenção. Em uma modalidade, um gene ccpA mutante é considerado de acordo com a invenção quando a concentração de glicose medida na etapa d) é de pelo menos 60 mM, pelo menos 70 mM ou pelo menos 80 mM, ou d2) um aumento da concentração de glicose obtida com a dita cepa DSM32587 com ccpA mutante selecionada em c) de pelo me- nos 150% comparado com a concentração de glicose obtida com a cepa DSM32587, quando ambas são avaliadas por meio do Teste B, significa que o gene ccpA mutante está de acordo com a invenção. Em uma mo-
dalidade, um gene ccpA mutante é considerado de acordo com a inven- ção quando o aumento de glicose na etapa d) é de pelo menos 200% ou pelo menos 300% da concentração de glicose da cepa DSM32587.
[0110] Uma vez identificado, um gene ccpA mutante, como identifi- cado no presente documento - pode ser introduzido em vez do gene CCpA de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose para obter uma cepa de Streptococcus ther- mophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção.
Ill. Uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção que traz uma mutação em seu gene glcK e uma mutação em seu gene ccpA
[0111] A invenção é dirigida a uma cepa de Streptococcus ther- mophilus positiva para lactose, negativa para galactose que traz uma mutação no gene glcK que codifica uma glucoquinase cuja atividade de glucoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento, e traz uma mutação em seu gene ccpA, em que a proporção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glu- coquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, é de pelo menos 4,10, como definido no presente documento.
[0112] Em uma modalidade, uma mutação no gene glcK que leva a uma atividade de glucoquinase na dita cepa que é significativamente reduzida, mas não nula, como descrito no presente documento (em par- ticular sob | acima) pode ser usada em combinação com qualquer mu- tação em ccpA, contanto que a proporção da atividade de beta-galacto- sidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a ativi- dade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, seja pelo menos 4,10, como definido no presente documento. Em outras palavras, a invenção é dirigida a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose que traz uma mutação no gene glcK, como definido no presente documento (em particular sob | acima), e ainda traz uma mutação no gene ccpA.
[0113] Em uma modalidade, uma mutação no gene ccpA que leva a uma proporção da atividade beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, em uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose que traz o gene ccpA mutante, em particular na cepa DGCC7710 - de pelo menos 4,18, como descrito no presente documento (em particular sob Il acima), pode ser usada com qualquer mutação de glcK, contanto que a proporção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, seja de pelo menos 4,10, como definido no presente do- cumento. Em outras palavras, a invenção é dirigida a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galac- tose que traz uma mutação no gene ccpA, em que a proporção da ativi- dade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, é pelo menos 4,10, como definido no presente documento (em particular sob Il acima), e que traz ainda uma mutação no gene glcK.
[0114] Em uma modalidade, a invenção é dirigida a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galac- tose, que traz: - um gene glcK mutante que leva a uma glucoquinase cuja atividade na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula, como definido em uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose, como definido no presente docu- mento, em particular sob | acima; e
- um gene ccpA mutante que leva a uma proporção da ativi- dade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, de pelo menos 4,10, como definido no presente documento, em particular como definido na cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lac- tose, negativa para galactose sob Il acima.
[0115] Assim, qualquer uma das modalidades descritas acima para o gene glcK mutante que leva a uma glucoquinase cuja atividade na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula, pode ser combi- nada com qualquer uma das modalidades descritas no presente docu- mento para o gene ccpA mutante que leva a uma proporção da ativi- dade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, de pelo menos 4,10, contanto que a cepa de Streptococcus thermophi- lus positiva para lactose, negativa para galactose obtida que traz ambas as mutações exiba um proporção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glu- coquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, de pelo menos 4,10, como definido no presente documento.
[0116] Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophi- lus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção traz: - um gene glcK que codifica uma glucoquinase que sofreu mutação em seu quadro de leitura aberta que leva particularmente a uma substituição de aminoácidos na proteína GIcK, em que a atividade de glucoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula; e - um gene ccpA que traz uma mutação selecionada a partir do grupo que consiste em a) uma mutação sem sentido (non-sense) (isto é, que leva a um códon TERMINAL) localizada entre o nucleotídeo 1 e o nucleotídeo 270 da sequência codificadora do gene ccpA; e b)
uma mutação localizada no primeiro quarto da sequência codificadora do gene ccpA (isto é, entre o nucleotídeo 1 e o nucleotídeo 250) que leva a um deslocamento (frameshift) de quadro do quadro de leitura aberta do gene ccpA.
[0117] Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophi- lus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção traz: - um gene glcK mutante que codifica uma glucoquinase cuja posição 144 não é uma glicina, em particular é uma serina, ou cuja po- sição 275 não é um ácido glutâmico, em particular é uma lisina; e - um gene ccpA que traz uma mutação que leva a um deslo- camento (frameshift) de quadro do quadro de leitura aberta do gene CCpA localizada entre o nucleotídeo 50 e o nucleotídeo 200 da sequên- cia codificadora do gene ccpA.
[0118] Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophi- lus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção traz: - um gene glcK mutante que codifica uma glucoquinase cuja posição 144 é uma serina ou a posição 275 é uma lisina; e - um gene ccpA que traz uma mutação que leva a um deslo- camento (frameshift) de quadro do quadro de leitura aberta do gene CCpA localizada entre o nucleotídeo 100 e o nucleotídeo 150 da sequên- cia codificadora do gene ccpA.
[0119] Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophi- lus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção traz: - um gene glcK mutante que codifica uma glucoquinase cuja sequência é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 22, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 e 64 (em particular SEQ ID NO: 22 e 45); e - um gene ccpA mutante cuja sequência é selecionada a par- tir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 71, 72, 73, 74, 75 e 76 (em particular é SEQ ID NO: 71).
[0120] Além de ser caracterizada por uma proporção da atividade beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, de pelo menos 4,10, como definido no presente docu- mento, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, ne- gativa para galactose da invenção que traz de um gene glcK mutante e um gene ccpA mutante pode ser ainda caracterizada por sua capaci- dade de liberar glicose quando usada para fermentar o leite.
[0121] Assim, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose que traz uma mutação no gene glcK e uma mutação no gene ccpA da invenção é ainda caracterizada pelo fato de que a concentração de glicose em um leite fermentado com a dita cepa de Streptococcus thermophilus, como avaliado por meio do Teste B, é de pelo menos 50 mM. Em uma modalidade particular, a concen- tração de glicose em um leite fermentado com a dita cepa de Strepto- coccus thermophilus, como avaliado por meio do Teste B, é de pelo me- nos 60 mM. Em uma modalidade particular, a concentração de glicose em um leite fermentado com a dita cepa de Streptococcus thermophilus, como avaliado por meio do Teste B, é de pelo menos 70 MM. Em uma modalidade particular, a concentração de glicose em um leite fermen- tado com a dita cepa de Streptococcus thermophilus, como avaliado por meio do Teste B, é de pelo menos 80 mM. Em uma modalidade particu- lar, a concentração de glicose em um leite fermentado com a dita cepa de Streptococcus thermophilus, como avaliado por meio do Teste B, é selecionada a partir do grupo que consiste em uma concentração de pelo menos 50 mM, pelo menos 60 mM, pelo menos 70 mM e pelo me- nos 80 mM.
[0122] Os métodos detalhados acima, por um lado para obter e identificar um gene glcK mutante em uma cepa de Streptococcus ther- mophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção e,
por outro lado, para identificar um gene ccpA mutante em uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galac- tose da invenção se aplicam, da mesma forma no presente documento para obter uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lac- tose, negativa para galactose que traz uma mutação em seu gene glcK e em seu gene ccpA.
[0123] Como um exemplo, aqueles versados na técnica podem pro- ceder por meio do método a seguir para obter e identificar um gene ccpA mutante de acordo com a invenção: a) fornecer a cepa DSM32587 (com mutação em seu gene glcK); b) realizar mutagênese no gene ccpA da cepa em a), por exemplo, mutagênese aleatória ou dirigida, para obter um gene ccpA cuja sequência é diferente da sequência do gene ccpA da DSM32587 para obter uma cepa DSM32587 com ccpA mutante; c) determinar a proporção da atividade de beta-galactosi- dase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoqui- nase, como avaliado por meio do Teste E, da cepa DSM32587 com ccpA mutante obtida em b) e selecionar uma cepa DSM32587 com ccpA mutante que exibe uma proporção de pelo menos 4,10; e d) determinar, por meio do Teste B, a concentração de gli- cose em um leite fermentado com a dita cepa DSM32587 com ccpA mu- tante selecionada em c), em que: d1) uma concentração de glicose de pelo menos 50 mM sig- nifica que o gene ccpA mutante está de acordo com a invenção. Em uma modalidade, um gene ccpA mutante é considerado de acordo com a invenção quando a concentração de glicose medida na etapa d) é de pelo menos 60 mM, pelo menos 70 mM ou pelo menos 80 mM, ou d2) um aumento da concentração de glicose obtida com a dita cepa DSM32587 com ccpA mutante selecionada em c) de pelo me- nos 150% comparado com a concentração de glicose obtida com a cepa DSM32587, quando ambas são avaliadas por meio do Teste B, significa que o gene ccpA mutante está de acordo com a invenção. Em uma mo- dalidade, um gene ccpA mutante é considerado de acordo com a inven- ção quando o aumento de glicose na etapa d) é de pelo menos 200% ou pelo menos 300% da concentração de glicose da cepa DSM32587.
[0124] Em outro exemplo, aqueles versados na técnica podem pro- ceder por meio do método a seguir para obter e identificar um gene glcK mutante de acordo com a invenção: a) fornecer uma cepa DGCC7710 em que a seu gene ccpA foi substituído pelo gene ccpA mutante como definido em SEQ ID NO: 71 (ccpAniaiis-120), denominada no presente documento cepa DGCC7710-ccpAn1Aa114-120; b) realizar mutagênese no gene glcK da cepa DGCC7710- CCpAnati4-120 EM a), por exemplo, mutagênese aleatória ou dirigida, para obter um gene glcK cuja sequência é diferente da sequência do gene glcK da cepa DGCC7710-ccpAniar14-120 para obter uma cepa DGCC7710-ccpAntaris-120 com gleK mutante; c) determinar a proporção da atividade de beta-galactosi- dase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoqui- nase, como avaliado por meio do Teste E, da cepa DGCC7710- CCpAniatia-120 com glcK mutante obtida em b) e selecionar uma cepa DGCC7710-ccpAniaia-120 com glcK mutante que exibe uma proporção de pelo menos 4,108; e d) determinar, por meio do Teste B, a concentração de gli- cose em um leite fermentado com a dita cepa DGCC7710-CcpAna114-120 com glcK mutante selecionada em c), em que: d1) uma concentração de glicose de pelo menos 50 mM sig- nifica que o gene glck mutante está de acordo com a invenção. Em uma modalidade, um gene glck mutante é considerado de acordo com a in- venção quando a concentração de glicose medida na etapa d) é de pelo menos 60 mM, pelo menos 70 mM ou pelo menos 80 mM, ou d2) um aumento da concentração de glicose obtida com a dita cepa DGCC7710-ccpAniatis-120 com glcK mutante selecionada em c) de pelo menos 150%, comparado com a concentração de glicose ob- tida com cepa DGCC7710-ccpAntari4-120, quando ambas são avaliadas por meio do Teste B, significa que o gene ccpA mutante está de acordo com a invenção. Em uma modalidade, um gene ccpA mutante é consi- derado de acordo com a invenção quando o aumento da glicose na etapa d) é pelo menos 200% ou pelo menos 300% da concentração de glicose da cepa DGCC7710-ccpAnia114-120.
[0125] Neste contexto, a cepa DGCC7710-ccpAniaii4-120 É a cepa DGCC7710 em que a seu gene ccpA foi substituído pelo gene ccpA como definido em SEQ ID NO: 71.
[0126] Uma vez identificado, um gene glcK mutante e/ou um gene ccpA mutante - como identificado no presente documento - pode ser in- troduzido em vez do gene glcK e/ou do gene ccpA de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galac- tose para obter uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção.
IV. Uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção que traz uma mutação em seu gene lacZ
[0127] A invenção é dirigida a uma cepa de Streptococcus ther- mophilus positiva para lactose, negativa para galactose que traz uma mutação no gene lacZ que codifica uma beta-galactosidase (que hidro- lisa a lactose em galactose e glicose), em que a proporção da atividade de beta-galactosidase na dita a cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, é de pelo menos 4,108, como definido no presente documento.
[0128] Qualquer mutação é apropriada, em particular, qualquer mu- tação que aumente a atividade de hidrólise da lactose (isto é, atividade de beta-galactosidase) da dita beta-galactosidase comparado com a cepa correspondente sem mutação no gene lacZ. Uma mutação do gene lacZ também pode ser identificada através da mutação do gene lacZ da cepa DGCC7710 para obter uma cepa DGCC7710 com lacZ mutante e comparar a atividade beta-galactosidase na dita cepa DGCCT7710 com lacZ mutante com a atividade beta-galactosidase na cepa DGCC7710, em particular quando ambas as cepas foram avalia- das por meio do Teste D. Assim, uma mutação /acZ de acordo com a invenção pode ser obtida e identificada por meio do método a seguir: a) fornecer a cepa DGCC7710; b) realizar mutagênese no gene lacZ para obter um gene lacZ cuja sequência é diferente da sequência do /lacZ de DGCC7710 para obter uma cepa DGCC7710 com lacZ mutante; c) determinar a atividade de beta-galactosidase na cepa DGCC7710 com lacZ mutante obtida em b) e de forma independente da cepa DGCC7710, ambas por meio do Teste D, em que a atividade de beta-galactosidase na cepa DGCC7710 com lacZ mutante é mais ele- vada do que a atividade de beta-galactosidase na cepa DGCC7710 sig- nifica que o gene lacZ é mutante de acordo com a invenção. Por "ativi- dade de beta-galactosidase mais elevada" entenda-se que a atividade de beta-galactosidase cepa DGCC7710 com lacZ mutante como obtido em b) é pelo menos 150%, pelo menos 200% ou pelo menos 300% maior do que a atividade de beta-galactosidase na cepa DGCC7710, quando ambas foram avaliadas por meio do Teste D.
[0129] Uma vez identificado, o gene /lacZ mutante de acordo com a invenção pode ser introduzido em vez do gene lacZ de uma cepa de
Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galac- tose para conceber uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção.
[0130] Assim, embora duas cepas de Streptococcus thermophi- lus possam diferir quanto à sequência de seu respectivo gene /acZ, isto não significa necessariamente que um destes dois genes /acZ seja mu- tante no sentido da invenção. Na verdade, não são consideradas muta- ções na presente invenção: - variações ao nível de nucleotídeos que levam a uma alte- ração no nível de proteína, mas em que esta alteração não tem impacto sobre a atividade de beta-galactosidase da beta-galactosidase resul- tante, como definido no presente documento. Na verdade, estas varia- ções podem ser observadas ao nível do gene lacZ de cepa de Strepto- coccus thermophilus da invenção sem afetar o escopo da proteção.
[0131] Exemplos não limitativos de genes /acZ que não são consi- derados como mutantes no sentido da invenção são: - o polinucleotídeo que codifica a beta-galactosidase como definido em SEQ ID NO: 7 8 (tipo Beta-Gal ST1), em particular o polinu- cleotídeo como definido em SEQ ID NO: 77; este tipo de Beta-Gal é aquele da cepa DGCC7710; - o polinucleotídeo de /acZ que codifica a beta-galactosi- dase, como definido em SEQ ID NO: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108 e 110 (Beta-Gal de tipo ST2 a ST1 3), em particular os polinucleotídeo de /acZ de acordo com SEQ ID NO: 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107 e 109. A sequência das beta-galactosidases, como definido em SEQ ID NO: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108 e 110, são 98,9 a 99,9% idênticas à SEQ ID NO: 78.
[0132] Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophi- lus da invenção não traz uma mutação selecionada a partir do grupo que consiste em uma mutação que leva ao silenciamento do gene lacZ e a grandes eliminações no gene lacZ.
[0133] Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophi- lus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção traz uma mutação em uma sequência regulatória, em particular no promotor, do gene lacZ que leva à superexpressão transcricional do gene lacZ. Exemplos não limitativos de sequências promotoras que podem sofrer mutação dentro da invenção são descritos nos nucleotídeos 1 a 126 dos genes lacZ, como definido em SEQ ID NO: 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107 e 109.
[0134] Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophi- lus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção traz uma mutação na sequência codificadora do gene /acZ que leva à substitui- ção de um aminoácido na beta-galactosidase, tal como uma atividade de beta-galactosidase aumentada, como definido no presente docu- mento. Em uma modalidade, a dita substituição não leva a uma beta- galactosidase truncada. Exemplos não limitativos de sequências codifi- cadoras de lacZ que podem sofrer mutação dentro da invenção são descritos nos nucleotídeos 127 a 3231 dos genes lacZ, como definido em SEQ ID NO: 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107 e 109.
[0135] São fornecidas para aqueles versados na técnica, nesta parte do pedido, orientações adicionais sobre como obter e identificar mutações do gene lacZ. Com base na proporção definida acima [ativi- dade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E] juntamente com uma cepa de referência definida no presente documento, aqueles versados na técnica saberão como identificar um gene lacZ mutante de acordo com a invenção e obter uma cepa de Streptococcus thermophilus da invenção.
[0136] Assim, aqueles versados na técnica podem proceder por meio do método a seguir: a) fornecer uma cepa de Streptococcus thermophilus cujo gene lacZ é um definido em SEQ ID NO: 77 como a cepa DGCC7710; b) realizar mutagênese no gene lacZ, por exemplo, mutagê- nese aleatória ou dirigida, para obter um gene lacZ cuja sequência é di- ferente da sequência do gene /acZ da cepa em a); c) inserir o gene lacZ obtido em b) em vez do gene lacZ da cepa DGCC7710 para obter um derivado de DGCC7710; d) determinar a proporção da atividade beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, do dito derivado de DGCC7710, em que uma proporção de pelo menos 4,10, como definido no presente documento, significa que o gene lacZ inserido é um gene /acZ mutante de acordo com a invenção. Em uma modalidade particular, um gene lacZ mutante é considerado de acordo com a invenção quando a pro- porção da atividade beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, da dita cepa derivada de DGCC7710 é pelo menos 5,10, pelo menos 6,10, pelo menos 7,10 ou pelo menos 8,108. Em uma modali- dade, a dita proporção é menor do que 8,10?.
[0137] Em uma modalidade, aqueles versados na técnica podem proceder por meio do método a seguir: a) forneça uma cepa de Streptococcus thermophilus, a se- quência promotora do gene lacZ de que h é como definido nos nucleo- tídeos 1 a 126 de SEQ ID NO: 77 como a cepa DGCC7710; b) realizar mutagênese no gene lacZ, por exemplo, mutagê- nese aleatória ou dirigida, para obter uma sequência promotora do gene lacZ cuja sequência é diferente da sequência promotora do gene lacZ da cepa em a);
c) inserir o gene lacZ mutante no promotor obtido em b) em vez do promotor do gene lacZ da cepa DGCC7710 para obter um deri- vado de DGCC7710; d) determinar a proporção da atividade de beta-galactosi- dase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoqui- nase, como avaliado por meio do Teste E, do dito derivado de DGCC7710, em que uma proporção de pelo menos 4,10 $, como defi- nido no presente documento significa que o promotor inserido do gene lacZ é um promotor mutante do gene lacZ de acordo com a invenção. Em uma modalidade particular, um promotor mutante do gene /acZ é considerado de acordo com a invenção quando a proporção da ativi- dade beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, da dita cepa derivada DGCC7710, é pelo menos 5,108, pelo menos 6,10, pelo menos 7,10 ou pelo menos 8,10º. Em uma modalidade, a dita propor- ção é menor do que 8,10*.
[0138] Uma vez identificado, um gene lacZ mutante, em particular um promotor mutante do gene lacZ - como identificado no presente do- cumento - pode ser introduzido em lugar do gene /acZ, em particular em lugar do promotor do gene lacZ, de uma cepa de Streptococcus ther- mophilus positiva para lactose, negativa para galactose para obter uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção.
V. Umacepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção que traz uma mutação em seu gene ptsH
[0139] Ainvenção é dirigida a uma cepa de Streptococcus ther- mophilus positiva para lactose, negativa para galactose que traz uma mutação no gene ptsH que codifica a proteína HPr, em que a proporção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a glucoquinase a atividade na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, é de pelo menos 4,10, como definido no presente documento.
[0140] Qualquer mutação é apropriada, contanto que a atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, seja pelo menos 4,10, como definido no presente docu- mento.
[0141] Assim, embora duas cepas de Streptococcus thermophi- lus possam diferir quanto à sequência dos seus respectivos genes ptsH, isto não significa necessariamente que um destes dois genes ptsH seja mutante no sentido da invenção. Na verdade, não são consideradas mu- tações na presente invenção: - variações ao nível de nucleotídeos que levam a uma alte- ração no nível de proteína, mas em que esta alteração não afeta a ati- vidade da proteína HPr resultante. Na verdade, estas variações podem ser observadas ao nível do gene ptsH da cepa de Streptococcus ther- mophilus da invenção sem afetar o escopo da proteção.
[0142] Exemplos não limitativos de genes ptsH que não são consi- derados como mutantes no sentido da invenção são: - o polinucleotídeo que codifica a proteína HPr como definido em SEQ ID NO: 112 (HPr tipo ST1), em particular o polinucleotídeo como definido em SEQ ID NO: 111; este tipo de HPr é aquele da cepa DGCC7710; - o polinucleotídeo de ptsH que codifica a proteína HPr como definido em SEQ ID NO: 114, 116, 118 e 120 (HPr tipos ST2 a 5), em particular o polinucleotídeo como definido em SEQ ID NO: 113, 115, 117 e 119. A sequência de proteínas HPr como definido em SEQ ID NO: 114, 116, 118 e 120 é de 96,5 a 98,8% idêntica à SEQ ID NO: 112.
[0143] Em uma modalidade, a mutação do gene ptsH não é uma mutação que leva ao silenciamento (isto é, a ruptura completa) do gene ptsH.
[0144] Em uma modalidade, a mutação é introduzida na sequência codificadora do gene ptsH.
[0145] Em uma modalidade, a mutação é uma mutação na sequên- cia codificadora do gene ptsH que leva a uma proteína HPr truncada. Qualquer que seja a posição do truncamento, a mutação introduzida no gene ptsH é uma substituição de nucleotídeos que leva a um códon TERMINAL ou uma eliminação, inserção ou eliminação/inserção que leva a um deslocamento (frameshift) de quadro do quadro de leitura aberta e um códon TERMINAL prematuro. Em uma modalidade, a mu- tação introduzida no gene ptsH é uma substituição de nucleotídeos que leva a um códon TERMINAL. Em uma modalidade, a mutação introdu- zida no gene ptsH é uma eliminação, inserção ou eliminação/inserção que leva a um deslocamento (frameshift) de quadro do quadro de leitura aberta e um códon TERMINAL prematuro.
[0146] Em uma modalidade, a mutação é uma mutação na sequên- cia codificadora do gene ptsH que leva à substituição de um aminoácido por outro aminoácido.
[0147] São fornecidas para aqueles versados na técnica, nesta parte do pedido, orientações adicionais sobre como obter e identificar mutações do gene ptsH. Com base na proporção definida acima [ativi- dade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E] juntamente com uma cepa de referência definida no presente documento, aqueles versados na técnica saberão como identificar um gene ptsH mutante de acordo com a invenção e obter uma cepa de Streptococcus thermophilus da invenção.
[0148] Assim, aqueles versados na técnica podem proceder por meio do método a seguir:
a) fornecer uma cepa de Streptococcus thermophilus cujo gene ptsHé como definido em SEQ ID NO: 111 como a cepa DGCC7710; b) realizar mutagênese no gene ptsH, por exemplo, mutagê- nese aleatória ou dirigida, para obter um gene ptsH cuja sequência é diferente da sequência do gene ptsH da cepa em a); c) inserir o gene ptsH obtido em b) em vez do gene ptsH da DGCC77 cepa 10 para obter um derivado de DGCC7710; e d) determinar a proporção da atividade beta-galactosidase, como avaliada por meio do Teste D, para a atividade glucoquinase, como avaliada por meio do Teste E, do dito derivado de DGCC7710, em que uma proporção de pelo menos 4,108, como definido no presente documento, significa que o gene ptsH inserido é um gene ptsH mutante de acordo com a invenção. Em uma modalidade particular, um gene bptsH mutante é considerado de acordo com a invenção quando a pro- porção da atividade beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, do dito derivado de DGCC7710 é pelo menos 5,10, pelo me- nos 6,108, pelo menos 7,10 ou pelo menos 8,10%. Em uma modali- dade, a dita proporção é menor do que 8,10?.
[0149] Uma vez identificado, um gene ptsH mutante - como identifi- cado no presente documento - pode ser introduzido em vez do gene bptsH de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose para obter uma cepa de Streptococcus ther- mophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção.
Vl. Uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção, de acordo com qualquer uma das modalidades de | a V, que traz ainda uma muta- ção em um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose
[0150] Além de qualquer uma das mutações descritas acima, como tal ou combinadas, os inventores mostraram que mutações adicionais de genes nas cepas de Streptococcus thermophilus positivas para lac- tose, negativas para galactose da invenção aumentam significativa- mente o nível de liberação de glicose durante fermentação de laticí- nios. Os inventores mostraram que a introdução de um gene mutante que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em particular um gene manL mutante, um gene manM mutante ou um gene manN mutante, em uma cepa de Streptococcus thermophilus como de- finido em | a V acima, leva a uma sinergia com relação à liberação de glicose, isto é, a concentração de glicose liberada é muito maior do que a adição da concentração de glicose liberada usando uma cepa de Streptococcus thermophilus como definido em | a V acima e a con- centração de glicose liberada usando uma cepa de Streptococcus ther- mophilus que sofreu mutação apenas no dito gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose.
[0151] Assim, a invenção é dirigida a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose selecionada a partir do grupo que consiste em uma cepa de Streptococcus ther- mophilus positiva para lactose, negativa para galactose, como definido em |, uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose, como definido em Il, uma cepa de Streptococ- cus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose, como definido em Ill, uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose, como definido em IV e uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para ga- lactose, como definido em V, a qual tem ainda uma mutação em um ou mais genes, em particular um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose. Em uma modalidade, o gene que codi- fica uma proteína do PTS específico para manose-glicose é o gene manL, o gene manM, o gene manN ou o gene manO. Em uma modali- dade, o gene que codifica uma proteína do PTS específico para ma- nose-glicose é o gene manL, o gene manM, o gene manL ou o gene manO. Em uma modalidade, o gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose é o gene manL, o gene manMou o gene manN.
[0152] Por "mutante/mutação em um ou mais genes, em particular genes que codificam uma proteína do PTS específico para manoser-gli- cose", entenda-se que a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose traz uma mutação em um, dois ou três genes selecionados a partir do grupo que consiste no gene manL, no gene manM, no gene manN e no gene manO. Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose traz uma mutação em um, dois ou três genes seleciona- dos a partir do grupo que consiste no gene manL, o gene manM e o gene manN. Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophi- lus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção traz uma mutação em manL. Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus ther- mophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção traz uma mutação em manM. Em uma modalidade, a cepa de Strepto- coccus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção traz uma mutação em manN. Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para ga- lactose da invenção traz uma mutação em manL e uma mutação em manM. Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus po- sitiva para lactose, negativa para galactose da invenção traz uma muta- ção em manL e uma mutação em manN. Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para ga- lactose da invenção traz uma mutação em manMe uma mutação em manN. Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophi- lus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção traz uma mutação em manL, uma mutação em manM e uma mutação em manN.
[0153] Em uma modalidade, a invenção é dirigida a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galac- tose que traz uma mutação no gene glcK que codifica uma glucoqui- nase cuja atividade de glucoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento, e traz uma mutação em um ou mais genes, em particular um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em que a propor- ção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, é pelo menos 4,10, como definido no presente documento. Em uma modalidade, o um ou mais genes, em particular o gene, que codifica uma proteína do PTS específico para ma- nose-glicose é o gene manL, o gene manM e/ou o gene manN.
[0154] Em uma modalidade, a invenção é dirigida a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galac- tose que traz uma mutação no gene ccpA, como definido no presente documento, e traz uma mutação em um ou mais genes, em particular um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose- glicose, em que a proporção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoqui- nase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, é de pelo menos 4,108, como definido no presente documento. Em uma modalidade, o um ou mais genes, em particular o gene, que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose é o gene manL, o gene manM e/ou o gene manN.
[0155] Em uma modalidade, a invenção é dirigida a uma cepa de
Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galac- tose que traz uma mutação no gene glcK que codifica uma glucoqui- nase cuja atividade de glucoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento, traz uma mutação em seu gene ccpA, como definido no presente docu- mento, e traz uma mutação em um ou mais genes, em particular um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em que a proporção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, é pelo menos 4,10, como definido no presente documento. Em uma modalidade, o um ou mais genes, em particular o gene que codifica uma proteína do PTS es- pecífico para manose-glicose é o gene manL, o gene manM e/ou o gene manN.
[0156] Em uma modalidade, a invenção é dirigida a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galac- tose que traz uma mutação no gene lacZ, como definido no presente documento, e traz uma mutação em um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em que a proporção da ativi- dade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, é de pelo menos 4,10, como definido no presente documento. Em uma modalidade, o um ou mais genes, em particular o gene, que codifica uma proteína do PTS específico para manose-gli- cose é o gene manL, o gene manM e/ou o gene manN.
[0157] Em uma modalidade, a invenção é dirigida a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galac- tose que traz uma mutação no gene ptsH, como definido no presente documento, e traz uma mutação em um gene que codifica uma proteína
TA4/174 do PTS específico para manose-glicose, em que a proporção da ativi- dade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, é de pelo menos 4,10, como definido no presente documento. Em uma modalidade, o um ou mais genes, em particular o gene, que codifica uma proteína do PTS específico para manose-gli- cose é o gene manL, o gene manM e/ou o gene manN.
[0158] Em relação à mutação/mutações no gene glcK, no gene CcCcpA, na combinação do gene glcK e o gene ccpA, no gene lacZ ou no gene písH, qualquer das modalidades descritas acima sob | a V se aplica de forma similar à cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose que traz ainda uma mutação em um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose- glicose da invenção, contanto que a cepa de Streptococcus thermophi- lus positiva para lactose, negativa para galactose obtida tenha uma pro- porção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, de pelo menos 4,10, como definido no presente documento
[0159] Em relação à mutação em um gene que codifica uma prote- ína do PTS específico para manose-glicose, qualquer mutação é apro- priada, em particular qualquer mutação que reduz ou elimina a importa- ção de glicose do meio para as bactérias. Esta mutação pode ser obtida e identificada através da introdução de um gene que codifica uma pro- teína do PTS específico para manose-glicose em qualquer uma das ce- pas da invenção descritas acima sob | a V e ao determinar, por meio do Teste B, a concentração de glicose no leite fermentado com a dita cepa, em que um aumento da concentração de glicose comparado com a cepa da invenção de | a V significa que o gene que codifica uma proteína do
PTS específico para manose-glicose é mutante de acordo com a inven- ção.
[0160] Em uma modalidade, a mutação do gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glucose, em particular do gene manL, gene manM ou gene manL, é uma mutação que leva ao silenci- amento (isto é, a interrupção completa) do gene.
[0161] Em uma modalidade, a mutação do gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glucose, em particular do gene manL, gene manM ou gene manL, é uma mutação do promotor do gene, em particular uma mutação em um determinado do promotor do gene que reduz ou inibe a transcrição do gene.
[0162] Em uma modalidade, a mutação do gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glucose, em particular do gene manL, gene manM ou gene manL, é uma mutação introduzida na se- quência codificadora do gene, em particular uma mutação que leva à redução ou eliminação da atividade de importação de glicose da prote- ína codificada pelo gene mutante, em particular à redução ou elimina- ção da atividade de importação de glicose da proteína IIABYa", prote- Ína IICMº" ou proteína IIDVYar,
[0163] Em uma modalidade, a mutação do gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em particular do gene manL, gene manM ou gene manL, é uma mutação na sequência codifi- cadora do gene que leva a uma proteína truncada, em particular uma proteína IIABY*" truncada, uma proteína IICY*" truncada ou uma prote- ína IIDYa" truncada, respectivamente, em particular uma proteína trun- cada (tal como uma proteína IIABYº*" truncada, uma proteína IICYa" trun- cada ou uma proteína IIDVYº" truncada) que tem uma atividade de impor- tação de glicose reduzida ou eliminada. Qualquer que seja a posição do truncamento, a mutação introduzida no gene é uma substituição de nu-
cleotídeos que leva a um códon TERMINAL ou uma eliminação, inser- ção ou eliminação/inserção que leva a um deslocamento (frameshift) de quadro do quadro de leitura aberta e um códon TERMINAL prematuro. Em uma modalidade, a mutação introduzida no gene é uma substituição de nucleotídeos que leva a um códon TERMINAL. Em uma modalidade, a mutação introduzida no gene é uma eliminação, inserção ou elimina- ção/inserção que leva a um deslocamento (frameshift) de quadro do quadro de leitura aberta e um códon TERMINAL prematuro.
[0164] Embora duas cepas de Streptococcus thermophilus possam diferir quanto à sequência dos seus respectivos genes manL, manM ou manL, isto não significa necessariamente que um destes genes seja mutante no sentido da invenção. Na verdade, não são consideradas mu- tações do gene do gene manL, manM ou manL, dentro da presente in- venção: - variações ao nível de nucleotídeos que não levam a ne- nhuma alteração no nível de proteína (variação silenciosa) e que não afetam a tradução do RNA de manL, manM ou manL; - variações ao nível de nucleotídeos que levam a uma alte- ração no nível de proteína, mas em que esta alteração não leva a uma diminuição ou eliminação da atividade de importação de glicose da pro- teína do PTS específico para manose-glicose; e - variações ao nível de nucleotídeos que levam a uma alte- ração no nível de proteína, mas em que esta alteração não permite au- mentar o nível de liberação de glicose quando introduzida em qualquer uma das cepas da invenção de | a V descritas acima.
[0165] Exemplos não limitativos de genes manL, manMe manN (que codificam, respectivamente a proteína IIABYº": a proteína IICY*" e a proteína IIDYº") que não são considerados como mutantes no sentido da invenção são os seguintes:
TTIINTA
- o polinucleotídeo que codifica a proteína IIABYº" como de- finido em SEQ ID NO: 122 (IIABY* tipo ST1), em particular o polinucle- otídeo como definido em SEQ ID NO: 121; este tipo de IIABYº" é aquele da cepa DGCC7710;
- o polinucleotídeo de manL que codifica, respectivamente a proteína IIABYº", como definido em SEQ ID NO: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152 e 154 (IIABYº tipo ST2 a ST17), em particular o polinucleotídeo como definido em SEQ ID NO: 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 13 7, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151 e 153. A sequência da proteína IIABYº*" como definido em SEQ ID NO: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152 e 154 é 98,4 a 99,6% idêntica à SEQ ID NO: 122;
- o polinucleotídeo que codifica a proteína IICMº" como defi- nido em SEQ ID NO: 174 (IICY*" tipo ST1), em particular o polinucleotí- deo como definido em SEQ ID NO: 173; este tipo de IICYº*" é aquele da cepa DGCC7710;
- o polinucleotídeo de manM que codifica, respectivamente a proteína IICYº" como definido em SEQ ID NO: 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 190, 192, 194, 196, 198 e 200 (II/CY*" tipo ST2 a ST1 4), em particular o polinucleotídeo como definido em SEQ ID NO: 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197 e 199. A sequência da proteína IICYº", como definido em SEQ ID NO: 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198 e 200, é 98,5 a 99,6% idêntica à SEQ ID NO: 174;
- o polinucleotídeo que codifica a proteína IIDYº" como defi- nido em SEQ ID NO: 211 (IIDY*" tipo ST1), em particular o polinucleotí- deo como definido em SEQ ID NO: 210; este tipo de IIDVº*" é aquele da cepa DGCC7710;
- o polinucleotídeo de manL que codifica, respectivamente, a proteína IIDYº" como definido em SEQ ID NO: 213, 215, 217, 219, 221,
223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 2467 e 249 (IIDVYa" tipo ST2 a ST20), em particular o polinucleotídeo como defi- nido em SEQ ID NO: 212, 214, 216, 218, 22 O, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246 e 248. A sequência da prote- ína IIDMºº, como definido em SEQ ID NO: 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247 e 249 é 97,3 a 99,6% idêntica à SEQ ID NO: 210.
[0166] Os inventores identificaram pelo menos uma mutação no gene manL a qual, quando inserida no gene manL de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galac- tose precursora [com mutação no gene glcK, no gene ccpA, tanto no gene glcK como no gene ccpA, no gene lacZ ou no gene ptsH e com uma proporção da atividade beta-galactosidase na dita cepa, como ava- liado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, da cepa de pelo menos 4,10" 6, como definido no presente documento, tal como qualquer uma das cepas da invenção em | a V descritas acima], permite aumentar a con- centração de glicose comparado com a cepa precursora, quando avali- ado por meio do Teste B.
[0167] Assim, a invenção é dirigida a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose que tem uma mutação no gene glcK, no gene ccpA, tanto no gene glcK como no gene ccpA, no gene lacZ ou no gene ptsH, e um mutação no gene manL, em que a proporção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoqui- nase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, é de pelo menos 4,108, como definido no presente documento. Em uma modalidade, a mutação no gene manL leva ao truncamento da proteína IIABYº" na po- sição 305. Em uma modalidade, a mutação no gene manL é a substitui ção do nucleotídeo G no nucleotídeo T na posição 916 (que leva a um códon TERMINAL na posição 306). Uma proteína IIABY*" de Strep- tococcus thermophilus truncada na posição 305 é denominada no pre- sente documento como IIABYº"395.
[0168] Em uma modalidade, a sequência da dita proteína I/!ABYan truncada na posição 305 é selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma sequência como definido em SEQ ID NO: 156; e b) uma sequência variante de IIABYº" que tenha pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 156, em particular, tem 305 aminoácidos de comprimento.
[0169] Para a definição da variante IJABYº" que tenha pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 156, a similaridade ou identidade é calculada no presente documento ao longo de todo o comprimento das 2 sequências após alinhamento ideal [isto é, número de resíduos de aminoácidos similares ou idênticos nas partes alinha- das das sequências]. Em uma modalidade, a sequência variante de |l- ABY*" tem pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de similari- dade ou identidade com SEQ ID NO: 156. Em uma modalidade, a se- quência variante de IIABY*"tem pelo menos 95% de similaridade ou identidade à SEQ ID NO: 156. Em uma modalidade, a sequência vari- ante de I!ABYº" tem pelo menos 97% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 156. Em uma modalidade, a sequência variante de IIAB- Mantem pelo menos 98% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO:
156.
[0170] Em uma modalidade particular, a sequência variante de IIA- BMan difere de SEQ ID NO: 156 por 1 a 30 substituições de aminoácidos. Em uma modalidade particular, a sequência variante de IIABVº" difere de SEQ ID NO: 156 por 1 a 20 substituições de aminoácidos. Em uma modalidade particular, a sequência variante de I!ABY?" difere de SEQ ID NO: 156 por 1 a 15 substituições de aminoácidos. Em uma modalidade particular, a sequência variante de I/ABVY?" difere de SEQ ID NO: 156 por 1 a 10 substituições de aminoácidos. Em uma modalidade particular, a sequência variante de IIABVYº" difere de SEQ ID NO: 156 por 1,2,3,4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições de aminoácidos. Em uma modalidade, a sequência da proteína I!ABYº*" da cepa de Streptococcus thermophi- lus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção é seleci- onada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 156 a 172.
[0171] Em uma modalidade, o gene manL portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção codifica uma proteína IIABMº" cuja sequência é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 156 e qualquer sequência variante de II!ABY?*" que tem pelo menos 90% similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 156, como definido no presente documento (em particular SEQ ID NO: 157 a 172). Em uma modalidade, o gene manL portado pela cepa de Streptococcus ther- mophilus da invenção é como definido em SEQ ID NO: 155.
[0172] Os inventores identificaram pelo menos uma mutação no gene manM a qual, quando inserida no gene manL de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galac- tose precursora [com mutação no gene glcK, no gene ccpA, tanto no gene glcK quanto no gene ccpA, no gene lacZ ou no gene ptsH e com uma proporção da atividade beta-galactosidase na dita cepa, como ava- liado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, da cepa de pelo menos 4,10 6 como definido no presente documento, tal como qualquer uma das cepas da invenção descritas em | a V acima], permite aumentar a con- centração de glicose comparado com a cepa precursora, quando testa- das por meio do Teste B.
[0173] Assim, a invenção é dirigida a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose que traz uma mutação no gene glcK, no gene ccpA, tanto no gene glcK como no gene ccpA, no gene lacZ ou no gene ptsH e uma mutação no gene manM, em que a proporção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoqui- nase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, é de pelo menos 4,108, como definido no presente documento. Em uma modalidade, a mutação no gene manM leva ao truncamento da proteína IICYº*" na po- sição 208. Em uma modalidade, a mutação no gene manM é a substi- tuição do nucleotídeo G no nucleotídeo T na posição 625 (que leva a um códon TERMINAL na posição 209). Uma proteína IICY*" da cepa de Streptococcus thermophilus truncada na posição 208 é denominada no presente documento como IICY*"298.
[0174] Em uma modalidade, a sequência da dita proteína I/CMan truncada na posição 208 é selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma sequência como definido em SEQ ID NO: 202; e b) uma sequência variante de IICYº" que tenha pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 202, em particular tem 208 aminoácidos de comprimento.
[0175] Para a definição da variante II/CYº" que tem pelo menos 90% de identidade ou identidade similar com SEQ ID NO: 202, a similaridade ou identidade é calculada no presente documento ao longo de todo o comprimento das 2 sequências após alinhamento ideal [isto é, número de resíduos de aminoácidos similares ou idêntico nas partes alinha- das das sequências]. Em uma modalidade, a sequência variante de IICY&" tem pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de similari- dade ou identidade com SEQ ID NO: 202. Em uma modalidade, a se- quência variante de IICYº*" tem pelo menos 95% de similaridade ou iden- tidade com SEQ ID NO: 202. Em uma modalidade, a sequência variante de IICM*" tem pelo menos 97% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 202. Em uma modalidade, a sequência variante de IICYº" tem pelo menos 98% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 202.
[0176] Em uma modalidade particular, a sequência variante de II/CVYan difere de SEQ ID NO: 202 por 1 a 30 substituições de aminoáci- dos. Em uma modalidade particular, a sequência variante de IICY*" di- fere de SEQ ID NO: 202 por 1 a 20 substituições de aminoácidos. Em uma modalidade particular, a sequência variante de IICVY*" difere de SEQ ID NO: 202 por 1 a 15 substituições de aminoácidos. Em uma mo- dalidade particular, a sequência variante de IICYº" difere de SEQ ID NO: 202 por 1 a 10 substituições de aminoácidos. Em uma modalidade par- ticular, a sequência variante de IICYº*" difere de SEQ ID NO: 202 por substituições de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos. Em uma modalidade, a sequência da proteína IICYº" da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 202 a
209.
[0177] Em uma modalidade, o gene manM portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção codifica uma proteína IICYan cuja sequência é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 202 e qualquer sequência variante de IICYº" que tem pelo menos 90% similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 202, como definido no presente documento (em particular SEQ ID NO: 203 a 209). Em uma modalidade, o gene manM portado pela cepa de Streptococcus ther- mophilus da invenção é como definido em SEQ ID NO: 201.
[0178] Os inventores identificaram pelo menos uma mutação no gene manL a qual, quando inserida no gene manL de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para ga- lactose precursora [com mutação no gene glcK, no gene ccpA, tanto no gene glcK como no gene ccpA, no gene lacZ ou no gene ptsH e que tem uma proporção da atividade beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, da cepa de pelo menos 4.10" 6, como definido no presente documento, tal como qualquer uma das cepas da invenção descritas em | a V acima], permite aumentar a con- centração de glicose, comparado com a cepa precursora, quando tes- tadas por meio do Teste B.
[0179] Assim, a invenção é dirigida a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose que traz uma mutação no gene glcK, no gene ccpA, tanto no gene glcK como no gene ccpA, no gene lacZ ou no gene ptsH e uma mutação no gene manL, em que a proporção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoqui- nase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, é de pelo menos 4,108, como definido no presente documento. Em uma modalidade, a mutação no gene manL leva ao truncamento da proteína IIDYº" na posi- ção 28. Em uma modalidade, a mutação no gene manL é uma inserção de um nucleotídeo A no trecho de 5 nucleotídeos A nas posições 37- 41 (que leva a um trecho de 6 nucleotídeos A, um deslocamento (fra- meshift) de quadro e um truncamento da proteína IIDYº" na posição 28). Esta proteína IIDYº" de Streptococcus thermophilus truncada na posição 28 é denominada no presente documento como IIDYº">2g,
[0180] Em uma modalidade, a sequência da dita proteína IIDYa" truncada na posição 28 é selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma sequência como definido em SEQ ID NO: 251; e b) uma | sequência variante de IDY*" que tenha pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 251, em particu- lar 28 aminoácidos de comprimento.
[0181] Para a definição da variante de IIDYº" que tenha pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 251, a similaridade ou identidade é calculada no presente documento ao longo de todo o comprimento das 2 sequências após alinhamento ideal [isto é, número de resíduos de aminoácidos similares ou idênticos nas partes alinha- das das sequências]. Em uma modalidade, a sequência variante de 1ID- Man tem pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 251. Em uma modalidade, a sequência variante de IIDYº" tem pelo menos 95% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 251. Em uma modalidade, a sequência variante de IIDMº" tem pelo menos 96% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 251. Em uma modalidade, a sequência variante de IIDYº" tem pelo menos 97% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 251.
[0182] Em uma modalidade particular, a sequência variante de IID- Man difere de SEQ ID NO: 251 por 1 a 10 substituições de aminoácidos. Em uma modalidade particular, a sequência variante de IIDY*" difere de SEQ ID NO: 251 por 1,2, 3,4, 5,6,7,8, 9 ou 10 substituições de ami- noácidos. Em uma modalidade, a sequência da proteína IIDVYº" da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para ga- lactose da invenção é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 251 a 255.
[0183] Em uma modalidade, o gene manL portado pela cepa Strep- tococcus thermophilus da invenção codifica uma proteína IIDYº" cuja se- quência é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 251 e qualquer sequência variante de IIDY*" que tenha pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 251, como definido no presente documento (em particular SEQ ID NO: 252 a 255). Em uma modalidade, o gene manL portado pela cepa de Streptococcus ther- mophilus da invenção é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 250.
[0184] Além de ser caracterizada por uma proporção da atividade beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, de pelo menos 4,10, como definido no presente docu- mento, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, ne- gativa para galactose da invenção que sofreu ainda mutação em um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose (definido em VI no presente documento) pode ser ainda caracterizada por sua capacidade de liberar glicose quando usada para fermentar o leite.
[0185] Assim, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose que sofreu ainda mutação em um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose (de- finida em VI no presente documento) é ainda caracterizada pelo fato de que a concentração de glicose em um leite fermentado com a dita cepa de Streptococcus thermophilus, como avaliado por meio do Teste B, é de pelo menos 80 mM. Em uma modalidade particular, a concentração de glicose em um leite fermentado com a dita cepa de Streptococcus thermophilus, como avaliado por meio do Teste B, é de pelo menos 90 mM. Em uma modalidade particular, a concentração de glicose em um leite fermentado com a dita cepa de Streptococcus thermophilus, como avaliado por meio do Teste B, é de pelo menos 100 mM. Em uma modalidade particular, a concentração de glicose em um leite fermen- tado com a dita cepa de Streptococcus thermophilus, como avaliado por meio do Teste B, é selecionada a partir do grupo que consiste em uma concentração com pelo menos 80 mM, pelo menos 90 mM e pelo menos 100 mM.
[0186] Qualquer método pode ser usado para identificar uma muta- ção em um gene que codifica uma proteína do PTS específico para ma- nose-glicose, em particular no gene manL, gene manM ou gene manL adequada dentro da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção.
[0187] Como um exemplo para obter e identificar uma mutação apropriada no gene manL, gene manM ou gene manL, aqueles versa- dos na técnica podem proceder por meio do método a seguir: a) fornecer a cepa DSM32587 (com mutação em seu gene glcK) b) realizar mutagênese no gene manL, manM ou manN da cepa em a), por exemplo, mutagênese aleatória ou dirigida, para obter um gene manL, manM ou manN cuja sequência é diferente da sequên- cia do gene manL, manM ou manN de DSM 32587 para obter uma cepa DSM32587 com man mutante; c) determinar a proporção da atividade de beta-galactosi- dase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoqui- nase, como avaliado por meio do Teste E, da cepa DSM32587 com man mutante obtida em b) e selecionar uma cepa DSM32587 com man mu- tante que exibe uma proporção de pelo menos 4,10, como definido no presente documento; e d) determinar, por meio do Teste B, a concentração de gli- cose em um leite fermentado com a dita cepa DSM32587 com man mu- tante selecionada em c), em que: d1) uma concentração de glicose de pelo menos 80 mM sig- nifica que o gene manL, manM ou manN mutante está de acordo com a invenção. Em uma modalidade, um gene manL, manM ou manN mu- tante é considerado de acordo com a invenção quando a concentração de glicose medida na etapa d) é de pelo menos 90 mM ou pelo menos 100 mM, ou d2) um aumento na concentração de glicose obtida com a cepa DSM32587 com man mutante selecionada em c) comparado com a cepa DSM32587, significa que o gene manL, manM ou manN mu- tante está de acordo com a invenção.
[0188] Alternativamente, aqueles versados na técnica podem pro- ceder por meio do método a seguir:
a) fornecer uma cepa DGCC7710 em que seu gene ccpA foi substituído pelo gene ccpA mutante como definido em SEQ ID NO: 71 (DGCC7710-ccpAniatia120), denominada no presente documento cepa DGCC7710-CcpAn1Aa114-120; b) realizar mutagênese no gene manL, manM ou manN da cepa em a), por exemplo, mutagênese aleatória ou dirigida, para obter um gene manL, manM ou manN cuja sequência é diferente da sequên- cia do gene manL, manM ou manN da cepa DGCC7710-ccpAnia114-120 para obter uma cepa DGCC7710-ccpAniari4-120 com man mutante; c) determinar a proporção de atividade de beta-galactosi- dase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoqui- nase, como avaliado por meio do Teste E, da cepa DGCC7710- CCPpAnatri4-120 com man mutante obtida em b) e selecionar uma cepa DGCC77 10-ccpAniaris-120 com man mutante que exibe uma proporção de pelo menos 4,10, como definido no presente documento; e d) determinar, por meio do Teste B, a concentração de gli- cose de um leite fermentado com a dita cepa DGCC7710-CcpAnia114-120 com man mutante selecionada em c), em que: d1) uma concentração de glicose de pelo menos 80 mM sig- nifica que o gene manL, manM ou manN mutante está de acordo com a invenção. Em uma modalidade, um gene manL, manM ou manN mu- tante é considerado de acordo com a invenção quando a concentração de glicose medida na etapa d) é de pelo menos 90 mM ou pelo menos 100 mM; ou d2) um aumento da concentração de glicose obtida com a cepa DGCC7710-ccpAniaii4-120 com man mutante selecionada em c), comparado com a cepa DGCC7710-ccpAnia114-120, Significa que o gene manL, manM ou manN mutante está de acordo com a invenção.
[0189] No método acima, a expressão "aumento da concentração de glicose" ou "aumentar a concentração de glicose" comparado com uma cepa de referência [precursora] na etapa d), significa uma concen- tração de glicose da cepa testada que é de pelo menos 150%, pelo me- nos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% da concentração de glicose da cepa de referência [precursora], quando ambas as cepas são analisadas por meio do Teste B.
[0190] Em uma modalidade, a expressão "aumento da concentra- ção de glicose" comparado com a cepa DSM32587 na etapa d) significa uma concentração de glicose da cepa testada [com mutação no gene manL, manM ou manN] que é pelo menos 150%, em 200% ou pelo me- nos 300% a concentração de glicose da cepa DSM32587, quando as duas cepas são analisadas por meio do Teste B.
[0191] Em uma modalidade, a expressão "aumento da concentra- ção de glicose", comparado com a cepa DGCC7710-cepAniaria-120 deri- vada na etapa d), significa uma concentração de glicose da cepa tes- tada [Mutante no gene manL, manM ou manN] que é a menos 150%, pelo menos 200%, pelo menos 300%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% da concentração de glicose da cepa DGCC7710-ccpAnia1i4-120 de- rivada, quando ambas as cepas são avaliadas por meio do Teste B.
[0192] Uma vez identificado, o gene manL, manM ou manN mu- tante de acordo com a invenção pode ser introduzido em vez do gene manL, manM ou manNde uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose definida em |, II, Ill, IV ou V acima. Exemplos De Algumas Cepas da Invenção
[0193] A invenção é dirigida à cepa DSM32587 de Streptococcus thermophilus depositada no DSMZ em 15 de agosto de 2017 ou qual- quer variante da mesma. Foi mostrado que a cepa DSM32587, a qual traz um gene glcK como definido em SEQ ID NO: 21 (que codifica uma glucoquinase, como definido em SEQ ID NO: 22), tem uma atividade de glucoquinase na dita cepa de 907 U/g de extrato de proteico total, uma
Vmax na dita cepa de 914 U/g de extrato proteico total, ao mesmo tempo em que liberava, no leite fermentado, 29 mM de glicose (como avaliado, respectivamente por meio do Teste A, Teste C e Teste B).
[0194] Uma variante da cepa DSM32587 é definida no presente do- cumento como uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose obtida a partir da cepa DSM32587 e que traz o mesmo gene glcK (SEQ ID NO: 21) que a cepa DSM32587 e em que a atividade de glucoquinase na dita cepa preenche a caracte- rística atividade de glucoquinase "significativamente reduzida, mas não nula", como definido no presente documento, e preenche a caracterís- tica Vmax para a glucoquinase "significativamente reduzida, mas não nula", como definido no presente documento.
[0195] Em uma modalidade, uma variante da cepa DSM32587 exibe uma proporção da atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, cujo valor mínimo é selecionado a partir do grupo que consiste em pelo menos 4,10, pelo menos 5,10, pelo menos 6,10" 6, pelo menos 7,10 e pelo menos 8,10 e, opcionalmente, cujo o valor máximo é menor do que 8,10*?.
[0196] Em uma modalidade particular, a variante da cepa DSM32587 expressa uma proteína GlcK como definido em SEQ ID NO: 22 cuja atividade de glucoquinase na dita variante está entre 800 e 1000 U/g de extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste A, e a Vmax para a glucoquinase na dita variante está entre 800 e 1000 U/g de extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste C.
[0197] Em uma modalidade particular, a variante DSM32587 da in- venção é ainda caracterizada pelo fato de que a concentração de gli- cose em um leite fermentado com a dita variante, como avaliado por meio do Teste B, é de pelo menos 20 mM. Em uma modalidade particu- lar, a variante DSM32587 da invenção é caracterizada pelo fato de que a concentração de glicose em um leite fermentado com a dita variante, como avaliado por meio do Teste B, é pelo menos a concentração de glicose em um leite fermentado com a cepa DSM32587, como avaliado por meio do Teste B.
[0198] Exemplos não limitativos de variantes são, por exemplo, va- riantes CRISPR, isto é, variantes da cepa DSM32587 com um ou mais de seus locus (loci) CRISPR modificados por inserção e/ou eliminação de um ou mais espaçadores (comparado com o locus (loci) CRISPR da cepa DSM32587).
[0199] A invenção também é dirigida às seguintes cepas de Strep- tococcus thermophilus positivas para lactose, negativas para galactose:
[0200] - uma cepa que corresponde à cepa DSM32587 na qual a sequência codificadora do gene ccpAé substituída pela sequência como apresentado em SEQ ID NO: 71 (ccpAnaiati14-120) e suas varian- tes; uma variante é definida no presente documento como uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para ga- lactose que traz o mesmo gene ccpA mutante e que exibe uma propor- ção da atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, cujo valor mínimo é selecionado a partir do grupo que consiste em pelo menos 4,108, pelo menos 5,10, pelo menos 6,108, pelo me- nos 7,10% e pelo menos 8,10 e, opcionalmente, cujo o valor máximo é menor do que 8,103;
[0201] - uma cepa que corresponde à cepa DSM32587 na qual a sequência codificadora do gene manL é substituída pela sequência como apresentado em SEQ ID NO: 155 (que codifica IIABYº"395TERMINAL) e suas variantes; uma variante é definida no presente documento como uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, nega- tiva para galactose que traz o mesmo gene manL mutante e que exibe uma proporção da atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, cujo valor mínimo é selecionado a partir do grupo que consiste em pelo menos 4.10, pelo menos 5,108, pelo menos 6,10, pelo menos 7,10% e pelo menos 8,10% e, opcionalmente, cujo o valor máximo é menor do que 8,10;
[0202] - uma cepa que corresponde à cepa DSM32587 na qual a sequência codificadora do gene manM é substituída pela sequência como apresentado em SEQ ID NO: 201 (que codifica IICYº"28) e suas variantes; uma variante é definida no presente documento como uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, nega- tiva para galactose que traz o mesmo gene manM mutante e que exibe uma proporção da atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, cujo valor mínimo é selecionado a partir do grupo que consiste em pelo menos 4,10, pelo menos 5,10, pelo menos 6,10, pelo menos 7,10% e pelo menos 8,108 e, opcionalmente, cujo o valor máximo é menor do que 8,10;
[0203] - uma cepa que corresponde à cepa DSM32587 na qual a sequência codificadora do genemanLé substituída pela sequên- cia como apresentado em SEQ ID NO: 250 (que codifica IIDYº"23) e suas variantes; uma variante é definida no presente documento como uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, nega- tiva para galactose que traz o mesmo gene manL mutante e que exibe uma proporção da atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, cujo valor mínimo é selecionado a partir do grupo que consiste em pelo menos 4,106, pelo menos 5,10, pelo menos 6,10, pelo menos 7,10% e pelo menos 8,10% e, opcionalmente, cujo o valor máximo é menor do que 8,10;
[0204] - uma cepa que corresponde à cepa DSM32587 na qual a sequência codificadora do gene ccpAé substituída pela sequência como apresentado em SEQ ID NO: 71 (ccpAntat14-120) e a sequência co- dificadora do gene manL é substituída pela sequência como apresen- tado em SEQ ID NO: 155 (que codifica IIABYº"3957ERMINAL) E SUas varian- tes; uma variante é definida no presente documento como uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para ga- lactose que traz o mesmo gene ccpA mutante e o mesmo gene manL mutante e que exibe uma proporção da atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase por meio do Teste E, cujo valor mínimo é selecionado a partir do grupo que consiste em pelo menos 4,10, pelo menos 5,10, pelo menos 6,10" 8, pelo menos 7,108 e pelo menos 8,10 e, opcionalmente, cujo o valor máximo é menor do que 8,10;
[0205] - uma cepa que corresponde à cepa DSM32587 na qual a sequência codificadora do gene ccpA é substituída pela sequência como apresentado em SEQ ID NO: 71 (ccpAnaiti14-120) e a sequência co- dificadora do gene manM é substituída pela sequência como apresen- tado em SEQ ID NO: 201 (que codifica IICYº"2,3) e suas variantes; uma variante é definida no presente documento como uma cepa de Strepto- coccus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose que traz o mesmo gene ccpA mutante e o mesmo gene manM mutante e que exibe uma proporção da atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase por meio do Teste E, cujo valor mínimo é selecionado a partir do grupo que consiste em pelo menos 4,108, pelo menos 5,108, pelo menos 6,10, pelo menos 7,10% e pelo menos 8,108 e, opcionalmente, cujo o valor máximo é menor do que 8,10;
[0206] - uma cepa que corresponde à cepa DSM32587 na qual a sequência codificadora do gene ccpA é substituída pela sequência como apresentado em SEQ ID NO: 71 (ccpAniai14-120) e a sequência co- dificadora do gene manL é substituída pela sequência como apresen- tado em SEQ ID NO: 250 (que codifica IIDVYº"23) e suas variantes; uma variante é definida no presente documento como uma cepa de Strepto- coccus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose que traz o mesmo gene ccpA mutante e o mesmo gene manL mutante e que exibe uma proporção da atividade de beta-galactosidase, como avali- ado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase por meio do Teste E, cujo valor mínimo é selecionado a partir do grupo que consiste em pelo menos 4,10, pelo menos 5,10, pelo menos 6,10, pelo me- nos 7,10% e pelo menos 8,10 e, opcionalmente, cujo o valor máximo é menor do que 8,10*?;
[0207] - uma cepa que corresponde à cepa DSM28255 na qual a sequência codificadora do gene ccpA é substituída pela sequência como apresentado em SEQ ID NO: 71 (ccpAniati4-120) e suas varian- tes; uma variante é definida no presente documento como uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para ga- lactose que traz o mesmo gene ccpA mutante e que exibe uma propor- ção da atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, o mínimo o valor selecionado a partir do grupo que consiste em pelo menos 4,10%, pelo menos 5,10, pelo menos 6,10, pelo menos 7,10% e pelo menos 8,108 e, opcionalmente, cujo o valor máximo é me- nor do que 8,10;
[0208] - uma cepa que corresponde à cepa DSM28255 na qual a sequência codificadora do gene ccpAé substituída pela sequência como apresentado em SEQ ID NO: 71 (ccpAniaii14-120) e a sequência co- dificadora do gene manL é substituída pela sequência como apresen- tado em SEQ ID NO: 155 (que codifica IIABYº"z395TERMINAL) E SUas Varian- tes; uma variante é definida no presente documento como uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para ga- lactose que traz o mesmo gene ccpA mutante e o mesmo gene manL mutante e que exibe uma proporção da atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase por meio do Teste E, cujo valor mínimo é selecionado a partir do grupo que consiste em pelo menos 4,10, pelo menos 5,10, pelo menos 6,10" 8, pelo menos 7,10 e pelo menos 8,10 e, opcionalmente, cujo o valor máximo é menor do que 8,10*;
[0209] - uma cepa que corresponde à cepa DSM28255 na qual a sequência codificadora do gene ccpA é substituída pela sequência como apresentado em SEQ ID NO: 71 (ccpAntai14-120) e a sequência co- dificadora do gene manM é substituída pela sequência como apresen- tado em SEQ ID NO: 201 (que codifica IICYº"7,3) e suas variantes; uma variante é definida no presente documento como uma cepa de Strepto- coccus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose que traz o mesmo gene ccpA mutante e o mesmo gene manM mutante e que exibe uma proporção da atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase por meio do Teste E, cujo valor mínimo é selecionado a partir do grupo que consiste em pelo menos 4,108, pelo menos 5,108, pelo menos 6,10, pelo menos 7,10% e pelo menos 8,108 e, opcionalmente, cujo o valor máximo é menor do que 8,10;
[0210] - uma cepa que corresponde à cepa DSM28255 na qual a sequência codificadora do gene ccpAé substituída pela sequência como apresentado em SEQ ID NO: 71 (ccpAniai4-120) e a sequência co- dificadora do gene manL é substituída pela sequência como apresen- tado em SEQ ID NO: 250 (que codifica IIDVYº"73) e suas variantes; uma variante é definida no presente documento como uma cepa de Strepto- coccus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose que traz o mesmo gene ccpA mutante e o mesmo gene manL mutante e que exibe uma proporção da atividade de beta-galactosidase, como avali- ado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase por meio do Teste E, cujo valor mínimo é selecionado a partir do grupo que consiste em pelo menos 4,10, pelo menos 5,108, pelo menos 6,10, pelo me- nos 7,10% e pelo menos 8,10% e, opcionalmente, cujo o valor máximo é menor do que 8,10*?.
[0211] Em uma modalidade particular, a sequência genômica da va- riante da cepa, como definido no presente documento, tem uma identi- dade de pelo menos 90%, com a sequência genômica da cepa a partir da qual a variante é obtida, em particular uma identidade de pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 95%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,1%, pelo menos 99,2%, pelo me- nos 99,3%, pelo menos 99,4%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,6%, pelo menos 99,7%, pelo menos 99,8%, pelo menos 99,9%, pelo menos 99,92%, pelo menos 99,94%, pelo menos 99,96%, pelo menos 99,98% ou pelo menos 99,99% com a sequência genômica da cepa a partir da qual a variante é obtida. A identidade é descrita na comparação das duas sequências genômicas em todo o seu comprimento (alinhamento global) e pode ser calculada usando qualquer programa com base no algoritmo de Needleman-Wunsch.
[0212] Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophi- lus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção não tem um gene glcK que codifica uma glucoquinase com uma serina na posi- ção 144 (isto é, o códon 144 do gene glcK não codifica uma serina), com exceção de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose selecionada a partir do grupo que con- siste em: a) uma cepa de Streptococcus thermophilus negativa para galactose, positiva para lactose, como definido em Ill, cujo gene glcK codifica uma glucoquinase com uma serina na posição 144; e b) uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose, como definido em VI, cujo gene glcK codifica uma glucoquinase com uma serina na posição 144.
[0213] Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophi- lus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção tem um gene glcK que codifica uma glucoquinase com uma serina na posição 144, com exceção de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose cujo gene ccpA sofreu mutação como definido em Ill e o gene glcK codifica uma glucoquinase com uma serina na posição 144; b) uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose cujo gene manL sofreu mutação como definido em VI e o gene glcK codifica uma glucoquinase com uma se- rina na posição 144; c) uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose cujo gene manM sofreu mutação como definido em VI e o gene glcK codifica uma glucoquinase com uma se- rina na posição 144; e d) uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose cujo gene manL sofreu mutação como definido em VI e o gene glcK codifica uma glucoquinase com uma se- rina na posição 144.
[0214] Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção não traz um gene glcK que codifica uma glucoquinase que tem uma serina na posi-
ção 144, com a excepção de uma cepa de Streptococcus thermophi- lus positiva para lactose, negativa para galactose selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose cujo gene ccpA é como definido em SEQ ID NO: 71 e o gene glcK codifica uma glucoquinase com uma se- rina na posição 144; b) uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose cujo gene manL codifica uma IIAB- Mantruncada na posição 305 como definido em SEQ ID NO: 156 e o gene glcK codifica uma glucoquinase com uma serina na posição 144; c) uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose cujo gene manM codifica uma IICMan truncada na posição 208 como definido em SEQ ID NO: 202 e o gene glcK codifica um glucoquinase com uma serina na posição 144; d) uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose cujo gene manN codifica uma IIDVYan truncada na posição 28 como definido em SEQ ID NO: 251 e o gene glcK codifica uma glucoquinase tendo uma serina na posição 144.
[0215] Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção, como defi- nido em | acima, não traz um gene glcK que codifica uma glucoquinase com uma serina na posição 144.
[0216] Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophi- lus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção não traz um gene glcK que codifica uma glucoquinase com uma serina na posi- ção 144.
Composição, Método e Uso das Cepas de Streptococcus thermophilus Positivas Para Lactose, Negativas Para Galactose da Invenção
[0217] A invenção também é dirigida a uma composição bacteri- ana que compreende ou que consiste em pelo menos uma cepa, em particular uma cepa de Streptococcus thermophilus, positiva para lac- tose, negativa para galactose da invenção. Em uma modalidade parti- cular, a composição bacteriana é uma cultura pura, isto é, compreende ou consiste em uma única cepa bacteriana. Em outra modalidade, a composição bacteriana é uma cultura mista, isto é, compreende ou con- siste nas cepas de Streptococcus thermophilus positivas para lactose, negativas para galactose da invenção e pelo menos uma outra cepa bacteriana. Por "pelo menos" (em referência a uma cepa ou bactéria), entenda-se 1 ou mais e, em particular, 1, 2, 3, 4 ou 5 cepas.
[0218] Assim, em uma modalidade, uma composição bacteriana da invenção compreende ou consiste nas cepas de Streptococcus ther- mophilus positivas para lactose, negativas para galactose da invenção e pelo menos uma bactéria do ácido láctico de espécies selecionadas a partir do grupo que consiste em espécies Lactococcus, espécies Strep- tococcus, espécies Lactobacillus, incluindo Lactobacillus acidophilus, espécies Enterococcus, espécies Pediococcus, espécies Leuconos- toc, espécies Bifidobacterium e espécies Oenococcus ou qualquer com- binação das mesmas. As espécies Lactococcus incluem Lactobacillus acidophilus e Lactococcus lactis, incluindo Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris e Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetilactis. As espécies Bifidobacterium incluem Bifido- bacterium animalis, em particular Bifidobacterium animalis subsp lactis. Outras espécies de bactérias do ácido láctico incluem Leuconostoc sp., Streptococcus - thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgari- cus e Lactobacillus helveticus.
[0219] Em uma modalidade, a composição bacteriana compreende ou consiste na(s) cepa(s) de Streptococcus thermophilus positiva(s) para lactose, negativa(s) para galactose da invenção e pelo menos uma cepa de Streptococcus thermophilus diferente da(s) cepa(s) de S. ther- mophilus da invenção e/ou pelo menos uma cepa da espécie Lactoba- cillus e/ou qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade par- ticular, a composição bacteriana compreende ou consiste na(s) cepa(s) de Streptococcus thermophilus da invenção, uma ou várias cepas da espécie Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus e/ou uma ou várias cepas da espécie Lactobacillus helveticus e/ou qualquer combinação das mesmas e, opcionalmente, pelo menos uma cepa de Streptococcus thermophilus diferente da(s) cepa(s) de S. thermophilus da invenção. Em uma modalidade particular, a composição bacteriana compreende ou consiste na(s) cepa(s) de Streptococcus thermophilus da invenção, pelo menos uma cepa da espécie Streptococcus thermophilus diferente da(s) cepa(s) de S. thermophilus da invenção e uma cepa da espécie Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Em outra modalidade parti- cular, a composição bacteriana compreende ou consiste nas cepas de Streptococcus thermophilus da invenção e uma cepa da espécie Lacto- bacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.
[0220] Em uma modalidade, a composição bacteriana compreende ou consiste nas cepas de Streptococcus thermophilus da invenção, uma Lactococcus lactis subsp. lactis e/ou uma Lactococcus lactis subsp. cremoris.
[0221] Em uma modalidade particular de qualquer composição bac- teriana definida no presente documento, como uma cultura pura ou mista, a composição bacteriana compreende ainda pelo menos uma cepa probiótica, tal como Bifidobacterium animalis subsp. lactis, Lacto- bacillus acidophilus, Lactobacillus paracasei ou Lactobacillus casei.
[0222] Em uma modalidade particular, a composição bacteriana, como uma cultura pura ou mista, como definido acima, está no formato congelado, seco, liofilizado, líquido ou sólido, na forma de grânulos ou grânulos congelados, ou pó ou pó seco. Em uma modalidade particular,
a composição bacteriana da invenção está em um formato congelado ou na forma de grânulos ou grânulos congelados, em particular contidos em um ou mais envelopes ou sachês. Em outra modalidade, a compo- sição bacteriana como definido no presente documento está em uma forma de pó, tal como um pó seco ou liofilizado, em particular contido em um ou mais envelopes ou sachês.
[0223] Em uma modalidade particular, a composição bacteriana da invenção, como cultura pura ou cultura mista como definido acima e qualquer que seja o formato (formato congelado, seco, liofilizado, líquido ou sólido, na forma de grânulos ou grânulos congelados, ou pó ou pó seco) compreende as cepas de Streptococcus thermophilus positivas para lactose, negativas para galactose da invenção em uma concentra- ção compreendida na faixa de 10º a 10"? CFU (unidades formadoras de colônias) por grama de composição bacteriana. Em uma modalidade particular, a concentração da(s) cepa(s) de Streptococcus thermophi- lus positiva(s) para lactose, negativa(s) para galactose dentro do com- posição bacteriana da invenção está na faixa de 107 a 10”? CFU por grama da composição bacteriana e, em particular, pelo menos 107, pelo menos 10º, pelo menos 10º, pelo menos 10º ou pelo menos 10** CFU/g da composição bacteriana. Em uma modalidade particular, quando na forma de concentrado congelado ou seco, a concentração da(s) cepa(s) de Streptococcus thermophilus positiva(s) para lactose, negativa(s) para galactose - como cultura pura ou como uma cultura mista - dentro da composição bacteriana está na faixa de 10º a 10"? CFU/g de concen- trado congelado ou concentrado seco e, mais preferivelmente, pelo me- nos 108, pelo menos 10º, pelo menos 10º, pelo menos 10 ou pelo me- nos 10º? CFU/g de concentrado congelado ou concentrado seco.
[0224] A invenção também refere-se a um método para a fabricação de um produto fermentado que compreende a) inocular um substrato com a(s) cepa(s) de Streptococcus thermophilus positiva(s) para lac- tose, negativa(s) para galactose da invenção e b) fermentar o dito subs- trato inoculado para obter um produto fermentado. Em uma modalidade particular, as cepas de Streptococcus thermophilus positivas para lac- tose, negativas para galactose da invenção são inoculadas como uma composição bacteriana, como definido no presente documento, como uma cultura pura ou uma cultura mista. Em uma modalidade, o substrato ao qual as cepas de S. thermophilus ou a composição bacteriana da in- venção são adicionadas é um substrato de leite. Por "substrato de leite" entenda-se leite de origem animal e/ou vegetal. Em uma modalidade particular, o substrato de leite é de origem animal, tal como de vaca, cabra, ovelha, búfalo, zebra, cavalo, burro ou camelo e assim por di- ante. O leite pode estar no estado nativo, pode ser um leite reconstitu- ido, um leite desnatado ou um leite suplementado com compostos ne- cessários para o crescimento das bactérias ou para o subsequente pro- cessamento do leite fermentado. Portanto, em uma modalidade particu- lar, a invenção também fornece um método para fabricar um produto lácteo fermentado, que compreende a) inocular um substrato de leite com a(s) cepa(s) de Streptococcus thermophilus positiva(s) para lac- tose, negativa(s) para galactose ou composição bacteriana da invenção e b) fermentar o dito substrato de leite inoculado para obter um produto lácteo fermentado.
[0225] A invenção também refere-se ao uso das cepas de Strepto- coccus thermophilus positivas para lactose, negativas para galactose da invenção ou uma composição da invenção para fabricar um produto lác- teo fermentado.
[0226] A invenção também é dirigida a um produto lácteo fermen- tado o qual é obtido usando a(s) cepa(s) de Streptococcus thermophi- lus positiva(s) para lactose, negativa(s) para galactose da invenção ou uma composição bacteriana da invenção, em particular obtida ou obti- das por meio do método da invenção. Assim, a invenção é dirigida a um produto lácteo fermentado que compreende as cepas de Strepto- coccus thermophilus positivas para lactose, negativas para galactose da invenção. Em uma modalidade particular, o produto lácteo fermentado da invenção é leite fermentado fresco. Em uma modalidade particular, o produto lácteo fermentado da invenção - em particular o leite fresco fer- mentado, como definido no presente documento - contém a cepa DSM32587 depositada no DSMZ em 15 de agosto de 2017 ou qualquer variante da mesma, como definido no presente documento.
Proteínas, Ácidos Nucleicos, Vetores, Construções e Seus Usos
[0227] A invenção também refere-se a uma cepa de Streptococcus thermophilus cuja atividade de glucoquinase é significativamente redu- zida, mas não nula, em um derivado de DGCC7710. Para testar se uma glucoquinase da invenção preenche a funcionalidade atividade de glu- coquinase "significativamente reduzida, mas não nula" em um derivado de DGCC7710, o gene glcKda cepa DGCC7710 é substituído pelo gene glcK que codifica a glucoquinase da cepa de Streptococcus thermophi- lus da invenção a ser testada para obter o derivado de DGCC7710 eo derivado de DGCC7710 é avaliado por meio do Teste A (consulte o Exemplo 4).
[0228] Uma glucoquinase de Streptococcus thermophilus satisfaz a característica de atividade de glucoquinase "significativamente redu- zida, mas não nula" em um derivado do DGCC7710, quando: a) a atividade de glucoquinase da dita glucoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 está entre 200 e 1500 U/g de extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste A, em particular entre 300 e 1200 U/g ou entre 400 e 1000 U/g de extrato proteico total, como testado no Teste A, ou b) a atividade de glucoquinase da dita glucoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 está entre e 60% da atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014, quando ambas são avaliadas por meio do Teste A, particular- mente entre 10 e 50% ou entre 15 e 40% da atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710, em que a atividade de glucoquinase no dito deri- vado DG7710 e a atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710 são analisadas por meio do Teste A.
[0229] Em uma modalidade particular, a atividade de glucoquinase da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção em um de- rivado de DGCC7710 está entre 2 00 e 1500 U/g de extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste A. Em uma modalidade particu- lar, a atividade de glucoquinase da glucoquinase de Streptococcus ther- mophilus da invenção em um derivado de DGCC7710 está entre 300 e 1200 U/g do extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste A. Em uma modalidade particular, a atividade de glucoquinase da gluco- quinase de Streptococcus thermophilus da invenção em um derivado de DGCC7710 está entre 400 e 1000 U/g do extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste A. Em uma modalidade particular, a ativi- dade de glucoquinase da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção em um derivado de DGCC7710 está entre um valor mi- nimo selecionado a partir do grupo que consiste em 200, 300 e 400 U/g de extrato proteico total e um valor máximo selecionado a partir do grupo que consiste em 1000, 1200 e 1500 U/g de extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste A. É digno de nota que, como mencionado no Teste A, os valores de atividade de glucoquinase descritos no pre- sente documento são a média de três experimentos (triplicatas).
[0230] Em uma modalidade particular, a atividade de glucoquinase da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção em um de- rivado de DGCC7710 está entre 5 e 60% da atividade da atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014. Por "atividade de glu- coquinase da cepa DGCC7710" entenda-se a atividade de glucoquinase cepa DGCC7710 (isto é, com SEQ ID NO: 2), como avaliado por meio do Teste A, na cepa DGCC7710 [isto é, o Teste A é realizado usando a cepa DGCC7710]. O valor percentual é calculado com base na ativi- dade de glucoquinase da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção em um derivado de DGCC7710 e a atividade de glucoqui- nase da cepa DGCC7710, ambas avaliadas por meio do Teste A.
[0231] Em uma modalidade particular, a atividade de glucoquinase da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção em um de- rivado de DGCC7710 está entre 5 e 60% da atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710. Em uma modalidade particular, a atividade de glu- coquinase da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção em um derivado de DGCC7710 está entre 10 e 50% da atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710. Em uma modalidade particular, a ati- vidade de glucoquinase da glucoquinase de Streptococcus thermophi- lus da invenção em um derivado de DGCC7710 está entre 15 e 40% da atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710. Em uma modalidade particular, a atividade de glucoquinase da glucoquinase de Streptococ- cus thermophilus da invenção em um derivado de DGCC7710 está en- tre uma porcentagem mínima selecionada a partir do grupo que consiste em 5, 10 e 15% da atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710 e uma porcentagem máxima selecionada a partir do grupo que consiste em 40, 50 e 60% da atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710. Em uma modalidade particular e qualquer que seja a faixa de porcentagens, a atividade de glucoquinase da glucoquinase de Streptococcus ther- mophilus da invenção é avaliada em um derivado de DGCC7710 por meio do Teste A, como descrito no presente documento. Vale ressaltar que os valores percentuais descritos no presente documento são calcu- lados com base nos valores da atividade de glucoquinase, os quais são a média de três experimentos independentes (triplicatas), como avali- ado por meio do Teste A.
[0232] A característica "atividade de glucoquinase em um derivado de DGCC7710 é significativamente reduzida, mas não nula" também pode ser caracterizada, em um derivado de DGCC7710, pela veloci- dade de avanço máxima da glucoquinase (Vmax) ou pela afinidade da glucoquinase (denominada Km) por um ou dois de seus substratos, isto é, glicose e ATP. Em uma modalidade, a funcionalidade "atividade de glucoquinase significativamente reduzida, mas não nula, em um deri- vado de DGCC7710"da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção é ainda caracterizada pela velocidade de avanço máxima da glucoquinase presente em um derivado de DGCC7710.
[0233] Portanto, em combinação com a modalidade da caracterís- tica "atividade de glucoquinase em um derivado de DGCC7710 é signi- ficativamente reduzida, mas não nula" definida no presente documento, a velocidade de avanço máxima (Vmax) da glucoquinase de Strepto- coccus thermophilus da invenção é significativamente reduzida, mas não nula em um derivado de DGCC7710. Para testar se uma glucoqui- nase da invenção preenche a característica de Vnax "significativamente reduzida, mas não nula" em um derivado de DGCC7710, o quadrode leitura aberta do gene glcK da cepa DGCC7710 é substituído pelo qua- dro de leitura aberta do gene glcK que codifica a glucoquinase de Strep- tococcus thermophilus da invenção a ser testada para obter um deri- vado de DGCC7710, e o derivado de DGCC7710 é avaliado por meio do Teste C (consulte Exemplo 4). A expressão "derivado de DGCC7710" é como definido acima.
[0234] A característica Vmnax "significativamente reduzida, mas não nula em um derivado de DGCC7710" para a glucoquinase da invenção pode ser definida por um ou dois destes parâmetros: - a Vmax da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção em um derivado de DGCC7710 está entre 200 e 1500 U/g de extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste C; - a Vmax da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção em um derivado de DGCC7710 está entre 5 e 60% da Vmax para a glucoquinase da cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014, quando ambas são avaliadas por meio do Teste C.
[0235] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se a uma glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção cuja ativi- dade de glucoquinase em um derivado de DGCC7710 é significativa- mente reduzida, mas não nula (como definido no presente documento) e em que a velocidade de avanço máxima (Vmax) da dita glucoquinase em um derivado de DGCC7710 é significativamente reduzida, mas não nula, e definida por um ou dois destes parâmetros: - a Vmax da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção em um derivado de DGCC7710 está entre 200 e 1500 U/g de extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste C; - a Vmax da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção em um derivado de DGCC7710 está entre 5 e 60% da Vmax para a glucoquinase da cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014, quando ambas são avaliadas por meio do Teste C.
[0236] Em uma modalidade particular, a Vinax da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invençãoem um derivado de DGCC7710 está entre 200 e 1500 U/g de extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste C. Em uma modalidade particular, a Vinax da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção em um de- rivado de DGCC7710 está entre 300 e 1200 U/g de extrato proteico to- tal, como avaliado por meio do Teste C. Em uma modalidade particular, a Vmax da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção em um derivado de DGCC7710 está entre 400 e 1000 U/g de extrato proteico total. Em uma modalidade particular, a Vinax da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção em um derivado de DGCC7710 está entre um valor mínimo selecionado a partir do grupo que consiste em 200, 300 e 400 U/g de extrato proteico total e um valor máximo selecionado a partir do grupo que consiste em 1000, 1200 e 1500 U/g de extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste C.
[0237] Em uma modalidade particular, a Vnax da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invençãoem um derivado de DGCC7710 está entre 10 e 50% da Vmax para a glucoquinase da cepa DGCC7710, quando ambas são avaliadas por meio do Teste C. Por "Vmax para a glucoquinase da cepa DGCC7710"entenda-se a Vmax para a glucoquinase da cepa DGCC7710 (isto é, com SEQ ID NO: 2), como avaliado por meio do Teste C, na cepa DGCC7710 [isto é, o Teste C é realizado usando a cepa DGCC7710]. O valor percentual é calcu- lado com base na Vmax da glucoquinase de Streptococcus thermophi- lus da invenção em um derivado de DGCC7710 e na Vmax para a glu- coquinase da cepa DGCC7710, ambas avaliadas por meio do Teste C. Em uma modalidade particular, a Vinax da glucoquinase de Streptococ- cus thermophilus da invenção em um derivado de DGCC7710 está en- tre 15 e 40% da Vmax para a glucoquinase da cepa DGCC7710. Em uma modalidade particular, a Vnax da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção em um derivado de DGCC7710 está entre uma porcentagem mínima selecionada a partir do grupo que consiste em 5, 10 e 15% da Vmax para a atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710 e uma porcentagem máxima selecionada a partir do grupo que consiste em 40, 50 e 60% da Vmax para a atividade de glucoqui- nase da cepa DGCC7710.
[0238] Em uma modalidade, a sequência da glucoquinase de Strep- tococcus thermophilus da invenção que tem uma atividade de glucoqui- nase significativamente reduzida, mas não nula em um derivado de DGCC7710 e opcionalmente uma Vmax significativamente reduzida, mas não nula em um derivado de DGCC7710 tem, em sua posição 275 (numeração com base na sequência como definido em SEQ ID NO: 25), um aminoácido que não é um ácido glutâmico (isto é, é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico). Em uma modalidade, a se- quência da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção que tem uma atividade de glucoquinase significativamente reduzida, mas não nula, em um derivado de DGCC7710 e, opcionalmente, Vnax significativamente reduzida, mas não nula, em um derivado de DGCC7710 tem, em sua posição 275 (numeração com base na sequên- cia como definido em SEQ ID NO: 25), um aminoácido que não é um aminoácido ácido (isto é, qualquer aminoácido exceto um amino- ácido ácido). Em uma modalidade, a sequência da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção que tem uma atividade de glu- coquinase significativamente reduzida, mas não nula, em um derivado de DGCC7710 e, opcionalmente, uma Vmax significativamente redu- zida, mas não nula, em um derivado de DGCC7710 tem, em sua posi- ção 275 (numeração com base na sequência como apresentado em SEQ ID NO: 25), um aminoácido que é selecionado a partir do grupo que consiste em uma lisina e qualquer um de seus aminoácidos conser- vativos. Em uma modalidade, a sequência da glucoquinase de Strepto- coccus thermophilus da invenção que tem uma atividade de glucoqui- nase significativamente reduzida, mas não nula, em um derivado de DGCC7710 e, opcionalmente, uma Vmax significativamente reduzida, mas não nula, em um derivado de DGCC7710 tem, em sua posição
275 (numeração com base na sequência como definido em SEQ ID NO: 25), um aminoácido que é uma lisina. Em uma modalidade particular, a glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção tem 322 ami- noácidos de comprimento. Em uma modalidade, quando a glucoqui- nase de Streptococcus thermophilus tem, em sua posição 275, um ami- noácido que não é um ácido glutâmico (em particular que não é um ami- noácido ácido, em particular que é uma lisina), a glucoquinase de Strep- tococcus thermophilus tem uma arginina em sua posição 278 e/ou uma serina em sua posição 279.
[0239] Em uma modalidade, a sequência da glucoquinase de Strep- tococcus thermophilus da invenção que tem uma atividade de glucoqui- nase significativamente reduzida, mas não nula, em um derivado de DGCC7710 e, opcionalmente, uma Vmax significativamente reduzida, mas não nula, em um derivado de DGCC7710 tem, em sua posição 144 (numeração com base na sequência como apresentado em SEQ ID NO: 46), um aminoácido que não é uma glicina (isto é, é qualquer aminoá- cido exceto uma glicina). Em uma modalidade, a sequência da gluco- quinase de Streptococcus thermophilus da invenção que tem uma ativi- dade de glucoquinase significativamente reduzida, mas não nula, em um derivado de DGCC7710 e, opcionalmente, uma Vmax significativa- mente reduzida, mas não nula, em um derivado de DGCC7710 tem, em sua posição 144 (numeração com base na sequência como definido em SEQ ID NO: 46), um aminoácido que não é um aminoácido alifático (isto é, qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático). Em uma modalidade, a sequência da glucoquinase de Streptococcus thermophi- lus da invenção que tem uma atividade de glucoquinase significativa- mente reduzida, mas não nula, em um derivado de DGCC7710 e, opci- onalmente, uma Vmax significativamente reduzida, mas não nula, em um derivado de DGCC7710 tem, em sua posição 144 (numeração com base na sequência como apresentado em SEQ ID NO: 46), um amino- ácido que é selecionado a partir do grupo que consiste em uma serina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos. Em uma modali- dade, a sequência da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção que tem uma atividade de glucoquinase significativamente re- duzida, mas não nula, em um derivado de DGCC7710 e, opcionalmente, uma Vmax significativamente reduzida, mas não nula, em um derivado de DGCC7710 tem, em sua posição 144 (numeração com base na se- quência como definido em SEQ ID NO: 46), um aminoácido que é uma serina. Em uma modalidade particular, a glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção tem 322 aminoácidos de comprimento.
[0240] Em uma modalidade particular, a sequência da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção que tem uma atividade de glucoquinase significativamente reduzida, mas não nula, em um deri- vado de DGCC7710 e, opcionalmente, uma Vmax significativamente re- duzida, mas não nula, em um derivado de DGCC7710 é selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma sequência como definido em SEQ ID NO: 25, em que o aminoácido na posição 275 é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular é qualquer aminoácido exceto um amino- ácido ácido, em particular é uma lisina; e b) uma sequência variante de GlIcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 25, em que o ami- noácido da glucoquinase que corresponde à posição 275 de SEQ ID NO: 25 (ou o aminoácido na posição 275 da glucoquinase) é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular é qualquer amino- ácido exceto um aminoácido ácido, em particular é uma lisina. Em uma modalidade particular, a sequência variante de GIcK tem 322 aminoáci- dos de comprimento. Em uma modalidade, a dita variante de GIcK tem uma arginina em sua posição 278 e/ou uma serina em sua posição 279;
c) uma sequência como definido em SEQ ID NO: 46, em que o aminoácido na posição 144 é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular é uma serina; e d) uma sequência variante de GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 46, em que o aminoá- cido da glucoquinase que corresponde à posição 144 de SEQ |D NO: 46 (ou o aminoácido na posição 144 da glucoquinase) é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular é qualquer aminoácido ex- ceto um aminoácido alifático, em particular é uma serina. Em uma mo- dalidade particular, a sequência variante de GlcK tem 322 aminoácidos de comprimento.
[0241] Para a definição da variante de GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 25, a similaridade ou identidade é calculada no presente documento ao longo de todo o comprimento das 2 sequências após alinhamento ideal [isto é, número de resíduos de aminoácidos similares ou idênticos nas partes alinhadas das sequências]; a posição 275, como definido em SEQ ID NO: 25, não é considerada para o cálculo da similaridade ou identidade. Em uma modalidade particular, a sequência variante de GlcK tem pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 25, em que o aminoácido da glucoquinase que corresponde à posição 275 de SEQ ID NO: 25 (ou o aminoácido na posição 275 da glucoquinase) é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular é uma lisina. Em uma modalidade, a sequência variante de GlcK tem pelo menos 95% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 25, em que o aminoácido que corresponde à posição 275 de SEQ ID NO: 25 (ou o aminoácido na posição 275 da glucoquinase) é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular é qual- quer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular é uma |li- sina. Em uma modalidade, a sequência variante de GlIcK tem pelo me- nos 97% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 25, em que o aminoácido que corresponde à posição 275 de SEQ ID NO: 25 (ou o aminoácido na posição 275 da glucoquinase) é qualquer aminoácido ex- ceto um ácido glutâmico, em particular é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular é uma lisina.
[0242] Em uma modalidade particular, a sequência da variante de GlIcK difere de SEQ ID NO: 25 por 1 a 30 substituições de aminoácidos, em que o aminoácido na posição 275 da dita variante de GlcK é qual- quer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular é uma lisina (a posição 275 não é considerada para o cálculo do número de substitui- ções). Em uma modalidade particular, a sequência da variante de GlIcK difere de SEQ ID NO: 25 por 1 a 20 substituições de aminoácidos, em que o aminoácido na posição 275 da dita variante de GlcK é qual- quer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular é uma lisina. Em uma modalidade particular, a sequência da variante de GlcK difere de SEQ ID NO: 25 por 1 a 15 substituições de aminoácidos, em que o ami- noácido na posição 275 da dita variante de GlcK é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular é uma lisina. Em uma modalidade particular, a sequência GlIcK difere de SEQ ID NO: 25 por 1 a 10 subs- tituições de aminoácidos, em que o aminoácido na posição 275 da dita variante de GlcK é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular é uma lisina. Em uma modalidade particular, a sequên- cia GlcK difere de SEQ ID NO: 25 por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou
12 substituições de aminoácidos em que o aminoácido na posição 275 da dita variante de GlIcK é qualquer aminoácido exceto um ácido glutãà- mico, em particular é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular é uma lisina.
[0243] Em uma modalidade particular, a sequência da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32,33 e 34, em que o amino o ácido na posição 275 da dita variante é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular é qualquer amino- ácido exceto um aminoácido ácido, em particular é uma lisina. Em uma modalidade particular, como a SEQ ID NO: 25 ou qualquer sequên- cia variante de GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou iden- tidade com SEQ ID NO: 25, como definido no presente documento (em particular, SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34), o aminoá- cido da glucoquinase da invenção que corresponde à posição 275 de SEQ ID NO: 25 (ou o aminoácido na posição 275 da glucoquinase da invenção) não é um ácido glutâmico.
[0244] Em uma modalidade particular, como a SEQ ID NO: 25 ou qualquer sequência variante de GIcK que tem pelo menos 90% de simi- laridade ou identidade com SEQ ID NO: 25, como definido no presente documento (em particular, SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34), o aminoácido da glucoquinase da invenção que corresponde à posição 275 de SEQ ID NO: 25 (ou o aminoácido na posição 275 da glucoquinase da invenção) não é um aminoácido ácido. Em uma moda- lidade particular, como a SEQ ID NO: 25 ou qualquer sequência variante de GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 25, como definido no presente documento (em particular, SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34), o aminoácido da glu- coquinase da invenção que corresponde à posição 275 de SEQ ID NO: (ou o aminoácido na posição 275 da glucoquinase da invenção)
é selecionado a partir do grupo que consiste em uma lisina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos. Em uma modalidade particular, como a SEQ ID NO: 25 ou qualquer sequência variante de GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 25, como definido no presente documento (em particular, SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34), o aminoácido da glucoquinase da invenção que corresponde à posição 275 de SEQ ID NO: 25 (ou o ami- noácido na posição 275 da glucoquinase da invenção) é uma lisina; As- sim, em uma modalidade particular, a sequência da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 22, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 e 43.
[0245] Para a definição da variante de GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 46, a similaridade ou identidade é calculada no presente documento ao longo de todo o comprimento das 2 sequências após alinhamento ideal [isto é, número de resíduos de aminoácidos similares ou idênticos nas partes alinhadas das sequências]; a posição 144, como definido em SEQ ID NO: 46, não é considerada para o cálculo da similaridade ou identidade. Em uma modalidade particular, a sequência variante de GlIcK tem pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 46, em que o aminoácido da glucoquinase que corresponde à posição 144 de SEQ ID NO: 46 (ou o aminoácido na posição 144 da glucoquinase) é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular é uma serina. Em uma modalidade, a sequência variante de GIcK tem pelo menos 95% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 46, em que o aminoácido que corresponde à posição 144 de SEQ ID NO: 46 (ou o aminoácido na posição 144 da glucoquinase) é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular é qualquer aminoácido exceto um ami-
noácido alifático, em particular é uma serina. Em uma modalidade, a se- quência variante de GlcK tem pelo menos 97% de similaridade ou iden- tidade com SEQ ID NO: 46, em que o aminoácido que corresponde à posição 144 de SEQ ID NO: 46 (ou o aminoácido na posição 144 da glucoquinase) é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular é uma serina.
[0246] Em uma modalidade particular, a sequência da variante de GlIcK difere de SEQ ID NO: 46 por 1 a 30 substituições de aminoácidos, em que o aminoácido na posição 144 da dita variante de GlIcK é qual- quer aminoácido exceto uma glicina, em particular é qualquer aminoá- cido exceto um aminoácido alifático, em particular é uma serina (a posi- ção 144 não é considerada para o cálculo do número de substituições). Em uma modalidade particular, a sequência da variante de GlcK difere de SEQ ID NO: 46 por 1 a 20 substituições de aminoácidos, em que o aminoácido na posição 144 da dita variante de GlcK é qualquer amino- ácido exceto uma glicina, em particular é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular é uma serina. Em uma modali- dade particular, a sequência da variante de GlIcK difere de SEQ ID NO: 46 por 1 a 15 substituições de aminoácidos, em que o aminoácido na posição 144 da dita variante de GlcK é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ali- fático, em particular é uma serina. Em uma modalidade particular, a se- quência GlcK difere de SEQ ID NO: 46 por 1 a 10 substituições de ami- noácidos, em que o aminoácido na posição 144 da dita variante de GlcK é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular é qual- quer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular é uma serina. Em uma modalidade particular, a sequência GlIcK difere de SEQ ID NO: 46 por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 substituições de aminoácidos em que o aminoácido na posição 144 5 da dita variante de
GlcK é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular é qual- quer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular é uma serina.
[0247] Em uma modalidade particular, a sequência da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 e 55, em que o aminoácido na posição 144 da dita variante existe qual- quer aminoácido exceto uma glicina, em particular é qualquer aminoá- cido exceto um aminoácido alifático, em particular é uma serina. Em uma modalidade particular, como a SEQ ID NO: 46 ou qualquer se- quência variante de GlIcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 46, como definido no presente documento (em particular SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55), o ami- noácido da glucoquinase da invenção que corresponde à posição 144 de SEQ ID NO: 46 (ou o aminoácido na posição 144 da glucoquinase da invenção) não é uma glicina.
[0248] Em uma modalidade particular, como a SEQ ID NO: 46 ou qualquer sequência variante de GlcK que tem pelo menos 90% de simi- laridade ou identidade com SEQ ID NO: 46, como definido no presente documento (em particular SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55), o aminoácido da glucoquinase da invenção que corresponde à po- sição 144 de SEQ ID NO: 46 (ou o aminoácido na posição 144 da glu- coquinase da invenção) não é um amino alifático ácido. Em uma moda- lidade particular, como a SEQ ID NO: 46 ou qualquer sequência vari- ante de GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 46, como definido no presente documento (em parti- cular SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55), o aminoácido da glucoquinase da invenção que corresponde à posição 144 de SEQ ID NO: 46 (ou o aminoácido na posição 144 da glucoquinase da invenção) é selecionado a partir do grupo que consiste em uma serina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos. Em uma modalidade particular, como a SEQ ID NO: 46 ou qualquer sequência variante de GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 46, como definido no presente documento (em particular SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55), o aminoácido da glucoquinase da invenção que corresponde à posição 144 de SEQ ID NO: 46 (ou o ami- noácido na posição 144 da glucoquinase da invenção) é uma serina; as- sim, em uma modalidade particular, a sequência da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 45, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 e 64.
[0249] Quando de definição da sequência da glucoquinase de Streptococcus thermophilus da invenção, está de acordo com os ensi- namentos do presente pedido que a atividade de glucoquinase em um derivado de DGCC7710 que expressa esta glucoquinase é significativa- mente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento e, opcionalmente, em que a Vmax da glucoquinase em um derivado de DGCC7710 é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento.
[0250] A invenção também é dirigida a um polinucleotídeo que co- difica uma glucoquinase da invenção, em particular uma glucoquinase de 322 aminoácidos da invenção. Em uma modalidade particular, o dito polinucleotídeo é de uma cepa de Streptococcus thermophilus. Com base no código genético, aqueles versados na técnica saberão se um polinucleotídeo codifica uma glucoquinase de Streptococcus thermophi- lus da invenção. Em uma modalidade particular, quando a glucoquinase codificada tem 322 aminoácidos de comprimento, o polinucleotídeo da invenção tem 969 nucleotídeos de comprimento.
[0251] Um exemplo não limitativo de um polinucleotídeo da inven- ção é descrito em SEQ ID NO: 21. Outro exemplo não limitativo de um polinucleotídeo da invenção é descrito em SEQ ID NO: 44. Outros exemplos não limitativos de polinucleotídeos da invenção são as se- quências apresentadas em SEQ ID NOs: 1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 e 19, nas quais o códon 144 ou 275 codifica qualquer aminoácido exceto uma glicina ou ácido glutâmico, respectivamente, em particular, codifica um qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático ou aminoácido ácido, respectivamente, em particular, codifica uma serina ou lisina, res- pectivamente. Em particular, exemplos não limitativos de polinucleotí- deos da invenção são as sequências apresentadas em SEQ ID NOs: 1,3, 5,7, 9, 11, 13, 15, 17 e 19, mas nas quais o códon 275 é AAA ou AAG. Em particular, exemplos não limitativos de polinucleotídeos da in- venção são as sequências apresentadas em SEQ ID NOs: 1,3,5,7,9, 11,13,15, 17 e 19, mas nas quais o códon 144 é AGT, AGC, TCT, TCC, TCA ou TCG.
[0252] A invenção também refere-se ao uso de um polinucleotídeo da invenção (ou uma construção, plasmídeo ou vetor) para conceber uma célula bacteriana, em particular uma célula bacteriana Gram-posi- tiva, em particular uma célula de Streptococcus thermophilus. Em uma modalidade particular, o polinucleotídeo da invenção (ou uma constru- ção, plasmídeo ou vetor) é usado para substituir o gene glcK de uma cepa de Streptococcus thermophilus, de modo que a cepa de Strepto- coccus thermophilus expresse uma glucoquinase da invenção. Em uma modalidade particular, a única glucoquinase expressa pela dita cepa de Streptococcus thermophilus obtida é uma glucoquinase da invenção. Em uma modalidade particular, o polinucleotídeo da invenção (ou uma construção, plasmídeo ou vetor) é usado para substituir o gene glcK de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose. Em uma modalidade, o polinucleotídeo da invenção (ou uma construção, plasmídeo ou vetor) é usado para substituir o gene glcK de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para ga- lactose.
[0253] A invenção também é dirigida a um gene ccpA mutante (ou polinucleotídeo de ccpA mutante) como definido ou como identificado acima.
[0254] Em uma modalidade, a invenção é dirigida a um polinucleo- tídeo de ccpA (mutante) de Streptococcus thermophilus o qual, quando inserido em vez do gene ccpA da cepa DGCC7710 [dando um derivado de DGCC7710], leva a um derivado de DGCC7710 que exibe uma pro- porção de atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, de pelo menos 4.10º. Neste contexto, o derivado de DGCC7710 é a cepa DGCC7710 na qual o gene ccpA precursor foi substituído pelo gene ccpA mutante a ser testado.
[0255] Em uma modalidade, a invenção é dirigida a um gene ccpA (mutante) de Streptococcus thermophilus o qual, quando inserido em lu- gar do gene ccpA da cepa DSM32587 [dando um derivado de DSM32587], leva a um derivado de DSM32587 que: - exibe uma proporção da atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, de pelo menos 4,10; e - libera uma concentração de glicose, como avaliado por meio do Teste B, que é pelo menos 50 mM ou libera uma concentração de glicose que é aumentada de pelo menos 150% ou pelo menos 200% comparado com a concentração de glicose liberada pela cepa DSM32587, quando ambas são avaliadas por meio do Teste B.
[0256] Neste contexto, o derivado de DSM32587 é a cepa DSM32587 na qual o gene ccpA precursor foi substituído pelo gene ccpA mutante a ser testado.
[0257] Em uma modalidade, o polinucleotídeo de ccpA mutante não é um alelo com silenciamento (isto é, um alelo rompido) do gene ccpA.
[0258] Em uma modalidade, o polinucleotídeo de ccpA mutante é um alelo do gene ccpA mutante na sequência codificadora. Em uma modalidade, a sequência codificadora do polinucleotídeo de ccpA mu- tante difere quanto a pelo menos uma mutação, em particular uma mu- tação do gene ccpA, como definido em SEQ ID NO: 65, 66, 67, 68, 69 ou 70.
[0259] Em uma modalidade, o gene ccpA traz uma mutação seleci- onada a partir do grupo que consiste em uma mutação sem sentido (non-sense) localizada entre o nucleotídeo 1 e o nucleotídeo 270 da se- quência codificadora do gene ccpA e uma mutação localizada no pri- meiro quarto da sequência codificadora do gene ccpA (isto é, entre o nucleotídeo 1 e o nucleotídeo 250) que leva a um deslocamento (fra- meshift) de quadro do quadro de leitura aberta do gene ccpA. Em uma modalidade, a mutação que leva a um deslocamento (frameshift) de quadro do quadro de leitura aberta do gene ccpA está localizada entre o nucleotídeo 50 e o nucleotídeo 200 da sequência codificadora do gene ccpA. Em uma modalidade, a mutação que leva a um deslocamento (frameshift) de quadro do quadro de leitura aberta do gene ccpA está localizada entre o nucleotídeo 100 e o nucleotídeo 150 da sequência codificadora do gene ccpA. Qualquer que seja a localização da mutação que leva a um deslocamento de quadro, a mutação é selecionada a par- tir do grupo que consiste em uma eliminação, uma inserção ou uma eli- minação/inserção (as quais nem todas são múltiplos de 3). Em uma mo- dalidade, a mutação do gene ccpA é uma eliminação de um nucleotídeo A no trecho de 7 nucleotídeos A nas posições 114-120.
[0260] Em uma modalidade, a sequência do polinucleotídeo ccpA mutante é selecionada a partir do grupo que consiste em a) uma se- quência como definido em SEQ ID NO: 71; e b) uma sequência vari- ante de ccpA que tem pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 71 (em particular SEQ ID NO: 72 a 76). A definição da variante de ccpA que tem pelo menos 90% de identidade é como detalhado acima em!ill.
[0261] A invenção também é dirigida ao uso de um polinucleotídeo de glcK, como definido no presente documento [que codifica uma glu- coquinase de Streptococcus thermophilus mutante, como definido no presente documento] e/ou ao uso de um polinucleotídeo de ccpA, como definido no presente documento, para conceber uma cepa de Strepto- coccus thermophilus. O polinucleotídeo de glcK e o polinucleotídeo de CCcpA, como definido no presente documento, são considerados mutan- tes de acordo com a invenção (isto é, um alelo mutante, como definido no presente documento ou como identificável por meio do método des- crito no presente documento). Em uma modalidade, o polinucleotídeo de glcK como definido no presente documento é usado. Em uma moda- lidade, o polinucleotídeo de ccpA como definido no presente documento é usado. Em uma modalidade, tanto o polinucleotídeo de glcK como de- finido no presente documento como o polinucleotídeo de ccpA como de- finido no presente documento são usados.
[0262] Em uma modalidade, o uso consiste em substituir [ou tro- car] o gene glcK e/ou o gene ccpA de uma cepa de Streptococcus ther- mophilus precursora por um polinucleotídeo de glcK mutante e/ou um polinucleotídeo de ccpA mutante, como definido no presente docu- mento, para conceber uma cepa de Streptococcus thermophilus que tem seu(s) gene(s) precursor(es) substituído(s) pelo(s) gene(s) mu- tante(s), como definido no presente documento. A invenção também é dirigida a um método para conceber uma cepa de Streptococcus ther- mophilus que compreende 1) substituir [ou trocar] o gene glcK e/ou o gene ccpA de uma cepa de Streptococcus thermophilus precursora por um polinucleotídeo de glcK mutante e/ou um polinucleotídeo de ccpA mutante, como definido no presente documento, e 2) obter uma cepa de Streptococcus thermophilus com seu(s) gene(s) precursor(es) subs-
tituído(s) pelo(s) gene(s) mutante(s), como definido no presente docu- mento. Em uma modalidade de uso ou do método, a cepa de Strepto- coccus thermophilus precursora é uma cepa de Streptococcus ther- mophilus positiva para lactose, negativa para galactose. Em uma moda- lidade de uso ou do método, a cepa de Streptococcus thermophilus pre- cursora é uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lac- tose, negativa para galactose que exibe uma proporção da atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a ativi- dade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, que é menor do que 4,10 ou menor do que 3,10%. Em uma modalidade de uso ou do método, a cepa de Streptococcus thermophilus precursora é uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para ga- lactose que traz uma mutação gene glcK como definido no presente do- cumento ou um gene ccpA mutante como definido no presente docu- mento, e que exibe uma proporção da atividade de beta-galactosidase, testada por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, maior do que 4,10.
[0263] A invenção também é dirigida ao uso de um gene mutante que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em particular um gene manL mutante, um gene manM mutante, um gene manN mutante ou um manO mutante, para conceber uma cepa. Em uma modalidade, a invenção é dirigida ao uso de um gene mutante que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em par- ticular um gene manL mutante, um gene manM mutante ou um gene manN mutante para conceber uma cepa. O gene manL, gene manM ou gene manN como definido no presente documento são considerados mutantes de acordo com a invenção (isto é, um alelo mutante como descrito no presente documento ou como identificável por meio dos mé- todos descritos no presente documento). Em uma modalidade, o uso consiste em substituir[ou trocar] o gene manl, gene manM ou gene manN de uma cepa de Streptococcus thermophilus precursora, respectivamente, por um polinucleotídeo de manL, manM ou manN mu- tante, como definido no presente documento, para conceber uma cepa de Streptococcus thermophilus que tem seu gene precursor substituído pelo gene (mutante), como definido no presente documento. A invenção é também dirigida a um método para conceber uma cepa de Strepto- coccus thermophilus que compreende 1) substituir [ou trocar] o gene manL, gene manM ou gene manN de uma cepa de Streptococcus ther- mophilus precursora, respectivamente, porum polinucleotídeo de manL, manM ou ManL mutante como definido e 2) obter uma cepa de Streptococcus thermophilus que tem seu gene precursor substituído pelo gene (mutante), como definido no presente documento. Em uma modalidade de uso ou do método, a cepa de Streptococcus thermophi- lus precursora é uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose. Por "respectivamente" entenda-se que o gene manL precursor é substituído pelo mutante manL, o gene manM precursor é substituído pelo mutante manM e/ou o gene manN precur- sor é substituído pelo mutante manN.
[0264] Em uma modalidade de uso ou do método, a cepa de Strep- tococcus thermophilus precursora é uma cepa de Streptococcus ther- mophilus positiva para lactose, negativa para galactose que exibe uma proporção de atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, que é de pelo menos 4,10, como definido no presente do- cumento. Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus precursora é uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lac- tose, negativa para galactose, como definido em qualquer dos pontos | a V acima. Os inventores mostraram que a introdução de um gene mu- tante que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em particular um gene manL mutante, um gene manM mutante ou um gene manN mutante, em uma cepa de Streptococcus thermophilus leva a uma proporção de atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, que é de pelo menos 4,108, como definido no presente documento, levando a uma sinergia em relação à liberação de glicose.
[0265] Em uma modalidade, a invenção é dirigida ao uso de um gene manL, gene manM ou gene manN mutantes de Streptococcus thermophilus que codificam, respectivamente, uma proteína IIABYa”, uma proteína IICYº" ou uma proteína IIDYº", em que a atividade de im- portação de glicose da dita proteína é diminuída ou eliminada ao subs- tituir o gene manL, o gene manM ou o gene manN correspondente de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, nega- tiva para galactose que exibe uma proporção da atividade de beta-ga- lactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase, como testado no Teste E, de pelo menos 4,10, como definido no presente documento.
[0266] Em uma modalidade, o gene manL, gene manM ou gene manN mutante de Streptococcus thermophilus é caracterizado pelo fato de, quando inserido individualmente em vez do gene manL, gene manM ou gene manN da cepa DSM32587 [dando um derivado de DSM32587], o derivado de DSM32587: - exibe uma proporção da atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, de pelo menos 4,108; e - libera uma concentração de glicose que é aumentada de pelo menos 150% ou pelo menos 200% comparado com a concentração de glicose liberada pela cepa DSM32587, quando ambas são avaliadas por meio do Teste B.
[0267] Neste contexto, o derivado de DSM32587 é a cepa DSM32587 na qual o gene manL, gene manM ou gene manN pre- cursor foi substituído pelo gene manL, gene manM ou gene manN mu- tante a ser testado.
[0268] Em uma modalidade, o gene manL, gene manM ou gene manN mutante de Streptococcus thermophilus é caracterizado pelo fato de, quando inserido individualmente em vez do gene manL, gene manM ou gene manN da cepa DGCC7710-ccpAniarisi2o (isto é, uma cepa DGCC7710 em que seu gene ccpA precursor foi substituído pelo gene ccpA como definido em SEQ ID NO: 71) [dando um derivado de DGCC7710-ccpAniaris120], o derivado de DGCC7710-ccpAnia114-120: - exibe uma proporção da atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, de pelo menos 4,10; e - libera uma concentração de glicose que é aumentada de pelo menos 150% ou pelo menos 200% comparado com a concentração de glicose liberada pela cepa DGCC7710-ccpAntari4-120 quando ambas foram avaliadas por meio do Teste B.
[0269] Neste contexto, a cepa DGCC7710-ccpAniaii4-120 É a cepa DGCC7710 na qual seu gene ccpA precursor foi substituído pelo gene ccpA, como definido em SEQ ID NO: 71. Neste contexto, o deri- vado de DGCC7710-ccpAnatis12o é um derivado de DGCC7710- CCpAniari4-120 NO qual o gene manL, gene manM ou gene manN precur- sor foi substituído pelo gene manL, gene manM ou gene manN mutante a ser testado, isto é, uma cepa DGCC7710 na qual o gene ccpA precur- sor foi substituído pelo gene ccpA como definido em SEQ ID NO: 71 e o gene manL, gene manM ou gene manN precursor foi substituído pelo gene manL, gene manM ou gene manN mutante a ser testado.
[0270] Por "inserido individualmente" entenda-se que, para caracte- rização — do gene man mutante, apenas umgenemanda cepa
DSM32587 ou da cepa DGCC7710-ccpAniar14-120 é substituído (ou tro- cado) pelo respectivo gene man mutante para ser caracterizado.
[0271] Em uma modalidade, o gene mutante que codifica uma pro- teína do PTS específico para manose-glicose é um gene manL mu- tante. Em uma modalidade, o gene manL mutante de Streptococcus thermophilus codifica uma proteína IIABYº" de Streptococcus thermophi- lus cuja atividade de importação de glicose é diminuída ou eliminada, em particular uma proteína IIABYº" de Streptococcus thermophilus trun- cada na posição 305 (IIABYº"395). Em uma modalidade, o gene manL mutante de Streptococcus thermophilus codifica uma proteína IIAB- Mantruncada de Streptococcus thermophilus cuja sequência é selecio- nada a partir do grupo que consiste em a) uma sequência como definido em SEQ ID NO: 156 e b) uma sequência variante de IIAB que tem pelo menos 90% similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 156, em parti- cular, tem 30 5 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, o gene manL mutante codifica uma proteína IIABY*" cuja sequência é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 156 a 172. Em uma modalidade, o gene manL mutante de Streptococcus ther- mophilus é como definido em SEQ ID NO: 155.
[0272] Em uma modalidade, o gene mutante que codifica uma pro- teína do PTS específico para manose-glicose é um gene manM mu- tante. Em uma modalidade, o gene manM mutante de Streptococcus thermophilus codifica uma proteína IICYM*" de Streptococcus thermophi- lus cuja atividade de importação de glicose é diminuída ou eliminada, em particular uma proteína IICYº*" de Streptococcus thermophilus trun- cada na posição 208 (IICYº"2,3): Em uma modalidade, o gene manM mu- tante de Streptococcus thermophilus codifica uma proteína IICYa" trun- cada de Streptococcus thermophilus cuja sequência é selecionada a partir do grupo que consiste em a) uma sequência como definido em SEQ ID NO: 202 e b) uma sequência variante de IICYº" que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 202, em particular que tem 208 aminoácidos de comprimento. Em uma modali- dade, o gene manM mutante codifica uma proteína IICY* cuja sequên- cia é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 202-
209. Em uma modalidade, o gene manM mutante de Streptococcus thermophilus é como definido em SEQ ID NO: 201.
[0273] Em uma modalidade, o gene mutante que codifica uma pro- teína do PTS específico para manose-glicose é um gene manN mu- tante. Em uma modalidade, o gene manN mutante de Streptococcus thermophilus codifica uma proteína IIDYº" de Streptococcus thermophi- lus cuja atividade de importação de glicose é diminuída ou eliminada, em particular uma proteína IIDYº" de Streptococcus thermophilus trun- cada na posição 28 (IIDVYº"2;). Em uma modalidade, o gene manN mu- tante de Streptococcus thermophilus codifica uma proteína IIDYa&" trun- cada de Streptococcus thermophilus cuja sequência é selecionada a partir do grupo que consiste em a) uma sequência como definido em SEQ ID NO: 251; e b) uma sequência variante de IIDY*" que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 251, em particular que tem 28 aminoácidos de comprimento. Em uma modali- dade, o gene manN mutante codifica uma proteína IIDYº" cuja sequên- cia é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 251 a 255. Em uma modalidade, o gene manN mutante de Streptococcus thermophilus é como definido em SEQ ID NO: 250.
[0274] A expressão "variante de IIABY*, variante de IICY*" e vari- ente de IIDYº" que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade" é como definido na parte VI acima.
[0275] Em uma modalidade, o polinucleotídeo como definido no pre- sente documento é fornecido em uma forma isolada. Um polinucleotí- deo "isolado" é substancial ou essencialmente isento de componentes que normalmente acompanham ou interagem com o gene como encon- trado em seu ambiente natural. Assim, um polinucleotídeo isolado é substancialmente isento de outro material celular ou meio de cultura quando produzido por meio de técnicas recombinantes ou substancial- mente isentos de precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizado quimicamente.
[0276] A invenção também é dirigida a uma construção que com- preende um polinucleotídeo como definido no presente documento. Em uma modalidade, a presente invenção abrange uma construção que compreende um polinucleotídeo da invenção operativamente ligado a uma sequência reguladora. O termo "operativamente ligado" refere-se a uma justaposição na qual os componentes descritos estão em uma relação que lhes permite funcionar da maneira pretendida. Uma se- quência reguladora "operativamente ligada" a uma sequência codifica- dora é ligada de tal maneira que a expressão da sequência codificadora é alcançada sob condições compatíveis com as sequências de con- trole. O termo "sequências reguladoras" inclui promotores e/ou intensi- ficadores e outros sinais de regulação de expressão. O termo "promo- tor' é usado no sentido normal da técnica, por exemplo, um sítio de li- gação à RNA polimerase. Em uma modalidade, de forma independente ou em combinação com a modalidade "sequência reguladora", a cons- trução contém ou expressa outro gene, tal como um marcador, que per- mita a seleção da construção. Há vários marcadores que podem ser usados, por exemplo, marcadores que conferem resistência a antibióti- cos - por exemplo, resistência a antibióticos bacterianos - tais como Eri- tromicina, Ampicilina, Estreptomicina e Tetraciclina.
[0277] Assim, em um aspecto adicional, é fornecido um vetor que compreende um polinucleotídeo ou uma construção como definido no presente documento. Como no presente documento usado, o termo "ve- tor" refere-se a qualquer molécula de ácido nucleico na qual outro ácido nucleico (por exemplo, o polinucleotídeo da invenção) pode ser inserido e que pode ser introduzido e replicado dentro da cepa bacteriana, tal como a cepa de Streptococcus thermophilus. Assim, o termo refere-se a qualquer construção de ácido nucleico (e, se necessário, qualquer sis- tema de administração associado) capaz de ser usado para introdu- zir material genético em uma cepa bacteriana, em particular uma cepa de Streptococcus thermophilus. A seleção de vetores apropriados é de conhecimento daqueles versados na técnica. Em uma modalidade, o vetor é um plasmídeo. Como usado no presente documento, o termo "plasmídeo" refere-se a uma construção de DNA fita dupla (ds) circular que pode ser usada como um vetor para introduzir DNA em uma cepa bacteriana, em particular uma cepa de Streptococcus thermophilus. As construções ou os vetores podem ser introduzidos em uma cepa bacte- riana como descrito no presente documento, tal como a cepa DGCC7710.
[0278] O polinucleotídeo, construção, vetor ou plasmídeo da inven- ção descritos no presente documento pode ser introduzido em uma cepa de Streptococcus thermophilus usando qualquer método disponí- vel.
[0279] "Introdução" (e "introduzido") se destina a significar apresen- tar a cepa de Streptococcus thermophilus, polinucleotídeo, constru- ção, vetor ou plasmídeo da invenção, como definido no presente docu- mento, de tal maneira que o(s) componente(s) tenha(m) acesso ao in- terior da cepa de Streptococcus thermophilus. Os métodos e composi- ções não dependem do método particular para introduzir uma sequência em uma cepa de Streptococcus thermophilus, apenas que o polinucleo- tídeo, construção, vetor ou plasmídeo da invenção obtenha acesso ao interior da cepa de Streptococcus thermophilus. A introdução inclui a in- corporação de um polinucleotídeo, construção, vetor ou plasmídeo da invenção na cepa de Streptococcus thermophilus em que o polinucleo- tídeo ou construção da invenção pode ser incorporado no genoma da cepa de Streptococcus thermophilus e inclui o fornecimento transitó- rio (direto) de um polinucleotídeo ou construção na cepa de Streptococ- cus thermophilus.
[0280] A introdução de um polinucleotídeo, construção, vetor ou plasmídeo da invenção em uma cepa de Streptococcus thermophi- lus pode ser realizada por meio de vários métodos, incluindo transfor- mação, conjugação, transdução ou fusão de protoplastos. Métodos para introduzir um polinucleotídeo, construção, vetor ou plasmídeo da inven- ção através de transformação em uma cepa de Streptococcus ther- mophilus incluem, porém sem limitações, microinjeção, eletroporação, métodos de transformação estáveis, métodos de transformação transi- tórios [tal como competência induzida usando produtos químicos (por exemplo, cátions divalentes, tal como CaCl2) ou meios mecânicos (ele- troporação)], aceleração de partículas balísticas (bombardeamento de partículas), transferência direta de genes, introdução mediada por vírus, peptídeos de penetração celular ou nanopartículas de sílica mesopo- rosa (MSN) mediada por proteína de distribuição direta. A introdução de um polinucleotídeo, construção, vetor ou plasmídeo da invenção em uma cepa de Streptococcus thermophilus pode ser realizada por meio de conjugação, a qual é um método específico de troca natural de DNA que requer contato físico célula a célula. A introdução de um polinucle- otídeo, construção, vetor ou plasmídeo da invenção em uma cepa de Streptococcus thermophilus pode ser realizada através de transdução, a qual é a introdução de DNA através de uma infecção por vírus (por exemplo, fago), o qual também é um método natural de troca de DNA. Em geral, estes métodos envolvem a incorporação de um polinucleotí- deo dentro de uma molécula de DNA ou RNA viral.
[0281] A invenção também é dirigida aos seguintes genes man mu- tantes como tal e suas proteínas codificadas correspondentes: - o gene manL mutante de Streptococcus thermophilus que codifica uma proteína II!ABYº" truncada de Streptococcus thermophilus cuja sequência é selecionada a partir do grupo que consiste em a) uma sequência como definido em SEQ ID NO: 156 e b) uma sequência vari- ante de IIAB que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 156, em particular tem 305 aminoácidos de compri- mento. Em uma modalidade, o gene manL mutante de Streptococcus thermophilus codifica uma proteína IIABYº*" cuja sequência é selecio- nada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 156 a 172. Em uma modalidade, o gene manL mutante de Streptococcus thermophilus é como definido em SEQ ID NO: 155; - ogene manN mutante de Streptococcus thermophilus que codifica uma proteína IIDY*" truncada de Streptococcus thermophi- lus cuja sequência é selecionada a partir do grupo que consiste em a) uma sequência como definido em SEQ ID NO: 2 51; e b) uma sequên- cia variante de IIDVYº" que tem pelo menos 90% de similaridade ou iden- tidade com SEQ ID NO: 2 51, em particular tem 28 aminoácidos de com- primento. Em uma modalidade, o gene manN mutante de Streptococ- cus thermophilus codifica uma proteína IIDY*" cuja sequência é selecio- nada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 251 a 255. Em uma modalidade, o gene manN mutante de Streptococcus thermophilus é como definido em SEQ ID NO: 250.
[0282] A expressão "variante de I!IABY*"e variante de IIDYº&" que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade" é definida na parte VI acima.
[0283] A invenção também é dirigida a um método para conceber uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, nega- tiva para galactose secretora de glicose que compreende:
a) fornecer uma cepa de Streptococcus thermophilus posi- tiva para lactose, negativa para galactose que secreta uma concentra- ção de glicose menor do que 1 MM quando avaliada por meio do Teste B; b) realizar mutação de (um) ou mais gene(s) selecionado(s) a partir do grupo que consiste no gene glcK, no gene ccpA, no gene lacZ e no gene ptsH e, opcionalmente, uma mutação de um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose; e c) selecionar, a partir dos mutantes obtidos em b), uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para ga- lactose em que a proporção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glu- coquinase da cepa, como avaliado por meio do Teste E, é pelo menos 4,108, como definido no presente documento.
[0284] Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophi- lus positiva para lactose, negativa para galactose fornecida em a) exibe uma proporção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, que é menor do que 4,10" 6 ou menor do que 3,10, como definido no presente documento.
[0285] A invenção também é dirigida a um método para conceber uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, nega- tiva para galactose secretora de glicose que compreende: a) fornecer uma cepa de Streptococcus thermophilus posi- tiva para lactose, negativa para galactose que exibe uma proporção da atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avali- ado por meio do Teste E, de pelo menos 4.10 como definido e que li- bera uma concentração de glicose entre 8 e 50 mM quando testada por meio do Teste B;
b) realizar mutação de um gene que codifica uma proteína PTS específico para manose-glicose, em particular um gene manL, um gene manM ou uma gene manN, na cepa fornecida em a); c) selecionar, a partir dos mutantes obtidos em b), uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para ga- lactose, em que o dito mutante obtido em b) libera uma concentração de glicose de pelo menos 60 mM, quando avaliado por meio do Teste B. Em uma modalidade, o dito mutante obtido em b) libera uma concen- tração de glicose de pelo menos 70 mM. Em uma modalidade, o dito mutante obtido em b) libera uma concentração de glicose de pelo menos 80 MM. Em uma modalidade, o dito mutante obtido em b) libera uma concentração de glicose de pelo menos 90 mM. Em uma modalidade, o dito mutante obtido em b) libera uma concentração de glicose de pelo menos 100 mM.
[0286] A invenção também é dirigida a um método para selecio- nar uma cepa de S. thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose de acordo com a invenção que compreende: 1) fornecer uma cepa de Streptococcus thermophilus posi- tiva para lactose, negativa para galactose que expressa uma glucoqui- nase cuja atividade é mais do que 1800 U/g de extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste A, em particular mais do que 200 O L/g de extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste A; 2) modificar o quadro de leitura aberta do gene glcK da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para ga- lactose da etapa 1), de modo que a dita cepa de Streptococcus ther- mophilus modificada expresse uma glucoquinase cuja sequência é mo- dificada, como definido no presente documento, comparado com a se- quência da glucoquinase precursora; 3) avaliar, por meio do Teste A, a atividade de glucoquinase na dita cepa de Streptococcus thermophilus modificada obtida na etapa
2) 4) selecionar uma cepa de Streptococcus thermophilus mo- dificada que expressa uma glucoquinase cuja atividade na dita cepa mo- dificada é reduzida, mas não nula, como definido no presente docu- mento por meio do Teste A; 5) opcionalmente, avaliar, por meio do Teste C, a Vnax para a glucoquinase na ditacepa de Streptococcus thermophilus modifi- cada selecionada na etapa 4) e selecionar uma cepa de Streptococcus thermophilus modificada que expressa uma glucoquinase cuja Vnax na dita cepa modificada é reduzida, mas não nula, como definido no pre- sente documento por meio do Teste C.
[0287] Em uma modalidade da etapa 2), a modificação do quadro de leitura aberta do gene glcK é realizada através de mutagênese diri- gida do gene glcK da cepa de Streptococcus thermophilus da etapa 1). Em uma modalidade da etapa 2), a modificação do quadro de leitura aberta do gene glcK é realizada através da substituição do quadro de leitura aberta precursor do gene glcK da cepa da etapa 1) por um qua- dro de leitura aberta heterólogo do gene glcK (onde "heterólogo" signi- fica um quadro de leitura aberta do gene glcK que não está original- mente presente na cepa da etapa 1), por exemplo, um quadro de leitura aberta do gene glcK que é concebido sinteticamente ou um quadro de leitura aberta do gene glcK obtido a partir de outra cepa de Streptococ- cus thermophilus).
[0288] Em uma modalidade da etapa 4), a característica "atividade de glucoquinase na dita cepa modificada é significativamente reduzida, mas não nula" é como definido acima para a definição da cepa de Strep- tococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção. Em uma modalidade particular, a atividade de glucoquinase da cepa de Streptococcus thermophilus modificada está, como avaliado por meio do Teste A, entre 200 e 1500, entre 300 e 1200 entre 400 e
1000 U/g de extrato proteico total ou está entre um valor mínimo seleci- onado a partir do grupo que consiste em 200, 300 e 400 U/g de extrato proteico total e um valor máximo selecionado a partir do grupo que con- siste em 1000, 1200 e 1500 U/g de extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste A. Em uma modalidade particular, a atividade de glu- coquinase da cepa de Streptococcus thermophilus modificada é entre 5 e 60%, 10 e 50%, 15 e 40% da atividade da atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710 (ambas avaliadas por meio do Teste A) ou está en- tre uma porcentagem mínima selecionada a partir do grupo que consiste em 5, 10 e 15% da atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710 e uma porcentagem máxima selecionada a partir do grupo que consiste em 40, 50 e 60% da atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710 (ambas são avaliadas por meio do Teste A). A expressão "atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710" é como definido acima.
[0289] Em uma modalidade particular da etapa 5), a característica "Vmax para a glucoquinase na dita cepa modificada é significativa- mente reduzida, mas não nula" é como definido acima para a definição da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose da invenção. Em uma modalidade particular, a veloci- dade de avanço máxima da glucoquinase na cepa de Streptococcus thermophilus modificada está entre 200 e 1500, entre 300 e 1200, en- tre 400 e 1000 U/g de extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste C, ou está entre um valor mínimo selecionado a partir do grupo que consiste em 200, 300 e 400 U/g de extrato proteico total e um valor máximo selecionado a partir do grupo que consiste em 1000, 1200 e 1500 U/g de extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste C. Em uma modalidade particular, a Vnax para a glucoquinase na cepa de Streptococcus thermophilus modificada está entre 5 e 60% 10 e 50%, entre 15 e 40% da Vmax para a glucoquinase da cepa DGCC7710, quando ambas são avaliadas por meio do Teste C, ou está entre uma porcentagem mínima selecionada a partir do grupo que consiste em 5, e 15% da Vmax para a atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710 e uma porcentagem máxima selecionada a partir do grupo que consiste em 40, 50 e 60% da Vmax para a glucoquinase da cepa DGCC77 10. A expressão "Vnax para a glucoquinase da cepa DGCC7710" é como definido acima.
[0290] Várias características e modalidades preferidas da presente invenção serão agora descritas por meio de exemplos não limitativos.
MATERIAL E MÉTODOS Cepas e condições de crescimento
[0291] As cepas de S. thermophilus (ST) descritas no presente pe- dido foram crescidas a 37ºC em caldo M17 (Oxoid, referência do forne- cedor CMO817) suplementado com 30 g/L de carboidratos apropria- dos e, se necessário, a adição de 15 g/L de Agar bacteriológico tipo À (Biokar, número de referência do fornecedor A1010HA) ou a 43ºC em leite (leite semidesnatado UHT "Le Petit Vendéen" + 3% de leite em pó BBA Lactalis). O caldo M17 autoclavado foi suplementado com Lactose, sacarose, galactose ou glicose filtrada em um filtro de 0,2 um. Os esto- ques congelados de cepas ST foram obtidos ao diluir pela metade uma cultura noturna em caldo M17 suplementado com 5 g/L de lactose e gli- cerol a 10% e armazenados a -20ºC. Quantificação do catabolismo de carboidratos durante fermenta- ção do leite [Teste B]
[0292] O leite semidesnatado UHT "Le Petit Vendéen" ("leite para iogurte") que contém 3% (p/v) de leite em pó (BBA, Lactalis), previa- mente pasteurizado durante 10 min a 90ºC, foi inoculado a 1% (v/v, cerca de 107 CFU/mI) com uma cultura da cepa de S. thermophilus a ser analisada (células ressuspensas em caldo M17 sem carboidratos da cultura noturna cultivada em caldo M17 suplementado com sacarose a
3%). Descobriu-se que este leite continha cerca de 175 mM de lac- tose. Os frascos de leite inoculados foram incubados estaticamente em banho-maria a 43ºC durante 24h para obtenção do leite fermentado.
[0293] As amostras TO e amostras de leite fermentado (T24h) (5 g) foram diluídas em 25 g de NH2SO, a 0,025 N antes de serem centrifu- gadas a 4600 rpm durante 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi filtrado através de um filtro de náilon de 0,2 um (Phenomenex, Alemanha, As- chaffenburg) diretamente em um frasco de HPLC de 2 ml. As amostras foram armazenadas a -20ºC até posterior análise. Os carboidratos fo- ram quantificados por meio de cromatografia líquida de alta eficiência (Agilent 1200 HPLC) equipada com um detector de índice de refração usando uma coluna de troca aniônica Aminex HPX-87H (Bio-Rad Labo- ratories Inc.) a 35ºC, com H2SO,s a 12,5 mM como fluido de eluição e vazão de 0,6 ml! min. A exploração dos resultados foi feita com o sof- tware de reprocessamento Chemstation (Agilent). Sequenciamento de glcK
[0294] A amplificação por PCR do gene da glucoquinase foi reali- zada usando os iniciadores GlcK-F4 (5-CAGGTATGAGTTTAG- CAACGG-3') e GIcCK-R12 (5-ATTCACCACGGCCTGAGAC-3'), [etapa de incubação a 98ºC, 5 min, seguido de 33 ciclos de 98ºC, 45 s; 58, 30 s; 68ºC, 3 min, com uma etapa final de extensão a 72ºC, 7 min). Os produtos de PCR de 2788 pb foram, então, tratados com o Illustra”Y ExoProStar"Y de acordo com as instruções do fabricante (GE Heal- thcare). As reações de sequenciamento foram realizadas usando o kit BigDye& Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Life Technologies), de acordo com as instruções do fabricante, usando um AB3500 (Applied Biosystems'Y) e iniciadores listados na Tabela 2.
Tabela 2: Lista de iniciadores para sequenciamento de glcK. Atividade de glucoquinase [Teste A]
[0295] Uma cultura noturna fresca de uma cepa de Streptococcus thermophilus em caldo M17 que contém 30 g/L de lactose foi obtida e usada para inocular a 1% (vol/vol) de 10 ml de caldo M17 fresco a 30 g/L de lactose. As células foram coletadas por meio de centrifugação (6000 g, 10 min, 4ºC) em uma densidade óptica de 600 nm (ODçoo) de 0,8 +/- 0,2, lavadas em 5 ml de tampão GLCK gelado (MgCl2 a 5 mM, K2HPO4KH2PO,. a 10 mM [pH de 7,2]) e ressuspensas em 500 ul de tampão GLCK gelado. Inibidores de protease isentos de EDTA "cOm- plete'M" (Roche, referência de fornecedor 04693132001) foram adicio- nados ao tampão GLCK, como descrito pelo fornecedor. As células fo- ram rompidas pela adição de 100 mg de esferas de vidro (150-212 um, Sigma G1145) a 200 ul de células ressuspensas e oscilação em uma frequência de 30 ciclos/s durante 6 min em um moinho oscilante MM200 (Retsch, Haan, Alemanha). Os detritos celulares e as esferas de vidro foram removidos por meio de centrifugação (14000 g, 15 min, 4ºC)e o sobrenadante transferido para um tubo de centrífuga limpo de 1,5 mL mantido em gelo. O teor total de proteínas foi determinado usando o FLUKA Protein Quantification Kit-Rapid (ref 51254). A atividade de glucoquinase nos extratos celulares foi determinada espectrofotometri- camente por um ensaio acoplado de glicose-6-fosfato desidrogenase (G-6PDH, EC1.1.1.49):NADPH (Porter et al., 1982), essencialmente como descrito por Pool et a/. (2006). Cada amostra (5, 10 e 20 uL) foi adicionada ao tampão de ensaio (KHPO4/KH2PO4a 10 mM [pH de 7,2], MgCl2 a 5 MM, ATP a 1 MM, glicose a 20 MM, NADP a 1 mM, 1 U de G- 6PDH) em um volume final de 250 uL e a mistura foi deixada em repouso durante 5 min a 30ºC. A densidade óptica a 340 nm foi medida durante minutos usando um leitor de microplacas de detecção múltipla Synergy HT (BIO-TEK). Uma unidade de glucoquinase corresponde à quantidade de enzima que catalisa a fosforilação de 1 umole de D-gli- cose em D-Glicose 6-fosfato por minuto sob as condições de ensaio. À atividade de glucoquinase foi calculada da seguinte forma: Atividade de glucoquinase (U/g do extrato proteico total) = dOD x V / [dt x | x € x Qprot], em que: - dOD é a variação da densidade óptica (OD) a 340 nm -Vé o volume da reação (aqui 250 uL) dt = tempo de medição (em minutos) | = comprimento do percurso óptico (aqui 0,73 cm) e= coeficiente de atenuação molar de NADPH; H+(aqui 6220 cm2/umol) Qprot = quantidade de proteína na cubeta (em g)
[0296] As medições foram em triplicata para cada amostra e os va- lores de atividade de glucoquinase específicos fornecidos no presente documento sob o Teste A são a média de três experimentos indepen- dentes . Velocidade de avanço máxima de GIcK [Teste C]
[0297] A velocidade de avanço máxima (Vmax) de GlcK foi deter- minada usando várias concentrações de glicose (0, 5, 10, 15, 20 mM) no extrato bruto preparado como descrito em "atividade de glucoqui- nase" (Teste A). As medições foram em triplicatas para cada amostra e os valores de Vmax fornecidos no presente documento no Teste C são a média de três experimentos independentes. A regressão linear que representa o inverso da velocidade específica em função do inverso da concentração de glicose dá o inverso da velocidade de avanço máxima na interseção com o eixo Y do gráfico. Desempenho de acidificação do leite
[0298] As propriedades acidificantes das cepas de S. thermophi- lus foram avaliadas ao registrar o pH ao longo do tempo, durante a fer- mentação do leite, como descrito no Teste B. O pH foi monitorado du- rante 24 horas usando o sistema CINAC (Alliance Instruments, França; eletrodo de pH Mettler 405 DPAS SC, Toledo, Espanha) como descrito anteriormente. O pH foi medido e registrado a cada 5 minutos. Usando o software v2.07 CINAC, o declínio entre um pHde 6,0 e pH de 5,5 (UPH/minutos) foi calculado [Declínio pH6-5,5]. Transferência do alelo de glcK da cepa STO para o genoma de 3 ou- tras cepas de S. thermophilus
[0299] Um produto de PCR de 1889 pb que contém o gene glcK da cepa STO foi obtido usando iniciadores GIcK-F1 (5- GAAGCAG- TTTGGGGTAGTAG-3') e GlIcK-R2 (5- GAGTTATCTACAGGAGCTGG- 3'). O produto de PCR foi, então, purificado usando o kit QIAquick PCR Purification (Qiagen) e eluído em água isenta de RNase. A concentra- ção do produto de PCR foi determinada usando o espectrofotôme- tro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, MA). O tamanho e a pureza do produto de PCR foram verificados por meio do sistema de eletroforese capilar com base em gel QIAxcel& (Qiagen, Hilden, Alema- nha). Cepas DGCC7710, ST1.1 e ST1.2 foram transformadas com o produto de 1889 pb e mutantes de PCR que têm seu gene glcK substi- tuído pelo alelo de glcK da cepa STO foram selecionados (a presença do alelo de glcK da cepa STO foi verificada por meio de sequencia- mento).
RESULTADOS
[0300] No pedido WO2013/160413 e Sorensen et al. (2016), a se- leção de glcK mutante foi realizada por meio da seleção de mutantes de 2-desoxiglicose (2-DOG) resistentes a partir de um conjunto de ce- pas fermentadoras de galactose (Exemplo 2 do pedido WO). Três mu- tantes foram descritos, CHCC15757 (também conhecido como St1-GS- 1), CHCC15887 e St2-GS-1, os quais exibem uma alteração de amino- ácido em sua glucoquinase, respectivamente, T141|, S72P e G249R. No entanto, foi mostrado que os mutantes obtidos têm um impacto sobre a cinética da acidificação (consulte o Exemplo 4 abaixo quanto à altera- ção S72P).
[0301] A atividade de glucoquinase de cepas que expressam uma glucoquinase que tem a alteração T1411, S72P ou G249R foi relatada como não sendo detectável (consulte Exemplo 4 abaixo quanto à mu- dança S72P). Isto pode explicar a cinética de acidificação retardada re- latada no pedido WO2013/160413 e Sgrensen et al. (2016). Supõe-se que o método usado para a seleção possa explicar a obtenção de mu- tantes que expressam apenas uma glucoquinase com atividade nula de glucoquinase (isto é, não detectável). Na verdade, em uma cepa fer- mentadora de galactose com uma glucoquinase de tipo selvagem, a 2- DOG será fosforilada pela glucoquinase (GlcK), que não pode mais ser usada como substrato pela fosfoglucomutase (PGM). Em consequên- cia, o 2-DOG seria tóxico para a cepa fermentadora de galactose como um resultado não apenas da competição entre a 2-DOG e a glicose pela localização de ligação da GIcK, mas também do consumo de ATP (pela glucoquinase) que não pode ser regenerada pela via da glicólise. Assim, para sobreviver, a melhor opção para a cepa que fermenta galactose é desativar a atividade de glucoquinase. Consequentemente, espera-se que o método de seleção descrito no pedido WO2013/160413 e Soren- sen et al. (2016) forneça predominantemente cepas fermentadoras de galactose cujo gene glcK não expressa uma glucoquinase funcional.
Exemplo 1: Rastreio de uma coleção de Streptococcus thermophi- lus quanto a cepas que excretam glicose
[0302] Os inventores do presente pedido, com o desejo de selecio- nar cepas que secretam glicose, usaram outra abordagem. Uma cole- ção de Streptococcus thermophilus foi rastreada por meio do Teste B quanto a cepas capazes de excretar glicose no leite fermentado. Foi usada uma quantidade de 10 mM de glicose como o limite mínimo para seleção. Uma cepa, STO, a qual libera 30 mM de glicose no leite fer- mentado usando o Teste B, foi selecionada. Exemplo 2. Identificação de uma mutação no gene glcK
[0303] Sequenciamento de vários genes — da cepa STO - conheci- dos por estarem envolvidos no catabolismo de carboidratos em S. ther- mophilus foi realizado e alinhado com a sequência dos genes corres- pondentes de outras cepas de Streptococcus thermophilus da nossa coleção.
[0304] Uma diferença de aminoácido não conservativa, E275K, foi identificada na sequência de GlcK da cepa STO, que não era encontrada em qualquer uma das sequência sde GlcK das outras cepas de S. ther- mophilus da coleção; esta diferença de aminoácido é o resultado de uma A na posição 823 do gene glcKem vez de uma G. Além disso, comparação da glucoquinase codificada pelo gene glcK de outras ce- pas de S. thermophilus confirmou que uma lisina na posição 275 (em vez de um ácido glutâmico) era única para STO e não era encontrada em qualquer uma das outras 107 cepas.
[0305] Outras diferenças de aminoácidos identificadas na glucoqui- nase deduzida a partir destas 108 cepas são representadas na Tabela
3. Assim, podem ser distinguidos 10 tipos diferentes de glucoquinase (GlcK tipo 1 à GIcK tipo 10, como apresentado, respectivamente, em SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 e 20). Para os experimentos seguintes, foram selecionadas 10 cepas, ST1 a ST10, cada uma ex- pressando uma glucoquinase única. SEQ ID NO: 2 foi feita uma é uma sequência de referência, uma vez que este tipo de GlcK foi encontrada em cerca de 70% das 108 cepas analisadas. Em particular, a cepa DGCC7710, depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de Janeiro de 2014, codifica uma glucoquinase como definido em SEQ ID NO: 2.
[0306] É digno de nota que a única diferença de aminoácido entre a sequência da glucoquinase codificada pela cepa STO e SEQ ID NO: 2 é a diferença de aminoácido na posição 275.
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[0307] Tabela 3: Diferenças da proteína GlIcK identificadas ao com- parar a sequência da proteína GlcK codificada por 108 cepas de S. ther- mophilus e sequência da proteína GlcK codificada por STO e ST20. As posições de aminoácidos listadas indicam todas as diferenças de ami- noácidos entre as proteínas GlcK. A sequência da proteína GlIcK de ST1 (SEQ ID NO: 2) foi escolhidda como uma sequência de referên- cia. As posições de aminoácidos não listadas nesta tabela são idênticas para todas as glucoquinases deste estudo. A coluna "aa diff" fornece o número de diferenças de aminoácidos comparado com SEQ ID NO: 2. À coluna "% id" fornece a porcentagem de identidade com SEQ ID NO: 2 Exemplo 3. Medição da atividade de glucoquinase da cepa STO e comparação com outras cepas (ST1 a ST10)
[0308] A atividade de glucoquinase da cepa STO foi comparada com a atividade de glucoquinase das cepas ST1 a ST10 selecionadas, como relatado no Exemplo 2, usando o Teste A. Os resultados são resumidos na Tabela 4.
EEE . Atividade relativa (U/g de extrato proteico total) (% DGCC7710) média Pare No a EL E O E LEI Ia Tabela 4: Atividade específica de glucoquinase de 11 cepas: 10 cepas - ST1 a ST1I0 - cada uma representando uma variante de prote-
ína GlIcK diferente e STO identificada no Exemplo 1; ND: não determi- nado
[0309] Estes dados mostram que a atividade de glucoquinase das cepas ST1 a ST10 está entre 2014 a 2791 U/g de extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste A. Uma atividade de glucoquinase acima de 1800 U/g de extrato proteico total foi considerada como repre- sentando uma atividade normal de glucoquinase. A atividade de gluco- quinase da cepa DGCC7710 foi considerada como uma atividade de glucoquinase de referência (uma vez que expressa o tipo de GlcK mais frequente, definido como SEQ ID NO: 2).
[0310] Por outro lado, a cepa STO, a qual expressa uma prote- ína GlcK que contém uma lisina na posição 275, tem uma atividade de glucoquinase que é de cerca de 977 U/g de extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste A, isto é, cerca de 3 vezes menor do quea atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710 (35%).
[0311] Estes dados mostram que a abordagem mantida pelos in- ventores permitiu selecionar pela primeira vez uma cepa de S. ther- mophilus negativa para galactose que expressa uma glucoquinase cuja atividade é significativamente reduzida, mas não nula.
Exemplo 4: Comparação da atividade de glucoquinase, Vmax, Km, liberação de glicose e cinética de acidificação da cepa DGCC7710, um derivado de DGCC7710 que traz uma diferença E275K e uma variante de DGCC7710 positiva para galactose que tem uma alteração de aminoácido nula na glucoquinase
[0312] Para verificar se a característica de secreção de glicose da cepa STO é o resultado de diminuição da atividade de glucoquinase e o resultado da diferença de aminoácido E275K identificada na glucoqui- nase, um derivado da cepa DGCC7710 foi concebido, em que o gene glcK codifica uma glucoquinase com ácido glutâmico (E) na posição 275 sendo substituído pelo aminoácido lisina (K). Este derivado
(DGC12534) foi depositado no DSMZ em 15 de agosto de 2017 sob o número de acesso DSM32587. A sequência de sua proteína GlcK é aquela definida em SEQ ID NO: 22.
[0313] Em paralelo, um mutante de DGCC7710 foi gerado, em que a(s) serina(s) na posição 72 foi substituída por uma prolina (P) para dar uma proteína GlIcK com uma sequência como definido em SEQ ID NO: 23 [substituição de aminoácido S72P; relatado na cepa DSM25851 do pedido WOZ2013/160413]. Uma vez que a substituição de aminoácido S72P leva a uma atividade nula de glucoquinase (isto é, uma cepa que não é capaz de usar glicose através da glucoquinase), o mutante foi an- teriormente tornado positivo para galactose (a fim de ser capaz de usar galactose, uma vez que espera-se que uma cepa negativa de S. ther- mophilus negativa para galactose que exibe uma atividade de glucoqui- nase nula seja inviável). Assim, o promotor do óperon gal da cepa DGCC7710 foi previamente tornado mutante de acordo com o pedido WO?2011/026863 para fornecer um promotor do óperon gal que tem a sequência como definido em SEQ NO: 24. Um mutante positivo para galactose com a substituição de aminoácido S72P na proteína GlcK foi obtido e denominado ST 1m-glcKO-gal+.
[0314] Um alinhamento na sequência de proteína da glucoqui- nase das cepas DGCC7710, DSM32587 e ST1m-glcKO-gal+ é descrito na Figura 1.
[0315] A atividade de glucoquinase, a Vnaxe Km da glucoqui- nase, a liberação de glicose no leite fermentado e a cinética de acidifi- cação das cepas DGCC7710, DSM32587 e ST1m-glcKO0-gal+foram de- terminadas como descrito em Material e Métodos. Os resultados obti- dos são descritos nas Tabelas 5 a 7 e na Figura 2 e resumidos na Ta- bela 8. Atividade específica de glucoquinase Cepa atividade relativa — FE es ge] QUA Tabela 5: Atividade específica de glucoquinase da cepa DGCC7710 e cepas DSM32587 e ST1m-glcKO-gal+ e atividade % comparado com a atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710 Vmax para a glucoquinase Km para a glucoquinase
(U/g de extrato proteico total) (mm)
[réis [575 RB6GOTAS | mis TO aro [Saes] No [To o | Tabela 6: Vmax para a glucoquinase da cepa DGCC7710 e nas cepas DSM32587 e ST1m-gicKO0-gal+ e Vmax % para a glucoquinase compa- rado com a Vmax para a glucoquinase da cepa DGCC7710 e Km de atividade de glucoquinase para as cepas DGCC7710, DSM32587 e ST1m-glcKO0-gal+; ND: não determinado
Cc Lactose con- Liberação de Liberação de glicose/lactose epa p sumida (mM) glicose (mM) consumida ( %) | peema | ss x Q"""mA [STegiea o g ESSI Tabela 7: Catabolismo de carboidrato no leite fermentado (24h) com as cepas DGCC7710, DSM32587 ou st1m-glcKO-gal+ Vmax para glu- Declínio Atividade específica de de gli- coquinase (U/g de pH 6- Cepa glucoquinase (U/g de cose/lac- de extrato pro- 5,5 extrato proteico total) tose consu- teico total (UpH/min) mida ( %) pe RR as o Tem [ses onm | Tabela 8:Resumo do comportamentodas cepasDGCC7710, DSM32587 e ST1m-glcKO0-gal+; ND: não determinado
[0316] Primeiro, os dados da Tabela 5 mostraram que a substitui- ção do ácido glutâmico (E) na posição 275 da proteína GlIcK por uma li- sina (K) é suficiente por si só para diminuir significativamente a ativi- dade de glucoquinase de 2756 para 907 U/g (isto é, 33% da atividade da cepa DGC7710) no derivado de DGCC7710 (DSM32587). Os dados obtidos para o mutante ST1m-glcKO0-gal+. Os mutantes confirmam que a alteração do aminoácido S72P é suficiente para eliminar totalmente a atividade de glucoquinase. Juntamente com a atividade de glucoqui- nase, os inventores também estudaram se a diminuição observada da atividade de glucoquinase da cepa DSM32587 era uma consequência de uma diminuição da afinidade (Km) da glucoquinase por seu substrato (glicose) e/ou uma diminuição na velocidade de avanço máxima (Vmax) da glucoquinase. Os dados da Tabela 6 confirmam que a substituição do ácido glutâmico (E) na posição 275 da proteína GlcK por uma lisina (K) é suficiente apenas para diminuir significativamente a Vmax para a glucoquinase de 2855 para 914 U/g (isto é, 32% da Vmax para DGCC7710) no derivado de DGCC7710 (DSM32587). Na ausência de uma glucoquinase funcional no mutante ST1m-glcKO-gal+, a Vmax não pôde ser determinada.
[0317] Os dados da Tabela 7 mostram que a cepa DSM32587 |i- bera 29 mM de glicose após fermentação do leite, enquanto que a cepa DGCC7710 com alta atividade de glucoquinase não libera uma quanti- dade significativa de glicose; além disso, a cepa DSM32587 consome 1,5 mais lactose do que a cepa DGCC7710. A glicose liberada no leite fermentado com DSM 32587 corresponde a 35% da lactose consumida, enquanto que a glicose liberada no leite fermentado com a cepa DGCC7710 está abaixo do nível de detecção (descobriu-se que o leite contém 175 mM de lactose sem níveis detectáveis de outros carboidra- tos ou ácidos). Estes dados mostraram que a cepa DSM32587 — na qual a atividade de glucoquinase e Vmax é cerca de 3 vezes reduzida comparado com a cepa DGCC7710 - compensa seu catabolismo da gli- cose inferior intracelular ao consumir 1. 5 mais lactose e liberar 35% da porção de glicose da lactose consumida após 24 horas. Finalmente, em relação ao mutante ST1m-glcK O-gal+, este mutante positivo para ga- lactose consome quase toda a lactose presente no leite (160 mM de 175 mM) e secreta 109 mM de glicose, que corresponde a 68% da lac- tose consumida. Supõe-se que a parte restante da glicose seja excre- tada no leite, mas novamente consumida pela célula, após o transporte através de um sistema PTS.
[0318] Finalmente, os dados da Figura 2 mostram que a cinética de acidificação da cepa DSM32587 não foi afetada significativamente com- parado com a cepa DGCC7710 (declínio de pH 6-5,5 de -0,0141 UpH/min para a cepa DSM32587 comparado com - 0,0117 UpH/min para a cepa DGCC7710). Em contraste, o declínio de pH 6-5,5 do mu- tante STim-glcKO-gal+ foi significativamente afetado (-0,0077 UpH/min).
[0319] Juntos, estes dados mostram que quanto mais a atividade de glucoquinase e a Vmax são diminuídas (até O), mais as cepas con- somem lactose e maior a quantidade de glicose excretada. Estes da- dos confirmam que a ausência de uma glucoquinase funcional, ao mesmo tempo em que fornece uma quantidade alta de glicose excre- tada, afeta significativamente a cinética de acidificação em uma cepa de S. thermophilus positiva para galactose. Os presentes inventores mostraram, surpreendentemente, pela primeira vez que a combina- ção da característica "negativa para galactose" de uma cepa de S. thermophilus e da característica "atividade de glucoquinase signi- ficativamente reduzida, mas não nula", juntamente com a caracte- rística "Vmax de glucoquinase significativamente reduzida, mas não nula" nesta cepa permite obter cepas com propriedades secre-
toras de glucose (acima de 10 mM) no leite fermentado com es- tas cepas.
Exemplo 5: Comparação da atividade de glucoquinase, Vmax, Km, cinética de liberação e acidificação de glicose de 2 ce- pas de S. thermophilus que expressam uma atividade padrão de glucoquinase e suas respectivas variantes com a diferença E275K
[0320] Para verificar se o comportamento de uma cepa de S. ther- mophilus negativa para galactose - com atividade de glucoquinase sig- nificativamente reduzida, mas não nula - na liberação de glicose após a cinética de fermentação e acidificação não se limita à base genética de DGCC7710, a diferença de aminoácidos E275K foi introduzida em 2 cepas de S. thermophilus negativas para galactose com 2 origens ge- néticas distintas: a cepa ST1.1 e a cepa ST1.2. Os respectivos mutan- tes foram denominados ST1.1m-glcK e ST1.2m-glcK. A sequência de GlIcK destes 2 mutantes é como definido em SEQ ID NO: 22.
[0321] A atividade de glucoquinase, a Vmax e Km da glucoqui- nase, a liberação de glicose no leite fermentado, e a cinética de acidifi- cação, da ST1.1im-glcK e ST1.2m-glcK mutantes foram determinadas como descrito em Material e Métodos) e comparados com os das ce- pas ST1.1 e ST1.2. Os resultados obtidos são descritos nas Tabe- las 9 a 11 e na Figura s 3A e 3B, e resumidos na Tabela 12.
[0322] Cepa extrato proteico total) relativa mo er om, | Tabela 9: Atividade específica de glucoquinase das cepas ST1.1 e ST1.2 e seus respectivos mutantes E275K e atividade % comparado com a atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710
Vmax da Glucoquinase Km da glucoquinase Cepa (U/g de extrato proteico total) (mM) sT11 2687 172 94 2011 ST1.1m- 795 130 28 1923 665 glcK sT1.2 2431 316 85 2532 | eo ST1.2m- 501 32 18 2397 452 glcK Tabela 10: Vmax de glucoquinase das cepas ST1.1 e ST1.2 e seus res- pectivos mutantes E275K e % de Vmax de glucoquinase comparado com a Vmax de glucoquinase da cepa DGCC7710 e Km de atividade de glucoquinase das cepas ST1.1 e ST1.2 e seus respectivos mutantes E275K Cc Lactose con- | Liberação de Liberação de glicose/lactose epa Pp sumida (mM) | glicose (mM) consumida (%) [Sra x O) Tabela 11: Catabolismo de carboidratos no leite fermentado (24h) com a cepa ST1.1, a cepa ST1.2 e seus respectivos mutantes E275K Liberação de Atividade específica de Vm da declínio Glicose / lac- Cepa glucoquinase (U/g de Glucoqui- pH6-5,5 tose consu- extrato proteico total) nase (UpH/min) mida (%) ST1.Im- 755 795 35 -0,0169 glcK sT1.2 2239 2431 -0,0136 ST1.2m- 453 501 26 -0,0150 glcK Tabela 12: Resumo do comportamento das cepas ST1.1 e STI.2 e seus respectivos mutantes E275K
[0323] Primeiramente, os dados da Tabela 9, mostraram bem que a substituição de ácido glutâmico (E) na posição 275 da proteína GlIcK por uma lisina (K) é suficiente por si só para diminuir a atividade de gluco- quinase de 2584 para 755 U/g na base genética de ST1.1 (isto é, uma atividade de glucoquinase que é de 27% aquela da DGCC7710) e de 2239 para 453 U/g na base genética de ST1.2, respectivamente, (isto é, uma atividade de glucoquinase que é de 16% aquela da DGCC7710). Uma observação similar foi feita para a Vmax para a glucoquinase para a qual a substituição do ácido glutâmico (E) na posição 275 da prote- ína GIcK por uma lisina (K) levou a uma diminuição da Vmax para a glu- coquinase de 2687 para 795 U/gna base genética de ST1.1 (isto é, 28% da DGCC7710) e de 2431 para 501 na base genética de ST1.2, respectivamente, (isto é, 18% da DGCC7710) (Tabela 10).
[0324] Os dados da Tabela 11 mostram que as cepas ST1.1m- glcK e ST1.2m-glcK - com uma atividade de glucoquinase significativa- mente reduzida, mas não nula, e uma Vmax significativamente redu- zida, mas não nula, liberam 30 e 18 mM de glicose, respectivamente, após fermentação do leite, enquanto que as cepas ST1.1 e ST1.2 - com alta atividade de glucoquinase - não liberam uma quantidade significa- tiva de glicose. Além disso, as cepas ST1.1m-glcK e ST1.2m-glcK con- somem 1,6 e 1,3 mais lactose do que as cepas ST1.1 e ST1.2, respec- tivamente. A glicose liberadano leite fermentado com as cepas ST1.1Im-glcK e ST1.2m-glcK corresponde a 35% e 26%, respectiva- mente, da lactose consumida, enquanto que a glicose liberada no leite fermentado com as cepas ST1.1 e ST1.2 está abaixo do nível de detec- ção ou muito próximo de zero. Estes dados mostraram que as ce- pas ST1.im-glcKe ST1.2m-glcK — nas quais a atividade de glucoqui- nase e Vmax é pelo menos 3 vezes reduzida comparado com aquelas das cepas ST1.1 e ST1.2 - compensa seu menor catabolismo intracelu- lar de glicose, consumindo entre 1,3 e 1,6 mais lactose, e liberando en- tre 26 e 35% da porção de glicose da lactose consumida após 24 horas.
[0325] Finalmente, os dados da Figura 3 mostram que a cinética de acidificação das cepas ST1.Iim-glcKe ST1.2m-glcK não foi significati- vamente afetada quando comparado com as cepas ST1.1 e ST1.2, res- pectivamente (declínio de pH 6-5,5 de -0,0169 UpH/min para a cepa ST1.1m-glcK comparado com - 0,0 160 UpH/min para a cepa ST1.1,e declínio de pH 6-5,5 de -0,0150 UpH/min para a cepa ST1,2m- glcK comparado com - 0,0136 UpH/min para a cepa ST1.1).
[0326] Juntos, estes dados confirmam que a introdução da dife- rença E275K na proteína GlcK de 2 cepas de S. thermophilus negati- vas para galactose e com origens genéticas distintas é suficiente para fornecer um leite fermentado com um nível interessante de glicose.
[0327] Em conclusão, o presente pedido é o primeiro a relatar que a combinação da característica de "negativa para galactose" em uma cepa de S. thermophilus com a característica "atividade de glucoquinase significativamente reduzida, mas não nula" nesta cepa, juntamente com a característica "Vmax de glucoquinase sig- nificativamente reduzida, mas não nula" na presente cepa, permite a obtenção de uma cepa de S. thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose que são utilizáveis para fornecer um leite fermentado com glicose liberada/acumulada. Exemplo 6: Identificação de outra proteína com mutação em GlIcK
[0328] Foi identificada uma cepa de Streptococcus thermophi- lus (ST20) cujo gene glcK contém uma diferença de aminoácidos não conservativa, G1448. Esta alteração de aminoácidos não foi encontrada em nenhuma das sequências de GlcK das outras cepas de S. ther- mophilus da coleção (GlcK tipos ST1 a ST10). Vale ressaltar que a única diferença de aminoácidos entre a sequência da glucoquinase co- dificada pela cepa ST20 e a SEQ ID NO: 2 é a diferença de aminoácidos na posição 144 (Tabela 3). Exemplo 7: Caracterização C da proporção da atividade de beta- galactosidase para a atividade de glucoquinase em mutantes glcK
[0329] Vários pedidos de patente (WO2015/0149940, WOZ2013/160413 e WO2017/103051) relatam cepas de Streptococcus thermophilus que liberam glicose. Contudo, as cepas descritas nestes pedidos são cepas positivas para galactose, um fenótipo que não é ne- cessariamente desejado, e foi demonstrado que é instável, em particular quando as cepas são cultivadas em meio que contém lactose.
[0330] Como mencionado acima, os resultados indicam que a ativi- dade de glucoquinase em uma cepa (que é reduzida, mas não nula, como definido no presente documento) é um parâmetro interessante para identificar cepas de Streptococcus thermophilus que liberam gli- cose. No entanto, este parâmetro pode ser insuficiente, quando usado isoladamente, para identificar cepas de Streptococcus thermophilus que liberam glicose com mutação em outros genes que não o gene glcK.
[0331] Assim, os inventores observaram e verificaram que, além da atividade de glucoquinase, a proporção da atividade de beta-galactosi- dase para a atividade de glucoquinase era um excelente parâmetro, não apenas para identificar cepas de Streptococcus thermophilus que libe- ram glicose com mutação em seu gene glcK, mas também identificar ce- pas de Streptococcus thermophilus que liberam glicose com mutação em outros genes.
[0332] Assim, esta proporção foi calculada ao: - determinar a atividade de beta-galactosidase (proteína U/g) em uma cepa por meio do Teste D - determinar a atividade de glucoquinase (proteína U/g) na dita mesma cepa por meio do Teste E; e - calcular a proporção da atividade de beta-galactosidase para a atividade de glucoquinase na dita cepa.
[0333] Esta proporção foi calculada na cepa DGCC7710, na cepa DSM32587 (que traz a mutação E275K em seu gene glcK), na cepa ST1.1, na cepa ST1.1m-glcK (que traz a mutação E275K em seu gene glcK), na cepa ST20 (que traz a mutação G1448S em seu gene glcK) e na cepa ST5. Vale ressaltar que, na ausência de uma glucoquinase fun- cional no mutante ST1m-glcKO0-gal+(atividade da GlIcK menor do que 0,1), esta proporção não pôde ser determinada. Os resultados são re- sumidos na Tabela 13 e na Figura 4.
[0334] A liberação de glicose no leite fermentado e a cinética de acidificação destas 6 cepas também foram determinadas como descrito em Material e Métodos, e resumidas na Tabela 14, e comparado com o comportamento da cepa ST1m-glcKO0-gal+. dedão Cepa (U/g de proteína) À (U/g de proteína) sidase/atividade de [a Te] farm ie] sms a [e | 5 [somo rasa] Gssnos Tabela 13: Resumo da proporção da atividade de beta-galactosidase para a atividade de glucoquinase nas cepas DGCC7710, DSM32587, ST1.1, ST1.1m-glcK, ST20 e ST5 Proporção de atividade de Liberação de Cepa beta-galactosidase/atividade | glicose (mM) peclínio pH 6- de glucoquinase (Teste B) 5,5 (Up Himin) sr DO [we nm
Tabela 14: Resumo do comportamento das cepas DGCC7710, DSM32587, ST1.1, ST1.1m-glcK, ST20, ST5 e ST1m-gicKO-gal+
[0335] Estes dados mostram que todas as cepas de liberação de glicose (pelo menos 32 mM) exibem uma actividade proporção de beta- galactosidase em relação à atividade de glucoquinase que é igual a ou maior do que 9,10 * enquanto que todas as cepas para as quais o nível de glicose não é detectável uma exposição atividade de beta-ga- lactosidase em relação à atividade de glucoquinase proporção que é de cerca de outubro 2-3 *-
[0336] Esta confirmação de que a proporção da atividade de beta- galactosidase para a atividade de glucoquinase (como calculado no pre- sente documento) é um excelente parâmetro para identificar cepas de Streptococcus thermophilus positivas para lactose, negativas para ga- lactose que liberam uma quantidade significativa de glicose. Exemplo 8: Caracterização da proporção da atividade de beta-ga- lactosidase para a atividade de glucoquinase em um mutante ccpA
[0337] Com base na conclusão do Exemplo 7, os inventores deter- minaram a atividade de beta-galactosidase (Teste D) para a atividade de glucoquinase (Teste E) de cepas de Streptococcus thermophilus po- sitivas para lactose, negativas para galactose (sem mutação no gene glcK) da coleção proprietária da DuPont.
[0338] Foi demonstrado que uma cepa (sT30) exibe esta propor- ção. O sequenciamento genômico desta cepa revelou uma mutação no gene ccpA: a eliminação de um nucleotídeo A no trecho de 7 nucle- otídeos A nas posições 114-120 (SEQ ID NO: 71), que leva a um des- locamento (frameshift) de quadro do campo aberto quadro de leitura do gene ccpA.
[0339] Esta mutação foi introduzida com base n cepa DGCC7710 para origina a cepa STim-ccpA (isto é, um primeiro derivado de DGCC7710 foi concebido no qual o gene ccpA da cepa DGCC7710 foi substituído pelo gene ccpA mutante, como definido em SEQ ID NO: 71) A mesma mutação foi introduzida com base na cepa ST1.1 para originar a cepa ST1.Im-ccpA. Esta mutação também foi introduzida no DSM32587 (isto é, DGCC7710, que traz um gene glcK mutante que co- difica uma glucoquinase com a substituição E275K) para originar a cepa ST1m-glck+ccpA.
[0340] A proporção da atividade de beta-galactosidase para a ativi- dade de glucoquinase foi calculada na cepa DGCC7710, cepa STIm- ccpA, cepa ST1.1 e cepa ST1.1m-ccpA. Os resultados são resumidos na Tabela 15 e na Figura 4. A liberação de glicose no leite fermentado e a cinética de acidificação destas 4 cepas também foram determinadas como descrito em Material e Métodos e resumido na Tabela 16. o Atividade de Beta Atividade de Glck Gal Proporção de atividade de U/g de proteína - i ivi Cepa (U/g de p' ) (Ulg de proteína) beta-galactosidase/atividade 5,20x10- DGCC7710 | 1692 1,19x103 3,07x106 1,84x10 STIm-ccpA 1871 310 2 2,25x103 9,82x106 3,57x10 1,03x10- ST1.Im-ccpA | 1701 290 7 1,44x103 6,07x106 Tabela 15: Síntese da proporção da atividade de beta-galactosidase para a atividade de glucoquinase nas cepas DGCC7710, ST1m-ccpA, ST1.1 e ST1.1Im-ccpA Declínio pH Proporção de atividade de beta-galac- | Glicose Cepa 6-5,5 tosidase/atividade de glucoquinase (mM) (UpH/min) ST1Im-ccpA 9,82x10 -0,0125
[se O as | om | Tabela 16: Resumo do comportamento das cepas DGCC7710, ST1Im- ccpA, KOST1m-ccpA, ST1m-glicK+ccpA, ST1.1 e ST1.Im-ccpA (ND: não determinado)
[0341] Primeiro, estes dados confirmam que o íon mutante ccpA identificado leva a uma cepa que exibe uma proporção da atividade beta-galactosidase para a atividade de glucoquinase de 6 e 9,8 10%, enquanto que as cepas sem mutação no gene ccpA exibem uma pro- porção da atividade de beta-galactosidase para a atividade de glucoqui- nase de 2,5,108 e 3,108. Em seguida, estes dados também confirmam que as cepas que trazem um gene ccpA mutante liberam glicose du- rante a fermentação do leite, em contraste com as cepas sem mutação no gene ccpA. Finalmente, estes dados também mostram que a cinética de acidificação das cepas que trazem um gene ccpA mutante não é afe- tada.
[0342] Em conjunto, estes resultados confirmam que a proporção da atividade de beta-galactosidase para a atividade de glucoquinase, como definido no presente documento, é um excelente parâmetro para identificar cepas de Streptococcus thermophilus positivas para lac- tose, negativas para galactose que liberam uma quantidade significativa de glicose.
[0343] Os resultados também mostram que os inventores identifica- ram, além das mutações do gene glcK que codifica uma glucoquinase cuja atividade é reduzida, mas não nula, outro gene - o gene ccpA - que pode ser mutante (mas não eliminado) para produzir uma cepa que li- bera glicose e que tem uma boa cinética de acidificação. O comporta- mento da cepa DGCC7710 que tem um gene ccpA mutante (SEQ ID NO: 71) [ST1m-ccpA] foi comparado com o comportamento de um deri-
vado de DGCC7710 no qual o gene ccpA da cepa DGCC7710 foi silen- ciado (KOST1m-ccpA). Curiosamente, esta comparação mostra que o KOST1m-ccpA é significativamente influenciado em relação à sua ciné- tica de acidificação, enquanto que a cepa ST1m-ccpA não (Tabela 16), mostrando que a mutação do gene ccpA na cepa STIm-ccpA é dife- rente de um silenciamento puro do gene.
[0344] Finalmente, a introdução do gene glcK mutante e do gene ccpA mutante na cepa DGCC7710 mostra uma quantidade de glicose (39 mM) que é aumentada comparado com a cepa DSM32587 (Tabela 14) e a cepa ST1m-ccpA. Exemplo 9: Caracterização da proporção da atividade de beta-ga- lactosidase para a atividade de glucoquinase em cepas mutan- tes no gene manL, e tanto no gene ccpA como no gene manL, e comparação com a proporção em cepas mutantes no gene glcK ou no gene ccpA
[0345] Em outros experimentos, os inventores identificaram cepas de Streptococcus thermophilus positivas para lactose, negativas para galactose (sem mutação em seu gene glcK) que trazem uma mutação no gene manL (gene que codifica a proteína I/IABY*, proteína que faz parte do PTS específico para manose-glicose). A mutação do gene manL é a substituição do nucleotídeo G no nucleotídeo T na posi- ção 916 que leva a um códon TERMINAL na posição 306 da proteína [IIABY"305] (SEQ ID NO: 155).
[0346] Esta mutação foi introduzida com base na cepa DGCC7710 para originar a cepa ST1m-manL; a mesma mutação foi introduzida com base na cepa ST1.1 para originar a cepa ST1.Im-manL. Além disso, o gene mutante manL foi introduzido na cepa STIm-ccpA e na cepa ST1.1Im-ccpA detalhadas no Exemplo 8 (isto é, as cepas DGCC7710 e ST1.1 que trazem um gene ccpA mutante).
[0347] A proporção da atividade de beta-galactosidase para a ativi- dade de glucoquinase foi calculada na cepa DGCC7710, cepa STIm- manL, cepa STiIm-ccpA, cepa STIm-ccpA, cepa STIm-cepA+manL, cepa ST1.1, cepa ST1.Im-manL, cepa ST1.1Im-ccpA e cepa ST1.1m- ccpAtmanL. Os resultados são resumidos na Tabela 17 e na Figura
4. A liberação de glicose no leite fermentado e a cinética de acidificação destas 8 cepas também foram determinadas como descrito em Material e Métodos e resumido na Tabela 18. Atividade Atividade de Beta Gene(s) de Glck Gal Proporção de atividade de Cepa mutante(s) | (U/g de proteína) | (U/g de proteina) beta-galactosidase/ativi- dade de glucoquinase [es so [ve 57 | [Fara [mm] 75 | e mese] me EI e e A e) Gs TF Fr FF FA Tabela 17: Resumo da proporção da atividade de beta-galactosidase para a atividade de glucoquinase nas cepas DGCC7710, STIm-manL, ST1m-ccpA, STIm-cepAtmanL, ST1.1, ST1.1iIm-man, ST1.Im-ccpA e ST1.Im-ccpA+manL Genes Declínio pH 6-5,5 Cepa Proporção ' mutantes (UpH/min) DGCC7710 1 3,07x106 -0,0140 ST1m-ccpA 9,82 x10% -0,0125 ST1Im-manL 2,54 x106 -0,0104 STIm-ccpAtmanL 9,11 x106 -0,0089 SsT11 / 2,50x10 -0,0180 ST1.1m-ccpA 6,07 x106 -0,0160
Tabela 18: Resumo do comportamento das cepas DGCC7710, STIm- manL, ST1m-ccpA, STIim-cepA+manL, ST1.1, ST1.Im-manL, ST1.1m- ccpA e ST1.Im-ccecpA+manL cepas
[0348] Primeiro, estes dados mostram que as cepas que sofreram mutação apenas no gene manL (ST1m+manL ou ST1.1m-manL) libe- ram glicose durante a fermentação do leite, embora não exibam uma proporção da atividade de beta-galactosidase para a atividade de glu- coquinase que é mais ou menos similar à cepa DGCC7710 ou ST1.1. Isto mostra que a mutação manL não afeta a atividade de glucoquinase e/ou a atividade de beta-galactosidase nas cepas de Streptococcus thermophilus.
[0349] Estes dados também mostram que as cepas sofreram muta- ções tanto nogene ccpA quanto no gene manL (cepas STIm- ccpA+manL e ST1.Im-ccpA+manL) exibem uma proporção da atividade de beta-galactosidase para a atividade de glucoquinase que é similar ou superior àquela das cepas mutante apenas no gene ccpA (cepas ST1m-ccpA e ST1.Im-ccpA). Isto confirma que a proporção de ativi- dade de beta-galactosidase para a atividade de glucoquinase (como de- finido no presente documento) pode ser usada para gerar e identificar outras mutações no gene glcK, gene ccpA e genes man ao combinar este(s) gene(s) mutante(s) a ser(em) testado(s) com o gene glcK, gene CCpA ou gene(s) man com mutações conhecidas (e determinação da proporção).
[0350] Curiosamente, os mutantes duplos (ccpA+manL) liberam gli- cose em concentração maior do que 100 mM e têm 7 a 10 vezes a con- centração de glicose das cepas ST1m-ccpA e ST1.1m-ccpA. Estes da- dos mostram que há uma sinergia com relação à concentração de gli- cose liberada [a concentração de glicose liberada usando o mutante du- plo é muito maior do que a adição da concentração de glicose liberada usando as cepas com ccpA mutante e a concentração de glicose libe- rada usando as cepas com manL mutante]. Embora a cinética de acidi- ficação destas cepas com mutação dupla seja afetada, a concentração de glicose liberada durante a fermentação torna estas cepas com muta- ção dupla industrialmente úteis. Estes dados confirmam que a propor- ção de atividade de beta-galactosidase para atividade de glucoquinase (como definido no presente documento) pode ser usada para identifi- car cepas Streptococcus thermophilus positivas para lactose, negativas para galactose que liberam uma quantidade significativa de glicose.
[0351] Finalmente, o elo colocado em evidência no presente docu- mento entre a proporção da atividade de beta-galactosidase para a ati- vidade de glucoquinase e a liberação de glicose durante a fermentação do leite pode ser usado para identificar outros genes cuja mutação leva a uma proporção, como definido no presente documento, com o objetivo de conceber mais cepas de Streptococcus thermophilus positivas para lactose, negativas para galactose que liberam glicose. Exemplo 10: Liberação de glicose de várias cepas mutantes de Streptococcus thermophilus positivas para lactose, negativas para lactose
[0352] Com base na identificação de uma mutação manL que au- menta o efeito de liberação de glicose de um gene ccpA mutante em ce- pas de Streptococcus thermophilus positivas para lactose, negativas para galactose, os inventores identificaram outras mutações em manM (que codifica a proteína IICMº") e ManL (que codifica a proteína IIDY*"): - o gene manM mutante com uma substituição do nucleotí- deo G no nucleotídeo T na posição 625, que leva a um códon TERMI- NAL na posição 209, como definido em SEQ ID NO: 201; - o gene manL mutante com uma inserção de um nucleotí- deo A no trecho de 5 nucleotídeos A nas posições 37-41 (que leva a um trecho de 6 nucleotídeos A, um deslocamento (frameshift) de quadro e um truncamento da proteína IIDVº*" na posição 28), como definido em SEQ ID NO: 250;
[0353] As cepas com mutação dupla e tripla, com base nos genes mutantes a seguir, foram concebidas com base na DGCC7710 (ST1) ou com base na ST1.1.
- STIm-manM: derivado de DGCC7710, no qual o gene manM da cepa DGCC7710 foi substituído pelo gene manM mutante como definido em SEQ ID NO: 201; - derivado ST1-manN: DGCC7710, no qual o gene manN foi substituído pelo gene manN mutante, como definido em SEQ ID NO: 250; - derivado ST1m-glck+manM: DSM32587 (traz o gene glcK que codifica uma glucoquinase com a substituição E275K; Exemplo 2), no qual o gene manM foi substituído pelo gene manM mutante, como definido em SEQ ID NO: 201; - STIm-ccpA+manM: derivado ST1m-ccpA (DGCC7710 que traz o gene ccpA mutante, como definido em SEQ ID NO: 71; Exemplo 8), no qual o gene manM foi substituído pelo gene manM mutante, como definido em SEQ ID NO: 201; - STIm-ccpA+manN: derivado ST1m-ccpA, no qual o gene manN foi substituído pelo gene manN mutante, como definido em SEQ ID NO: 250; - derivado STim-gicK+ccpA+manM: DSM32587, no qual o gene ccpA foi substituído pelo gene ccpA mutante como definido em SEQ ID NO:71e o gene manM foi substituído pelo gene manM mu- tante como definido em SEQ ID NO: 201; e - ST1.Im-glcK+manM: derivado ST1.1m-glcK (cepa ST1.1 que traz o gene glcK que codifica uma glucoquinase com a substituição E275K; Exemplo 2), na qual o gene manM foi substituído pelo gene manM mutante, como definido em SEQ ID NO: 201.
[0354] A liberação de glicose no leite fermentado e a cinética de acidificação destes 7 cepas adicionais e as cepas descritas no exemplo anterior s foram determinados tal como descrito em materiais e méto- dos, e resumidos na Tabela 19. mo fes o Como | mutantes (UpH/min) man | roma [came | | amo Tabela 19: Resumo do comportamento das cepas DGCC7710, ST1.1e de seus mutantes (nd: não determinado)
[0355] Estes dados mostram que, enquanto que os mutantes man individuais (manL, manM ou ManN) liberam glicose entre 7 e 18 MM, a introdução destes genes manL, manM ou ManN mutantes em cepas portadoras de mutações no gene glcK e/ou no gene ccpA leva a mutan- tes duplos ou triplos que liberam entre 89 e até 125 mM de glicose. Es- tas observações confirmam o efeito intensificador dos genes man mu- tantes na liberação de glicose.
[0356] Estes dados também confirmam que os genes mutantes po- dem ser identificados com sucesso usando a proporção de atividade beta-galactosidase para a atividade glucoquinase, como definido no presente documento e, então, combinados para conceber cepas que li- beram uma quantidade significativa de glicose durante a fermentação do leite. A determinação de que esta proporção é um excelente parâà- metro vinculado à liberação de glicose abre caminho não apenas para a geração e identificação de outras mutações no gene glcK, no gene CCpA, no gene manL, no gene manL e no gene manN, mas também em qualquer outro gene de interesse (contanto que seja atingido o valor mi- nimo da proporção definida).
SEQUÊNCIAS SEQ ID NO:2 MSKKLLGIDLGGTTVKFGILTADGEVQEKWAIETNTFENGSHIV- PDIVESLKHRLELYGLTA-
EDFIGIGMGSPGAVDRENKTVTGAFNLNWAETQEVGSVIEKELGIPFA IDNDANVAALGERWVGAGANNRNVVFITLGTGVGGGVIADGNL!- HGVAGAGGEIGHIIVEP- DTGFECTCGNKGCLETVASATGIVRVAHHLAEKYEGNSSIKAAVDNG EFVTSKDIIVAATEGDKFADSIVDKVSKYLGLATANISNILNPDSVVI- GGGVSAAGEFLRS-
RVEGYFTRYAFPQVRRTTKVKLAELGNDAGIIGAASLAYSIDK SEQ ID NO:22 MSKKLLGIDLGGTTVKFGILTADGEVQEKWAIETNTFENGSHIV-
PDIVESLKHRLELYGLTA- EDFIGIGMGSPGAVDRENKTVTGAFNLNWAETQEVGSVIEKELGIPFA IDNDANVAALGERWVGAGANNRNVVFITLGTGVGGGVIADGNL- HGVAGAGGEIGHIIVEP- DTGFECTCGNKGCLETVASATGIVRVAHHLAEKYEGNSSIKAAVDNG EFVTSKDIIVAATEGDKFADSIVDKVSKYLGLATANISNILNPDSVVI- GGGVSAAGKFLRS-
RVEGYFTRYAFPQVRRTTKVKLAELGNDAGIIGAASLAYSIDK SEQ ID NO:45 MSKKLLGIDLGGTTVKFGILTADGEVQEKWAIETNTFENGSHIV- PDIVESLKHRLELYGLTA-
EDFIGIGMGSPGAVDRENKTVTGAFNLNWAETQEVGSVIEKELGIPFA IDNDANVAALGERWVGAGANNRNVVFITLGTGVSGGVIADGNL- HGVAGAGGEIGHIIVEP- DTGFECTCGNKGCLETVASATGIVRVAHHLAEKYEGNSSIKAAVDNG EFVTSKDIIVAATEGDKFADSIVDKVSKYLGLATANISNILNPDSVVI- GGGVSAAGEFLRS-
RVEGYFTRYAFPOQVRRTTKVKLAELGNDAGIIGAASLAYSIDK SEQ ID NO:23 MSKKLLGIDLGGTTVKFGILTADGEVQEKWAIETNTFENGSHIV- PDIVESLKHRLELYGLTA-
EDFIGIGMGPPGAVDRENKTVTGAFNLNWAETQEVGSVIEKELGIPFA IDNDANVAALGERWVGAGANNRNVVFITLGTGVGGGVIADGNL|- HGVAGAGGEIGHIIVEP-
DTGFECTCGNKGCLETVASATGIVRVAHHLAEKYEGNSSIKAAVDNG EFVTSKDIIVAATEGDKFADSIVDKVSKYLGLATANISNILNPDSVVI- GGGVSAAGEFLRS- RVEGYFTRYAFPQVRRTTKVKLAELGNDAGIIGAASLAYSIDK
SEQ ID NO :65 ATGAATACTGATGAAACAATCACAATTTATGATGTAGCGCG- TGAAGCTGGAGTATCGATGG-
CAACTGTTTCTCGTGTTGTAAATGGTAACAAAAACGTAAAAGAAAA CACCCGAAAAAAAGTGCTCGAAGTCATTGATCGTTTGGATTACCG- TCCAAATGCGGTTGCG- CGTGGCTTGGCAAGTAAAAAAACAACTACTGTAGGAGTTGTCATT CCAAATATTGTAAATAGCTATTTTGCTACTCTAGCTAAAGGTA- TTGATGACATTGCAAC- CATGTATAAGTATAATATTGTTCTTGCTTCCAGTGATGATAATGAG GATCATGAAGTTACAGTCATTCATTCTCTAATTTCTAAACAAG- TTGATGGTATTATTTTTA- TGGGACACCATCTGACAGAAAAAATCCGTGCAGAATTCTCTCGTA CCCGTACACCGATTGTTCTAGCAGGAACAGTTGATCTCGAACAC- CAATTACCAAGTGTTAA- CATCGACTATAAAGCTGCCGTTGAGGATTGTGTAACGCAACTTGC TAAAAATAATGAAAAGGTTGCCTTTGTATCAGGACCACTAA- TTGATGATATTAATGGCAAAC- TACGTTTGGCCGGGTATAAGTCTGGACTTGAAAAGAATAATTTGAG CTACAACGAAGGACTTGTCTTTGAAGCTAAATATAGCTATAAAGA- CGGCTTTGAGTTAGCA- CAACGTGTCTTGAACTCTGGTGCCACTGCTGCCTATGTTGGGGAA GATGAATTGGCTGCAGGTCTCTTGAATGGCCTCTTTGCTGCAGEG- CAAATCAGTTCCAGAAGA- TTTCGAAATCATCACAAGCAATGATTCACCGGTTACAAGCTACACA CGTCCAAACCTTTCTAGTATAAACCATCCTCTCTATGATTTAGGGG- CAGTTAGCATGCGTA- TGTTGACTAAAATTATGCATAAGGAAGAACTTGAAGATAAAGACGT TATTCTTAATCATGGTCTAACTTTACGCCAGTCAACAAAATAA
SEQ ID NO :71 ATGAATACTGATGAAACAATCACAATTTATGATGTAGCGCG- TGAAGCTGGAGTATCGATGG-
CAACTGTTTCTCGTGTTGTAAATGGTAACAAAAACGTAAAAGAAAA CACCCGAAAAAAGTGCTCGAAGTCATTGATCGTTTGGATTACCG- TCCAAATGCGGTTGCGCG- TGGCTTGGCAAGTAAAAAAACAACTACTGTAGGAGTTGTCATTCCA AATATTGTAAATAGCTATTTTGCTACTCTAGCTAAAGGTA- TTGATGACATTGCAACCATGTA- TAAGTATAATATTGTTCTTGCTTCCAGTGATGATAATGAGGATCAT GAAGTTACAGTCATTCATTCTCTAATTTCTAAACAAGTTGATGGTA- TTATTTTTATGGGACA- CCATCTGACAGAAAAAATCCGTGCAGAATTCTCTCGTACCCGTAC ACCGATTGTTCTAGCAGGAACAGTTGATCTCGAACACCAATTAC- CAAGTGTTAACATCGAC- TATAAMAGCTGCCGTTGAGGATTGTGTAACGCAACTTGCTAAAAATA ATGAAAAGGTTGCCTTTGTATCAGGACCACTAATTGATGATATTAA- TGGCAAACTACG- TTTGGCCGGGTATAAGTCTGGACTTGAAAAGAATAATTTGAGCTAC AACGAAGGACTTGTCTTTGAAGCTAAATATAGCTATAAAGACGG- CTTTGAGTTAGCACAACG- TGTCTTGAACTCTGGTGCCACTGCTGCCTATGTTGGGGAAGATGA ATTGGCTGCAGGTCTCTTGAATGGCCTCTTTGCTGCAGGCAAAT- CAGTTCCAGAAGATTT- CGAAATCATCACAAGCAATGATTCACCGGTTACAAGCTACACACG TCCAAACCTTTCTAGTATAAACCATCCTCTCTATGATTTAGGGGCA- GTTAGCATGCGTATG- TTGACTAAAATTATGCATAAGGAAGAACTTGAAGATAAAGACGTTA TTCTTAATCATGGTCTAACTTTACGCCAGTCAACAAAATAA
SEQ ID NO :122 MGIGIIASHGRFAEGIHOSGSMIFGDQEKVOVVTFMPSEGP- DDLYAHFENNAIAQFDV-
DDEILVLADLWSGSPFENQASRIARENPDRKIAIITGLNLPMLIQAYTER MMDANATVEQVAANIIKEAKGGIKALPEELNPAEET- TAAPVEAAAPQGAIPEGTVIGD- GKLKINLARLDTRLLHGQVVTNWVPYSKADRIIVASDDVAKDELRKELI KQAAPNGIKVNVVPIQKLIDASKDPRFGNTHALVLFETVQDALRAIE- GGVPIKELN- VGSMAHSTGKTMVNNVLSMDKDDVACFEKLRDLGVEFDVRKVPND
SKKDLFELIKKANVQ SEQ ID NO :155 ATGGGTATCGGTATTATTATTGCCAGCCATGGTAGGTTCG- CTGAAGGAATCCACCAATCAGG-
CTCTATGATTTTTGGGGACCAAGAGAAAGTTCAAGTTGTGACTTTC ATGCCAAGTGAAGGTCCTGATGATTTGTACGCTCACTTCAA- CAACGCCATTGCACAATT- CGATGTTGATGATGAAATTCTTGTTTTGGCTGACCTTTGGAGTGGT TCACCATTTAACCAAGCTAGTCGAATCGCTAGGGAAAATCCAGA- TCGCAAGATTGCTATCAT- CACAGGACTTAACTTGCCAATGCTAATCCAAGCATACACTGAACGT ATGATGGATGCTAACGCTACTGTAGAGCAAGTTGCTGCTAATAT- CATCAAGGAAGCTAAGGG- TGGTATCAAGGCACTTCCAGAAGAGCTAAATCCAGCTGAGGAAAC AACTGCAGCTCCTGTAGAAGCTGCAGCACCTCAAGGAGCTA- TCCCTGAAGGAACAGTCATCG- GAGATGGTAAACTCAAGATTAACTTGGCACGTTTGGACACACGTC TCTTGCATGGTCAAGTAGTAACTAACTGGGTACCTTATTCTAAAG- CAGACCGTATTATTG- TTGCTTCGGATGACGTTGCCAAAGATGAGCTTCGTAAGGAATTGA TCAAACAGGCTGCACCAAACGGTATTAAAGTAAACGTTGTT- CCGATTCAAAAATTAA- TTGATGCTTCTAAAGACCCACGTTTTGGAAATACACATGCGCTTGT CTTGTTCGAAACTGTTCAAGACGCACTTCGTGCTATCGAAGGTGG- CGTGCCAATAAAAGAAC- TTAACGTTGGTTCTATGGCTCACTCAACTGGTAAAACAATGGTTAA CAACGTTTTGTCTATGGATAAAGATGATGTTGCTTGTTTTGAAAAA- TTACGTGACCTTGGCG- TTTAATTTGACGTCCGTAAGGTTCCAAACGATTCTAAGAAAGATTT
GTTTGAGCTTATCAAGAAAGCTAACGTTCAATAA SEQ ID NO:156 MGIGINIASHGRFAEGIHOSGSMIFGDQEKVOQVVTFMPSEGP- DDLYAHFNNAIAQFDV-
DDEILVLADLWSGSPFENQASRIARENPDRKIAIITGLNLPMLIQAYTER MMDANATVEQVAANIIKEAKGGIKALPEELNPAEET- TAAPVEAAAPQGAIPEGTVIGD- GKLKINLARLDTRLLHGQVVTNWVPYSKADRIIVASDDVAKDELRKELI KQAAPNGIKVNVVPIQKLIDASKDPRFGNTHALVLFETVOQDALRAIE-
GGVPIKELNVGSMAHSTGKTMVNNVLSMDKDDVACFEKLRDLGV SEQ ID NO:174 MSDMSIISAILVVAVAFLAGLESILDQFQFHQPLVACTLIGAA- TGNLTAGIMLGGS-
LQMITLAWANIGAAVAPDVALASVAAAIILVKGGKFTAEGIGVAIAIAILL AVAGLFLTMPVRTASIAFVHAADKAAEHGNIAGVERAYYLALLLOGL- RIAVPAALLLAI!- PAQSVQHALGLMPDWLTHGLVVGGGMVVAVGYAMIINMMATREVW PFFAIGFALAAISQLTLIALSTIGVAIAFIYLNLSKOGGGNGGGNGGG-
TSSGSGDPIGDILEDY SEQ ID NO:201 ATGTCAGATATGTCAATTATTTCTGCGATTTTGGTCGTAG- CTGTTGCCTTCCTTGCTGG-
TCTTGAAAGTATCCTTGACCAATTCCAATTCCACCAACCACTTGTT GCATGTACCCTCATCGGTGCTGCCACAGGTAACCTCACTGCAGG- TATCATGCTTGGTGGTT- CTCTTCAAATGATTACCCTTGCTTGGGCAAACATCGGTGCTGCCG TAGCTCCTGACGTTGCCCTTGCATCTGTTGCCGCTGCCAT- CATTTTGGTTAAAGGTGGTAAA- TTTACAGCTGAAGGTATCGGTGTTGCGATTGCAATAGCTATCCTG CTTGCAGTTGCAGGTCTCTTCCTAACTATGCCTGTTCGTACAG- CATCTATTGCCTTTGTT- CATGCTGCAGATAAAGCTGCAGAACACGGAAACATCGCTGGTGTT GAACGTGCATACTACCTCGCTCTCCTTCTTCAAGGTTTGCGTA- TTGCTGTGCCAGCAG- CCCTTCTTCTTGCCATCCCGGCCCAATCTGTTCAACATGCCCTTG GCTTGATGCCTGACTGGCTCACCCATGGTTTGGTTGTCGGTGG- TGGTATGGTCGTAGCCG- TTGGTTACGCCATGATTATCAATATGATGGCTACTCGTTAAGTTTG GCCATTCTTCGCCATTGGTTTTGCTTTGGCAGCAATTAGCCAA- TTGACACTTATCGCTCT- TAGTACCATTGGTGTTGCCATCGCCTTCATCTACCTCAACCTTTCT AAACAAGGTGGCGGAAATGGTGGCGGAAATGGTGGCGGAACTT- CATCTGGTTCAGGCGAC-
CCAATCGGCGATATCTTGGAAGACTACTAG SEQ ID NO:202
MSDMSIISAILVVAVAFLAGLESILDQFQFHQPLVACTLIGAA- TGNLTAGIMLGGS- LQMITLAWANIGAAVAPDVALASVAAAIILVKGGKFTAEGIGVAIAIAILL AVAGLFLTMPVRTASIAFVHAADKAAEHGNIAGVERAYYLALLLQGL- RIAVPAALLLAI!-
PAQSVQHALGLMPDWLTHGLVYVGGGMVVAVGYAMIINMMATR SEQ ID NO:211 MAEKIQLSQADRKKVWWRSQFLAGAWNYERMONLGWAYS- LIPAIKKLYTNKEDOAAALKRH-
LEFENTHPYVAAPIIGVTLALEEEKANGTEIEDAAIOGVKIGMMGPLAGI GDPVFWFTIRPILGALGASLAQAGNIAGPLIFFIGWNLIRMAFLWYT- QELGYKAGSEITK- DISGGILKDITKGASILGMFILAVLVERWVSVVFTVKLPGKVLPKGAYIE WPKGYVTGDOLKTILGQVNDKLSFDKIQVDTLOKOQLDS-
LIPGLTGLLLTFACMWLLKKKVSPITINGLFVVGIVASFFGIM SEQ ID NO:250 ATGGCTGAAAAAATTCAATTATCTCAAGCGGATCG- TAAAAMAAGGTTTGGTGGCGCTCACAA-
TTCTTGCAAGGTGCATGGAACTATGAACGTATGCAAAACTTGGGTT GGGCTTACTCACTCATTCCTGCTATCAAAAAACTTTATACTAA- CAAAGAGGACCAAGCCGCA- GCTCTTAAACGTCACTTGGAATTCTTCAACACTCACCCTTACGTAG CTGCTCCTATCATAGGGGTTACCTTAGCTCTTGAAGAAGAAAAAG- CTAATGGTACTGAAA- TCGAAGATGCGGCTATCCAAGGGGTTAAMATCGGTATGATGGGTC CACTTGCCGGTATCGGTGACCCTGTCTTCTGGTTCACAATTCG- TCCAATTCTTGGTG- CCCTTGGTGCATCATTGGCACAAGCTGGTAACATTGCTGGTCCAC TTATCTTCTTCATTGGTTGGAACCTTATCCGCATGGCCTTCTTG- TGGTACACTCAAGAAC- TTGGTTACAAAGCAGGTTCAGAAATCACTAAAGACATATCTGGTGG TATCTTGAAAGATATTACTAAAGGGGCATCAATACTTGGTATGTT- CATCTTGGCCGTCCTCG- TTGAACGTTGGGTATCTGTCGTCTTCACTGTAAAGCTTCCAGGTAA AGTTTTGCCTAAAGGTGCTTATATTGAATGGCCAAAAGGATATGT- TACTGGTGACCAAC- TAAAAACTATCCTTGGTCAAGTCAACGATAAGCTTAGCTTTGATAA GATTCAAGTCGATACCCTACAAAAACAATTGGATTCATTAATTCCA- GGTTTGACGGGACTT- CTCCTTACTTTTGCATGTATGTGGTTGCTTAAGAAGAAAGTTTCAC CAATCACAATCATCATCGGACTCTTTGTAGTTGGTATTGTTGCAAG-
CTTCTTCGGAATCATGTAA SEQ ID NO:251
MAEKIQLSQADRKKGLVALTILARCMEL CEPAS
[0357] Os números DGCC são referências internas à coleção da DuPont Danisco; os números DSM são os números atribuídos pelo Leib- niz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganis- men und Zellkulturen, GmbH (Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig), após depósito sob o Tratado de Budapeste.
[0358] Quanto à cepa DGCC7710 de Streptococcus thermophilus depositada sob o Tratado de Budapeste no Leibniz-Institut DSMZ-Deu- tsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, GmbH, em 14 de janeiro de 2014 sob o número DSM28255, confirmamos no presente documento que o depositante, Danisco Deutschland GmbH (da Busch- Johannsen-Strasse 1, D-25899 Niebull, Alemanha) autorizou a Reque-
rente (DuPont Nutrition Biosciences ApS) a se referir ao material bioló- gico depositado no presente pedido. As expressões "cepa DGCC7710" e "derivado de DGCC7710" são usados alternadamente com a expres- são de "cepa DSM28255" e "derivado de DSM28255".
[0359] A cepa de Streptococcus thermophilus depositada sob o Tra- tado de Budapeste no Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, GmbH, em 15 de agostode 2017 sob o número DSM32587 foi depositada pela DuPont Nutrition Biosci- ences ApS.
[0360] A Requerente solicita que uma amostra dos micro-organis- mos depositados apresentados no presente documento só possa ser disponibilizada para aqueles versados na técnica até a data em que a patente for concedida.
[0361] Em relação às designações nas quais uma patente Europeia é solicitada, uma amostra destes micro-organismos depositados será disponibilizada até a publicação da menção da concessão da patente Europeia ou até a data em que o pedido for recusado ou retirado ou considerado retirado, apenas pela emissão desta amostra para aqueles versados na técnica nomeados pela pessoa que solicita a amostra e aprovado i) pelo solicitante e/ou ii) pelo Instituto Europeu de Patentes, o que for aplicável.
REFERÊNCIAS Pool et al.; 2006. Metabolic Engineering 8(5): 456-464 Porter et a/.; 1982. Biochim Biophys Acta 709: 178-186 Sgrensen et al/.; 2016. Appl Environ Microbiol 82(12): 3683- 3692 Van den Bogaard et al. 2000. Journal of Bacteriology; 182: 5982-5989

Claims (37)

REIVINDICAÇÕES
1. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lac- tose, negativa para galactose que traz uma mutação em (um) ou mais gene(s) selecionado(s) a partir do grupo que consiste no gene glcK, no gene ccpA, no gene lacZ e no gene ptsH e, opcionalmente, traz uma mutação em um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, caracterizada pelo fato de que a proporção da atividade beta- galactosidase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase na dita cepa, como avaliado por meio do Teste E, é de pelo menos 4,10 e opcionalmente menor do que 8,10*?.
2. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lac- tose, negativa para galactose, de acordo com a reivindicação 1, carac- terizada pelo fato de que a atividade de glucoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula.
3. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lac- tose, negativa para galactose, de acordo com a reivindicação 2, carac- terizada pelo fato de que tem uma mutação em seu gene glck, em par- ticular no quadro de leitura aberta de seu gene glck.
4. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lac- tose, negativa para galactose, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que a atividade de glucoquinase na dita cepa está entre 300 e 1200 U/g ou entre 400 e 1000 U/g de extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste A.
5. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lac- tose, negativa para galactose, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que a atividade de glucoquinase na dita cepa está entre 10 e 5% da atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014, em particular entre 15 e 40% da atividade de glucoqui- nase da cepa DGCC7710, em que tanto a atividade de glucoquinase da dita cepa como a atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710 são avaliadas por meio do Teste A.
6. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lac- tose, negativa para galactose, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 3 a 5, caracterizada pelo fato de que a velocidade de avanço máxima (Vmax) de sua glucoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula, e é definida por uma ou mais dois destes parâ- metros: - a Vmax para a glucoquinase na dita cepa está entre 300 e 1200 U/g ou entre 400 e 1000 U/g de extrato proteico total, como avali- ado por meio do Teste C; - a Vmax para a glucoquinase na dita cepa está entre e 50% da Vmax para a glucoquinase da cepa DGCC7710 deposi- tada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014, quando ambas são avaliadas por meio do Teste C, em particular está entre 15 e 40% da Vmax para a glucoquinase da DGCC7710.
7. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lac- tose, negativa para galactose, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 3 a 6, caracterizada pelo fato de que o gene glcK mutante co- difica uma glucoquinase selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma glucoquinase que tem um aminoácido em sua posi- ção 275 que não é um ácido glutâmico, em particular não é um amino- ácido ácido, em particular é uma lisina; b) uma glucoquinase cuja sequência é como definido em SEQ ID NO: 25, em que o aminoácido na posição 275 da dita SEQ ID não é um ácido glutâmico, em particular não é um aminoácido ácido, em particular é uma lisina; c) uma glucoquinase cuja sequência tem pelo menos 90%
de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 25, em particular tem 322 aminoácidos de comprimento, em que o aminoácido da glucoqui- nase que corresponde à posição 275 de SEQ ID NO: 25 (ou o aminoá- cido na posição 275 da dita glucoquinase) não é um ácido glutâmico, em particular não é um aminoácido ácido, em particular é uma lisina; d) uma glucoquinase que tem um aminoácido em sua posi- ção 144 que não é uma glicina, em particular não é um aminoácido ali- fático, em particular é uma serina; e) uma glucoquinase cuja sequência é como definido em SEQ ID NO: 46, em que o aminoácido na posição 144 não é uma glicina, em particular não é um aminoácido alifático, em particular é uma se- rina; ou f) um glucoquinase cuja sequência tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 46, em particular tem 322 aminoácidos de comprimento, em que o aminoácido da dita glucoqui- nase que corresponde à posição 144 de SEQ ID NO: 46 (ou o aminoá- cido na posição 144 da dita glucoquinase) não é uma glicina, em parti- cular não é um aminoácido alifático, em particular é uma serina.
8. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lac- tose, negativa para galactose, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 3 a 7, caracterizada por ter ainda uma mutação no gene ccpA.
9. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lac- tose, negativa para galactose, de acordo com a reivindicação 1, carac- terizada por ter uma mutação no gene ccpA.
10. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lac- tose, negativa para galactose, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizada pelo fato de que que o gene ccpA tem uma mutação se- lecionada a partir do grupo que consiste em uma mutação sem sentido (non-sense) localizada entre o nucleotídeo 1 e o nucleotídeo 270 da se-
quência codificadora do gene ccpA e uma mutação localizada no pri- meiro quarto da sequência codificadora do gene ccpA que leva a um deslocamento (frameshifty de quadro do quadro de leitura aberta do gene ccpA.
11. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lac- tose, negativa para galactose, de acordo com a reivindicação 10, carac- terizada pelo fato de que a sequência do dito gene ccpA mutante é se- lecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma sequência como definido em SEQ ID NO: 71; e b) uma sequência variante de ccpA que tem pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 71.
12. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lac- tose, negativa para galactose, de acordo com a reivindicação 1, carac- terizada por ter uma mutação no gene /lacZ que codifica uma beta-ga- lactosidase, de modo que a atividade de hidrólise de lactose da dita beta-galactosidase seja aumentada.
13. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lac- tose, negativa para galactose, de acordo com a reivindicação 1, carac- terizada por ter uma mutação no gene ptsH que codifica HPr.
14. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lac- tose, negativa para galactose, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 2 a 13, caracterizada por ter sofrido mutação adicional em um ou mais genes, em particular um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em particular em um ou mais genes, em particular um gene selecionado a partir do grupo que consiste no gene manL, no gene manM e no gene manN.
15. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lac- tose, negativa para galactose, de acordo com a reivindicação 14, carac- terizada pelo fato de que o gene mutante que codifica uma proteína do
PTS específico para manose-glicose codifica uma proteína cuja ativi- dade de importação de glicose é diminuída ou eliminada, em particular uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma proteína IIABY*" de Streptococcus thermophilus trun- cada na posição 305 (IIABV2"305): b) uma proteína IICY*" de Streptococcus thermophilus trun- cada na posição 208 (IICYº"203); e c) uma proteína IIDY*" de Streptococcus thermophilus trun- cada na posição 28 (IIDVYº"2g).
16. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lac- tose, negativa para galactose, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizada pelo fato de que a sequência da proteína IIABYº"305 é se- lecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma sequência como definido em SEQ ID NO: 156; e b) uma sequência variante de IIAB que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 156, em particular que tem 305 aminoácidos de comprimento; em que a sequência da proteína IICVº",.; é selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma sequência como definido em SEQ ID NO: 202; e b) uma sequência variante de IICYº" que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 202, em particular que tem 208 aminoácidos de comprimento; em que a sequência da proteína IIDVY?"2; é selecionada a par- tir do grupo que consiste em: a) uma sequência como definido em SEQ ID NO: 251; e b) uma sequência variante de IIDYº" que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 251, em particular que tem 28 aminoácidos de comprimento.
17. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lac- tose, negativa para galactose, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que a concentração de gli- cose em um leite fermentado com a dita cepa de Streptococcus ther- mophilus, como avaliado por meio do Teste B, é de pelo menos 8 mM.
18. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lac- tose, negativa para galactose caracterizada pelo fato de ser selecionada a partir do grupo que consiste em - a cepa DSM32587 depositada no DSMZ em 15 de agosto de 2017; - uma cepa que corresponde à cepa DSM32587 na qual a sequência codificadora do gene ccpAé substituída pela sequência como apresentado em SEQ ID NO: 71 (ccpA ata114-120); - uma cepa que corresponde à cepa DSM32587 na qual a sequência codificadora do gene manL é substituída pela sequência como apresentado em SEQ ID NO: 155 (que codifica IIABYº"305); - uma cepa que corresponde à cepa DSM32587 na qual a sequência codificadora do gene manM é substituída pela sequência como apresentado em SEQ ID NO: 201 (que codifica 1ICYº" 208); - uma cepa que corresponde à cepa DSM32587 na qual a sequência codificadora do gene manNé substituída pela sequência como apresentado em SEQ ID NO: 250 (que codifica IIDYº"25); - uma cepa que corresponde à cepa DSM32587 na qual a sequência codificadora do gene ccpAé substituída pela sequência como apresentado em SEQ ID NO: 71 (ccpAniaii14-120) e a sequência co- dificadora do gene manL é substituída pela sequência como apresen- tado em SEQ ID NO: 155 (que codifica IIABYº"395); - uma cepa que corresponde à cepa DSM32587 na qual a sequência codificadora do gene ccpA é substituída pela sequência como apresentado em SEQ ID NO: 71 (ccpAniai14-120) e a sequência co- dificadora do gene manM é substituída pela sequência como apresen- tado em SEQ ID NO: 201 (que codifica IICYº" 208);
- uma cepa que corresponde à cepa DSM32587 na qual a sequência codificadora do gene ccpA é substituída pela sequência como apresentado em SEQ ID NO: 71 (ccpAniai14-120) e a sequência co- dificadora do gene manN é substituída pela sequência como apresen- tado em SEQ ID NO: 250 (que codifica IIDVYº"28)
- uma cepa que corresponde à cepa DSM28255 na qual a sequência codificadora do gene ccpA é substituída pela sequência apresentada na SEQ ID NO: 71 (ccpA a1a114-120);
- uma cepa que corresponde à cepa DSM28255 na qual a sequência codificadora do gene ccpAé substituída pela sequência como apresentado em SEQ ID NO: 71 (ccpAniaii4-120) e a sequência co- dificadora do gene manL é substituída pela sequência como apresen- tado em SEQ ID NO: 155 (que codifica IIABYº"305);
- uma cepa que corresponde à cepa DSM28255 na qual a sequência codificadora do gene ccpA é substituída pela sequência como apresentado em SEQ ID NO: 71 (ccpAntati4-120) e a sequência co- dificadora do gene manM é substituída pela sequência como apresen- tado em SEQ ID NO: 201 (que codifica 1I/CYº" 206);
- uma cepa que corresponde à cepa DSM28255 na qual a sequência codificadora do gene ccpAé substituída pela sequência como apresentado em SEQ ID NO: 71 (ccpAniai14-120) e a sequência co- dificadora do gene manN é substituída pela sequência como apresen- tado em SEQ ID NO: 250 (que codifica IIDVº"23); e
- Suas variantes as quais exibem uma proporção da atividade beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a ativi- dade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, cujo valor mínimo é selecionado a partir do grupo que consiste em pelo menos
4,108, pelo menos 5,10, pelo menos 6,10%, pelo menos 7,10% e pelo menos 8,10 e, opcionalmente cujo valor máximo é menor do que 8,10*.
19. Composição, caracterizada por compreender pelo menos uma cepa, em particular uma cepa de Streptococcus thermophilus posi- tiva para lactose, negativa para galactose como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, em particular em combinação com outra bactéria do ácido láctico, em particular com uma ou mais cepa(s) sele- cionada(s) a partir do grupo que consiste em uma cepa do gênero Lac- tobacillus, tal como uma cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp bulga- ricus, uma cepa do gênero Lactococcus, tal como uma cepa de Lacto- coccus lactis, ou uma cepa do gênero Bifidobacterium.
20. Método para fabricar um produto lácteo fermentado, em particular um leite fermentado, caracterizado por compreender inocular um substrato de leite com a cepa de Streptococcus thermophilus posi- tiva para lactose, negativa para galactose como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, ou uma composição como definida na reivindicação 19, e fermentar o dito leite inoculado para obter um pro- duto lácteo fermentado.
21. Uso da cepa de Streptococcus thermophilus positiva pa- ra lactose, negativa para galactose, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 ou uma composição como definida na reivindica- ção 19, caracterizado por ser para fabricar um produto lácteo fermen- tado.
22. Produto lácteo fermentado, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos uma cepa, em particular uma cepa de Strep- tococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 ou obtida por meio de um método como definido na reivindicação 20.
23. Glucoquinase de Streptococcus thermophilus caracteri- zada pelo fato de que a atividade de glucoquinase é significativamente reduzida, mas não nula, em um derivado do DGCC7710, como definido por: a) a atividade de glucoquinase da dita glucoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 está entre 300 e 1200 U/g ou entre 400 e 1000 U/g do extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste A, ou b) a atividade de glucoquinase da dita glucoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 está entre e 50% da atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014, quando ambas são avaliadas por meio do Teste A, em particular entre 15 e 40% da atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710, em que a atividade de glucoquinase no dito derivado de DGCC7710 ea atividade de glucoquinase da cepa DGCC7710 são analisadas por meio do Teste A.
24. Glucoquinase, de acordo com a reivindicação 23, carac- terizada ainda por ter uma velocidade de avanço máxima (Vmax) "sig- nificativamente reduzida, mas não nula' em um derivado de DGCC7710, como definido por um ou dois destes parâmetros: a) a Vmax da dita glucoquinase de Streptococcus thermophi- lus em um derivado de DGCC7710 está entre 300 e 1200 U/g ou entre 400 e 1000 U/g de extrato proteico total, como avaliado por meio do Teste C; b) a Vmax da dita glucoquinase de Streptococcus thermophi- lus em um derivado de DGCC7710 que está entre 10 e 50% da Vmax para a glucoquinase da cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014, quando ambas são avaliadas por meio do Teste C, em particular está entre 15 e 40% da Vmax para a glucoquinase de DGCC7710.
25. Glucoquinase de Streptococcus thermophilus, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizada por ser selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma glucoquinase que tem um aminoácido na posição 275 que não é um ácido glutâmico, em particular que não é um aminoácido ácido, em particular é uma lisina, b) uma glucoquinase que tem um aminoácido na posição 275 que não é um ácido glutâmico, em particular que não é um aminoácido ácido, em particular é uma lisina e com uma arginina na posição 278 e/ou uma serina na posição 279; e c) uma glucoquinase que tem um aminoácido em sua posi- ção 144 que não é uma glicina, em particular que não é um aminoá- cido alifático, em particular é uma serina.
26. Glucoquinase, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 23 a 25, caracterizada pelo fato de que a sequência é selecio- nada a partir do grupo que consiste em: a) uma sequência como definido em SEQ ID NO: 25, em que o aminoácido na posição 275 da dita SEQ ID não é um ácido glutâmico, em particular não é um aminoácido ácido, em particular é uma lisina; e b) uma sequência variante de GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 25, em que o aminoácido da dita glucoquinase que corresponde à posição 275 de SEQ ID NO: 25 (ou o aminoácido na posição 275 da dita glucoquinase) não é um ácido glutâmico, em particular não é um aminoácido ácido, em particular é uma lisina; c) uma sequência como definido em SEQ ID NO: 46, em que o aminoácido na posição 144 não é glicina, em particular não é um ami- noácido alifático, em particular é uma serina; e d) uma sequência variante de GlIcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 46, em que o aminoá- cido da dita glucoquinase que corresponde à posição 144 de SEQ ID
NO: 46 (ou o aminoácido na posição 144 da dita glucoquinase) não é uma glicina, em particular que não é um aminoácido alifático, em parti- cular é uma serina.
27. Polinucleotídeo, caracterizado por codificar uma gluco- quinase de Streptococcus thermophilus como definida em qualquer uma das reivindicações 23 a 26.
28. Polinucleotídeo de ccpA de Streptococcus thermophi- lus, caracterizado por ser selecionado a partir do grupo que consiste em: a) um polinucleotídeo de ccpA o qual, quando inserido em vez dogene ccpA da cepa DGCC7710,leva a um derivado de DGCC7710 que exibe uma proporção da atividade de beta-galactosi- dase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoqui- nase, como avaliado por meio do Teste E, de pelo menos 4.10%; e b) um polinucleotídeo de ccpA o qual, quando inserido em vez dogene ccpA da cepa DSM32587,leva aum derivado de DSM32587: - que exibe uma proporção da atividade de beta-galactosi- dase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoqui- nase, como avaliado por meio do Teste E, de pelo menos 4.10; e - libera uma concentração de glicose, como avaliado por meio do Teste B, que é pelo menos 50 mM ou libera uma concentração de glicose que é aumentada de pelo menos 150% ou pelo menos 200% comparado com a concentração de glicose liberada pela cepa DSM32587, quando ambas são avaliadas por meio do Teste B.
29. Polinucleotídeo de ccpA de Streptococcus thermophilus, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada por trazer uma muta- ção selecionada a partir do grupo que consiste em uma mutação sem sentido (non-sense) localizada entre o nucleotídeo 1 e o nucleotídeo 270 da sequência codificadora do gene ccpA e uma mutação localizada no primeiro quarto da sequência codificadora do gene ccpA que leva a um deslocamento (frameshift) de quadro do quadro de leitura aberta do gene ccpA, em particular um polinucleotídeo cuja sequência é selecio- nada a partir do grupo que consiste em a) uma sequência como definido em SEQ ID NO: 71; e b) uma sequência variante de ccpA que tem pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 71.
30. Uso de um polinucleotídeo de acordo com a reivindica- ção 27 e/ou um polinucleotídeo como definido na reivindicação 28 ou 29, caracterizado por ser para conceber uma cepa de Streptococcus thermophilus.
31. Uso de um gene manl, um gene manMou um gene manN mutante de Streptococcus thermophilus que codificam, respecti- vamente, uma proteína I!IABYº", uma proteína II/CYº" ou uma proteína IIDY*", caracterizado pelo fato de que a atividade de importação de gli- cose da dita proteína é diminuída ou eliminada ao substituir, respectiva- mente, o gene manL, gene manM ou gene manN correspondentes de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose, em que a proporção da atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, é de pelo menos 4,10.
32. Uso, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a dita cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose, negativa para galactose que exibe uma proporção da ati- vidade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade da glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, de pelo menos 4,10 é qualquer uma das cepas como definidas em qual- quer uma das reivindicações 2 a 13.
33. Uso, de acordo com a reivindicação 31 ou 3 2, caracteri- zado pelo fato de que o dito gene manL, gene manM ou gene manN mutante de Streptococcus thermophilus é definido pelo fato de que: a) quando inserido individualmente em vez do gene manL,
gene manM ougene manNda cepa DSM32587, o derivado de DSM32587: - exibe uma proporção da atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, de pelo menos 4,10; e - libera uma concentração de glicose que é aumentada de pelo menos 150% ou pelo menos 200% comparado com a concentração de glicose liberada pela cepa DSM32587, quando ambas são avaliadas por meio do Teste B; ou b) quando inserido individualmente em lugar do gene manL, gene manM ou gene manN de uma cepa DGCC7710 na qual o gene ccpA foi anteriormente substituído pelo gene ccpA como definido em SEQ ID NO: 71 (isto é, da cepa DGCC7710-ccpAntaia-120), o derivado de DGCC7710-ccpAnia114-120: - exibe uma proporção da atividade de beta-galactosidase, como avaliado por meio do Teste D, para a atividade de glucoquinase, como avaliado por meio do Teste E, de pelo menos 4.10; e - libera uma concentração de glicose que é aumentada em pelo menos 150% ou pelo menos 200% comparado com a concentração de glicose liberada pela cepa DGCC7710-ccpAntaris-120 quando ambas foram avaliadas por meio do Teste B.
34. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicação 31 a 33, caracterizado pelo fato de que o dito gene manL mutante de Strep- tococcus thermophilus codifica uma proteína IIABY*" de Streptococcus thermophilus truncada na posição 305 (IIABYº"395), em particular uma proteína IIABY*"355 truncada cuja sequência é selecionada a partir do grupo que consiste em a) uma sequência como definido em SEQ ID NO: 156 e b) uma sequência variante de I/ABYº" que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com SEQ ID NO: 156, em particular que tem 305 aminoácidos de comprimento.
35. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, caracterizado pelo fato de que o dito gene manM mutante de Streptococcus thermophilus codifica uma proteína IICYº" de Streptococ- cus thermophilus truncada na posição 208 (IICYº"28), em particular uma proteína IICY*" truncada cuja sequência é selecionada a partir do grupo que consiste em a) uma sequência como definido em SEQ ID NO: 202 e b) uma sequência variante de IICYº*" que tem pelo menos 90% de simi- laridade ou identidade com SEQ ID NO: 202, em particular que tem 208 aminoácidos de comprimento.
36. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, caracterizado pelo fato de que o dito gene manN mutante de Strep- tococcus thermophilus codifica uma proteína IIDYº&" de Streptococcus thermophilus truncada na posição 28 (IIDYº">3), em particular uma pro- teína IIDVYº* truncada cuja sequência é selecionada a partir do grupo que consiste em a) uma sequência como definido em SEQ ID NO: 251; e b) uma sequência variante de IIDY?" que tem pelo menos 90% de similari- dade ou identidade com SEQ ID NO: 251, em particular que tem 28 ami- noácidos de comprimento.
37. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 36, caracterizado pelo fato de que o dito gene manL, gene manM ou gene manN mutante de Streptococcus thermophilus é selecionadoa partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 201 e SEQ ID NO: 250.
DGCC7T710 MSKKLLGIDLGGTTVKFGILTADGEVQEKWAIETNTFENGSHIVPDIVESLKHRLELYG DSM32587 MSKKLLGIDLGGTTVKFGILTADGEVQEKWAIETNTFENGSHIVPDIVESLKHRLELYG STlm-glcK0-gal+ MSKKLLGIDLGGTTVKFGILTADGEVQEKWAIETNTFENGSHIVPDIVESLKHRLELYG
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SAAGEFLRSRVEGY FTRYAFPQVRRTTKVKLAELGNDAGIIGAASLAYSIDK Fig 1. Cinética de acidificação do leite a 43 ºC 7 ——=e—=——0*É Íe—- c==«=« 6,5 + 6 v * 1 % — Controle (leite) 5,5 À x «“ST1mOgal+ pH (UpH) ) *. — -DSM32587 V Mn TS DSM28255 Ss <S bx) 4,5 Ss "TONA 4 3,5 + A + — o 300 600 900 1200 1500 | Tempo (min) Fig 2.
A. Cinética de acidificação do leite a 43 ºC 7 6,5 Vw 6 ! h > Controle (leite) 5,5 pH (UpH) W — ST1.1 VW — -STLim
SN
X N 4,5 Es LSQUISCSOs== 4 3,5 o 300 600 900 1200 1500 Tempo (min) B. Cinética de acidificação do leite a 43 ºC 7 6,5 & h
SR Controle (leite) 55 h =—ST12 pH (Up) W ---sTL2m 5 v
VW . Ne. 4,5 ee 4 3,5 o 300 600 900 1200 1500 Tempo (min) Fig 3.
EE ; e
A > EE.” “. & o br ê Po, E 2
3. & o ã * PD 2. S & & mem. o <q Po 8 3 s o Cr o, 3 % s ?, o 8 "e Fo Oo 8 e H E. “ o 8 “& 8 S Ev, “, e [IME “s Ao ts s à" “< ê 3 8 8 8 8 8 8 % & & à &à &â& &â &$ & 8 Fig 4.
BR112020009948-1A 2017-12-22 2018-12-21 bactérias do ácido láctico com propriedades adoçantes e usos das mesmas BR112020009948A2 (pt)

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